JP4322975B2 - 新規なクロマノール配糖体の製造方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なクロマノール配糖体の製造方法およびその方法により製造されるクロマノール配糖体に関するものである。より詳しくは、本発明は、有機合成技術を用いたクロマノール配糖体の製造方法およびその方法により製造されるクロマノール配糖体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
下記一般式：
【０００３】
【化１４】
【０００４】
（ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基を表わし、該糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、ｎは０〜４の整数であり、およびｍは１〜６の整数である）
で表されるクロマノール配糖体は、特開平０７−１１８２８７号において、優れた抗酸化活性、熱やｐＨ安定性及び水溶性を有する化合物であることが報告されている。
【０００５】
また、近年、本発明者らの研究により、上記一般式で表されるクロマノール配糖体は、上記特性の他に放射線防護作用や炎症性腸疾患予防及び治療効果も有することが分かった。
【０００６】
このような種々の優れた特性を有するクロマノール配糖体は、従来、糖転移作用を触媒する酵素を用いて、下記一般式：
【０００７】
【化１５】
【０００８】
（ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、およびｎは０〜４の整数である。）
で表される２−置換アルコールと糖とを有機溶媒の存在下において反応させることにより（特開平７−１１８２８７号）または多孔質キトサンビーズにα−グルコシダーゼを固定化させた固定化酵素を用いて、上記一般式で示される２−置換アルコールと糖とを有機溶媒共存下において反応させることにより（特開平９−２４９６８８号）、製造されてきた。
【０００９】
しかしながら、上記の方法は、双方とも、酵素を用いるものであるが、目的の糖を効率よく２−置換アルコールに転移させることができる酵素が入手できる場合には良好に適応できるが、フコース等の糖の種類によっては、糖を２−置換アルコールに転移させて目的とするクロマノール配糖体を生産できる酵素がまだ発見されていない、または知られていても非常に高価であり、かつたとえ目的とするクロマノール配糖体を生産する酵素があったとしても、その反応効率が非常に悪い場合には、収率が悪く経済的に適応できないという問題点があった。
【００１０】
一方、上述したように、クロマノール配糖体には様々な特性があるが、その特性の発現強度は２−置換アルコールに結合する糖の種類によって当然相違する、さらには、クロマノール配糖体を生体に投与する際のクロマノール配糖体のグリコシド結合の安定性や細胞への取り込まれ方にも、結合する糖の種類によって違いが生じることは常識となっている。このため、様々な種類の糖を有するクロマノール配糖体について、目的とする特性（例えば、抗酸化活性、熱安定性、ｐＨ安定性、水溶性、放射線防護作用または炎症性腸疾患予防若しくは治療効果）、グリコシド結合の安定性および細胞への取り込まれ易さ等を検討することは非常に有用である。
【００１１】
したがって、酵素により糖を転移できない、または転移できたとしても効率が悪く目的とするクロマノール配糖体が十分量生産できないなどの欠点を克服するクロマノール配糖体の製造方法に対する要望は強く存在している。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、新規なクロマノール配糖体の製造方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、酵素により糖を転移できない、または転移できたとしても効率が悪く目的とするクロマノール配糖体が十分量生産できないなどの欠点を克服する有機合成によるクロマノール配糖体の製造方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、生成するクロマノール配糖体の分解を防ぎクロマノール配糖体を高い収率で製造する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる他の目的は、このような方法により製造されるクロマノール配糖体を提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情を鑑みて鋭意研究を行った結果、アノマー位に脱離基を導入し他の水酸基を保護基で保護した糖の誘導体を２−置換アルコール誘導体と縮合させることにより、目的とするクロマノール配糖体を効率良く合成できることを発見した。また、上記に加えて、本発明者らは、上記縮合反応後における保護基の脱保護法に関しても鋭意研究を行った結果、保護基の脱保護を酸分解により、酵素分解によりまたは金属試薬を用いて行うことにより、生成したクロマノール配糖体の分解を効率よく防止し、これによりクロマノール配糖体の収率を向上させることができることを発見した。これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、上記諸目的は、下記（イ）から（ヌ）によって達成される。
【００１８】
（イ） アノマー位に脱離基を導入し他の水酸基を保護基で保護した糖の誘導体および一般式（２）：
【００１９】
【化１６】
【００２０】
［ただし、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一または異なる水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、Ｒ５は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、およびｎは０〜４の整数である。］
で表される２−置換アルコール誘導体の縮合反応を有し、前記糖の誘導体が一般式（３）で表されるＬ−フコース供与体、一般式（４）で表されるＬ−ラムノース供与体、一般式（５）で表されるＤ−キシロース供与体、一般式（６）で表されるＤ−ガラクトース供与体または一般式（７）で表されるＤ−マンノース供与体である、
【００２１】
【化１７】
【００２２】
［ただし、式（３）、（４）、（５）、（６）及び（７）中、Ｙはハロゲン原子、硫黄化合物またはトリクロロアセトイミド基を表し、その種類によりα体またはβ体のいずれかの型を優先的にとり、およびＲは同一または異なるアセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブリノイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基またはトリチル基を表す。］
一般式（１）：
【００２４】
【化１８】
【００２５】
［ただし、式中、Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ およびＲ ４ は同一または異なる水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、Ｒ ５ は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、Ｘは単糖残基（但し、糖残基中の水酸基の水素原子はアセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブリノイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基またはトリチル基で置換されていてもよい）を表し、およびｎは０〜４の整数である。］
で表されるクロマノール配糖体の製造方法。
【００２９】
（ロ）前記縮合反応後における保護基の脱保護が酸分解により行われるものである前記（イ）に記載の方法。
【００３０】
（ハ）前記酸分解がメタノール性塩酸またはアルコールに塩酸を添加した溶媒の存在下で行われるものである前記（ロ）に記載の方法。
【００３１】
（ニ）前記縮合反応後における保護基の脱保護が酵素分解により行われるものである前記（イ）に記載の方法。
【００３２】
（ホ）前記酵素分解に使用される酵素がエステラーゼまたはリパーゼである前記（ニ）に記載の方法。
【００３３】
（ヘ）前記縮合反応後における保護基の脱保護が金属試薬を用いて行われるものである前記（イ）に記載の方法。
【００３４】
（ト）前記金属試薬が水素化リチウムアルミニウムまたは水素化ジイソブチルアルミニウムである前記（ヘ）に記載の方法。
【００４５】
【発明の実施の形態】
本発明は、下記一般式（２）：
【００４６】
【化２９】
【００４７】
［ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、およびｎは０〜４の整数である。］
で表される２−置換アルコール誘導体（以下、「糖受容体」と称する）を基質として使用してアノマー位に脱離基を導入し他の水酸基を保護基で保護した糖の誘導体（以下、「糖供与体」と称する）と縮合反応を起こさせて、下記一般式（１）：
【００４８】
【化３０】
【００４９】
［ただし、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一または異なる水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、Ｒ５は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、Ｘは単糖残基（但し、糖残基中の水酸基の水素原子はアセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブリノイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基またはトリチル基で置換されていてもよい）を表し、およびｎは０〜４の整数である。］
で表されるクロマノール配糖体を製造することを特徴とするものである。ここで、糖供与体は、上記一般式（３）で表されるＬ−フコース供与体、上記一般式（４）で表されるＬ−ラムノース供与体、上記一般式（５）で表されるＤ−キシロース供与体、上記一般式（６）で表されるＤ−ガラクトース供与体または上記一般式（７）で表されるＤ−マンノース供与体である。
【００５０】
本発明を以下に詳細に説明する。
【００５１】
本発明において、糖供与体は、糖残基のアノマー位に脱離基を導入し、他の水酸基を保護基で保護した糖の誘導体である。この際、アノマー位に導入される脱離基としては、塩素、臭素やフッ素等のハロゲン原子、チオメチル基、チオエチル基やチオフェニル基等の硫黄化合物およびトリクロロアセトイミド基などが挙げられる。これらの脱離基のうち、臭素、塩素、チオメチル基、チオエチル基、チオフェニル基及びトリクロロアセトイミド基が好ましく使用される。
【００５２】
また、本発明において、アノマー位以外の水酸基を保護する保護基としては、アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基及びレブリノイル基等のアシル系保護基、およびベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基及びトリチル基等のエーテル系保護基が挙げられる。これらの保護基のうち、アシル系保護基、特にアセチル基が好ましくは使用される。
【００５３】
本発明による糖供与体における糖部分は、目的とするクロマノール配糖体の種類によって決まるが、具体的には、Ｄ，Ｌ−グルコース、Ｄ，Ｌ−ガラクトース、Ｄ，Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−キシロース、Ｄ，Ｌ−マンノース、Ｄ，Ｌ−ラムノース、Ｄ，Ｌ−アラビノース、Ｄ，Ｌ−リキソース、Ｄ，Ｌ−リボース、Ｄ，Ｌ−アロース、Ｄ，Ｌ−アルトロース、Ｄ，Ｌ−イドース、Ｄ，Ｌ−タロース、Ｄ，Ｌ−デオキシリボース、Ｄ，Ｌ−２−デオキシリボース、Ｄ，Ｌ−キノボース及びＤ，Ｌ−アベクオースなどが挙げられる。これらのうち、Ｄ，Ｌ−グルコース、Ｄ，Ｌ−ガラクトース、Ｄ，Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−キシロース、Ｄ，Ｌ−マンノース、Ｄ，Ｌ−ラムノース、Ｄ，Ｌ−アラビノース、Ｄ，Ｌ−リキソース、Ｄ，Ｌ−リボース、Ｄ，Ｌ−タロース、Ｄ，Ｌ−デオキシリボース及びＤ，Ｌ−２−デオキシリボースが好ましく使用され、特に、下記一般式（３）で表されるＬ−フコース供与体、下記一般式（４）で表されるＬ−ラムノース供与体、下記一般式（５）で表されるＤ−キシロース供与体、下記一般式（６）で表されるＤ−ガラクトース供与体または下記一般式（７）で表されるＤ−マンノース供与体が糖供与体として好ましく使用される。
【００５４】
【化３１】
【００５５】
【化３２】
【００５６】
【化３３】
【００５７】
【化３４】
【００５８】
【化３５】
【００５９】
［ただし、式（３）、（４）、（５）、（６）及び（７）中、Ｙはハロゲン原子、硫黄化合物またはトリクロロアセトイミド基を表し、その種類によりα体またはβ体のいずれかの型を優先的にとり、およびＲは同一または異なるアセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブリノイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基またはトリチル基を表す。］
本発明の方法によると、糖供与体の２位の水酸基を上記アシル系保護基で保護して縮合する場合、隣接基効果により、１，２−トランス型のグリコシド結合を有するクロマノール配糖体が得られる。例えば、グルコース、ガラクトース、フコース及びキシロース等の２位の水酸基がエカトリアルで配座しているグルコ型の糖はβ型でアグリコンと結合し、マンノースやラムノース等の２位の水酸基がアキシアルで配座しているマンノ型の糖はα型でアグリコンと結合する。
【００６０】
さらに、本発明におけるクロマノール配糖体及び糖受容体をそれぞれ表すものである、上記一般式（１）及び（２）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わすものであるが、低級アルキル基を表わす際には、炭素原子数が好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６の低級アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基及びオクチル基等が挙げられ、これらのうち、メチル基及びエチル基が好ましい。同様にして、Ｒ５は、水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わすものであるが、これらのうち、低級アルキル基を表わす際には、上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４における場合と同様であり、また、低級アシル基を表わす際には、炭素原子数が好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜８の低級アシル基であり、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基及びオクタノイル基等が挙げられ、これらのうち、アセチル基及びプロピオニル基が好ましい。さらに、上記一般式（１）において、Ｘは、グルコース、ガラクトース、フコース、キシロース、マンノース、ラムノース、アラビノース、リキソース、リボース、アロース、アルトロース、イドース、タロース、デオキシリボース、２−デオキシリボース、キノボース及びアベクオース等の単糖残基を表わすが、この際、糖残基中の水酸基の水素原子はアセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブリノイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基またはトリチル基で置換されていてもよい。上記単糖残基のうち、グルコース、ガラクトース、フコース、キシロース、マンノース、ラムノース、アラビノース、リキソース、リボース、タロース、デオキシリボース及び２−デオキシリボースがＸとして好ましく使用され、特にフコース、キシロース及びラムノースが好ましく使用される。さらに、ｎは、０〜４、好ましくは１〜３の整数である。
【００６１】
本発明において、糖受容体は、縮合の際、６位の水酸基をアセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブリノイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基及びトリチル基等の保護基、好ましくは、アセチル基やベンゾイル基で保護しておくことが好ましい。
【００６２】
以下に、本発明による糖供与体の調製方法の一実施態様を示す。糖１ｇに対してピリジンを５〜２０ｍｌ、好ましくは１０〜１５ｍｌの割合で加えて溶解させる。さらにこの溶液に、無水酢酸を１０〜２０ｍｌ、好ましくは１５〜２０ｍｌを加えて、室温で３〜８時間、好ましくは５〜７時間撹拌する。次に、この撹拌溶液にメタノールを２０ｍｌ添加することにより過剰の無水酢酸を壊した後、すべての水酸基をアセチル基で保護した糖（以下、「アセチル糖誘導体」と称する）を塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン及びエーテル等の有機溶媒、好ましくは塩化メチレンで抽出する。得られた抽出液を減圧下で濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、アセチル糖誘導体を得る。さらに、このようにして得られたアセチル糖誘導体１ｇに対して塩化メチレンを５〜２０ｍｌ、好ましくは１０〜１５ｍｌの割合で加えて溶解させる。さらにこの溶液に、臭化水素酢酸溶液（２５％（ｗ／ｗ））を０．５〜２ｍｌ、好ましくは１〜１．５ｍｌを添加して、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、１５〜６０分間、好ましくは２０〜３０分間撹拌する。次に、この撹拌溶液に氷上で蒸留水を５〜３０ｍｌ、好ましくは１５〜２０ｍｌ加えて、臭化水素を分解する。この反応液を塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン及びエーテル等の有機溶媒、好ましくは塩化メチレンで抽出する。得られた抽出液を減圧下で濃縮することにより、１位に臭素が導入され他の水酸基はアセチル基で保護された糖供与体（以下、「１−ブロモ糖供与体」と称する）が得られる。
【００６３】
次に、本発明による糖受容体の調製方法の一実施態様を示す。２−置換アルコール１ｇに対してピリジンを５〜２０ｍｌ、好ましくは１０〜１５ｍｌの割合で加えて溶解させる。さらにこの溶液に、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリドを０．７〜１．５ｇ、好ましくは０．９〜１．０ｇ加えて、室温で３〜８時間、好ましくは４〜５時間撹拌する。次いで、この撹拌溶液に無水酢酸を０．８〜２ｍｌ、好ましくは１〜１．５ｍｌ添加して、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、３〜８時間、好ましくは４〜５時間撹拌する。この反応液にメタノールを２ｍｌ加えることにより過剰の無水酢酸を壊した後、６位の水酸基をアセチル基で保護して２位の水酸基をｔ−ブチルジメチルシリル基で保護した２−置換アルコールを得る。このように保護された２−置換アルコールを塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン及びエーテル等の有機溶媒、好ましくは塩化メチレンで抽出する。得られた抽出液を減圧下で濃縮して、得られた化合物を酸性条件、例えば、酢酸水溶液（８０％（ｗ／ｗ））中で、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、３６〜５４時間、好ましくは４０〜４８時間撹拌して、ｔ−ブチルジメチルシリル基を脱保護する。脱保護された化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、２−置換アルコールの６位の水酸基のみをアセチル基で保護した糖受容体が得られる。
【００６４】
さらに、本発明による糖供与体及び糖受容体の縮合反応の一実施態様を、上記で得られた糖供与体及び糖受容体について、以下に示す。糖受容体１ｇおよび糖受容体１ｇに対してモル比で１．０〜１．５等量、好ましくは１．２等量の１−ブロモ糖供与体を塩化メチレンやベンゼン等の非極性溶媒に溶解して、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）を２〜４ｇ、好ましくは２．５〜３．０ｇ添加して、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、１〜５時間、好ましくは３時間撹拌する。この反応溶液に無水条件下で活性化剤を添加して、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、１２〜４８時間、好ましくは２０〜３０時間撹拌する。得られた反応液をセライト瀘過してモレキュラーシーブ４Ａ（４Å）及び過塩素酸銀を除去した後、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、すべての水酸基がアセチル基で保護されたクロマノール配糖体（以下、「クロマノール配糖体アセチル誘導体」と称する）が得られる。
【００６５】
本発明において使用される活性化剤としては、三フッ化ホウ酸・エーテル錯体、過塩素酸銀、トリフルオロメタンスルホン酸銀、臭化水銀、シアン化水銀、Ｎ−ヨードコハク酸イミド−トリフルオロメタンスルホン酸、ジメチルメチルチオスルホニウムトリフラート及びｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられ、特に、臭素を糖供与体の脱離基として使用した場合には過塩素酸銀等の重金属塩を使用することが好ましい。
【００６６】
また、上記実施態様においては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製を行ったが、この精製方法に制限されるものではなく、公知の精製方法が使用される。
【００６７】
次いで、以下のようにして、クロマノール配糖体アセチル誘導体の脱保護を行う。
【００６８】
本発明において、上記したような糖供与体と糖受容体との縮合反応後に得られた縮合物、すなわち、水酸基がアセチル基等の保護基で保護されたクロマノール配糖体アセチル誘導体から、保護基を脱離する脱保護法としては、特に限定されるものではなく、例えば、アルカリ分解法、酸分解法、酵素分解法及び金属試薬を用いた脱保護法等の種々の方法を採択できる。
【００６９】
しかしながら、クロマノール配糖体は、その化学的性質によりアルカリ条件下では非常に不安定な化合物であるため、縮合で得られた化合物の脱保護処理を抗酸化剤であるピロガロール共存下でアルカリ分解するといったアルカリ分解法では、クロマノール配糖体の分解が起こり収率が低下するという欠点がある。このため、大量のクロマノール配糖体を合成することを考慮すると、アルカリ分解法による場合に比べて、酸分解法による、酵素分解法による及び金属試薬を用いた脱保護法、特に金属試薬を用いた脱保護法の方が本発明において好ましく使用される。
【００７０】
第一に、縮合物のアセチル基等の保護基の脱保護を酸分解によって行う場合には、クロマノール配糖体の分解が防止され、アルカリ分解により脱保護を行う場合と比較して収率良くクロマノール配糖体を得ることができ、例えば、縮合で得られた化合物をメタノール性塩酸に溶解させる酸分解法はアルカリ分解法に比較して約７倍量の配糖体を得ることが可能となる。しかしながら、上記酸分解による脱保護法では、２−置換アルコールに結合している糖の種類によっては、酸性条件下で、アセチル基の脱保護と同時にグリコシド結合が切断される配糖体もあり、このような場合には良好な収率で配糖体を得ることは困難になってしまう。このため、酸分解による脱保護処理には、酸に安定な配糖体を使用することが好ましく、酸に不安定な配糖体の場合には、酸分解ではなくむしろ酵素分解や金属試薬を用いて脱保護を行なう方法が好ましいといえる。
【００７１】
次に、縮合で得られた化合物のアセチル基などの保護基をエステラーゼ等の酵素により加水分解させて脱保護処理を行う場合には、上記と同様に、クロマノール配糖体の分解は防止され、アルカリ分解により脱保護を行う場合と比較して収率良くクロマノール配糖体を得ることができ、例えば、縮合で得られた化合物をエステラーゼにより加水分解させて脱保護処理を行う方法はアルカリ分解法に比較して約７倍量の配糖体を得ることが可能となる。しかしながら、上記酵素分解による脱保護法では、使用する酵素が高価であり、製造されるクロマノール配糖体のコストが高くなってしまい、経済的でないという問題がある。
【００７２】
これらの脱保護法に対して、金属試薬を使用して縮合物のアセチル基等の脱保護を還元的に行なう場合には、上記と同様に、クロマノール配糖体の分解は防止され、アルカリ分解により脱保護を行う場合と比較して収率良くクロマノール配糖体を得ることができ、例えば、縮合で得られた化合物を水素化リチウムアルミニウムや水素化ジイソブチルアルミニウムを用いて脱保護処理を行う方法はアルカリ分解法に比較して約８．２５倍量の配糖体を得ることが可能となる。また、これらの利点に加えて、金属試薬を用いた脱保護法は、結合する糖の種類に関わらず、全ての配糖体の脱保護に適用が可能であり、かつ高収率で配糖体の製造が可能であるという長所も有する。
【００７３】
本発明による脱保護をアルカリ分解、酸分解、酵素分解および金属試薬を用いる場合に分けて、その一実施態様を、それぞれ、上記で得られたクロマノール配糖体アセチル誘導体を用いて以下に示す。
【００７４】
まず、アルカリ分解によるアセチル基の脱保護を行う場合には、例えば、得られたクロマノール配糖体アセチル誘導体１ｇを蒸留水−メタノール混合溶液（１：１（ｖ／ｖ））２０〜５０ｍｌ、好ましくは２５〜３０ｍｌに溶解して、１０ｇのピロガロールを加えて、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、３０分〜２時間、好ましくは１時間〜１時間３０分間撹拌する。このようにして得られた反応溶液に水酸化ナトリウム１〜２０ｇ、好ましくは８〜１２ｇを加えて、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、１〜４時間、好ましくは２〜３時間撹拌して、アセチル基の脱保護を行い、目的とするクロマノール配糖体が得られる。
【００７５】
次に、酸分解によるアセチル基の脱保護を行う場合には、まず、塩化ナトリウム２０〜１００ｇ、好ましくは４０ｇ〜５０ｇに濃硫酸５０ｍｌ〜２００ｍｌ、好ましくは８０ｍｌ〜１００ｍｌを滴下して発生する塩化水素ガスをメタノール（あらかじめモレキュラーシーブで脱水したもの）に吸収させ、メタノール性塩酸を調製する。このときの塩酸の濃度は５〜１５％が好ましい。そして、クロマノール配糖体アセチル誘導体１ｇを上記のようにして調製されたメタノール性塩酸１０〜５０ｍｌ、好ましくは２０〜３０ｍｌに溶解させて室温で２〜８時間、好ましくは４〜６時間、攪拌してアセチル基を酸分解させる。その後、反応液から目的とするクロマノール配糖体を分離、精製する。
【００７６】
さらに、酵素分解によるアセチル基の脱保護の場合には、緩衝溶液中で加水分解酵素を使用して行なう。この際、アセチル基の脱保護を行なうのに使用される酵素としては、エステラーゼ、例えば、シグマ（ＳＩＧＭＡ）製のブタの肝臓及びウサギの肝臓由来のエステラーゼ、及びリパーゼ、例えば、ブタの膵臓由来のリパーゼなどが挙げられる。
【００７７】
また、上記実施態様において、添加される酵素量は、使用される酵素の種類や反応条件等によって異なるが、例えば、シグマ（ＳＩＧＭＡ）製のブタ肝臓由来のエステラーゼを２ｇのクロマノール配糖体アセチル誘導体を含む反応液５００ｍｌに添加する場合、１０，０００から５０，０００Ｕ、好ましくは２０，０００から４０，０００Ｕである。酵素量が１０，０００Ｕ未満の場合には、酵素による触媒作用が十分でなく好ましくない。これに対して、酵素量が５０，０００Ｕを越える場合には、過度の添加に見合うだけの効果が得られず不経済である。なお、上記で使用されたブタ肝臓由来のエステラーゼの「１Ｕ」とは、基質として酪酸エチルを用い、ｐＨ８．０、２５℃において１分間に１μｍｏｌの酪酸エチルを加水分解する酵素量を意味するものである。
【００７８】
また、酵素分解法による脱保護反応は、縮合で得られたクロマノール配糖体アセチル誘導体を反応溶液に溶解させることが望ましく、そのため、水に対する溶解度が非常に低いクロマノール配糖体アセチル誘導体を溶解し得る有機溶媒を添加する必要がある。同時に、添加される有機溶媒は、エステラーゼの加水分解活性を効率よく発現させることができるものでなければならない。このような条件を満たす有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、およびアセトニトリルなどが挙げられる。例えば、ブタ肝臓由来のエステラーゼを酵素分解反応に使用する際には、エステラーゼの加水分解活性を高めるために、メタノール、エタノールまたはジメチルスルホキシドを使用することが望ましい。添加する有機溶媒の濃度は、使用する酵素の種類などによって、相違するが、例えば、エステラーゼを用いる場合、添加する有機溶媒の濃度は、１０〜２５％、反応効率を考慮すると、好ましくは、１５〜２０％である。有機溶媒濃度が１０％未満の場合には、所望とするクロマノール配糖体を反応溶液に溶解させることが難しく、また、２５％を越える場合には、酵素の安定性が低下し加水分解効率が悪くなるため好ましくない。
【００７９】
さらに、酵素分解法による実施態様において、その反応条件は、使用する酵素やクロマノール配糖体アセチル誘導体の種類や量などによって異なる。例えば、ブタ肝臓由来のエステラーゼを用いる場合、反応系のｐＨは、６．５〜８．５、好ましくは７．５〜８．０である。ｐＨが上記範囲を外れる場合には上述した酵素が失活するなどして好ましくない。また、反応温度に関しても、例えば、ブタ肝臓由来のエステラーゼを用いる場合、２０〜６０℃、好ましくは３０〜４０℃である。反応温度が上記範囲の下限を下回る場合には、使用した酵素の活性が低下し、充分な加水分解率を確保するのに長時間を要するため経済的でなく、また、反応温度が上記範囲の上限を越える場合には、酵素が失活するため好ましくない。さらに、反応時間に関しては、例えば、ブタ肝臓由来のエステラーゼを用いる場合、２〜６０時間、好ましくは１５〜５０時間である。この際、反応時間が２時間未満の場合には、反応が平衡近くに達していないため、充分な加水分解率を得ることができず、また、６０時間を越える場合には、これに見合うだけの更なる効果が期待できないため、好ましくない。
【００８０】
最後に、金属試薬を用いたアセチル基の脱保護は、具体的には、金属試薬を溶解させた有機溶媒中に縮合で得られた化合物を添加して反応させる簡単な方法である。より詳しく述べると、まず、縮合で得られた上記クロマノール配糖体アセチル誘導体１ｇを５０〜１００ｍｌの非極性溶媒に溶解する。この溶液を、糖アセチル誘導体１ｇに対して、０．５ｇ〜３ｇ、好ましくは０．７５ｇ〜１．２５ｇの金属試薬を予め溶解した非極性溶媒５０〜１００ｍｌに、冷却しながら、１〜２時間にわたって滴下する。滴下後、この混合液を室温で１〜６時間、好ましくは２〜４時間攪拌してアセチル基の脱保護を行なう。反応液から目的とするクロマノール配糖体を分離精製する。
【００８１】
この際反応に使用される金属試薬としては、水素化リチウムアルミニウム（ＬｉＡｌＨ4 ）およびそのトリアルコキシ誘導体（ＬｉＡｌＨ（ＯＲ）3 、この際、Ｒは炭素原子数１〜４のアルキル基を表す）、水素化ジイソブチルアルミニウム（（ｉ−Ｃ4 Ｈ9 ）2 ＡｌＨ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4 ）及び水素化ホウ素リチウム（ＬｉＢＨ4 ）等が挙げられる。これらのうち、水素化リチウムアルミニウム（ＬｉＡＬＨ4 ）及び水素化ジイソブチルアルミニウム（（ｉ−Ｃ4 Ｈ9 ）2 ＡｌＨ）が好ましく使用される。
【００８２】
また、上記実施態様において使用される非極性溶媒としては、例えば、エーテル、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、トルエン、ベンゼン及びヘキサンなどが挙げられる。これらのうち、テトラヒドロフランが非極性溶媒として好ましく使用される。
【００８３】
上記したようにして反応が終了した後、反応液から脱保護により得られた目的とするクロマノール配糖体を分離、精製することにより高純度のクロマノール配糖体が得られる。
【００８４】
このようにして、非極性溶媒中に糖供与体及び糖受容体を溶解し、無水条件下で活性化剤の存在下で糖供与体及び糖受容体の縮合反応を行い、得られた化合物を精製し、保護基を脱保護するという簡便な工程により、本発明のクロマノール配糖体が高い収率で製造できる。
【００８５】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらにより本発明の範囲がなんら制限されるものでないことはいうまでもない。
【００８６】
実施例１
１）フコース供与体の製造
Ｌ−フコース１１５０ｍｇをピリジン１５ｍｌに溶解して無水酢酸１５ｍｌを加えて、室温で６時間撹拌した。反応溶液にメタノール１５ｍｌを添加することにより過剰の無水酢酸を壊し、生成物を塩化メチレン３０ｍｌで抽出した。次に、抽出液を２Ｎ塩酸３０ｍｌ、飽和炭酸ナトリウム溶液３０ｍｌ及び飽和食塩水３０ｍｌで順次洗浄し、ピリジン及び酢酸を除去した。この溶液を減圧下で乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。
【００８７】
このようにして得られた化合物を塩化メチレン２０ｍｌに溶解し、臭化水素酢酸溶液（２５％（ｗ／ｗ））１．５ｍｌを加えて室温で３０分間撹拌した。反応液に蒸留水２０ｍｌを加えて、試薬を壊し、１位に臭素が導入され他の水酸基はアセチル基で保護された糖供与体を塩化メチレン２０ｍｌで抽出した。抽出液を飽和炭酸ナトリウム溶液２０ｍｌで洗浄して残存する酢酸を除去した。硫酸ナトリウム１０ｇを添加し、水分を除去した後、減圧下で乾燥することにより、下記一般式で示される２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコピラノシルブロミド(2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-fucopyranosyl bromide) （以下、「フコース供与体」と称する）２１００ｍｇを得た。
【００８８】
【化３６】
【００８９】
２）糖受容体の製造
２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-hydroxymethyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol) １０００ｍｇをピリジン１０ｍｌに溶解し、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド９５０ｍｇを加え、室温で５時間撹拌した。この溶液に無水酢酸１ｍｌを加え、室温で５時間撹拌した。氷上で冷やしながら、反応液にメタノール２ｍｌを添加し、過剰の無水酢酸を壊し、２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの６位の水酸基をアセチル基で保護し、２位の水酸基をｔ−ブチルジメチルシリル基で保護した化合物を塩化メチレン２０ｍｌで抽出して、減圧下で乾燥した。この化合物を酢酸水溶液（８０％（ｗ／ｗ））１００ｍｌに溶解し、室温で４８時間撹拌した。反応液にエタノールを添加し、減圧下で共沸させながら、酢酸及び蒸留水を除去した。このようして得られた黄色のシロップ状の化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、下記一般式で示される２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの６位の水酸基のみをアセチル基で保護した、２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−アセテート(2-hydroxymethyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-acetate)（以下、「糖受容体」と称する）１１００ｍｇを得た。
【００９０】
【化３７】
【００９１】
３）配糖体の製造
１）で得られたフコース供与体２１００ｍｇと２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å） ３ｇを加え、室温で３時間撹拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを添加して室温で２４時間撹拌することにより、縮合反応を行った。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。この化合物を５０％メタノール溶液５０ｍｌに溶解してピロガロール２５ｇを加えて、１時間撹拌した後、水酸化ナトリウム２５ｇを添加して室温で３時間撹拌した。反応液に濃塩酸１０ｍｌを添加して中和した後、３０％メタノール溶液で平衡化したカラム（担体：ＸＡＤ−４）にアプライした。溶離液として３０％メタノール溶液を用いて非吸着物を溶出後、１００％メタノール溶液を溶離液としてクロマノール配糖体を溶出した。溶出液を減圧下で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、下記物性を有し、下記一般式で示される２−（β−Ｌ−フコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-L-fucopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)２００ｍｇを得た。
【００９２】
【化３８】
【００９３】
この化合物の赤外線吸収スペクトルを図１に示す。
【００９４】
また、上記化合物の13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【００９５】
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリング）：１１．８
１１．８
１２．７
１６．６
１９．９
２２．４および２２．６
２８．０
７０．０
７０．２
７１．１
７３．１
７３．５
７４．０および７４．０
１０３．８および１０４．０
１１６．８
１２０．３
１２０．９
１２２．６
１４４．３
１４５．２
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３８２ （分子イオンピーク）
比旋光度
【００９６】
【外１】
【００９７】
実施例２
実施例１の１）で得られたフコース供与体２１００ｍｇと、実施例１の２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å） １ｇを加え室温で２時間攪拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを加えて室温で２４時間攪拌することにより、縮合反応を行なった。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。
【００９８】
得られた化合物をメタノール８０ｍｌに溶解した後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）４００ｍｌに加えた。次に、この溶液に、エステラーゼ２０，０００Ｕを加え、３５℃で４８時間反応させた。このときの加水分解率は９０％であった。反応終了後、反応液を遠心分離し（１２０００ｒｐｍ、４℃、５分）、上清から酢酸エチルで配糖体を抽出した。抽出液を減圧下で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、実施例１において得られたものと同様の一般式、赤外吸収スペクトル、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析、および比旋光度の分析結果を有する２−（β−Ｌ−フコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-L-fucopyranosyl)methyl)-2,5,7,8-tetramethylchoman-6-ol)１４００ｍｇを得た。
【００９９】
これより、エステラーゼを用いた酵素分解により脱保護を行う（実施例２、収量：１４００ｍｇ）ことにより、アルカリ分解により脱保護を行う（実施例１、収量：２００ｍｇ）のに比べて、７倍量のクロマノール配糖体が得られた。
【０１００】
実施例３
実施例１の１）で得られたフコース供与体２１００ｍｇと実施例１の２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å） ３ｇを加えて室温で３時間攪拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを添加して室温で２４時間攪拌することにより、縮合反応を行なった。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトクラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。この化合物をテトラヒドロフラン５０ｍｌに溶解して、水素化リチウムアルミニウム２ｇを５０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解させた溶液に冷却しながら滴下した。この混合液を３時間室温で撹拌後、メタノール５０ｍｌを冷却しながら反応液に添加して反応を終了させた。反応液に蒸留水１００ｍｌを加えた後、酢酸エチルで配糖体を抽出した。抽出液を減圧下で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、実施例１において得られたものと同様の一般式、赤外吸収スペクトル、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析、および比旋光度の分析結果を有する２−（β−Ｌ−フコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-L-fucopyranosyl)methyl)-2,5,7,8-tetramethylchoman-6-ol)１６５０ｍｇを得た。
【０１０１】
これより、水素化リチウムアルミニウムを用いて脱保護を行う（実施例３、収量：１６５０ｍｇ）ことにより、アルカリ分解により脱保護を行う（実施例１、収量：２００ｍｇ）のに比べて、８．２５倍量のクロマノール配糖体が得られた。
【０１０２】
実施例４
水素化リチウムアルミニウムの代わりに水素化ジイソブチルアルミニウムを用いた以外は、実施例３と同様にして配糖体の製造を行うことによって、実施例１において得られたものと同様の一般式、赤外吸収スペクトル、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析、および比旋光度の分析結果を有する２−（β−Ｌ−フコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-L-fucopyranosyl)methyl)-2,5,7,8-tetramethylchoman-6-ol)１６５０ｍｇを得た。
【０１０３】
これより、水素化ジイソブチルアルミニウムを用いて脱保護を行う（実施例４、収量：１６５０ｍｇ）ことにより、アルカリ分解により脱保護を行う（実施例１、収量：２００ｍｇ）に比べて、８．２５倍量のクロマノール配糖体が得られた。
【０１０４】
実施例５
実施例１において、Ｌ−フコースの代わりにＬ−ラムノースを用いた以外は、実施例１と同様にして、縮合反応及び分離回収を行うことにより、下記物性を有し、下記一般式で示される２−（α−Ｌ−ラムノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(α-L-rhamnopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)１６０ｍｇを得た。
【０１０５】
【化３９】
【０１０６】
この化合物の赤外線吸収スペクトルを図２に示す。
【０１０７】
また、上記化合物の13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【０１０８】
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリング）：
１１．７
１１．８
１２．７
１７．７および１７．９
１９．８
２１．９および２２．０
２８．４
６８．４および６８．５
７０．４
７０．７
７０．９および７１．１
７１．３
７３．７
１００．１および１００．２
１１６．６
１２０．２
１２１．０
１２２．６
１４４．２
１４５．２
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３８２ （分子イオンピーク）
比旋光度
【０１０９】
【外２】
【０１１０】
実施例６
実施例１において、Ｌ−フコースの代わりにＤ−キシロースを用いた以外は、実施例１と同様にして、縮合反応及び分離回収を行うことにより、下記物性を有し、下記一般式で示される２−（β−Ｄ−キシロピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-D-xylopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)２５０ｍｇを得た。
【０１１１】
【化４０】
【０１１２】
この化合物の赤外線吸収スペクトルを図３に示す。
【０１１３】
また、上記化合物の13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【０１１４】
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリング）：
１１．７
１１．８
１２．７
１９．７および１９．８
２０．７
２２．２および２２．３
２８．０および２８．２
６５．６
６９．５
７３．２
７３．９および７４．０
７６．５
１０３．９および１０４．１
１１６．８
１２０．２
１２０．９
１２２．６
１４４．２
１４５．２
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３６８ （分子イオンピーク）
比旋光度
【０１１５】
【外３】
【０１１６】
実施例７
１）マンノース供与体の製造
Ｄ−マンノース１１５０ｍｇをピリジン１５ｍｌに溶解して無水酢酸１５ｍｌを加えて室温で６時間攪拌した。この反応溶液にメタノール１５ｍｌを加えることにより過剰の無水酢酸を壊し、生成物を塩化メチレン３０ｍｌで抽出した。次に、抽出液を２Ｎ塩酸、飽和炭酸ナトリウム溶液３０ｍｌ及び飽和食塩水３０ｍｌで順次洗浄して、ピリジン及び酢酸を除去した。この溶液を減圧下で乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン，１：１（ｖ／ｖ））で精製した。
【０１１７】
得られた化合物を塩化メチレン２０ｍｌに溶解し、臭化水素酢酸溶液（２５％（ｗ／ｗ））２．５ｍｌを加えて、室温で３０分間攪拌した。反応液に蒸留水２０ｍｌを加えて過剰の試薬を壊し、１位に臭素が導入され他の水酸基はアセチル基で保護された糖供与体を塩化メチレン２０ｍｌで抽出した。抽出液を飽和炭酸ナトリウム溶液２０ｍｌで洗浄して酢酸を除去した。硫酸ナトリウム１０ｇを加え、水分を除去した後、減圧下で乾燥することにより、下記式で示される２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルブロミド(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl bromide)（以下、「マンノース供与体」と称する）２１００ｍｇを得た。
【０１１８】
【化４１】
【０１１９】
２）糖受容体の製造
２−ヒドロキシルメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール１０００ｍｇをピリジン１０ｍｌに溶解し、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド９５０ｍｇを加え、室温で５時間攪拌した。この溶液に無水酢酸１ｍｌを加え室温で５時間攪拌した。氷上で冷やしながら、反応液にメタノール２ｍｌを加え過剰の無水酢酸を壊し、２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの６位の水酸基をアセチル基で保護し、２位の水酸基をｔ−ブチルジメチルシリル基で保護した化合物を塩化メチレン２０ｍｌで抽出して、減圧下で乾燥した。この化合物を酢酸溶液（８０％（ｗ／ｗ））１００ｍｌに溶解し、室温で２４時間攪拌した。反応液にエタノールを加え、減圧下で共沸させながら、酢酸および蒸留水を除去した。このようにして得られた黄色のシロップ状の化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、下記一般式で示される２−ヒドロキシルメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−アセテート(2-hydroxymethyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-acetate)（以下、「糖受容体」と称する）１１００ｍｇを得た。
【０１２０】
【化４２】
【０１２１】
３）配糖体の製造
１）で得られたマンノース供与体２１００ｍｇと２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å） １ｇを加えて室温で２時間攪拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを添加して室温で２４時間攪拌することにより、縮合反応を行なった。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製し、目的とする配糖体の全ての水酸基がアセチル基で保護された化合物を得た。得られた化合物を５０％メタノール溶液５０ｍｌに溶解してピロガロール２５ｇを加えて、室温で１時間攪拌した後、水酸化ナトリウム２５ｇを加えて室温で３時間攪拌した。反応液に濃塩酸１０ｍｌを加え中和した後、３０％メタノール溶液で平衡化したカラム（担対：ＸＡＤ−４）にアプライした。溶離液として３０％メタノール溶液を用いて非吸着物を溶出後、１００％メタノール溶液を溶離液としてクロマノール配糖体を溶出した。溶出液を減圧下で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝６：１（ｖ／ｖ））で精製し下記の物性を有し、下記一般式で示される２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(α-D-mannopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)２００ｍｇを得た。
【０１２２】
【化４３】
【０１２３】
この化合物の赤外線吸収スペクトルを図４に示す。
【０１２４】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【０１２５】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6）：
１．１７および１．２１（ｓ，３Ｈ）
１．６５から１．７４（ｍ，１Ｈ）
１．７７から１．９１（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．１６から４．６９（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．７
１１．８
１２．７
１９．７および１９．８
２１．９および２２．１
２８．２および２８．５
６１．０および６１．２
６６．７および６６．９
７０．２および７０．３
７１．０
７３．８
７３．９
７４．１
１００．１および１００．２
１１６．７
１２０．２および１２０．３
１２０．９
１２２．６
１４４．１および１４４．２
１４５．２
質量スペクトル （ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比施光度：
【０１２６】
【外４】
【０１２７】
実施例８
実施例７の１）で得られたマンノース供与体２１００ｍｇと、実施例７の２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å） １ｇを加え室温で２時間攪拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを加えて室温で２４時間攪拌することにより、縮合反応を行なった。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で目的とする配糖体の全ての水酸基がアセチル基で保護された化合物を精製した。
【０１２８】
得られた化合物をメタノール性１０％塩酸５０ｍｌに溶解して、室温で４時間攪拌した。反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したカラム（担体：ＸＡＤ−４）にアプライした。溶離液として３０％メタノール溶液を用いて非吸着物を溶出後、１００％メタノール溶液を溶離液としてクロマノール配糖体を溶出した。溶出液を減圧下で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝６：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、実施例７において得られたものと同様の赤外吸収スペクトル、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析、および比旋光度の分析結果を呈する２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール１４００ｍｇを得た。
【０１２９】
これより、メタノール性塩酸を用いた酸分解により脱保護を行う（実施例８、収量：１４００ｍｇ）ことにより、アルカリ分解により脱保護を行う（実施例７、収量：２００ｍｇ）に比べて、７倍量のクロマノール配糖体が得られた。
【０１３０】
実施例９
１）ガラクトース供与体の製造
Ｄ−ガラクトース１１５０ｍｇをピリジン１５ｍｌに溶解して無水酢酸１５ｍｌを加えて、室温で６時間攪拌した。反応溶液にメタノール１５ｍｌを添加することにより過剰の無水酢酸を壊し、生成物を塩化メチレン３０ｍｌで抽出した。次に、抽出液を２Ｎ塩酸３０ｍｌ、飽和炭酸ナトリウム溶液３０ｍｌ及び飽和食塩水３０ｍｌで順次洗浄し、ピリジンおよび酢酸を除去した。この溶液を減圧下で乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。
【０１３１】
このようにして得られた化合物を塩化メチレン２０ｍｌに溶解し、臭化水素酢酸溶液（２５％（ｗ／ｗ））１．５ｍｌを加えて、室温で３０分間攪拌した。反応後に蒸留水２０ｍｌを加えて、過剰の試薬を壊し、１位に臭素が導入され他の水酸基はアセチル基で保護された糖供与体を塩化メチレン２０ｍｌで抽出した。抽出液を飽和炭酸ナトリウム溶液２０ｍｌで洗浄して残存する酢酸を除去した。硫酸ナトリウム１０ｇを添加して、水分を除去して後、減圧下で乾燥することにより、下記一般式で示される２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-galactopyranosyl bromide)（以下、「ガラクトース供与体」と称する）２１００ｍｇを得た。
【０１３２】
【化４４】
【０１３３】
２）糖受容体の製造
２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラチルクロマン−６−オール(2-hydroxymethyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol) １００ｍｇをピリジンに溶解し、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド９５０ｍｇを加え、室温で５時間攪拌した。この溶液に無水酢酸２ｍｌを加えて５時間攪拌した。氷上で冷やしながら、反応液にメタノール２ｍｌを添加し、過剰の無水酢酸を壊し、２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの６位の水酸基をアセチル基で保護し、２位の水酸基をｔ−ブチルジメチルシリル基で保護した化合物を塩化メチレン２０ｍｌで抽出して、減圧下で乾燥した。この化合物を酢酸水溶液（８０％（ｗ／ｗ））１００ｍｌに溶解し、室温で４８時間攪拌した。反応液にエタノールを添加し、減圧下で共沸させながら、酢酸及び蒸留水を除去した。このようにして得られた黄色のシロップ状の化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、下記一般式で示される２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの６位の水酸基のみをアセチル基を保護した２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−アセート(2-hydroxymethyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-acetate)（以下、「糖受容体」と称する）１１００ｍｇを得た。
【０１３４】
【化４５】
【０１３５】
３）配糖体の製造
１）で得られたガラクトース供与体２１００ｍｇと２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）３ｇを加え、室温で３時間攪拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを添加して室温で２４時間攪拌することにより、縮合反応を行なった。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。この化合物を５０％メタノール溶液５０ｍｌに溶解してピロガロール２５ｇを加えて、１時間攪拌した後、水酸化ナトリウム２５ｇを添加して室温で３時間攪拌した。反応液に濃硫酸１０ｍｌを添加して中和した後、３０％メタノール溶液で平衡化したカラム（担体：ＸＡＤ−４）にアプライした。溶離液として３０％メタノール溶液を用いて非吸着物を溶出後、１００％メタノール溶液を溶離液としてクロマール配糖体を溶出した。溶出液を減圧下で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸メチル：メタノール＝５：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、下記物性を有し、下記一般式で示される２−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-D-galactopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol) ２００ｍｇを得た。
【０１３６】
【化４６】
【０１３７】
この化合物の赤外線吸収スペクトルを図５に示す。
【０１３８】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【０１３９】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．２１および１．２４（ｓ，３Ｈ）
１．６７から１．７３（ｍ，１Ｈ）
１．９０から１．９３（ｍ，１Ｈ）
１．９８（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０５（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．１７から４．７８（ｍ，１３Ｈ）
７．３８（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 ，プロトンデカップリング）：
１１．７
１１．８
１２．６
１９．７および１９．８
２２．２および２２．５
２８．０および２８．１
６０．３および６０．４
６８．１
７０．５
７３．１および７３．２
７３．４
７３．９および７４．０
７５．１および７５．２
１０４．０および１０４．２
１１６．８
１２０．２
１２０．８
１２２．５
１４４．２
１４５．２
質量スペクトル（ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比施光度：
【０１４０】
【外５】
【０１４１】
実施例１０
実施例９の１）で得られたガラクトース供与体２１００ｍｇと実施例９の２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å） ３ｇを加え、室温で３時間攪拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを添加して室温で２４時間攪拌することにより、縮合反応を行なった。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。この化合物をテトラヒドロフラン５０ｍｌに溶解して、水素化リチウムアルミニウム２ｇを５０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解させた溶液に冷却しながら滴下した。この混合液を３時間室温で撹拌後、メタノール５０ｍｌを冷却しながら反応液に添加して反応を終了させた。沈殿物を濾過して得られた濾液を減圧下で乾燥した。得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝５：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、実施例９において得られたものと同様の一般式、赤外吸収スペクトル、 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析、および比旋光度の分析結果を有する２−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-D-galactopyransosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)１６５０ｍｇを得た。
【０１４２】
これより、水素化リチウムアルミニウムを用いて脱保護を行う（実施例１０、収量：１６５０ｍｇ）ことにより、アルカリ分解により脱保護を行う（実施例９、収量：２００ｍｇ）のに比べて、８．２５倍量のクロマノール配糖体が得られた。
【０１４３】
実施例１１
水素化リチウムアルミニウムの代わりに水素化ジイソブチルアルミニウムを用いた以外は、実施例１０と同様にして配糖体の製造を行うことによって、実施例９において得られたものと同様の一般式、赤外吸収スペクトル、 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析、および比旋光度の分析結果を有する２−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-D-galactopyransosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)１６５０ｍｇを得た。
【０１４４】
これより、水素化ジイソブチルアルミニウムを用いて脱保護を行う（実施例１１、収量：１６５０ｍｇ）ことにより、アルカリ分解により脱保護を行う（実施例９、収量：２００ｍｇ）のに比べて、８．２５倍量のクロマノール配糖体が得られた。
【０１４５】
比較例１
特開平７−１１８，２８７号の実施例１に記載の方法と同様の方法を用いて、下記一般式で示される２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(α-D-glucopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol) を約３００ｍｇ得た。
【０１４６】
【化４７】
【０１４７】
実施例１２：放射線防護作用の評価
実施例１、５及び６ならびに比較例１で得られたクロマノール配糖体を、それぞれ、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％牛胎仔血清＋ＨＥＤＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）系培養液（以下、「完全培養液」と略称する）中に最終濃度が１ｍＭになるように溶解し、クロマノール配糖体溶液を予め調製した。
【０１４８】
次に、マウスのＴリンパ腫株ＥＬ−４細胞を完全培養液中で３７℃、５％ＣＯ2 雰囲気下で継代培養し、細胞密度が２×１０5 個／ｍｌになるように調整した。このようにして培養されたＥＬ−４細胞培養液の上清を除去し、上記クロマノール配糖体溶液をそれぞれ等量加え、Ｘ線を照射するまでの３０分間、上記と同様の条件下で細胞培養を行った。クロマノール配糖体を含む培養液中で所定時間培養した後、３Ｇｙの放射線を０．９２Ｇｙ／分の線量率で照射した。放射線照射終了直後、細胞を遠心沈降（４００ｇ×５分）させ、ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄し、完全培養液で再浮遊させて培養した。これに、サイトカラシンＢのＤＭＳＯ溶液（２ｍｇ／ｍｌ濃度）を最終濃度が３μｇ／ｍｌになるように添加し、２０時間培養後に２核細胞中の小核保有細胞の頻度（小核誘発頻度）を測定し、細胞の放射線損傷の頻度を表わす尺度とした。また、各放射線照射細胞について、上記クロマノール配糖体溶液の濃度を０μｇ／ｍｌとした以外は上記操作を同様に繰り返して得られた比較対照の小核誘発頻度を基準として下記式より小核誘発抑制率を計算した。この際、上記細胞は１群４〜５連で放射線照射実験を行い、結果はこれらの平均値として表わした。結果を表１に示す。
【０１４９】
【数１】
【０１５０】
【表１】
【０１５１】
表１より、実施例１、５および６で得られたクロマノール配糖体の小核誘発頻度は、比較例１で得られたクロマノール配糖体の値に比べて有意に小さく、これより、本発明によるクロマノール配糖体は放射線被爆による細胞の損傷を有効に抑制することが示された。
【０１５２】
【発明の効果】
上述したように、本発明のクロマノール配糖体の製造方法は、アノマー位に脱離基を導入し他の水酸基を保護基で保護した糖の誘導体および一般式（２）で表される２−置換アルコール誘導体の縮合反応からなることを特徴とするものである。したがって、本発明の方法によると、フコースなどの従来の酵素では２−置換アルコール誘導体に転移できない糖を用いたクロマノール配糖体の製造が、簡便な製造及び精製工程により、効率良く可能になる。
【０１５３】
また、発明のクロマノール配糖体の製造方法において、縮合反応後における保護基の脱保護を酸分解により、酵素分解によりまたは金属試薬を用いて、特に、金属試薬を用いて行なうことにより、クロマノール配糖体の分解が効率良く防止され、ゆえに、クロマノール配糖体がさらに高い収率で製造できる。
【０１５４】
さらに、本発明のクロマノール配糖体は、熱やｐＨ安定性及び水溶性及び抗酸化活性に加えて、放射線防護作用にも優れているので、今後、様々な分野における利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１で得られた２−（β−Ｌ−フコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
【図２】 実施例５で得られた２−（α−Ｌ−ラムノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
【図３】 実施例６で得られた２−（β−Ｄ−キシロピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
【図４】 実施例７で得られた２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
【図５】 実施例９で得られた２−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規なクロマノール配糖体の製造方法およびその方法により製造されるクロマノール配糖体に関するものである。より詳しくは、本発明は、有機合成技術を用いたクロマノール配糖体の製造方法およびその方法により製造されるクロマノール配糖体に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
下記一般式：
【０００３】
【化１４】
（ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、Ｘは単糖残基またはオリゴ糖残基を表わし、該糖残基の水酸基の水素原子は低級アルキル基または低級アシル基で置換されていてもよく、ｎは０〜４の整数であり、およびｍは１〜６の整数である）
で表されるクロマノール配糖体は、特開平０７−１１８２８７号において、優れた抗酸化活性、熱やｐＨ安定性及び水溶性を有する化合物であることが報告されている。
【０００５】
また、近年、本発明者らの研究により、上記一般式で表されるクロマノール配糖体は、上記特性の他に放射線防護作用や炎症性腸疾患予防及び治療効果も有することが分かった。
【０００６】
このような種々の優れた特性を有するクロマノール配糖体は、従来、糖転移作用を触媒する酵素を用いて、下記一般式：
【０００７】
【化１５】
（ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わし、およびｎは０〜４の整数である。）
で表される２−置換アルコールと糖とを有機溶媒の存在下において反応させることにより（特開平７−１１８２８７号）または多孔質キトサンビーズにα−グルコシダーゼを固定化させた固定化酵素を用いて、上記一般式で示される２−置換アルコールと糖とを有機溶媒共存下において反応させることにより（特開平９−２４９６８８号）、製造されてきた。
【０００９】
しかしながら、上記の方法は、双方とも、酵素を用いるものであるが、目的の糖を効率よく２−置換アルコールに転移させることができる酵素が入手できる場合には良好に適応できるが、フコース等の糖の種類によっては、糖を２−置換アルコールに転移させて目的とするクロマノール配糖体を生産できる酵素がまだ発見されていない、または知られていても非常に高価であり、かつたとえ目的とするクロマノール配糖体を生産する酵素があったとしても、その反応効率が非常に悪い場合には、収率が悪く経済的に適応できないという問題点があった。
【００１０】
一方、上述したように、クロマノール配糖体には様々な特性があるが、その特性の発現強度は２−置換アルコールに結合する糖の種類によって当然相違する、さらには、クロマノール配糖体を生体に投与する際のクロマノール配糖体のグリコシド結合の安定性や細胞への取り込まれ方にも、結合する糖の種類によって違いが生じることは常識となっている。このため、様々な種類の糖を有するクロマノール配糖体について、目的とする特性（例えば、抗酸化活性、熱安定性、ｐＨ安定性、水溶性、放射線防護作用または炎症性腸疾患予防若しくは治療効果）、グリコシド結合の安定性および細胞への取り込まれ易さ等を検討することは非常に有用である。
【００１１】
したがって、酵素により糖を転移できない、または転移できたとしても効率が悪く目的とするクロマノール配糖体が十分量生産できないなどの欠点を克服するクロマノール配糖体の製造方法に対する要望は強く存在している。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
したがって、本発明の目的は、新規なクロマノール配糖体の製造方法を提供することである。
【００１３】
本発明の他の目的は、酵素により糖を転移できない、または転移できたとしても効率が悪く目的とするクロマノール配糖体が十分量生産できないなどの欠点を克服する有機合成によるクロマノール配糖体の製造方法を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、生成するクロマノール配糖体の分解を防ぎクロマノール配糖体を高い収率で製造する方法を提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる他の目的は、このような方法により製造されるクロマノール配糖体を提供することである。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記事情を鑑みて鋭意研究を行った結果、アノマー位に脱離基を導入し他の水酸基を保護基で保護した糖の誘導体を２−置換アルコール誘導体と縮合させることにより、目的とするクロマノール配糖体を効率良く合成できることを発見した。また、上記に加えて、本発明者らは、上記縮合反応後における保護基の脱保護法に関しても鋭意研究を行った結果、保護基の脱保護を酸分解により、酵素分解によりまたは金属試薬を用いて行うことにより、生成したクロマノール配糖体の分解を効率よく防止し、これによりクロマノール配糖体の収率を向上させることができることを発見した。これらの知見に基づいて、本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、上記諸目的は、下記（イ）から（ヌ）によって達成される。
【００１８】
（イ） アノマー位に脱離基を導入し他の水酸基を保護基で保護した糖の誘導体および一般式（２）：
【００１９】
【化１６】
［ただし、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一または異なる水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、Ｒ５は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、およびｎは０〜４の整数である。］
で表される２−置換アルコール誘導体の縮合反応を有し、前記糖の誘導体が一般式（３）で表されるＬ−フコース供与体、一般式（４）で表されるＬ−ラムノース供与体、一般式（５）で表されるＤ−キシロース供与体、一般式（６）で表されるＤ−ガラクトース供与体または一般式（７）で表されるＤ−マンノース供与体である、
【００２１】
【化１７】
［ただし、式（３）、（４）、（５）、（６）及び（７）中、Ｙはハロゲン原子、硫黄化合物またはトリクロロアセトイミド基を表し、その種類によりα体またはβ体のいずれかの型を優先的にとり、およびＲは同一または異なるアセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブリノイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基またはトリチル基を表す。］
一般式（１）：
【００２４】
【化１８】
［ただし、式中、Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ およびＲ ４ は同一または異なる水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、Ｒ ５ は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、Ｘは単糖残基（但し、糖残基中の水酸基の水素原子はアセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブリノイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基またはトリチル基で置換されていてもよい）を表し、およびｎは０〜４の整数である。］
で表されるクロマノール配糖体の製造方法。
【００２９】
（ロ）前記縮合反応後における保護基の脱保護が酸分解により行われるものである前記（イ）に記載の方法。
【００３０】
（ハ）前記酸分解がメタノール性塩酸またはアルコールに塩酸を添加した溶媒の存在下で行われるものである前記（ロ）に記載の方法。
【００３１】
（ニ）前記縮合反応後における保護基の脱保護が酵素分解により行われるものである前記（イ）に記載の方法。
【００３２】
（ホ）前記酵素分解に使用される酵素がエステラーゼまたはリパーゼである前記（ニ）に記載の方法。
【００３３】
（ヘ）前記縮合反応後における保護基の脱保護が金属試薬を用いて行われるものである前記（イ）に記載の方法。
【００３４】
（ト）前記金属試薬が水素化リチウムアルミニウムまたは水素化ジイソブチルアルミニウムである前記（ヘ）に記載の方法。
【００４５】
【発明の実施の形態】
本発明は、下記一般式（２）：
【００４６】
【化２９】
［ただし、式中、Ｒ1 、Ｒ2 、Ｒ3 およびＲ4 は同一または異なる水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、Ｒ5 は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、およびｎは０〜４の整数である。］
で表される２−置換アルコール誘導体（以下、「糖受容体」と称する）を基質として使用してアノマー位に脱離基を導入し他の水酸基を保護基で保護した糖の誘導体（以下、「糖供与体」と称する）と縮合反応を起こさせて、下記一般式（１）：
【００４８】
【化３０】
［ただし、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は同一または異なる水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、Ｒ５は水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表し、Ｘは単糖残基（但し、糖残基中の水酸基の水素原子はアセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブリノイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基またはトリチル基で置換されていてもよい）を表し、およびｎは０〜４の整数である。］
で表されるクロマノール配糖体を製造することを特徴とするものである。ここで、糖供与体は、上記一般式（３）で表されるＬ−フコース供与体、上記一般式（４）で表されるＬ−ラムノース供与体、上記一般式（５）で表されるＤ−キシロース供与体、上記一般式（６）で表されるＤ−ガラクトース供与体または上記一般式（７）で表されるＤ−マンノース供与体である。
【００５０】
本発明を以下に詳細に説明する。
【００５１】
本発明において、糖供与体は、糖残基のアノマー位に脱離基を導入し、他の水酸基を保護基で保護した糖の誘導体である。この際、アノマー位に導入される脱離基としては、塩素、臭素やフッ素等のハロゲン原子、チオメチル基、チオエチル基やチオフェニル基等の硫黄化合物およびトリクロロアセトイミド基などが挙げられる。これらの脱離基のうち、臭素、塩素、チオメチル基、チオエチル基、チオフェニル基及びトリクロロアセトイミド基が好ましく使用される。
【００５２】
また、本発明において、アノマー位以外の水酸基を保護する保護基としては、アセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基及びレブリノイル基等のアシル系保護基、およびベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基及びトリチル基等のエーテル系保護基が挙げられる。これらの保護基のうち、アシル系保護基、特にアセチル基が好ましくは使用される。
【００５３】
本発明による糖供与体における糖部分は、目的とするクロマノール配糖体の種類によって決まるが、具体的には、Ｄ，Ｌ−グルコース、Ｄ，Ｌ−ガラクトース、Ｄ，Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−キシロース、Ｄ，Ｌ−マンノース、Ｄ，Ｌ−ラムノース、Ｄ，Ｌ−アラビノース、Ｄ，Ｌ−リキソース、Ｄ，Ｌ−リボース、Ｄ，Ｌ−アロース、Ｄ，Ｌ−アルトロース、Ｄ，Ｌ−イドース、Ｄ，Ｌ−タロース、Ｄ，Ｌ−デオキシリボース、Ｄ，Ｌ−２−デオキシリボース、Ｄ，Ｌ−キノボース及びＤ，Ｌ−アベクオースなどが挙げられる。これらのうち、Ｄ，Ｌ−グルコース、Ｄ，Ｌ−ガラクトース、Ｄ，Ｌ−フコース、Ｄ，Ｌ−キシロース、Ｄ，Ｌ−マンノース、Ｄ，Ｌ−ラムノース、Ｄ，Ｌ−アラビノース、Ｄ，Ｌ−リキソース、Ｄ，Ｌ−リボース、Ｄ，Ｌ−タロース、Ｄ，Ｌ−デオキシリボース及びＤ，Ｌ−２−デオキシリボースが好ましく使用され、特に、下記一般式（３）で表されるＬ−フコース供与体、下記一般式（４）で表されるＬ−ラムノース供与体、下記一般式（５）で表されるＤ−キシロース供与体、下記一般式（６）で表されるＤ−ガラクトース供与体または下記一般式（７）で表されるＤ−マンノース供与体が糖供与体として好ましく使用される。
【００５４】
【化３１】
【化３２】
【化３３】
【化３４】
【化３５】
［ただし、式（３）、（４）、（５）、（６）及び（７）中、Ｙはハロゲン原子、硫黄化合物またはトリクロロアセトイミド基を表し、その種類によりα体またはβ体のいずれかの型を優先的にとり、およびＲは同一または異なるアセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブリノイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基またはトリチル基を表す。］
本発明の方法によると、糖供与体の２位の水酸基を上記アシル系保護基で保護して縮合する場合、隣接基効果により、１，２−トランス型のグリコシド結合を有するクロマノール配糖体が得られる。例えば、グルコース、ガラクトース、フコース及びキシロース等の２位の水酸基がエカトリアルで配座しているグルコ型の糖はβ型でアグリコンと結合し、マンノースやラムノース等の２位の水酸基がアキシアルで配座しているマンノ型の糖はα型でアグリコンと結合する。
【００６０】
さらに、本発明におけるクロマノール配糖体及び糖受容体をそれぞれ表すものである、上記一般式（１）及び（２）において、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、同一または異なる水素原子または低級アルキル基を表わすものであるが、低級アルキル基を表わす際には、炭素原子数が好ましくは１〜８、より好ましくは１〜６の低級アルキル基であり、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基及びオクチル基等が挙げられ、これらのうち、メチル基及びエチル基が好ましい。同様にして、Ｒ５は、水素原子、低級アルキル基または低級アシル基を表わすものであるが、これらのうち、低級アルキル基を表わす際には、上記Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４における場合と同様であり、また、低級アシル基を表わす際には、炭素原子数が好ましくは１〜１０、より好ましくは１〜８の低級アシル基であり、例えば、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基及びオクタノイル基等が挙げられ、これらのうち、アセチル基及びプロピオニル基が好ましい。さらに、上記一般式（１）において、Ｘは、グルコース、ガラクトース、フコース、キシロース、マンノース、ラムノース、アラビノース、リキソース、リボース、アロース、アルトロース、イドース、タロース、デオキシリボース、２−デオキシリボース、キノボース及びアベクオース等の単糖残基を表わすが、この際、糖残基中の水酸基の水素原子はアセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブリノイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基またはトリチル基で置換されていてもよい。上記単糖残基のうち、グルコース、ガラクトース、フコース、キシロース、マンノース、ラムノース、アラビノース、リキソース、リボース、タロース、デオキシリボース及び２−デオキシリボースがＸとして好ましく使用され、特にフコース、キシロース及びラムノースが好ましく使用される。さらに、ｎは、０〜４、好ましくは１〜３の整数である。
【００６１】
本発明において、糖受容体は、縮合の際、６位の水酸基をアセチル基、ベンゾイル基、ピバロイル基、クロロアセチル基、レブリノイル基、ベンジル基、ｐ−メトキシベンジル基、アリル基、ｔ−ブチルジメチルシリル基、ｔ−ブチルジフェニルシリル基、トリメチルシリル基及びトリチル基等の保護基、好ましくは、アセチル基やベンゾイル基で保護しておくことが好ましい。
【００６２】
以下に、本発明による糖供与体の調製方法の一実施態様を示す。糖１ｇに対してピリジンを５〜２０ｍｌ、好ましくは１０〜１５ｍｌの割合で加えて溶解させる。さらにこの溶液に、無水酢酸を１０〜２０ｍｌ、好ましくは１５〜２０ｍｌを加えて、室温で３〜８時間、好ましくは５〜７時間撹拌する。次に、この撹拌溶液にメタノールを２０ｍｌ添加することにより過剰の無水酢酸を壊した後、すべての水酸基をアセチル基で保護した糖（以下、「アセチル糖誘導体」と称する）を塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン及びエーテル等の有機溶媒、好ましくは塩化メチレンで抽出する。得られた抽出液を減圧下で濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、アセチル糖誘導体を得る。さらに、このようにして得られたアセチル糖誘導体１ｇに対して塩化メチレンを５〜２０ｍｌ、好ましくは１０〜１５ｍｌの割合で加えて溶解させる。さらにこの溶液に、臭化水素酢酸溶液（２５％（ｗ／ｗ））を０．５〜２ｍｌ、好ましくは１〜１．５ｍｌを添加して、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、１５〜６０分間、好ましくは２０〜３０分間撹拌する。次に、この撹拌溶液に氷上で蒸留水を５〜３０ｍｌ、好ましくは１５〜２０ｍｌ加えて、臭化水素を分解する。この反応液を塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン及びエーテル等の有機溶媒、好ましくは塩化メチレンで抽出する。得られた抽出液を減圧下で濃縮することにより、１位に臭素が導入され他の水酸基はアセチル基で保護された糖供与体（以下、「１−ブロモ糖供与体」と称する）が得られる。
【００６３】
次に、本発明による糖受容体の調製方法の一実施態様を示す。２−置換アルコール１ｇに対してピリジンを５〜２０ｍｌ、好ましくは１０〜１５ｍｌの割合で加えて溶解させる。さらにこの溶液に、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリドを０．７〜１．５ｇ、好ましくは０．９〜１．０ｇ加えて、室温で３〜８時間、好ましくは４〜５時間撹拌する。次いで、この撹拌溶液に無水酢酸を０．８〜２ｍｌ、好ましくは１〜１．５ｍｌ添加して、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、３〜８時間、好ましくは４〜５時間撹拌する。この反応液にメタノールを２ｍｌ加えることにより過剰の無水酢酸を壊した後、６位の水酸基をアセチル基で保護して２位の水酸基をｔ−ブチルジメチルシリル基で保護した２−置換アルコールを得る。このように保護された２−置換アルコールを塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、ベンゼン、トルエン及びエーテル等の有機溶媒、好ましくは塩化メチレンで抽出する。得られた抽出液を減圧下で濃縮して、得られた化合物を酸性条件、例えば、酢酸水溶液（８０％（ｗ／ｗ））中で、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、３６〜５４時間、好ましくは４０〜４８時間撹拌して、ｔ−ブチルジメチルシリル基を脱保護する。脱保護された化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、２−置換アルコールの６位の水酸基のみをアセチル基で保護した糖受容体が得られる。
【００６４】
さらに、本発明による糖供与体及び糖受容体の縮合反応の一実施態様を、上記で得られた糖供与体及び糖受容体について、以下に示す。糖受容体１ｇおよび糖受容体１ｇに対してモル比で１．０〜１．５等量、好ましくは１．２等量の１−ブロモ糖供与体を塩化メチレンやベンゼン等の非極性溶媒に溶解して、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）を２〜４ｇ、好ましくは２．５〜３．０ｇ添加して、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、１〜５時間、好ましくは３時間撹拌する。この反応溶液に無水条件下で活性化剤を添加して、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、１２〜４８時間、好ましくは２０〜３０時間撹拌する。得られた反応液をセライト瀘過してモレキュラーシーブ４Ａ（４Å）及び過塩素酸銀を除去した後、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、すべての水酸基がアセチル基で保護されたクロマノール配糖体（以下、「クロマノール配糖体アセチル誘導体」と称する）が得られる。
【００６５】
本発明において使用される活性化剤としては、三フッ化ホウ酸・エーテル錯体、過塩素酸銀、トリフルオロメタンスルホン酸銀、臭化水銀、シアン化水銀、Ｎ−ヨードコハク酸イミド−トリフルオロメタンスルホン酸、ジメチルメチルチオスルホニウムトリフラート及びｐ−トルエンスルホン酸などが挙げられ、特に、臭素を糖供与体の脱離基として使用した場合には過塩素酸銀等の重金属塩を使用することが好ましい。
【００６６】
また、上記実施態様においては、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製を行ったが、この精製方法に制限されるものではなく、公知の精製方法が使用される。
【００６７】
次いで、以下のようにして、クロマノール配糖体アセチル誘導体の脱保護を行う。
【００６８】
本発明において、上記したような糖供与体と糖受容体との縮合反応後に得られた縮合物、すなわち、水酸基がアセチル基等の保護基で保護されたクロマノール配糖体アセチル誘導体から、保護基を脱離する脱保護法としては、特に限定されるものではなく、例えば、アルカリ分解法、酸分解法、酵素分解法及び金属試薬を用いた脱保護法等の種々の方法を採択できる。
【００６９】
しかしながら、クロマノール配糖体は、その化学的性質によりアルカリ条件下では非常に不安定な化合物であるため、縮合で得られた化合物の脱保護処理を抗酸化剤であるピロガロール共存下でアルカリ分解するといったアルカリ分解法では、クロマノール配糖体の分解が起こり収率が低下するという欠点がある。このため、大量のクロマノール配糖体を合成することを考慮すると、アルカリ分解法による場合に比べて、酸分解法による、酵素分解法による及び金属試薬を用いた脱保護法、特に金属試薬を用いた脱保護法の方が本発明において好ましく使用される。
【００７０】
第一に、縮合物のアセチル基等の保護基の脱保護を酸分解によって行う場合には、クロマノール配糖体の分解が防止され、アルカリ分解により脱保護を行う場合と比較して収率良くクロマノール配糖体を得ることができ、例えば、縮合で得られた化合物をメタノール性塩酸に溶解させる酸分解法はアルカリ分解法に比較して約７倍量の配糖体を得ることが可能となる。しかしながら、上記酸分解による脱保護法では、２−置換アルコールに結合している糖の種類によっては、酸性条件下で、アセチル基の脱保護と同時にグリコシド結合が切断される配糖体もあり、このような場合には良好な収率で配糖体を得ることは困難になってしまう。このため、酸分解による脱保護処理には、酸に安定な配糖体を使用することが好ましく、酸に不安定な配糖体の場合には、酸分解ではなくむしろ酵素分解や金属試薬を用いて脱保護を行なう方法が好ましいといえる。
【００７１】
次に、縮合で得られた化合物のアセチル基などの保護基をエステラーゼ等の酵素により加水分解させて脱保護処理を行う場合には、上記と同様に、クロマノール配糖体の分解は防止され、アルカリ分解により脱保護を行う場合と比較して収率良くクロマノール配糖体を得ることができ、例えば、縮合で得られた化合物をエステラーゼにより加水分解させて脱保護処理を行う方法はアルカリ分解法に比較して約７倍量の配糖体を得ることが可能となる。しかしながら、上記酵素分解による脱保護法では、使用する酵素が高価であり、製造されるクロマノール配糖体のコストが高くなってしまい、経済的でないという問題がある。
【００７２】
これらの脱保護法に対して、金属試薬を使用して縮合物のアセチル基等の脱保護を還元的に行なう場合には、上記と同様に、クロマノール配糖体の分解は防止され、アルカリ分解により脱保護を行う場合と比較して収率良くクロマノール配糖体を得ることができ、例えば、縮合で得られた化合物を水素化リチウムアルミニウムや水素化ジイソブチルアルミニウムを用いて脱保護処理を行う方法はアルカリ分解法に比較して約８．２５倍量の配糖体を得ることが可能となる。また、これらの利点に加えて、金属試薬を用いた脱保護法は、結合する糖の種類に関わらず、全ての配糖体の脱保護に適用が可能であり、かつ高収率で配糖体の製造が可能であるという長所も有する。
【００７３】
本発明による脱保護をアルカリ分解、酸分解、酵素分解および金属試薬を用いる場合に分けて、その一実施態様を、それぞれ、上記で得られたクロマノール配糖体アセチル誘導体を用いて以下に示す。
【００７４】
まず、アルカリ分解によるアセチル基の脱保護を行う場合には、例えば、得られたクロマノール配糖体アセチル誘導体１ｇを蒸留水−メタノール混合溶液（１：１（ｖ／ｖ））２０〜５０ｍｌ、好ましくは２５〜３０ｍｌに溶解して、１０ｇのピロガロールを加えて、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、３０分〜２時間、好ましくは１時間〜１時間３０分間撹拌する。このようにして得られた反応溶液に水酸化ナトリウム１〜２０ｇ、好ましくは８〜１２ｇを加えて、５〜３０℃、好ましくは１０〜２５℃で、１〜４時間、好ましくは２〜３時間撹拌して、アセチル基の脱保護を行い、目的とするクロマノール配糖体が得られる。
【００７５】
次に、酸分解によるアセチル基の脱保護を行う場合には、まず、塩化ナトリウム２０〜１００ｇ、好ましくは４０ｇ〜５０ｇに濃硫酸５０ｍｌ〜２００ｍｌ、好ましくは８０ｍｌ〜１００ｍｌを滴下して発生する塩化水素ガスをメタノール（あらかじめモレキュラーシーブで脱水したもの）に吸収させ、メタノール性塩酸を調製する。このときの塩酸の濃度は５〜１５％が好ましい。そして、クロマノール配糖体アセチル誘導体１ｇを上記のようにして調製されたメタノール性塩酸１０〜５０ｍｌ、好ましくは２０〜３０ｍｌに溶解させて室温で２〜８時間、好ましくは４〜６時間、攪拌してアセチル基を酸分解させる。その後、反応液から目的とするクロマノール配糖体を分離、精製する。
【００７６】
さらに、酵素分解によるアセチル基の脱保護の場合には、緩衝溶液中で加水分解酵素を使用して行なう。この際、アセチル基の脱保護を行なうのに使用される酵素としては、エステラーゼ、例えば、シグマ（ＳＩＧＭＡ）製のブタの肝臓及びウサギの肝臓由来のエステラーゼ、及びリパーゼ、例えば、ブタの膵臓由来のリパーゼなどが挙げられる。
【００７７】
また、上記実施態様において、添加される酵素量は、使用される酵素の種類や反応条件等によって異なるが、例えば、シグマ（ＳＩＧＭＡ）製のブタ肝臓由来のエステラーゼを２ｇのクロマノール配糖体アセチル誘導体を含む反応液５００ｍｌに添加する場合、１０，０００から５０，０００Ｕ、好ましくは２０，０００から４０，０００Ｕである。酵素量が１０，０００Ｕ未満の場合には、酵素による触媒作用が十分でなく好ましくない。これに対して、酵素量が５０，０００Ｕを越える場合には、過度の添加に見合うだけの効果が得られず不経済である。なお、上記で使用されたブタ肝臓由来のエステラーゼの「１Ｕ」とは、基質として酪酸エチルを用い、ｐＨ８．０、２５℃において１分間に１μｍｏｌの酪酸エチルを加水分解する酵素量を意味するものである。
【００７８】
また、酵素分解法による脱保護反応は、縮合で得られたクロマノール配糖体アセチル誘導体を反応溶液に溶解させることが望ましく、そのため、水に対する溶解度が非常に低いクロマノール配糖体アセチル誘導体を溶解し得る有機溶媒を添加する必要がある。同時に、添加される有機溶媒は、エステラーゼの加水分解活性を効率よく発現させることができるものでなければならない。このような条件を満たす有機溶媒としては、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、メタノール、エタノール、およびアセトニトリルなどが挙げられる。例えば、ブタ肝臓由来のエステラーゼを酵素分解反応に使用する際には、エステラーゼの加水分解活性を高めるために、メタノール、エタノールまたはジメチルスルホキシドを使用することが望ましい。添加する有機溶媒の濃度は、使用する酵素の種類などによって、相違するが、例えば、エステラーゼを用いる場合、添加する有機溶媒の濃度は、１０〜２５％、反応効率を考慮すると、好ましくは、１５〜２０％である。有機溶媒濃度が１０％未満の場合には、所望とするクロマノール配糖体を反応溶液に溶解させることが難しく、また、２５％を越える場合には、酵素の安定性が低下し加水分解効率が悪くなるため好ましくない。
【００７９】
さらに、酵素分解法による実施態様において、その反応条件は、使用する酵素やクロマノール配糖体アセチル誘導体の種類や量などによって異なる。例えば、ブタ肝臓由来のエステラーゼを用いる場合、反応系のｐＨは、６．５〜８．５、好ましくは７．５〜８．０である。ｐＨが上記範囲を外れる場合には上述した酵素が失活するなどして好ましくない。また、反応温度に関しても、例えば、ブタ肝臓由来のエステラーゼを用いる場合、２０〜６０℃、好ましくは３０〜４０℃である。反応温度が上記範囲の下限を下回る場合には、使用した酵素の活性が低下し、充分な加水分解率を確保するのに長時間を要するため経済的でなく、また、反応温度が上記範囲の上限を越える場合には、酵素が失活するため好ましくない。さらに、反応時間に関しては、例えば、ブタ肝臓由来のエステラーゼを用いる場合、２〜６０時間、好ましくは１５〜５０時間である。この際、反応時間が２時間未満の場合には、反応が平衡近くに達していないため、充分な加水分解率を得ることができず、また、６０時間を越える場合には、これに見合うだけの更なる効果が期待できないため、好ましくない。
【００８０】
最後に、金属試薬を用いたアセチル基の脱保護は、具体的には、金属試薬を溶解させた有機溶媒中に縮合で得られた化合物を添加して反応させる簡単な方法である。より詳しく述べると、まず、縮合で得られた上記クロマノール配糖体アセチル誘導体１ｇを５０〜１００ｍｌの非極性溶媒に溶解する。この溶液を、糖アセチル誘導体１ｇに対して、０．５ｇ〜３ｇ、好ましくは０．７５ｇ〜１．２５ｇの金属試薬を予め溶解した非極性溶媒５０〜１００ｍｌに、冷却しながら、１〜２時間にわたって滴下する。滴下後、この混合液を室温で１〜６時間、好ましくは２〜４時間攪拌してアセチル基の脱保護を行なう。反応液から目的とするクロマノール配糖体を分離精製する。
【００８１】
この際反応に使用される金属試薬としては、水素化リチウムアルミニウム（ＬｉＡｌＨ4 ）およびそのトリアルコキシ誘導体（ＬｉＡｌＨ（ＯＲ）3 、この際、Ｒは炭素原子数１〜４のアルキル基を表す）、水素化ジイソブチルアルミニウム（（ｉ−Ｃ4 Ｈ9 ）2 ＡｌＨ）、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ4 ）及び水素化ホウ素リチウム（ＬｉＢＨ4 ）等が挙げられる。これらのうち、水素化リチウムアルミニウム（ＬｉＡＬＨ4 ）及び水素化ジイソブチルアルミニウム（（ｉ−Ｃ4 Ｈ9 ）2 ＡｌＨ）が好ましく使用される。
【００８２】
また、上記実施態様において使用される非極性溶媒としては、例えば、エーテル、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、トルエン、ベンゼン及びヘキサンなどが挙げられる。これらのうち、テトラヒドロフランが非極性溶媒として好ましく使用される。
【００８３】
上記したようにして反応が終了した後、反応液から脱保護により得られた目的とするクロマノール配糖体を分離、精製することにより高純度のクロマノール配糖体が得られる。
【００８４】
このようにして、非極性溶媒中に糖供与体及び糖受容体を溶解し、無水条件下で活性化剤の存在下で糖供与体及び糖受容体の縮合反応を行い、得られた化合物を精製し、保護基を脱保護するという簡便な工程により、本発明のクロマノール配糖体が高い収率で製造できる。
【００８５】
【実施例】
次に、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、これらにより本発明の範囲がなんら制限されるものでないことはいうまでもない。
【００８６】
実施例１
１）フコース供与体の製造
Ｌ−フコース１１５０ｍｇをピリジン１５ｍｌに溶解して無水酢酸１５ｍｌを加えて、室温で６時間撹拌した。反応溶液にメタノール１５ｍｌを添加することにより過剰の無水酢酸を壊し、生成物を塩化メチレン３０ｍｌで抽出した。次に、抽出液を２Ｎ塩酸３０ｍｌ、飽和炭酸ナトリウム溶液３０ｍｌ及び飽和食塩水３０ｍｌで順次洗浄し、ピリジン及び酢酸を除去した。この溶液を減圧下で乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。
【００８７】
このようにして得られた化合物を塩化メチレン２０ｍｌに溶解し、臭化水素酢酸溶液（２５％（ｗ／ｗ））１．５ｍｌを加えて室温で３０分間撹拌した。反応液に蒸留水２０ｍｌを加えて、試薬を壊し、１位に臭素が導入され他の水酸基はアセチル基で保護された糖供与体を塩化メチレン２０ｍｌで抽出した。抽出液を飽和炭酸ナトリウム溶液２０ｍｌで洗浄して残存する酢酸を除去した。硫酸ナトリウム１０ｇを添加し、水分を除去した後、減圧下で乾燥することにより、下記一般式で示される２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−フコピラノシルブロミド(2,3,4-tri-O-acetyl-α-L-fucopyranosyl bromide) （以下、「フコース供与体」と称する）２１００ｍｇを得た。
【００８８】
【化３６】
２）糖受容体の製造
２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-hydroxymethyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol) １０００ｍｇをピリジン１０ｍｌに溶解し、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド９５０ｍｇを加え、室温で５時間撹拌した。この溶液に無水酢酸１ｍｌを加え、室温で５時間撹拌した。氷上で冷やしながら、反応液にメタノール２ｍｌを添加し、過剰の無水酢酸を壊し、２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの６位の水酸基をアセチル基で保護し、２位の水酸基をｔ−ブチルジメチルシリル基で保護した化合物を塩化メチレン２０ｍｌで抽出して、減圧下で乾燥した。この化合物を酢酸水溶液（８０％（ｗ／ｗ））１００ｍｌに溶解し、室温で４８時間撹拌した。反応液にエタノールを添加し、減圧下で共沸させながら、酢酸及び蒸留水を除去した。このようして得られた黄色のシロップ状の化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、下記一般式で示される２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの６位の水酸基のみをアセチル基で保護した、２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−アセテート(2-hydroxymethyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-acetate)（以下、「糖受容体」と称する）１１００ｍｇを得た。
【００９０】
【化３７】
３）配糖体の製造
１）で得られたフコース供与体２１００ｍｇと２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å） ３ｇを加え、室温で３時間撹拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを添加して室温で２４時間撹拌することにより、縮合反応を行った。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。この化合物を５０％メタノール溶液５０ｍｌに溶解してピロガロール２５ｇを加えて、１時間撹拌した後、水酸化ナトリウム２５ｇを添加して室温で３時間撹拌した。反応液に濃塩酸１０ｍｌを添加して中和した後、３０％メタノール溶液で平衡化したカラム（担体：ＸＡＤ−４）にアプライした。溶離液として３０％メタノール溶液を用いて非吸着物を溶出後、１００％メタノール溶液を溶離液としてクロマノール配糖体を溶出した。溶出液を減圧下で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、下記物性を有し、下記一般式で示される２−（β−Ｌ−フコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-L-fucopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)２００ｍｇを得た。
【００９２】
【化３８】
この化合物の赤外線吸収スペクトルを図１に示す。
【００９４】
また、上記化合物の13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【００９５】
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリング）：１１．８
１１．８
１２．７
１６．６
１９．９
２２．４および２２．６
２８．０
７０．０
７０．２
７１．１
７３．１
７３．５
７４．０および７４．０
１０３．８および１０４．０
１１６．８
１２０．３
１２０．９
１２２．６
１４４．３
１４５．２
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３８２ （分子イオンピーク）
比旋光度
【００９６】
【外１】
実施例２
実施例１の１）で得られたフコース供与体２１００ｍｇと、実施例１の２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å） １ｇを加え室温で２時間攪拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを加えて室温で２４時間攪拌することにより、縮合反応を行なった。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。
【００９８】
得られた化合物をメタノール８０ｍｌに溶解した後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）４００ｍｌに加えた。次に、この溶液に、エステラーゼ２０，０００Ｕを加え、３５℃で４８時間反応させた。このときの加水分解率は９０％であった。反応終了後、反応液を遠心分離し（１２０００ｒｐｍ、４℃、５分）、上清から酢酸エチルで配糖体を抽出した。抽出液を減圧下で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、実施例１において得られたものと同様の一般式、赤外吸収スペクトル、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析、および比旋光度の分析結果を有する２−（β−Ｌ−フコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-L-fucopyranosyl)methyl)-2,5,7,8-tetramethylchoman-6-ol)１４００ｍｇを得た。
【００９９】
これより、エステラーゼを用いた酵素分解により脱保護を行う（実施例２、収量：１４００ｍｇ）ことにより、アルカリ分解により脱保護を行う（実施例１、収量：２００ｍｇ）のに比べて、７倍量のクロマノール配糖体が得られた。
【０１００】
実施例３
実施例１の１）で得られたフコース供与体２１００ｍｇと実施例１の２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å） ３ｇを加えて室温で３時間攪拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを添加して室温で２４時間攪拌することにより、縮合反応を行なった。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトクラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。この化合物をテトラヒドロフラン５０ｍｌに溶解して、水素化リチウムアルミニウム２ｇを５０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解させた溶液に冷却しながら滴下した。この混合液を３時間室温で撹拌後、メタノール５０ｍｌを冷却しながら反応液に添加して反応を終了させた。反応液に蒸留水１００ｍｌを加えた後、酢酸エチルで配糖体を抽出した。抽出液を減圧下で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝８：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、実施例１において得られたものと同様の一般式、赤外吸収スペクトル、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析、および比旋光度の分析結果を有する２−（β−Ｌ−フコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-L-fucopyranosyl)methyl)-2,5,7,8-tetramethylchoman-6-ol)１６５０ｍｇを得た。
【０１０１】
これより、水素化リチウムアルミニウムを用いて脱保護を行う（実施例３、収量：１６５０ｍｇ）ことにより、アルカリ分解により脱保護を行う（実施例１、収量：２００ｍｇ）のに比べて、８．２５倍量のクロマノール配糖体が得られた。
【０１０２】
実施例４
水素化リチウムアルミニウムの代わりに水素化ジイソブチルアルミニウムを用いた以外は、実施例３と同様にして配糖体の製造を行うことによって、実施例１において得られたものと同様の一般式、赤外吸収スペクトル、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析、および比旋光度の分析結果を有する２−（β−Ｌ−フコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-L-fucopyranosyl)methyl)-2,5,7,8-tetramethylchoman-6-ol)１６５０ｍｇを得た。
【０１０３】
これより、水素化ジイソブチルアルミニウムを用いて脱保護を行う（実施例４、収量：１６５０ｍｇ）ことにより、アルカリ分解により脱保護を行う（実施例１、収量：２００ｍｇ）に比べて、８．２５倍量のクロマノール配糖体が得られた。
【０１０４】
実施例５
実施例１において、Ｌ−フコースの代わりにＬ−ラムノースを用いた以外は、実施例１と同様にして、縮合反応及び分離回収を行うことにより、下記物性を有し、下記一般式で示される２−（α−Ｌ−ラムノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(α-L-rhamnopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)１６０ｍｇを得た。
【０１０５】
【化３９】
この化合物の赤外線吸収スペクトルを図２に示す。
【０１０７】
また、上記化合物の13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【０１０８】
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリング）：
１１．７
１１．８
１２．７
１７．７および１７．９
１９．８
２１．９および２２．０
２８．４
６８．４および６８．５
７０．４
７０．７
７０．９および７１．１
７１．３
７３．７
１００．１および１００．２
１１６．６
１２０．２
１２１．０
１２２．６
１４４．２
１４５．２
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３８２ （分子イオンピーク）
比旋光度
【０１０９】
【外２】
実施例６
実施例１において、Ｌ−フコースの代わりにＤ−キシロースを用いた以外は、実施例１と同様にして、縮合反応及び分離回収を行うことにより、下記物性を有し、下記一般式で示される２−（β−Ｄ−キシロピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-D-xylopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)２５０ｍｇを得た。
【０１１１】
【化４０】
この化合物の赤外線吸収スペクトルを図３に示す。
【０１１３】
また、上記化合物の13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【０１１４】
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリング）：
１１．７
１１．８
１２．７
１９．７および１９．８
２０．７
２２．２および２２．３
２８．０および２８．２
６５．６
６９．５
７３．２
７３．９および７４．０
７６．５
１０３．９および１０４．１
１１６．８
１２０．２
１２０．９
１２２．６
１４４．２
１４５．２
質量スペクトル（ＦＡＢ）
ｍ／ｚ ３６８ （分子イオンピーク）
比旋光度
【０１１５】
【外３】
実施例７
１）マンノース供与体の製造
Ｄ−マンノース１１５０ｍｇをピリジン１５ｍｌに溶解して無水酢酸１５ｍｌを加えて室温で６時間攪拌した。この反応溶液にメタノール１５ｍｌを加えることにより過剰の無水酢酸を壊し、生成物を塩化メチレン３０ｍｌで抽出した。次に、抽出液を２Ｎ塩酸、飽和炭酸ナトリウム溶液３０ｍｌ及び飽和食塩水３０ｍｌで順次洗浄して、ピリジン及び酢酸を除去した。この溶液を減圧下で乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン，１：１（ｖ／ｖ））で精製した。
【０１１７】
得られた化合物を塩化メチレン２０ｍｌに溶解し、臭化水素酢酸溶液（２５％（ｗ／ｗ））２．５ｍｌを加えて、室温で３０分間攪拌した。反応液に蒸留水２０ｍｌを加えて過剰の試薬を壊し、１位に臭素が導入され他の水酸基はアセチル基で保護された糖供与体を塩化メチレン２０ｍｌで抽出した。抽出液を飽和炭酸ナトリウム溶液２０ｍｌで洗浄して酢酸を除去した。硫酸ナトリウム１０ｇを加え、水分を除去した後、減圧下で乾燥することにより、下記式で示される２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシルブロミド(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-mannopyranosyl bromide)（以下、「マンノース供与体」と称する）２１００ｍｇを得た。
【０１１８】
【化４１】
２）糖受容体の製造
２−ヒドロキシルメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール１０００ｍｇをピリジン１０ｍｌに溶解し、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド９５０ｍｇを加え、室温で５時間攪拌した。この溶液に無水酢酸１ｍｌを加え室温で５時間攪拌した。氷上で冷やしながら、反応液にメタノール２ｍｌを加え過剰の無水酢酸を壊し、２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの６位の水酸基をアセチル基で保護し、２位の水酸基をｔ−ブチルジメチルシリル基で保護した化合物を塩化メチレン２０ｍｌで抽出して、減圧下で乾燥した。この化合物を酢酸溶液（８０％（ｗ／ｗ））１００ｍｌに溶解し、室温で２４時間攪拌した。反応液にエタノールを加え、減圧下で共沸させながら、酢酸および蒸留水を除去した。このようにして得られた黄色のシロップ状の化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、下記一般式で示される２−ヒドロキシルメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−アセテート(2-hydroxymethyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-acetate)（以下、「糖受容体」と称する）１１００ｍｇを得た。
【０１２０】
【化４２】
３）配糖体の製造
１）で得られたマンノース供与体２１００ｍｇと２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å） １ｇを加えて室温で２時間攪拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを添加して室温で２４時間攪拌することにより、縮合反応を行なった。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製し、目的とする配糖体の全ての水酸基がアセチル基で保護された化合物を得た。得られた化合物を５０％メタノール溶液５０ｍｌに溶解してピロガロール２５ｇを加えて、室温で１時間攪拌した後、水酸化ナトリウム２５ｇを加えて室温で３時間攪拌した。反応液に濃塩酸１０ｍｌを加え中和した後、３０％メタノール溶液で平衡化したカラム（担対：ＸＡＤ−４）にアプライした。溶離液として３０％メタノール溶液を用いて非吸着物を溶出後、１００％メタノール溶液を溶離液としてクロマノール配糖体を溶出した。溶出液を減圧下で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝６：１（ｖ／ｖ））で精製し下記の物性を有し、下記一般式で示される２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(α-D-mannopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)２００ｍｇを得た。
【０１２２】
【化４３】
この化合物の赤外線吸収スペクトルを図４に示す。
【０１２４】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【０１２５】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（３００ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6）：
１．１７および１．２１（ｓ，３Ｈ）
１．６５から１．７４（ｍ，１Ｈ）
１．７７から１．９１（ｍ，１Ｈ）
１．９７（ｓ，３Ｈ）
２．０１（ｓ，３Ｈ）
２．０４（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．１６から４．６９（ｍ，１３Ｈ）
７．３９（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（７５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 、プロトンデカップリングスペクトル）：
１１．７
１１．８
１２．７
１９．７および１９．８
２１．９および２２．１
２８．２および２８．５
６１．０および６１．２
６６．７および６６．９
７０．２および７０．３
７１．０
７３．８
７３．９
７４．１
１００．１および１００．２
１１６．７
１２０．２および１２０．３
１２０．９
１２２．６
１４４．１および１４４．２
１４５．２
質量スペクトル （ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比施光度：
【０１２６】
【外４】
実施例８
実施例７の１）で得られたマンノース供与体２１００ｍｇと、実施例７の２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å） １ｇを加え室温で２時間攪拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを加えて室温で２４時間攪拌することにより、縮合反応を行なった。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で目的とする配糖体の全ての水酸基がアセチル基で保護された化合物を精製した。
【０１２８】
得られた化合物をメタノール性１０％塩酸５０ｍｌに溶解して、室温で４時間攪拌した。反応液を３０％メタノール溶液で平衡化したカラム（担体：ＸＡＤ−４）にアプライした。溶離液として３０％メタノール溶液を用いて非吸着物を溶出後、１００％メタノール溶液を溶離液としてクロマノール配糖体を溶出した。溶出液を減圧下で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝６：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、実施例７において得られたものと同様の赤外吸収スペクトル、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析、および比旋光度の分析結果を呈する２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール１４００ｍｇを得た。
【０１２９】
これより、メタノール性塩酸を用いた酸分解により脱保護を行う（実施例８、収量：１４００ｍｇ）ことにより、アルカリ分解により脱保護を行う（実施例７、収量：２００ｍｇ）に比べて、７倍量のクロマノール配糖体が得られた。
【０１３０】
実施例９
１）ガラクトース供与体の製造
Ｄ−ガラクトース１１５０ｍｇをピリジン１５ｍｌに溶解して無水酢酸１５ｍｌを加えて、室温で６時間攪拌した。反応溶液にメタノール１５ｍｌを添加することにより過剰の無水酢酸を壊し、生成物を塩化メチレン３０ｍｌで抽出した。次に、抽出液を２Ｎ塩酸３０ｍｌ、飽和炭酸ナトリウム溶液３０ｍｌ及び飽和食塩水３０ｍｌで順次洗浄し、ピリジンおよび酢酸を除去した。この溶液を減圧下で乾燥し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。
【０１３１】
このようにして得られた化合物を塩化メチレン２０ｍｌに溶解し、臭化水素酢酸溶液（２５％（ｗ／ｗ））１．５ｍｌを加えて、室温で３０分間攪拌した。反応後に蒸留水２０ｍｌを加えて、過剰の試薬を壊し、１位に臭素が導入され他の水酸基はアセチル基で保護された糖供与体を塩化メチレン２０ｍｌで抽出した。抽出液を飽和炭酸ナトリウム溶液２０ｍｌで洗浄して残存する酢酸を除去した。硫酸ナトリウム１０ｇを添加して、水分を除去して後、減圧下で乾燥することにより、下記一般式で示される２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−ガラクトピラノシルブロミド(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-α-D-galactopyranosyl bromide)（以下、「ガラクトース供与体」と称する）２１００ｍｇを得た。
【０１３２】
【化４４】
２）糖受容体の製造
２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラチルクロマン−６−オール(2-hydroxymethyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol) １００ｍｇをピリジンに溶解し、ｔ−ブチルジメチルシリルクロリド９５０ｍｇを加え、室温で５時間攪拌した。この溶液に無水酢酸２ｍｌを加えて５時間攪拌した。氷上で冷やしながら、反応液にメタノール２ｍｌを添加し、過剰の無水酢酸を壊し、２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの６位の水酸基をアセチル基で保護し、２位の水酸基をｔ−ブチルジメチルシリル基で保護した化合物を塩化メチレン２０ｍｌで抽出して、減圧下で乾燥した。この化合物を酢酸水溶液（８０％（ｗ／ｗ））１００ｍｌに溶解し、室温で４８時間攪拌した。反応液にエタノールを添加し、減圧下で共沸させながら、酢酸及び蒸留水を除去した。このようにして得られた黄色のシロップ状の化合物をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、下記一般式で示される２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの６位の水酸基のみをアセチル基を保護した２−ヒドロキシメチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−アセート(2-hydroxymethyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-acetate)（以下、「糖受容体」と称する）１１００ｍｇを得た。
【０１３４】
【化４５】
３）配糖体の製造
１）で得られたガラクトース供与体２１００ｍｇと２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）３ｇを加え、室温で３時間攪拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを添加して室温で２４時間攪拌することにより、縮合反応を行なった。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。この化合物を５０％メタノール溶液５０ｍｌに溶解してピロガロール２５ｇを加えて、１時間攪拌した後、水酸化ナトリウム２５ｇを添加して室温で３時間攪拌した。反応液に濃硫酸１０ｍｌを添加して中和した後、３０％メタノール溶液で平衡化したカラム（担体：ＸＡＤ−４）にアプライした。溶離液として３０％メタノール溶液を用いて非吸着物を溶出後、１００％メタノール溶液を溶離液としてクロマール配糖体を溶出した。溶出液を減圧下で乾燥した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸メチル：メタノール＝５：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、下記物性を有し、下記一般式で示される２−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-D-galactopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol) ２００ｍｇを得た。
【０１３６】
【化４６】
この化合物の赤外線吸収スペクトルを図５に示す。
【０１３８】
また、上記化合物の 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析及び比旋光度の結果は以下のとおりである。
【０１３９】
1Ｈ−ＮＭＲ δ（２７０ＭＨｚ， ＤＭＳＯ−ｄ6 ）：
１．２１および１．２４（ｓ，３Ｈ）
１．６７から１．７３（ｍ，１Ｈ）
１．９０から１．９３（ｍ，１Ｈ）
１．９８（ｓ，３Ｈ）
２．０２（ｓ，３Ｈ）
２．０５（ｓ，３Ｈ）
２．５０（ｂｒｏａｄ ｔ，２Ｈ）
３．１７から４．７８（ｍ，１３Ｈ）
７．３８（ｓ，１Ｈ）
13Ｃ−ＮＭＲ δ（６７．８ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ6 ，プロトンデカップリング）：
１１．７
１１．８
１２．６
１９．７および１９．８
２２．２および２２．５
２８．０および２８．１
６０．３および６０．４
６８．１
７０．５
７３．１および７３．２
７３．４
７３．９および７４．０
７５．１および７５．２
１０４．０および１０４．２
１１６．８
１２０．２
１２０．８
１２２．５
１４４．２
１４５．２
質量スペクトル（ＦＡＢ）：
ｍ／ｚ ３９８ （分子イオンピーク）
比施光度：
【０１４０】
【外５】
実施例１０
実施例９の１）で得られたガラクトース供与体２１００ｍｇと実施例９の２）で得られた糖受容体１１００ｍｇを塩化メチレン１０ｍｌに溶解し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å） ３ｇを加え、室温で３時間攪拌した後、過塩素酸銀１２００ｍｇと炭酸銀１６００ｍｇを添加して室温で２４時間攪拌することにより、縮合反応を行なった。縮合後、反応液をセライト濾過し、モレキュラーシーブ４Ａ（４Å）、過塩素酸銀及び炭酸銀を除去した後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：ヘキサン＝１：１（ｖ／ｖ））で精製した。この化合物をテトラヒドロフラン５０ｍｌに溶解して、水素化リチウムアルミニウム２ｇを５０ｍｌのテトラヒドロフランに溶解させた溶液に冷却しながら滴下した。この混合液を３時間室温で撹拌後、メタノール５０ｍｌを冷却しながら反応液に添加して反応を終了させた。沈殿物を濾過して得られた濾液を減圧下で乾燥した。得られた残査をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝５：１（ｖ／ｖ））で精製することにより、実施例９において得られたものと同様の一般式、赤外吸収スペクトル、 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析、および比旋光度の分析結果を有する２−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-D-galactopyransosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)１６５０ｍｇを得た。
【０１４２】
これより、水素化リチウムアルミニウムを用いて脱保護を行う（実施例１０、収量：１６５０ｍｇ）ことにより、アルカリ分解により脱保護を行う（実施例９、収量：２００ｍｇ）のに比べて、８．２５倍量のクロマノール配糖体が得られた。
【０１４３】
実施例１１
水素化リチウムアルミニウムの代わりに水素化ジイソブチルアルミニウムを用いた以外は、実施例１０と同様にして配糖体の製造を行うことによって、実施例９において得られたものと同様の一般式、赤外吸収スペクトル、 1Ｈ−ＮＭＲ、13Ｃ−ＮＭＲ、質量分析、および比旋光度の分析結果を有する２−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(β-D-galactopyransosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol)１６５０ｍｇを得た。
【０１４４】
これより、水素化ジイソブチルアルミニウムを用いて脱保護を行う（実施例１１、収量：１６５０ｍｇ）ことにより、アルカリ分解により脱保護を行う（実施例９、収量：２００ｍｇ）のに比べて、８．２５倍量のクロマノール配糖体が得られた。
【０１４５】
比較例１
特開平７−１１８，２８７号の実施例１に記載の方法と同様の方法を用いて、下記一般式で示される２−（α−Ｄ−グルコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オール(2-(α-D-glucopyranosyl)methyl-2,5,7,8-tetramethylchroman-6-ol) を約３００ｍｇ得た。
【０１４６】
【化４７】
実施例１２：放射線防護作用の評価
実施例１、５及び６ならびに比較例１で得られたクロマノール配糖体を、それぞれ、ＲＰＭＩ−１６４０＋１０％牛胎仔血清＋ＨＥＤＥＳ緩衝液（２５ｍＭ）系培養液（以下、「完全培養液」と略称する）中に最終濃度が１ｍＭになるように溶解し、クロマノール配糖体溶液を予め調製した。
【０１４８】
次に、マウスのＴリンパ腫株ＥＬ−４細胞を完全培養液中で３７℃、５％ＣＯ2 雰囲気下で継代培養し、細胞密度が２×１０5 個／ｍｌになるように調整した。このようにして培養されたＥＬ−４細胞培養液の上清を除去し、上記クロマノール配糖体溶液をそれぞれ等量加え、Ｘ線を照射するまでの３０分間、上記と同様の条件下で細胞培養を行った。クロマノール配糖体を含む培養液中で所定時間培養した後、３Ｇｙの放射線を０．９２Ｇｙ／分の線量率で照射した。放射線照射終了直後、細胞を遠心沈降（４００ｇ×５分）させ、ＲＰＭＩ−１６４０で２回洗浄し、完全培養液で再浮遊させて培養した。これに、サイトカラシンＢのＤＭＳＯ溶液（２ｍｇ／ｍｌ濃度）を最終濃度が３μｇ／ｍｌになるように添加し、２０時間培養後に２核細胞中の小核保有細胞の頻度（小核誘発頻度）を測定し、細胞の放射線損傷の頻度を表わす尺度とした。また、各放射線照射細胞について、上記クロマノール配糖体溶液の濃度を０μｇ／ｍｌとした以外は上記操作を同様に繰り返して得られた比較対照の小核誘発頻度を基準として下記式より小核誘発抑制率を計算した。この際、上記細胞は１群４〜５連で放射線照射実験を行い、結果はこれらの平均値として表わした。結果を表１に示す。
【０１４９】
【数１】
【表１】
表１より、実施例１、５および６で得られたクロマノール配糖体の小核誘発頻度は、比較例１で得られたクロマノール配糖体の値に比べて有意に小さく、これより、本発明によるクロマノール配糖体は放射線被爆による細胞の損傷を有効に抑制することが示された。
【０１５２】
【発明の効果】
上述したように、本発明のクロマノール配糖体の製造方法は、アノマー位に脱離基を導入し他の水酸基を保護基で保護した糖の誘導体および一般式（２）で表される２−置換アルコール誘導体の縮合反応からなることを特徴とするものである。したがって、本発明の方法によると、フコースなどの従来の酵素では２−置換アルコール誘導体に転移できない糖を用いたクロマノール配糖体の製造が、簡便な製造及び精製工程により、効率良く可能になる。
【０１５３】
また、発明のクロマノール配糖体の製造方法において、縮合反応後における保護基の脱保護を酸分解により、酵素分解によりまたは金属試薬を用いて、特に、金属試薬を用いて行なうことにより、クロマノール配糖体の分解が効率良く防止され、ゆえに、クロマノール配糖体がさらに高い収率で製造できる。
【０１５４】
さらに、本発明のクロマノール配糖体は、熱やｐＨ安定性及び水溶性及び抗酸化活性に加えて、放射線防護作用にも優れているので、今後、様々な分野における利用が期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】 実施例１で得られた２−（β−Ｌ−フコピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
【図２】 実施例５で得られた２−（α−Ｌ−ラムノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
【図３】 実施例６で得られた２−（β−Ｄ−キシロピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
【図４】 実施例７で得られた２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
【図５】 実施例９で得られた２−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）メチル−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−６−オールの赤外線吸収スペクトルである。
Claims (3)
- アノマー位に脱離基を導入し他の水酸基を保護基で保護した糖の誘導体および一般式（２）：
で表される２−置換アルコール誘導体の縮合反応を有し、前記糖の誘導体が一般式（３）で表されるＬ−フコース供与体、一般式（４）で表されるＬ−ラムノース供与体、一般式（５）で表されるＤ−キシロース供与体、一般式（６）で表されるＤ−ガラクトース供与体または一般式（７）で表されるＤ−マンノース供与体である、
一般式（１）：
で表されるクロマノール配糖体の製造方法。 - 前記縮合反応後における保護基の脱保護が酸分解により、酵素分解により、または金属試薬を用いて行われる、請求項１に記載の方法。
- 前記縮合反応後における保護基の脱保護が金属試薬を用いて行われる、請求項２に記載の方法。
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