JP4316677B2 - 単一分子種の構造化された自己組織型単分子膜、特に物質ライブラリの作製方法 - Google Patents

Description

本発明は単一分子種の構造化された自己組織型単分子膜の製造方法に関する。本発明の望ましい応用は、分子間相互作用の試験のための、固相で結合された物質ライブラリまたはその他のアッセイの作製である。
分子レベルで相互作用する相手を迅速に発見するために有用なこの種のライブラリは公知であり、本発明と最も類似した先行技術により作成することができる。たとえば表面に分子反応の相手を載せたマイクロビーズ（微小球）の使用が知られている。またいわゆるミックス・アンド・スプリット法（Erb,E.;Jander.K.D.;Brenner,S.:Recursive Deconvolution of Combinatorial Chemical Libraries,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,p.11422-6（1994））による上記ライブラリの構築方法も知られている。
各成分の位置（x方向およびy方向の）が一義的に確定している固相結合ライブラリには特別の利点がある。このようなライブラリを大量に作製するには、たとえば改造したビーム（インクジェット）プリンタを用いて、相互に組み合わせるべき物質を基板上に点状に吹き付けることができる（Shcober,A.;Guenther,R.;Schwienhorst,A.;Doering,M.;Lindemann,B.F.:Accurate high-speed liquid Handling of very small biological samples、Biotechniques 15,p.324-9,1993）。このようなライブラリを並行的に作製するには、多数の細いチャンネルを備えたヘッドを表面に当て、同時に多数の微小反応領域としても作用する、いわゆる「アプリケータ」を使用する必要がある（US 5,429,807参照）。上記の目的のためにはまた、光活性化可能な保護基の利用（US 5,489,678）およびスタンプ法（DE 195 43 232.0）も知られている。
これら公知の方法および装置には、原理的な欠陥がある。すなわち、
ビームプリンタを使用する場合は、プロセスが直列的に進行するため、同一物質を用いて多数の表面要素を同時に扱うことができない。いわゆるアプリケータは小型化に技術的な限界がある。物質の移動に表面に構造や凹凸を持たせたスタンプを利用するスタンプ合成法は、正確な位置決めが極めて困難であり、再現性のある多重合成は事実上不可能である。
光で活性化される保護基を利用した複雑な化学的方法では、反応段階の効率を高めようとすれば長い照射時間が必要となり、このためライブラリを作製するための全体の所要時間は非常に長くなる。さらにこの方法は光に敏感であるからプロセスの実施が面倒である。Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.93,Nov.96,p.13555-13560にはこのような物質ライブラリ構築法が記述されている。この方法では、まず基板に適当な保護基、または最初の保護基を担持するモノマーを付着させる。ついで基板表面を光活性化可能なレジストで被覆し、予め定められた合成アルゴリズムに従って表面の一部を照射し構造を生成させる。構造の生成した領域では保護基が分解する。ついで残りの部分に第２のモノマーを結合させることができる。残ったレジストを除去した後、新しい構造に対応するレジスト層に対して同様の操作を繰り返す。前記の欠点の他に、この方法の主な欠点はマトリックスからホトレジスト層を完全に除去することができないため合成各段階の収率、したがって合成全体の収率が低下することである。
本発明の目的は、単一分子種の自己組織型構造を有する単分子膜を作製するための、再現性よく反復することが可能な、かつ単分子膜と分子種との局所的に限定された結合を高収率で得ることのできる方法を提供することである。この方法は特に、テストアッセイや固相で結合された物質ライブラリの構築を意図している。
上記の目的は、特許請求範囲に記載した特徴によって達成される。
本発明においては、特別に作製した微小構造を有するポリマーマスクを用いる。このマスクは、適切な基板への印捺用として設計され、所定の領域に開口部を有しており、基板上への単分子膜の生成を可能にするものである。
以下に本発明を図示した実施例によって更に詳細に説明する。
図1a〜1eは必要なポリマーマスクの形成方法の可能性を、
図２は特定の実施態様による、固相により結合された物質ライブラリの構築過程を、
図３は本発明による、z方向にナノ構造を有する表面の一例を、
図４は物質ライブラリを構築するための種々のポリマーマスクのセットの一部を概略的に示す。
図1a〜1dは本発明の範囲内で必要とされるポリマーマスクの形成の可能性を例示したものである。出発点は図1aに示す、両面を厚さ500nmのSiO₂熱酸化層11で被覆した4”のシリコンウェハー10である。この酸化層11を微小構造の作製に通常使用されるホトレジスト層12でスピンコート法により被覆する。ホトレジスト層12は図示されていないマスクを備えている。このマスクは、後述する工程において、後で使用する基板2に寸法を合わせたフレーム14がポリマーマスク完成後に残るように作製されている。図1bに示した、このようにして残ったホトレジスト層の部分120には窓121が開口している。マスクによる指定に従って最初のSiO₂酸化層11に窓を作り、ホトレジスト層を除去した結果をSiO₂マスクの残存領域110と共に図1cに示す。図1cにはまた、新たに施した感光性ポリマー層13も示されている。このポリマー層はこの実施例においてはPDMS（ポリジメチルシロキサン）にクロス架橋剤、たとえばキシレンやクロロホルム等の有機溶媒に可溶なジアジド化合物または2,2-ジメトキシ-2-フェニルアセトフェノンを添加して製造されるが、予定されている用途およびこのポリマー層13に用いる試薬によっては、他の物質、たとえば硫酸ジアジドスチルベン塩等の適切な架橋剤を加えたポリビニルアルコール、PMMA、ポリビニルピロリドン等を使用することも本発明の範囲内で可能である。このポリマー層13は図示されていない更に別のマスクを備え、その構造は後にポリマー層13に形成される構造を転写することにより後述の基板2に後で形成される構造に対応している。図1dはポリマー層13に構造を形成しマスク窓130を形成した結果を示す。図1dには同時にシリコンのSiO₂マスク層110で被覆されなかった領域が公知のエッチング剤によって除去された状況をも示している。続いて別のエッチング浴により、被覆されていないSiO₂の領域をすべて除去する。個々のシリコンフレームが構造を付与された自立的なポリマーマスク13によって隔てられた最終結果を図1eに示す。この部分を以後微小構造を有するポリマーマスク1と称する。本発明の範囲においては、このポリマーマスクは１回から多数回使用してもよい。物質ライブラリを構築するには、このようなポリマーマスク1が更に必要であるが、以後すべて1で示す。これらの窓130は原則として相同であるが、部分的には図1fに矢印131で示すように、合成ないし修飾アルゴリズムに従って開いていない箇所がある。上記ポリマー層13に構造を形成する方法は本発明においては重要ではない。たとえばサブミクロン範囲に至る微小な開口部が必要な場合には、いわゆる乾式エッチング法を使用することができる。ただし本質的なことは、生成したポリマーマスクが十分薄く可撓性であって、後述の基板2の上に置いたとき付着力のみで密着し、以後の工程で使用される薬剤に対して化学的に安定であることである。詳細は述べないが、全工程にわたって用いられるポリマーマスク1と後で使用する基板2にはそれぞれ位置決めマークが付けられ、たとえば通常のマスクアライナを用いた微小構造の形成において正確な位置決めが可能となっている。
次に図2によって、本発明の意味における基板2の作製を説明する。基板2としては金で被覆したシリコンウェハーを使用する。この基板は作成後直ちに２回蒸留した水の中に入れて保管する。基板2上には上の例で作製したポリマーマスク1を置き、詳細には示していない金表面と反応する反応溶液3をその上に注ぐ。この実施例では反応溶液3として燐酸塩緩衝液（0.01M,pH8.5）に溶解したNHS-SS-ビオチン10μg/ml溶液を使用する。室温で約15分間の熟成の後、表面を純緩衝液および蒸留水で洗浄し、ポリマーマスク1を剥離する。ついで基板2の表面全体にストレプタビジンを供給すると、ポリマーマスク1の開口部領域130によって規定された領域に固定化されているビオチンと約10^-15Mの濃度で結合する。これにより金表面上にストレプタビジンに占有された領域20が形成される。図3にはそのような領域３ヶ所が参照線によって示されている。このようにして形成された、いくつかの規則的に分布する領域20に分割された単分子膜は、たとえばビオチニル化した分子の固定化マトリックスとして、あるいは空間的に選択的な付着力または一定の界面エネルギーを有する基板として使用できる。
別の実施例として、物質ライブラリ構築のための基板の作製を説明する。この場合、基板2としてはたとえば高純度シリコン板を用い、その全表面をたとえば3-グリシドキシプロピルトリメトキシシランで処理する。基板2に3-グリシドキシプロピルトリメトキシシランを注ぎ（10％トルエン溶液、80℃、約８時間）、0.05M HCl中で２時間熟成すると上記エポキシドが加水分解されて遊離水酸基を生じ、たとえばホスホルアミディト（Phosphoramidit）と自発的に反応するようになる。このためには、たとえばテトラゾールの0.1Mアセトニトリル溶液で活性化したC18スペーサを有するホスホルアミディト（Phosphoramidit）と処理済の基板表面を10分間反応させた後、表面をアセトニトリルで十分洗浄する。これによって基板表面に生ずるジメトキシトリチル基はホスホルアミディト（Phosphoramidit）保護基の化学において知られた標準的な保護基である。
このように処理した基板2に、図２と同様にして、たとえば図１のように作製したポリマーマスク1を置き、マスクアライナで位置決めを行う。ポリマーマスクはその作製方法から、基板に対して付着力を有するので、位置決めの後は基板2とポリマーマスク1から成る積層体をサポートから外すことができる。この積層体をトリフルオロ酢酸の2％水溶液で処理すると、ポリマーマスクの開口部130においては前述のように形成された保護基が分解される。ついでポリマーマスクを基板から剥離し、図３と同様に予め定めた形に分布した保護基のない領域20を得る。基板はこの状態で既にテストアッセイとして利用することができる。基板の具体的な製造方法は多様であり、多数の用途に適合させることが可能である。
このように前処理した基板は更にたとえば公知のホスホルアミディト（Phosphoramidit）サイクルを行わせることによって、領域20にオリゴヌクレオチドモノマーを合成することができる。
本発明に従って物質ライブラリを構築するには更に別のポリマーマスク1を用いる。このポリマーマスクの開口部130は、合成しようとする物質群に様々に対応するように、第１のポリマーマスクの開口部130と基本的には一致するが、部分的には図４に例示したように開いていないマスク領域131が存在する。また必要に応じてより大きい開口部を形成し、したがって基板上の隣接作用領域をより大きくとることも、本発明の範囲内で可能である。所定の箇所における分子種を更に延長するには、合成サイクルに対応した新しいポリマーマスクを置き、合成すべき物質で処理して反応および洗浄工程を実行した後ポリマーマスクを剥離する。個々の分子種の成長高さはモノマー数個の寸法であり、基板上の合成位置によって種々に異なるが、ポリマーマスクはいずれも付着力によって密着し、鎖長が30〜100ないしそれ以上の合成層のパッケージにおいても、ポリマーマスクが後続の合成溶液によって流去されることはない。以上の方法により、微小構造の分野で用いられる装置技術を応用すれば、信頼性の高い物質ライブラリを高い再現性と収率をもって構築することが可能である。
本発明によれば、ペプチド、多糖類、ポリテルペン等、種々のポリマーライブラリーないし物質ライブラリが構築できる。物質クラスの異なる分子種を１枚の基板上に集める混合ライブラリの作製も可能である。同様に、物質クラスの異なるモノマーから成る混合ポリマーのライブラリも可能である。このためには保護基ないし結合官能基の相溶性が条件となる。分岐ポリマーの作製も、それに応じて多重に官能化され保護されたモノマーを使用すれば可能である。
本発明により、先行技術に関連して述べた問題点は有効に回避される。使用されるポリマーマスクに形成される開口部の寸法はサブミクロン領域まで可能である。本発明の基本的な利点は、適用される化学物質に制限がないことであり、機械的部分の材料は基本的に反応サイクルに適合させることができる。
以上の説明および下記の特許請求範囲、および図面に示された特徴は、単独でも任意の組み合わせにおいても本発明の本質をなすものである。
記号リスト
1 ポリマーマスク
10 シリコンウェハー
11 SiO₂酸化層
110 SiO₂マスク領域
12 ホトレジスト層
120 ホトレジスト層残存領域
121 窓
13 ポリマー層
130 ポリマー層13の開口部領域
131 ポリマー層13の開口していないマスク領域
14 フレーム
2 基板
20 基板2上の特定領域

Claims (4)

1. 単一分子種の構造化された自己組織型単分子膜の作製方法であって、
   ａ）第１の単分子膜に適合する基板上に、ｂ）該基板上の作用領域に対応して定められた微小な開口部を有して、微小構造化されたポリマーマスクを少なくとも１回該基板上の所定の位置に置き、該ポリマーマスクは付着力のみで該基板に密着するように薄くかつ可撓性であり、該ポリマーマスクに使用する材料は以後の工程で使用する薬剤を考慮して、それら薬剤に対して化学的に安定であるように選ばれ、ｃ）該基板と該ポリマーマスクから成る積層体に、少なくとも第１の単分子膜をマスク開口部の領域に形成させるため、使用目的に適合した第１の薬剤を注ぎ、ｃ１）形成すべき単分子膜構造に従って、該第１の薬剤又はそれとは別の他の薬剤により、前記ｃ）の工程を繰り返し、ｄ）前記ｃ）の工程又はｃ）とｃ１）の工程を実行し、マスク開口部に対応して該薬剤に曝露された基板表面の領域を修飾した後、該ポリマーマスクを剥離し、該剥離したポリマーマスクが再使用可能であることを特徴とする方法。
2. 該第１のポリマーマスクとは別の他のポリマーマスク及び該第１の薬剤とは別の他の薬剤を用いて、該他のポリマーマスクが該第１のポリマーマスクと同一の位置を取るように、かつ該他のポリマーマスクが該第１のポリマーマスクと一致する開口部を有するが、合成又は修飾アルゴリズムに従って開いていない部分も存在するように、前記ｂ）〜ｄ）の工程を繰り返すことを特徴とする、請求項１の方法。
3. 外形寸法が基板と同一であり、該開口部を形成したポリマー箔を基板側に有するフレームから形成されたポリマーマスクを使用することを特徴とする、請求項１乃至２の何れかの方法。
4. 請求項１乃至３の何れかに記載の方法で自己組織型単分子膜を作製し、それにより物質ライブラリを作製する方法。

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