JP4262479B2

JP4262479B2 - Ｓｃｃｅ改変トランスジェニック哺乳動物およびヒト疾患のモデルとしてのそれらの使用

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Inventors: トールビョルン・エーイェルルード; レンナルト・ハンソン
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Description

本発明は、トランスジェニックscce哺乳動物および哺乳動物胚、ヒト疾患研究モデルとしてのそれらの使用、これらのモデルを使ってこれらの疾患の処置に有効な化合物および組成物を同定する方法、ならびにその化合物および組成物そのものに関する。特に本発明は、scce遺伝子を皮膚で過剰発現させるトランスジェニック哺乳動物に関する。これらのモデル動物は重度の皮膚障害を特徴とする表現型の大きな変化を示し、さまざまなヒト疾患を処置するための化合物および組成物の同定に役立つ。

器官としての皮膚は生物学的、医学的、および化粧品学的観点から興味深い。皮膚疾患は、乾癬および湿疹などの器官特異的なものと、全身性アレルギー反応などの全身性疾患の症状発現であるものが、数多く存在する。皮膚特異的な疾患が存在するという事実は、皮膚に特有な分子機構の存在を示す証拠であると見なすことができる。同様に、皮膚特異的な分子過程に関する研究は、皮膚障害の理解および処置にとって重要である。これらの過程のいくつかが、皮膚の最も特殊化した機能、すなわち身体の外側と内側の間に物理化学的障壁を形成することに、何らかの形で関係していると考えることは理にかなっていると思われる。物理化学的皮膚障壁は皮膚の最外層、すなわち角質層に局在している。

角質層は皮膚の最も特殊化した構造である。皮膚の最外部を占めているのは、表皮の分化過程の最終産物、すなわち重層扁平上皮である。表皮細胞の大部分は、さまざまな分化状態にある角化細胞からなっている。最下層の角化細胞、すなわち基底細胞は、皮膚の結合組織である真皮と接触している基底膜上に存在し、分裂能力を持っている唯一の角化細胞である。基底細胞の一部は絶え間なく基底膜を離れており、分化過程を経て最終的には角質層の構成単位となる。この過程で角化細胞はいくつかの適応変化を起こす。表皮特異的サイトケラチンからなる細胞骨格の含量の増加が起こる。デスモソーム数の増加により、隣接する細胞の中間径フィラメントが連結して一つの機能単位を形成する。最も劇的な変化は、一番上にある生細胞、すなわち顆粒層から、死んでいる角質層への移行（これは通常、角化と呼ばれる）時に起こる。共有結合によって架橋されたタンパク質が、形質膜の内面近くに沈着して、耐性の高い細胞外被を形成する。さらに、角化細胞特異的な細胞小器官に由来する脂質に富む物質が細胞外間隙に分泌され、角質層の細胞を取り巻く脂質ラメラを形成することにより、親水性物質に対する透過障壁を構成する。最後に、高密度のサイトケラチンフィラメントを除くすべての細胞内構造が消失する。

したがって、角質層の細胞、すなわち角質細胞は死んでいる。これは、角質層におけるさまざまな過程の調節が、角化細胞がまだ生きている状態での「プログラミング」の結果でなければならないことを意味している。表皮の代謝回転は通常約4週間で進行し、細胞が角質層の一部になっている期間はそのうちの約2週間であるが、この代謝回転は落屑の過程で細胞が皮膚表面から剥離することによって終わる。この過程は角質層の「プログラミング」の一例である。角質層が物理化学的障壁として機能するための前提条件は、機械的に耐性な構造、すなわちデスモソームによって、個々の細胞がつなぎ合わされることである。落屑の前提条件であるデスモソームの分解は、組織の障壁機能を損なわずに角質層の新規産生と釣り合う細胞剥離が皮膚表面から起こるように、調節されなければならない。

角化の障害
皮膚は、さまざまな重症度を持つ多くの病的状態において、角化過程に障害を持つ。乾癬では、典型的な慢性炎症に加えて、未成熟角質層の過剰産生が、この疾患の典型的鱗屑を引き起こす。「魚鱗」の形成につながる角質層の肥厚を特徴とする遺伝性皮膚疾患の一群、いわゆる魚鱗癬というものがある。いくつかの魚鱗癬では落屑速度の低下が起こる。魚鱗癬ほど重症ではないが、「乾燥肌」（乾皮症）も、角質細胞が正常時のように単一細胞としてまたは小さな細胞凝集塊としてではなく、肉眼で見ることのできる大きな鱗屑として角質層から剥離することを特徴とする。これは、老齢者およびアトピー患者（すなわち皮膚刺激原に対する耐性が低下していて特徴的な形態の内因性湿疹を発症しやすい個体）にはよく見られ障害である。ざ瘡疾患では、皮脂腺の導管部で角化障害が起こり、それが面皰の形成および皮脂腺の閉塞をもたらす。まず面皰の形成が起こり、これが炎症性ざ瘡病変を誘発すると考えられる。

角化にはタンパク質分解酵素が関与する
角化過程および角質層の代謝回転には、タンパク質分解酵素が重要な役割を果たすと思われる段階がいくつかある。生きている表皮層から角質化した表皮層への移行中に起こるサイトケラチンフィラメント以外の全細胞内構造の消失には、間違いなくタンパク質分解が関与するに違いない。角化中にサイトケラチンフィラメントが特別なタイプの凝集を起こす際に機能すると考えられるタンパク質、フィラグリンへのプロフィラグリンの変換は、特異的プロテイナーゼによって触媒されうる。角質層では、さらにフラグリンが、おそらく「天然保湿剤」として重要であると思われる低分子量成分に分解される。さらに、角化過程では、サイトケラチンポリペプチドのタンパク質分解的修飾も起こる。最後に、タンパク質分解事象は、最終的に落屑をつながる過程で、角質層における細胞間付着構造の分解に、おそらく決定的な役割を果たすだろう。

角質層細胞付着および落屑．デスモソームの役割
角質層および表皮の生存部分における細胞間付着は、かなりの部分が、デスモソームによって媒介されている。デスモソームは２つの対称的な半分からなり、各半分は2つの隣接する細胞によって形成される。デスモソームの各半分は、サイトケラチンフィラメントに結合した1つの細胞内部分と、細胞内に係留されていて膜貫通部分および細胞外部分を持つ糖タンパク質によって構成される1つの部分とを持っている。これらのタンパク質の細胞外部分、デスモグレインは、接着分子であり、細胞外間隙でそれらが互いに相互作用することにより、付着構造が形成される。デスモソームの分解は、手掌および足底の角質層では、非掌蹠角質層と比べて、多少異なる経路をたどるようである。後者の組織では、細胞が完全に角質化するとまもなくデスモソームの約85％が消失する。極めて扁平な細胞の絨毛面に選択的に位置する残りのデスモソームは、落屑が起こるレベルまで無傷のままのようである。掌蹠角質層では角質細胞の扁平性がはるかに低く、この組織の深い層ではデスモソームの広範な分解は起こらない。どちらの組織でも落屑はデスモソーム分解と関係している。魚鱗癬皮膚ならびに「乾燥肌」では、角質層の表面層で、デスモソームの数が増えることが示されている。

皮膚の組織特異的な分子機構の多くは、高度に組織化された脂質に取り巻かれた角質化した表皮細胞からなる表皮の障壁形成最外層、すなわち角質層の形成および代謝回転に関係している。角質層は表皮分化の過程で絶え間なく形成されている。表面細胞の絶え間ない落屑によって角質層の厚さを一定に保つ機序を理解しようとする努力のなかで、2つのヒトセリンプロテアーゼ、角質層キモトリプシン様酵素（stratum corneum chymotryptic enzyme：SCCE）および角質層トリプシン様酵素（stratum corneum tryptic enzyme：SCTE）が同定された（Hanssonら 1994およびBrattsandら 1999）。SCCEのクローニングと発現は、参照により本明細書に組み込まれるWO95/00651に記載されている。どちらの酵素もセリンプレテアーゼのカリクレインファミリーに属し、その遺伝子は染色体19q13.3-19q13.4の短い区間に局在している（Diamandisら 2000）。SCCEはヒトカリクレイン7（KLK7）と同義である。しかしカリクレイン類の番号付けは種によって異なることに留意すべきである。SCCEおよびSCTEの発現は、角質化を起こしつつあって落屑を必要としている扁平上皮に限定されているようである（Ekholmら 2000）。

一般的な炎症性皮膚疾患は、機能低下、斑点形成および耐え難い感覚症状を引き起こすことにより、重度の障害をもたらしうる。これらの疾患の多くが示す主な症状はかゆみであり、これは多くの場合、極めて厄介で、罹患者の日常生活の多くの側面および睡眠パターンに重大な障害を引き起こす。10％を超える小児がその小児期のある時点で発症するアトピー性皮膚炎の場合、そう痒症は主な診断基準であり、活動性疾患ではこれが常に認められる。「アトピー性皮膚炎は引っかいた時に噴出するかゆみである」とか「そう痒症はアトピー性皮膚炎の本質的特徴であるとみなすべきである」とさえ言われている（Beltrani, 1999）。かゆみの機序はよく分かっておらず、現在利用できる処置では不十分な場合が多い。これは、少なくとも一つには、満足のゆく動物モデルがないためであると言える（GreavesおよびWall, 1996）。

乾癬およびアトピー性皮膚炎などの炎症性皮膚疾患では、免疫系がその病因に中心的役割を果たすことを支持する証拠が圧倒的である。種々の疾患特異的な皮膚病変および徴候の発生は、免疫系と皮膚由来の構造および分子との細胞レベルおよび分子レベルでの相互作用の結果であると思われる。これらの相互作用を理解することを目指す大半の研究では、サイトカイン、成長因子、および接着分子に焦点が当てられてきた。これらの成分の多くは皮膚細胞によって産生されるが、それらは一般に体中の細胞および組織に多かれ少なかれ存在する。この事実は例えば皮膚特異的な治療法の開発などで問題を引き起こしうる。もし、炎症性皮膚疾患の病態生理に中心的役割を果たす真に皮膚特異的な構造または分子を見つけることができれば、状況は異なってくるだろう。本発明は、セリンプロテアーゼである角質層キモトリプシン様酵素（SCCE）がこの皮膚特異的分子のカテゴリーに属しうることを示す新しい証拠を提示する。

本発明は、これらのプロテアーゼの一つ、SCCEの、皮膚疾患への考え得る関与を解明することを目指した研究から得られた結果に関する。ヒトおよびネズミscce遺伝子を特徴づけ、ヒトscce mRNAを過剰発現させるトランスジェニック動物を作出した。これらの動物に唯一観察される総体的（gross）表現型変化は皮膚に見いだされ、例えばヒトにおけるアトピー性皮膚炎の慢性段階などの炎症性皮膚疾患にみられるものといくつかの類似点を持つ組織学的変化を示した。また、トランスジェニック動物は重症なかゆみの徴候も示した。最近乾癬で示された証拠（Ekholmら, 1999）に対応して、ヒトのアトピー性皮膚炎の慢性病巣におけるSCCEの過剰発現を示す証拠も見つかった。これらの結果は、全体として、SCCEおよび類縁酵素がかゆみを伴う炎症性皮膚疾患の病態生理に関与しているという思想、またしたがって、SCCEは器官特異的処置戦略の潜在的標的であるという思想を裏付けている。本発明のトランスジェニック動物は、かゆみの機序をさらに詳しく研究し、かゆみを一成分とするさまざまな皮膚疾患を軽減するための潜在的化合物および組成物を試験するための、新しいモデルとなりうる。

ヒトscce cDNAに由来するcDNAプローブを使って、ヒト白血球ゲノムライブラリー、カタログ番号HL1111j、ロット番号3511（Clontech, カリフォルニア州）から、ヒトSCCE遺伝子を単離した。オーバーラップクローンを単離し、ABI377（Applied Biosystems, 米国カリフォルニア州フォスターシティ）を使って、構造遺伝子全体を自動DNAシークエンシングによって配列決定し、解析した。全配列はGene Bankアクセッション番号AF332583を使って見ることができる。

表１：ヒトSCCE［生物名＝ヒト（Homo sapiens）］Homo sapiens角質層キモトリプシン様酵素遺伝子（配列番号３）

ネズミscce遺伝子を単離するために、ネズミscce cDNA（Baekmanら, 1999）に由来するcDNAプローブを使って、129SVJ Lambda Fix IIゲノムライブラリー、カタログ番号946306（Stratagene, カリフォルニア州ラホーヤ）のクローンをスクリーニングし、単離した。全遺伝子配列を上述のように決定し、解析した。全配列は、参照により本明細書に組み込まれるGene Bankアクセッション番号AF339930を使って見ることができ、本明細書には記載しない。

ヒトおよびネズミSCCEのアミノ酸配列（cDNAから推定したもの）は約80％の類似度を示す（Hanssonら 1994およびBaeckmanら 1999）。

ヒトおよびネズミscce構造遺伝子のゲノム構成を図1に図解する。これら2つの種に由来する構造遺伝子間の最も明白な相違は、ヒトscce遺伝子の方がイントロンが長いことである。図1に示すように、ヒトおよびマウスに由来するscce遺伝子はどちらも6つのエクソン（図の黒い四角形）を持ち、翻訳開始点はエクソン2にあり、停止コドンはエクソン6にある。全体的に見てこれら2つの遺伝子のエクソン-イントロン構造の構成は類似しているが、イントロンが短いためにネズミ遺伝子の方が小さく、8kbのヒト遺伝子に対して約4kbである。ヒト遺伝子では翻訳開始部位が5'末端の60ヌクレオチド下流に見いだされ、潜在的TATAボックスがエクソン1の約35bp上流に見いだされる。同様に、ネズミ開始コドンも、第2エクソン内、イントロン-エクソン接合部の39ヌクレオチド下流に位置する。

内在性scceと比較して改変された発現調節を受けるトランスジェニックマウスを作出するために、SV40初期エンハンサーおよびプロモーター要素の制御下にある組換えヒトscce遺伝子を、実施例2で述べるように構築した。SV40e-hscceが単一の部位に組み込まれている点でトランスジェニックであることが示された3匹のファウンダーを取得し、C57BL/6JxCBAマウスでのさらなる育種によって、系統を樹立した。予想どおり、これら3系統の一次特性解析により、組換えscce発現のレベルは非常に大きく異なることが明らかになった（下記参照）。最も高いhscce転写物レベルを持つ1010番系統では皮膚異常が明白だったが、他の2系統では皮膚変化または他の総体的表現型変化は何も認められなかった。1010番トランスジェニックマウスをさらに詳しく比較研究するために、見かけ上正常な表現型を持つ系統の一つ（107番）と非トランスジェニック同腹仔とを対照として含めた。

組換えscce遺伝子の転写調節の重要性は、トランスジェニックマウスモデルの他の変異株から得られた結果によって証明された。これらの実験では、ヒトscce構造遺伝子を含むゲノム断片の上流に、さまざまな調節要素を挿入した。例えば、組換えscceの発現を、内在性SCCEの通常の分布よりも基底細胞層により多く誘導する目的で、マウス/ヒトケラチン14プロモーター（Vassarら）を利用した。また、プロモーターを含む無改変ヒトscce上流調節配列を持つ長いゲノム断片も試験し、評価した。これらの実験では、結果として得られたトランスジェニックマウスはどちらも、変化した皮膚形態の徴候もかゆみの徴候も示さなかった。ここに詳述する、sv40初期エンハンサーおよびプロモーター要素を含む組換えscce発現用コンストラクトは、驚くほど限定された発現分布と、非常に興味深い皮膚生物学上の変化および明白なかゆみの徴候を持つトランスジェニックマウスをもたらした。sv40初期調節配列は通常であれば増殖細胞における高レベル転写を媒介するのだが、ここでは分化した角化細胞に最も強い発現が観察されたので、この表現型および発現パターンは意外だった。

本発明者らの知る限りでは、これは、皮膚特異的と考えられる酵素の遺伝子操作によって作出された、かゆみを伴う炎症性皮膚疾患のマウスモデの最初の報告例である。SV40-scceトランスジェニックマウスは、かゆみを伴うヒト皮膚疾患の病態生理に関する新しい洞察を与え、器官特異的な標的に向けられた処置方法を開発するための新しい動物モデルになると思われる。RNAレベルではいくつかの器官でSCCEの発現を検出することができるが、そのレベルは皮膚でのレベルとは比較にならない（Hanssonら 1994およびBrattsandら 1999）。非悪性組織の場合、SCCEタンパク質は、今のところ、角質化を起こしつつあって落屑を必要としている扁平上皮の上部基底層上層細胞（high suprabasal cell）にしか見いだされていない（Ekholmら 2000およびEkholmら 1998）。本発明者らは、マウスにおいてSCCEが通常発現される部位に近い部位でSCCEを過剰発現させると、アトピー性皮膚炎および乾癬などの一般的でしばしば消耗性のヒト皮膚疾患に、ある程度似た状態になることを、ここに示す。

皮膚に表現型の変化を持つSV40-scceトランスジェニックマウスでは、トランスジェニックSCCE（RNAおよびタンパク質）の発現が、他の器官、特に小腸、大腸および肺にも見いだされた。これらの器官に病的変化が見られなかったという事実は、SCCEが媒介する効果に対する耐性もしくは不応性、または影響を受けない器官におけるSCCE活性化酵素の不在によって説明することができる。ヒトおよびネズミSCCEは不活性な前駆体として産生され、保存された部位でのトリプシン切断によって活性プロテアーゼに変換される（Hanssonら 1994およびBaeckmannら 1999）。表皮におけるSCCEの活性化を担っている酵素はまだ同定されていない。

SV40-scceトランスジェニックマウスの皮膚におけるSCCEの発現パターンは多少予想外だった。導入遺伝子コンストラクトはSV40プロモーターを含んでいるので、増殖中の角化細胞を含む部位、すなわち表皮の基底層中および毛包中に、最も強い発現が見いだされると予想された。これに反して、SCCEの発現を示す証拠は基底細胞には見つからなかった。その代わりに、基底層上層細胞（suprabasal cell）に発現が認められ、その強さは基底層から離れるほど連続的に増加することが、免疫組織化学によって見いだされた。このパターンは、ヒトでは、乾癬（Ekholmら 1999）病巣およびアトピー性皮膚炎での慢性病巣に見られるパターンと類似している。考えうる説明の一つとして、ヒトscce遺伝子は、表皮の未分化角化細胞におけるその発現を抑制するような内部調節要素を含んでいるのかもしれない。

SCCEが過角化を伴う表皮の肥厚、皮膚炎症性浸潤およびかゆみをもたらす機序は、まだ解明されていない。最新の見解によれば、SCCE前駆体は上部基底層上層表皮角化細胞（high suprabasal epidermal kerationcytes）で合成され、脂質に富むラメラ体（lamellar body）に貯蔵される。最終分化角化細胞が生細胞から角質細胞、すなわち表皮の角質化した表面層−角質層−の構成単位に変換される過程で、SCCE前駆体を含むラメラ体の内容物が細胞外間隙に分泌され、その場所で活性プロテアーゼへのプロSCCEの変換が起こる（Sondellら 1995）。一つの可能性は、仮説どおりに活性化されたSCCEが表皮を通って真皮の表面部分まで拡散し、それによって表皮の肥厚ならびに皮膚炎症およびかゆみを媒介する神経終末の活性化を誘導するというものである。かゆみの潜在的媒介物質としてのプロテアーゼに関する先の研究では、これらの酵素がヒトボランティアに皮内注射された。トリプシンおよびマスト細胞キマーゼの注射は、マスト細胞によるヒスタミンの放出が関与すると考えられる機序によってかゆみを引き起こしたが、皮内注射されたカリクレインが引き起こすかゆみは、ヒスタミンが関与しない機序によって媒介されるようだった（Haegermarkら 1972およびHaegermark 1974）。抗ヒスタミン薬による処置は、SV40-scceトランスジェニックマウスに見られるかゆみを軽減しないようだった（A.NyおよびT.Egelrud, 未公表の観察結果）。免疫組織化学によってSV40-scceトランスジェニックマウスの皮膚に検出されるSCCEが表皮の表層部分に限定されていたという事実は、これらのマウスに観察される皮膚炎症およびそう痒症が、活性SCCEの直接的効果ではなかったことを示唆している。さらにまた、かゆみの徴候は約5週齢までは観察されなかったが、SCCEの過剰発現はさらに若い動物でも認められた。表皮におけるSCCEの過剰発現が引き起こす変化および徴候に関するもう一つの説明は、生きている表皮層と角質層の間の移行ゾーンにおけるタンパク質分解活性の増加が媒介物質の放出をもたらし、その媒介物質が皮膚の他の部分に拡散し、その場所で表皮変化、皮膚炎症およびそう痒症を引き起こすのかもしれないというものである。第3の可能性は、表皮過角化および有棘層肥厚、皮膚炎症ならびにそう痒症は、角化層における細胞間細胞付着を担う構造のタンパク質分解の増加が引き起こす角質層の障壁機能の低下に対する適応応答の結果であるというものである。表皮の増殖応答は、放出された媒介物質の角化細胞に対する直接的効果または皮膚炎症に付随する効果の結果かもしれない。

最近になって、重症な皮膚疾患を伴う遺伝性ヒト状態における、欠損した表皮障壁機能と異常なタンパク質分解との直接的関係が記載された。ネザートン症候群における病因突然変異がセリンプロテアーゼ阻害剤の前駆体をコードする遺伝子に局在していることを示す強力な証拠が提示された（Chavanasら 2000）。これらの結果を本件の結果と総合すると、皮膚におけるセリンプロテアーゼ活性の増加は、確かに、皮膚の病態生理に重要な役割を果たしていることが示唆される。またこれらは、皮膚疾患の新しい治療原理の候補をさらに探索する動機にもなる。

本発明は、角質層キモトリプシン様酵素（SCCE）またはその変異体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも重要な部分が皮膚における前記異種scceまたはその変異体の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されてなる異種ヌクレオチド配列がゲノムに組み込まれている、非ヒトトランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚に関する。

「異種(ヘテロローガスな)」という用語は、別のDNA配列に挿入または連結されるDNA配列であって、それを接合させるDNA配列が本来コードしていないポリペプチドをコードしているDNA配列を表す。対立遺伝子変異または自然界で起こる突然変異事象は、ここに定義する異種DNA配列をもたらさない。

好ましくは、本発明は、角質層キモトリプシン様酵素（SCCE）またはその変異体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも重要な部分が表皮におけるscceの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されてなる異種ヌクレオチド配列がゲノムに組み込まれている、トランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚に関する。

「ヒト角質層キモトリプシン様酵素（SCCE）」という用語は、WO95/00651記載の、そして添付の配列表に示す、配列番号２のアミノ酸配列を持つセリンプロテアーゼを意味する。SCCEはヒトカリクレイン7（KLK7）と同義である。しかし、カリクレイン類の番号付けは種によって異なる。実施例6で論じるように、ラットKLK7（Kroonら 1997）はラットSCCEではないようである。「SCCE変異体」という用語は、厳密には配列番号２に示すアミノ酸配列を持たない前記配列の変異体を意味し、例えば、ウシ、ブタ、ラットもしくはマウスなどの他の種に由来するSCCEプロテアーゼ、または配列番号２の一部を含む合成ポリペプチドなどであることができる。SCCE変異体は、一般に、精製された天然または組換えヒトSCCEに対して産生させた抗体と反応し、一般に、有意な「SCCE活性」を持つだろう。すなわちSCCE変異体は、WO95/00651に記載するように、皮膚の角化層の試料を中性pHまたはほぼ中性pHおよび生理温度（すなわち約37℃）でインキュベートするモデル系で誘発することができる自発的細胞解離と同じ阻害剤によって阻害することができるセリンプロテイナーゼであるだろう。

以下の表からわかるように、さまざまな種に由来するSCCEの間には有意な類似性がある。

表２：ヒトSCCEの第162〜184残基に相当する、さまざまな種に由来する部分推定アミノ酸配列のアラインメント（Hanssonら 1994）。太字はAsn-170残基およびSer-176残基を表す。

さまざまな種に由来するSCCE中の主要基質特異性ポケット（primary substrate specificity pouch）の底部（上記表２の第170残基）は保存されたアスパラギン残基を含み、既知のセリンプロテアーゼのなかでは他に類がない。また、この残基から活性セリン残基（表２の第176残基）までの配列も高度に保存されている。このことから、SCCEの機能、すなわち特殊化した触媒特性は、上述のアスパラギン残基に決定的に依存していることが示唆される。

表３：ヒトSCCEの第(-)7〜27残基に相当する、さまざまな種に由来する部分推定アミノ酸配列のアラインメント（Hanssonら 1994）。太字は活性化部位（Lys-(-1)またはArg(-1)のC末端側）に隣接する残基を表す。

活性ヒトSCCEは、KIIDGなどの配列中のKのC末端側の切断によって生成する。この活性化はインビトロではトリプシンによって触媒されうる（Hanssonら, 1994）。この切断部位に隣接するアミノ酸配列を調べると、種間で高度に保存されていることがわかる。コンセンサス配列はG-X₁-X₂-I-I-D-G（配列番号１４）（X₁はアスパラギン酸（D）またはグルタミン酸（E）であり、X₂はリジン（K）またはアルギニン（R）である）である。アスパラギン酸およびグルタミン酸はどちらも負に荷電した官能基を持ち、機能的に類似している。リジンとアルギニンにも同じことが言え、これらはどちらも正に荷電した官能基を持ち、トリプシン様の主要基質特異性を持つ酵素によって触媒される反応の切断部位を形成する。活性化部位に隣接するコンセンサス配列は、既知のセリンプロテアーゼのなかでは他に類がないことから、重要な機能を持つことが示唆される。また、SCCE活性化を特異的機能とする酵素が組織（例えば表皮）中に存在することも示唆される。

より具体的に述べると、本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも75％の配列一致度を有しかつグリシン-X₁-X₂-イソロイシン-イソロイシン-アスパラギン酸-グリシン（配列番号１４）という部分配列（ここにX₁はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、X₂はリジンまたはアルギニンである）を含むアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも重要な部分が皮膚における発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されてなる異種ヌクレオチド配列がゲノムに組み込まれている、トランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚に関する。

好ましくは、本発明は、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも75％の配列一致度を有しかつX₃-アスパラギン-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-セリン（配列番号１５）という部分配列（ここにX₃は任意のアミノ酸残基、X₄は任意のアミノ酸残基、X₅はシステイン残基、X₆は任意のアミノ酸、X₇はグリシン残基、X₈はアスパラギン酸残基であり、セリンはセリンプロテアーゼに特有の活性セリン残基である）を含むアミノ酸配列を持つタンパク質をコードするヌクレオチド配列の少なくとも重要な部分が皮膚における発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されてなる異種ヌクレオチド配列がゲノムに組み込まれている、トランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚に関する。

別の態様では、コードされているポリペプチドが、配列番号２に示すアミノ酸配列に対して少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％、好ましくは少なくとも98％、例えば少なくとも99％の配列一致度を持つ。

2つのアミノ酸配列または2つの核酸の一致率を決定するには、それらの配列を最適な比較ができるように整列させる（例えば第1アミノ酸または核酸配列の配列には、第2アミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントが得られるようにギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1配列中の位置が第2配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その分子はその位置で一致している。2つの配列間の一致率は、両配列が共有する一致した位置の数の関数である（すなわち一致率（％）＝［一致した位置の数］/［位置（例えばオーバーラップしている位置）の総数］×100））。ある態様では、2つの配列は同じ長さを持つ。

一致率を決定するための2つの配列のアラインメントは数学的アルゴリズムを使って達成することができる。2つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい一例は、KarlinおよびAltschul（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877記載のように修正されたKarlinおよびAltschul（1990）Proc.Natl.Acad Sci.USA 87:2264-2268のアルゴリズムであるが、これに限定されるわけではない。そのようなアルゴリズムは、Altschulら（1990）J.Mol.Biol. 215:403-410のNBLATおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るには、NBLASTプログラムを使って、スコア（score）＝100、ワード長（wordlength）＝12で、BLASTヌクレオチド検索を行うことができる。本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るには、XBLASTプログラムを使って、スコア＝50、ワード長＝3で、BLASTタンパク質検索を行うことができる。比較のためにギャップつきアラインメントを得るには、Altschulら（1997）Nucleic Acids Res 25:3389-402に記載されているようにGapped BLASTを利用することができる。あるいは、PSI-Blastを使って、分子間の遠い関係を検出する反復検索を行うこともできる。NBLAST、XBLASTおよびGapped BLASTプログラムを利用する場合は、各プログラムのデフォルトパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照されたい。あるいは、例えばEMBLデータベースでPearson W.RとD.J.Lipmanのプログラム（Proc Natl Acad Sci USA 85:2444-2448, 1998）などによって配列を整列させてから、配列一致度を計算することもできる（www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST）。一般に、「スコア行列（scoring matrix）」および「ギャップペナルティー（gap penalty）」については、デフォルト設定をアラインメントに使用することができる。

2つの配列間の一致率は、ギャップを許してまたはギャップを許さずに、上述の技術と同様の技術を使って決定することができる。一致率を計算する際には、厳密な一致だけをカウントする。

「SCCEをコードするヌクレオチド配列の少なくとも重要な部分」という用語は、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を持ち、好ましくは後述する異常な表現型をもたらすポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列（すなわちDNA配列またはRNA配列）を意味する。SCCEまたはその変異体をコードするヌクレオチド配列を作製する際には、イントロン配列、すなわち表１に示すヒトscce中に存在する1つまたは複数のイントロン（参照により本明細書に組み込まれるGenBankアクセッション番号AF332583の注釈も参照されたい）またはネズミ配列から推定されうる1つまたは複数のネズミイントロンを含めることが有用であり、そうすることが必要でさえあるかもしれないことが考えられる。イントロン配列の全てが必要なわけではなく、他の種に由来するSCCEから得られるイントロン配列または他のタンパク質をコードする遺伝子から得られるイントロン配列も適している可能性があり、SCCEをコードするヌクレオチド配列に適切な方法で挿入されるべきであると思われる。

異常な表現型を得るにはSCCEの小部分しか必要でないことが考えられる。「重要な部分」という用語は、配列番号２の少なくとも50アミノ酸、例えば少なくとも70アミノ酸、少なくとも100アミノ酸、少なくとも150アミノ酸または少なくとも200アミノ酸をコードしているヌクレオチド配列を意味する。これらの長さは「配列番号２に示すペプチドの重要な部分」であると見なされる。コードされるポリペプチドは上記の長さより長くてもよく、その場合は、コードされるポリペプチドと配列番号２とに共通する部分を示す。しかし一般的には、そのようなヌクレオチド配列は、WO95/00651記載の、そして添付の配列表に示す、配列番号１のヌクレオチド配列の大部分、例えば少なくとも500ヌクレオチド、例えば少なくとも600ヌクレオチド、少なくとも650ヌクレオチド、少なくとも700ヌクレオチド、例えば750ヌクレオチドを含むだろう。

そのようなヌクレオチド配列は一般に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列またはその一部に相補的な配列とハイブリダイズするだろう。したがって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、配列番号１のヌクレオチド配列またはその一部に相補的な配列とハイブリダイズするヌクレオチド配列が組み込まれているゲノムを持ち、前記配列が、皮膚におけるscceの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結された角質層キモトリプシン様酵素（SCCE）またはその変異体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも重要な部分を含んでいる、トランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚は、本発明の思想に包含される。前記トランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚の特に興味深い一態様では、前記プロモーターが表皮におけるscceの発現を駆動する。ハイブリダイゼーション条件に関連して使用する場合、「ストリンジェント」という用語は、当技術分野で定義されているとおり、すなわち融解温度T_mより15〜20℃低い温度である（Sambrookら, 1989, 11.45-11.49ページ参照）。条件は「高度にストリンジェント」であること、すなわち融解温度T_mより5〜10℃低い温度であることが好ましい。しかし、遺伝コードは縮重しているので、配列番号１とはわずかな類似性しか持たないヌクレオチド配列でも、SCCEをコードしうる場合がある。

SCCEをコードするヌクレオチド配列を持つ核酸を発現させるためのベクターでは、ヒトSCCEをコードするヌクレオチド配列を持つ核酸が「作動可能に連結」されている必要がある。ある核酸が別の核酸配列と機能的な関係に置かれている場合、その核酸は作動可能に連結されている。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、それがあるコード配列の転写に影響を及ぼすのであれば、その配列に作動可能に連結されている。プロモーターとエンハンサーは同じ物体である場合も、2つの異なる物体である場合もある。SV40初期プロモーターは、統合されたプロモーターとエンハンサーの一例である。作動可能に連結されているとは、連結されるDNA配列が隣接していることを意味し、また、2つのタンパク質コード領域を接合する必要がある場合には、連結されるDNA配列が隣接していて、しかも読み枠が一致していることを意味する。「SCCEコンストラクト」という用語は、角質層キモトリプシン様酵素（SCCE）またはその変異体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも重要な部分が皮膚または皮膚の一部におけるscceの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されてなるヌクレオチド配列を意味する。特に、表皮におけるscceの発現を駆動するプロモーターを含むSCCEコンストラクトが考えられる。

本発明の好ましい一態様では、プロモーターが遍在性プロモーターである。「遍在性プロモーター」という用語は、1種類または数種類の標的細胞タイプに特異的な発現を示すプロモーター（組織特異的プロモーター）とは対照的に、宿主生物の多種多様な細胞タイプで活性であるプロモーターを意味する。「遍在性プロモーター」の一例は、SV40初期プロモーターなどのSV40プロモーターおよびその変異体である。遍在性プロモーターの他の例として、ポリオーマ初期プロモーター、レトロウイルス末端反復配列（5'-LTR）、アデノウイルスプロモーター、ならびにベータアクチンおよびリボゾームタンパク質プロモーターなどのハウスキーピング細胞性遺伝子が挙げられる。プロモーターは好ましくは異種プロモーターである。ポリオーマ初期ウイルスプロモーター、エプスタインバーウイルスプロモーターおよびレトロウイルス末端反復配列LTRプロモーターなどの構成的ウイルスプロモーターは、本発明のトランスジェニック哺乳動物の構築に役立つだろうと考えられる。

本発明の重要な一態様は、マウス、ラットおよびウサギなどの齧歯類動物、ネコおよびイヌからなる群より選択されるトランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚に関する。本発明の好ましい一態様は、マウスからなる群より選択されるトランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚である。

本発明のトランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚は、好ましくは、配列番号１に示すようなヒトSCCEをコードするDNA配列の重要な部分を含む異種ヌクレオチド配列を含む。本発明のトランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚は、好ましくは、上に定義したように配列番号２に示すペプチドの重要な部分をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい態様として、DNA配列は、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号23からアミノ酸番号253までに相当するペプチド、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号30からアミノ酸番号253までに相当するペプチド、または配列番号２に示すペプチドをコードする。現時点で好ましい態様は、DNA配列が配列番号１に示すDNAを含むまたはDNA配列が配列番号１である、本発明のトランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚に関する。

本発明の重要な一態様では、本発明のトランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚が、異常な表現型（例えば異常な皮膚表現型）および/または癌の素因（例えば卵巣癌の素因）を示す。本発明の哺乳動物または哺乳動物胚は、好ましくは、表皮過角化、有棘層肥厚、表皮および/または真皮炎症および/またはそう痒症を特徴とする1つまたは複数の炎症性皮膚疾患、例えば表皮過角化を伴う遺伝性皮膚疾患、尋常性魚鱗癬、乾癬、慢性アトピー性皮膚炎または慢性湿疹などに似た異常な皮膚表現型を示す。したがって本発明の哺乳動物または哺乳動物胚は、表皮過角化、有棘層肥厚、表皮/真皮炎症および/またはそう痒症を示しうる。

さらに本発明は、角質層キモトリプシン様酵素（SCCE）またはその変異体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも重要な部分が皮膚におけるscceまたはその変異体の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されてなる異種ヌクレオチドコンストラクトが組み込まれているゲノムを持つトランスジェニック非ヒト哺乳動物または哺乳動物胚を作出する方法であって、
（a）角質層キモトリプシン様酵素（SCCE）またはその変異体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも重要な部分が皮膚におけるscceまたはその変異体の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されてなるヌクレオチド配列を構築して増幅し、
（b）前記異種ヌクレオチドコンストラクトを非ヒト細胞に導入し、
（c）前記細胞または前記細胞の子孫を使って、推定上のトランスジェニック非ヒト哺乳動物または哺乳動物胚をいくつか作出し、
（d）前記異種ヌクレオチドコンストラクトが組み込まれているゲノムを持つ前記非ヒト哺乳動物または哺乳動物胚を選択すること、
を含む方法を提供する。

本発明の一態様では、前記トランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚に、表皮におけるscceの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結された上述のSCCEまたはその変異体をコードするヌクレオチドが組み込まれている。好ましい一態様として、本発明は、上に定義した異常な表現型を示す本発明のトランスジェニック哺乳動物を作出する方法に関する。この方法では、物理的手段、化学的手段またはウイルス手段によって、例えばエレクトロポレーション、トランスフェクション、微量注入またはウイルス感染などによって、SCCEコンストラクトを哺乳動物の卵子または胚に導入する。本発明の好ましい一態様では、哺乳動物の卵子もしくは胚、または哺乳動物の胚性幹細胞に、SCCEコンストラクトを微量注入する。好ましい一態様として、本発明の方法では、C57BL/6JxCBA-f2マウスの卵子または胚に、SCCEコンストラクトを微量注入する。好ましくは、この方法ではさらに、得られたマウスをC57BL/6JxCBAまたはC57BL/6Jと掛け合わせて、トランスジェニック同腹仔および安定なマウス系統を得る。上述したようなSCCEコンストラクトを含むトランスジェニック哺乳動物から誘導されるそのような安定細胞系統は、例えば後述するような好適化合物のハイスループットスクリーニングなどに役立つと考えられる。

本発明のもう一つの側面は、病原的状態の処置、軽減または改善の改良を目指して疾患を研究するためのモデル、化粧用製剤または医薬製剤の開発または試験を行うためのモデル、または診断方法を開発するためのモデルとしての、本発明のトランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚の使用に関する。前記トランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚の本発明による好ましい使用は、皮膚疾患のモデルまたは卵巣癌などの癌のモデルとしての使用である。

本発明の重要な一側面は、異常な表現型または望ましくない表現型の予防または処置に有効な化合物または組成物をスクリーニングする方法であって、
（a）SCCEの少なくとも重要な部分をコードするヌクレオチド配列がある器官における前記scceの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されて組み込まれているゲノムを持つトランスジェニック哺乳動物であり異常な表現型を示す齧歯類動物に、ある化合物または組成物を投与し、
（b）工程（a）に従って処置された哺乳動物の関連器官の外観および/または行動を評価し、そして
（c）処置された齧歯類動物の関連器官の外観および/または行動を無処置対照哺乳動物と比較すること、
を含む方法に関する。

本発明の重要は一側面は、異常な表現型または望ましくない表現型の予防または処置に有効な化合物または組成物を同定する方法であって、
（a）SCCEの少なくとも重要な部分をコードするヌクレオチド配列がある器官における前記scceの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されて組み込まれているゲノムを持つトランスジェニック哺乳動物であり異常な表現型を示す齧歯類動物に、ある化合物または組成物を投与し、
（b）工程（a）に従って処置された哺乳動物の関連器官の外観および/または行動を評価し、そして
（c）処置された齧歯類動物の関連器官の外観および/または行動を無処置対照哺乳動物と比較し、
（d）その化合物または組成物が、前記異常な表現型または望ましくない表現型の予防または処置に有効であることを確認すること、
を含む方法に関する。

好ましい態様では、器官が卵巣または皮膚、より好ましくは表皮である。現時点で好ましい本発明の一態様は、尋常性魚鱗癬、結節性痒疹、神経皮膚炎、扁平苔癬などのかゆみを伴う炎症性皮膚疾患の予防または処置に有効な化合物または組成物のスクリーニング方法または同定方法に関する。本発明の他の好ましい態様は、慢性アトピー性皮膚炎および乾癬の予防または処置に有効な化合物または組成物のスクリーニング方法または同定方法に関する。さらに本発明は、化粧用組成物をスクリーニングするための本発明の方法に関する。

本発明のもう一つの重要な側面は、i）本発明の方法を使って、ある化合物または組成物が、異常な表現型または望ましくない表現型の予防または処置に有効であることを確認し、ii）その化合物を薬学的に許容できる賦形剤または希釈剤と混合することを含む、医薬組成物の製造方法に関する。

特に本発明は、上述したようなトランスジェニック哺乳動物または哺乳動物胚の使用を含む上記の方法を使って発見または開発された化粧用組成物または医薬組成物に関する。この点で、本発明は、全身処置用の医薬製剤ならびに皮膚または上皮への局所適用用の化粧用製剤および医薬製剤に関する。

本発明のさらにもう一つの側面は、異常な表現型または望ましくない表現型を処置または予防する方法であって、そのような異常な表現型または望ましくない表現型を患っている患者に、本発明の方法に従って製造された医薬組成物を投与することを含む方法に関する。

本発明の好ましい一態様は、尋常性魚鱗癬、結節性痒疹、神経皮膚炎、扁平苔癬などのかゆみを伴う炎症性皮膚疾患を処置または予防する方法に関する。本発明の他の好ましい方法は、慢性アトピー性皮膚炎および乾癬を処置または予防する方法に関する。

以下の実施例は例示のために記載するものであって、本発明を記載した具体例に限定しようとするものではない。、

ヒトSCCE遺伝子の単離およびクローニング
ヒト白血球ゲノムライブラリー、カタログ番号HL1111j、ロット番号3511（Clontech, カリフォルニア州）から、ヒトscce cDNA由来のcDNAプローブを使って、ヒトSCCE遺伝子を単離した。SYM3300（5'-GGTGGCCCTGCTCAGTGGCA-3'）（配列番号１６）およびSYM3301（5'-CACCATGGATGACACAGCCTGG-3'）（配列番号１７）を使用して、PCRにより、pS500（Hanssonら, 1994）から253bpのcDNA断片を増幅し、オリゴラベリングキット（Amersham, 英国）を使ったランダムプライマー法によって³²P標識し、それをプローブとしてスクリーニングに使用した。この断片は公表されたヒトSCCE cDNA配列（Hanssonら, 1994）の第149〜401塩基をカバーする。約5×10⁵プラークをスクリーニングした。膜製造者の推奨に従ってフィルターを調製し、65℃でプレハイブリダイズおよびハイブリダイズし、65℃および25℃で洗浄した（Colony/Plaque Screen（商標）ハイブリダイゼーショントランスファーメンブレン, DuPont NEN, マサチューセッツ州）。フィルターをHyperfilm-MP（Amersham, 英国）に露出した。3ラウンドのスクリーニング後に、個々の陽性クローンを選択し、標準的技術（Sambrookら, 1989）を使ってファージDNAを単離した。ファージDNAをいくつかの制限酵素で消化し、3種類のプローブを使ってサザンブロッティングを行った。まず最初に、上述の253bp 5'断片を使用した。次に、618bpの3'非コードcDNA断片をプローブとして使用した。テンプレートとしてpS501を使用し、フォワードプライマーSYM3302（5'-AATAAAGAAACACAAAACCC-3'）（配列番号１８）およびリバースプライマーSYM3418（5'-TGTAATATCATTGTGGGC-3'）（配列番号１９）を使って、PCRにより、断片を増幅した。pS501は、λgt11角化細胞cDNAライブラリーから単離された1888bpのヒトSCCE cDNAがpUC19のEcoRI部位に連結されているプラスミドであって、停止コドンの4つ先のアミノ酸からのコード配列を持つcDNAをカバーし、さらに868bpの非翻訳3'配列を含んでいる。最後に、全コードSCCE cDNA配列を含む897bpの断片を、EcoRI/DraI消化したpS500（Hanssonら, 1994）から単離し、それをプローブとして使用した。プローブを標識し、上述のようにハイブリダイゼーションを行った。2つの陽性クローンをSalIで消化し、pUC19にクローニングして、pS772およびpS773を得た。ヒトSCCE遺伝子のDNA配列を決定するために、pUC19中にpS772とpS773のオーバーラップサブクローンをいくつか作製した。M13フォワードプライマーおよびリバースプライマーならびに特異的プライマーを使って、ジデオキシ法（T7シークエンシングキット（Pharmacia, スウェーデン）またはDye Termination Cycle Sequencing Ready Reactionキット（PE Applied Biosystems, カリフォルニア州））により、サブクローンを配列決定した。

マウスSCCE遺伝子の単離およびクローニング
ネズミSCCE遺伝子を単離するために、HindIII/SalI消化したpS506（Baeckmanら, 1999）から、430bp cDNA断片を単離した。その断片を、オリゴラベリングキット（Amersham, 英国）を使ったランダムプライマー法によって³²P標識し、それをプローブとして、129SVJ Lambda Fix IIゲノムライブラリー（Stratagene, カリフォルニア州）をスクリーニングした。約1×10⁶個のプラークをスクリーニングした。製造者の説明に従って、ブロットを調製し、65℃でプレハイブリダイズおよびハイブリダイズした（Colony/Plaque Screen（商標）ハイブリダイゼーショントランスファーメンブレン, DuPont NEN, マサチューセッツ州）。洗浄もハイブリダイゼーションプロトコールに記載されているように行い、膜をHyperfilm-MP（Amersham, 英国）に露出した。3ラウンドのスクリーニング後に個々の陽性クローンを選択した。SYM4118（5'-GGATGTGAAGCTCATCTC-3'）（配列番号２０）およびSYM4121（5'-TGGAGTCGGGGATGCCAG-3'）（配列番号２１）を使ったPCRにより、数個の陽性プラークを、さらに詳しく調べた。得られたPCR産物を、上述のプローブおよび条件を使って、サザンブロット法で分析した。確認された陽性クローンから標準的技術を使ってファージDNAを単離した。一群の制限酵素で消化したファージDNAに対して、上述のプローブおよび条件を使って、サザン分析を行った。陽性クローンの1つをSacIで消化し、約15.5kbの断片を単離し、pUC19にクローニングして、pS714を得た。pUC19中にpS714のオーバーラップサブクローンをいくつか作製した。サブクローンのDNA配列決定は、ヒトSCCE遺伝子について説明したように行った。

プライマー伸長解析
2つのエクソン1特異的オリゴヌクレオチド（1つはヒト、1つはマウス）を使って、ヒトおよびネズミSCCE転写物の5'末端を決定した。ヒト転写物の開始点を決定するために（Ausubelら）、フォワードプライマーSYM4720（5'-GGGAGGGTGGAGAGAGA GTGCAGTG）（配列番号２２）およびリバースプライマーSYM4899（5'-AGTCTAGGCTGCAG CCCCTAC-3'）（配列番号２３）を使って、プラスミドpS779（5'非翻訳配列、エクソン1〜3、エクソン4の5'末端およびイントロン1〜3をカバーするサブクローン）から、346bpのPCR断片を増幅した。245bpの³²P-dCTP標識一本鎖プローブを作製するために、増幅された断片にプライマーhEXON1（5'-CTCGAGGGATCTGATGTGATCC-3'）（配列番号２４）をアニールさせ、Prime-A-Probe（商標）DNAラベリングキット（Ambion, 米国テキサス州オースティン）を使って標識化を行った。10⁶cpmの標識プローブをヒト皮膚から得た50μgの全RNAと混合した。S1-Assay（商標）（Ambion, 米国テキサス州オースティン）を使って、ハイブリダイゼーションおよびS1処理を行った。最終産物を配列決定用ゲルで解析した。オリゴヌクレオチドhEXON1でプライミングしたpS779のジデオキシ配列決定反応をサイズマーカーとして使用した。

ネズミ転写物の開始点は、SacI直線化pS721（5'非翻訳配列、エクソン1〜3、イントロン1〜2、およびイントロン3の5'末端をカバーするサブクローン）を使って決定した。プライマーmEXON1（5'-CTGGGAGTGACTTGGCGTGGCTCT-3'）（配列番号２５）を直線状プラスミドにアニーリングさせることによって225bpの³²P-dCTP標識一本鎖プローブを作製した。標識化はPrime-A-Probe（商標）DNAラベリングキット（Ambion, 米国テキサス州オースティン）を使って行った。10⁶cpmの標識プローブをマウス尾から単離した50μgの全RNAと混合した。S1-Assay（商標）（Ambion, 米国テキサス州オースティン）を使って、ハイブリダイゼーションおよびS1処理を行った。オリゴヌクレオチドmEXON1でプライミングしたpS721の配列決定反応をサイズマーカーとして使用して、得られた産物を上述のように解析した。

結果
（Gene Bankのヌクレオチド配列：ヒトscce（hSCCE）：アクセッション番号AF332583；ネズミscce（mSCCE）：アクセッション番号AF339930）
ヒト白血球EMBL3λゲノムライブラリーを、ヒトscce cDNA（Hanssonら, 1994）のコード領域から作製したプローブを使ってスクリーニングし、個々の陽性クローンを同定した。制限酵素分析およびサザンブロット法に基づいて、それぞれ12kbpと15.5kbpのサイズを持つ2つのオーバーラップクローンを選択した。これらのクローンはscce cDNA全体にまたがっていた。ヒトscce構造遺伝子のゲノム構造は6つのエクソンを含み、約8kbに及ぶ。エクソンおよびイントロンの構成とサイズを図１に示す。翻訳開始部位（+1と呼ぶ）はエクソン2の5'末端から60ヌクレオチド下流に見いだされる。

ネズミscce遺伝子を単離するために、ネズミscce cDNA（Baeckmanら）のコード領域に相当するプローブを使って、SVJ129ゲノムλFIX（商標）IIライブラリーをスクリーニングした。単離されたクローンのうち、約15.5kbを含む1つのクローンに、ネズミ構造遺伝子全体が含まれていることが明らかになった。11770ヌクレオチドを含む主要部分を配列決定したところ、ネズミscce構造遺伝子はヒト遺伝子より短いことが明らかになった。しかし、全体の構成にはヒトホモログとの類似点がいくつかあり、やはり6つのエクソンからなっている（図１）。ネズミcDNAのポリアデニル化部位は現時点では同定されていないので、エクソン6の正確なサイズは決定することができなかった。しかし、推定ポリA部位の位置は、停止コドンの136bp 3'側に特定された。翻訳開始部位（+1と呼ぶ）はエクソン2中、イントロン1の3'イントロン-エクソン接合部の39ヌクレオチド3'側に見いだされる。

ヒトおよびネズミ転写物の5'末端を決定するためにプライマー伸長研究を行った。ヒトcDNAの配列解析（エクソン1、未公表の結果）により、主要ヒトプライマー伸長産物はヒトcDNA配列の5'末端に認められるヌクレオチドまで伸びていることが明らかになった。プライマー伸長法によってネズミ遺伝子から得られる2つの主要産物を解析すると、2つの異なる転写物開始点が見つかる。一方の産物はネズミSCCE cDNA 5'末端の1ヌクレオチド5'側まで伸びている（Baeckmanら）。他方の産物は、cDNA 5'末端の1ヌクレオチド3'側まで伸びている。

SV40eプロモーターの制御下にあるhscce遺伝子を持つscceトランスジェニックマウスの作出および総体的表現型特性解析
導入遺伝子の構築
シミアンウイルス40初期（SV40e）エンハンサーおよびプロモーターの転写制御下にヒトゲノムscce構造遺伝子を過剰発現させるために、発現ベクターを構築した。開始コドンの20bp上流と停止コドンの4.8kb下流にそれぞれHindIIIリンカーを挿入することにより、scceゲノムDNAを改変した。その結果得られたHindIII scce断片を、SV40eエンハンサーおよびプロモーター要素を含むpS99（図２）の325bp BamHI/HindIII断片に連結し、pBluescript SK+/-（Stratagene）にクローニングして、pAM119を得た。遺伝子導入のために、プラスミドpAM119をBamHIおよびClaIで消化し、約10.7kbのSV40e/scce断片を電気溶出によって単離、精製した後、1細胞期のマウス卵子に微量注入した。

標準的な微量注入法（Hoganら, 1986）により、C57BL/6JxCBA-f2胚に、トランスジェニックマウスを作出した。注入する10.7kb SV40e/scce断片は、pAM119プラスミドから、BamHIおよびClaIによる制限酵素切断によって切り出し、アガロースゲルでのゲル電気泳動によって分離し、切り取り、等速電気泳動法を使って単離し、エタノールで沈殿させた。

トランスジェニック動物の同定
トランスジェニック動物を同定するために、3週齢マウスの尾生検材料からDNAを抽出し、Ausubelらに記載されているように、そのDNAをサザンブロット法またはPCRによって解析した。PCR解析はヒトscceに特異的なプライマー（IE2：5'-GCT CTC CCA TTA GTC CCC AGA GA-3'（配列番号２６）、MJ2：5'-CCA CTT GGT GAA CTT GCA CAC TTG-3'（配列番号２７））を使って行った。簡単に述べると、95℃で10分間の初期変性の後、95℃で30秒間の変性、65℃で30秒間のアニーリング、72℃で45秒間の伸長を28サイクル行い、最後に72℃で10分間の伸長を行うという条件で、PCRを行った。その結果得られたPCR産物は、1％アガロースゲルを使用し、Ausubelら（1992）に記載されているように臭化エチジウムでDNAを可視化することにより、標準的アガロースゲル電気泳動法で解析した。ヘテロ接合型マウスをC57BL/6JxCBAと掛け合わせることにより、3つのトランスジェニック系統（103番、107番および1010番）を樹立した。

結果
予想通り、これら3系統の一次特性解析により、組換えscce発現レベルは非常に大きく異なることが明らかになった（実施例３参照）。最も高いhscce転写物レベルを持つ1010番系統では皮膚異常が明白だったが、他の2系統では皮膚変化または他の総体的表現型変化は何も認められなかった。1010番トランスジェニックマウスをさらに詳しく比較研究するために、見かけ上正常な表現型を持つ系統の一つ（107番）と非トランスジェニック同腹仔とを対照として含めた。1010番トランスジェニック動物における巨視的表現型変化は、4〜5週齢のマウスの目の周りの狭い領域からの脱毛として確認された。さらに歳を取ったマウスでは、体毛全般の明らかな減少と、光沢の低下した外被の外観とが認められた。背部の皮膚表面が細かい鱗屑で覆われている場合もあった。5〜6週齢以降に、これらのトランスジェニック動物の何匹かは、引っ掻き行動を伴うかゆみの徴候を示し、引っ掻き行動の頻度は時間と共に増加した。

1010番および107番C57BL/6JxCBA系統のトランスジェニックマウスならびに同腹仔対照に対して、通常の組織学的解析による剖検診断を行った。調べた組織は脳、小脳、腸（十二指腸/空腸、回腸、結腸、直腸）、および皮膚である。3週齢の動物の一部については、心臓、肝臓、肺、唾液腺、脾臓、胸腺および甲状腺も調べた。同腹仔対照（1010番用：3週、n＝5；5週、n＝5；107番用：5週、n＝3）および107番系統のトランスジェニックマウス（5週、n＝3）では、有意な巨視的または微視的異常は認められなかった。1010番系統のトランスジェニック動物では、皮膚に異常が認められたが、他の器官または組織には異常は認められなかった。3週齢（すなわち、生きている動物の視診によって表現型変化が観察できるようになる前）のマウスでは、調べた動物の全て（n＝4）で皮膚変化が認められた。これらの変化には、軽度〜中等度の表皮過形成および過角化、ならびに上部真皮における混合白血球による軽度の細胞性炎症反応が含まれていた。5週齢の動物（n＝4）での皮膚異常は、種類は同じであったが、一層顕著であり、著しい有棘層肥厚様過形成、および表皮の過角化を伴い、表皮は主として正角化していた。さらに、一部の動物では、真皮中のマスト細胞数が増加していた。表皮の白血球浸潤はときどき認められ、その場合は、肥厚した角質化層内に小さな顆粒球群として現れ、それらの部位では角質化層は錯角化していた。

マウスにおけるscce-mRNA、SCCEタンパク質およびSV40e-scceトランスジェニックマウスにおける触媒活性SCCEの発現の決定
組織の単離
組織標本をさまざまな年齢で収集し、直ちに凍結して、分析するまで液体窒素中に保存しておいた。

RNA単離およびcDNA合成ならびにリアルタイム定量PCR
50〜300mgの単離した組織、肝臓、皮膚、肺、脳、小腸、結腸、および耳から、RNA STAT-60（商標）（Tel-Test "B", Inc., 米国テキサス州フレンズウッド）を使用して、製造者の指示に従って全RNAを調製した。50μgの各RNA調製物を、RQ1 DNアーゼ（Promega, 米国ウィスコンシン州マディソン）により、Ausubelらに従って、DNアーゼ処理した。各組織から得た全RNA約1.6μgをcDNA合成に使用した。同じ遺伝的背景を持つ動物から得た3つのRNA試料を混合し、Superscript(商標) Preamplification System for First Strand cDNA Synethsis（Life Technologies, Inc., 米国メリーランド州ゲイサーズバーグ）を使用して、製造者の指示に従ってcDNA合成を行った。cDNA合成はオリゴd(T)_12-18プライマーを使ってプライミングした。合成されたcDNAを水で100倍に希釈してから、リアルタイム定量を行った。リアルタイム定量は各cDNAに対して3回行った。トランスジェニックヒトSCCEのリアルタイム定量用のプライマーおよびプローブは、ヒトSCCEの配列とネズミSCCEの配列とがほとんど相同性を示さない（相同性が低い）エクソン4および5上に設計した。フォワードプライマー（5'-GCGAACCCCCTGGAACAA-3'）（配列番号２８）は、エクソン4にあって、ヒトcDNA配列（Hanssonら参照）の427〜444位をカバーする。リバースプライマー（5'-ACATCCACGCACATGAGGTCA-3'）（配列番号２９）は、エクソン5にあって、ヒトcDNA配列の490〜510位をカバーする。リアルタイム増幅プローブ（5'-CCTGTACTGTCTCCGGCTGGGGCACTACC-3'）（配列番号３０）は、エクソン4にあって、ヒトcDNA配列の445〜473位をカバーし、その5'末端をレポーター蛍光色素FAMで標識し、3'末端を消光蛍光色素TAMRAで標識した。PCR産物の増幅およびリアルタイム検出は、ABI Prism 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, 米国カリフォルニア州フォスターシティー）で行った。ネズミ酸性リボソームリンタンパク質P0（ACC番号X15267）の一部分の増幅を、リアルタイム定量研究の内在性対照として使用した。相対的定量値を式：2^-ΔΔTに従って計算した。式中、ΔC_Tは標的と内在性対照とのC_T値の差である（User Bulletin #2, PE Applied Biosystem）。

SCCE特異的ポリクローナル抗体
組換えヒトSCCEに対するポリクローナル抗体を、Sondellら（Sondellら 1996）に記載されているように作製し、アフィニティー精製した。これらの抗体は、ヒトSCCEおよびプロSCCE、ならびにネズミSCCEと反応する。

組織調製、ELISA、免疫ブロッティングおよびザイモグラフィー
200〜400mgの凍結組織をプロテアーゼ阻害剤の混合物（Complete（商標）Protease Inhibitor Cocktail Tablets、カタログ番号1836153、Boehringer Mannheim、ドイツ）を含む1mlのdH₂O中でホモジナイズした後、4℃、20,000×gで30分間遠心分離することにより、ELISA用の組織抽出物を調製した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準物質として、ビシンコニン酸との反応によって決定した。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動用に、約0.1mgのマウス皮膚を、10mlの1M酢酸中でホモジナイズし、4℃で一晩抽出した。遠心分離によって清澄化した後、抽出物を小分けし、凍結乾燥し、ザイモグラフィー用電気泳動試料緩衝液に再溶解した。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ザイモグラフィー、および免疫ブロッティングは、記載されているように行った（Ekholmら 2000）。

ELISAを行うために、ポリスチレンマイクロタイタープレートを、コーティング緩衝液（0.1M Na₂CO₃、0.02％NaN₃(w/v)、pH9.6）中に調製した濃度7μg/mlのSCCE特異的ウサギポリクローナル抗体100μlで被覆した。振とう台上、4℃で一晩インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液（10mM NaH₂PO₄、0.15M NaCl、0.05％（v/v）Tween 20、pH7.2）で1回洗浄した。その後、200μlのブロッキング緩衝液（10mM NaH₂PO₄、0.15M NaCl、0.1％（w/v）ウシ血清アルブミン（BSA）、pH7.2）を各ウェルに加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、希釈緩衝液（10mM NaH₂PO₄、0.15M NaCl、0.1％（w/v）BSA、0.05％（v/v）Tween 20、pH7.2）中の試料（または標準物質）50μlを各ウェルに加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で3回洗浄し、さらに、アルカリホスファターゼで標識した100μl/ウェルのSCCE特異抗体（7μg/ml）を添加することによって調製した。プレートを37℃で1時間インキュベートした後、洗浄緩衝液で3回洗浄した。新たに調製した基質溶液（ホスファターゼ基質錠剤（Sigma104ホスファターゼ基質錠剤）2個を10mlの0.1ジエタノールアミン-HCl、0.5mM MgCl₂、pH9.8に溶解）100μlを添加することによって、発色を行った。プレートを室温で30分間、遮光下にインキュベートした。最後に25μlの停止溶液を各ウェルに添加し、405nmで吸光度を読み取った。定量には、組換えヒトプロSCCE（Hanssonら）を標準物質として使用した。

結果
トランスジェニックマウスで転写されるヒトSCCEのリアルタイム定量
1010番および107番トランスジェニック系統間で皮膚表現型に相違があるかどうかを調べるために、様々な組織におけるhscce mRNAの発現を定量RT-PCRによって解析した。結果を図３Aに示す。

6種類の組織を解析した。これらの解析により、1010番系統のトランスジェニックマウスにでは、調べた組織の全てで、hscceの発現量が、107番系統のマウスおよび非トランスジェニック同腹仔よりも有意に高いことがわかった。最も高い相対hscce mRNAレベルは腸および肺に見いだされたが、上記2つのトランスジェニック系統間のhscce発現量の相違は皮膚で最も著しく、hscce mRNAの相対レベルは1010番マウスでは107番マウスより約24倍高かった。

ELISA
ELISAによるSCCEタンパク質の解析（図4B）は、107系統のトランスジェニックマウスおよび正常対照から得た組織については、検出限界に近い値、または検出限界未満の値を示した。1010番トランスジェニックマウスでは、SCCEタンパク質は皮膚、腸および肺を含むいくつかの組織に容易に検出することができ、その相対レベル（ng/mg）は皮膚で最も高かった。

免疫ブロッティングおよびザイモグラフィー
SCCE特異抗体を使った免疫ブロッティングにより、ELISAの結果が裏付けられた。対照マウスの皮膚の抽出物には、ヒトSCCEに似た分子量を持つ成分が少量検出されたが、1010番トランスジェニックマウスから得た皮膚抽出物には同じ相対分子量を持つ成分が多量に検出された（図4A）。カゼイン含有アクリルアミドゲルでのザイモグラフィーにより、1010番トランスジェニックマウスから得た皮膚の抽出物は、ヒトSCCEと同じ電気泳動移動度を持つタンパク質分解酵素を含んでいることが明らかになった。対応する酵素は対照抽出物には検出できなかった（図4B；活性ネズミSCCEの量は使用した実験条件では低すぎて検出できない）。これらの結果は、1010番トランスジェニックマウスの皮膚で産生されるヒトプロSCCEの一部が、タンパク質分解活性を持つ酵素に変換されることを示唆している。これは、活性ヒトSCCEに相当する成分を抗体で標識する免疫ブロッティング実験（図3A）でも裏付けられた。1010番トランスジェニックマウスの皮膚抽出物では、SCCEの他にも、SCCEとは無関係なタンパク質分解酵素の量が増加していた。この酵素の性質は現在のところわかっていない。

結論
RNAレベルでのさまざまな組織におけるhscceの発現は、1010番トランスジェニックマウスの方が、A107番トランスジェニックマウスよりも高かった。上記2系統に属するトランスジェニックマウス間の相違は、SCCEタンパク質の発現に関して、さらに一層顕著だった。1010番トランスジェニックマウスの皮膚には、免疫ブロット法で、多量のSCCEタンパク質を検出することができた。このタンパク質の大部分はプロSCCEのようであったが、増量した活性なSCCEも検出することができた。

炎症性皮膚疾患およびかゆみを研究するためのモデルとしてのscceトランスジェニックマウス
3匹の雄トランスジェニック1010番マウスを野生型C57BL/6J雌と交配して、6群の同腹仔、合計40匹のマウスを得た。これらのうち19匹（トランスジェニックマウス8匹）を7〜8週齢で屠殺し、21匹（トランスジェニックマウス11匹）は13〜14週齢まで追跡した。後者のグループでは、足による引っ掻き動作を定量化した。

トランスジェニック1010番動物における巨視的表現型変化は、4〜5週齢のマウスの目の周りの狭い領域からの脱毛として確認された。さらに歳を取ったマウスでは、体毛全般の明らかな減少と、光沢の低下した外被の外観とが認められた。背部の皮膚表面が細かい鱗屑で覆われている場合もあった。5〜6週齢以降に、これらのトランスジェニック動物の何匹かは、引っ掻き行動を伴うかゆみの徴候を示し、引っ掻き行動の頻度は時間と共に増加した。

かゆみ行動
13〜14週間追跡した11匹のトランスジェニックマウスのうち、8匹（73％）は10〜11週齢でかゆみの徴候（1分あたり少なくとも1周期の後肢または前肢による引っ掻き行動）を示した。引っ掻き行動の頻度は観察した動物によって異なった。一部の動物は弱いまたは中等度のかゆみの徴候を示し、他の動物はほとんどの時間を引っ掻き行動に費やしていた（図５）。3週齢までは、トランスジェニック動物と正常動物の間で、体重に、統計的有意差はなかった。年齢が増すにつれてトランスジェニック動物の方が低体重になる傾向が生じた。14〜15週齢では、トランスジェニック動物の方が野生型同腹仔より7〜10％体重が低かった（雄の場合、平均27.0g対30.0g；p＝0.022；雌の場合、平均21.7g対23.5g；p＝0.033）。

組織学的解析
組織学および免疫組織化学（Ekholmら 1998およびSondellら 1996）のために、常法に従って試料をホルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋するか、またはホルムアルデヒド中で2時間固定した後に凍結した。動物の屠殺時に、組織（背側皮膚、大腸、小腸、および肺）を顕微鏡分析用に調製した。常法により処理した皮膚試料の予備的顕微鏡検査を盲検的に行った（検査員には遺伝子型または引っ掻き行動に関する情報を与えなかった）。1例を除く全ての例で、トランスジェニック動物は野生型対照とは区別することができ、最も顕著な相違は、トランスジェニック動物における肥厚した表皮だった。表皮厚はトランスジェニック動物で55μm（SD＝21μm；n＝19）、対照動物で15μm（SD＝2.6μm；n＝21；p＜0.001）だった。若い（7〜8週齢）トランスジェニック動物と年取った（13〜14週齢）トランスジェニック動物の間で、表皮厚に、統計的有意差はなかった。対照と比較して顕著で頻繁に認められる他の組織学的所見（図6A〜B）は、顕著な過角化、皮膚の真皮部分の細胞性の増加、および付属器構造（毛包壁、皮脂腺および皮脂導管）の上皮厚の増加だった。結合組織中の細胞数の増加については、リンパ球および顆粒球はその一因に過ぎず、線維芽細胞および/または組織球様細胞の数も増加しているようだった。トルイジンブルー染色により、一部のトランスジェニック動物で、皮膚マスト細胞数の増加が明らかになった（図示していない結果）。通常の染色切片では、調べた他の器官のいずれにも、トランスジェニック動物と対照動物との間に相違は見つからなかった（図示していない結果）

免疫組織化学
1010番トランスジェニック動物および同腹仔対照から採取した皮膚試料の免疫組織学的解析を、SCCE特異抗体を使って行ったところ、トランスジェニック動物では、肥厚した角質化層を含む毛包間表皮の基底層上層部分（suprabasal parts）に、角化細胞の強い標識がみられた。毛包および皮脂導管では、導管および毛包の角質化した裏打ちを含む管腔部分だけが染色された（図6C）。これは、上記抗体による標識が認められないか極めて弱い毛包間表皮の基底細胞ならびに毛包、皮脂導管および皮脂腺の主要部分とは著しく対照的だった。対照では、角質層への移行部に近い毛包間表皮の狭い領域、角質層、および毛包の管腔部分が比較的弱く標識された（図6D）。このパターンは正常なヒト表皮について先に記述されているパターンと似ていた（Ekholmら 1998）。ホルムアルデヒド固定凍結試料の免疫蛍光顕微鏡検査でも、同様の結果（図の掲載なし）が得られた。

腸では、SCCE特異的標識が、トランスジェニック動物および不規則に分布した上皮細胞だけに見られた。染色された細胞は、小腸の絨毛の先端および結腸上皮の管腔部分に、より多く存在した。トランスジェニック動物の肺では、細気管支上皮細胞の先端部分が弱く標識された。抗体濃度を高くすると、肺胞上皮も散漫に標識されるようだった（腸および肺の結果は図示していない）。

罹患したヒト皮膚との比較
ウーメオ大学ヒト研究倫理委員会の承認を受けて、説明に基づく同意を得た後、ヒトボランティアおよび患者から皮膚生検材料を採取した。アトピー性皮膚炎を持つ5人の成人の前腕の屈面にある慢性湿疹病巣から生検材料を採取し、顕微鏡検査のために上述のように処理した。対応する部位からの生検材料をボランティアから採取した。通常の染色切片（図の掲載なし）では、病巣は予想通り著しい有棘層肥厚、過角化、および主としてリンパ球からなるまばらな皮膚浸潤を示した。SCCE特異抗体を使った免疫組織像は、対照と比較して、標識された基底層上層細胞層の数の著しい増加を示した（図6E〜F）。有棘層肥厚、過角化、およびSCCE特異的染色のパターンに関して、病巣皮膚と正常皮膚の間に見られる相違は、1010番トランスジェニックマウスの皮膚と対照マウスの皮膚の間に見られる相違と著しく似ていた。

鎮痒剤を試験するためのscceトランスジェニックマウス
18〜22週齢、平均体重24.2gのトランスジェニックマウスに、250μgのグルココルチコイド・トリアムシノロンアセトニドを100μlの総液量で0日目に皮下注射し、100μgのトリアムシノロンアセトニドを100μlの総液量で7、14および21日目に皮下注射するか、同じ時点に100μlの生理食塩水を皮下注射した。午前に引っ掻き行動のエピソードを数え、午後に注射をした。注射用溶液を調製するために、25μlまたは10μlのKencort-T（商標）懸濁液10mg/ml（Bristtol-Myers Squibb）を、75μlまたは90μlの生理食塩水と混合した。結果を図7に示す。トリアムシノロンアセトニドは引っ掻き行動の減少に著しく有効だった。

20〜21週齢、平均体重24.5mgのトランスジェニックマウスに、経管投与法により、ロラチジン（loratidine）を100μlの総液量で投与するか、または100μlの対照溶液を投与した。引っ掻き行動のエピソードを投与直前（0時間）に数え、その後、表示の時点で数えた。投与溶液は、30μlのロラチジン1mg/ml、ショ糖600mg/ml（Clarityn混合液（商標）, Schering-Plough）または対照溶液として30μlのショ糖600mg/mlを、70μlの生理食塩水と混合することによって調製した。結果を図8Aに示す。7日後に、10μlの生理食塩水と混合したショ糖溶液のロラチジン混合物90μlで、同じマウスを処置した。結果を図8Bに示す。図8Aおよび8Bからわかるように、処置群と対照群の間で、引っ掻き行動の頻度に有意差はなかった。これは、SCCEマウスのかゆみ行動が抗ヒスタミン剤での処置によって軽減されないことを示している。

これら2つの実験は、かゆみに対して潜在的効果を持つ薬物（鎮痒薬）の評価にscceトランスジェニックマウスを使用できることを示している。グルココルチコイド・トリアムシノロンアセトニドはかゆみの軽減に著しく有効なようであるが、抗ヒスタミン剤ロラチジンは統計的に有意な鎮痒効果をもたなかった。

このように、SCCEトランスジェニックマウスにおけるそう痒症は、グルココルチコイドによる処置には応答し、抗ヒスタミン剤による処置には応答しないようである。例えばアトピー性皮膚炎、湿疹および乾癬などに付随するそう痒症を患っているヒト患者でも、よく似た状況を見いだすことができる。

hscce-cDNAに相同なウシ、ラットおよびブタ由来のヌクレオチド配列の決定
ウシ、ブタおよびラットから皮膚生検材料を採取し、液体窒素で直ちに凍結し、Mikro-Dismembranator U（B.Braun Biotech International GmbH, ドイツ・メルスンゲン）を使って2000rpmで45秒間ホモジナイズした。1mlのTrizol Reagent（Life Technologies AB, スウェーデン・テービー）を使用し、製造者の説明書に従って、RNAを単離し、DNアーゼ処理し、フェノール：CHCl₃で抽出し、Boehringer Mannheimプロトコール（「非放射性インサイチューハイブリダイゼーション応用マニュアル（Nonradioactive In Situ Hybridization application Manual）」Boehringer Mannheim, ドイツ・マンハイム）に従ってLiClで沈殿させた。RT-PCRは、RT反応にオリゴd(T)₁₆プライマー（Perkin Elmer, 米国カリフォルニア州フォスターシティ）を使って、記載されているように行った（Lindstroemら）。各RT反応には100ngの全RNAを使用した。

PCRのために、hscce cDNAとmscce cDNAに見いだされる保存された配列から5本のプライマーを設計して、プライマーmS3、698、696、H2およびmS4（表４）を得た。TOPO TAクローニングキット（Invitrogen/NOVEX, オランダ・グローニンゲン）を使って、製造者の推奨どおりに、PCR産物をpCRIIベクターにクローニングした。QIAprep Spin Miniprep Kit（Qiagen, カリフォルニア州チャッツワース）を使ってプラスミドDNAを単離した。ヌクレオチド配列決定は、DYEnamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit（Amersham Pharmacia Biotech Sverige, スウェーデン・ウプサラ）とABI377自動DNAシークエンサー（Perkin-Elmer）を使って行った。

5'cDNA末端を取得するために、SMART Race cDNA Amplification Kit（Clontech Laboratories, Inc., カリフォルニア州パロアルト）を、製造者の説明書に従って使用した。先の段階で得たcDNA配列から種特異的プライマーを設計した（表４）。

表４：RT-PCR、5'-RACEおよびネステッド5'-RACEに使用したオリゴマープライマー
オリゴマーa〜eはSCCE cDNA配列とmSCCE cDNA配列とを比較することによって見いだされる保存された配列から設計した。位置はmSCCE cDNAから導いた（Baeckmanら）。オリゴマーf〜jは先の種特異的クローニング反応で得たヌクレオチド配列決定データに基づいて設計した。

SMART IIオリゴヌクレオチド（5'-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGTACGCGGG-3'）（配列番号４１）および5'-RACE cDNA合成プライマー（5'-(T)₂₅N_-1N-3'）（N＝A、C、GまたはT；N_-1＝A、GまたはC）（配列番号４２）を使って、全RNAから第1鎖cDNAを作製した。5'-RACEは、ロングユニバーサルプライマー（0.02μM）（5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-3'）（配列番号４３）およびショートユニバーサルプライマー（1μM）（5'-CTAATACGACTCACTATAGGGCC-3'）（配列番号４４）を含むユニバーサルプライマーミックス（UPM）およびそれぞれの種に合わせた特異的プライマー（KO0905、GR0905およびRÅ1016）を使って行った。PCR反応のサイクルパラメータは、Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480に関する製造者の推奨値から適合させたが、最終ステップでは25サイクルとした。ブタ用およびラット用の特異的プライマーを使った反応で得られた5'-RACE PCR産物を、ネステッドユニバーサルプライマー（NUP）（5'-AAGCAGTGGTAACAACGCAGAGT-3'）（配列番号４５）と、それぞれブタ用（nGR0905）およびラット用（nRÅ1016）のネステッド特異的プライマーとを使ったネステッドPCRにかけた。ネステッドPCRは製造者の説明書に従って行い、増幅サイクルを20回とした。5'-RACEおよびネステッド5'-RACEで得られた産物をアガロースゲル上でチェックした。特性解析のために、産物を上述のようにクローニングし、配列決定した。結果を推定アミノ酸配列として表５に示す。表６にIIDGという配列で始まる活性酵素の類似度の計算値を示す。比較のためにヒトSCCE（Hanssonら, 1994）およびマウスSCCE（Baeckmanら, 1999）の配列を含める。

表５および配列番号４９に示すラットSCCE配列はGenBankデータベースに見いだすことができない。このことは、このラットSCCEが既知のラットカリクレインまたはカリクレイン様タンパク質のいずれとも一致しないことを示している。

表５：5つの種に由来するSCCEの推定アミノ酸配列のアラインメント
ウシ、ブタ、およびラットの配列はC末端部分が完全ではない。

図のSeq 2（ウシ）は配列番号４６、図のSeq 3（ブタ）は配列番号４７、図のSeq 1（ヒト）は配列番号４８、図のSeq 4（ラット）は配列番号４９、図のSeq 5（マウス）は配列番号５０である。

表６：活性酵素の類似度の計算値

^＊活性酵素の比較はIIDGなどの配列から始めた。

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ヒトおよびネズミ構造遺伝子ならびに組換えsv40e/hscce遺伝子の構成を表す図。6つのエクソンを黒い四角形で示している。エクソン2に位置する翻訳開始部位を「ATG」で表し、エクソン6中の停止コドンを「TAA」で表している。トランスジェニック動物の作出に使用したコンストラクトにおけるsv40e転写調節要素の位置も矢印で示してある。 pS99を表す図。 A：トランスジェニック系統1010番（黒い棒）および107番（中空の棒）から得たさまざまな組織調製物中の組換えヒトscce mRNAのリアルタイム定量PCR分析を表す図。各系統に属する3匹の動物からプールした材料を含むRNA試料に対して、三重の分析を行った。ネズミ酸性リボソームリンタンパク質を内部標準物質として使用した。平均およびSD。 B：トランスジェニック系統1010番（黒い棒）および107番（中空の棒）ならびに非トランスジェニック同胞（灰色の棒）から得られるさまざまな組織中のSCCEタンパク質のELISA分析を表す図。各系統および対照群に属する3匹の動物からプールした抽出物に対して、三重の分析を行った。平均およびSD。 1010番scceトランスジェニックマウスから得られる皮膚中のプロSCCEおよび活性SCCEを表す図。Hu＝ヒト足底角質層の抽出物。Tg＝1010番トランスジェニックマウスから得られる皮膚の抽出物。Wt＝野生型同腹仔から得た皮膚の抽出物。約0.1gのマウス皮膚を1M酢酸10ml中でホモジナイズし、4℃で一晩抽出した。遠心分離によって清澄化した後、抽出物を小分けし、凍結乾燥し、電気泳動試料緩衝液に再溶解した。 A：SCCE特異抗体による免疫ブロット（還元試料）。矢印は、上から順に、グリコシル化プロSCCE、非グリコシル化プロSCCEとグリコシル化SCCEとの混合物、および非グリコシル化SCCEを表す。TgとWtについてそれぞれ0.1mgおよび4.5mgの皮膚に相当する量の試料を適用した。 B：1％カゼインを含む12.5％アクリルアミドゲルでのザイモグラフィー（非還元試料）。TgとWtについてそれぞれ0.4mgおよび4.5mgの皮膚に相当する量の試料を適用した。矢印はSCCEを表す。左端に分子量マーカーを示す（星印）：上から順に106、81、47.5、35.2、28.2、および20.8kDa。 scceトランスジェニック（1010番）マウスの引っ掻き行動を表す図。21匹のマウス（トランスジェニックマウス11匹、雌5匹；野生型同腹仔10匹、雌2匹）を、マウスが5〜6週齢の時から開始して5日ごとに45日間観察した。各観察時点でマウスを個別ケージに移し、ケージへの移動から最初の計数までと、計数期間と計数期間の間に、それぞれ2.5分の経過時間をおいて、1回5分間で3回にわたって、後肢または前肢による引っ掻き行動のエピソードを数えた。3回の観察期間の結果を合わせ、1分あたりの引っ掻き行動のエピソードの数を計算した。Aには引っ掻き行動のエピソードの数（各群の全ての動物に関する平均およびSEM）を示し、Bには1分あたり少なくとも1回の引っ掻き行動のエピソードを示す動物の割合を記載する。■（四角形）＝1010番トランスジェニックマウス；▲（三角形）＝野生型同腹仔。 scce 1010番トランスジェニックマウスよび対照から得られる皮膚の組織像およびSCCE免疫組織像。正常ヒト皮膚およびアトピー性皮膚炎の慢性病巣との比較。ホルムアルデヒド固定パラフィン包埋試料。A〜B：ヘマトキシリンおよびエオシンで染色。C〜F：SCCE特異抗体を使った免疫ペルオキシダーゼ染色、ヘマトキシリンによる対比染色。AおよびC:1010番トランスジェニックマウス、5週齢。BおよびD：非トランスジェニック同腹仔。E:アトピー性皮膚炎。F：正常ヒト皮膚。線分＝50μm。 scceトランスジェニックマウスのかゆみに対するグルココルチコイド・トリアムシノロンアセトニドの効果を表す図。■＝トリアムシノロンアセトニド（n＝4）。▲＝対照（食塩水）（n＝6）。＊＝対照群と処置群の間に統計的に有意な差（p＜0.05）。 scceトランスジェニックマウスのかゆみに対する抗ヒスタミン薬ロラチジンの効果を表す図。黒い棒＝ロラチジン（n＝7）。白い棒＝対照（n＝7）。平均およびSE。処置群と対照群の間で引っ掻き行動の頻度に統計的有意差はなかった。

Claims

表皮過角化、有棘層肥厚、表皮炎症、真皮炎症およびそう痒症の予防または処置に有効な化合物または組成物を同定する方法であって、
（a）配列番号２に示すヒト角質層キモトリプシン様酵素（ SCCE ）、配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号 23 〜 253 に対応するヒト角質層キモトリプシン様酵素、または配列番号２に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号 30 〜 253 に対応するヒト角質層キモトリプシン様酵素をコードするヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列の発現を皮膚において駆動する SV40 初期プロモーターに作動可能に連結している該ヌクレオチド配列、を含むヌクレオチド配列 (SCCE コンストラクト ) がゲノム内に組み込まれている、表皮過形成および過角化、および皮膚の軽度の細胞性炎症反応を有するトランスジェニックマウスに、ある化合物または組成物を投与し、
（b）工程（a）に従って処置されたマウスの皮膚の外観および/または行動を評価し、
（c）処置されたマウスの皮膚の外観および/または行動を無処置対照哺乳動物と比較し、そして
（d）該化合物または組成物が、表皮過角化、有棘層肥厚、表皮炎症、真皮炎症およびそう痒症の予防または処置に有効であることを確認すること、
を含む方法。
表皮過角化の予防または処置に有効な化合物または組成物を同定する請求項１記載の方法。