JP4262479B2 - Scce改変トランスジェニック哺乳動物およびヒト疾患のモデルとしてのそれらの使用 - Google Patents
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Description
皮膚は、さまざまな重症度を持つ多くの病的状態において、角化過程に障害を持つ。乾癬では、典型的な慢性炎症に加えて、未成熟角質層の過剰産生が、この疾患の典型的鱗屑を引き起こす。「魚鱗」の形成につながる角質層の肥厚を特徴とする遺伝性皮膚疾患の一群、いわゆる魚鱗癬というものがある。いくつかの魚鱗癬では落屑速度の低下が起こる。魚鱗癬ほど重症ではないが、「乾燥肌」(乾皮症)も、角質細胞が正常時のように単一細胞としてまたは小さな細胞凝集塊としてではなく、肉眼で見ることのできる大きな鱗屑として角質層から剥離することを特徴とする。これは、老齢者およびアトピー患者(すなわち皮膚刺激原に対する耐性が低下していて特徴的な形態の内因性湿疹を発症しやすい個体)にはよく見られ障害である。ざ瘡疾患では、皮脂腺の導管部で角化障害が起こり、それが面皰の形成および皮脂腺の閉塞をもたらす。まず面皰の形成が起こり、これが炎症性ざ瘡病変を誘発すると考えられる。
角化過程および角質層の代謝回転には、タンパク質分解酵素が重要な役割を果たすと思われる段階がいくつかある。生きている表皮層から角質化した表皮層への移行中に起こるサイトケラチンフィラメント以外の全細胞内構造の消失には、間違いなくタンパク質分解が関与するに違いない。角化中にサイトケラチンフィラメントが特別なタイプの凝集を起こす際に機能すると考えられるタンパク質、フィラグリンへのプロフィラグリンの変換は、特異的プロテイナーゼによって触媒されうる。角質層では、さらにフラグリンが、おそらく「天然保湿剤」として重要であると思われる低分子量成分に分解される。さらに、角化過程では、サイトケラチンポリペプチドのタンパク質分解的修飾も起こる。最後に、タンパク質分解事象は、最終的に落屑をつながる過程で、角質層における細胞間付着構造の分解に、おそらく決定的な役割を果たすだろう。
角質層および表皮の生存部分における細胞間付着は、かなりの部分が、デスモソームによって媒介されている。デスモソームは2つの対称的な半分からなり、各半分は2つの隣接する細胞によって形成される。デスモソームの各半分は、サイトケラチンフィラメントに結合した1つの細胞内部分と、細胞内に係留されていて膜貫通部分および細胞外部分を持つ糖タンパク質によって構成される1つの部分とを持っている。これらのタンパク質の細胞外部分、デスモグレインは、接着分子であり、細胞外間隙でそれらが互いに相互作用することにより、付着構造が形成される。デスモソームの分解は、手掌および足底の角質層では、非掌蹠角質層と比べて、多少異なる経路をたどるようである。後者の組織では、細胞が完全に角質化するとまもなくデスモソームの約85%が消失する。極めて扁平な細胞の絨毛面に選択的に位置する残りのデスモソームは、落屑が起こるレベルまで無傷のままのようである。掌蹠角質層では角質細胞の扁平性がはるかに低く、この組織の深い層ではデスモソームの広範な分解は起こらない。どちらの組織でも落屑はデスモソーム分解と関係している。魚鱗癬皮膚ならびに「乾燥肌」では、角質層の表面層で、デスモソームの数が増えることが示されている。
(a)角質層キモトリプシン様酵素(SCCE)またはその変異体をコードするヌクレオチド配列の少なくとも重要な部分が皮膚におけるscceまたはその変異体の発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されてなるヌクレオチド配列を構築して増幅し、
(b)前記異種ヌクレオチドコンストラクトを非ヒト細胞に導入し、
(c)前記細胞または前記細胞の子孫を使って、推定上のトランスジェニック非ヒト哺乳動物または哺乳動物胚をいくつか作出し、
(d)前記異種ヌクレオチドコンストラクトが組み込まれているゲノムを持つ前記非ヒト哺乳動物または哺乳動物胚を選択すること、
を含む方法を提供する。
(a)SCCEの少なくとも重要な部分をコードするヌクレオチド配列がある器官における前記scceの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されて組み込まれているゲノムを持つトランスジェニック哺乳動物であり異常な表現型を示す齧歯類動物に、ある化合物または組成物を投与し、
(b)工程(a)に従って処置された哺乳動物の関連器官の外観および/または行動を評価し、そして
(c)処置された齧歯類動物の関連器官の外観および/または行動を無処置対照哺乳動物と比較すること、
を含む方法に関する。
(a)SCCEの少なくとも重要な部分をコードするヌクレオチド配列がある器官における前記scceの発現を駆動するプロモーターに作動可能に連結されて組み込まれているゲノムを持つトランスジェニック哺乳動物であり異常な表現型を示す齧歯類動物に、ある化合物または組成物を投与し、
(b)工程(a)に従って処置された哺乳動物の関連器官の外観および/または行動を評価し、そして
(c)処置された齧歯類動物の関連器官の外観および/または行動を無処置対照哺乳動物と比較し、
(d)その化合物または組成物が、前記異常な表現型または望ましくない表現型の予防または処置に有効であることを確認すること、
を含む方法に関する。
ヒト白血球ゲノムライブラリー、カタログ番号HL1111j、ロット番号3511(Clontech, カリフォルニア州)から、ヒトscce cDNA由来のcDNAプローブを使って、ヒトSCCE遺伝子を単離した。SYM3300(5'-GGTGGCCCTGCTCAGTGGCA-3')(配列番号16)およびSYM3301(5'-CACCATGGATGACACAGCCTGG-3')(配列番号17)を使用して、PCRにより、pS500(Hanssonら, 1994)から253bpのcDNA断片を増幅し、オリゴラベリングキット(Amersham, 英国)を使ったランダムプライマー法によって32P標識し、それをプローブとしてスクリーニングに使用した。この断片は公表されたヒトSCCE cDNA配列(Hanssonら, 1994)の第149〜401塩基をカバーする。約5×105プラークをスクリーニングした。膜製造者の推奨に従ってフィルターを調製し、65℃でプレハイブリダイズおよびハイブリダイズし、65℃および25℃で洗浄した(Colony/Plaque Screen(商標)ハイブリダイゼーショントランスファーメンブレン, DuPont NEN, マサチューセッツ州)。フィルターをHyperfilm-MP(Amersham, 英国)に露出した。3ラウンドのスクリーニング後に、個々の陽性クローンを選択し、標準的技術(Sambrookら, 1989)を使ってファージDNAを単離した。ファージDNAをいくつかの制限酵素で消化し、3種類のプローブを使ってサザンブロッティングを行った。まず最初に、上述の253bp 5'断片を使用した。次に、618bpの3'非コードcDNA断片をプローブとして使用した。テンプレートとしてpS501を使用し、フォワードプライマーSYM3302(5'-AATAAAGAAACACAAAACCC-3')(配列番号18)およびリバースプライマーSYM3418(5'-TGTAATATCATTGTGGGC-3')(配列番号19)を使って、PCRにより、断片を増幅した。pS501は、λgt11角化細胞cDNAライブラリーから単離された1888bpのヒトSCCE cDNAがpUC19のEcoRI部位に連結されているプラスミドであって、停止コドンの4つ先のアミノ酸からのコード配列を持つcDNAをカバーし、さらに868bpの非翻訳3'配列を含んでいる。最後に、全コードSCCE cDNA配列を含む897bpの断片を、EcoRI/DraI消化したpS500(Hanssonら, 1994)から単離し、それをプローブとして使用した。プローブを標識し、上述のようにハイブリダイゼーションを行った。2つの陽性クローンをSalIで消化し、pUC19にクローニングして、pS772およびpS773を得た。ヒトSCCE遺伝子のDNA配列を決定するために、pUC19中にpS772とpS773のオーバーラップサブクローンをいくつか作製した。M13フォワードプライマーおよびリバースプライマーならびに特異的プライマーを使って、ジデオキシ法(T7シークエンシングキット(Pharmacia, スウェーデン)またはDye Termination Cycle Sequencing Ready Reactionキット(PE Applied Biosystems, カリフォルニア州))により、サブクローンを配列決定した。
ネズミSCCE遺伝子を単離するために、HindIII/SalI消化したpS506(Baeckmanら, 1999)から、430bp cDNA断片を単離した。その断片を、オリゴラベリングキット(Amersham, 英国)を使ったランダムプライマー法によって32P標識し、それをプローブとして、129SVJ Lambda Fix IIゲノムライブラリー(Stratagene, カリフォルニア州)をスクリーニングした。約1×106個のプラークをスクリーニングした。製造者の説明に従って、ブロットを調製し、65℃でプレハイブリダイズおよびハイブリダイズした(Colony/Plaque Screen(商標)ハイブリダイゼーショントランスファーメンブレン, DuPont NEN, マサチューセッツ州)。洗浄もハイブリダイゼーションプロトコールに記載されているように行い、膜をHyperfilm-MP(Amersham, 英国)に露出した。3ラウンドのスクリーニング後に個々の陽性クローンを選択した。SYM4118(5'-GGATGTGAAGCTCATCTC-3')(配列番号20)およびSYM4121(5'-TGGAGTCGGGGATGCCAG-3')(配列番号21)を使ったPCRにより、数個の陽性プラークを、さらに詳しく調べた。得られたPCR産物を、上述のプローブおよび条件を使って、サザンブロット法で分析した。確認された陽性クローンから標準的技術を使ってファージDNAを単離した。一群の制限酵素で消化したファージDNAに対して、上述のプローブおよび条件を使って、サザン分析を行った。陽性クローンの1つをSacIで消化し、約15.5kbの断片を単離し、pUC19にクローニングして、pS714を得た。pUC19中にpS714のオーバーラップサブクローンをいくつか作製した。サブクローンのDNA配列決定は、ヒトSCCE遺伝子について説明したように行った。
2つのエクソン1特異的オリゴヌクレオチド(1つはヒト、1つはマウス)を使って、ヒトおよびネズミSCCE転写物の5'末端を決定した。ヒト転写物の開始点を決定するために(Ausubelら)、フォワードプライマーSYM4720(5'-GGGAGGGTGGAGAGAGA GTGCAGTG)(配列番号22)およびリバースプライマーSYM4899(5'-AGTCTAGGCTGCAG CCCCTAC-3')(配列番号23)を使って、プラスミドpS779(5'非翻訳配列、エクソン1〜3、エクソン4の5'末端およびイントロン1〜3をカバーするサブクローン)から、346bpのPCR断片を増幅した。245bpの32P-dCTP標識一本鎖プローブを作製するために、増幅された断片にプライマーhEXON1(5'-CTCGAGGGATCTGATGTGATCC-3')(配列番号24)をアニールさせ、Prime-A-Probe(商標)DNAラベリングキット(Ambion, 米国テキサス州オースティン)を使って標識化を行った。106cpmの標識プローブをヒト皮膚から得た50μgの全RNAと混合した。S1-Assay(商標)(Ambion, 米国テキサス州オースティン)を使って、ハイブリダイゼーションおよびS1処理を行った。最終産物を配列決定用ゲルで解析した。オリゴヌクレオチドhEXON1でプライミングしたpS779のジデオキシ配列決定反応をサイズマーカーとして使用した。
(Gene Bankのヌクレオチド配列:ヒトscce(hSCCE):アクセッション番号AF332583;ネズミscce(mSCCE):アクセッション番号AF339930)
ヒト白血球EMBL3λゲノムライブラリーを、ヒトscce cDNA(Hanssonら, 1994)のコード領域から作製したプローブを使ってスクリーニングし、個々の陽性クローンを同定した。制限酵素分析およびサザンブロット法に基づいて、それぞれ12kbpと15.5kbpのサイズを持つ2つのオーバーラップクローンを選択した。これらのクローンはscce cDNA全体にまたがっていた。ヒトscce構造遺伝子のゲノム構造は6つのエクソンを含み、約8kbに及ぶ。エクソンおよびイントロンの構成とサイズを図1に示す。翻訳開始部位(+1と呼ぶ)はエクソン2の5'末端から60ヌクレオチド下流に見いだされる。
導入遺伝子の構築
シミアンウイルス40初期(SV40e)エンハンサーおよびプロモーターの転写制御下にヒトゲノムscce構造遺伝子を過剰発現させるために、発現ベクターを構築した。開始コドンの20bp上流と停止コドンの4.8kb下流にそれぞれHindIIIリンカーを挿入することにより、scceゲノムDNAを改変した。その結果得られたHindIII scce断片を、SV40eエンハンサーおよびプロモーター要素を含むpS99(図2)の325bp BamHI/HindIII断片に連結し、pBluescript SK+/-(Stratagene)にクローニングして、pAM119を得た。遺伝子導入のために、プラスミドpAM119をBamHIおよびClaIで消化し、約10.7kbのSV40e/scce断片を電気溶出によって単離、精製した後、1細胞期のマウス卵子に微量注入した。
トランスジェニック動物を同定するために、3週齢マウスの尾生検材料からDNAを抽出し、Ausubelらに記載されているように、そのDNAをサザンブロット法またはPCRによって解析した。PCR解析はヒトscceに特異的なプライマー(IE2:5'-GCT CTC CCA TTA GTC CCC AGA GA-3'(配列番号26)、MJ2:5'-CCA CTT GGT GAA CTT GCA CAC TTG-3'(配列番号27))を使って行った。簡単に述べると、95℃で10分間の初期変性の後、95℃で30秒間の変性、65℃で30秒間のアニーリング、72℃で45秒間の伸長を28サイクル行い、最後に72℃で10分間の伸長を行うという条件で、PCRを行った。その結果得られたPCR産物は、1%アガロースゲルを使用し、Ausubelら(1992)に記載されているように臭化エチジウムでDNAを可視化することにより、標準的アガロースゲル電気泳動法で解析した。ヘテロ接合型マウスをC57BL/6JxCBAと掛け合わせることにより、3つのトランスジェニック系統(103番、107番および1010番)を樹立した。
予想通り、これら3系統の一次特性解析により、組換えscce発現レベルは非常に大きく異なることが明らかになった(実施例3参照)。最も高いhscce転写物レベルを持つ1010番系統では皮膚異常が明白だったが、他の2系統では皮膚変化または他の総体的表現型変化は何も認められなかった。1010番トランスジェニックマウスをさらに詳しく比較研究するために、見かけ上正常な表現型を持つ系統の一つ(107番)と非トランスジェニック同腹仔とを対照として含めた。1010番トランスジェニック動物における巨視的表現型変化は、4〜5週齢のマウスの目の周りの狭い領域からの脱毛として確認された。さらに歳を取ったマウスでは、体毛全般の明らかな減少と、光沢の低下した外被の外観とが認められた。背部の皮膚表面が細かい鱗屑で覆われている場合もあった。5〜6週齢以降に、これらのトランスジェニック動物の何匹かは、引っ掻き行動を伴うかゆみの徴候を示し、引っ掻き行動の頻度は時間と共に増加した。
組織の単離
組織標本をさまざまな年齢で収集し、直ちに凍結して、分析するまで液体窒素中に保存しておいた。
50〜300mgの単離した組織、肝臓、皮膚、肺、脳、小腸、結腸、および耳から、RNA STAT-60(商標)(Tel-Test "B", Inc., 米国テキサス州フレンズウッド)を使用して、製造者の指示に従って全RNAを調製した。50μgの各RNA調製物を、RQ1 DNアーゼ(Promega, 米国ウィスコンシン州マディソン)により、Ausubelらに従って、DNアーゼ処理した。各組織から得た全RNA約1.6μgをcDNA合成に使用した。同じ遺伝的背景を持つ動物から得た3つのRNA試料を混合し、Superscript(商標) Preamplification System for First Strand cDNA Synethsis(Life Technologies, Inc., 米国メリーランド州ゲイサーズバーグ)を使用して、製造者の指示に従ってcDNA合成を行った。cDNA合成はオリゴd(T)12-18プライマーを使ってプライミングした。合成されたcDNAを水で100倍に希釈してから、リアルタイム定量を行った。リアルタイム定量は各cDNAに対して3回行った。トランスジェニックヒトSCCEのリアルタイム定量用のプライマーおよびプローブは、ヒトSCCEの配列とネズミSCCEの配列とがほとんど相同性を示さない(相同性が低い)エクソン4および5上に設計した。フォワードプライマー(5'-GCGAACCCCCTGGAACAA-3')(配列番号28)は、エクソン4にあって、ヒトcDNA配列(Hanssonら参照)の427〜444位をカバーする。リバースプライマー(5'-ACATCCACGCACATGAGGTCA-3')(配列番号29)は、エクソン5にあって、ヒトcDNA配列の490〜510位をカバーする。リアルタイム増幅プローブ(5'-CCTGTACTGTCTCCGGCTGGGGCACTACC-3')(配列番号30)は、エクソン4にあって、ヒトcDNA配列の445〜473位をカバーし、その5'末端をレポーター蛍光色素FAMで標識し、3'末端を消光蛍光色素TAMRAで標識した。PCR産物の増幅およびリアルタイム検出は、ABI Prism 7700 Sequence Detection System (PE Applied Biosystems, 米国カリフォルニア州フォスターシティー)で行った。ネズミ酸性リボソームリンタンパク質P0(ACC番号X15267)の一部分の増幅を、リアルタイム定量研究の内在性対照として使用した。相対的定量値を式:2-ΔΔTに従って計算した。式中、ΔCTは標的と内在性対照とのCT値の差である(User Bulletin #2, PE Applied Biosystem)。
組換えヒトSCCEに対するポリクローナル抗体を、Sondellら(Sondellら 1996)に記載されているように作製し、アフィニティー精製した。これらの抗体は、ヒトSCCEおよびプロSCCE、ならびにネズミSCCEと反応する。
200〜400mgの凍結組織をプロテアーゼ阻害剤の混合物(Complete(商標)Protease Inhibitor Cocktail Tablets、カタログ番号1836153、Boehringer Mannheim、ドイツ)を含む1mlのdH2O中でホモジナイズした後、4℃、20,000×gで30分間遠心分離することにより、ELISA用の組織抽出物を調製した。タンパク質濃度は、ウシ血清アルブミンを標準物質として、ビシンコニン酸との反応によって決定した。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動用に、約0.1mgのマウス皮膚を、10mlの1M酢酸中でホモジナイズし、4℃で一晩抽出した。遠心分離によって清澄化した後、抽出物を小分けし、凍結乾燥し、ザイモグラフィー用電気泳動試料緩衝液に再溶解した。SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動、ザイモグラフィー、および免疫ブロッティングは、記載されているように行った(Ekholmら 2000)。
トランスジェニックマウスで転写されるヒトSCCEのリアルタイム定量
1010番および107番トランスジェニック系統間で皮膚表現型に相違があるかどうかを調べるために、様々な組織におけるhscce mRNAの発現を定量RT-PCRによって解析した。結果を図3Aに示す。
ELISAによるSCCEタンパク質の解析(図4B)は、107系統のトランスジェニックマウスおよび正常対照から得た組織については、検出限界に近い値、または検出限界未満の値を示した。1010番トランスジェニックマウスでは、SCCEタンパク質は皮膚、腸および肺を含むいくつかの組織に容易に検出することができ、その相対レベル(ng/mg)は皮膚で最も高かった。
SCCE特異抗体を使った免疫ブロッティングにより、ELISAの結果が裏付けられた。対照マウスの皮膚の抽出物には、ヒトSCCEに似た分子量を持つ成分が少量検出されたが、1010番トランスジェニックマウスから得た皮膚抽出物には同じ相対分子量を持つ成分が多量に検出された(図4A)。カゼイン含有アクリルアミドゲルでのザイモグラフィーにより、1010番トランスジェニックマウスから得た皮膚の抽出物は、ヒトSCCEと同じ電気泳動移動度を持つタンパク質分解酵素を含んでいることが明らかになった。対応する酵素は対照抽出物には検出できなかった(図4B;活性ネズミSCCEの量は使用した実験条件では低すぎて検出できない)。これらの結果は、1010番トランスジェニックマウスの皮膚で産生されるヒトプロSCCEの一部が、タンパク質分解活性を持つ酵素に変換されることを示唆している。これは、活性ヒトSCCEに相当する成分を抗体で標識する免疫ブロッティング実験(図3A)でも裏付けられた。1010番トランスジェニックマウスの皮膚抽出物では、SCCEの他にも、SCCEとは無関係なタンパク質分解酵素の量が増加していた。この酵素の性質は現在のところわかっていない。
RNAレベルでのさまざまな組織におけるhscceの発現は、1010番トランスジェニックマウスの方が、A107番トランスジェニックマウスよりも高かった。上記2系統に属するトランスジェニックマウス間の相違は、SCCEタンパク質の発現に関して、さらに一層顕著だった。1010番トランスジェニックマウスの皮膚には、免疫ブロット法で、多量のSCCEタンパク質を検出することができた。このタンパク質の大部分はプロSCCEのようであったが、増量した活性なSCCEも検出することができた。
3匹の雄トランスジェニック1010番マウスを野生型C57BL/6J雌と交配して、6群の同腹仔、合計40匹のマウスを得た。これらのうち19匹(トランスジェニックマウス8匹)を7〜8週齢で屠殺し、21匹(トランスジェニックマウス11匹)は13〜14週齢まで追跡した。後者のグループでは、足による引っ掻き動作を定量化した。
13〜14週間追跡した11匹のトランスジェニックマウスのうち、8匹(73%)は10〜11週齢でかゆみの徴候(1分あたり少なくとも1周期の後肢または前肢による引っ掻き行動)を示した。引っ掻き行動の頻度は観察した動物によって異なった。一部の動物は弱いまたは中等度のかゆみの徴候を示し、他の動物はほとんどの時間を引っ掻き行動に費やしていた(図5)。3週齢までは、トランスジェニック動物と正常動物の間で、体重に、統計的有意差はなかった。年齢が増すにつれてトランスジェニック動物の方が低体重になる傾向が生じた。14〜15週齢では、トランスジェニック動物の方が野生型同腹仔より7〜10%体重が低かった(雄の場合、平均27.0g対30.0g;p=0.022;雌の場合、平均21.7g対23.5g;p=0.033)。
組織学および免疫組織化学(Ekholmら 1998およびSondellら 1996)のために、常法に従って試料をホルムアルデヒド固定し、パラフィン包埋するか、またはホルムアルデヒド中で2時間固定した後に凍結した。動物の屠殺時に、組織(背側皮膚、大腸、小腸、および肺)を顕微鏡分析用に調製した。常法により処理した皮膚試料の予備的顕微鏡検査を盲検的に行った(検査員には遺伝子型または引っ掻き行動に関する情報を与えなかった)。1例を除く全ての例で、トランスジェニック動物は野生型対照とは区別することができ、最も顕著な相違は、トランスジェニック動物における肥厚した表皮だった。表皮厚はトランスジェニック動物で55μm(SD=21μm;n=19)、対照動物で15μm(SD=2.6μm;n=21;p<0.001)だった。若い(7〜8週齢)トランスジェニック動物と年取った(13〜14週齢)トランスジェニック動物の間で、表皮厚に、統計的有意差はなかった。対照と比較して顕著で頻繁に認められる他の組織学的所見(図6A〜B)は、顕著な過角化、皮膚の真皮部分の細胞性の増加、および付属器構造(毛包壁、皮脂腺および皮脂導管)の上皮厚の増加だった。結合組織中の細胞数の増加については、リンパ球および顆粒球はその一因に過ぎず、線維芽細胞および/または組織球様細胞の数も増加しているようだった。トルイジンブルー染色により、一部のトランスジェニック動物で、皮膚マスト細胞数の増加が明らかになった(図示していない結果)。通常の染色切片では、調べた他の器官のいずれにも、トランスジェニック動物と対照動物との間に相違は見つからなかった(図示していない結果)
1010番トランスジェニック動物および同腹仔対照から採取した皮膚試料の免疫組織学的解析を、SCCE特異抗体を使って行ったところ、トランスジェニック動物では、肥厚した角質化層を含む毛包間表皮の基底層上層部分(suprabasal parts)に、角化細胞の強い標識がみられた。毛包および皮脂導管では、導管および毛包の角質化した裏打ちを含む管腔部分だけが染色された(図6C)。これは、上記抗体による標識が認められないか極めて弱い毛包間表皮の基底細胞ならびに毛包、皮脂導管および皮脂腺の主要部分とは著しく対照的だった。対照では、角質層への移行部に近い毛包間表皮の狭い領域、角質層、および毛包の管腔部分が比較的弱く標識された(図6D)。このパターンは正常なヒト表皮について先に記述されているパターンと似ていた(Ekholmら 1998)。ホルムアルデヒド固定凍結試料の免疫蛍光顕微鏡検査でも、同様の結果(図の掲載なし)が得られた。
ウーメオ大学ヒト研究倫理委員会の承認を受けて、説明に基づく同意を得た後、ヒトボランティアおよび患者から皮膚生検材料を採取した。アトピー性皮膚炎を持つ5人の成人の前腕の屈面にある慢性湿疹病巣から生検材料を採取し、顕微鏡検査のために上述のように処理した。対応する部位からの生検材料をボランティアから採取した。通常の染色切片(図の掲載なし)では、病巣は予想通り著しい有棘層肥厚、過角化、および主としてリンパ球からなるまばらな皮膚浸潤を示した。SCCE特異抗体を使った免疫組織像は、対照と比較して、標識された基底層上層細胞層の数の著しい増加を示した(図6E〜F)。有棘層肥厚、過角化、およびSCCE特異的染色のパターンに関して、病巣皮膚と正常皮膚の間に見られる相違は、1010番トランスジェニックマウスの皮膚と対照マウスの皮膚の間に見られる相違と著しく似ていた。
18〜22週齢、平均体重24.2gのトランスジェニックマウスに、250μgのグルココルチコイド・トリアムシノロンアセトニドを100μlの総液量で0日目に皮下注射し、100μgのトリアムシノロンアセトニドを100μlの総液量で7、14および21日目に皮下注射するか、同じ時点に100μlの生理食塩水を皮下注射した。午前に引っ掻き行動のエピソードを数え、午後に注射をした。注射用溶液を調製するために、25μlまたは10μlのKencort-T(商標)懸濁液10mg/ml(Bristtol-Myers Squibb)を、75μlまたは90μlの生理食塩水と混合した。結果を図7に示す。トリアムシノロンアセトニドは引っ掻き行動の減少に著しく有効だった。
ウシ、ブタおよびラットから皮膚生検材料を採取し、液体窒素で直ちに凍結し、Mikro-Dismembranator U(B.Braun Biotech International GmbH, ドイツ・メルスンゲン)を使って2000rpmで45秒間ホモジナイズした。1mlのTrizol Reagent(Life Technologies AB, スウェーデン・テービー)を使用し、製造者の説明書に従って、RNAを単離し、DNアーゼ処理し、フェノール:CHCl3で抽出し、Boehringer Mannheimプロトコール(「非放射性インサイチューハイブリダイゼーション応用マニュアル(Nonradioactive In Situ Hybridization application Manual)」Boehringer Mannheim, ドイツ・マンハイム)に従ってLiClで沈殿させた。RT-PCRは、RT反応にオリゴd(T)16プライマー(Perkin Elmer, 米国カリフォルニア州フォスターシティ)を使って、記載されているように行った(Lindstroemら)。各RT反応には100ngの全RNAを使用した。
オリゴマーa〜eはSCCE cDNA配列とmSCCE cDNA配列とを比較することによって見いだされる保存された配列から設計した。位置はmSCCE cDNAから導いた(Baeckmanら)。オリゴマーf〜jは先の種特異的クローニング反応で得たヌクレオチド配列決定データに基づいて設計した。
ウシ、ブタ、およびラットの配列はC末端部分が完全ではない。
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Claims (2)
- 表皮過角化、有棘層肥厚、表皮炎症、真皮炎症およびそう痒症の予防または処置に有効な化合物または組成物を同定する方法であって、
(a)配列番号2に示すヒト角質層キモトリプシン様酵素( SCCE )、配列番号2に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号 23 〜 253 に対応するヒト角質層キモトリプシン様酵素、または配列番号2に示すアミノ酸配列のアミノ酸番号 30 〜 253 に対応するヒト角質層キモトリプシン様酵素をコードするヌクレオチド配列であって、該ヌクレオチド配列の発現を皮膚において駆動する SV40 初期プロモーターに作動可能に連結している該ヌクレオチド配列、を含むヌクレオチド配列 (SCCE コンストラクト ) がゲノム内に組み込まれている、表皮過形成および過角化、および皮膚の軽度の細胞性炎症反応を有するトランスジェニックマウスに、ある化合物または組成物を投与し、
(b)工程(a)に従って処置されたマウスの皮膚の外観および/または行動を評価し、
(c)処置されたマウスの皮膚の外観および/または行動を無処置対照哺乳動物と比較し、そして
(d)該化合物または組成物が、表皮過角化、有棘層肥厚、表皮炎症、真皮炎症およびそう痒症の予防または処置に有効であることを確認すること、
を含む方法。 - 表皮過角化の予防または処置に有効な化合物または組成物を同定する請求項1記載の方法。
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