JP4260152B2

JP4260152B2 - リソソーム蓄積症の早期検出方法

Info

Publication number: JP4260152B2
Application number: JP2005283143A
Authority: JP
Inventors: ジェイメイクルピーター; エーブルックスダグラス; ジェイホップウッドジョン
Original assignee: Children Youth and Womens Health Service Inc
Current assignee: Children Youth and Womens Health Service Inc
Priority date: 1996-05-17
Filing date: 2005-09-28
Publication date: 2009-04-30
Anticipated expiration: 2017-05-16
Also published as: EP1021725B1; CA2731490A1; US20040191847A1; NZ332641A; IL127033A0; CA2253875C; WO1997044668A1; JP2008289501A; JP3837711B2; JP2006061161A; AUPN991796A0; CA2253875A1; EP1021725A1; JP2001519894A; DE69739317D1; ATE426169T1; EP1021725A4; IL127033A; US6759189B1

Description

図１は免疫精製された(immunopurified)Lamp-1に対して産出されたポリクローナル抗血清の交差感受性をを示すグラフ図である。マイクロタイターウェルは、実施例３に記載される第１ステップ定量方法を用いて、ポリクローナル抗体が５μg/ml（白丸）または１０μg/ml（白四角）の水準で被覆されている。図２はLamp-1に対するＥｕ³⁺標識化抗体の交差感受性を示すグラフ図である。１０ng/ml（黒丸），２０ng/ml（白四角）または４０ng/ml（白丸）のいずれがを含むLamp-1の標準溶液が調製され、各サンプルへの蛍光反応は実施例３に記載される第１ステップ定量方法を用いて遅延時間(time-delayed)蛍光免疫検定法におけるＥｕ³⁺標識化抗体の濃度範囲で測定される。図３は実施例３に記載される第１ステップ定量方法を用いて測定される１８６人の新生児から得られる血斑中のLamp-1の水準を示すグラフ図である。ｘ軸はLamp-1の水準（ng/血斑(blood spot)）を表している。Lamp-1水準の各範囲内の個体数はｙ軸に表される。図４は２５種類のリソソーム蓄積症を表す３２０人のＬＳＤ罹患者と１５２人の非罹患者から得られる血漿中のLamp-1水準を示すグラフ図である。Lamp-1水準は実施例３に記載される第２ステップ定量方法において５〜１０μlの試料を用いて測定される。中央の棒は各疾患におけるLamp-1水準の中央値を表し、陰影部分は百分位数の２５番目と７５番目を表し、上部および下部の棒は範囲の境界を表している。異常値（白丸）ならびに極度の異常値（^*）も表示する。GM1＝GM1ガングリオシドーシス；MLD＝異染性白質ジストロフィー；MSD＝複数のスルファターゼ欠損症；N-P＝ニーマン・ピック病；SAS＝シアル酸蓄積；TSD＝テイ・サックス病。図５は１４人のＬＳＤ罹患者および４人の（正常な）非罹患者から得られる血漿試料中のLamp-2水準を示すグラフ図である。個体の状態はｘ軸に表される。図６はスクロソームモデル(Sucrosome Model)からの繊維芽細胞の電子顕微鏡および免疫蛍光検査顕微鏡の写真図である。パネルＡ，Ｂ，ＣおよびＤは、（Ａ）０日；（Ｂ）１日；（Ｃ）７日；（Ｄ）２８日にわたって１００mMスクロースを含んだ培地における繊維芽細胞成長の電子顕微鏡写真である。パネルＥ，Ｆ，ＧおよびＨは、（Ａ）０日；（Ｂ）１日；（Ｃ）７日；（Ｄ）２８日にわたって１００mMスクロースを含んだ培地における繊維芽細胞成長の免疫蛍光検査顕微鏡写真である。免疫蛍光検査写真は、相対強度の比較を可能にするために同じ時間（４５秒）露光させた。スケールバー(scalebar)は電子顕微鏡写真においては４μで、免疫蛍光顕微鏡写真においては２０μである。図７はスクロソームモデル(Sucrosome Model)における相対的なLamp-1タンパク質水準を示すグラフ図である。皮膚の繊維芽細胞を１００mMスクロースの存在または非存在下で２８日間成長させた。細胞は所定の時点で回収され、Lamp-1はスクロースの存在下（黒四角）および非存在下（白四角）で成長した細胞内で測定される。Lamp-1の値は総蛋白含有量に対して正常化される。図８はスクロソームモデル(Sucrosome Model)における蓄積の補正を示す電子顕微鏡の写真図である。正常な培地（パネルＡ）またはスクロースを含むメディア（パネルＢ〜Ｈ）において成長した繊維芽細胞の電子顕微鏡写真。細胞を１４日間成長させ、すぐに回収（パネルＡおよびＢ），BME培地に移しかえられ、１日（パネルＣ）；３日（パネルＥ）および７日（パネルＧ）後に回収、あるいは、転化酵素を含むメディアに移しかえられ、１日（パネルＤ）；３日（パネルＦ）および７日（パネルＨ）後に回収される。スケールバー(scale bar)は２μである。図９はスクロソームモデルに関する蓄積補正後のLamp-1蛋白の相対的水準を示すグラフ図である。皮膚の繊維芽細胞は貯蔵液胞を蓄積するためにスクロースの存在下で１４日間成長させた。細胞は、さらに２１日目まで、スクロースを含む培地内で成長を続けるか、あるいは細胞をBME培地もしくは転化酵素を含むBME培地に移しかえることによって補正されるLamp-1は２１日を経た時点で測定され、プロットされる。細胞はスクロースのみを含む培地上（黒四角）、スクロースを含む培地上で１４日間、その後BME培地に配置される（黒三角）、スクロースを含む培地上で１４日間、その後転化酵素を含む培地に配置される（黒丸）または期間−コースを通じてBME培地上（□）で成長させられる。図１０は抗-Lamp-1モノクローナル抗体を用いて標識化した罹患細胞系からの繊維芽細胞を示す免疫蛍光検査顕微鏡の写真図である。繊維芽細胞はポンペ（パネルＡ），サッラ（パネルＢ），MPS-II（パネルＣ）およびMPS-VI（パネルＤ）の罹患細胞系からである。写真は相対強度の比較を可能にするために同じ時間（４５秒）露光させた。スケールバー(scale bar)は２０μである。図１１は患者の細胞系における蓄積の補正を示す電子顕微鏡の写真図である。細胞系はポンペに罹患した細胞（パネルＡ）；ポンペを補正した細胞（パネルＢ）；ＭPS-IIに罹患した細胞（パネルＣ）；MPS-IIを補正した細胞（パネルＤ）；MPS-VIに罹患した細胞（パネルＥ）；MPS-VIを補正した細胞（パネルＦ）からである。電子顕微鏡写真は、酵素の添加後７日以内に貯蔵液胞の大きさが劇的に縮小した（パネルＢ，Ｄ，Ｆ）ということから、ポンペ（パネルＡおよびＢ），MPS-II（パネルＣおよびＤ）およびMPS-VI（パネルＥおよびＦ）に罹患した細胞において補正を確認した。スケールバー(scale bar)は２μである。図１２はポンペに罹患した繊維芽細胞および補正されたポンペ繊維芽細胞における相対的なLamp-1の水準を示すグラフ図である。ポンペに罹患した繊維芽細胞および正常な皮膚の繊維芽細胞は融合(confluency)まで成長させられ、さらに１４日間まで正常な培地で続けられるかもしくは、細胞をα−グルコシダーゼを含む培地に移しかえることで補正される。相対的なLamp-1の水準は２度目の１４日間の期間が経過した時点で測定され、プロットされる。通常の細胞は（黒三角）で、BME培地のポンペ罹患細胞は（黒四角）で、α−グルコシダーゼを含むポンペ罹患細胞は（白四角）で表される。

Claims

ＬＡＭＰ−２に結合する抗体分子を含む、ヒトまたは動物の患者において、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を検出するため、ＬＳＤの進行をモニタリングするため、またはＬＳＤの処置の効能をモニタリングするための組成物。
ポリクローナル抗体としてさらに定義される請求項１に記載の組成物。
モノクローナル抗体としてさらに定義される請求項１に記載の組成物。
リポーター分子で標識化される請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
前記リポーター分子は酵素分子，蛍光体分子または放射性核種分子であることを特徴とする、請求項４に記載の組成物。
前記酵素分子，蛍光体分子または放射性核種分子はホースラディッシュペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，β−ガラグトシダーゼ，アルカリホスファターゼ，フルオレセイン，Ｅｕ^３＋またはその他のランタノイド金属もしくはローダミンを含むリストから選択されることを特徴とする、請求項５に記載の組成物。
前記蛍光体分子はＥｕ^３＋であることを特徴とする、請求項６記載の組成物。
ＬＡＭＰ−２の水準の増加を検定することによって、リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）を検知する、またはＬＳＤの進行をモニターする、あるいはＬＳＤの治療の効能をモニターするために用いるキットにおいて、該キットはＬＡＭＰ−２である抗原および該抗原に結合することができる第１の抗体分子を含むことを特徴とするキット。
請求項８に記載のキットにおいて、前記第１の抗体はモノクローナル抗体であることを特徴とするキット。
請求項８に記載のキットにおいて、前記第１の抗体はポリクローナル抗体であることを特徴とするキット。
請求項８〜１０のいずれかに記載のキットにおいて、前記第１の抗体はリポーター分子で標識化されることを特徴とするキット。
請求項１１に記載のキットにおいて、前記リポーター分子は酵素分子，蛍光体分子または放射性核種分子であることを特徴とするキット。
請求項１２に記載のキットにおいて、前記酵素分子，蛍光体分子または放射性核種分子はホースラディッシュペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，β−ガラグトシダーゼ，アルカリホスファターゼ，フルオレセイン，Ｅｕ^３＋またはその他のランタノイド金属もしくはローダミンを含むリストから選択されることを特徴とするキット。
請求項１３に記載のキットにおいて、前記蛍光体分子はＥｕ^３＋であることを特徴とするキット。
前記第１の抗体を認識する第２の抗体をさらに含む請求項８〜１４のいずれかに記載のキットにおいて、該第２の抗体はリポーター分子に結合されることを特徴とするキット。
請求項１５に記載のキットにおいて、前記リポーター分子は酵素分子，蛍光体分子または放射性核種分子であることを特徴とするキット。
請求項１６に記載のキットにおいて、前記酵素分子，蛍光体分子または放射性核種分子はホースラディッシュペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，β−ガラグトシダーゼ，アルカリホスファターゼ，フルオレセイン，Ｅｕ^３＋またはその他のランタノイド金属もしくはローダミンを含むリストから選択されることを特徴とするキット。
請求項１７に記載のキットにおいて、前記蛍光体分子はＥｕ^３＋であることを特徴とするキット。
請求項１６に記載のキットにおいて、リポーター分子が酵素分子である場合、該キットはさらに該酵素に対して特定の基質分子を含むことを特徴とするキット。
請求項８〜１９のいずれかに記載のキットにおいて、前記抗原はＬＡＭＰ−２であることを特徴とするキット。
請求項２０に記載のキットにおいて、前記ＬＳＤはＭＰＳＩ，ＭＰＳＩＩ，ゴーシェ病，ポンペ病およびサッラズ病（Ｓａｌｌａ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）を含むリストから選択されることを特徴とするキット。