JP4214372B2

JP4214372B2 - New plastic-degrading bacteria

Info

Publication number: JP4214372B2
Application number: JP2002334162A
Authority: JP
Inventors: 敏明神戸; ゆき枝茂野
Original assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency; National Institute of Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-11-18
Filing date: 2002-11-18
Publication date: 2009-01-28
Anticipated expiration: 2022-11-18
Also published as: JP2004166542A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な微生物、および該微生物を用いる生物学的処理法によるプラスチックの分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、プラスチック廃棄物の処理が問題になっている。プラスチック廃棄物の処理方法としては焼却や埋め立てが主であるが、焼却は地球温暖化の促進、埋め立ては埋立地の減少等の問題を抱えている。例えばポリウレタンは、全世界で年間約６００万ｔ，国内では約５５万ｔが消費されている。このうち、その発泡緩衝体は断熱性に優れることから冷蔵庫等の断熱材として大量に利用されている。現在、このポリウレタン廃棄物は不燃ゴミとして埋め立て処分される場合が多いが処分場の不足ならびに環境汚染の問題が生じている。一方、自然環境の点から好ましいものに微生物を利用した生分解法があるが、プラスチックは一般に生分解性ではないという問題を有する。
【０００３】
プラスチックを分解できる微生物に関する報告は少ないが、その例を以下に示す。
ポリ乳酸を分解する微生物の例としては、アミコラトプシス(Amycolatopsis)属菌(Pranamuda H, Tokiwa Y, Tanaka H (1995) Microbial degradation of an aliphatic polyester with a high melting point, poly(tetramethylene succinate). Appl. Envirion. Microbiol. 61: 1828−1832)やバシラススミッチイ(Bacillus smitii)( Sakai K, Kawano H, Iwami A, Nakamura M, Moriguchi M (2001) Isolation of a thermophilic poly-L-lactide degrading bacterium from compost and its enzymatic characterization. J. Biosci. Bioeng. 92: 298−300)等が報告されている。
【０００４】
【非特許文献１】
Pranamuda H, Tokiwa Y, Tanaka H 著、Microbial degradation of an aliphatic polyester with a high melting point, poly(tetramethylene succinate). Appl. Envirion. Microbiol. 61: 1828−1832、1995年
【非特許文献２】
Sakai K, Kawano H, Iwami A, Nakamura M, Moriguchi M 著、Isolation of a thermophilic poly-L-lactide degrading bacterium from compost and its enzymatic characterization. J. Biosci. Bioeng. 92: 298−300、2001年
ポリウレタンは分子内にウレタン結合及びエステル結合またはエーテル結合を含み、それらの結合が切断されることによって分解が進む。ポリオール部分のエステル結合はカビや細菌によって切断されるという報告が数例ある。Darby（Darby R. T. and Kaplan A. M.: Appl. Microbiol., 16, 900-905 (1968).）らはカビによる種々のポリウレタン分解試験を行い、エーテル系よりもエステル系ポリウレタンの方が分解を受け易いことや、イソシアネートやポリオールの種類によって分解特性が異なることを報告している。Kay（Kay, M. J., McCabe, R. W., Morton, L. H. G.: Int. Biodeterio. Biodegrad., 31, 209-225 (1991).）らはエステル系ポリウレタン分解菌として１５種類の菌を単離し、分解力の強かったCorynebacterium 属菌について分解特性を検討した結果について報告している。
【非特許文献３】
Darby R. T. and Kaplan A. M.著、Appl. Microbiol., 16, 900-905 (1968)
【非特許文献４】
Kay, M. J., McCabe, R. W., Morton, L. H. G.著、Int. Biodeterio. Biodegrad., 31, 209-225 (1991)
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、プラスチックを分解することのできる新規微生物、および該微生物を用いたプラスチックの分解方法を提供することを目的とする。特に、複数種のプラスチックを分解することのできる微生物を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この問題を解決するため、我々はプラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する微生物のスクリーングを行い、ペニバチルス（Paenibacillus）属に属する微生物が該プラスチックを分解できることを見出した。尚、ペニバチルス（Paenibacillus）属に属する微生物が該プラスチックの分解能を有することはこれまで知られていなかった。また、本発明者らはペニバチルス属に属する微生物を用いるプラスチックの分解方法を見出した。
【０００７】
即ち、本発明はプラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有するペニバチルス属に属する微生物を提供するものであり、また、ペニバチルス属に属する微生物を用いたプラスチックの分解方法を提供するものである。尚、該微生物由来のプラスチック分解活性を有する酵素、該酵素のアミノ酸配列および遺伝子配列は、同一出願人による「発明の名称：新規なプラスチック分解酵素および該酵素をコードする遺伝子」の同日特許出願に記載されている。
【０００８】
【発明の実施の形態】
ペニバチルス属に属し、プラスチック分解能を有する微生物は、既に公知の微生物であってもよく、新たにスクリーニングされた微生物であってもよい。微生物のスクリーニングの一例を示せば、各地より採取した土壌をポリ乳酸の粉末を含む培地の入った試験管に入れ、３０℃にて振とう培養し、一週間ごとに植え継ぎを繰り返した後、エマルジョン化したポリ乳酸を含んだ寒天平板に希釈塗布し、コロニー周辺にプラスチックの分解に伴うクリヤーゾーンの形成が見られた菌を取得することにより行うことができる。
【０００９】
本発明の微生物は、プラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有するペニバチルス属菌であればよい。具体的には、代表例として、平成１４年１１月１４日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたペニバチルスアミロリチカス（Paenibacillus amylolyticus）TB−13株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９１０４）が挙げられる。ペニバチルス属菌の菌学的性質は、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（ＢＥＲＧＥＹ’ＳＭＡＮＵＡＬＯＦＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（第１巻１９８４年、第２巻１９８６年、第３巻１９８９年、第４巻１９８９年）に記載されている。
【００１０】
更に本発明の微生物は、プラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有するペニバチルス属菌であれば、野生株、変異株のいずれでも良い。
【００１１】
変異株は、従来からよく用いられている変異剤であるエチルメタンスルホン酸による変異処理、ニトロソグアニジン、メチルメタンスルホン酸などの他の化学物質処理、紫外線照射、或いは変異剤処理なしで得られる、いわゆる自然突然変異によって取得することも可能である。
【００１２】
ペニバチルス属に属する微生物の培養に用いる培地としては、ペニバチルス属に属する微生物が生育できる培地であれば特に制限なく用いることができ、例えば、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には、本発明の微生物が資化し得る炭素源、例えばグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる塩類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。
【００１３】
本発明において分解できるプラスチックは、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、ポリ乳酸、ポリウレタン、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート―ｃｏ―アジペート、およびポリエチレンサクシネートが挙げられる。
【００１４】
ポリ乳酸とは、乳酸を主要成分とする重合体をさし、ポリＬ−乳酸や、ポリＤ−乳酸等のポリ乳酸ホモポリマー、ポリＬ/Ｄ−乳酸共重合体、およびこれらにε−カプロラクトン、グリコリド、デプシペプチド等の他の成分を共重合させたポリ乳酸共重合体、そして上記ポリマー間、および他の成分ポリマーとのブレンド体を含む。その重合方法としては、乳酸からの直接重合法、ラクタイド（乳酸の環状二量体）を介する開環重合法等が知られている。また、本発明の分解方法において適用し得るポリ乳酸樹脂の数平均分子量は、特に制限はなく、分子量5,000〜20,000のポリ乳酸の分解については実施例に示している。
【００１５】
ポリウレタンとは、分子中にウレタン結合（−NHCOO−）を有する高分子化合物の総称で、多官能イソシアネートとヒドロキル基含有化合物との反応により得られ、エステル、エーテル、アミド、ウレア、カルバメートなどの基を有するポリマーである。ヒドロキシル基もしくはイソシアネート基の官能性数を変化させることで多種多様の分岐あるいは架橋ポリマーを調製することができる。用いるポリオールの種類によってエステル系とエーテル系に大別できる。ポリウレタンは、易加工性、耐腐敗性、耐変質性、低比重等の優れた特性により、弾性体、発泡体、接着剤、塗料、繊維、合成皮革など幅広い用途を持っており、自動車部品としても広く使用されている。本発明の分解方法において適用し得るポリウレタン樹脂の数平均分子量は、特に制限はない。
【００１６】
ポリブチレンサクシネートとは、コハク酸とブタンジオールからなる高分子をいう。ポリプロピレンやＰＥＴなみの機械的強度を有し、融点もポリカプロラクトンより高い。成形加工性もポリエチレンに近く、同種の成形加工機が使用できる。本発明の分解方法において適用し得るポリブチレンサクシネートの数平均分子量は、特に制限はなく、分子量140,000のポリブチレンサクシネートの分解については実施例に示している。
【００１７】
ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートとは、ポリブチレンサクシネート合成において原料にアジピン酸を加えることにより調製される高分子をいう。融点は90℃ぐらいにまで下がるが、柔軟性が向上する。包装材や苗のポット、ゴミ袋などに利用されている。本発明の分解方法において適用し得るポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートの数平均分子量は、特に制限はなく、分子量140,000および250,000のポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートの分解については実施例に示している。
【００１８】
ポリエチレンサクシネートとは、ポリブチレンサクシネートのブタンジオールをエチレングリコールに代えたものをいう。機械物性はポリエチレンやポリプロピレンと同等、融点は１００℃と低めであるが、酸素を通しにくいため食品フィルムへの応用が期待されている。本発明の分解方法において適用し得るポリエチレンサクシネートの数平均分子量は、特に制限はなく、分子量60,000のポリエチレンサクシネートの分解については実施例に示している。
【００１９】
更に本発明は、プラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを微生物の作用により分解処理する方法を提供する。該方法は、微生物の増殖過程でプラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する、あるいは微生物の有する酵素の作用によりプラスチックを分解する作用を利用するもの、すなわち増殖した後の微生物菌体、例えば休止菌体を利用するものである。
あるいは、菌体を定法により凍結乾燥した粉末状、その粉末と各種ビタミンやミネラル、必要な栄養源、例えば酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン等を配合した後に打錠した錠剤等固形状の形態の調製物としてプラスチックの処理に提供しても良い。また、菌株を活性汚泥およびコンポストの成分として利用することもできる。
【００２０】
分解に共されるプラスチックは、例えば液体の培地中にエマルジョンとして、あるいは粉体の形で加えても良いし、フィルム、ペレット等の塊として加えても良い。なお、培地に対するプラスチックの投入量は、0.01〜10重量％が望ましい。添加する微生物量は極少量であってもよいが、分解効率を考慮してプラスチックに対して0.1重量％以上（湿重量）が好ましい。また、分解に供するプラスチックは、1種類であっても複数種類であっても良い。
【００２１】
微生物の増殖過程でプラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する態様では、プラスチックを単一の炭素源として与えることも、他の炭素源とともに与えることもできる。使用し得る培地としては、炭素源としては、プラスチックあるいはグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる無類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。
【００２２】
微生物の有する酵素のプラスチックを分解する作用を利用する態様、すなわち増殖した後の微生物菌体、例えば休止菌体を利用する態様では、プラスチックの分解に際し、該微生物の増殖を伴わないため、緩衝液にプラスチックを添加した培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。
【００２３】
プラスチックの分解に要する時間は、分解に供するプラスチックの種類、組成、形状及び量、使用した微生物の種類及び樹脂に対する相対量、その他種々の培養条件等に応じて変化しうる。
【００２４】
本発明において、上記微生物に対し、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養を行えばプラスチックの分解がみられる。好ましくは回転振盪培養が良く、回転数は３０〜２５０回転／分の範囲であるのが良い。培養条件としては、培養温度は１０〜５０℃、特に３０℃付近が好ましい。また、培地のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは７付近であるのが良い。
【００２５】
培地中のプラスチックの分解の確認は、例えば、分解に供したプラスチックの重量減少の測定、エマルジョンとして供する場合はプラスチックの分解によるクリアーゾーンの形成により測定することができる。
【００２６】
【実施例】
本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
実施例１微生物のスクリーニング
エマルジョンの作成方法
各種プラスチックのエマルジョンの作成は以下の方法に従った。各種プラスチック2g を40mlのジクロロメタンに溶解し、40mgのアニオン界面活性剤であるPlysurf A210Gを含んだ蒸留水250mlに加えてホモジナイザー（10,000 rpm 10 min）にてエマルジョン化した。その後、これを80℃に加熱してジクロロメタンを揮発させた。
【００２７】
培地
以下の培地を使用した。 KH₂PO₄ 2.0(g/l); K₂HPO₄, 7.0(g/l); NH₄NO₃, 1.0(g/l); MgSO₄ ^.7H₂O, 0.1(g/l); ZnSO₄ ^.7H₂O, 0.001(g/l); CuSO₄ ^.7H₂O, 0.0001(g/l); FeSO₄ ^.7H₂O, 0.01(g/l); MnSO₄ ^.4-6H₂O, 0.002(g/l)。pH は7.2とした。固体培地として上記の培地に寒天(15 g/l) を加えたものを用いた。
【００２８】
スクリーニング
日本各地より採取した土壌各0.2グラムを内径10mmの大型試験管に入れ培地10mlを加えた。ここにポリ乳酸の粉末2mgを加えて30℃にて振とう培養した。一週間ごとに植え継ぎを４回繰り返した後、エマルジョン化したポリ乳酸（和光純薬（株）より購入）および1g/lの酵母エキスを含んだ寒天平板に希釈塗布した。コロニー周辺にプラスチックの分解に伴うクリヤーゾーンの形成が見られた菌を取得した。
【００２９】
約４００種類の土壌を用いて分解菌の検索を行った結果、最優良株としてTB-13株を選出した。
実施例２微生物の同定
生理学的試験は一般的な方法に従って行った。同定にはBergey's Manual of Systematic Bacteriology (Bergey DH, Krieng NR (1986) P. amylolyticus. In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2. Baltimore: WILLIAUMS&WILKINS Co., pp.1139.)を参考にした。16s rDNAの配列決定と解析は（株）エヌシーアイエムビージャパンに依頼した。
【００３０】
常法に従い、各種生理試験を行った。TB-13株はグラム陰性、好気性の桿菌で、その他の生理学的性質は以下の表１のとおりであった。
【００３１】
【表１】

【００３２】
また、本菌株はグルコース、Ｌ−アラビノース、リボース、マンノース、マンニトール、マルトース、キシロース、フルクトース、N−アセチルグルコサミン、スクロース、トレハロースに生育可能で、グルコナート、ソルビトール、アラビトール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、イヌリンには生育できなかった。
【００３３】
これらの結果をBergey's Manual of Systematic Bacteriology（Bergey DH, Krieng NR (1986) P. amylolyticus In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2. Baltimore: WILLIAUMS&WILKINS Co., pp.1139.）に照らしたところ、TB-13株はペニバチルスアミロリチカス（Paenibacillus amylolyticus）であると同定した。また16S rRNA 遺伝子配列の解析結果からも本菌株はペニバチルスアミロリチカスと97.65%の相同性を示した。
【００３４】
実施例３プラスチック分解試験
材料
エステル型ポリウレタンは、ポリジエチレングリコールアジペート（平均分子量2,500）と2,4-トリレンジイソシアネートより合成した物を用いた。ポリ乳酸は和光純薬（株）より購入した。ポリブチレンサクシネートおよびポリブチレンサクシネート-co-アジペートは（株）昭和高分子製のビオノーレを使用した。ポリエチレンサクシネートは日本触媒社製のルナーレSEをもちいた。アニオン界面活性剤Plysurf A210Gは第一工業製薬社製のものを用いた。
【００３５】
分解試験
ポリウレタンを除く各種プラスチックの分解活性はエマルジョン化した各種プラスチックを含んだ寒天平板上で鑑定した。各種平板に植菌して、30℃にて２週間培養して、コロニー周辺のクリヤーゾーンの形成量を持って分解量とした。
【００３６】
ポリウレタンは有機溶媒に不溶なためエマルジョンを作成できないので、以下の方法で分解試験を行った。酵母エキス1%を含む上記培地10mlにキューブ状のポリウレタン1gをいれ、滅菌後植菌して、30℃にて２週間培養した。分解量は重量法にて測定した。
【００３７】
ペニバチルスアミロリチカスTB-13株を用いて、各種プラスチックに対する分解活性を試験した結果を表２に示した。本菌株はポリ乳酸、ポリブチレンサクシネート-co-アジペートおよびポリエチレンサクシネートに高い分解活性を示した。また、ポリブチレンサクシネートにも弱い分解活性を示した。また、ペニバチルスアミロリチカスTB-13株を用いたポリウレタンに対する分解試験の結果を表３に示した。本菌株はポリウレタンの分解も可能であった。つまり、本菌株は、複数種のプラスチックを分解可能であることが判明した。
【００３８】
【表２】

【００３９】
【表３】

【００４０】
【発明の効果】
本菌株の純粋培養系を用いた各種ポリエステル型プラスチックの集約的分解処理、土壌中やコンポスト中に添加することによる分解処理や肥料として再資源化等への応用が期待される。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel microorganism and a method for decomposing plastics by a biological treatment method using the microorganism.
[0002]
[Prior art]
In recent years, disposal of plastic waste has become a problem. Incineration and landfill are the main methods for treating plastic waste, but incineration has problems such as promotion of global warming and landfill has a decrease in landfill. For example, polyurethane consumes about 6 million tons annually worldwide and about 550,000 tons domestically. Among these, since the foam cushion is excellent in heat insulation, it is used in large quantities as a heat insulating material for refrigerators and the like. At present, this polyurethane waste is often landfilled as incombustible waste, but there are insufficient disposal sites and environmental pollution problems. On the other hand, biodegradation methods using microorganisms are preferable from the viewpoint of the natural environment, but plastics generally have a problem that they are not biodegradable.
[0003]
There are few reports on microorganisms that can degrade plastics.
Examples of microorganisms that degrade polylactic acid include the genus Amycolatopsis (Pranamuda H, Tokiwa Y, Tanaka H (1995) Microbial degradation of an aliphatic polyester with a high melting point, poly (tetramethylene succinate). Envirion. Microbiol. 61: 1828-1832) and Bacillus smitii (Sakai K, Kawano H, Iwami A, Nakamura M, Moriguchi M (2001) Isolation of a thermophilic poly-L-lactide degrading bacterium from compost and its enzymatic characterization. J. Biosci. Bioeng. 92: 298-300).
[0004]
[Non-Patent Document 1]
Pranamuda H, Tokiwa Y, Tanaka H, Microbial degradation of an aliphatic polyester with a high melting point, poly (tetramethylene succinate). Appl. Envirion. Microbiol. 61: 1828-1832, 1995 [Non-patent document 2]
Sakai K, Kawano H, Iwami A, Nakamura M, Moriguchi M, Isolation of a thermophilic poly-L-lactide degrading bacterium from compost and its characteristic characterization.J. Biosci. Bioeng. 92: 298-300, 2001 The molecule contains a urethane bond and an ester bond or an ether bond, and the decomposition proceeds by breaking these bonds. There are several reports that the ester bond of the polyol part is cleaved by mold and bacteria. Darby (Darby RT and Kaplan AM: Appl. Microbiol., 16, 900-905 (1968).) Et al. Conducted various polyurethane degradation tests with fungi and found that ester polyurethanes are more susceptible to degradation than ethers. It has also been reported that the decomposition characteristics differ depending on the type of isocyanate or polyol. Kay (Kay, MJ, McCabe, RW, Morton, LHG: Int. Biodeterio. Biodegrad., 31, 209-225 (1991).) Et al. Isolated 15 types of bacteria as ester-based polyurethane-degrading bacteria. We report the results of the investigation of the degradation characteristics of the strong Corynebacterium spp.
[Non-Patent Document 3]
By Darby RT and Kaplan AM, Appl. Microbiol., 16, 900-905 (1968)
[Non-Patent Document 4]
Kay, MJ, McCabe, RW, Morton, LHG, Int. Biodeterio. Biodegrad., 31, 209-225 (1991)
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to provide a novel microorganism capable of decomposing a plastic, and a method for decomposing a plastic using the microorganism. In particular, an object is to provide a microorganism capable of decomposing a plurality of types of plastics.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In order to solve this problem, we screened microorganisms that degrade plastics, especially plastics that have ester bonds in the molecular structure, and found that microorganisms belonging to the genus Paenibacillus can degrade the plastics. Heretofore, it has not been known that microorganisms belonging to the genus Paenibacillus have the ability of plastics. The present inventors have also found a method for decomposing plastics using microorganisms belonging to the genus Penibacillus.
[0007]
That is, the present invention provides a microorganism belonging to the genus Penibacillus having the ability to degrade plastics, particularly plastics having an ester bond in the molecular structure, and a method for decomposing plastics using microorganisms belonging to the genus Penibacillus. It is to provide. Incidentally, the enzyme derived from the microorganism and having the plastic degrading activity, the amino acid sequence and the gene sequence of the enzyme are the same patent application filed on the same day as the “title of the invention: novel plastic degrading enzyme and gene encoding the enzyme”. Are listed.
[0008]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The microorganism belonging to the genus Penibacillus and having plastic resolution may be a known microorganism or a newly screened microorganism. To show an example of screening for microorganisms, soil collected from various places is put in a test tube containing a medium containing polylactic acid powder, cultured at 30 ° C. with shaking, and planting is repeated every week. It can be carried out by diluting and applying to an agar plate containing emulsified polylactic acid and obtaining bacteria in which a clear zone is formed around the colony due to the decomposition of the plastic.
[0009]
The microorganism of the present invention may be any fungus belonging to the genus Penibacillus having the ability to degrade plastics, particularly plastics having an ester bond in the molecular structure. Specifically, as a representative example, Penibacillus amylolyticus TB-13 strain deposited at the Patent Organism Depositary of National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as of November 14, 2002 ( Accession number FERM P-19104). The mycological properties of the genus Penibacillus are as follows: BERGEY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology (Vol. 1, 1984, Vol. 1986, Vol. 3, 1989, Vol. 4) Vol. 1989).
[0010]
Furthermore, the microorganism of the present invention may be a wild strain or a mutant strain as long as it belongs to the genus Penibacillus having the ability to degrade plastics, particularly plastics having an ester bond in the molecular structure.
[0011]
Mutant strains can be obtained without mutation treatment with ethyl methanesulfonic acid, a commonly used mutation agent, other chemical treatments such as nitrosoguanidine, methylmethanesulfonic acid, ultraviolet irradiation, or treatment with a mutation agent. It can also be obtained by so-called spontaneous mutation.
[0012]
The medium used for culturing the microorganism belonging to the genus Penibacillus can be used without particular limitation as long as it can grow the microorganism belonging to the genus Penibacillus. For example, LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% % NaCl), but is not limited to these. The medium used for the growth of the microorganism of the present invention specifically contains a carbon source that can be assimilated by the microorganism of the present invention, such as glucose, and a nitrogen source that can be assimilated by the microorganism of the present invention. May contain an organic nitrogen source, such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steeple liquor, etc., and an inorganic nitrogen source, such as ammonium sulfate, ammonium chloride and the like. Further, if desired, a salt composed of a cation such as sodium ion, potassium ion, calcium ion or magnesium ion and an anion such as sulfate ion, chlorine ion or phosphate ion may be contained. Furthermore, trace elements such as vitamins and nucleic acids can also be contained. The concentration of the carbon source is, for example, about 0.1 to 10%, and the concentration of the nitrogen source is, for example, about 0.01 to 5%, depending on the type. Moreover, the density | concentration of inorganic salt is about 0.001-1%, for example.
[0013]
The plastic that can be decomposed in the present invention may be any plastic having an ester bond in the molecular structure of the plastic. Non-limiting examples include polylactic acid, polyurethane, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate, and polyethylene succinate.
[0014]
Polylactic acid refers to a polymer containing lactic acid as a main component. Poly L-lactic acid, polylactic acid homopolymer such as poly D-lactic acid, poly L / D-lactic acid copolymer, and ε-caprolactone , A polylactic acid copolymer obtained by copolymerizing other components such as glycolide, depsipeptide, and the like, and blends between the above polymers and with other component polymers. As the polymerization method, a direct polymerization method from lactic acid, a ring-opening polymerization method via lactide (a cyclic dimer of lactic acid), and the like are known. The number average molecular weight of the polylactic acid resin that can be applied in the decomposition method of the present invention is not particularly limited, and the decomposition of polylactic acid having a molecular weight of 5,000 to 20,000 is shown in the Examples.
[0015]
Polyurethane is a general term for polymer compounds having a urethane bond (—NHCOO—) in the molecule, and is obtained by reaction of a polyfunctional isocyanate and a hydroxyl group-containing compound, and groups such as ester, ether, amide, urea, carbamate, etc. It is a polymer having A wide variety of branched or cross-linked polymers can be prepared by varying the functional number of the hydroxyl or isocyanate groups. Depending on the type of polyol used, it can be broadly divided into ester and ether types. Polyurethanes have a wide range of applications such as elastic bodies, foams, adhesives, paints, fibers, and synthetic leather due to excellent properties such as easy processability, rot resistance, alteration resistance, and low specific gravity. Are also widely used. The number average molecular weight of the polyurethane resin that can be applied in the decomposition method of the present invention is not particularly limited.
[0016]
Polybutylene succinate is a polymer composed of succinic acid and butanediol. It has mechanical strength similar to polypropylene and PET, and its melting point is higher than that of polycaprolactone. Molding processability is close to that of polyethylene, and the same type of molding machine can be used. The number average molecular weight of polybutylene succinate that can be applied in the decomposition method of the present invention is not particularly limited, and the decomposition of polybutylene succinate having a molecular weight of 140,000 is shown in the Examples.
[0017]
The polybutylene succinate-co-adipate is a polymer prepared by adding adipic acid to a raw material in the synthesis of polybutylene succinate. The melting point drops to around 90 ° C, but flexibility is improved. Used for packaging materials, seedling pots, garbage bags, etc. The number average molecular weight of polybutylene succinate-co-adipate that can be applied in the degradation method of the present invention is not particularly limited. Yes.
[0018]
Polyethylene succinate refers to polybutylene succinate with butanediol replaced with ethylene glycol. The mechanical properties are the same as polyethylene and polypropylene, and the melting point is as low as 100 ° C., but it is expected to be applied to food films because it is difficult for oxygen to pass through. The number average molecular weight of polyethylene succinate that can be applied in the decomposition method of the present invention is not particularly limited, and the decomposition of polyethylene succinate having a molecular weight of 60,000 is shown in the Examples.
[0019]
Furthermore, the present invention provides a method for decomposing plastics, particularly plastics having an ester bond in the molecular structure, by the action of microorganisms. This method uses the fact that plastic is decomposed and consumed as a nutrient source in the growth process of microorganisms, or uses the action of decomposing plastics by the action of the enzyme of microorganisms, that is, microbial cells after growth For example, resting cells are used.
Alternatively, preparation of solid form such as a powder obtained by freeze-drying bacterial cells by a conventional method, a tablet compressed after blending the powder, various vitamins and minerals, and necessary nutrient sources such as yeast extract, casamino acid, peptone, etc. It may be provided for the processing of plastics as a product. The strain can also be used as an activated sludge and compost component.
[0020]
The plastic used for the decomposition may be added, for example, as an emulsion in a liquid medium or in the form of a powder, or may be added as a lump such as a film or a pellet. In addition, as for the input amount of the plastic with respect to a culture medium, 0.01 to 10 weight% is desirable. Although the amount of microorganisms to be added may be extremely small, it is preferably 0.1% by weight or more (wet weight) with respect to the plastic in consideration of decomposition efficiency. Further, the plastic to be decomposed may be one kind or plural kinds.
[0021]
In embodiments that utilize the fact that plastic is degraded and consumed as a nutrient source during the growth of microorganisms, the plastic can be provided as a single carbon source or with other carbon sources. Examples of the medium that can be used include plastic or glucose as a carbon source, and a nitrogen source that can be assimilated by the microorganism of the present invention, and an organic nitrogen source such as peptone, meat extract, yeast extract, and corn -An inorganic nitrogen source such as a steeple liquor, for example, ammonium sulfate, ammonium chloride and the like can be contained. Furthermore, if desired, a unique species comprising a cation such as sodium ion, potassium ion, calcium ion and magnesium ion and an anion such as sulfate ion, chlorine ion and phosphate ion may be included. Furthermore, trace elements such as vitamins and nucleic acids can also be contained. The concentration of the carbon source is, for example, about 0.1 to 10%, and the concentration of the nitrogen source is, for example, about 0.01 to 5%, depending on the type. Moreover, the density | concentration of inorganic salt is about 0.001-1%, for example.
[0022]
In an embodiment using the action of decomposing plastic of an enzyme possessed by a microorganism, that is, in an embodiment using a microbial cell after growth, for example, a resting microbial cell, there is no growth of the microorganism when the plastic is decomposed. A culture medium or the like to which a plastic is added may be used, but a nitrogen source, an inorganic salt, a vitamin, or the like may also be added. Examples of the buffer solution include a phosphate buffer solution.
[0023]
The time required for the plastic decomposition can vary depending on the type, composition, shape and amount of plastic to be decomposed, the type of microorganism used and the relative amount to the resin, and other various culture conditions.
[0024]
In the present invention, when the above microorganism is subjected to stationary culture, shaking culture or aeration culture under aerobic conditions, the plastic is decomposed. Preferably, rotary shaking culture is good, and the number of rotations is in the range of 30 to 250 rotations / minute. As culture conditions, the culture temperature is preferably 10 to 50 ° C., particularly around 30 ° C. The pH of the medium is in the range of 4 to 10, preferably around 7.
[0025]
Confirmation of the degradation of the plastic in the medium can be measured, for example, by measuring the weight loss of the plastic subjected to the degradation, or by forming a clear zone due to the degradation of the plastic when used as an emulsion.
[0026]
【Example】
The present invention will be described in more detail with reference to examples, but the scope of the present invention is not limited to these examples.
Example 1 Screening of microorganisms Method for preparing emulsions Emulsions of various plastics were prepared according to the following method. 2 g of various plastics were dissolved in 40 ml of dichloromethane, added to 250 ml of distilled water containing 40 mg of an anionic surfactant Plysurf A210G, and emulsified with a homogenizer (10,000 rpm 10 min). Thereafter, this was heated to 80 ° C. to volatilize dichloromethane.
[0027]
The following medium was used. _{_{KH 2 PO 4 2.0 (g /}} l); K 2 HPO 4, 7.0 (g / l); NH 4 NO 3, 1.0 (g / l);. MgSO 4 7H 2 O, 0.1 (g / l); ZnSO _{^{_{. 4 7H 2 O, 0.001 (}}} g / l);. CuSO 4 7H 2 O, 0.0001 (g / l);. FeSO 4 7H 2 O, 0.01 (g / l);. MnSO 4 4-6H 2 O, 0.002 (g / l). The pH was 7.2. As the solid medium, the above medium added with agar (15 g / l) was used.
[0028]
Screening 0.2 g of soil collected from various places in Japan was placed in a large test tube with an inner diameter of 10 mm and 10 ml of medium was added. To this, 2 mg of polylactic acid powder was added and cultured at 30 ° C. with shaking. After repeating the transplantation four times every week, it was diluted and applied to an agar plate containing emulsified polylactic acid (purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 1 g / l yeast extract. Bacteria in which a clear zone was formed around the colony due to plastic degradation were obtained.
[0029]
As a result of searching for degrading bacteria using about 400 kinds of soil, TB-13 strain was selected as the best strain.
Example 2 Identification of microorganisms Physiological tests were performed according to general methods. For identification, reference was made to Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Bergey DH, Krieng NR (1986) P. amylolyticus. In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2. Baltimore: WILLIAUMS & WILKINS Co., pp. 1139). The sequencing and analysis of 16s rDNA was requested from NMC Japan.
[0030]
Various physiological tests were performed according to a conventional method. The TB-13 strain is a Gram-negative, aerobic Neisseria gonorrhoeae, and other physiological properties are shown in Table 1 below.
[0031]
[Table 1]

[0032]
In addition, this strain can grow on glucose, L-arabinose, ribose, mannose, mannitol, maltose, xylose, fructose, N-acetylglucosamine, sucrose, trehalose, gluconate, sorbitol, arabitol, erythritol, D-arabinose, inulin Could not grow.
[0033]
These results were compared with Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Bergey DH, Krieng NR (1986) P. amylolyticus In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2. Baltimore: WILLIAUMS & WILKINS Co., pp. 1139.) The -13 strain was identified as Paenibacillus amylolyticus. From the analysis result of 16S rRNA gene sequence, this strain showed 97.65% homology with Penibacillus amylolyticus.
[0034]
Example 3 Plastic degradation test The material ester type polyurethane used was synthesized from polydiethylene glycol adipate (average molecular weight 2,500) and 2,4-tolylene diisocyanate. Polylactic acid was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. As the polybutylene succinate and polybutylene succinate-co-adipate, Bionole manufactured by Showa High Polymer Co., Ltd. was used. Polyethylene succinate used Lunare SE manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd. An anionic surfactant Plysurf A210G manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku Co., Ltd. was used.
[0035]
Degradation test The degradation activity of various plastics excluding polyurethane was evaluated on an agar plate containing various emulsified plastics. Each plate was inoculated and cultured at 30 ° C. for 2 weeks. The amount of clear zone around the colony was taken as the amount of degradation.
[0036]
Since polyurethane is insoluble in an organic solvent, an emulsion cannot be prepared. Therefore, a decomposition test was conducted by the following method. 10 g of the above medium containing 1% yeast extract was charged with 1 g of cube-shaped polyurethane, sterilized, inoculated, and cultured at 30 ° C. for 2 weeks. The amount of decomposition was measured by a gravimetric method.
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Table 2 shows the results of testing the degradation activity against various plastics using Penibacillus amylolyticus TB-13 strain. This strain showed high degradation activity for polylactic acid, polybutylene succinate-co-adipate and polyethylene succinate. Polybutylene succinate also showed weak degradation activity. Table 3 shows the results of a degradation test for polyurethane using Penibacillus amylolyticus TB-13 strain. This strain was also capable of degrading polyurethane. That is, it was found that this strain can decompose a plurality of types of plastics.
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[Table 2]

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[Table 3]

[0040]
【The invention's effect】
It is expected to be applied to intensive decomposition treatment of various polyester type plastics using a pure culture system of this strain, recycling treatment by adding it to soil and compost, and recycling as fertilizer.

Claims

A microorganism belonging to Penibacillus amylolyticus and having one or more plastic resolutions selected from the group consisting of polyurethane, polylactic acid, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate, and polyethylene succinate, Or its mutants with plastic resolution.

Penibacillus amylolyticus TB-13 strain (Accession number FERM P-19104).

A method for degrading one or more plastics selected from the group consisting of polyurethane, polylactic acid, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate, and polyethylene succinate, comprising Penibacillus amylolyticus A microorganism or variant thereof having one or more plastic degradability selected from the group consisting of polyurethane, polylactic acid, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate, and polyethylene succinate, and A method for decomposing the plastic, comprising the step of contacting the plastic or a mixture containing the plastic.

The degradation method according to claim 3, wherein the microorganism is Penibacillus amylolyticus TB-13 strain (Accession No. FERM P-19104).