JP2004166542A

JP2004166542A - New plastic decomposing bacterium

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Publication number: JP2004166542A
Application number: JP2002334162A
Authority: JP
Inventors: Toshiaki Kanbe; 敏明神戸; Yukie Shigeno; ゆき枝茂野
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2002-11-18
Filing date: 2002-11-18
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2022-11-18
Also published as: JP4214372B2

Abstract

<P>PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a bacterium decomposing a plastic since there is a problem that a plastic is not generally biodegradable, though a biodegradation method using a bacterium is preferable as a method for treating a plastic in terms of the natural environment and to provide a method for decomposing a plastic using the bacterium. <P>SOLUTION: The bacterium belonging to the genus Paenibacillus has ability of decomposing a plastic containing an ester bond in the molecular structure. The method for decomposing a plastic comprises using the bacterium belonging to the genus Paenibacillus. <P>COPYRIGHT: (C)2004,JPO

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な微生物、および該微生物を用いる生物学的処理法によるプラスチックの分解方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年、プラスチック廃棄物の処理が問題になっている。プラスチック廃棄物の処理方法としては焼却や埋め立てが主であるが、焼却は地球温暖化の促進、埋め立ては埋立地の減少等の問題を抱えている。例えばポリウレタンは、全世界で年間約６００万ｔ，国内では約５５万ｔが消費されている。このうち、その発泡緩衝体は断熱性に優れることから冷蔵庫等の断熱材として大量に利用されている。現在、このポリウレタン廃棄物は不燃ゴミとして埋め立て処分される場合が多いが処分場の不足ならびに環境汚染の問題が生じている。一方、自然環境の点から好ましいものに微生物を利用した生分解法があるが、プラスチックは一般に生分解性ではないという問題を有する。
【０００３】
プラスチックを分解できる微生物に関する報告は少ないが、その例を以下に示す。
ポリ乳酸を分解する微生物の例としては、アミコラトプシス（Ａｍｙｃｏｌａｔｏｐｓｉｓ）属菌（ＰｒａｎａｍｕｄａＨ，ＴｏｋｉｗａＹ，ＴａｎａｋａＨ（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆａｎａｌｉｐｈａｔｉｃｐｏｌｙｅｓｔｅｒｗｉｔｈａｈｉｇｈｍｅｌｔｉｎｇｐｏｉｎｔ，ｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓｕｃｃｉｎａｔｅ）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：１８２８−１８３２）やバシラススミッチイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｍｉｔｉｉ）（ＳａｋａｉＫ，ＫａｗａｎｏＨ，ＩｗａｍｉＡ，ＮａｋａｍｕｒａＭ，ＭｏｒｉｇｕｃｈｉＭ（２００１）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅｄｅｇｒａｄｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｏｍｃｏｍｐｏｓｔａｎｄｉｔｓｅｎｚｙｍａｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９２：２９８−３００）等が報告されている。
【０００４】
【非特許文献１】
ＰｒａｎａｍｕｄａＨ，ＴｏｋｉｗａＹ，ＴａｎａｋａＨ著、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆａｎａｌｉｐｈａｔｉｃｐｏｌｙｅｓｔｅｒｗｉｔｈａｈｉｇｈｍｅｌｔｉｎｇｐｏｉｎｔ，ｐｏｌｙ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｓｕｃｃｉｎａｔｅ）．Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｉｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６１：１８２８−１８３２、１９９５年
【非特許文献２】
ＳａｋａｉＫ，ＫａｗａｎｏＨ，ＩｗａｍｉＡ，ＮａｋａｍｕｒａＭ，ＭｏｒｉｇｕｃｈｉＭ著、Ｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅｄｅｇｒａｄｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｒｏｍｃｏｍｐｏｓｔａｎｄｉｔｓｅｎｚｙｍａｔｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．９２：２９８−３００、２００１年
ポリウレタンは分子内にウレタン結合及びエステル結合またはエーテル結合を含み、それらの結合が切断されることによって分解が進む。ポリオール部分のエステル結合はカビや細菌によって切断されるという報告が数例ある。Ｄａｒｂｙ（ＤａｒｂｙＲ．Ｔ．ａｎｄＫａｐｌａｎＡ．Ｍ．：Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６，９００−９０５（１９６８）．）らはカビによる種々のポリウレタン分解試験を行い、エーテル系よりもエステル系ポリウレタンの方が分解を受け易いことや、イソシアネートやポリオールの種類によって分解特性が異なることを報告している。Ｋａｙ（Ｋａｙ，Ｍ．Ｊ．，ＭｃＣａｂｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｍｏｒｔｏｎ，Ｌ．Ｈ．Ｇ．：Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄ．，３１，２０９−２２５（１９９１）．）らはエステル系ポリウレタン分解菌として１５種類の菌を単離し、分解力の強かったＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属菌について分解特性を検討した結果について報告している。
【非特許文献３】
ＤａｒｂｙＲ．Ｔ．ａｎｄＫａｐｌａｎＡ．Ｍ．著、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１６，９００−９０５（１９６８）
【非特許文献４】
Ｋａｙ，Ｍ．Ｊ．，ＭｃＣａｂｅ，Ｒ．Ｗ．，Ｍｏｒｔｏｎ，Ｌ．Ｈ．Ｇ．著、Ｉｎｔ．Ｂｉｏｄｅｔｅｒｉｏ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄ．，３１，２０９−２２５（１９９１）
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、プラスチックを分解することのできる新規微生物、および該微生物を用いたプラスチックの分解方法を提供することを目的とする。特に、複数種のプラスチックを分解することのできる微生物を提供することを目的とする。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
この問題を解決するため、我々はプラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する微生物のスクリーングを行い、ペニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が該プラスチックを分解できることを見出した。尚、ペニバチルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物が該プラスチックの分解能を有することはこれまで知られていなかった。また、本発明者らはペニバチルス属に属する微生物を用いるプラスチックの分解方法を見出した。
【０００７】
即ち、本発明はプラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有するペニバチルス属に属する微生物を提供するものであり、また、ペニバチルス属に属する微生物を用いたプラスチックの分解方法を提供するものである。尚、該微生物由来のプラスチック分解活性を有する酵素、該酵素のアミノ酸配列および遺伝子配列は、同一出願人による「発明の名称：新規なプラスチック分解酵素および該酵素をコードする遺伝子」の同日特許出願に記載されている。
【０００８】
【発明の実施の形態】
ペニバチルス属に属し、プラスチック分解能を有する微生物は、既に公知の微生物であってもよく、新たにスクリーニングされた微生物であってもよい。微生物のスクリーニングの一例を示せば、各地より採取した土壌をポリ乳酸の粉末を含む培地の入った試験管に入れ、３０℃にて振とう培養し、一週間ごとに植え継ぎを繰り返した後、エマルジョン化したポリ乳酸を含んだ寒天平板に希釈塗布し、コロニー周辺にプラスチックの分解に伴うクリヤーゾーンの形成が見られた菌を取得することにより行うことができる。
【０００９】
本発明の微生物は、プラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有するペニバチルス属菌であればよい。具体的には、代表例として、平成１４年１１月１４日付けで、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されたペニバチルスアミロリチカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＴＢ−１３株（受託番号ＦＥＲＭＰ−１９１０４）が挙げられる。ペニバチルス属菌の菌学的性質は、バージーズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリオロジー（ＢＥＲＧＥＹ’ＳＭＡＮＵＡＬＯＦＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）（第１巻１９８４年、第２巻１９８６年、第３巻１９８９年、第４巻１９８９年）に記載されている。
【００１０】
更に本発明の微生物は、プラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを分解する能力を有するペニバチルス属菌であれば、野生株、変異株のいずれでも良い。
【００１１】
変異株は、従来からよく用いられている変異剤であるエチルメタンスルホン酸による変異処理、ニトロソグアニジン、メチルメタンスルホン酸などの他の化学物質処理、紫外線照射、或いは変異剤処理なしで得られる、いわゆる自然突然変異によって取得することも可能である。
【００１２】
ペニバチルス属に属する微生物の培養に用いる培地としては、ペニバチルス属に属する微生物が生育できる培地であれば特に制限なく用いることができ、例えば、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）が挙げられるがこれらに限定されない。本発明の微生物の生育に使用する培地は、具体的には、本発明の微生物が資化し得る炭素源、例えばグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる塩類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。
【００１３】
本発明において分解できるプラスチックは、プラスチックの分子構造中にエステル結合を有するものであればよい。制限的でない例としては、ポリ乳酸、ポリウレタン、ポリブチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート―ｃｏ―アジペート、およびポリエチレンサクシネートが挙げられる。
【００１４】
ポリ乳酸とは、乳酸を主要成分とする重合体をさし、ポリＬ−乳酸や、ポリＤ−乳酸等のポリ乳酸ホモポリマー、ポリＬ／Ｄ−乳酸共重合体、およびこれらにε−カプロラクトン、グリコリド、デプシペプチド等の他の成分を共重合させたポリ乳酸共重合体、そして上記ポリマー間、および他の成分ポリマーとのブレンド体を含む。その重合方法としては、乳酸からの直接重合法、ラクタイド（乳酸の環状二量体）を介する開環重合法等が知られている。また、本発明の分解方法において適用し得るポリ乳酸樹脂の数平均分子量は、特に制限はなく、分子量５，０００〜２０，０００のポリ乳酸の分解については実施例に示している。
【００１５】
ポリウレタンとは、分子中にウレタン結合（−ＮＨＣＯＯ−）を有する高分子化合物の総称で、多官能イソシアネートとヒドロキル基含有化合物との反応により得られ、エステル、エーテル、アミド、ウレア、カルバメートなどの基を有するポリマーである。ヒドロキシル基もしくはイソシアネート基の官能性数を変化させることで多種多様の分岐あるいは架橋ポリマーを調製することができる。用いるポリオールの種類によってエステル系とエーテル系に大別できる。ポリウレタンは、易加工性、耐腐敗性、耐変質性、低比重等の優れた特性により、弾性体、発泡体、接着剤、塗料、繊維、合成皮革など幅広い用途を持っており、自動車部品としても広く使用されている。本発明の分解方法において適用し得るポリウレタン樹脂の数平均分子量は、特に制限はない。
【００１６】
ポリブチレンサクシネートとは、コハク酸とブタンジオールからなる高分子をいう。ポリプロピレンやＰＥＴなみの機械的強度を有し、融点もポリカプロラクトンより高い。成形加工性もポリエチレンに近く、同種の成形加工機が使用できる。本発明の分解方法において適用し得るポリブチレンサクシネートの数平均分子量は、特に制限はなく、分子量１４０，０００のポリブチレンサクシネートの分解については実施例に示している。
【００１７】
ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートとは、ポリブチレンサクシネート合成において原料にアジピン酸を加えることにより調製される高分子をいう。融点は９０℃ぐらいにまで下がるが、柔軟性が向上する。包装材や苗のポット、ゴミ袋などに利用されている。本発明の分解方法において適用し得るポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートの数平均分子量は、特に制限はなく、分子量１４０，０００および２５０，０００のポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートの分解については実施例に示している。
【００１８】
ポリエチレンサクシネートとは、ポリブチレンサクシネートのブタンジオールをエチレングリコールに代えたものをいう。機械物性はポリエチレンやポリプロピレンと同等、融点は１００℃と低めであるが、酸素を通しにくいため食品フィルムへの応用が期待されている。本発明の分解方法において適用し得るポリエチレンサクシネートの数平均分子量は、特に制限はなく、分子量６０，０００のポリエチレンサクシネートの分解については実施例に示している。
【００１９】
更に本発明は、プラスチック、特に分子構造中にエステル結合を有するプラスチックを微生物の作用により分解処理する方法を提供する。該方法は、微生物の増殖過程でプラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する、あるいは微生物の有する酵素の作用によりプラスチックを分解する作用を利用するもの、すなわち増殖した後の微生物菌体、例えば休止菌体を利用するものである。
あるいは、菌体を定法により凍結乾燥した粉末状、その粉末と各種ビタミンやミネラル、必要な栄養源、例えば酵母エキス、カザミノ酸、ペプトン等を配合した後に打錠した錠剤等固形状の形態の調製物としてプラスチックの処理に提供しても良い。また、菌株を活性汚泥およびコンポストの成分として利用することもできる。
【００２０】
分解に共されるプラスチックは、例えば液体の培地中にエマルジョンとして、あるいは粉体の形で加えても良いし、フィルム、ペレット等の塊として加えても良い。なお、培地に対するプラスチックの投入量は、０．０１〜１０重量％が望ましい。添加する微生物量は極少量であってもよいが、分解効率を考慮してプラスチックに対して０．１重量％以上（湿重量）が好ましい。また、分解に供するプラスチックは、１種類であっても複数種類であっても良い。
【００２１】
微生物の増殖過程でプラスチックが分解され栄養源として消費されることを利用する態様では、プラスチックを単一の炭素源として与えることも、他の炭素源とともに与えることもできる。使用し得る培地としては、炭素源としては、プラスチックあるいはグルコース等、及び本発明の微生物が資化し得る窒素源を含有し、窒素源としては有機窒素源、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーン・スチープ・リカー等、無機窒素源、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等を含有することができる。さらに所望により、ナトリウムイオン、カリウムイオン、カルシウムイオン、マグネシウムイオン等の陽イオンと硫酸イオン、塩素イオン、リン酸イオン等の陰イオンとからなる無類を含んでもよい。さらに、ビタミン類、核酸類等の微量要素を含有することもできる。炭素源の濃度は、例えば０．１〜１０％程度であり、窒素源の濃度は、種類により異るが、例えば０．０１〜５％程度である。また、無機塩類の濃度は、例えば０．００１〜１％程度である。
【００２２】
微生物の有する酵素のプラスチックを分解する作用を利用する態様、すなわち増殖した後の微生物菌体、例えば休止菌体を利用する態様では、プラスチックの分解に際し、該微生物の増殖を伴わないため、緩衝液にプラスチックを添加した培地などであっても良いが、その他に窒素源、無機塩、ビタミンなどを添加しても良い。緩衝液としては、例えばリン酸緩衝液が挙げられる。
【００２３】
プラスチックの分解に要する時間は、分解に供するプラスチックの種類、組成、形状及び量、使用した微生物の種類及び樹脂に対する相対量、その他種々の培養条件等に応じて変化しうる。
【００２４】
本発明において、上記微生物に対し、好気条件で、静置培養、振盪培養あるいは通気培養を行えばプラスチックの分解がみられる。好ましくは回転振盪培養が良く、回転数は３０〜２５０回転／分の範囲であるのが良い。培養条件としては、培養温度は１０〜５０℃、特に３０℃付近が好ましい。また、培地のｐＨは４〜１０の範囲、好ましくは７付近であるのが良い。
【００２５】
培地中のプラスチックの分解の確認は、例えば、分解に供したプラスチックの重量減少の測定、エマルジョンとして供する場合はプラスチックの分解によるクリアーゾーンの形成により測定することができる。
【００２６】
【実施例】本発明を実施例によってさらに詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらのみに限定されるものではない。
実施例１微生物のスクリーニング
エマルジョンの作成方法
各種プラスチックのエマルジョンの作成は以下の方法に従った。各種プラスチック２ｇを４０ｍｌのジクロロメタンに溶解し、４０ｍｇのアニオン界面活性剤であるＰｌｙｓｕｒｆＡ２１０Ｇを含んだ蒸留水２５０ｍｌに加えてホモジナイザー（１０，０００ｒｐｍ１０ｍｉｎ）にてエマルジョン化した。その後、これを８０℃に加熱してジクロロメタンを揮発させた。
【００２７】
培地
以下の培地を使用した。ＫＨ_２ＰＯ_４２．０（ｇ／ｌ）；Ｋ_２ＨＰＯ_４，７．０（ｇ／ｌ）；ＮＨ_４ＮＯ_３，１．０（ｇ／ｌ）；ＭｇＳＯ_４ ^．７Ｈ_２Ｏ，０．１（ｇ／ｌ）；ＺｎＳＯ_４ ^．７Ｈ_２Ｏ，０．００１（ｇ／ｌ）；ＣｕＳＯ_４ ^．７Ｈ_２Ｏ，０．０００１（ｇ／ｌ）；ＦｅＳＯ_４ ^．７Ｈ_２Ｏ，０．０１（ｇ／ｌ）；ＭｎＳＯ_４ ^．４−６Ｈ_２Ｏ，０．００２（ｇ／ｌ）。ｐＨは７．２とした。固体培地として上記の培地に寒天（１５ｇ／ｌ）を加えたものを用いた。
【００２８】
スクリーニング
日本各地より採取した土壌各０．２グラムを内径１０ｍｍの大型試験管に入れ培地１０ｍｌを加えた。ここにポリ乳酸の粉末２ｍｇを加えて３０℃にて振とう培養した。一週間ごとに植え継ぎを４回繰り返した後、エマルジョン化したポリ乳酸（和光純薬（株）より購入）および１ｇ／ｌの酵母エキスを含んだ寒天平板に希釈塗布した。コロニー周辺にプラスチックの分解に伴うクリヤーゾーンの形成が見られた菌を取得した。
【００２９】
約４００種類の土壌を用いて分解菌の検索を行った結果、最優良株としてＴＢ−１３株を選出した。
実施例２微生物の同定
生理学的試験は一般的な方法に従って行った。同定にはＢｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＢｅｒｇｅｙＤＨ，ＫｒｉｅｎｇＮＲ（１９８６）Ｐ．ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ．Ｉｎ：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：ＷＩＬＬＩＡＵＭＳ＆ＷＩＬＫＩＮＳＣｏ．，ｐｐ．１１３９．）を参考にした。１６ｓｒＤＮＡの配列決定と解析は（株）エヌシーアイエムビージャパンに依頼した。
【００３０】
常法に従い、各種生理試験を行った。ＴＢ−１３株はグラム陰性、好気性の桿菌で、その他の生理学的性質は以下の表１のとおりであった。
【００３１】
【表１】

【００３２】
また、本菌株はグルコース、Ｌ−アラビノース、リボース、マンノース、マンニトール、マルトース、キシロース、フルクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、スクロース、トレハロースに生育可能で、グルコナート、ソルビトール、アラビトール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、イヌリンには生育できなかった。
【００３３】
これらの結果をＢｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（ＢｅｒｇｅｙＤＨ，ＫｒｉｅｎｇＮＲ（１９８６）Ｐ．ａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓＩｎ：Ｂｅｒｇｅｙ’ｓＭａｎｕａｌｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２．Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ：ＷＩＬＬＩＡＵＭＳ＆ＷＩＬＫＩＮＳＣｏ．，ｐｐ．１１３９．）に照らしたところ、ＴＢ−１３株はペニバチルスアミロリチカス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）であると同定した。また１６ＳｒＲＮＡ遺伝子配列の解析結果からも本菌株はペニバチルスアミロリチカスと９７．６５％の相同性を示した。
【００３４】
実施例３プラスチック分解試験
材料
エステル型ポリウレタンは、ポリジエチレングリコールアジペート（平均分子量２，５００）と２，４−トリレンジイソシアネートより合成した物を用いた。ポリ乳酸は和光純薬（株）より購入した。ポリブチレンサクシネートおよびポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートは（株）昭和高分子製のビオノーレを使用した。ポリエチレンサクシネートは日本触媒社製のルナーレＳＥをもちいた。アニオン界面活性剤ＰｌｙｓｕｒｆＡ２１０Ｇは第一工業製薬社製のものを用いた。
【００３５】
分解試験
ポリウレタンを除く各種プラスチックの分解活性はエマルジョン化した各種プラスチックを含んだ寒天平板上で鑑定した。各種平板に植菌して、３０℃にて２週間培養して、コロニー周辺のクリヤーゾーンの形成量を持って分解量とした。
【００３６】
ポリウレタンは有機溶媒に不溶なためエマルジョンを作成できないので、以下の方法で分解試験を行った。酵母エキス１％を含む上記培地１０ｍｌにキューブ状のポリウレタン１ｇをいれ、滅菌後植菌して、３０℃にて２週間培養した。分解量は重量法にて測定した。
【００３７】
ペニバチルスアミロリチカスＴＢ−１３株を用いて、各種プラスチックに対する分解活性を試験した結果を表２に示した。本菌株はポリ乳酸、ポリブチレンサクシネート−ｃｏ−アジペートおよびポリエチレンサクシネートに高い分解活性を示した。また、ポリブチレンサクシネートにも弱い分解活性を示した。また、ペニバチルスアミロリチカスＴＢ−１３株を用いたポリウレタンに対する分解試験の結果を表３に示した。本菌株はポリウレタンの分解も可能であった。つまり、本菌株は、複数種のプラスチックを分解可能であることが判明した。
【００３８】
【表２】

【００３９】
【表３】

【００４０】
【発明の効果】本菌株の純粋培養系を用いた各種ポリエステル型プラスチックの集約的分解処理、土壌中やコンポスト中に添加することによる分解処理や肥料として再資源化等への応用が期待される。[0001]
The present invention relates to a novel microorganism and a method for decomposing plastic by a biological treatment method using the microorganism.
[0002]
2. Description of the Related Art In recent years, treatment of plastic waste has become a problem. Incineration and landfills are the main methods of treating plastic waste, but incineration has problems such as promotion of global warming and landfilling has a problem of reduction of landfills. For example, about 6 million tons of polyurethane are consumed worldwide every year, and about 550,000 t in Japan. Among them, the foamed buffer is used in large quantities as a heat insulating material for refrigerators and the like because of its excellent heat insulating properties. At present, this polyurethane waste is often landfilled as non-combustible garbage, but there is a shortage of disposal sites and problems of environmental pollution. On the other hand, a biodegradation method using microorganisms is preferable in view of the natural environment, but plastics generally have a problem that they are not biodegradable.
[0003]
Although there are few reports on microorganisms that can degrade plastic, examples are shown below.
Examples of microorganisms that degrade polylactic acid include Amycolatopsis genus (Pranamuda H, Tokyo Y, and Tanaka H (1995) Microbial degradation of the analytic polyhedral liposome hop elimination of the lipophilic liposome hops). ... Envirion Microbiol 61: 1828-1832) and Bacillus scan Mitch Lee (Bacillus smitii) (Sakai K, Kawano H, Iwami A, Nakamura M, Moriguchi M (2001) Isolation of a thermophilic poly-L-lacti e degrading bacterium from compost and its enzymatic characterization J. Biosci Bioeng 92:... 298-300) and the like have been reported.
[0004]
[Non-patent document 1]
Pranamuda H, Tokyo Y, Tanaka H, Microbial degradation of an aliphatic polymer with a high melting point, poly (tetramethylene succ.). Appl. Envirion. Microbiol. 61: 1828-1832, 1995 [Non-Patent Document 2]
Sakai K, Kawano H, Iwami A, Nakamura M, Moriguchi M, Isolation of the thermophilic poly-L-lactide catalyzing stomach framing stomach framing scoping. J. Biosci. Bioeng. 92: 298-300, 2001 Polyurethane contains a urethane bond and an ester bond or an ether bond in a molecule, and the decomposition proceeds by breaking these bonds. There are several reports that ester bonds in the polyol moiety are cleaved by mold and bacteria. Darby (Darby RT and Kaplan A. M .: Appl. Microbiol., 16, 900-905 (1968)) conducted various types of polyurethane decomposition tests using mold and found that ester-based polyurethanes were better than ether-based polyurethanes. Report that susceptible to decomposition and that the decomposition characteristics vary depending on the type of isocyanate or polyol. Kay (Kay, MJ, McCabe, RW, Morton, LHG: Int. Biodeterio. Biodegrad., 31, 209-225 (1991)) and the like as ester-based polyurethane-decomposing bacteria. The report describes the results of isolating 15 types of bacteria and examining the degradation characteristics of Corynebacterium spp.
[Non-Patent Document 3]
Darby R. T. and Kaplan A. M. Authors, Appl. Microbiol. , 16, 900-905 (1968).
[Non-patent document 4]
Kay, M .; J. McCabe, R .; W. Morton, L .; H. G. FIG. Author, Int. Biodeterio. Biodegrad. , 31, 209-225 (1991)
[0005]
SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to provide a novel microorganism capable of decomposing plastic and a method for decomposing plastic using the microorganism. In particular, an object is to provide a microorganism capable of decomposing a plurality of types of plastics.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
To solve this problem, we screened for microorganisms that degrade plastics, especially plastics that have ester bonds in the molecular structure, and found that microorganisms belonging to the genus Paenibacillus can degrade the plastics. It has not been known that a microorganism belonging to the genus Paenibacillus has the resolution of the plastic. In addition, the present inventors have found a method for decomposing plastic using a microorganism belonging to the genus Penibacillus.
[0007]
That is, the present invention provides a microorganism belonging to the genus Penibacilus, which has the ability to degrade plastics, particularly plastics having an ester bond in the molecular structure, and a method for decomposing plastics using a microorganism belonging to the genus Penibacilus. To provide. The enzyme derived from the microorganism and having an activity of decomposing plastic, an amino acid sequence and a gene sequence of the enzyme are disclosed in the same applicant's patent application “Title of the Invention: Novel Plastic Degrading Enzyme and Gene Encoding the Enzyme” on the same day. Has been described.
[0008]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Microorganisms belonging to the genus Penibacilus and having the ability to degrade plastics may be already known microorganisms, or may be microorganisms newly screened. As an example of screening for microorganisms, soil collected from various places is placed in a test tube containing a medium containing polylactic acid powder, shake-cultured at 30 ° C., and subculture is repeated every week. It can be carried out by diluting and applying to an agar plate containing emulsified polylactic acid, and obtaining a bacterium in which a clear zone is formed around the colony due to decomposition of the plastic.
[0009]
The microorganism of the present invention may be any microorganism of the genus Penibacilus having the ability to degrade plastics, especially plastics having an ester bond in the molecular structure. Specifically, as a representative example, Penibacillus amylolyticus TB-13 strain deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary on November 14, 2002 (Paenibacillus amyloliticus) strain TB-13 ( Accession number FERM P-19104). The mycological properties of Penicillus spp. Are described in BERGEY'S MANUAL OF Systematic Bacteriology (Vol. 1, 1984, Vol. 2, 1986, Vol. 3, 1989, Vol. 4). Vol. 1989).
[0010]
Furthermore, the microorganism of the present invention may be a wild-type strain or a mutant strain as long as it is a bacterium belonging to the genus Penibacillus capable of degrading plastics, particularly plastics having an ester bond in the molecular structure.
[0011]
Mutant strains can be obtained without mutation treatment with ethyl methanesulfonic acid, a conventionally used mutation agent, nitrosoguanidine, treatment with other chemicals such as methyl methanesulfonic acid, ultraviolet irradiation, or treatment with a mutagen, It is also possible to obtain by so-called spontaneous mutation.
[0012]
As a medium used for culturing a microorganism belonging to the genus Penibacillus, any medium can be used as long as it can grow a microorganism belonging to the genus Penicillus. For example, an LB medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, % NaCl). The medium used for growing the microorganism of the present invention specifically contains a carbon source that can be assimilated by the microorganism of the present invention, such as glucose, and a nitrogen source that can be assimilated by the microorganism of the present invention. May contain an organic nitrogen source such as peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor and the like, and an inorganic nitrogen source such as ammonium sulfate and ammonium chloride. Further, if desired, salts containing cations such as sodium ion, potassium ion, calcium ion and magnesium ion and anions such as sulfate ion, chloride ion and phosphate ion may be contained. Further, it may contain trace elements such as vitamins and nucleic acids. The concentration of the carbon source is, for example, about 0.1 to 10%, and the concentration of the nitrogen source varies depending on the type, but is, for example, about 0.01 to 5%. The concentration of the inorganic salts is, for example, about 0.001 to 1%.
[0013]
The plastic that can be decomposed in the present invention may be any plastic that has an ester bond in the molecular structure of the plastic. Non-limiting examples include polylactic acid, polyurethane, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate, and polyethylene succinate.
[0014]
Polylactic acid refers to a polymer containing lactic acid as a main component, and polylactic acid homopolymers such as poly-L-lactic acid and poly-D-lactic acid, poly-L / D-lactic acid copolymer, and ε-caprolactone. , Glycolide, depsipeptide and the like, and a polylactic acid copolymer obtained by copolymerizing other components, and blends between the above-mentioned polymers and with other component polymers. As the polymerization method, a direct polymerization method from lactic acid, a ring-opening polymerization method via lactide (cyclic dimer of lactic acid) and the like are known. The number average molecular weight of the polylactic acid resin applicable in the decomposition method of the present invention is not particularly limited, and the decomposition of polylactic acid having a molecular weight of 5,000 to 20,000 is shown in Examples.
[0015]
Polyurethane is a generic term for a polymer compound having a urethane bond (—NHCOO—) in a molecule, and is obtained by reacting a polyfunctional isocyanate with a hydroxyl group-containing compound, and is a group such as ester, ether, amide, urea, and carbamate. Is a polymer having A wide variety of branched or crosslinked polymers can be prepared by varying the number of hydroxyl or isocyanate functionalities. Depending on the type of polyol used, it can be broadly classified into ester type and ether type. Polyurethane has a wide range of applications such as elastic materials, foams, adhesives, paints, fibers, and synthetic leather due to its excellent properties such as easy processability, rot resistance, deterioration resistance, and low specific gravity. Are also widely used. The number average molecular weight of the polyurethane resin applicable in the decomposition method of the present invention is not particularly limited.
[0016]
Polybutylene succinate refers to a polymer composed of succinic acid and butanediol. It has the same mechanical strength as polypropylene and PET, and has a higher melting point than polycaprolactone. The molding processability is close to that of polyethylene, and the same type of molding machine can be used. The number average molecular weight of polybutylene succinate applicable in the decomposition method of the present invention is not particularly limited, and the decomposition of polybutylene succinate having a molecular weight of 140,000 is shown in Examples.
[0017]
Polybutylene succinate-co-adipate refers to a polymer prepared by adding adipic acid to a raw material in the synthesis of polybutylene succinate. Although the melting point is lowered to about 90 ° C., the flexibility is improved. It is used for packaging materials, seedling pots, garbage bags, etc. The number average molecular weight of polybutylene succinate-co-adipate applicable in the decomposition method of the present invention is not particularly limited, and the decomposition of polybutylene succinate-co-adipate having a molecular weight of 140,000 and 250,000 is carried out. This is shown in the example.
[0018]
Polyethylene succinate refers to polybutylene succinate obtained by replacing butanediol with ethylene glycol. Although its mechanical properties are equivalent to those of polyethylene and polypropylene, and its melting point is as low as 100 ° C., its application to food films is expected because of its low oxygen permeability. The number average molecular weight of polyethylene succinate applicable in the decomposition method of the present invention is not particularly limited, and the decomposition of polyethylene succinate having a molecular weight of 60,000 is shown in Examples.
[0019]
The present invention further provides a method for decomposing plastics, particularly plastics having an ester bond in the molecular structure, by the action of microorganisms. The method utilizes the fact that plastic is decomposed and consumed as a nutrient source during the growth process of microorganisms, or utilizes the action of decomposing plastic by the action of enzymes possessed by microorganisms, that is, microbial cells after growth. For example, a quiescent cell is used.
Alternatively, preparation of a solid form such as a tablet obtained by freeze-drying the cells by a conventional method, a tablet obtained by mixing the powder with various vitamins and minerals, necessary nutrients such as yeast extract, casamino acid, peptone, etc. It may be provided to plastic processing as a product. The strain can also be used as a component of activated sludge and compost.
[0020]
The plastics to be decomposed may be added, for example, in a liquid medium as an emulsion or in the form of a powder, or may be added as a lump such as a film or a pellet. The amount of the plastic added to the medium is preferably 0.01 to 10% by weight. The amount of microorganisms to be added may be extremely small, but is preferably 0.1% by weight or more (wet weight) based on the plastic in consideration of the decomposition efficiency. Further, the plastic to be disassembled may be one kind or a plurality of kinds.
[0021]
In an embodiment utilizing the fact that plastic is decomposed and consumed as a nutrient source during the growth of microorganisms, the plastic can be provided as a single carbon source or together with other carbon sources. Examples of the medium that can be used include a carbon source such as plastic or glucose, and a nitrogen source that can be assimilated by the microorganism of the present invention. As the nitrogen source, an organic nitrogen source such as peptone, meat extract, yeast extract, and corn -It may contain inorganic nitrogen sources such as steep and liquor, such as ammonium sulfate and ammonium chloride. Further, if desired, it may contain an unmatched cation composed of a cation such as sodium ion, potassium ion, calcium ion and magnesium ion and an anion such as sulfate ion, chloride ion and phosphate ion. Further, it may contain trace elements such as vitamins and nucleic acids. The concentration of the carbon source is, for example, about 0.1 to 10%, and the concentration of the nitrogen source varies depending on the type, but is, for example, about 0.01 to 5%. The concentration of the inorganic salts is, for example, about 0.001 to 1%.
[0022]
In the embodiment utilizing the action of the enzyme of the microorganism to decompose the plastic, that is, in the embodiment utilizing microbial cells after proliferation, for example, resting cells, the decomposition of the plastic does not accompany the growth of the microorganism, so the buffer solution The medium may be a medium to which plastic is added, or a nitrogen source, an inorganic salt, a vitamin or the like may be added. Examples of the buffer include a phosphate buffer.
[0023]
The time required for decomposing the plastic may vary depending on the type, composition, shape and amount of the plastic to be decomposed, the type of microorganism used and the relative amount to the resin, various other culture conditions, and the like.
[0024]
In the present invention, if the above microorganism is subjected to static culture, shaking culture or aeration culture under aerobic conditions, the decomposition of plastic is observed. Rotational shaking culture is preferable, and the number of rotations is preferably in the range of 30 to 250 rotations / minute. As the culturing conditions, the culturing temperature is preferably from 10 to 50C, particularly preferably around 30C. The pH of the medium is preferably in the range of 4 to 10, preferably around 7.
[0025]
The degradation of the plastic in the medium can be confirmed, for example, by measuring the weight loss of the plastic subjected to the degradation, or when providing as an emulsion, by forming a clear zone by the degradation of the plastic.
[0026]
EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to Examples, but the scope of the present invention is not limited only to these.
Example 1 Screening of microorganisms Emulsion preparation method Emulsions of various plastics were prepared according to the following method. 2 g of each plastic was dissolved in 40 ml of dichloromethane, added to 250 ml of distilled water containing 40 mg of Plysurf A210G as an anionic surfactant, and emulsified with a homogenizer (10,000 rpm, 10 min). Thereafter, this was heated to 80 ° C. to evaporate dichloromethane.
[0027]
Medium The following medium was used. KH ₂ PO ₄ 2.0 (g / l); K ₂ HPO ₄ , 7.0 (g / l); NH ₄ NO ₃ , 1.0 (g / l); MgSO ₄ ^. 7H ₂ O, 0.1 (g / l); ZnSO ₄ ^. 7H ₂ O, 0.001 (g / l); CuSO ₄ ^. 7H ₂ O, 0.0001 (g / l); FeSO ₄ ^. _{7H 2 O, 0.01 (g /} l); MnSO 4. _{4-6H 2 O, 0.002 (g /} l). The pH was 7.2. As the solid medium, a medium obtained by adding agar (15 g / l) to the above medium was used.
[0028]
Screening 0.2 g of each soil collected from all over Japan was placed in a large test tube having an inner diameter of 10 mm, and 10 ml of a medium was added. 2 mg of polylactic acid powder was added thereto, followed by shaking culture at 30 ° C. After subculture was repeated four times every week, the solution was diluted and applied to an agar plate containing emulsified polylactic acid (purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and 1 g / l of yeast extract. A bacterium in which a clear zone was formed around the colony due to the decomposition of the plastic was obtained.
[0029]
As a result of searching for degrading bacteria using about 400 types of soils, a TB-13 strain was selected as the best strain.
Example 2 Microbial identification Physiological tests were performed according to the general method. For identification, see Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Bergey DH, Krieng NR (1986) P. amylyoticus. In: Bergey's Manual B.I.S. I made it. The sequencing and analysis of the 16s rDNA was requested to NCIM Japan.
[0030]
Various physiological tests were performed according to a conventional method. The TB-13 strain was a gram-negative, aerobic bacillus, and other physiological properties were as shown in Table 1 below.
[0031]
[Table 1]

[0032]
This strain can grow on glucose, L-arabinose, ribose, mannose, mannitol, maltose, xylose, fructose, N-acetylglucosamine, sucrose, trehalose, and can grow on gluconate, sorbitol, arabitol, erythritol, D-arabinose, and inulin. Could not grow.
[0033]
These results Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (Bergey DH, Krieng NR (1986) P. amylolyticus In: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol 2. Baltimore:. WILLIAUMS & WILKINS Co., pp.1139.) In light of the As a result, the TB-13 strain was identified as Penibacillus amylolyticus. Also, from the result of analyzing the 16S rRNA gene sequence, this strain showed 97.65% homology with Penicillus amylolyticus.
[0034]
Example 3 Plastic decomposition test As a material ester type polyurethane, a product synthesized from polydiethylene glycol adipate (average molecular weight: 2,500) and 2,4-tolylene diisocyanate was used. Polylactic acid was purchased from Wako Pure Chemical Industries, Ltd. As polybutylene succinate and polybutylene succinate-co-adipate, Bionole manufactured by Showa Polymer Co., Ltd. was used. Polyethylene succinate used Lunare SE manufactured by Nippon Shokubai Co., Ltd. The anionic surfactant Plysurf A210G used was manufactured by Daiichi Kogyo Seiyaku.
[0035]
Decomposition test The decomposition activity of various plastics except polyurethane was evaluated on an agar plate containing various emulsified plastics. The cells were inoculated on various plates and cultured at 30 ° C. for 2 weeks. The amount of formation of the clear zone around the colony was defined as the amount of decomposition.
[0036]
Since polyurethane cannot be formed into an emulsion because it is insoluble in an organic solvent, a decomposition test was performed by the following method. 1 g of cube-shaped polyurethane was added to 10 ml of the above medium containing 1% of yeast extract, sterilized, inoculated, and cultured at 30 ° C. for 2 weeks. The decomposition amount was measured by a gravimetric method.
[0037]
Table 2 shows the results of testing the degradation activity of various types of plastics using the Penicillus amylolyticus TB-13 strain. This strain showed high degradation activity for polylactic acid, polybutylene succinate-co-adipate and polyethylene succinate. In addition, polybutylene succinate also showed weak decomposition activity. In addition, Table 3 shows the results of a decomposition test for polyurethane using Penibacillus amylolyticus TB-13 strain. This strain was also able to degrade polyurethane. That is, the present strain was found to be able to degrade a plurality of types of plastics.
[0038]
[Table 2]

[0039]
[Table 3]

[0040]
The present invention is expected to be applied to the intensive decomposition treatment of various polyester-type plastics using the pure culture system of the present strain, the decomposition treatment by adding it to the soil or compost, and the recycling of fertilizer to resources. .

Claims

A microorganism belonging to the genus Penibacilus and having the ability to degrade plastic, or a mutant thereof having degradability to plastic.

2. The microorganism according to claim 1, wherein the microorganism belonging to the genus Penibacillus is Penibacillus amylolyticus.

The microorganism according to claim 1, wherein the microorganism belonging to the genus Penibacillus is Penibacillus amylolyticus TB-13 strain (accession number FERM P-19104).

The microorganism according to any one of claims 1 to 3, wherein the plastic has an ester bond in a molecular structure.

4. The microorganism according to claim 1, wherein the plastic is polyurethane.

The microorganism according to any one of claims 1 to 3, wherein the plastic is polylactic acid, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate, or polyethylene succinate.

A method for decomposing plastic, comprising the step of contacting a microorganism belonging to the genus Penibacillus and capable of degrading plastic or a mutant thereof with plastic.

The degradation method according to claim 7, wherein the microorganism belonging to the genus Penibacillus is Penibacillus amylolyticus.

The decomposition method according to claim 7, wherein the microorganism belonging to the genus Penibacillus is Penibacillus amylolyticus TB-13 strain (accession number FERM P-19104).

The decomposition method according to claim 7, wherein the plastic is polyurethane.

The decomposition method according to claim 7, wherein the plastic has an ester bond in a molecular structure.

The decomposition method according to claim 7, wherein the plastic is polylactic acid, polybutylene succinate, polybutylene succinate-co-adipate, or polyethylene succinate.