JP2006158237A - Microorganism having polyurethane decomposing ability and method for decomposing polyurethane - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、ポリウレタン分解方法及びポリウレタン分解剤、並びにポリウレタン含有廃棄物処理方法及びポリウレタン含有廃棄物処理剤に関する。また本発明は、高分子化合物の分解能を有する微生物の単離方法に関する。 The present invention relates to a polyurethane decomposition method and a polyurethane decomposition agent, and a polyurethane-containing waste treatment method and a polyurethane-containing waste treatment agent. The present invention also relates to a method for isolating a microorganism having a resolution of a polymer compound.
ポリウレタンは、主鎖中にウレタン結合（−ＮＨＣＯＯ−）を有する高分子化合物の総称であり、ポリオールとポリイソシアネートとの付加重合により合成されるものである。ポリウレタンは、ポリオールの種類によってエステル型ポリウレタンとエーテル型ポリウレタンとに大別される。 Polyurethane is a general term for polymer compounds having a urethane bond (—NHCOO—) in the main chain, and is synthesized by addition polymerization of a polyol and a polyisocyanate. Polyurethanes are roughly classified into ester-type polyurethanes and ether-type polyurethanes depending on the type of polyol.
また、ポリウレタンは、例えば、自動車等のシート、衣類の繊維、靴のクッション、接着剤及び塗料等の工業製品に広く使用されている。ポリウレタンを含む工業製品の製造過程、あるいは、不要となった工業製品自体は、ポリウレタン含有廃棄物として何らかの処理を経なければならない。例えば、ポリウレタン含有廃棄物は、焼却処理、化学的分解処理又は生分解処理等によって減容化され、最終的に廃棄される。なかでも生分解処理は、焼却処理を行う場合に問題となる大気汚染や、化学的分解処理を行う場合に問題となる高コストの問題を解決する手法として注目をされている。 Polyurethanes are widely used in industrial products such as seats for automobiles, clothing fibers, shoe cushions, adhesives and paints. The manufacturing process of industrial products containing polyurethane, or the industrial products themselves that are no longer necessary, must undergo some kind of treatment as polyurethane-containing waste. For example, polyurethane-containing waste is reduced in volume by incineration, chemical decomposition, biodegradation, or the like, and finally discarded. In particular, biodegradation processing is attracting attention as a method for solving air pollution that is a problem when performing incineration and high-cost problems that are problematic when performing chemical decomposition.
ポリウレタンの生分解処理としては、一般に、エステル型ポリウレタンがエーテル型ポリウレタンと比較して容易に分解されうることから、エステル型ポリウレタンを対象として所定の菌を用いて行われている。例えば、特許文献１〜３には、細菌が生産する酵素（エステラーゼ）が、エステル型ポリウレタンのエステル結合を切断し、分解する技術（微生物、酵素）が開示されている。また特許文献４には、プラスチックの生分解性簡易測定法として、ラッカーゼを含む酵素を利用する方法が開示されている。 In general, biodegradation treatment of polyurethane is performed using a predetermined bacterium for ester polyurethane because ester polyurethane can be easily decomposed compared to ether polyurethane. For example, Patent Documents 1 to 3 disclose techniques (microorganisms and enzymes) in which an enzyme (esterase) produced by bacteria cleaves and degrades an ester bond of an ester-type polyurethane. Patent Document 4 discloses a method of using an enzyme containing laccase as a simple method for measuring biodegradability of plastics.
一方、エーテル型ポリウレタンは、分子中にエーテル結合やウレタン結合といった自然界にはあまり存在していない結合を有しているため、難分解性であることが知られている。本発明者は、エーテル型ポリウレタンを分解処理するための方法として、酵素や化学物質を用いた反応が有効であることを見出している（特許文献５〜７参照）。しかしながら、生分解処理に使用可能な、エーテル型ポリウレタンを効率的に分解する微生物は報告されていない。 On the other hand, ether type polyurethanes are known to be hardly decomposable because they have bonds such as ether bonds and urethane bonds that do not exist so much in nature. The present inventor has found that a reaction using an enzyme or a chemical substance is effective as a method for decomposing ether type polyurethane (see Patent Documents 5 to 7). However, there has been no report of microorganisms that can be used for biodegradation treatment and efficiently decompose ether type polyurethane.
以上のように、エーテル型ポリウレタンを効率的に分解処理するための方法及び微生物の開発が望まれている。 As described above, development of a method and microorganisms for efficiently decomposing ether type polyurethane is desired.
また、従来、高分子化合物の分解能を有する微生物を取得するため、分解微生物の単離には、培養液の一部を採取して移植する集積培養法が用いられている（例えば非特許文献１及び２参照）。集積培養法は、微生物の分離を行う前に目的とする微生物の数を増加させ、与えられた培養条件下で最大の増殖速度を有する微生物が優勢となることを利用して、目的微生物を分離するものである。しかしながらこの分離方法では、微生物が、分解対象化合物を分解し、増殖できる場合には、その微生物を目的微生物として単離することができるが、微生物が、化合物を分解した後、その分解物を資化して増殖できない場合には、目的の微生物は少量にしか存在しないため単離することができない。また、化合物の分解とは関係のない微生物が優勢となり、結果として目的の微生物を分離できないことも多い。 Conventionally, in order to obtain a microorganism having a resolution of a polymer compound, an integrated culture method in which a part of a culture solution is collected and transplanted is used for isolation of a degrading microorganism (for example, Non-Patent Document 1). And 2). The enrichment culture method increases the number of target microorganisms before separating the microorganisms and separates the target microorganisms by taking advantage of the fact that the microorganism with the highest growth rate prevails under the given culture conditions. To do. However, in this separation method, when a microorganism can decompose and grow a compound to be decomposed, the microorganism can be isolated as a target microorganism. However, after the microorganism has decomposed the compound, the decomposed product is utilized. If the target microorganism cannot be grown, it cannot be isolated because the target microorganism exists only in a small amount. In addition, microorganisms unrelated to the decomposition of the compound are dominant, and as a result, the target microorganism cannot often be separated.
従って、高分子化合物の分解能を有する微生物を効率よく単離するための方法が望まれている。 Therefore, a method for efficiently isolating a microorganism having a resolution of a polymer compound is desired.
そこで、本発明は、上述した実状に鑑み、ポリウレタン分解能を有する微生物及びそれを用いたポリウレタンの分解方法を提供することを目的とする。また本発明は、高分子化合物の分解能を有する微生物の単離方法を提供することを目的とする。 In view of the above, the present invention has an object to provide a microorganism having a polyurethane resolution and a method for decomposing polyurethane using the microorganism. Another object of the present invention is to provide a method for isolating a microorganism having a resolution of a polymer compound.
本発明者は、上記課題を解決するため鋭意検討を行った結果、エーテル型ポリウレタンの分解能を有する細菌及び担子菌を見出し、これらのポリウレタン分解能を有する微生物を用いることによりポリウレタンを効率的に分解することができるという知見を得た。また、ポリウレタン分解能を有する微生物を単離する際に、移植による集積培養法を行わずに一定期間培養を継続することによってポリウレタン分解能を有する微生物を効率的に単離することができることを見出し、本発明を完成するに至った。 As a result of intensive studies to solve the above-mentioned problems, the present inventors have found bacteria and basidiomycetes having the resolution of ether-type polyurethane, and efficiently decompose the polyurethane by using these microorganisms having the ability of polyurethane. I got the knowledge that I can do it. In addition, when isolating microorganisms having polyurethane degradability, it was found that microorganisms having polyurethane decomposability can be efficiently isolated by continuing the culture for a certain period of time without carrying out an accumulation culture method by transplantation. The invention has been completed.
すなわち、本発明は、以下を包含する。
（１）ポリウレタン分解能を有する微生物の菌体又はその培養物とポリウレタン含有物とを接触させて、ポリウレタンを分解することを特徴とするポリウレタン分解方法。
（２）ポリウレタン分解能を有する微生物の菌体又はその培養物を含むことを特徴とするポリウレタン分解剤。
That is, the present invention includes the following.
(1) A method for decomposing a polyurethane, comprising decomposing polyurethane by bringing a cell of a microorganism having polyurethane decomposability or a culture thereof into contact with a polyurethane-containing material.
(2) A polyurethane decomposing agent comprising a microbial cell having a polyurethane decomposability or a culture thereof.
上記分解方法及び分解剤は、エーテル型ポリウレタンに対して優れた分解効率を示すため、分解対象となるポリウレタン又はポリウレタン含有物は、エーテル型ポリウレタンを主成分とするものであってもよい。 Since the decomposition method and the decomposition agent exhibit excellent decomposition efficiency with respect to the ether type polyurethane, the polyurethane or the polyurethane-containing material to be decomposed may be composed mainly of the ether type polyurethane.
また、上記分解方法及び分解剤において、ポリウレタン分解能を有する微生物は、細菌又は担子菌に属するものとすることができる。 Moreover, in the said decomposition method and decomposition agent, the microorganisms which have a polyurethane resolution | decomposability can belong to bacteria or a basidiomycete.
ここで、ポリウレタン分解能を有する細菌としては、ホンギア属、ストレプトマイセス属、サーマス属、ブレビバシラス属、ミクロモノスポラ属、プロミクロモノスポラ属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、スフィンゴモナス属、バシラス属、ロドコッカス属及びクツネリア属からなる群より選択される属に属するものが含まれる。そのような属に属する細菌としては、例えば、ホンギア・コレエンシス、ストレプトマイセス・アヌラタス、ストレプトマイセス・ラベンジュレ、ストレプトマイセス・セプタタス、ストレプトマイセス・ノドサス、ストレプトマイセス・テンダエ、サーマス・サーモフィラス、ブレビバシラス・コシネンシス、ミクロモノスポラ・シトレ、プロミクロモノスポラ・スクモエ、シュードモナス・フルバ、アグロバクテリウム・アルベルティマグニ、アグロバクテリウム・ルビ、スフィンゴモナス・エキノイデス、バシラス・ハルマパラス、バシラス・スブティリス、ロドコッカス・ロドクロウス及びクツネリア・ビリドグリセアが挙げられる。 Here, the bacteria having a polyurethane resolution include the genus Hongia, Streptomyces, Thermus, Brevibacillus, Micromonospora, Promicromonospora, Pseudomonas, Agrobacterium, Sphingomonas, and Bacillus And those belonging to a genus selected from the group consisting of Rhodococcus and Cutunelia. Examples of bacteria belonging to such a genus include, for example, Hongya choreensis, Streptomyces anuratus, Streptomyces lavender, Streptomyces septatas, Streptomyces nodosus, Streptomyces tendae, Thermus thermophilus, Brevibacillus cosinensis, Micromonospora citre, Promicromonospora scumoe, Pseudomonas fulba, Agrobacterium albertimagni, Agrobacterium rubi, Sphingomonas echinoides, Bacillus halmapalas, Bacillus subtilis, Rhodococcus Rhodocrous and Kutneria viridogrisea.
またポリウレタン分解能を有する担子菌としては、マクカワタケ属、シミタケ属、マンネンタケ属、カワラタケ属、キカイガラタケ属、マツオウジ属及びディコミツス属からなる群より選択される属に属するものが含まれる。そのような属に属する担子菌としては、例えば、ファネロカエテ・クリソスポリウム、オオウズラタケ、マンネンタケ、ニクウスバタケ、アラゲカワラタケ、キカイガラタケ、シイタケ及びマツエノオオウズラタケが挙げられる。 Further, the basidiomycetes having polyurethane decomposability include those belonging to the genus selected from the group consisting of the genus Mackawatake, Shimitake, Mannentake, Kawaratake, Kikaigarake, Matsuouji and Dicomitus. Examples of basidiomycetes belonging to such a genus include Fanerocaete chrysosporium, Ozutake, Mannentake, Nikuusutake, Aragekawaratake, Kikaigarake, Shiitake, and Matsue Ozuratake.
さらに、上記（１）及び（２）を提供することによって、廃棄物に含有されているポリウレタンを分解処理することもできる。すなわち、本発明は、ポリウレタン分解能を有する微生物の菌体又はその培養物とポリウレタン含有廃棄物とを接触させて、ポリウレタンを分解することを特徴とするポリウレタン含有廃棄物の処理方法、並びにポリウレタン分解能を有する微生物の菌体又はその培養物を含むことを特徴とするポリウレタン含有廃棄物処理剤を包含する。 Furthermore, the polyurethane contained in the waste can be decomposed by providing the above (1) and (2). That is, the present invention relates to a method for treating a polyurethane-containing waste characterized by decomposing polyurethane by contacting a cell of a microorganism having polyurethane resolution or a culture thereof with a polyurethane-containing waste, and the polyurethane resolution. A polyurethane-containing waste treatment agent characterized by comprising a microbial cell or a culture thereof.
（３）高分子化合物の分解能を有する微生物の単離方法であって、
（ａ）高分子化合物の存在下で微生物含有サンプルを培養するステップであって、その際、移植による集積培養を行なわず、少なくとも１ヶ月間にわたり培養を継続することを含む、培養ステップ、
（ｂ）高分子化合物の変化又は培地の変化を観察するステップ、
（ｃ）変化が観察された微生物含有サンプルから微生物を単離するステップ、
を含む、高分子化合物分解微生物の単離方法。
(3) A method for isolating a microorganism having a resolution of a polymer compound,
(A) a step of culturing a microorganism-containing sample in the presence of a polymer compound, the method comprising culturing for at least one month without performing accumulation culture by transplantation,
(B) observing a change in the polymer compound or a change in the medium;
(C) isolating microorganisms from the microorganism-containing sample in which changes are observed;
A method for isolating a polymer compound-degrading microorganism, comprising:
ここで、高分子化合物は、微生物により唯一の炭素源として使用されることが好ましい。また、高分子化合物としては例えばポリウレタンを用いることができる。
また微生物には、細菌、放線菌、糸状菌、担子菌、藻類及び原生動物が含まれる。
上記単離方法においては、さらに、単離した微生物の高分子化合物分解能を評価するステップを行ってもよい。
Here, the polymer compound is preferably used as a sole carbon source by microorganisms. As the polymer compound, for example, polyurethane can be used.
Microorganisms include bacteria, actinomycetes, filamentous fungi, basidiomycetes, algae and protozoa.
In the isolation method, a step of evaluating the resolution of the polymer compound of the isolated microorganism may be further performed.
本発明に係るポリウレタン分解方法及びポリウレタン分解剤により、ポリウレタン、特にエーテル型ポリウレタンを効率的に分解することができる。また、本発明に係るポリウレタン分解方法及びポリウレタン分解剤により、各種の分野で分解・減容化が望まれるポリウレタン含有廃棄物を処理することができる。 By the polyurethane decomposing method and the polyurethane decomposing agent according to the present invention, polyurethane, particularly ether type polyurethane can be efficiently decomposed. In addition, the polyurethane-containing waste which is desired to be decomposed and reduced in various fields can be treated by the polyurethane decomposing method and the polyurethane decomposing agent according to the present invention.
さらに、本発明に係る高分子化合物の分解能を有する微生物の単離方法により、高分子化合物の分解能を有する微生物を簡便かつ高効率で単離することができ、そのように単離された微生物は産業廃棄物の処理、バイオレメディエーション等の分野で有用である。 Furthermore, by the method for isolating a microorganism having a resolution of a polymer compound according to the present invention, a microorganism having a resolution of a polymer compound can be isolated easily and with high efficiency. It is useful in fields such as industrial waste treatment and bioremediation.
以下、本発明を詳細に説明する。
１．ポリウレタン分解方法
本発明に係るポリウレタンの分解方法（以下、「本分解方法」ともいう）は、ポリウレタン分解能を有する微生物（以下、「ポリウレタン分解微生物」ともいう）を利用することにより、ポリウレタンを含有する対象物を処理する方法である。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
1. Polyurethane Decomposition Method The polyurethane decomposition method according to the present invention (hereinafter also referred to as “the present decomposition method”) contains polyurethane by utilizing a microorganism having polyurethane decomposability (hereinafter also referred to as “polyurethane decomposition microorganism”). A method for processing an object.
本発明者は、種々の土壌サンプル及び水サンプルから、ポリウレタン分解能を有する微生物を単離することに成功した。かかるポリウレタン分解微生物には、ポリウレタン分解能を有する細菌（ポリウレタン分解細菌）及びポリウレタン分解能を有する担子菌（ポリウレタン分解担子菌）が含まれる。 The present inventors have succeeded in isolating microorganisms having polyurethane degradability from various soil samples and water samples. Such polyurethane-degrading microorganisms include bacteria having polyurethane degradability (polyurethane degrading bacteria) and basidiomycetes having polyurethane degradability (polyurethane degrading basidiomycetes).
単離されたポリウレタン分解細菌は、ホンギア属、ストレプトマイセス属、サーマス属、ブレビバシラス属、ミクロモノスポラ属、プロミクロモノスポラ属、シュードモナス属、アグロバクテリウム属、スフィンゴモナス属、バシラス属、ロドコッカス属又はクツネリア属に属するものである。かかるポリウレタン分解能を有する細菌としては、下記の表１に挙げるものを例示することができる。 The isolated polyurethane-degrading bacteria are the genus Hongia, Streptomyces, Thermus, Brevibacillus, Micromonospora, Promicromonospora, Pseudomonas, Agrobacterium, Sphingomonas, Bacillus, Rhodococcus It belongs to the genus or the genus Cutunelia. Examples of such bacteria having polyurethane decomposability include those listed in Table 1 below.
表１に示されるサーマス・サーモフィラスＨ５４株は、独立行政法人、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成１６年１１月１２日付でＦＥＲＭ Ｐ−２０２９８として寄託されている。上記菌株は本発明者らにより、土壌及び水から単離された細菌である。この菌株の菌学的性質は実施例５に示す通りである。 The Thermus Thermophilus H54 strain shown in Table 1 is a FERM on November 12, 2004, which is an independent administrative agency, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Depositary Center (1st, 1st, 1st East, Tsukuba City, Ibaraki). Deposited as P-20298. The above strains are bacteria isolated by the present inventors from soil and water. The mycological properties of this strain are as shown in Example 5.
また単離されたポリウレタン分解担子菌は、白色腐朽菌であるマクカワタケ属（Phanerochaete）、マンネンタケ属（Ganoderma）、カワラタケ属（Coriolus）、マツオウジ属（Lentinus）及びディコミツス属（Dichomitus）、並びに褐色腐朽菌であるシミタケ属（Tyromyces）及びキカイガラタケ属（Gloeophyllum）に属するものである。かかるポリウレタン分解能を有する担子菌としては、下記の表２に挙げるものを例示することができる。 The isolated polyurethane-degrading basidiomycetes are white rot fungi, Phanerochaete, Ganoderma, Coriolus, Lentinus, and Dichomitus, and brown rot fungi. Belonging to the genus Tyromyces and the genus Gloeophyllum. Examples of basidiomycetes having such a polyurethane resolution include those listed in Table 2 below.
表２において、ＡＴＣＣ、ＩＦＯ、ＣＢＳ又はＫの略語を用いて示した株の名称は、各分譲機関におけるカタログ番号である。ＡＴＣＣは「Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｕ．Ｓ．Ａ」、ＩＦＯは「Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ」、ＣＢＳは「Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ」の各分譲機関を表す。表２に列挙した菌株は、いずれも各分譲機関からカタログ番号に従って容易に入手することが出来る。 In Table 2, the names of the strains indicated using the abbreviations ATCC, IFO, CBS, or K are catalog numbers at each sales agency. ATCC is “American Type Collection Rockville, USA”, IFO is “Institute for Fermentation, Osaka, Japan”, CBS is “The CentralBureau Vort” Any of the strains listed in Table 2 can be easily obtained according to the catalog number from each sales agency.
表１及び２に例示したポリウレタン分解能を有する微生物は、ポリウレタンを分解し資化することにより、ポリウレタンを唯一の炭素源として資化し、増殖できる点で好ましい。 Microorganisms having a polyurethane resolution exemplified in Tables 1 and 2 are preferable in that they can be utilized as a sole carbon source by decomposing and assimilating the polyurethane, thereby allowing it to grow.
本分解方法においては、ポリウレタン分解能を有する微生物のうち少なくとも１種を用いる限り、複数種を組み合わせて使用することも可能である。例えば、ポリウレタン分解細菌の２種以上の組み合わせ、ポリウレタン分解担子菌の２種以上の組み合わせ、又は、ポリウレタン分解細菌の１種以上とポリウレタン分解担子菌の１種以上の組み合わせを用いることができる。 In this decomposition method, as long as at least one kind of microorganisms having polyurethane decomposability is used, a plurality of kinds can be used in combination. For example, a combination of two or more polyurethane-degrading bacteria, a combination of two or more polyurethane-degrading basidiomycetes, or a combination of one or more polyurethane-degrading bacteria and one or more polyurethane-degrading basidiomycetes can be used.
また本分解方法においては、上記ポリウレタン分解微生物の培養物を使用することもできる。
ここでポリウレタン分解微生物の培養物を使用する場合には、ポリウレタン分解微生物の培養物は、その培養物のまま使用してもよいし、培養物を濾過、遠心分離若しくは抽出等の精製処理を行って使用してもよいし、又は培養物を水等で希釈して使用してもよい。培養物は、上述したポリウレタン分解微生物を培養することに調製することができ、その培養条件としては、後述するような通常の培養条件を用いればよい。
In this degradation method, a culture of the above-mentioned polyurethane-degrading microorganism can also be used.
When a polyurethane-degrading microorganism culture is used, the polyurethane-degrading microorganism culture may be used as it is, or the culture is subjected to a purification treatment such as filtration, centrifugation or extraction. Or the culture may be diluted with water or the like. The culture can be prepared by culturing the above-described polyurethane-degrading microorganism, and the culture conditions may be normal culture conditions as described below.
本分解方法においては、ポリウレタンを含むものであればいかなるものも分解対象とすることができる。具体的な対象物としては、ポリウレタンを用いて製造された各種工業製品又はその廃棄物、あるいは、当該工業製品及び廃棄物を前処理した処理物を挙げることができる。工業製品としては、例えば、自動車等のシート、衣類の繊維、靴のクッション、接着剤及び塗料等を挙げることができる。ここで、本分解方法においては、ポリウレタンとして如何なるモノマー成分を有するポリウレタンをも分解することができるが、特に、分子中にエーテル結合を有するエーテル型ポリウレタンを効率よく分解することができる。 In the present decomposing method, any object containing polyurethane can be targeted for decomposition. Specific examples of the object include various industrial products manufactured using polyurethane or wastes thereof, or processed products obtained by pretreating the industrial products and wastes. Industrial products include, for example, automobile sheets, clothing fibers, shoe cushions, adhesives, paints, and the like. Here, in this decomposition method, a polyurethane having any monomer component can be decomposed as a polyurethane, but in particular, an ether type polyurethane having an ether bond in a molecule can be efficiently decomposed.
本分解方法では、ポリウレタン含有物を、上述したポリウレタン分解微生物の菌体又はその培養物と接触させることで、当該ポリウレタン含有物に含まれるポリウレタンを分解することができる。 In this decomposition method, the polyurethane contained in the polyurethane-containing material can be decomposed by bringing the polyurethane-containing material into contact with the cells of the above-described polyurethane-decomposing microorganism or a culture thereof.
ここで「接触」とは、ポリウレタン含有物と共にポリウレタン分解微生物の菌体を培養すること、ポリウレタン含有物とポリウレタン分解微生物の菌体又は培養物とを混合すること、ポリウレタン含有物にポリウレタン分解微生物の菌体又はその培養物を散布すること、ポリウレタン分解微生物の菌体又はその培養物を不織布等に接種したものをポリウレタン含有物に静置することなどを指す。 Here, “contact” means culturing the cells of polyurethane-degrading microorganisms together with the polyurethane-containing material, mixing the polyurethane-containing materials and cells or cultures of the polyurethane-degrading microorganisms, It refers to spraying bacterial cells or cultures thereof, and placing polyurethane-degrading microorganism cells or cultures inoculated on a nonwoven fabric or the like on a polyurethane-containing material.
ポリウレタン含有物と共にポリウレタン分解微生物を培養する場合には、通常の培養条件を用いればよく、例えば、培地として、グルコース、デンプン、スクロース等の炭素源、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、酵母エキス、ペプトン等の窒素源を含有し、好ましくは、リン酸カリウム、硝酸マグネシウム、塩化カルシウム等の無機塩類や微量金属類、アミノ酸類、ビタミン類等の微量成分を含有する培地を用いて、静置培養、振盪培養、通気培養、通気撹拌培養等の各種培養条件を用いて培養を行うことができる。また培地は、固体培地及び液体培地のいずれも使用することができる。ここで、培養の最適条件に関しては、用いる微生物の種類により異なるため、上記培地及び培養方法は用いる微生物に適するものに適宜選択及び調製され、また、温度、ｐＨ、培養期間等のその他の培養条件も適宜選択されて培養が行われることが好ましい。 When culturing polyurethane-degrading microorganisms together with polyurethane-containing materials, normal culture conditions may be used. For example, as a medium, carbon sources such as glucose, starch, sucrose, nitrogen sources such as potassium nitrate, ammonium nitrate, yeast extract, peptone, etc. Preferably, using a medium containing trace amounts of components such as inorganic salts such as potassium phosphate, magnesium nitrate, calcium chloride and trace metals, amino acids, vitamins, etc., static culture, shaking culture, aeration Culture can be performed using various culture conditions such as culture and aeration and agitation culture. As the medium, either a solid medium or a liquid medium can be used. Here, since the optimum conditions for culture vary depending on the type of microorganism used, the above medium and culture method are appropriately selected and prepared as appropriate for the microorganism used, and other culture conditions such as temperature, pH, culture period, etc. It is preferable that the culture is carried out with appropriate selection.
例えば、ポリウレタン分解能を有する細菌を用いて本分解方法を実施する場合には、好ましい培地としては、ＮＢ培地（Nutrient Broth；Beckton Dickinson等より入手可能）、ＬＢ培地（Luria-Bertani培地；１％バクトトリプトン、０．５％バクト−イーストエクストラクト、１％ＮａＣｌ、ＮａＯＨでｐＨを７．０〜７．５に調整）、Ｍ９培地（Ｎａ２ＨＰＯ４６．０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３．０ｇ、ＮａＣｌ ０．５ｇ、ＮＨ４Ｃｌ １．０ｇ、１Ｍ ＭｇＳＯ４１．０ｍｌ、２Ｍ グルコース５．６ｍｌ、１％ビタミンＢ１（チアミン）１．０ｍｌ、１Ｍ ＣａＣｌ２ ０．１ｍｌ）、Ｍ培地（最少培地；２．２ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．８ｇ ＫＨ２ＰＯ４、３．０ｇ ＮＨ４ＮＯ３、１０．０ｍｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０．０ｍｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０．０ｍｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ酵母エキス、１Ｌ蒸留水）等が挙げられ、好ましい培養条件は、温度２５〜３５℃、好ましくは約３０℃において、ｐＨ６〜８であり、培養期間はおよそ１週間〜３ヶ月程度である。また、ポリウレタン分解能を有する担子菌を用いて本分解方法を実施する場合には、好ましい培地としては、ポテトデキストロース培地（ＰＤ培地；Ｄｉｆｃｏ社等より入手可能）、Ｋｉｒｋ培地（１Ｌ中、１０ｇグルコース、０．２ｇ酢酸エキス、６．２ｇポリペプトン、５ｍｌの２Ｈコハク酸バッファー（ｐＨ４．５）、１．８ｇ酒石酸アンモニウム、２．０ｇ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｍｇチアミン−ＨＣｌ、１０ｍｌ Ｋｉｒｋ微量元素溶液（１Ｌ、ｐＨ４．５中、９ｇニトリロ三酢酸ナトリウム、３ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．７３ｇ ＭｎＳＯ４、６ｇ ＮａＣｌ、０．６ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．１ｇ ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．６ｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．１ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、６０ｍｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１１０ｍｇ ＡｌＫ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏ、６０ｍｇ Ｈ３ＢＯ３、７０ｍｇ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ））、木粉培地（１Ｌ中、１０ｇグルコース、２０ｍｌコーンスティープリカー、５０ｍｇ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０ｍｌ Ｋｉｒｋ微量元素溶液、５μｌ ２Ｍコハク酸バッファー（ｐＨ４．５））等が挙げられ、好ましい培養条件は、温度２０〜３０℃、好ましくは約２５℃において、ｐＨ４〜６であり、培養期間はおよそ１週間〜３ヶ月程度である。 For example, when this degradation method is carried out using bacteria having polyurethane decomposability, preferred media include NB medium (available from Nutrient Broth; Beckton Dickinson et al.), LB medium (Luria-Bertani medium; 1% Bact. Tryptone, 0.5% Bacto-yeast extract, 1% NaCl, pH adjusted to 7.0-7.5 with NaOH, M9 medium (6.0 g Na 2 HPO 4 , 3.0 g KH 2 PO 4 , NaCl 0.5 g, NH 4 Cl 1.0 g, 1M MgSO 4 1.0 ml, 2M glucose 5.6 ml, 1% vitamin B1 (thiamine) 1.0 ml, 1M CaCl 2 0.1 ml), M medium (minimum medium) ; 2.2g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O, 0.8g KH 2 PO 4, 3.0g NH 4 NO 3, 10.0mg FeSO 4 · 7H 2 O, 10 0mg CaCl 2 · 2H 2 O, 10.0mg MgSO 4 · 7H 2 O, 1g yeast extract, 1L of distilled water) and the like, preferred culture conditions include a temperature 25 to 35 ° C., preferably at about 30 ° C., pH 6 The culture period is about 1 week to 3 months. In the case of carrying out this degradation method using basidiomycetes having polyurethane resolution, preferred media include potato dextrose medium (PD medium; available from Difco), Kirk medium (10 g glucose in 1 L, 0.2 g acetic acid extract, 6.2 g polypeptone, 5 ml 2H succinate buffer (pH 4.5), 1.8 g ammonium tartrate, 2.0 g KH 2 PO 4 , 0.5 g MgSO 4 .7H 2 O, 0.1 g CaCl 2 .2H 2 O, 10 mg thiamine-HCl, 10 ml Kirk trace element solution (1 L, pH 4.5, 9 g sodium nitrilotriacetate, 3 g MgSO 4 .7H 2 O, 2.73 g MnSO 4 , 6 g NaCl, 0.7 g 6 g FeSO 4 · 7H 2 O, 1.1 g CoSO 4 · 7H 2 O, 0.6 g CaCl 2 · 2H 2 O, 1.1g ZnSO 4 · 7H 2 O, 60mg CuSO 4 · 5H 2 O, 110mg AlK (SO 4) 2 · 12H 2 O, 60mg H 3 BO 3, 70mg Na 2 MoO 4 · 2H 2 O)), wood flour medium (in 1 L, 10 g glucose, 20 ml corn steep liquor, 50 mg MnSO 4 .5H 2 O, 10 ml Kirk trace element solution, 5 μl 2 M succinate buffer (pH 4.5)) and the like. The culture conditions are a temperature of 20 to 30 ° C., preferably about 25 ° C., pH 4 to 6, and a culture period of about 1 week to about 3 months.
使用するポリウレタン分解微生物の菌体又はその培養物の量は、使用する微生物の種類、ポリウレタン含有物中のポリウレタンの存在量などを考慮して、望ましい結果が得られるように決定しうる。 The amount of the cells of the polyurethane-degrading microorganism to be used or the culture thereof can be determined so as to obtain a desired result in consideration of the type of microorganism to be used, the amount of polyurethane present in the polyurethane-containing material, and the like.
さらに、ポリウレタンの分解をさらに効率的に行うために、ポリウレタン分解微生物の菌体又はその培養物と共にその他の追加成分を使用してもよく、そのような追加成分としては、限定するものではないが、ポリウレタン分解微生物の増殖を促進する培養液等が挙げられる。 Furthermore, in order to perform the degradation of polyurethane more efficiently, other additional components may be used together with the cells of the polyurethane-degrading microorganism or its culture, and such additional components are not limited. And a culture solution that promotes the growth of polyurethane-degrading microorganisms.
以上のように、ポリウレタン分解能を有する微生物の菌体又はその培養物とポリウレタン含有物とを接触させることによって、ポリウレタン含有物に含まれるポリウレタンを分解することができる。 As described above, the polyurethane contained in the polyurethane-containing material can be decomposed by bringing the microbial cell having a polyurethane resolution or a culture thereof into contact with the polyurethane-containing material.
また、本分解方法をポリウレタン含有廃棄物の処理に適用することができ、ポリウレタン分解能を有する微生物の菌体又はその培養物を用いてポリウレタン含有廃棄物に含まれるポリウレタンを分解し、ポリウレタン含有廃棄物を分解・減容化することができる。 In addition, the present decomposition method can be applied to the treatment of polyurethane-containing waste, and the polyurethane contained in the polyurethane-containing waste is decomposed using a microorganism cell having a polyurethane degradability or its culture, and the polyurethane-containing waste is decomposed. Can be decomposed and reduced in volume.
ポリウレタン含有廃棄物の処理方法においては、上述したポリウレタンを含有する廃棄物を、ポリウレタン分解微生物の菌体又はその培養物と接触させる前に、分解処理に適するように前処理することが好ましい。例えば前処理としては、具体的には、工業製品等の対象物をシュレッダー等により粉砕する処理、加熱処理、加熱・加湿処理等を挙げることができる。 In the method for treating a polyurethane-containing waste, it is preferable to pretreat the waste containing polyurethane as described above so as to be suitable for the decomposition treatment before contacting with the cells of the polyurethane-degrading microorganism or its culture. For example, specific examples of the pretreatment include a process of pulverizing an object such as an industrial product with a shredder or the like, a heat treatment, and a heating / humidification treatment.
ポリウレタン分解微生物の菌体又はその培養物によるポリウレタンの分解終了後は、分解処理済のポリウレタン含有廃棄物を適切な分離装置、例えば振動篩、膜、ベルトプレス又は遠心分離装置等を用いて、ポリウレタン分解微生物の菌体又はその培養物を分離することができる。あるいは、分離を行わずに分解処理済のポリウレタン含有廃棄物をさらなる処理に供してもよい。微生物は、事前に動物試験等により安全性を確認されたものを用いるか、あるいは安全性を徹底するために使用後に殺菌処理を行うことが好ましい。 After the degradation of the polyurethane by the cells of the polyurethane-degrading microorganism or its culture, the polyurethane-containing waste that has been subjected to the degradation treatment is removed from the polyurethane using an appropriate separation device such as a vibrating sieve, membrane, belt press, or centrifugal separation device. The cells of the decomposing microorganism or the culture thereof can be isolated. Alternatively, the decomposed polyurethane-containing waste may be subjected to further processing without separation. It is preferable to use microorganisms whose safety has been confirmed in advance by animal tests or the like, or to perform sterilization after use in order to ensure safety.
本分解方法を用いることにより、各種の分野で分解・減容化が望まれるポリウレタンを効率的に分解することができる。例えば、プラスチック、紙、ゴム等からなるシュレッダーダストは産業廃棄物の１種であり、その減容化が望まれているが、本発明により、シュレッダーダストの体積の最大を占めるポリウレタンを分解することによって、減容化することができる。また、産業廃棄物処理場において原位置での分解及び減容化が可能であるため、新たに処理場を掘削する必要がなく、また廃棄物を移動させる必要がないため経済的である。 By using this decomposition method, it is possible to efficiently decompose polyurethane which is desired to be decomposed and reduced in volume in various fields. For example, shredder dust made of plastic, paper, rubber, etc. is a kind of industrial waste, and its volume reduction is desired. However, according to the present invention, polyurethane that occupies the largest volume of shredder dust can be decomposed. The volume can be reduced. In addition, since it can be decomposed and reduced in volume at an industrial waste treatment plant, it is economical because it is not necessary to newly excavate the treatment plant and it is not necessary to move waste.
２．ポリウレタン分解剤
本発明に係るポリウレタン分解剤は、ポリウレタン分解能を有する微生物の菌体又はその培養物を含むものである。本分解剤は、ポリウレタン分解微生物のうちの１種を単独で、又は複数種を組み合わせて含有することができ、また１種又は複数種のポリウレタン分解微生物から調製された培養物を含有してもよい。ポリウレタン分解微生物の菌体及びその培養物は、前項「１．ポリウレタン分解方法」に記載のように調製することができる。
2. Polyurethane Degrading Agent The polyurethane degrading agent according to the present invention contains a microbial cell having a polyurethane degradability or a culture thereof. The present degrading agent can contain one kind of polyurethane-degrading microorganisms alone or in combination of two or more kinds, and also contains a culture prepared from one or more kinds of polyurethane-degrading microorganisms. Good. The cells of the polyurethane-decomposing microorganism and the culture thereof can be prepared as described in the preceding section “1.
本分解剤の形態は特に限定されず、ポリウレタン分解微生物の菌体又はその培養物のそのままの形態、ポリウレタン分解微生物の菌体又はその培養物を適当な溶媒中に溶解若しくは懸濁した形態、あるいは該ポリウレタン分解微生物の菌体又はその培養物を保存可能なように凍結又は乾燥した形態など、任意の形態をとることができる。このような形態は、当技術分野で公知の方法に従って適宜調製することができる。 The form of the present decomposing agent is not particularly limited, and the form of the polyurethane-degrading microorganism or its culture as it is, the form of the polyurethane-degrading microorganism or its culture dissolved or suspended in an appropriate solvent, or Arbitrary forms such as a frozen or dried form so that the cells of the polyurethane-degrading microorganism or its culture can be stored can be used. Such a form can be appropriately prepared according to a method known in the art.
また、本分解剤は、他の成分を含んでもよい。他の成分は、ポリウレタン分解微生物の菌体又はその培養物のポリウレタン分解能を損なわないものであれば特に限定されるものではなく、例えば、微生物の増殖に効果があるビール類、米ぬか、おがくず等、微生物の安定化に効果がある麦飯石、その他の微生物担体等が挙げられる。 In addition, the present decomposition agent may contain other components. The other components are not particularly limited as long as they do not impair the polyurethane degradability of polyurethane-degrading microorganisms or cultures thereof, for example, beer, rice bran, sawdust, etc. that are effective for the growth of microorganisms, Examples thereof include barley-stones and other microbial carriers that are effective in stabilizing microorganisms.
本分解剤は、ポリウレタン含有物と接触させて使用するが、ポリウレタン含有物との接触は、前項「１．ポリウレタン分解方法」に記載のようにすることができる。また、使用量は、使用する微生物の種類、ポリウレタン含有物中のポリウレタンの存在量などを考慮して、望ましい結果が得られるように決定しうる。また、本分解剤は、ポリウレタン含有廃棄物処理剤として用いることも可能である。 The present decomposing agent is used in contact with a polyurethane-containing material, and the contact with the polyurethane-containing material can be performed as described in the preceding section “1. Polyurethane Decomposing Method”. The amount used can be determined so as to obtain a desired result in consideration of the type of microorganisms used, the amount of polyurethane present in the polyurethane-containing material, and the like. Further, the present decomposition agent can also be used as a polyurethane-containing waste treatment agent.
本分解剤により、ポリウレタンの分解を、本分解剤を使用することのみで簡便に行うことが可能となる。 With this decomposition agent, the polyurethane can be easily decomposed only by using the decomposition agent.
３．高分子化合物の分解能を有する微生物の単離方法
本発明に係る高分子化合物の分解能を有する微生物の単離方法は、従来行われている移植による集積培養を行わず、微生物含有サンプルを高分子化合物と接触させたまま長期間にわたって培養を継続することを特徴とするものである。
3. A method for isolating a microorganism having a resolution of a polymer compound The method for isolating a microorganism having a resolution of a polymer compound according to the present invention is a method for isolating a microorganism-containing sample from a microorganism-containing sample without performing conventional culture by transplantation. The culture is continued for a long period of time while being in contact with.
従って、本単離方法においては、微生物含有サンプルを高分子化合物の存在下にて少なくとも１ヶ月にわたり培養する。その際、移植による集積培養は行わない。移植による集積培養とは、当技術分野で公知の培養方法であり、特定条件下での微生物の培養中に、培養液の一部を採取して新たな培養液に植え継ぎ、数日から数週間毎にその操作を繰り返すことによって、特定条件下で増殖する微生物を集積するものである（非特許文献１）。本単離方法では、このような移植による集積培養を行わず（培地を採取して植え継ぐことなく）、長期間にわたって培養を継続する。本分解方法によって、従来の方法では高分子化合物の分解能を有する微生物を単離することのできなかったサンプルから、複数の分解微生物を単離することに成功した（実施例２及び４参照）。 Therefore, in this isolation method, the microorganism-containing sample is cultured for at least 1 month in the presence of the polymer compound. At that time, accumulation culture by transplantation is not performed. Accumulated culture by transplantation is a culture method known in the art, and during culture of microorganisms under specific conditions, a part of the culture solution is collected and transferred to a new culture solution, and several days to several days. By repeating the operation every week, microorganisms that grow under specific conditions are accumulated (Non-patent Document 1). In this isolation method, such an accumulation culture by transplantation is not performed (the medium is not collected and transferred), and the culture is continued for a long period of time. By this degradation method, a plurality of degrading microorganisms were successfully isolated from a sample that could not isolate a microorganism having a resolution of a polymer compound by the conventional method (see Examples 2 and 4).
培養は、通常の培養条件を用いればよく、例えば、培地として、グルコース、デンプン、スクロース等の炭素源、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、酵母エキス、ペプトン等の窒素源を含有し、好ましくは、リン酸カリウム、硝酸マグネシウム、塩化カルシウム等の無機塩類や微量金属類、アミノ酸類、ビタミン類等の微量成分を含有する培地を用いることができる。 The culture may be carried out under normal culture conditions. For example, the medium contains a carbon source such as glucose, starch or sucrose, and a nitrogen source such as potassium nitrate, ammonium nitrate, yeast extract or peptone, preferably potassium phosphate, A medium containing trace components such as inorganic salts such as magnesium nitrate and calcium chloride, trace metals, amino acids and vitamins can be used.
また、培養は、高分子化合物の存在下で行われる。本単離方法において、高分子化合物は特に限定されるものではなく、例えば、プラスチック類（ポリウレタン、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコール、脂肪族ポリエステル、ポリ乳酸など）などが挙げられる。 The culture is performed in the presence of a polymer compound. In this isolation method, the polymer compound is not particularly limited, and examples thereof include plastics (polyurethane, polyvinyl alcohol, polyethylene glycol, aliphatic polyester, polylactic acid, and the like).
ここで、好ましくは、高分子化合物が、微生物により唯一の栄養源（例えば炭素源）として使用されるように培地の成分を調製する。このような培地を使用することによって、高分子化合物を分解し、その分解物を資化して増殖することのできる微生物を単離することができ、またそのような微生物は効率的に固形高分子化合物を分解可能であるため好ましい。 Here, preferably, the components of the medium are prepared so that the polymer compound is used as a sole nutrient source (for example, a carbon source) by the microorganism. By using such a medium, it is possible to isolate a microorganism capable of decomposing a polymer compound and assimilating the decomposed product to proliferate, and such a microorganism can be efficiently solid polymer. It is preferable because the compound can be decomposed.
培養は、少なくとも１ヶ月間、好ましくは約１ヶ月〜１５ヶ月、より好ましくは約３ヶ月〜１２ヶ月にわたり、培地を移植することなく、静置培養、振盪培養などにより行う。また、温度、ｐＨ等のその他の培養条件も適宜選択されて培養が行われることが好ましい。 The culture is performed for at least 1 month, preferably about 1 to 15 months, more preferably about 3 to 12 months, by static culture, shaking culture, or the like without transplanting the medium. In addition, it is preferable that the other culture conditions such as temperature and pH are appropriately selected and cultured.
高分子化合物の分解能を有する微生物の供与源は、微生物を含有するサンプルであれば特に限定されるものではなく、例えば、土壌サンプル、水サンプル（例えば温泉サンプル）、植物サンプルなどを用いることができる。また単離しようとする微生物の種類も特に限定されるものではなく、例えば、細菌、放線菌、糸状菌、担子菌、藻類、及び原生動物が挙げられる。 The source of microorganisms having the resolution of the polymer compound is not particularly limited as long as it is a sample containing microorganisms. For example, a soil sample, a water sample (for example, a hot spring sample), a plant sample, or the like can be used. . The type of microorganism to be isolated is not particularly limited, and examples thereof include bacteria, actinomycetes, filamentous fungi, basidiomycetes, algae, and protozoa.
上述のようにして、高分子化合物の存在下にて微生物含有サンプルを培養した後、その高分子化合物の変化及び培養液の変化を観察する。高分子化合物の変化としては、形状、色の変化があり、例えば、その形状変化は走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）を用いて亀裂として観察することができる。また、培養液の変化は、例えば濁り、変色などにより観察することができる。 As described above, after culturing the microorganism-containing sample in the presence of the polymer compound, changes in the polymer compound and changes in the culture solution are observed. Changes in the polymer compound include changes in shape and color. For example, the change in shape can be observed as a crack using a scanning electron microscope (SEM). Moreover, the change of a culture solution can be observed by turbidity, discoloration, etc., for example.
続いて、上記の変化が観察された微生物含有サンプルから、微生物を単離する。微生物を単離する方法は当技術分野で周知であり、任意の方法によって行うことができる。 Subsequently, the microorganism is isolated from the microorganism-containing sample in which the above change is observed. Methods for isolating microorganisms are well known in the art and can be performed by any method.
本単離方法においては、単離した微生物の高分子化合物分解力を評価するステップをさらに行ってもよい。具体的には、例えば、高分子化合物の存在下にて単離微生物を培養し、一定期間の経過後、該高分子化合物の重量変化を測定することにより、分解された高分子化合物の量を評価することができる。 In the present isolation method, a step of evaluating the ability of the isolated microorganism to decompose the polymer compound may be further performed. Specifically, for example, an isolated microorganism is cultured in the presence of the polymer compound, and after a certain period of time, the weight change of the polymer compound is measured to determine the amount of the decomposed polymer compound. Can be evaluated.
本単離方法により、高分子化合物を分解する微生物を、従来は単離することのできなかったような微生物でも簡便かつ高効率で単離することができる。そのように単離された微生物は、固形高分子化合物の分解力に優れ、産業廃棄物の処理、バイオレメディエーション等の分野で特に有用である。 By this isolation method, a microorganism that degrades a polymer compound can be isolated easily and with high efficiency even with a microorganism that could not be isolated conventionally. Microorganisms isolated in this way are excellent in decomposability of solid polymer compounds, and are particularly useful in the fields of industrial waste treatment, bioremediation and the like.
以下、実施例を用いて本方法をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, although this method is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to these Examples.
〔実施例１〕振盪培養によるポリウレタン分解能を有する細菌の単離（集積培養法）
本実施例においては、振盪培養によりポリウレタン分解能を有する細菌を単離した。
[Example 1] Isolation of bacteria having polyurethane resolution by shaking culture (accumulation culture method)
In this example, bacteria having polyurethane degradability were isolated by shaking culture.
５０ｍｌ容チューブ（ポリプロピレン製、コーニング社）に、１０ｍｌのＭ培地（２．２ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．８ｇ ＫＨ２ＰＯ４、３．０ｇ ＮＨ４ＮＯ３、１０．０ｍｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０．０ｍｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０．０ｍｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ酵母エキス、１Ｌ蒸留水）を添加し、その中に、土壌サンプル１ｇ又は河川水等液体サンプル１ｍｌを加え、ポリウレタンテストピース（エーテル型ポリウレタン、１ｃｍ角に細断したもの）を１個入れ、３０℃で２週間振盪培養（１００ｒｐｍ）した（１次集積培養）。 In a 50 ml tube (made of polypropylene, Corning), 10 ml of M medium (2.2 g Na 2 HPO 4 · 12H 2 O, 0.8 g KH 2 PO 4 , 3.0 g NH 4 NO 3 , 10.0 mg FeSO 4・ 7H 2 O, 10.0 mg CaCl 2 · 2H 2 O, 10.0 mg MgSO 4 · 7H 2 O, 1 g yeast extract, 1 L distilled water), and 1 g soil sample or liquid sample such as river water 1 ml was added, and one polyurethane test piece (ether type polyurethane, 1 cm square shredded) was added, followed by shaking culture (100 rpm) at 30 ° C. for 2 weeks (primary accumulation culture).
培養２週間後のすべてのチューブ（チューブＡとする）から培養液１ｍｌを取り、９ｍｌのＭ培地が入った５０ｍｌ容チューブ（チューブＢとする）に移し、新たにポリウレタンテストピースを入れ、３０℃にて１００ｒｐｍで振盪培養した（２次集積培養）。残ったチューブＡは、ポリウレタンテストピースを入れたまま、３０℃にて静置した。 Take 1 ml of the culture solution from all tubes (referred to as tube A) after 2 weeks of culture, transfer them to a 50 ml tube (referred to as tube B) containing 9 ml of M medium, add a new polyurethane test piece, and add 30 ° C. Culture at 100 rpm with shaking (secondary enrichment culture). The remaining tube A was allowed to stand at 30 ° C. with the polyurethane test piece placed.
２週間培養後のチューブＢのうち、培養液に濁り又は変色が観察されるか、ポリウレタンテストピース自体に変色等の変化が見られたサンプルについては、培養液１ｍｌを取り、９ｍｌのＭ培地が入った５０ｍｌ容チューブ（チューブＣとする）に移し、新たにポリウレタンテストピースを入れ、３０℃、１００ｒｐｍで振盪培養した（３次集積培養）。チューブＣに植え継ぎしなかったチューブＢは廃棄し、残ったチューブＢは、ポリウレタンテストピースを入れたまま、３０℃にて静置した。 For tubes B that have been cultured for 2 weeks, turbidity or discoloration is observed in the culture solution, or changes such as discoloration are observed in the polyurethane test piece itself, take 1 ml of the culture solution, and 9 ml of M medium is added. The sample was transferred to a 50 ml tube (referred to as tube C), and a new polyurethane test piece was added, followed by shaking culture at 30 ° C. and 100 rpm (third accumulation culture). The tube B that was not transplanted to the tube C was discarded, and the remaining tube B was allowed to stand at 30 ° C. with the polyurethane test piece placed.
さらに２週間培養後のチューブＣのうち、培養液に濁りが観察されたサンプルについては、培養液１ｍｌを取り、０．８％ＮａＣｌ溶液にて、希釈し、ＤＮＢ固体培地（ＮＢ培地を１００倍希釈したＤＮＢ培地に、寒天１．８％加えた固体培地）に塗布し、３０℃で培養した。また、上記チューブＣから１ｍｌ培養液を取り、９ｍｌのＭ培地が入った５０ｍｌ容チューブ（チューブＤとする）に移し、新たにポリウレタンテストピースを入れ、３０℃にて１００ｒｐｍで振盪培養した（４次集積培養）。チューブＤに植えつがなかったチューブＣは廃棄し、残ったチューブＣは、ポリウレタンテストピースを入れたまま３０℃にて静置した。 Further, for the sample in which turbidity was observed in the tube C after culturing for 2 weeks, 1 ml of the culture solution was taken, diluted with 0.8% NaCl solution, and the DNB solid medium (NB medium 100 times). The diluted DNB medium was applied to a solid medium (1.8% agar added) and cultured at 30 ° C. Also, 1 ml of the culture solution was taken from the above tube C, transferred to a 50 ml tube (referred to as tube D) containing 9 ml of M medium, and a new polyurethane test piece was placed and cultured at 30 ° C. with shaking at 100 rpm (4 Next enrichment culture). The tube C that was not planted in the tube D was discarded, and the remaining tube C was allowed to stand at 30 ° C. with the polyurethane test piece still inserted.
培養２週間後に、チューブＤ中の培養液に濁りがあるかどうか、ポリウレタンテストピースの形に変化があるかどうかを観察した。培養液の濁りやポリウレタンテストピースの形状に変化があったサンプルについては、培養液１ｍｌを取り、０．８％ＮａＣｌ溶液にて、希釈し、ＤＮＢ固体培地に塗布し、３０℃で培養した。それ以外のチューブは、廃棄とした。 After 2 weeks of culturing, it was observed whether the culture medium in tube D was cloudy and whether the shape of the polyurethane test piece had changed. For samples with turbidity of the culture solution or changes in the shape of the polyurethane test piece, 1 ml of the culture solution was taken, diluted with 0.8% NaCl solution, applied to a DNB solid medium, and cultured at 30 ° C. The other tubes were discarded.
ＤＮＢ固体培地培養後、１週間目までに固体培地上に出現したコロニーを全種類釣菌し、ＤＮＢ固体培地に植菌し、３０℃で培養した。シングルコロニーとなるまで純粋分離を繰り返した。単離菌は、ＤＮＢ固体培地に植菌、培養後、パラフィルムでよく密封し、ポリウレタン分解試験に使用するまで４℃で保存した。また、培養液１ｍｌを２ｍｌチューブにとり、８０％グリセロール溶液を５００μｌとり、よく懸濁させ、−８０℃にて凍結保存した。最終的に７５１株を単離した。 After culturing the DNB solid medium, all types of colonies that appeared on the solid medium by the first week were inoculated, inoculated into the DNB solid medium, and cultured at 30 ° C. Pure separation was repeated until a single colony was obtained. The isolated bacteria were inoculated and cultured in DNB solid medium, sealed well with parafilm, and stored at 4 ° C. until used for polyurethane degradation test. In addition, 1 ml of the culture solution was put in a 2 ml tube, 500 μl of 80% glycerol solution was taken, suspended well, and stored frozen at −80 ° C. Finally, strain 751 was isolated.
〔実施例２〕静置培養によるポリウレタン分解能を有する細菌の単離
本実施例においては、移植による集積培養法を行わずに静置培養によりポリウレタン分解能を有する細菌を単離した。
[Example 2] Isolation of bacteria having polyurethane decomposability by stationary culture In this example, bacteria having polyurethane decomposability were isolated by static culture without carrying out an accumulation culture method by transplantation.
５０ｍｌ容チューブ（ポリプロピレン製、コーニング社）に、１０ｍｌのＭ培地を添加し、その中に、土壌サンプル１ｇ又は河川水等液体サンプル１ｍｌを加え、ポリウレタンテストピースを１個入れ、３０℃で２週間振盪培養した（１００ｒｐｍ）後、そのままポリウレタンテストピースを入れ、３０℃にて静置した（実施例１におけるチューブＡ）。 Add 10 ml of M medium to a 50 ml tube (made of polypropylene, Corning), add 1 g of soil sample or 1 ml of liquid sample such as river water, and put one polyurethane test piece at 30 ° C for 2 weeks. After shaking culture (100 rpm), a polyurethane test piece was put as it was and left at 30 ° C. (tube A in Example 1).
１０ヶ月静置培養後のサンプルから、ポリウレタンテストピースを取り出し、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）観察に供した。その結果、ポリウレタンテストピースの形状に変化が観察された７１種のサンプルについては、その培養液１ｍｌを取り、０．８％ＮａＣｌ溶液にて、希釈し、ＤＮＢ固体培地に塗布し、３０℃で培養した。 A polyurethane test piece was taken out from the sample after stationary culture for 10 months and subjected to observation with a scanning electron microscope (SEM). As a result, for 71 types of samples in which changes in the shape of the polyurethane test piece were observed, 1 ml of the culture solution was taken, diluted with 0.8% NaCl solution, applied to a DNB solid medium, and 30 ° C. Cultured.
さらに亀裂が認められたサンプルから再度菌株の単離を行うため、もとの土壌又は河川水サンプルをそれぞれ１ｇ又は１ｍｌ取り、１０ｍｌのＭ培地に懸濁し、ＤＮＢ固体培地に塗布し、３０℃で培養した。ＤＮＢ固体培地での培養後、１週間目までに固体培地上に出現したコロニーを全種類釣菌し、ＤＮＢ固体培地に植菌し、３０℃で培養した。シングルコロニーとなるまで純粋分離を繰り返した。単離菌は、ＤＮＢ固体培地に植菌、培養後、パラフィルムでよく密封し、ポリウレタン分解試験に使用するまで４℃で保存した。最終的に３３０株を単離した。 In order to isolate strains again from samples with cracks, 1 g or 1 ml of the original soil or river water sample was taken, suspended in 10 ml of M medium, applied to DNB solid medium, and 30 ° C. Cultured. After culturing in the DNB solid medium, all types of colonies that appeared on the solid medium by the first week were inoculated, inoculated into the DNB solid medium, and cultured at 30 ° C. Pure separation was repeated until a single colony was obtained. The isolated bacteria were inoculated and cultured in DNB solid medium, sealed well with parafilm, and stored at 4 ° C. until used for polyurethane degradation test. Finally, 330 strains were isolated.
培養２ヶ月目まで、１週間ごと観察し、ポリウレタンシートの形状に変化が見られたサンプルについては、そこから微生物を同じ固体培地に植菌し、培養した。シングルコロニーとなるまで純粋分離を繰り返し、単離菌は、固体培地で培養後、パラフィルムでよく密封し、ポリウレタン分解試験に使用するまで４℃で保存した。また、細菌の場合には、培養液１ｍｌを２ｍｌチューブにとり、８０％グリセロール溶液を５００μｌとり、よく懸濁させ、−８０℃にて凍結保存した。最終的に３３０株を単離した。 Up to the second month of culture, the samples were observed every week, and for the samples in which the shape of the polyurethane sheet was changed, the microorganisms were inoculated into the same solid medium and cultured. Pure separation was repeated until a single colony was obtained, and the isolated bacteria were cultured in a solid medium, sealed well with parafilm, and stored at 4 ° C. until used for polyurethane degradation test. In the case of bacteria, 1 ml of the culture solution was placed in a 2 ml tube, 500 μl of 80% glycerol solution was well suspended, and stored frozen at −80 ° C. Finally, 330 strains were isolated.
〔実施例３〕ポリウレタン分解能を有する好熱性細菌の単離
本実施例においては、ポリウレタン分解能を有する細菌を単離するため、好熱性細菌サンプルから単離を実施した。
Example 3 Isolation of Thermophilic Bacteria with Polyurethane Degradation In this example, isolation was carried out from thermophilic bacterial samples in order to isolate bacteria with polyurethane degradability.
２０ｍｌ容ガラスバイアルに、７ｍｌの好熱菌分離用培地（下記参照）を添加し、その中に、土壌サンプル１ｇ又は河川水等液体サンプル１ｍｌを加え、ポリウレタンテストピースを１個入れ、アルミキャップで密栓し、８０℃で静置培養した（１次集積培養）。ここで、好熱菌単離用培地は、２ｇペプトン、２ｇ酵母エキス、６ｇ ＮａＣｌ、２０ｍｌ Ｃａｓｔｅｎｈｏｌｚの１０倍溶液塩溶液（１ｇニトリロ三酢酸、０．６ｇ ＣａＳＯ４・２Ｈ２Ｏ、１ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０８ｇ ＮａＣｌ、１．０３ｇ ＫＮＯ３、６．８９ｇ ＮａＮＯ３、１．１１ｇ Ｎａ２ＨＰＯ４、蒸留水（１Ｌまで））、２ｍｌ ＦｅＣｌ３・５Ｈ２Ｏ溶液（０．４ｇ ＦｅＣｌ３・５Ｈ２Ｏ、蒸留水（１Ｌまで））、２ｍｌ Ｎｉｔｈｓｃｈ’ｓ微量成分溶液（０．５ｍｌ Ｈ２ＳＯ４、３．１６ｇ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ Ｈ３ＢＯ３、０．０２５ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０２５ｇ Ｎａ２Ｍｏ４・２Ｈ２Ｏ、０．０４６ｇ ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、蒸留水（１Ｌまで））、蒸留水（１Ｌまで）、ｐＨ８．０からなるものとした。 Add 7 ml of thermophile isolation medium (see below) to a 20 ml glass vial, add 1 g of soil sample or 1 ml of liquid sample such as river water, and put one polyurethane test piece with aluminum cap. Sealed and statically cultured at 80 ° C. (primary enrichment culture). Here, the culture medium for thermophilic bacteria is 2 g peptone, 2 g yeast extract, 6 g NaCl, 10 ml solution salt solution of 20 ml Castenholz (1 g nitrilotriacetic acid, 0.6 g CaSO 4 .2H 2 O, 1 g MgSO 4. 7H 2 O, 0.08 g NaCl, 1.03 g KNO 3 , 6.89 g NaNO 3 , 1.11 g Na 2 HPO 4 , distilled water (up to 1 L), 2 ml FeCl 3 .5H 2 O solution (0.4 g FeCl 3 · 5H 2 O, distilled water (up to 1L)), 2ml Nithsch's trace component solution (0.5ml H 2 SO 4, 3.16g MnSO 4 · 5H 2 O, 0.5g ZnSO 4 · 7H 2 O, 0.5g H 3 BO 3, 0.025g CuSO 4 · 5H 2 O, 0.025g Na 2 Mo 4 · 2H 2 O, 0.046g CoCl 2 · H 2 O, distilled water (up to 1L)), distilled water (up to 1L), consisted of pH 8.0.
培養１週間後のすべてのバイアル（バイアルＡ）から培養液１ｍｌを取り、６ｍｌの好熱菌単離用培地が入った２０ｍｌ容ガラスバイアル（バイアルＢ）に移し、新たにポリウレタンテストピースを入れ、８０℃で静置培養した（２次集積培養）。 Take 1 ml of the culture solution from all vials (vial A) after 1 week of culture, transfer it to a 20 ml glass vial (vial B) containing 6 ml of the thermophile isolation medium, put a new polyurethane test piece, Static culture was performed at 80 ° C. (secondary enrichment culture).
１週間培養後のバイアルＢのうち、培養液に濁り又は変色が観察されるか、ポリウレタンテストピースに変色などの変化がみられたサンプルについては、培養液１ｍｌを取り、６ｍｌの好熱菌単離用培地が入った２０ｍｌ容ガラスバイアルに移し、新たにポリウレタンテストピースを入れ、５０℃又は８０℃で静置培養した。 For a sample of vial B that has been cultured for one week, in which turbidity or discoloration is observed in the culture solution or a change such as discoloration is observed in the polyurethane test piece, 1 ml of the culture solution is taken and 6 ml of thermophilic bacteria The sample was transferred to a 20 ml glass vial containing a release medium, and a new polyurethane test piece was placed therein, followed by stationary culture at 50 ° C. or 80 ° C.
さらに１週間培養後のチューブＣのうち、培養液に濁りが観察されたサンプルについては、培養液１ｍｌを取り、０．８％ＮａＣｌ溶液にて希釈し、好熱菌用固体培地（好熱菌分離用培地に２％のＰｈｙｔｏｇｅｌ（Ｓｉｇｍａ社製）を使用した）に塗布し、５０℃又は８０℃で培養した。好熱菌用固体培地で培養後、１週間目までに固体培地上に出現したコロニーを全種類釣菌し、好熱菌用固体培地に植菌し、５０℃又は８０℃で培養した。シングルコロニーとなるまで純粋分離を繰り返した。単離菌は、好熱菌用固体培地に植菌、培養後、パラフィルムでよく密封し、ポリウレタン分解試験に使用するまで４℃で保存した。また、培養液１ｍｌを２ｍｌチューブにとり、８０％グリセロール溶液を５００μｌとり、よく懸濁させ、−８０℃にて凍結保存した。最終的に、８０℃培養から１６株を、５０℃培養から７８株を単離した。 Further, in tube C after culturing for 1 week, for the sample in which turbidity was observed in the culture solution, 1 ml of the culture solution was taken, diluted with 0.8% NaCl solution, and the solid medium for thermophile (thermophilic bacteria). The separation medium was applied to 2% Phytogel (manufactured by Sigma)) and cultured at 50 ° C. or 80 ° C. After culturing in the solid medium for thermophile, all types of colonies that appeared on the solid medium by the first week were inoculated, inoculated into the solid medium for thermophile, and cultured at 50 ° C or 80 ° C. Pure separation was repeated until a single colony was obtained. The isolated bacterium was inoculated and cultured in a solid medium for thermophilic bacteria, sealed well with parafilm, and stored at 4 ° C. until used in a polyurethane degradation test. In addition, 1 ml of the culture solution was put in a 2 ml tube, 500 μl of 80% glycerol solution was taken, suspended well, and stored frozen at −80 ° C. Finally, 16 strains were isolated from the 80 ° C. culture and 78 strains were isolated from the 50 ° C. culture.
〔実施例４〕単離した微生物によるポリウレタン分解試験
本実施例においては、実施例１〜３において単離した微生物のポリウレタン分解力を、ポリウレタンテストピースの重量減少により、定量的に評価することとした。
Example 4 Polyurethane Degradation Test with Isolated Microorganisms In this example, the ability of the microorganisms isolated in Examples 1 to 3 to be quantitatively evaluated by the weight loss of the polyurethane test piece was evaluated. did.
実施例１に記載のようにして振盪培養で取得した細菌の場合は、当該微生物をＮＢ固体培地に植菌し、３０℃で培養し、生育させた後、当該菌を１０ｍｌのＭ培地（０．１％酵母エキス含）の入った５０ｍｌ容チューブに植菌し、あらかじめ重量を測定したポリウレタンテストピースを１個入れ、３０℃で振盪培養した。振盪速度は、１００ｒｐｍとした。 In the case of bacteria obtained by shaking culture as described in Example 1, the microorganisms are inoculated into an NB solid medium, cultured at 30 ° C. and grown, and then the bacteria are added to 10 ml of M medium (0 Inoculated into a 50 ml tube containing 1% yeast extract), one polyurethane test piece weighed in advance was placed, and cultured at 30 ° C. with shaking. The shaking speed was 100 rpm.
実施例２に記載のようにして静置培養で取得した細菌の場合は、当該微生物をＮＢ固体培地に植菌し、３０℃で培養し、生育させた後、当該菌を１０ｍｌのＭ培地（０．１％酵母エキス含）の入った５０ｍｌ容チューブに植菌し、あらかじめ重量を測定したポリウレタンテストピースを１個入れ、３０℃で静置培養した。 In the case of a bacterium obtained by static culture as described in Example 2, the microorganism is inoculated into an NB solid medium, cultured at 30 ° C. and grown, and then the bacterium is added to 10 ml of M medium ( Inoculated into a 50 ml tube containing 0.1% yeast extract), one polyurethane test piece weighed in advance was placed, and statically cultured at 30 ° C.
実施例３に記載のようにして単離した好熱菌の場合は、当該微生物を好熱菌用固体培地に植菌し、５０℃または８０℃で培養し、生育させた後、当該菌を７ｍｌの好熱菌用培地の入った２０ｍｌ容ガラスバイアルに植菌し、あらかじめ重量を測定したポリウレタンテストピースを１個入れ、アルミキャップで密栓し、５０℃または８０℃で静置培養した。 In the case of a thermophilic bacterium isolated as described in Example 3, the microorganism is inoculated into a solid medium for thermophilic bacteria, cultured at 50 ° C. or 80 ° C. and grown, A 20 ml glass vial containing 7 ml of a thermophilic medium was inoculated, and one polyurethane test piece weighed in advance was placed, sealed with an aluminum cap, and statically cultured at 50 ° C. or 80 ° C.
それぞれ１ヵ月後に、ポリウレタンテストピースを取り出し、手もみによりよく水洗し、８０℃で８時間乾燥させた後、重量を測定した。最終的に８０℃培養から１６株を、５０℃培養から７８株を単離した。 One month after each, the polyurethane test piece was taken out, thoroughly washed with hands and dried at 80 ° C. for 8 hours, and the weight was measured. Finally, 16 strains were isolated from the 80 ° C. culture and 78 strains were isolated from the 50 ° C. culture.
実施例１に記載のようにして単離した微生物（７５１株）のポリウレタン分解力をＮ＝２で評価した。その結果、最高で３．０％／月の重量減少を示す株（１０１６１２Ｆ；沖縄県西表島大富 堆肥から分離）を見出した。分解率の高かった微生物のＯＤ（濁度）が高くなかったことから、ポリウレタンを分解し、その分解物を炭素源として、増殖している可能性は低いものと考えられた。 The polyurethane decomposing ability of the microorganism (strain 751) isolated as described in Example 1 was evaluated at N = 2. As a result, a strain (101612F; separated from Otomi Iriomote Island Compost, Okinawa Prefecture) showing a maximum weight loss of 3.0% / month was found. Since the OD (turbidity) of microorganisms having a high decomposition rate was not high, it was considered that the possibility of growing polyurethane using the decomposition product as a carbon source was low.
また実施例２に記載のようにして単離した微生物（３３０株）のポリウレタン分解力を評価したところ、最高で８．７％／月の重量減少を示す株（９０６０３Ｄ；広島県向島広大臨海試験所 土壌から分離）を見出した。 In addition, when the ability of the microorganisms (330 strains) isolated as described in Example 2 to evaluate the ability of decomposing polyurethane was evaluated, the strain showing a maximum weight loss of 8.7% / month (90603D; (Separated from soil).
実施例３に記載のようにして単離した好熱性細菌（１６株＋７８株）のポリウレタン分解力を評価したところ、５０℃培養からは、有意な分解力を示す（２％以上の分解率）株は見られなかったが、８０℃培養において、最高で６．０％／月の重量減少を示す株（Ｈ５４；静岡県熱川温泉温泉菩薩横 源泉から分離）を見出した。 When the polyurethane decomposing ability of the thermophilic bacterium (16 strains + 78 strains) isolated as described in Example 3 was evaluated, it showed a significant degrading power from the 50 ° C. culture (decomposition rate of 2% or more). Although no strains were found, a strain (H54; isolated from the source of Yokoyoko, Atagawa Onsen, Shizuoka Prefecture) that showed a maximum weight loss of 6.0% / month in 80 ° C. culture was found.
〔実施例５〕ポリウレタン分解能を有する細菌の同定
実施例４の分解試験において２％／月以上の重量減少を示した微生物について同定を行なった。ポリウレタン分解細菌の同定には、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列をもとにした系統解析により行った。
Example 5 Identification of Bacteria with Polyurethane Degradation Microorganisms that showed a weight loss of 2% / month or more in the degradation test of Example 4 were identified. Identification of polyurethane-degrading bacteria was performed by phylogenetic analysis based on the sequence of 16S rRNA gene.
結果を表３に示す。実施例３に従って好熱菌から単離された株は、サーマス・サーモフィラスと同定された。それ以外の株は、実施例２により単離された株である。 The results are shown in Table 3. A strain isolated from thermophilic bacteria according to Example 3 was identified as Thermus thermophilus. The other strains are strains isolated according to Example 2.
上記サーマス・サーモフィラスＨ５４株は、独立行政法人、産業技術総合研究所特許生物寄託センター（茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６）に、平成１６年１１月１２日付でＦＥＲＭ Ｐ−２０２９８として寄託されている。この菌株の菌学的性質は次の通りである。
（１）形態的性質
（ａ）細胞の多形性の有無：多形性なし
（ｂ）運動性の有無：運動性なし
（ｃ）胞子の有無：胞子なし
（２）培養的性質
（ａ）肉汁Ｐｈｙｔｏｇｅｌ平板培養：クリーム色、光沢なし、拡散性色素なし
（ｂ）肉汁液体培養：表面発育なし
（３）化学分類学的性質
（ａ）１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列に基づく系統解析：
Ｈ５４株の１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列（配列番号１）
tggagagttt gatcctggct cagggtgaac gctggcggcg tgcctaagac atgcaagtcg tgcgggccgc
cggggtttta ctccgtggtc agcggcggac gggtgagtaa cgcgtgggtg acctacccgg aagaggggga
caacccgggg aaactcgggc taatccccca tgtggacccg ccccttgggg tgtgtccaaa gggctttgcc
cgcttccgga tgggcccgcg tcccatcagc tagttggtgg ggtaatggcc caccaaggcg acgacgggta
gccggtctga gaggatggcc ggccacaggg gcactgagac acgggcccca ctcctacggg aggcagcagt
taggaatctt ccgcaatggg cgcaagcctg acggagcgac gccgcttgga ggaagaagcc cttcggggtg
taaactcctg aacccgggac gaaacccccg acgaggggac tgacggtacc ggggtaatag cgccggccaa
ctccgtgcca gcagccgcgg ta
The Thermus Thermophilus H54 strain is an independent administrative agency, the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 6th) as FERM P-20298 on November 12, 2004. It has been deposited. The bacteriological properties of this strain are as follows.
(1) Morphological properties (a) Presence or absence of polymorphism of cells: No polymorphism (b) Presence or absence of motility: No motility (c) Presence or absence of spores: No spore (2) Culture properties (a) Meat broth Phytogel plate culture: cream color, no gloss, no diffusible pigment (b) Meat broth liquid culture: no surface growth (3) Chemical taxonomic properties (a) Phylogenetic analysis based on 16S rDNA base sequence:
16S rDNA base sequence of H54 strain (SEQ ID NO: 1)
tggagagttt gatcctggct cagggtgaac gctggcggcg tgcctaagac atgcaagtcg tgcgggccgc
cggggtttta ctccgtggtc agcggcggac gggtgagtaa cgcgtgggtg acctacccgg aagaggggga
caacccgggg aaactcgggc taatccccca tgtggacccg ccccttgggg tgtgtccaaa gggctttgcc
cgcttccgga tgggcccgcg tcccatcagc tagttggtgg ggtaatggcc caccaaggcg acgacgggta
gccggtctga gaggatggcc ggccacaggg gcactgagac acgggcccca ctcctacggg aggcagcagt
taggaatctt ccgcaatggg cgcaagcctg acggagcgac gccgcttgga ggaagaagcc cttcggggtg
taaactcctg aacccgggac gaaacccccg acgaggggac tgacggtacc ggggtaatag cgccggccaa
ctccgtgcca gcagccgcgg ta
ｂｌａｓｔ検索をおこなったところ、サーマス・サーモフィラスＨＢ８株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（アクセッションＮｏ．Ｘ０７９９８）と９９．８％の相同性を示し、またサーマス・サーモフィラスＨＢ２７株の１６Ｓ ｒＤＮＡ配列（アクセッションＮｏ．ＡＥ０１７３０７）と９９．６％の相同性を示した。 When a blast search was performed, it showed 99.8% homology with the 16S rDNA sequence of the Thermus thermophilus HB8 strain (Accession No. X07998), and the 16S rDNA sequence of the Thermus thermophilus HB27 strain (Accession No. AE017307). ) And 99.6% homology.
〔実施例６〕担子菌によるポリウレタン分解試験
本実施例においては、担子菌のポリウレタン分解力を評価し、ポリウレタン分解力の高い担子菌を単離した。
[Example 6] Polyurethane degradation test by basidiomycetes In this example, basidiomycetes were evaluated for their ability to degrade polyurethane, and basidiomycetes with high polyurethane degradation were isolated.
担子菌をポテトデキストロース（ＰＤ）固体培地（Ｄｉｆｃｏ社製）に植菌し、２５℃で前培養し、生育させた。その後の培養は、（Ａ）ＰＤ培地で振盪培養、（Ｂ）Ｋｉｒｋ培地（１Ｌ中、１０ｇグルコース、０．２ｇ酢酸エキス、６．２ｇポリペプトン、５ｍｌの２Ｈコハク酸バッファー（ｐＨ４．５）、１．８ｇ酒石酸アンモニウム、２．０ｇ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｍｇチアミン−ＨＣｌ、１０ｍｌ Ｋｉｒｋ微量元素溶液（１Ｌ、ｐＨ４．５中、９ｇニトリロ三酢酸ナトリウム、３ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．７３ｇ ＭｎＳＯ４、６ｇ ＮａＣｌ、０．６ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．１ｇ ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．６ｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．１ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、６０ｍｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１１０ｍｇ ＡｌＫ（ＳＯ４）２・１２Ｈ２Ｏ、６０ｍｇ Ｈ３ＢＯ３、７０ｍｇ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ））で静置培養、（Ｃ）木粉培地（１Ｌ中、１０ｇグルコース、２０ｍｌコーンスティープリカー、５０ｍｇ ＭｎＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、１０ｍｌ Ｋｉｒｋ微量元素溶液、５μｌ ２Ｍコハク酸バッファー（ｐＨ４．５））で静置培養の３通りで行った。 The basidiomycetes were inoculated into a potato dextrose (PD) solid medium (manufactured by Difco), pre-cultured at 25 ° C., and grown. Subsequent cultures were (A) shaking culture in PD medium, (B) Kirk medium (10 g glucose, 0.2 g acetic acid extract, 6.2 g polypeptone in 1 L, 5 ml 2H succinate buffer (pH 4.5), 1 .8 g ammonium tartrate, 2.0 g KH 2 PO 4 , 0.5 g MgSO 4 .7H 2 O, 0.1 g CaCl 2 .2H 2 O, 10 mg thiamine-HCl, 10 ml Kirk trace element solution (1 L in pH 4.5) 9 g sodium nitrilotriacetate, 3 g MgSO 4 .7H 2 O, 2.73 g MnSO 4 , 6 g NaCl, 0.6 g FeSO 4 .7H 2 O, 1.1 g CoSO 4 .7H 2 O, 0.6 g CaCl 2. 2H 2 O, 1.1 g ZnSO 4 .7H 2 O, 60 mg CuSO 4 .5H 2 O, 110 mg AlK (SO 4 ) 2 .1 2H 2 O, 60 mg H 3 BO 3 , 70 mg Na 2 MoO 4 .2H 2 O)), (C) wood flour medium (10 g glucose in 1 L, 20 ml corn steep liquor, 50 mg MnSO 4 .5H 2 O, 10 ml Kirk trace element solution, 5 μl 2M succinic acid buffer (pH 4.5)) was carried out in three ways of static culture.
ＰＤ培地での振盪培養には、３００ｍｌ容三角フラスコに５０ｍｌのＰＤ培地を加え、上記の前培養した菌を植菌し、２５℃で、１ヶ月間振盪培養した。植菌は、固体培地に生育した菌を寒天ごとコルクボーラーで打ち抜き、そのままフラスコに入れた。 For shaking culture in PD medium, 50 ml of PD medium was added to a 300 ml Erlenmeyer flask, the above-cultured bacteria were inoculated, and cultured at 25 ° C. for 1 month. Inoculation was performed by punching out the fungus grown on a solid medium with a cork borer and placing it in a flask as it was.
Ｋｉｒｋ培地での静置培養には、３００ｍｌ容三角フラスコに５０ｍｌのＫｉｒｋ培地を加え、上記の前培養した菌を植菌し、２５℃で、１ヶ月間静置培養した。植菌は、固体培地に生育した菌を寒天ごとコルクボーラーで打ち抜き、そのままフラスコに入れた。 For static culture in Kirk medium, 50 ml of Kirk medium was added to a 300 ml Erlenmeyer flask, the above pre-cultured bacteria were inoculated, and statically cultured at 25 ° C. for 1 month. Inoculation was performed by punching out the fungus grown on a solid medium with a cork borer and placing it in a flask as it was.
木粉培地での静置培養には、３００ｍｌ容三角フラスコにブナ木粉１０ｇと２０ｍｌのＫｉｒｋ培地を加え、上記の前培養した菌を植菌し、２５℃で、１ヶ月間静置培養した。植菌は、固体培地に生育した菌を寒天ごとコルクボーラーで打ち抜き、そのままフラスコに入れた。 For stationary culture in a wood flour medium, 10 g of beech wood flour and 20 ml of Kirk medium were added to a 300 ml Erlenmeyer flask, and the above pre-cultured bacteria were inoculated and incubated at 25 ° C. for 1 month. . Inoculation was performed by punching out the fungus grown on a solid medium with a cork borer and placing it in a flask as it was.
それぞれＮ＝３で実施し、１ヵ月後にポリウレタンテストピースを取り出し、実施例４と同様に重量を測定した。 Each was carried out at N = 3, and after one month, the polyurethane test piece was taken out and weighed in the same manner as in Example 4.
その結果を表４に示す。試験した担子菌のうち、最高で３．８％／月の重量減少を示す担子菌が存在した。 The results are shown in Table 4. Among the basidiomycetes tested, there were basidiomycetes that showed a weight loss of up to 3.8% / month.
本発明に係るポリウレタン分解方法及びポリウレタン分解剤により、ポリウレタン、特にエーテル型ポリウレタンを効率的に分解することができる。また、本発明に係るポリウレタン分解方法及びポリウレタン分解剤により、各種の分野で分解・減容化が望まれるポリウレタン含有廃棄物を処理することができる。 By the polyurethane decomposing method and the polyurethane decomposing agent according to the present invention, polyurethane, particularly ether type polyurethane can be efficiently decomposed. In addition, the polyurethane-containing waste which is desired to be decomposed and reduced in various fields can be treated by the polyurethane decomposing method and the polyurethane decomposing agent according to the present invention.
さらに、本発明に係る高分子化合物を分解する微生物の単離方法により、高分子化合物分解微生物を簡便かつ高効率で単離することができ、そのように単離された微生物はバイオレメディエーション等の分野に有用である。 Furthermore, by the method for isolating a microorganism that degrades a polymer compound according to the present invention, a microorganism capable of decomposing a polymer compound can be isolated easily and efficiently, and the microorganism thus isolated can be used for bioremediation and the like. Useful in the field.
Claims (21)
（ａ）高分子化合物の存在下で微生物含有サンプルを培養するステップであって、その際、移植による集積培養を行なわず、少なくとも１ヶ月間にわたり培養を継続することを含む、培養ステップ、
（ｂ）高分子化合物の変化又は培地の変化を観察するステップ、
（ｃ）変化が観察された微生物含有サンプルから微生物を単離するステップ、
を含む、高分子化合物分解微生物の単離方法。 A method for isolating a microorganism having a resolution of a polymer compound,
(A) a step of culturing a microorganism-containing sample in the presence of a polymer compound, the method comprising culturing for at least one month without performing accumulation culture by transplantation,
(B) observing a change in the polymer compound or a change in the medium;
(C) isolating microorganisms from the microorganism-containing sample in which changes are observed;
A method for isolating a polymer compound-degrading microorganism, comprising:
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