JP4214247B2 - 酸性ペルオキシダーゼ及びその遺伝子 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、担子菌テルミトマイセス・アルブミノサス（Termitomyces albuminosus）ＡＴＴＣ４２０１０由来の酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼは、過酸化酵素ともよばれ、過酸化水素の存在下、種々の化合物を酸化する酵素であり、動物界、植物界及び微生物界に広く分布することが知られている。ペルオキシダーゼは、各種酵素抗体標識など各種分析試薬として既に実用化されており、また、各種廃液・排水中の有機塩素化合物、環境ホルモン等の分解・除去、パルプ廃液の脱色、洗濯物の色移り防止、フェノール樹脂の合成、食品の劣化防止などの幅広い用途が期待されている。かかるペルオキダーゼの中でも、近年、種々の微生物に由来するペルオキダーゼが探索されてきており、例えば、担子菌のコプリヌス・シネリウス（特開平３−１９４９号公報）、ヒラタケ（Biochim. Biopys. Acta, 1251, 205-209, 1995）、ホウロクタケ（特開平８−７０８６２号公報）、白色腐朽菌のファネロカエテ・クリソスポリウム（Gene, 93, 119-124, 1990）、ファネロカエテ・ソルディダ（特開２０００−１５２７８６号公報）、糸状菌のアルスロマイセス・ラモスス（Agric. Biol. Chem, 50, 247, 1986）、子嚢菌ゲオトリカム・キャンディウム（Journal of Bioscience and Bioengineering, 87, 411, 1999）、コフキサルノコシカケ(Biotech. Lett. 23, 103, 2001)、カワラタケ(Biochem. Biophys. Res. Commun, 179, 428-435, 1991)、セリポリオプシス・スベミスポラ(Gene, 206, 185-193, 1998)、ダイコミタス・スクアレンス(Biochim. Biophys. Acta, 1434, 356-364, 1999)、フレビア・ラヂアタ(Gene, 85, 343-351, 1989)、不完全菌類のフザリウム・オキシスポルム、フミコラ・インソレンスなどの微生物に由来するペルオキシダーゼが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、担子菌テルミトマイセス・アルブミノサスＡＴＴＣ４２０１０に由来する新規な酸性ペルオキシダーゼや、かかる酸性ペルオキシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列を明らかにして、その有用な機能をより広く活用するための手段を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
担子菌テルミトマイセス・アルブミノサスＡＴＴＣ４２０１０より新規な酸性ペルオキシダーゼ（ＴＡＰ）を単離し、その酵素学的性質を決定したところ、従来知られているペルオキシダーゼと比較して、ｐＨ２．３において最大活性を示すなど非常に低いｐＨ条件で高い活性を有することを見い出した。また、同菌株より単離したＴＡＰ遺伝子は既存の担子菌由来のペルオキシダーゼに対して非常に低い相同性（約３０％）を示したに過ぎなかったが、ｐＨ３．０〜４．０において最大活性を有する子嚢菌ゲオトリカム・キャンディウム（Geotricum candium）由来のペルオキシダーゼＤｙｐに対し、ＴＡＰはアミノ酸配列で５６％の相同性を示すことから、ＴＡＰは担子菌より単離された新規のペルオキシダーゼであり、相同酵素であるＤｙＰより低ｐＨ領域において活性を示す酵素であることがわかった。本発明はこれら知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００５】
すなわち本発明は、(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項１）や、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなり、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項２）や、請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項３）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項４）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質（請求項５）に関する。
【０００６】
また本発明は、請求項４又は５記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質（請求項６）や、請求項４又は５記載のタンパク質に特異的に結合する抗体（請求項７）や、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７記載の抗体（請求項８）や、請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクター（請求項９）や、請求項４又は５記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項１０）や、請求項１０記載の発現系を含んでなる宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物から酸性ペルオキシダーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法（請求項１１）に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の対象となるＤＮＡとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡであればどのようなものでもよく、ここで、上記酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質とは、酸性領域においてペルオキシダーゼ活性を定性的に呈するタンパク質をいう。
【０００８】
また、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含む配列からなるＤＮＡをプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、新規な酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。こうして得られるＤＮＡも本発明に包含される。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【０００９】
これら本発明のＤＮＡは、本発明に開示されたＤＮＡ配列情報等に基づき、例えば担子菌テルミトマイセス・アルブミノサスＡＴＴＣ４２０１０等のゲノム遺伝子から、ＰＣＲ又はＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションなど公知の方法により調製することができる。その他、化学合成によっても調製することができる。また、これら本発明のＤＮＡから、酸性ペルオキシダーゼ活性を有する人工変異タンパク質をコードする本発明のＤＮＡ、すなわち、塩基配列レベルやアミノ酸配列レベルでの本発明の人工変異ＤＮＡを得るには、公知の突然変異手段を用いればよく、例えば市販の突然変異誘発キットを用いると変異を容易に導入することができる。さらに、アミノ酸配列に含まれる第１番目のメチオニン（Met)が欠失しているものなども、アミノ酸配列の変異によるタンパク質に含まれる。
【００１０】
本発明のタンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質であれば特に制限されるものではなく、これら本発明のタンパク質はそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由来は特に制限されるものではない。
【００１１】
本発明の融合タンパク質としては、本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質等の精製や、酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質等に対する抗体の定量用などとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００１２】
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明のタンパク質、融合タンパク質等の全部又は一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、酸性ペルオキシダーゼの特性やその産生機構を明らかにする上で有用である。
【００１３】
上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のタンパク質又はエピトープを含むその断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００１４】
また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本発明のタンパク質の機能解析を行うことができる。また本件発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００１５】
本発明の組換えベクターとしては、上記本発明のＤＮＡを含むベクターであれば特に制限されないが、本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系を含むものが好ましく、例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、より具体的には、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明はまた、上記本発明のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる本発明のタンパク質をコードするＤＮＡや上記発現系を含む組換えベクターの宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
【００１７】
また、本発明の組換えタンパク質の製造方法としては、上記発現系を含んでなる宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物から酸性ペルオキシダーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取する方法であればどのような方法でもよく、かかる本発明のタンパク質を細胞培養物から回収し精製する方法としては、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法を挙げることができる。また、上記アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本発明のタンパク質を得ることができる。上記本発明のタンパク質の精製方法は、ペプチド合成の際にも適用することができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこの実施例により限定されるものではない。
実施例１（ＴＡＰの調製）
［１．テルミトマイセス・アルブミノサスの培養］
担子菌テルミトマイセス・アルブミノサスＡＴＣＣ４２０１０は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）より購入したものを、ポテトデキストロース（Potato dextrose）寒天培地（Difco社製）により生育させ、保存しておいたものを用いた。前培養は、ポテトデキストロース寒天培地上で生育した本菌株を直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、それを下記に示すＴＡＰ単離用培地１０ｍｌを入れた１００ｍｌ容三角フラスコに移し、３０℃で１週間培養することにより行った。前培養で得られた菌体を、カップ型ブレンダーＣＭ１００（イウチ社製）を用い破砕し、ＴＡＰ単離用培地５００ｍｌを入れた２リットル容フラスコに植菌して本培養を行った。本培養は、３０℃で４日間振盪培養（１００ｒｐｍ）し、５目日以降は、毎日１５分間酸素ガスをフラスコに吹き込み培養することにより行った。
【００１９】
本培養中、経時的に採取した培養上清０．１ｍｌに、反応液［５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２．３）、０．１ｍＭ過酸化水素、０．５ｍＭ２，６−ジメトキシフェノール］１ｍｌを加え、分光光度計ＤＵ５３０（ベックマン社製）を用いて、４６９ｎｍの吸光度の上昇により反応を追跡しすることにより、ＴＡＰ活性を測定したところ、培養２０日目に最大のＴＡＰ活性を得ることができた。
【００２０】
［２．ＴＡＰ単離用培地組成（１リットル）］
Yeast Carbon Base（Difco社製） １．１７ｇ
酒石酸アンモニウム １２ｍＭ
金属塩混合液*（下記に組成を示す） ６０ｍｌ
ＭｎＳＯ4 １００μＭ
Ｔｗｅｅｎ８０ ０．１％
イオン交換水を用い１リットルとし、ｐＨ６．０に調整
＊：金属塩混合液 (Methods in Enzymology,161, 238-249, 1988)
ＭｇＳＯ4 ３ｇ
ＮａＣｌ ０．５ｇ
ＦｅＳＯ4 ０．１ｇ
ＣｏＣｌ2 ０．１ｇ
ＺｎＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ ０．１ｇ
ＣｕＳＯ4 ０．１ｇ
ＡｌＫ（ＳＯ4）2 １２Ｈ2Ｏ １０ｍｇ
Ｈ3ＢＯ3 １０ｍｇ
Ｎａ2ＭｏＯ4 ２Ｈ2Ｏ １０ｍｇ
Sodium nitrilotriacetate １．５ｇ
イオン交換水を用い１リットルとし、ｐＨ４．５に調整
【００２１】
［３．ＴＡＰの単離］
ＴＡＰを単離するため、培養２０日目の培養液を、グラスウールにより菌体と濾別した。濾液は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析を１２時間行った。これを予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）により平衡化したＤＥＡＥ−Toyopearl（東ソー社製）を充填したカラム（３ｃｍ×１０ｃｍ）に流し込み、ＴＡＰをカラムに結合させた。流し込み終了後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍｌ、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）２００ｍｌによりカラムを洗浄した。ＴＡＰは０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）への直線グラジエントによりカラムから溶出させた。活性画分は、限外濾過膜PM-10（amicon社製）により濃縮後、Superdex 200HR 10/30（Amasham-Pharmasic Biotech社製）を用い分画した。分画条件は溶離液として０．１Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用い、流速０．５ｍｌ／分とした。活性画分は、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対し透析後、MonoQ HR5/5（Amasham-Pharmasic Biotech社製）により更に分画を行った。分画条件は溶離液として１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用い、塩化ナトリウム０〜０．５Ｍへのリニアグラジエントで、流速１．０ｍｌ／分とした。最終的に得られた活性画分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析を行ったところ、唯一のバンドを与えた。
【００２２】
［４．ＴＡＰの至適ｐＨ］
精製したＴＡＰ２．３ｎｇに、反応液［５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５〜２．０）及び５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．１〜２．０）、０．４ｍＭ過酸化水素、５０μＭ２，２'−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）２アンモニウム］１ｍｌを加え、分光光度計ＤＵ５３０（ベックマン社製）を用いて、４１５ｎｍの吸光度の上昇により追跡することにより、至適ｐＨを決定した。結果を図１に示す。なお、図中の●はリン酸緩衝液、■はクエン酸緩衝液である。図１からわかるように、精製ＴＡＰはｐＨ２．３において最大活性を示し、ＴＡＰの至適ｐＨがｐＨ２．３であることがわかった。
【００２３】
実施例２（ＴＡＰ遺伝子の調製）
［１．ＴＡＰ遺伝子断片の取得］
ＴＡＰ遺伝子断片の取得は、図２に示されるように、各種プライマーを用いて行った。まず、培養１７日目の菌体（湿潤重量約３ｇ）より、全ＲＮＡの単離をacid guanidinium phenol-chloroform法（Chonczynski P., Sacchi N., Analytical Biochemistry, 162, 156-159, 1987）により行った。単離した全ＲＮＡは、oligotex-dT30 <Super> mRNA Purification Kit（TAKARA社製）を用い、ｐｏｌｙＡ ＲＮＡを分別することにより回収した。６０ｎｇのＰｏｌｙＡ ＲＮＡは、SuperscriptII（Gibco BRL社製）により、プライマー１：5'-TTTACCTCTTCAGC(T)19-3'（配列番号３）を用いて取扱説明書に従い逆転写し、first strand ｃＤＮＡを得た。
【００２４】
ＴＡＰのＮ末端アミノ酸配列を、気相プロテインシークエンサーABI 477Aを用いて常法により分析した。その結果、配列番号４のアミノ酸配列が決定された。このＮ末端アミノ酸配列をもとに、プライマー２：5'-TTCGARAAYATHGARGCHGCYAT-3'（配列番号５）及びプライマー３：5'-ATYYTBGTKGGYATGAAGAARCA-3'（配列番号６）の２種類の混合プライマーを作製した。ＴＡＰ遺伝子断片の取得には、ＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription polymerase chain reaction）法を用いた。１μｌのfirst strand ｃＤＮＡ溶液に、０．２μＭのプライマー１、５μＭのプライマー２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（deoxyribonucleoside triphosphate）、２ＵのＥＸＴａｑ（TAKARA社製）、３μｌの１０×ＥＸＴａｑ bufferを加え、最終液量を３０μｌとした。
【００２５】
ＰＣＲは、MJ Research PTC-200を用い、反応１（９４℃３０秒、４５℃１分、７２℃２分、５サイクル）、反応２（９４℃３０秒、４９℃１分、７２℃２分、５サイクル）、反応３（９４℃３０秒、５３℃１分、７２℃２分、５サイクル）、反応４（９４℃３０秒、５７℃１分、７２℃２分、２０サイクル）の条件で行った。こうして得られた反応液１μｌを鋳型ＤＮＡとし、２回目のＰＣＲを次の条件で行った。上記反応液１μｌに、０．３μＭプライマー１、５μＭプライマー３、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２ＵのＥｘＴａｑ（TAKARA社製）、３μｌの１０×ＥＸＴａｑ bufferを加え、最終液量３０μｌとし、ＰＣＲサイクルを９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分４０サイクルで行った。
【００２６】
この結果得られた該反応液を、アガロース電気泳動により分離し、QIAEX II Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用い、約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収した。該ＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega社製)に取扱説明書に従い連結し、このベクターを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、目的のＤＮＡ断片を含むコロニーを、シークエンスすることでスクリーニングを行った。なお、ＤＮＡシークエンサーはABI PRISM377(Applied Biosystems社製)、シークエンス反応はABI PRISM Cycle sequencing Kit (Applied Biosystems社製)を用いた。
【００２７】
［２．完全長ＴＡＰ遺伝子配列の決定］
上記得られたＴＡＰ遺伝子断片は、５'末端を欠くものである。そこで、完全長ＴＡＰ遺伝子を取得するため、５'ＲＡＣＥ（5' rapid amplification of cDNA ends）法を、５'ＲＡＣＥ ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（GIBCO BRL社製）を用いて行った。まず、先に得た部分ＴＡＰ遺伝子の塩基配列をもとに、プライマー４：5'-AATCGTATACGACAGTCCACG-3'（配列番号７）、プライマー５： 5'-CATCGGAGGCATCAGCGAAC-3'（配列番号８）を作製した。２．５ｐｍｏｌのプライマー４を用い、約２２ｎｇのｐｏｌｙＡ ＲＮＡを用いて、SuperscriptII（GIBCO BRL 社製）により逆転写反応を行った。得られたfirst strand ｃＤＮＡの５'末端にデオキシシトシンテールを付加し、これを鋳型として、プライマー５と５'ＲＡＣＥｖｅｒｓｉｏｎ２．０（GIBCO BRL社製）に添付のAbridged anchor primerを用いて、ＰＣＲを以下の条件で行った。first strand ｃＤＮＡ約１ｎｇに対して、終濃度各０．４μＭのプライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２ＵのＥＸ−Ｔａｑを加え、最終反応量を５０μｌとし、ＰＣＲサイクルを９４℃４０秒、５５℃４０秒、７２℃１分、３５サイクルで行った。ＰＣＲ反応終了後、約４００ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルより、前記と同様の方法により抽出し、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニング後、シークエンスの決定を行った。こうして得た配列は、上記得られたＴＡＰ遺伝子断片の塩基配列と約３００ｂｐにわたり同一の配列をもち、両配列を連結することにより完全長ＴＡＰ遺伝子配列（配列番号１）を決定することができた。また、連結後の配列から推定されるＴＡＰアミノ酸配列（配列番号２）には、精製酵素より決定されたＮ末端アミノ酸配列が存在していた。
【００２８】
上記ＴＡＰアミノ酸配列（配列番号２）に対し、相同性検索を行ったところ、有意な相同性を示す２つの遺伝子が存在した。結果を表１に示す。遺伝子cpop21は、担子菌Polyporaceae sp.に由来するもののその機能は不明である。遺伝子ｄｙｐは子嚢菌Geotricum candidumに由来し、その発現産物であるペルオキシダーゼＤｙＰの至適ｐＨは最低３．０である。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【発明の効果】
ＴＡＰは従来のペルオキシダーゼと比較して、極めて低いｐＨ領域において活性を有することから、従来知られているペルオキシダーゼでは使用不可能なｐＨ領域での使用が可能であり、酸性領域での各種酵素抗体標識（ウェスタンブロット、レポーターアッセイ等）の原理に基づく分析法や、酸性廃液・排水中の有機塩素化合物、環境ホルモン等の分解に有利に用いることができる。
【００３１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＴＡＰの至適ｐＨの測定結果を示す図である。
【図２】本発明のＴＡＰ遺伝子の取得の概要を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、担子菌テルミトマイセス・アルブミノサス（Termitomyces albuminosus）ＡＴＴＣ４２０１０由来の酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質、及び該タンパク質をコードする遺伝子等に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ペルオキシダーゼは、過酸化酵素ともよばれ、過酸化水素の存在下、種々の化合物を酸化する酵素であり、動物界、植物界及び微生物界に広く分布することが知られている。ペルオキシダーゼは、各種酵素抗体標識など各種分析試薬として既に実用化されており、また、各種廃液・排水中の有機塩素化合物、環境ホルモン等の分解・除去、パルプ廃液の脱色、洗濯物の色移り防止、フェノール樹脂の合成、食品の劣化防止などの幅広い用途が期待されている。かかるペルオキダーゼの中でも、近年、種々の微生物に由来するペルオキダーゼが探索されてきており、例えば、担子菌のコプリヌス・シネリウス（特開平３−１９４９号公報）、ヒラタケ（Biochim. Biopys. Acta, 1251, 205-209, 1995）、ホウロクタケ（特開平８−７０８６２号公報）、白色腐朽菌のファネロカエテ・クリソスポリウム（Gene, 93, 119-124, 1990）、ファネロカエテ・ソルディダ（特開２０００−１５２７８６号公報）、糸状菌のアルスロマイセス・ラモスス（Agric. Biol. Chem, 50, 247, 1986）、子嚢菌ゲオトリカム・キャンディウム（Journal of Bioscience and Bioengineering, 87, 411, 1999）、コフキサルノコシカケ(Biotech. Lett. 23, 103, 2001)、カワラタケ(Biochem. Biophys. Res. Commun, 179, 428-435, 1991)、セリポリオプシス・スベミスポラ(Gene, 206, 185-193, 1998)、ダイコミタス・スクアレンス(Biochim. Biophys. Acta, 1434, 356-364, 1999)、フレビア・ラヂアタ(Gene, 85, 343-351, 1989)、不完全菌類のフザリウム・オキシスポルム、フミコラ・インソレンスなどの微生物に由来するペルオキシダーゼが知られている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、担子菌テルミトマイセス・アルブミノサスＡＴＴＣ４２０１０に由来する新規な酸性ペルオキシダーゼや、かかる酸性ペルオキシダーゼをコードする遺伝子の塩基配列を明らかにして、その有用な機能をより広く活用するための手段を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
担子菌テルミトマイセス・アルブミノサスＡＴＴＣ４２０１０より新規な酸性ペルオキシダーゼ（ＴＡＰ）を単離し、その酵素学的性質を決定したところ、従来知られているペルオキシダーゼと比較して、ｐＨ２．３において最大活性を示すなど非常に低いｐＨ条件で高い活性を有することを見い出した。また、同菌株より単離したＴＡＰ遺伝子は既存の担子菌由来のペルオキシダーゼに対して非常に低い相同性（約３０％）を示したに過ぎなかったが、ｐＨ３．０〜４．０において最大活性を有する子嚢菌ゲオトリカム・キャンディウム（Geotricum candium）由来のペルオキシダーゼＤｙｐに対し、ＴＡＰはアミノ酸配列で５６％の相同性を示すことから、ＴＡＰは担子菌より単離された新規のペルオキシダーゼであり、相同酵素であるＤｙＰより低ｐＨ領域において活性を示す酵素であることがわかった。本発明はこれら知見に基づいて完成するに至ったものである。
【０００５】
すなわち本発明は、(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項１）や、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなり、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項２）や、請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ（請求項３）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質（請求項４）や、配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質（請求項５）に関する。
【０００６】
また本発明は、請求項４又は５記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質（請求項６）や、請求項４又は５記載のタンパク質に特異的に結合する抗体（請求項７）や、抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７記載の抗体（請求項８）や、請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクター（請求項９）や、請求項４又は５記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞（請求項１０）や、請求項１０記載の発現系を含んでなる宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物から酸性ペルオキシダーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法（請求項１１）に関する。
【０００７】
【発明の実施の形態】
本発明の対象となるＤＮＡとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡや、配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなるＤＮＡであればどのようなものでもよく、ここで、上記酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質とは、酸性領域においてペルオキシダーゼ活性を定性的に呈するタンパク質をいう。
【０００８】
また、配列番号１に示される塩基配列又はその相補的配列並びにこれらの配列の一部又は全部を含む配列からなるＤＮＡをプローブとして、各種ＤＮＡライブラリーに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイゼーションを行ない、該プローブにハイブリダイズするＤＮＡを単離することにより、新規な酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを得ることもできる。こうして得られるＤＮＡも本発明に包含される。かかる本発明のＤＮＡを取得するためのハイブリダイゼーションの条件としては、例えば、４２℃でのハイブリダイゼーション、及び１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による４２℃での洗浄処理を挙げることができ、６５℃でのハイブリダイゼーション、及び０．１×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳを含む緩衝液による６５℃での洗浄処理をより好ましく挙げることができる。なお、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を与える要素としては、上記温度条件以外に種々の要素があり、当業者であれば、種々の要素を適宜組み合わせて、上記例示したハイブリダイゼーションのストリンジェンシーと同等のストリンジェンシーを実現することが可能である。
【０００９】
これら本発明のＤＮＡは、本発明に開示されたＤＮＡ配列情報等に基づき、例えば担子菌テルミトマイセス・アルブミノサスＡＴＴＣ４２０１０等のゲノム遺伝子から、ＰＣＲ又はＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションなど公知の方法により調製することができる。その他、化学合成によっても調製することができる。また、これら本発明のＤＮＡから、酸性ペルオキシダーゼ活性を有する人工変異タンパク質をコードする本発明のＤＮＡ、すなわち、塩基配列レベルやアミノ酸配列レベルでの本発明の人工変異ＤＮＡを得るには、公知の突然変異手段を用いればよく、例えば市販の突然変異誘発キットを用いると変異を容易に導入することができる。さらに、アミノ酸配列に含まれる第１番目のメチオニン（Met)が欠失しているものなども、アミノ酸配列の変異によるタンパク質に含まれる。
【００１０】
本発明のタンパク質としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質や、配列番号２で示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質であれば特に制限されるものではなく、これら本発明のタンパク質はそのＤＮＡ配列情報等に基づき公知の方法で調製することができ、その由来は特に制限されるものではない。
【００１１】
本発明の融合タンパク質としては、本発明のタンパク質とマーカータンパク質及び／又はペプチドタグとが結合しているものであればどのようなものでもよく、マーカータンパク質としては、従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものではなく、例えば、アルカリフォスファターゼ、抗体のＦｃ領域、ＧＦＰなどを具体的に挙げることができ、また本発明におけるペプチドタグとしては、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＧＳＴタグなどの従来知られているペプチドタグを具体的に例示することができる。かかる融合タンパク質は、常法により作製することができ、Ｎｉ−ＮＴＡとＨｉｓタグの親和性を利用した酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質等の精製や、酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質等に対する抗体の定量用などとして、また当該分野の研究用試薬としても有用である。
【００１２】
本発明のタンパク質に特異的に結合する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の免疫特異的な抗体を具体的に挙げることができ、これらは上記本発明のタンパク質、融合タンパク質等の全部又は一部を抗原として用いて常法により作製することができるが、その中でもモノクローナル抗体がその特異性の点でより好ましい。かかるモノクローナル抗体等の抗体は、例えば、酸性ペルオキシダーゼの特性やその産生機構を明らかにする上で有用である。
【００１３】
上記の本発明の抗体は、慣用のプロトコールを用いて、動物（好ましくはヒト以外）に本発明のタンパク質又はエピトープを含むその断片を投与することにより産生され、例えばモノクローナル抗体の調製には、連続細胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブリドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today 4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることができる。
【００１４】
また前記モノクローナル抗体等の抗体に、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシアネート）又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125Ｉ、32Ｐ、14Ｃ、35Ｓ又は3Ｈ等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、本発明のタンパク質の機能解析を行うことができる。また本件発明の抗体を用いる免疫学的測定方法としては、ＲＩＡ法、ＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝集反応法、オクタロニー法等の方法を挙げることができる。
【００１５】
本発明の組換えベクターとしては、上記本発明のＤＮＡを含むベクターであれば特に制限されないが、本発明のタンパク質を宿主細胞内で発現させることができる発現系を含むものが好ましく、例えば、染色体、エピソーム及びウイルスに由来する発現系、より具体的には、細菌プラスミド由来、酵母プラスミド由来、ＳＶ４０のようなパポバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス由来のベクター、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来及びこれらの組合せに由来するベクター、例えば、コスミドやファージミドのようなプラスミドとバクテリオファージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。この発現系は発現を起こさせるだけでなく発現を調節する制御配列を含んでいてもよい。
【００１６】
本発明はまた、上記本発明のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞に関する。かかる本発明のタンパク質をコードするＤＮＡや上記発現系を含む組換えベクターの宿主細胞への導入は、Davisら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びSambrookら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション(transvection)、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング (scrape loading)、弾丸導入(ballistic introduction)、感染等により行うことができる。そして、宿主細胞としては、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等の細菌原核細胞や、酵母、アスペルギルス等の真菌細胞や、ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞や、Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞等の動物細胞や、植物細胞等を挙げることができる。
【００１７】
また、本発明の組換えタンパク質の製造方法としては、上記発現系を含んでなる宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物から酸性ペルオキシダーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取する方法であればどのような方法でもよく、かかる本発明のタンパク質を細胞培養物から回収し精製する方法としては、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、アニオン又はカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー及びレクチンクロマトグラフィーを含めた公知の方法、好ましくは、高速液体クロマトグラフィーを用いる方法を挙げることができる。また、上記アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、例えば、本発明のタンパク質に対する抗体を結合させたカラムや、上記本発明のタンパク質に通常のペプチドタグを付加した場合は、このペプチドタグに親和性のある物質を結合したカラムを用いることにより、本発明のタンパク質を得ることができる。上記本発明のタンパク質の精製方法は、ペプチド合成の際にも適用することができる。
【００１８】
【実施例】
以下、実施例により、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこの実施例により限定されるものではない。
実施例１（ＴＡＰの調製）
［１．テルミトマイセス・アルブミノサスの培養］
担子菌テルミトマイセス・アルブミノサスＡＴＣＣ４２０１０は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection）より購入したものを、ポテトデキストロース（Potato dextrose）寒天培地（Difco社製）により生育させ、保存しておいたものを用いた。前培養は、ポテトデキストロース寒天培地上で生育した本菌株を直径５ｍｍのコルクボーラーで打ち抜き、それを下記に示すＴＡＰ単離用培地１０ｍｌを入れた１００ｍｌ容三角フラスコに移し、３０℃で１週間培養することにより行った。前培養で得られた菌体を、カップ型ブレンダーＣＭ１００（イウチ社製）を用い破砕し、ＴＡＰ単離用培地５００ｍｌを入れた２リットル容フラスコに植菌して本培養を行った。本培養は、３０℃で４日間振盪培養（１００ｒｐｍ）し、５目日以降は、毎日１５分間酸素ガスをフラスコに吹き込み培養することにより行った。
【００１９】
本培養中、経時的に採取した培養上清０．１ｍｌに、反応液［５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ２．３）、０．１ｍＭ過酸化水素、０．５ｍＭ２，６−ジメトキシフェノール］１ｍｌを加え、分光光度計ＤＵ５３０（ベックマン社製）を用いて、４６９ｎｍの吸光度の上昇により反応を追跡しすることにより、ＴＡＰ活性を測定したところ、培養２０日目に最大のＴＡＰ活性を得ることができた。
【００２０】
［２．ＴＡＰ単離用培地組成（１リットル）］
Yeast Carbon Base（Difco社製） １．１７ｇ
酒石酸アンモニウム １２ｍＭ
金属塩混合液*（下記に組成を示す） ６０ｍｌ
ＭｎＳＯ4 １００μＭ
Ｔｗｅｅｎ８０ ０．１％
イオン交換水を用い１リットルとし、ｐＨ６．０に調整
＊：金属塩混合液 (Methods in Enzymology,161, 238-249, 1988)
ＭｇＳＯ4 ３ｇ
ＮａＣｌ ０．５ｇ
ＦｅＳＯ4 ０．１ｇ
ＣｏＣｌ2 ０．１ｇ
ＺｎＳＯ4 ７Ｈ2Ｏ ０．１ｇ
ＣｕＳＯ4 ０．１ｇ
ＡｌＫ（ＳＯ4）2 １２Ｈ2Ｏ １０ｍｇ
Ｈ3ＢＯ3 １０ｍｇ
Ｎａ2ＭｏＯ4 ２Ｈ2Ｏ １０ｍｇ
Sodium nitrilotriacetate １．５ｇ
イオン交換水を用い１リットルとし、ｐＨ４．５に調整
【００２１】
［３．ＴＡＰの単離］
ＴＡＰを単離するため、培養２０日目の培養液を、グラスウールにより菌体と濾別した。濾液は１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析を１２時間行った。これを予め１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）により平衡化したＤＥＡＥ−Toyopearl（東ソー社製）を充填したカラム（３ｃｍ×１０ｃｍ）に流し込み、ＴＡＰをカラムに結合させた。流し込み終了後、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）２００ｍｌ、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）２００ｍｌによりカラムを洗浄した。ＴＡＰは０．５Ｍの塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）への直線グラジエントによりカラムから溶出させた。活性画分は、限外濾過膜PM-10（amicon社製）により濃縮後、Superdex 200HR 10/30（Amasham-Pharmasic Biotech社製）を用い分画した。分画条件は溶離液として０．１Ｍ塩化ナトリウム含有２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）を用い、流速０．５ｍｌ／分とした。活性画分は、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）に対し透析後、MonoQ HR5/5（Amasham-Pharmasic Biotech社製）により更に分画を行った。分画条件は溶離液として１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を用い、塩化ナトリウム０〜０．５Ｍへのリニアグラジエントで、流速１．０ｍｌ／分とした。最終的に得られた活性画分をドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析を行ったところ、唯一のバンドを与えた。
【００２２】
［４．ＴＡＰの至適ｐＨ］
精製したＴＡＰ２．３ｎｇに、反応液［５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５〜２．０）及び５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ３．１〜２．０）、０．４ｍＭ過酸化水素、５０μＭ２，２'−アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）２アンモニウム］１ｍｌを加え、分光光度計ＤＵ５３０（ベックマン社製）を用いて、４１５ｎｍの吸光度の上昇により追跡することにより、至適ｐＨを決定した。結果を図１に示す。なお、図中の●はリン酸緩衝液、■はクエン酸緩衝液である。図１からわかるように、精製ＴＡＰはｐＨ２．３において最大活性を示し、ＴＡＰの至適ｐＨがｐＨ２．３であることがわかった。
【００２３】
実施例２（ＴＡＰ遺伝子の調製）
［１．ＴＡＰ遺伝子断片の取得］
ＴＡＰ遺伝子断片の取得は、図２に示されるように、各種プライマーを用いて行った。まず、培養１７日目の菌体（湿潤重量約３ｇ）より、全ＲＮＡの単離をacid guanidinium phenol-chloroform法（Chonczynski P., Sacchi N., Analytical Biochemistry, 162, 156-159, 1987）により行った。単離した全ＲＮＡは、oligotex-dT30 <Super> mRNA Purification Kit（TAKARA社製）を用い、ｐｏｌｙＡ ＲＮＡを分別することにより回収した。６０ｎｇのＰｏｌｙＡ ＲＮＡは、SuperscriptII（Gibco BRL社製）により、プライマー１：5'-TTTACCTCTTCAGC(T)19-3'（配列番号３）を用いて取扱説明書に従い逆転写し、first strand ｃＤＮＡを得た。
【００２４】
ＴＡＰのＮ末端アミノ酸配列を、気相プロテインシークエンサーABI 477Aを用いて常法により分析した。その結果、配列番号４のアミノ酸配列が決定された。このＮ末端アミノ酸配列をもとに、プライマー２：5'-TTCGARAAYATHGARGCHGCYAT-3'（配列番号５）及びプライマー３：5'-ATYYTBGTKGGYATGAAGAARCA-3'（配列番号６）の２種類の混合プライマーを作製した。ＴＡＰ遺伝子断片の取得には、ＲＴ−ＰＣＲ（reverse transcription polymerase chain reaction）法を用いた。１μｌのfirst strand ｃＤＮＡ溶液に、０．２μＭのプライマー１、５μＭのプライマー２、０．２ｍＭのｄＮＴＰ（deoxyribonucleoside triphosphate）、２ＵのＥＸＴａｑ（TAKARA社製）、３μｌの１０×ＥＸＴａｑ bufferを加え、最終液量を３０μｌとした。
【００２５】
ＰＣＲは、MJ Research PTC-200を用い、反応１（９４℃３０秒、４５℃１分、７２℃２分、５サイクル）、反応２（９４℃３０秒、４９℃１分、７２℃２分、５サイクル）、反応３（９４℃３０秒、５３℃１分、７２℃２分、５サイクル）、反応４（９４℃３０秒、５７℃１分、７２℃２分、２０サイクル）の条件で行った。こうして得られた反応液１μｌを鋳型ＤＮＡとし、２回目のＰＣＲを次の条件で行った。上記反応液１μｌに、０．３μＭプライマー１、５μＭプライマー３、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２ＵのＥｘＴａｑ（TAKARA社製）、３μｌの１０×ＥＸＴａｑ bufferを加え、最終液量３０μｌとし、ＰＣＲサイクルを９４℃３０秒、５５℃１分、７２℃２分４０サイクルで行った。
【００２６】
この結果得られた該反応液を、アガロース電気泳動により分離し、QIAEX II Gel Extraction Kit（キアゲン社製）を用い、約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収した。該ＤＮＡ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Promega社製)に取扱説明書に従い連結し、このベクターを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、目的のＤＮＡ断片を含むコロニーを、シークエンスすることでスクリーニングを行った。なお、ＤＮＡシークエンサーはABI PRISM377(Applied Biosystems社製)、シークエンス反応はABI PRISM Cycle sequencing Kit (Applied Biosystems社製)を用いた。
【００２７】
［２．完全長ＴＡＰ遺伝子配列の決定］
上記得られたＴＡＰ遺伝子断片は、５'末端を欠くものである。そこで、完全長ＴＡＰ遺伝子を取得するため、５'ＲＡＣＥ（5' rapid amplification of cDNA ends）法を、５'ＲＡＣＥ ｖｅｒｓｉｏｎ２．０（GIBCO BRL社製）を用いて行った。まず、先に得た部分ＴＡＰ遺伝子の塩基配列をもとに、プライマー４：5'-AATCGTATACGACAGTCCACG-3'（配列番号７）、プライマー５： 5'-CATCGGAGGCATCAGCGAAC-3'（配列番号８）を作製した。２．５ｐｍｏｌのプライマー４を用い、約２２ｎｇのｐｏｌｙＡ ＲＮＡを用いて、SuperscriptII（GIBCO BRL 社製）により逆転写反応を行った。得られたfirst strand ｃＤＮＡの５'末端にデオキシシトシンテールを付加し、これを鋳型として、プライマー５と５'ＲＡＣＥｖｅｒｓｉｏｎ２．０（GIBCO BRL社製）に添付のAbridged anchor primerを用いて、ＰＣＲを以下の条件で行った。first strand ｃＤＮＡ約１ｎｇに対して、終濃度各０．４μＭのプライマー、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、２ＵのＥＸ−Ｔａｑを加え、最終反応量を５０μｌとし、ＰＣＲサイクルを９４℃４０秒、５５℃４０秒、７２℃１分、３５サイクルで行った。ＰＣＲ反応終了後、約４００ｂｐのＤＮＡ断片をアガロースゲルより、前記と同様の方法により抽出し、ｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニング後、シークエンスの決定を行った。こうして得た配列は、上記得られたＴＡＰ遺伝子断片の塩基配列と約３００ｂｐにわたり同一の配列をもち、両配列を連結することにより完全長ＴＡＰ遺伝子配列（配列番号１）を決定することができた。また、連結後の配列から推定されるＴＡＰアミノ酸配列（配列番号２）には、精製酵素より決定されたＮ末端アミノ酸配列が存在していた。
【００２８】
上記ＴＡＰアミノ酸配列（配列番号２）に対し、相同性検索を行ったところ、有意な相同性を示す２つの遺伝子が存在した。結果を表１に示す。遺伝子cpop21は、担子菌Polyporaceae sp.に由来するもののその機能は不明である。遺伝子ｄｙｐは子嚢菌Geotricum candidumに由来し、その発現産物であるペルオキシダーゼＤｙＰの至適ｐＨは最低３．０である。
【００２９】
【表１】
【発明の効果】
ＴＡＰは従来のペルオキシダーゼと比較して、極めて低いｐＨ領域において活性を有することから、従来知られているペルオキシダーゼでは使用不可能なｐＨ領域での使用が可能であり、酸性領域での各種酵素抗体標識（ウェスタンブロット、レポーターアッセイ等）の原理に基づく分析法や、酸性廃液・排水中の有機塩素化合物、環境ホルモン等の分解に有利に用いることができる。
【００３１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のＴＡＰの至適ｐＨの測定結果を示す図である。
【図２】本発明のＴＡＰ遺伝子の取得の概要を示す図である。
Claims (11)
- 以下の(ａ)又は(ｂ)のタンパク質をコードするＤＮＡ。
(ａ)配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
(ｂ)配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質 - 配列番号１に示される塩基配列若しくはその相補的配列又はこれらの配列の一部若しくは全部を含む配列からなり、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 請求項２記載のＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 配列番号２に示されるアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ酸性ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質。
- 請求項４又は５記載のタンパク質と、マーカータンパク質及び／又はペプチドタグとを結合させた融合タンパク質。
- 請求項４又は５記載のタンパク質に特異的に結合する抗体。
- 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項７記載の抗体。
- 請求項１〜３のいずれか記載のＤＮＡを含む組換えベクター。
- 請求項４又は５記載のタンパク質を発現することができる発現系を含んでなる宿主細胞。
- 請求項１０記載の発現系を含んでなる宿主細胞を培地に培養し、得られる培養物から酸性ペルオキシダーゼ活性を有する組換えタンパク質を採取することを特徴とする組換えタンパク質の製造方法。
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