JP4214202B2 - 糖代謝異常の診断又はモニタリング方法 - Google Patents

Description

本発明は、試料中のアディポネクチン（GBP28）を測定することにより糖代謝異常を診断又はモニタリングする方法、試料中のGBP28を測定することにより2型糖尿病治療剤の治療効果をモニタリングする方法、試料中の天然型GBP28を測定することを特徴とするGBP28の測定方法、及び、天然型GBP28に対して特異的に反応するモノクローナル抗体に関する。

糖尿病に罹患している患者は世界中で1億人以上に達しており、その90％以上が2型糖尿病である（Schoonjans, K.及びAuwerx, J., Lancet 355:1008-1010, 2000）。2型糖尿病は、インスリン分泌障害及び／又はインスリン抵抗性を特徴とする（DeFronzo, R.A.ら, Diabetes Care 15:318-368, 1992）。チアゾリジンジオンは、動物実験及び臨床研究の双方においてインスリン抵抗性を改善することが示された。2型糖尿病患者にこれらの薬剤を投与すると、インスリンの作用が上昇する結果として、血糖値、糖ヘモグロビン、及び血清インスリンレベルが低下する（Schwartz S.ら, N. Engl. J. Med. 338:861-866, 1998）。

一方、脂肪細胞由来の血漿タンパク質であるアディポネクチン（Maeda, K.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 221:286-289, 1996; Arita, Y.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:79-83, 1999）[別名ゼラチン結合タンパク質28（GBP28）（Nakano, Y.ら,J. Biochem. 120:803-812, 1996; Saito, K.ら, Gene 229:67-73, 1999; Saito, K.ら, Biol. Pharm. Bull. 22:1158-1162, 1999）]は、in vitroにおいて損傷した血管壁に接着し、内皮性NF-κBシグナル伝達を阻害し（Ouchi, N.ら, Circulation 102:1296-1301, 2000）、HB-EGF及びPDGFによって誘導される平滑筋の細胞増殖を抑制する（Matsuzawa, Y.ら, Ann. N. Y. Acad. Sci. 892:146-154, 1999）。さらに、肥満患者においてはこのタンパク質の血清レベルは低いことが報告されており（Arita, Y.ら, Biochem. Biophys. Res. Commun. 257:79-83, 1999）、また、2型糖尿病患者及び冠状動脈疾患患者においても前記血清レベルが低下していることが報告されている（Hotta, K.ら, Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. 20:1595-1599, 2000）。

従来、2型糖尿病と関連する因子として、血中グルコース、HbA_1C、血清インスリン、HOMA-IR等が知られている。しかしながら、これらを2型糖尿病の診断又は治療効果のモニタリングの指標として使用するには、操作性及び／又は感度の点で不十分であった。また、上述のように、GBP28についても2型糖尿病との関連についての示唆がなされていたが、実際に臨床の場において、GBP28が2型糖尿病の診断及び治療効果モニタリングに利用可能であるか否かについては十分な知見が得られていなかった。

一方、GBP28の測定方法としては、大本らによるELISA法が知られている（Ohmotoら, BIO Clinica 15(10) 758-761, 2000；特開2000-304748）。しかしながら、血液中の天然型GBP28は単量体3個から構成され、更にこの3量体が4〜6個ずつ凝集した存在形態をとっている（J. Biochem. 120, 803-812, 1996）のに対し、かかる従来法は単量体構造のGBP28に対するモノクローナル抗体を用いていることから試料中の天然型GBP28を変性させなければならず、測定にあたって検体をSDS溶液と混合し、100℃で熱処理を行うことが必要であり、操作が煩雑であった。また、かかる従来法は天然型GBP28を変性させた形態で測定するものであり、天然の状態のGBP28を直接測定することができなかった。

本発明者等は、上記課題を解決するために、臨床において2型糖尿病等の糖代謝異常の診断及び治療効果モニタリングの指標となり得る因子を探索すべく、2型糖尿病関連の種々のパラメーターにつき2型糖尿病患者における血中濃度を測定し、鋭意検討を重ねた結果、後述の実施例に示すように、GBP28の測定が糖代謝異常の診断及びその治療剤の治療効果モニタリングに非常に有効であることを見出した。また、GBP28を凝集した形態のままで測定することにより、試料中のGBP28を天然の状態で簡便そして迅速に測定できることを見出し、本発明を完成させるに到った。

すなわち本発明は、以下の（１）〜（１５）を提供する。
（１） 試料中のアディポネクチン（GBP28）を測定することにより糖代謝異常を診断又はモニタリングする方法。
（２） 糖代謝異常が2型糖尿病である、上記（１）に記載の方法。
（３） GBP28が天然型である、上記（１）又は（２）に記載の方法。
（４） 試料中のGBP28を測定することにより2型糖尿病治療剤の治療効果をモニタリングする方法。
（５） GBP28が天然型である、上記（４）に記載の方法。
（６） 2型糖尿病治療剤がチアゾリジン誘導体である、上記（４）又は（５）に記載の方法。
（７） 抗原−抗体反応を用いて測定することを特徴とする、上記（５）又は（６）に記載の方法。
（８） 試料中の天然型GBP28を測定することを特徴とする、GBP28の測定方法。
（９） GBP28の測定を、天然型GBP28に特異的に反応するモノクローナル抗体を使用して行うことを特徴とする、上記（１）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０） ハイブリドーマFERM BP-7660またはFERM BP-7661が産生するモノクローナル抗体を使用することを特徴とする、上記（９）に記載の方法。
（１１） GBP28の測定を、固相法、競合法、凝集法、比濁法、サンドウィッチ酵素抗体法のいずれかによって行うことを特徴とする、上記（１）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２） 試料が、血清、血漿、関節液、胸水、組織抽出液、組織、培養上清又は尿であることを特徴とする、上記（１）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３） GBP28の3量体構造及び／又はGBP28の3量体が凝集した構造を有する天然型GBP28に対して特異的に反応するモノクローナル抗体。
（１４） ハイブリドーマFERM BP-7660またはFERM BP-7661が産生するものである、上記（１３）に記載のモノクローナル抗体。
（１５） 天然型GBP28に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を含む、試料中の天然型GBP28を測定するためのキット。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願２００１−２４８０４７号の明細書及び／または図面に記載される内容を包含する。

本発明により、試料中のGBP28の濃度を測定することから、臨床の場において2型糖尿病等の糖代謝異常を簡便に診断することが可能になると共に、2型糖尿病治療剤、特にチアゾリジン誘導体の治療効果をモニタリングすることが可能となった。また、本発明の抗体を用いれば、GBP28好ましくは天然型のGBP28の血中濃度を測定することが可能であり、試料中のGBP28に対して熱処理等の前処理を行わずに、GBP28を定量的に測定することができる。このことにより、測定の簡便化及び検体処理能力の改善が期待できる。

更に、本発明の方法は、大量の検体を簡便に処理できるため、糖尿病、高血圧、高脂血症、動脈硬化等インスリン抵抗性の関連する成人病に対する臨床的検査において、非常に有効な測定系を提供するものである。

GBP28は、ヒトにおいては配列番号１に示すアミノ酸配列及び配列番号２に示すヌクレオチド配列を有することが知られている。また、GBP28は、血液中においては単量体3個から構成される3量体が更に4〜6個ずつ凝集した存在形態をとっていることが知られている（J. Biochem. 120, 803-812, 1996）。

本発明者等は、健常人由来の血液等の試料中のGBP28濃度が2型糖尿病の特徴であるインスリン抵抗性の指標に関わるインスリン、インスリン抵抗性指数（HOMA-IR）、中性脂肪、HDL-コレステロール、LDL-コレステロールと相関関係を示したこと、及び、2型糖尿病患者由来の血液等の試料中のGBP28濃度が、2型糖尿病治療剤の治療効果をモニタリングする上で、従来2型糖尿病の指標とされていた血漿グルコース、HbA_1C、血清インスリン、HOMA-IRと比較して大きな変化率を示す事を確認したことから、血液等の試料中のGBP28濃度が2型糖尿病等の糖代謝異常の診断及び2型糖尿病等の治療剤の治療効果のモニタリングにおける新たな指標として非常に有効であることを見出した。

従って、本発明者等は、試料中のGBP28、好ましくは天然型GBP28を測定することにより2型糖尿病等の糖代謝異常を診断する方法及び2型糖尿病治療剤の治療効果をモニタリングする方法を提供する。

本発明において、試料とは、血清、血漿、関節液、胸水、組織抽出液、組織、培養上清又は尿を挙げることができるが、本発明はこれらに特に限定されるものではない。

糖代謝異常としては、糖尿病（1型糖尿病、2型糖尿病）や糖尿病合併症（高血圧、高脂血症、動脈硬化、緑内障）等が挙げられ、特に本発明は2型糖尿病の診断又は治療剤による治療効果のモニタリングのために好適である。

糖代謝異常の治療剤としては、公知の種々のものが使用できる。例えば、2型糖尿病の治療剤としては、一般にグリベンクラミド、グリクラジド、トルブタミド、グリメピリド等のスルホニルウレア剤、ナテグリニド等の即効型インスリン分泌促進剤、ボグリボース、アカルボース等のαグルコシダーゼ阻害剤、ピオグリタゾン等のインスリン抵抗性改善剤、メトホルミン等のビグアナイド剤が挙げられ、本発明の方法を好適に適用することができる。特に好適な2型糖尿病治療剤としては、ピオグリタゾン、トログリタゾン等のチアゾリジン誘導体が挙げられる。

GBP28の測定は、特に限定されるものではないが、GBP28、好ましくは、GBP28の3量体構造及び／又はGBP28の3量体が凝集した構造を有する天然型GBP28に特異的に反応するモノクローナル抗体を使用し、固相法、競合法、凝集法、比濁法、サンドウィッチ酵素抗体法等の当分野において通常行われるいずれかの方法によって行うことができる。特に固相酵素免疫検定法（ELISA）を用いて測定するのが好ましい。酵素免疫検定法は、当分野において通常行われる方法であり、当業者であれば、上記のGBP28に特異的に反応する抗体を用いて行うことができる。

上記測定方法において天然型GBP28に特異的に反応するモノクローナル抗体を使用する場合には、天然の状態では存在しない、変性した構造やGBP28単量体を測定しないようにすることができる。具体的には、GBP28がコラーゲン様の立体構造を組んでいるときの3量体において初めて出現する部位を認識するモノクローナル抗体を作製し使用することが特に好ましい。

図１に、GBP28を測定するための本発明の方法及び従来法の原理を模式的に示す。従来法では、GBP28に対するモノクローナル抗体を取得するために、遺伝子組換大腸菌によって発現されたGBP28を免疫原として用いている。しかし、組換えGBP28は封入体として菌中に存在するため、該蛋白の精製時には塩酸グアニジン、尿素、還元剤などによる処理が必要である。そのため、免疫原として用いるGBP28には変性型かつ単量体構造のGBP28しか用いることができない。その結果、得られるモノクローナル抗体は変性した単量体GBP28にのみ反応するものであり、試料中の天然型GBP28を測定するにあたっては、試料中の該GBP28を単量体GBP28に変性させるための処理が予め必要である。これに対して、本発明の方法は、天然型GBP28に特異的に反応するモノクローナル抗体を使用するので、血液中に存在する天然型GBP28を処理することなくそのまま測定することができるものである。

本発明のモノクローナル抗体は、例えば、天然型GBP28を抗原として当分野において一般的な方法によって得ることができる。天然型GBP28は、そのゼラチン結合性を利用して、例えば大量のヒト血漿をGelatin-cellulofineカラム（J.Biochem. 120, 803-812, 1996）に通すことによって精製することができる。この天然型GBP28を使用し、例えば、動物に免疫し、この免疫動物から脾臓又はリンパ節を採取する。この脾臓又はリンパ節に含まれる抗体産生細胞とミエローマ細胞とをポリエチレングリコールなどを用いて融合し、ハイブリドーマを調製する。目的のハイブリドーマをスクリーニングし、これを培養し、その培養上清からモノクローナル抗体を調製することができる。培養は、in vitroで行っても良いが、in vivoで行うこともでき、例えばマウス等の腹腔内にハイブリドーマを投与した後、腹水から目的の抗体を得ることができる。モノクローナル抗体の精製は、例えば、硫酸アンモニウム沈殿や陰イオンクロマトグラフィーによる分画、プロテインAや固定化抗原を用いたアフィニティー精製により行うことができる。これにより調製された抗体は、GBP28の測定のために用いられる他、GBP28の発現異常に起因する疾患の抗体治療等に利用することも可能である。

本発明において特に好適に使用できる抗GBP28モノクローナル抗体の特徴は以下の通りである。
使用したミエローマ細胞株：P3U1
抗原：ヒト血清より単離精製したGBP28（約50μg）溶液を完全アジュバントとミセル化してマウス腹腔内に投与。2週間後にブーストしてから3日目に脾臓を摘出してＢ細胞を採取。
モノクローナル抗体を調整したクローン数：3個（ＩＨ５、６、７）
Ｉｇ型：全てIgGκ型
エピトープ：GBP28の3量体で熱変性されていないもののみ認識する。従って、コラーゲン様の立体構造を組んでいるときの3量体において初めて出現する部位と考えられる。

尚、本発明において好適に使用できる抗GBP28モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマIH-6及びIH-7は、日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１ 中央第６ 独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに2001年7月12日付けでFERM BP-7660及びFERM BP-7661という受託番号で寄託されている。

試料中のGBP28を測定することにより糖代謝異常を診断する方法及び治療剤による治療効果をモニタリングする方法は、具体的には、例えば、次の様にして行うことができる。

１）GBP28濃度の測定
患者等から採取した血清等を希釈し、マウス抗GBP28モノクローナル抗体で被覆した96ウェルのマイクロタイタープレートに添加し、血清中のGBP28をウェル上のマウス抗GBP28モノクローナル抗体に結合させる。ウェルを洗浄後、酵素標識マウス抗GBP28モノクローナル抗体を添加し、ウェル上に存在するマウス抗GBP28モノクローナル抗体に結合させる。さらにウェルを洗浄後、酵素に対する基質溶液を加えることにより発色反応を起こさせ、発色反応停止後、吸光度を測定する。予め、同様の方法で既知濃度のGBP28標準溶液について吸光度を測定し、GBP28の濃度に対する吸光度の標準曲線を作成しておき、測定した吸光度の値を該標準曲線から、GBP28の濃度に換算することによって、患者等から採取した血清等中のGBP28の濃度を測定することができる。

２）糖代謝異常を診断又はモニタリングする方法
GBP28を2型糖尿病等の糖代謝異常の診断における指標として使用する場合は、例えば、上述した測定法により測定したGBP28の濃度値を、予め求めておいた正常値若しくは境界値と比較する。

３）治療剤の治療効果をモニタリングする方法
また、GBP28を2型糖尿病治療剤の治療効果のモニタリングにおける指標として使用する場合は、例えば、2型糖尿病患者から治療開始前と治療開始後の血液を採取し、上述した測定法によりGBP28を測定し、治療開始前後の血液中のGBP28含量からの変化率を計算し、治療効果の判定を行う方法が挙げられる。治療開始後の血中GBP28濃度が治療開始前に比べ増加した場合、治療剤による治療効果が認められたとの判定ができる。前後の血液採取の間隔は1ヶ月から3ヶ月が好ましい。

本発明はまた、天然型GBP28に対して特異的に反応するモノクローナル抗体を含む、試料中の天然型GBP28を測定するためのキットである。本発明のキットは、上記本発明の抗体の他、緩衝剤、ペルオキシダーゼ等の標識体で標識した二次抗体、標準液、ブロッキング液、ペルオキシダーゼ等の酵素基質液、洗浄液等を適宜含んでいても良い。本発明のモノクローナル抗体は、GBP28の3量体構造を認識するものであるため、非標識のモノクローナル抗体をプレート上に固定してGBP28含有試料を添加した後、標識した同じ種類のモノクローナル抗体を使用してサンドイッチアッセイを行うことができる。

以下、本発明を実施例を挙げて更に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。

尚、各実施例において、統計的解析は全てMacintoshのためのStatView（登録商標）プログラム（version 4.5-J, Abacus Concepts Inc., Berkeley, California）を用いて行った。ベースライン及び3ヶ月間の追跡データの比較のためにWilcoxon signed-rankテスト（two-tailed）を行い、GBP28及び他のパラメーターの変化率の比較のために、有意性はPearsonの相関係数と偏相関係数を用いて評価した。血清インスリン、TG及びGBP28レベル、並びにHOMA-IRは、大規模の研究においてlog変換すると正規分布するため、これらのパラメーターについては対数を解析に使用した。全てのデータは平均±S.D.で表わし、ｐ＜0.05の場合に統計的に有意であるとした。

［実施例１］ 各パラメーターの測定
食事療法のみを受けている（ｎ＝７）か、又は食事療法と共にスルホニルウレア剤の投与を受けている（ｎ＝３）、40〜66歳（57.7±7.4）の10名の2型糖尿病男性患者に対して、チアゾリジン系薬ピオグリタゾンの3ヶ月投与の前後に以下のパラメーターについて調べた。各患者の体重、血糖及び血圧、及び各患者に対する治療は検討開始前少なくとも3ヶ月間は一定していた。3名の患者に対するスルホニルウレア剤の投与量は期間中一定とした。10名の患者全員に毎日朝食後にピオグリタゾンを投与した（経口、30mg／日）。開始時点における患者の年齢、体格指数（BMI）、及び臨床プロファイルを表１に示す。

尚、表中、データはｎ又は平均（±S.D.）を示す。

最大血圧（SBP）及び最小血圧（DBP）は少なくとも5分間休憩した後に座った状態で2回測定した。身長、体重、空腹時血漿グルコース（FPG）、HbA_1c、血清インスリン、アディポネクチン、総コレステロール（TC）、中性脂肪（TG）、HDL-コレステロール、LDL-コレステロール、及び尿酸レベルは、一晩絶食後の朝に測定した。血漿グルコース、脂質及び尿酸は一般的な自動化測定方法によって測定した。血清インスリン濃度は、以前記載されているように（Kawai, T.ら, Metabolism 48:1102-1107, 1999; Hirose, H.ら, Clin. Sci. (Colch) 94:633-636, 1998; Hirose, H.ら, J. Hypertens. 16:2007-2012, 1998; Hirose, H.ら, Clin. Sci. (Colch) 100:145-150, 2001）、市販のキット（Tosoh、Tokyo）EIAによって測定した。インスリン抵抗性指数は、ホメオスタシスモデルアセスメント（HOMA-IR）によって評価した（Matthews, D.R.ら, Diabetologia 28:412-419, 1985; Rudenski, A.S.ら, Metabolism 40:908-917, 1991）。
結果を表２に示す。

尚、表中、データはｎ又は平均（±S.D.）を示す。

表２に示すように、ピオグリタゾンの3ヶ月投与により、最大血圧、最小血圧、空腹時血漿グルコース、HbA_1C、血清インスリン及びHOMA-IRは顕著に低下した。体格指数（BMI）及びLDL-コレステロールは上昇したが、中性脂肪、HDL-コレステロール及び尿酸は有意な変化がなかった。

血糖及び血圧コントロールに対する効果は、対照食事療法群とは違い、トログリタゾン（Kawai, T.ら, Metabolism, 48:1102-1107, 1999）と同様に認められた。血圧に対するチアゾリジンジオンの効果に関しては、トログリタゾンはインスリン抵抗性動物（Yoshioka, S.ら, J. Hypertens. 18:1857-1864, 2000）及び臨床研究（Ogihara, T.ら, Am. J. Hypertens. 8:316-320, 1995）において血圧を低下させることが報告されている。LDL-コレステロールに対する効果については、トログリタゾン（SchwartzS.ら, N. Eng. J. Med. 338:861-866, 1998）又はロジグリタゾン（Balfour, J.A.およびPlosker, G.L., Drugs 57:921-930, 1999）の投与がLDL-コレステロールの上昇に関与することが報告されている。ピオグリタゾンの投与によってもLDL-コレステロールがわずかに増加したが、3ヵ月後に顕著であった。

［実施例２］ 脂肪分布の測定
実施例１と同じ患者に対して、ピオグリタゾン3ヶ月投与前後の脂肪分布を測定した。皮下脂肪及び内臓脂肪分布は、Tokunagaらの臍高レベルにおけるコンピュータ連動断層撮影（CT）スキャニング方法（Tokunaga, K.ら, Int. J. Obes. 7:437-445, 1983）を改変して−150〜−50 Hounsfieldユニット領域を測定することによって決定した。CT画像は本発明者等が先に報告したもの（Kawai, T.ら, Metabolism, 48:1102-1107, 1999）と同じプロトコルでベースライン及び3ヶ月治療後で撮影した。V/S比率は臓器内脂肪領域（VFA）を皮下脂肪領域（SFA）で割った値として計算した。結果を表３に示す。

尚、表中、データはｎ又は平均（±S.D.）を示す。

表３に示すように、ピオグリタゾン3ヶ月投与の後、BMI及び皮下脂肪領域（SFA）が顕著に増加した。これはトログリタゾンの結果（Kawai, T.ら, Metabolism, 48:1102-1107, 1999; Kelly, I.E.ら, Diabetes Care 22:288-293, 1999; Mori, Y.ら, Diabetes Care 22:908-912, 1999）と本質的に同じであった。対照的に、臓器内脂肪領域（VFA）は減少せず、むしろわずかに増加し、トログリタゾンで得られた知見と異なっていた。この違いの理由は明らかでないが、トログリタゾンのビタミンＥ構造、及び／又はPPARαの機能のような構造的差異による可能性がある。尚、VFAは増加傾向にあり、V/S比率は減少傾向にあったが、これらの差異において統計学的有意性は得られなかった。

［実施例３］ GBP28の測定
実施例１と同じ患者に対して、ピオグリタゾン3ヶ月投与前後のGBP28の血中濃度を測定した。

抗ヒトGBP28モノクローナル抗体は以下のようにして作製した。まず、ヒト血清より単離精製したGBP28（約50μg）溶液を完全アジュバントとミセル化してマウス腹腔に投与し、2週間後にブーストしてから3日目に脾臓を摘出してＢ細胞を採取した。このＢ細胞とミエローマ細胞とを融合してハイブリドーマを調製し、目的のハイブリドーマをマウスに腹腔内投与した後、（20日後に）腹水をDEAE-Sepharose Fast Flowで処理することにより目的のモノクローナル抗体を得た。

ELISAによるGBP28の測定は以下のようにして行った。GBP28の標準サンプル、441倍希釈の未知サンプル及び対照サンプル各100μlを、マウス抗GBP28モノクローナル抗体で被覆した96ウェルのマイクロタイタープレートに添加した。プレートを60分間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識マウス抗GBP28モノクローナル抗体と共に更に30分間インキュベートした。プレートを再度洗浄し、テトラメチルベンジジン試薬と共に30分間インキュベートした。次いで、各ウェルに0.36Ｎの硫酸水溶液100μlを添加して反応を止め、450nmにおける吸光度を測定した。アッセイ内及びアッセイ間係数はそれぞれ4.8-4.9％及び3.3-6.8％であった。

3ヶ月間のピオグリタゾン投与の結果、10名の患者全てにおいて血清アディポネクチンレベルは上昇した（ベースラインの値の1.5〜6.8倍、平均して3倍）（表２及び図２）。更に、GBP28及び表２及び３に示す他のパラメーター間の3ヶ月間の変動について検討した。各パラメータの測定値（一部は対数値）の変化率を比較した結果、従来から知られている2型糖尿病関連因子である血中グルコース（18.2%）、HbA_1c（9.0 %）、血清インスリン（23.7 %）、HOMA-IR（62.6%）等よりも、試料中のGBP28濃度は大きな変化率（80.9%）を示した。

［実施例４］ 健常人での測定結果
実施例３では、GBP28は2型糖尿病患者において、2型糖尿病治療剤であるチアゾリジン誘導体の治療効果のモニタリングに用いることができることが明らかとなり、GBP28濃度はインスリン抵抗性の指標になる可能性が予測できた。そこで、健常人を対象とし、血中のGBP28濃度とインスリン抵抗性との関わりが報告されているパラメーターとの関係について調べた。

毎年来院して健康診断を受けている30歳から65歳の980名を対象にインスリン抵抗性との関わりが報告されているパラメーターについて調べた。対象者の内訳としては、男性714名、女性266名であり、内分泌疾患患者及び腎臓ないし肝臓に重篤な疾患をもつ患者は測定対象から除いた。また、インスリンや抗糖尿病薬、抗高脂血症薬の治療を受けている患者も測定対象から除いた。

測定したパラメーターとしては、最大血圧（SBP）及び最小血圧（DBP）は少なくとも5分間休憩した後に座った状態で2回測定した。年齢、BMI、心拍数、空腹時血漿グルコース（FPG）、血清インスリン、アディポネクチン、総コレステロール（TC）、中性脂肪（TG）、HDL-コレステロール、LDL-コレステロール、及び尿酸レベルは、一晩絶食後の朝に測定した。血漿グルコース、尿酸は一般的な自動化測定方法によって測定した。血清インスリン濃度は、先に記載されているように、市販のキット（Tosoh、Tokyo）EIAによって測定した。インスリン抵抗性指数は、ホメオスタシスモデルアセスメント（HOMA-IR）によって評価した。

本検討で測定した各パラメーターとGBP28との比較結果を男性については表４に、女性については表５に示す。

尚、表中、データは平均±SD及び相関係数そしてp値を示す。血中のGBP28は0.4μg/mLから61.2μg/mLと幅広い濃度分布を示した。男性の血中GBP28濃度は7.2±4.6μg/mL、女性の血中GBP28濃度は13.3±7.3μg/mL、で、男性よりも女性のほうが高い濃度を示した。

表４及び表５に示すように、血中のGBP28の濃度はBMI、最大血圧、最小血圧、空腹時血漿グルコース、インスリン、HOMA-IR、中性脂肪、LDL-コレステロールそして尿酸と負の相関関係を示した。またHDL-コレステロールとは正の相関関係を示した。また、年齢とBMIでの補正を加えてGBP28と各パラメーターとの比較を行った場合にはインスリン（男性r =-0.229、女性r = -0.137）、HOMA-IR（男性r =-0.237、女性r = -0.134）、中性脂肪（男性r =-0.197、女性r = -0.275）、HDL-コレステロール（男性r = -0.330、女性r = 0.345）、LDL-コレステロール（男性r =-0.083、女性r = -0.199）とp<0.05の信頼性で統計学的に有意な相関関係を示した。その結果、HOMA-IRや、インスリン、中性脂肪、HDL-コレステロール、LDL-コレステロールと相関関係を示した。

以上から、健常人においても、GBP28濃度がインスリン抵抗性の指標になりうることが確認された。

［実施例５］ 試料中の天然型GBP28を測定するためのキットの製造
Ａ．本発明のキットに使用する材料
（１）抗ヒトGBP28モノクローナル抗体コート・プレート
・抗ヒトGBP28モノクローナル抗体溶液
マウス腹水をDEAE-Sepharose Fast Flowで処理することにより得られた抗ヒトGBP28モノクローナル抗体を、0.1Mリン酸緩衝液（pH7.0）にて10μg/mLとした。

・プレート調製用洗浄液組成

・ブロッキング溶液組成

１．Nunc製MaxiSorp F8プレートに抗体溶液を120μL/well分注し、4℃で一晩静置。
２．抗体溶液を除いた後、洗浄液で2回洗浄。
３．ブロッキング溶液を200μL/well分注し、37℃で一晩静置。
４．ブロッキング溶液を除去。
５．減圧下で一晩置き十分に乾燥させた後、密封し4℃に保存。

（２）標準液
・GBP28抗原溶液
抗ヒトGBP28モノクローナル抗体を結合させたアフィニティーカラムにより健常人プール血清からGBP28を精製した後、更にゲル濾過を行った。GBP28濃度は280nmの吸光度より求めた。（Abs.280nm=1.000の時の濃度を1.0mg/mLとした。）

・希釈用緩衝液

GBP28抗原溶液を上記組成の希釈用緩衝液にて希釈することにより、GBP28濃度を0、2、5、10、25、50ng/mLとした。
（３）ペルオキシダーゼ標識抗ヒトGBP28モノクローナル抗体溶液
・ペルオキシダーゼ標識抗ヒトGBP28モノクローナル抗体原液
抗ヒトGBP28モノクローナル抗体をペプシン処理及び還元処理することによりFab'フラグメントとし、これにマレイミド化ペルオキシダーゼを結合させた。濃度は280、403nmの吸収より抗ヒトGBP28モノクローナル抗体のFab'部分とペルオキシダーゼ部分の各々の濃度を求め、合計することにより算出した。

・標識抗体希釈溶液

ペルオキシダーゼ標識抗ヒトGBP28モノクローナル抗体溶液を上記組成の標識抗体希釈溶液にて希釈し標識抗体濃度を350ng/mLとし、ペルオキシダーゼ標識抗ヒトGBP28モノクローナル抗体溶液とした。

（４）濃縮洗浄液（用時精製水にて20倍希釈する）

（５）基質液
市販のELISA用TMB(テトラメチルベンチジン)溶液を用いた。
（６）反応停止液
0.36N H₂SO₄を用いた。

Ｂ．アッセイ・プロトコル
被検検体は標準液の調製に用いた希釈用緩衝液で、適切な濃度（〜50ng/mL）になるまで希釈する。通常の検体は約400〜500倍が適切と思われる。（例：21倍希釈を2回繰り返し、441倍希釈とする。）
１．標準液及び被検試料を100μL/well入れる。
２．プレート攪拌機で5〜10秒程度攪拌した後、遮光、室温で60分間静置。
３．標準液及び被検試料を除き、洗浄液にて4回洗浄。
４．ペルオキシダーゼ標識抗体溶液を100μL/well入れる。
５．プレート攪拌機で5〜10秒程度攪拌した後、遮光、室温で30分間静置。
６．ペルオキシダーゼ標識抗体溶液を除き、洗浄液にて4回洗浄。
７．基質液を100μL/well入れる。
８．プレート攪拌機で5〜10秒程度攪拌した後、遮光、室温で30分間静置。
９．反応停止液を100μL/well入れる。
１０．プレート攪拌機で5〜10秒程度攪拌した後、各wellの吸光度を測定。
（測定波長：450/650nm（主/副）、検量線近似式：二次式）

［実施例６］ 検量線の作成
調製した0、2、5、10、25、50ng/mLのGBP28標準液をサンプルとして測定し、検量線を確認したところ、図３に示すように、ほぼ直線の検量線が得られた。血液中のGBP28の平均濃度は10μg/mLであるため、検体は21倍希釈を2回行った441倍希釈で測定することとした（測定範囲：0〜22μg/mL）。

［実施例７］ 同時再現性試験
キット測定値の変動を評価するために、3種類の血清サンプルを用いて、各々24回ずつ測定した。その結果、表１１に示すように、ＣＶ値はいずれも5％以下と満足できる結果であった。このことから、当キットの測定値に対する信頼性を得ることができた。

［実施例８］ 日差再現性試験
キット測定値の日差変動を評価するために、5種類の血清サンプルを用いて、各々5回ずつ5日に分けて測定を行った。その結果、表１２に示すように、5日間の測定値のバラツキはＣＶ3.3〜6.8％と満足できる結果であった。このことから、当キットの測定値に対する信頼性を得ることができた。

［実施例９］ 希釈試験
診断薬キットでは、血清成分の反応系への影響をさける目的で、血清サンプルを通常希釈してアッセイに用いる。そのため、至適な希釈倍率であるかどうかを確認するために、所定濃度のサンプルを適宜希釈して測定し、得られた値がグラフ上で直線を描くかどうかを確認する。直線が描ければ、標準液と同等の性能を得たことになり測定値に血清成分の影響がないと判断する。

そこで、3種類の血清サンプルをアッセイプロトコルに従って441倍に希釈し、さらにそのサンプルを1/5〜5/5まで希釈して各々2回ずつ測定した。その結果、表１３及び図４に示すように、いずれの検体においても良好な直線性が得られたことから、当キットの希釈倍率に支障がないことが確認された。

［実施例１０］ 添加回収試験
血中に存在するタンパク質は単離されたタンパク質と異なり、さまざまな血中に存在する他のタンパク質や物質と複合体を構成する場合や立体構造に変化をきたす場合がある。そのため、単離されたタンパク質を濃度調製した標準品では良好な評価結果が得られていても、血清などをサンプルとした場合に、正確な濃度が測定されていない場合がある（例えば、複合体が形成されることにより、抗体に対するエピトープが失われるなど）。

そこで、サンプル血清に適当な濃度に調製されたGBP28標準液を添加したものをサンプルとして測定した。続いて、得られた値から標準品添加前のサンプル濃度を差し引いた値を、添加した量で割ることにより回収率として求めた。その結果、表１４に示すように、平均95％程度の良好な回収率が得られたことから、当キットでは、添加した標準品が血中成分の影響を受けることなく測定されていることが証明され、血中GBP28を正確に測定できていることが確認された。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

図１は、本発明の方法及び従来法の原理を模式的に示す。 図２は、10名の2型糖尿病患者（日本人男性）に対するピオグリタゾンの3ヶ月投与（30mg／日）による血清アディポネクチンレベルの変化を示す。 ○−○：食事療法及びピオグリタゾン（ｎ＝７） ■−■：食事療法、スルホニルウレア剤及びピオグリタゾン（ｎ＝３） 図３は、GBP28の検量線を示す。 図４は、GBPアッセイの希釈直線性を示す。

Claims (3)

1. 試料中の、アディポネクチン(GBP28)の3量体構造及び／又はGBP28の3量体が凝集した構造を有する天然型GBP28を、該天然型構造のまま測定することにより、2型糖尿病を検査する方法。
2. GBP28の単量体構造には反応しないが、GBP28の3量体構造及び／又はGBP28の3量体が凝集した構造を有する天然型GBP28に特異的に反応するモノクローナル抗体を用いて測定することを特徴とする、請求項１に記載の2型糖尿病を検査する方法。
3. 上記GBP28の3量体が凝集した構造は、該3量体が4〜6個ずつ凝集した構造であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の2型糖尿病を検査する方法。

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