JP4165674B2 - 液中微粒子の電磁泳動分析法およびその装置 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、分散媒中に分散された微小物体に、電場をかけ、かつ、電場と直角方向に磁場をかけて微小物体を磁場中で電磁泳動させる方法、そのための装置、及び、その方法による微小物体の分離方法並びにそのための分離装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
荷電した又は荷電させた微小物体を電気泳動させる方法は、分析手段や分離手段として広く応用されてきている。これらの電気泳動法は、微小物体を含有する分散媒に電場をかけることにより行われてきたが、電場と同時に磁場をかけることはなかった。
【０００３】
均一電場中の液中粒子が均一磁場によって受ける電磁泳動力に関する理論式が以前提案されたが（A. Kolin, Science, 1953, 117, 134.）、実際の泳動を検討することはほとんど行われてこなかった。そこで本発明者らは、分散媒中の微小物体の電気泳動挙動に及ぼす磁場の影響を検討し、液中での微小物体の新たな分離・キャラクタリゼーション法としての可能性を検討した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、分散媒中の分子や微粒子などの微小物体の電気泳動挙動に及ぼす磁場の影響を検討し、分散媒、特に溶液状の分散媒中での微小物体の新たな泳動方法・分離方法を提供しようとするものである。より詳細には、本発明は、分散媒中に分散された微小物体に、電場及び電場と直角方向に磁場をかけて微小物体を電磁場中で電磁泳動させる方法、そのための装置、及び、その方法による微小物体の分離方法並びに分離装置を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、分散媒中に分散された微小物体に、電場をかけ、かつ、電場と垂直方向に磁場をかけて微小物体を磁場中で電磁泳動させて、当該微小物体の泳動速度を測定する方法に関する。
また、本発明は、分散媒中に分散された微小物体に、電場をかけ、かつ、電場と垂直方向に磁場をかけて微小物体を磁場中で電磁泳動させて、当該微小物体の泳動速度を測定するための装置に関する。
さらに、本発明は、分散媒中に分散された複数種の微小物体に、電場をかけ、かつ、電場と垂直方向に磁場をかけて微小物体を磁場中で電磁泳動させて、当該微小物体の泳動速度により当該微小物体を分離する方法及びその装置に関する。
【０００６】
透磁率μ、電流密度ｊ、磁場の強さＨの中で、ある体積要素Ｖを有する物体が、磁場とそれに垂直な電場によって受ける力Ｆは、次の式（１）、（２）で示される。
ｄＦ ＝ （μＨｊ）ｄＶ （１）
Ｆ ＝ （μＨｊ）Ｖ （２）
電流密度ｊが、媒体と媒体中の微小物体とで異なる場合には、それぞれにかかる力が異なることになるから、その力の差により微小物体が媒体中を泳動することになる。媒体中の微小物体と媒体の電流密度の関係は、マックスウエル（Maxwell ）の式から、次の（３）で示されることになる。
ｊ１ ＝ ｊ２（３σ１／（２σ２＋σ１）） （３）
【０００７】
ここに、ｊ１は微小物体内の電流密度、
ｊ２は媒体中の電流密度、
σ１は微小物体の電気伝導度、
σ２は媒体の電気伝導度をそれぞれ示している。
前記の（２）式によれば、電磁場中の媒体中の体積Ｖを有する微小物体が受ける力Ｆ１、及び、媒体が受ける力Ｆ２はそれぞれ次ぎの（４）及び（５）式で示されることになる。
Ｆ１ ＝ μ１Ｈｊ２Ｖ（３σ１／（２σ２＋σ１）） （４）
Ｆ２ ＝ μ２Ｈｊ２Ｖ （５）
ここに、μ１は微小物体の透磁率であり、μ２は媒体の透磁率である。
したがって、電磁場中で媒体中の微小物体が受ける相対的な力Ｆ（即ち、Ｆ１−Ｆ２）は次式（６）で示されることになる。
ここで媒体と微小物体の透磁率が等しいかほぼ等しい、即ち、
μ１ ≒ μ２ ＝ μ
として、
ｎ ＝ σ１／σ２
とすると相対的な力Ｆは次式（７）で示される。
Ｆ ＝ −２μＨｊ２Ｖ（（１−ｎ）／（２＋ｎ）） （７）
【０００８】
この力Ｆを重力場にたとえて説明すると、水中の物質が重力Ｆ１と浮力Ｆ２を受けているようなものである。しかし、上記で説明してきた力Ｆは、電磁場で受ける力であるから、以下においては、Ｆ１を電磁力と呼び、Ｆ２を電磁浮力と呼ぶことにする。電磁場中の微小物体が受ける前記した力の関係を図１に示す。
【０００９】
また、微小物体としてその電気伝導度σ１が０のものを使用した場合には、式（４）から電磁力Ｆ１は０になり、この結果、微小物体には電磁浮力Ｆ２のみが実質的に作用することになる。即ち、この場合の力Ｆは、次の（８）式で示される。
Ｆ ＝ −μ２Ｈｊ２Ｖ （８）
したがって、実質的に電気伝導度が０の微小物体を媒体の透磁率がμ２の媒体中に分散させて、これを電磁場中におくと、微小物体の体積Ｖ、及び、媒体中の電流密度ｊ２に比例した力Ｆが、微小物体にかかることになる。ここで、電流密度を一定にしておくと、微小物体の体積に応じて加わる力が異なることになり、体積に応じた電磁泳動がみられることになる。
理論的にはσ１＝０（ｎ＝０）ということも考えられるが、実際にはポリスチレンのような場合でもσ１は０ではなく、電磁泳動はσ１、即ち、ｎの値にも依存することになる。
【００１０】
また、この時の泳動速度ｖは、次式（９）で示されるストークスの法則の式、
Ｆ ＝ ６πηＲｖ （９）
（式中、ηは媒体の粘度であり、Ｒは微小物体の半径である。）
と前記の（７）式から、次の式（１０）で示されることになる。
ｖ ＝ （−４／９）・（μＨｊ２Ｒ２／η）（（１−ｎ）／（２＋ｎ））
（１０）
（式中、μ２は媒体の透磁率であり、Ｈは磁場の強さであり、ｊ２は媒体中の電流密度であり、ηは媒体の粘度であり、Ｒは微小物体の半径である。）
【００１１】
以上の状況は均一な磁場の場合であり、磁場が不均一な場合には媒体及び微小物体に磁場勾配に応じた力が作用することになる。体積Ｖの微小物体に作用する力（磁場吸引力）Ｆｍは次の式（１１）で示される。
Ｆｍ ＝ Ｖμ０χ（Ｈ・（ｄＨ／ｄｘ）） （１１）
ここに、μ０は真空の透磁率であり、ＣＧＳ単位系ではμ０＝１であり、χは磁化率であり、（ｄＨ／ｄｘ）は磁場勾配を示す。
【００１２】
この力Ｆｍは、式（１１）からもわかるように磁化率χが小さい物質においては余り問題にならないが、塩化マンガン水溶液のように磁化率χが大きな特に常磁性の物質である場合には大きな力として効いてくることになる。不均一磁場における媒体中の微小物体が非磁性の物質である場合には、前記式（１１）からもわかるように微小物体にかかる力は無いから、見かけ上同体積の媒体にかかる力Ｆｍが微小物体に逆向きにかかることになる。これは、前記の電磁浮力と同様な考え方によるものである。したがって、不均一磁場において磁性物質からなる媒体中の非磁性物質からなる微小物体にかかる力Ｆは、次の式（１２）で示される。
Ｆ ＝ −Ｖμ０χ（Ｈ・（ｄＨ／ｄｘ）） （１２）
ここに、μ０は真空の透磁率であり、χは媒体の磁化率であり、（ｄＨ／ｄｘ）は磁場勾配を示す。
【００１３】
本発明者らは、微小物体としてポリスチレン粒子と炭素球粒子を用いて、これらの微小物体の電気泳動挙動に及ぼす磁場の影響を検討した。
実験で用いたセルを図２に示す。図２中の単位はｍｍである。この実験に用いた磁石には縦、横１６ｍｍ、高さ５ｍｍ、表面磁場約０．３Ｔのネオジウム鉄ボロン磁石であり、これにより均一磁場を生成させた。
【００１４】
この実験で使用した電磁泳動実験装置を図３、図４、及び、図５に示す。図３は、図２に示されるセルの両開口部に電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）を設置することができるようにしたセルホルダーを示している。図４は、前記したセルホルダーと磁石との関係を示している。即ち、セルの両端にセルホルダーにより電極が設けられ電流は図４中のｉで示される方向に流れており、これと垂直方向に磁場Ｈが掛けられるように両側に磁石が設置されており、この磁石の間隔は２３ｍｍであった。そして、セルの下側に光源が設けられており、この光源により泳動をセルの上側から観察した。光は図５に示されるように顕微鏡内蔵の光源により下から当てられた。
【００１５】
図５には、この装置の全体像を示した。この装置には、セルに電流を流すための定電流電源、観察のための顕微鏡、観察結果を記録しておくためのＣＣＤカメラとビデオ装置、及び、ステージの高さを決定するためのデジタルゲージが設けられている。
このデジタルゲージによりμｍのオーダーでステージの高さを調節できるようにした。このデジタルゲージにより焦点を合わせたステージの位置をμｍオーダーで計測することができるが、セル内に溶液を入れたときには、屈折率の違いによりデジタルゲージの値をそのままセル内の位置とすることはできなかった。例えば、セルの上面と下面に焦点を合わせたときのステージの高さの差は約１９０μｍとなり、実際のセルの深さ２５０μｍ（図２参照）よりも小さく観測される。このためにデジタルゲージで測定された値を補正する必要があり、次式（１３）及び（１４）で示す式により補正をした。
【００１６】
セル内での粒子の深さを求めるために、まずセルの上面と下面に焦点を合わし、ステージの高さを記録する。次に、粒子に焦点を合わしてステージの高さを記録する。そして以下に示す式（１３）によって粒子の相対深さの比（Ｄｒ）を求め、次いでこのＤｒの値から次式（１４）によりセルの下面からの高さ（ｈＤ）を求めた。
Ｄｒ ＝ （ｈ１−ｈ３）／（ｈ２−ｈ３） （１３）
（式中、ｈ１は粒子に焦点を合わせたときのステージの高さであり、ｈ２はセルの上面に焦点を合わせたときのステージの高さであり、ｈ３はセルの下面に焦点を合わせたときのステージの高さである。）
ｈＤ ＝ Ｄｒ×２５０μｍ （１４）
【００１７】
粒径が３μｍ、１５μｍ及び２０μｍである三種類のポリスチレン粒子を微小物体として電磁泳動させた。媒体としては、１ＭＫＣｌ溶液を用いた。その結果を図６に示す。図６の縦軸は泳動速度ｖ（μｍ／秒）を示し、横軸は電流ｉ（μＡ）を示している。
【００１８】
図６からわかるように、泳動速度ｖは電流ｉの比例しており、このことは前記式（９）で示されるとおりの結果であることがわかる。この実験においては、媒体の流動は観測されず、微小物体のみの泳動が観察された。その泳動速度ｖは粒子径が大きいほど大きく、このことは電磁浮力が粒子の体積に依存していることとよく一致していることを示す。粒径が２０μｍの微小物体の傾きは、粒径が１５μｍの微小物体の傾きの約１．７４倍であり、これは半径の二乗の倍率（１．７８倍）にほぼ一致していることもわかった。
なお、粒径３μｍの微小物体の電磁泳動は観測することができなかった。
【００１９】
この実験における泳動速度ｖを前記式（１０）においてｎ＝０として計算した結果を図７に示す。磁場の強さＨが１０５０エルステッド（Ｏｅ）で、媒体の粘度ηが８．７８８×１０−３ポイズ（ｐｏｉｓｅ）であり、ＣＧＳ単位系で計算した。
図７の計算値と図６の実測値には、電流値が大きくなるほど大きな開きが見られるが、その傾向は一致しており、量的には、実測値は前記式（１０）のｎ＝０．３２３とすると計算値と実験値が一致することがわかる。
【００２０】
次に不均一な磁場での電磁泳動の実験を行った。この実験では導電率の異なる二種類の微小物体を用いた。
導電率の小さいポリスチレンラテックス（カルボキシレート）粒子（以下ポリスチレン粒子と略す）と、導電体の粒子である炭素球粒子を微小物体として用いた。それぞれの調製方法を以下に示す。
まずポリスチレン粒子（半径１．５μｍ）は、市販のラテックス試料を精製水（蒸留水をミリポア（MILLIPORE ）で精製した水。）（以下、水と略す）、又はＫＣｌ水溶液で観測しやすい粒子数に希釈したものを用いた（粒子数 ３．３６×１０５個 ｃｍ−３）。実際には１００ｃｍ３の水に対して、ラテックス試料を２０μｌ加えた。試料は普段は冷蔵保存し、測定する前に室温（２５℃）に戻した。
【００２１】
次に炭素球粒子としてバイオテクリサーチのカーボンカラム・ビーズを用い、約０．０５％（Ｗ／Ｗ）になるように調製した。しかし、水だけでは浮かんでしまい分散しなかったので、中性の界面活性剤であるトリトンＸ−１００（ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＣＨ３（ＣＨ２）７Ｃ６Ｈ４（ＯＣＨ２ＣＨ２）１０ＯＨからなる中性の界面活性剤）を約０．０１％（Ｖ／Ｖ）になるように加え、振とう機で１時間程度振とうさせると、よい分散が得られた。粒子の半径は様々であったが、かなり小さい粒子（半径約１μｍ）だけはある程度の時間分散していた。実際には１００ｃｍ３の水に対して、炭素球を約０．０５ｇ、トリトンＸ−１００を１０μｌ加えた。
【００２２】
この実験に使用した実験装置を図８に示す。図８の実験装置は、図５に示した均一磁場での実験装置と、セルの部分及びデジタルゲージの部分を除きほぼ同様なものである。
ここで便宜上、図８の右上に示したセル（内径７３×２３×ｌｍｍ）に座標軸を置いた。長さ方向をＸ軸、幅方向をＹ軸、深さ方向をＺ軸とした。セルはアルミの枠に固定されていて、そのアルミ枠をステージに水平に固定し ＸＹ方向に平行に動かせるようにした。粒子の泳動の様子は、セルの真上から光学顕微鏡を用いて観察した。倍率は３００倍（接眼レンズ×１５、対物レンズ×２０）である。この顕微鏡には焦点調製のために目盛のついた微動ネジがついているので、その値から深さを求めた。
【００２３】
電磁泳動挙動の測定法は、基本的には前記の電気泳動挙動の測定法と操作は変わらない。変わった点は、セルの下に磁石（１６×１６×５ｍｍ）を設置する点である。この磁石はステージの動きと関係なく常に対物レンズの真下にあるので、顕微鏡の視野内では水平な均一電場に垂直に均一磁場が存在している（図９参照）。磁石には非常に強力なネオジム鉄ボロン磁石を用いた（ｌｍｍのガラスを挟んだ上の磁束密度約０．３６Ｔ）。図９に、この実験のセル部分を示す。
【００２４】
まず、あらかじめ測定前に試料のｐＨと導電率を測定する。セルに試料を満たした後、ステージに固定し、顕微鏡でまず深さの基準となる溝を探す。次に上の溝から微動ネジを使って定常レベルに合わせ、焦点の合っている粒子をＸＹステージを動かして探す。粒子が見つかったら、ビデオを縁画にし電圧をかける（約５０Ｖ）。泳動挙動を緑画したら、電圧をかけるのを止めビデオを止める。このようにして数個の粒子について測定し、電極の正負を変え、上下の定常レベルについてそれぞれ測定し、この４過程で１つの試料の測定とする。測定した試料はそのままもう一度導電率を測定する。
【００２５】
なお、トリトンＸ−１００を加えたことによって多少セルの中を流れる試料の流れが遅くなったように感じられたので、トリトンＸ−１００水溶液の粘度を調べた。測定にはユベロード粘度計を使い、２５℃における水に対する相対粘度を求めた。
【００２６】
まず、磁場をかけずに電気のみによる電気泳動の様子を観察した。その結果を図１０に示す。写真は左側が正極で右側が負極で、媒体として１ｍＭＫＣｌを用いたポリスチレンラテックス粒子の映像であり、右側は電圧をかけたとき（０秒）であり、真ん中は８秒後であり、左側は１６秒後の映像である。
この電気泳動ではポリスチレンラテックス粒子はＸ軸方向（図中の左右方向）にのみ泳動しており、Ｙ軸方向（図中の上下方向）への泳動はみられなかった。
【００２７】
次に、磁場をかけると明らかに粒子の泳動挙動に変化が見られた。結果を図１１に示す。いずれの写真も前記の図１０と同様であるが、図１１の上段がＫＣｌを添加していない場合（０ｍＭ）であり、２段目がＫＣｌ０．１ｍＭの場合であり、３段目（最下段）がＫＣｌ１ｍＭの場合のものである。
粒子は電気泳動の場合とは異なり、ＫＣｌ濃度が増すに連れてＹ軸方向（図中の上下方向）への大きな泳動が観察された。
【００２８】
この写真（図１１）のように粒子は斜めに泳動する。そこで粒子の泳動速度をＸ軸方向・Ｙ軸方向の速度にベクトル分解して、電気泳動との違いについて検討した。
Ｘ軸方向の速度成分Ｖｘは電気泳動と同じ方向なので、電気泳動移動度とＶｘから求めた泳動移動度を比較することで磁場による寄与があるか否かを検討した。この検討に際して泳動移動度にしたのは、泳動速度では単純な比較ができないからである。Ｖｘを電場で割って規格化した泳動移動度を、ＫＣｌ濃度に対してプロットした場合、泳動移動度が電気泳動移動度とほぼ一致した。その結果を図１２に示す。図１２の黒丸印は炭素粒子の場合を示し、白丸印はポリスチレンラテックス粒子の場合を示す。図１２の横軸はＫＣｌ濃度（１０−３モル／ｄｍ３ ）を対数で示しており、縦軸は速度成分Ｖｘの泳動移動度（１０−８ｍ２／秒／Ｖ ）を示している。図１３は同様に泳動移動度を示している。
同図から分かるように泳動移動度にほとんど違いが見られなかった。この結果から磁場の存在下での泳動におけるＶｘは電気泳動の寄与のみであることが分かった。
【００２９】
Ｙ軸方向の速度成分Ｖｙは電気泳動のときには０であった。しかもＶｘは電気泳動だけであったので、このＶｙ成分は電磁泳動そのものであると考えられる。電磁泳動力は電流密度に比例するので、このＶｙを電流に対してプロットした結果を図１４に示す。図１４の黒丸印は炭素粒子の場合を示し、白丸印はポリスチレンラテックス粒子の場合を示す。図１４の横軸は電流（１０−６Ａ）を示しており、縦軸は泳動速度（１０−６ｍ／秒）を示している。
その結果、ポリスチレン、炭素両粒子とも原点を通る同一の直線に近似できた。このことは導電率の全く違う両粒子にもかかわらず、電磁泳動力に差が見られなかったことを示している。
【００３０】
以上の結果は、不均一磁場における電磁泳動においては、電磁流動が支配的であり、開放系に近い状態では、電磁流動と電気泳動をそれぞれ直交する方向に作用させ、イオンや微粒子の分離を行うことができ、密閉系においては、バルクフローの動力源として利用が可能であることを示している。また、均一磁場における電磁泳動においては流動は起こらず、電磁浮力による粒子の泳動分離が起こり、この泳動速度は、粒子半径の二乗に比例し、電流に比例し、また、これと電気泳動との組み合わせも可能であることから、粒子の大きさ、電荷、導電率に基づく泳動分析が期待されることを示している。したがって本発明は、分散媒との組合せにより、電磁場の中での微小物体の分離又はキャラクタリゼーション法としての可能性を示すものであり、本発明は従来の電場のみを用いた電気泳動法とはことなる新たな分離・キャラクタリゼーション法を提供するものである。
【００３１】
本発明の泳動の対象となる微小物体としては、帯電している微小物体であってもよく、また、電場又は磁場をかけることにより帯電する微小物体であってもよいし、帯電しないものであってもよい。微小物体としては導電性を少しでも有するものが好ましい。
本発明における微小物体としては、例えば、ポリスチレンなどの高分子物質の粒状物、炭素などの無機物質の粒状物、分子や分子の凝集物、酵素などの蛋白質、ペプチド、細菌類や細胞などの微生物などが挙げられる。これらの微小物体には、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質などのマーカーが付されていてもよい。
これらの微小物体は、従来の電気泳動による分離だけでなく、その大きさ、例えば体積などやその形により本発明の方法により分離することが可能となる。
【００３２】
媒体としては、電導性があれば特に制限はなく、液体状であっても、ゲル状であってもよいが、水溶液が好ましい。また、分散媒中に必要に応じて界面活性剤などの他の添加物を添加することもできる。
【００３３】
本発明の方法は電場に垂直な方向に磁場をかけることを特徴とするものであるが、磁場をかける方向は媒体や分離しようとする微小物体に応じて適宜変更することもできる。また、磁場は一方向からのみではなく必要に応じて多方向からかけることも可能である。磁場はセル全体に均一になるものであってもよいが、不均一な磁場であってもよい。
【００３４】
本発明で使用されるセルは密閉型のものが好ましいが、密閉型でなくともよく、電場及び磁場に応じて適宜設計することができる。また、セルには微小物体に二次元的な泳動に応じた分画ができる分画部を有することもできる。従来の電気泳動は一次元的な泳動であり、分画することは困難であったが、本発明の電磁泳動は二次元的泳動であることから、分画部、例えば分画のための仕切板を設けた分画部などを設けることにより分離された微小物体を直接分画部に分取することが可能となる。
【００３５】
【実施例】
次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１
（１）装置
縦と横が各々０．２５ｍｍで長さが６ｍｍの図２に示すセルに媒体及び微小物体を入れ、これを図３に示すセルの両端に電極を設けることができるセルホルダーに固定した。電極としては、直径１ｍｍの銀線をテフロンチューブに入れ、これを陽極、白金線を陰極として電気分解を行った。１００μＡの定電流を５〜１０分間流すと、銀線の先端に塩化銀が付着した。これを可逆電極として用いた。媒体及び微小物体の入ったセルをセルホルダーに固定するに際しては、セル内の溶液を密閉し、セル内に溶液を密閉する際には、作業を溶液中で行って気泡の進入を防ぎ、スクリューで締め付けることによって液漏れをなくした。
セルを固定したセルホルダーを電場に垂直方向から磁場がかかるように図４に示す磁石の間にセットした。磁石には縦、横１６ｍｍ、高さ５ｍｍ、表面磁場約０．３Ｔのネオジウム鉄ボロン磁石を用いた。
磁場の中にセットされたセルホルダーを図５に示す顕微鏡に置き、デジタルゲージを設定した。実験に用いた装置の全体像を図５に示す。
セルの両端には電極が接続され、このセルをニ枚の磁石ではさみ、光は顕微鏡内蔵の光源により下からあてた。
【００３７】
図５に示す装置には以下のものが使用された。
【００３８】
（２） 試薬と測定
前記（１）に記載の装置を用いて、粒径が３μｍ、１５μｍポリスチレンラテックス粒子（直径１４．５７１μｍ、標準偏差１．６５７μｍ）（以下、１５μポリスチレン粒子と略す）及び２０μｍポリスチレンラテックス粒子（直径２２．００１μｍ、標準偏差２．７１２μｍ）（以下２０μポリスチレン粒子と略す）である三種類のポリスチレン粒子を微小物体として電磁泳動させた。媒体としては、１ＭＫＣｌ溶液を用いた。これを観測しやすい粒子数に希釈した。試料は晋段は冷蔵保存し、測定する前に室温（２５℃）に戻した。
その結果を図６に示す。図６の縦軸は泳動速度ｖ（μｍ／秒）を示し、横軸は電流ｉ（μＡ）を示している。
【００３９】
実施例２
（１）装置
不均一磁場における電磁泳動の実験を行った。この実験の装置を図８に示す。この実験では、定電圧電源・光学顕微鏡・ＣＣＤカメラ・ブリッグスセル（Ｂｒｉｇｇｓ−Ｃｅｌｌ）一式からなるζ電位測定用（三田村理研工業）の装置を用いた。
ここで便宜上、図８の右上に示したセル（内径７３×２３×１ｍｍ）に座標軸を置いた。長さ方向をＸ軸、幅方向をＹ軸、深さ方向をＺ軸とした。セルはアルミの枠に固定されていて、そのアルミ枠をステージに水平に固定し、ＸＹ方向に平行に動かせるようにした。粒子の泳動の様子は、セルの真上から光学顕微鏡を用いて観察した。倍率は３００倍（接眼レンズ×１５、対物レンズ×２０）であった。この顕微鏡には焦点調整のために目盛のついた微動ネジがついているので、その値から深さを求めた。
【００４０】
この実験に用いた装置を以下に示す。
【００４１】
（２） 試薬
電磁泳動力の違いを見るために、この実験では導電率の異なる二種類の粒子を用いた。絶縁体であるポリスチレンラテックス（カルボキシレート）粒子（以下ポリスチレン粒子と略す）と、導電体の粒子である炭素球粒子である。それぞれの調製方法を以下に示す。
まずポリスチレン粒子（半径１．５μｍ）は、市販のラテックス試料を蒸留水をミリポア（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）によって精製した精製水（以下、水と略す）又はＫＣｌ水溶液で観測しやすい粒子数に希釈したものを用いた（粒子数 ３．３６×１０５個・ｃｍ−３）。実際には１００ｃｍ３の水に対して、ラテックス試料を２０μｌ加えた。試料は晋段は冷蔵保存し、測定する前に室温（２５℃）に戻した。
【００４２】
次に炭素球粒子としてバイオテクリサーチのカーボンカラム・ビーズを用い、約０．０５％（Ｗ／Ｗ）になるように調製した。しかし、水だけでは浮かんでしまい分散しなかったので、中性の界面活性剤であるトリトンＸ−１００を約０．０１％（Ｖ／Ｖ）になるように加え、振とう機で１時間程度振とうさせると、よい分散が得られた。粒子の半径は様々であったが、かなり小さい粒子（半径、約１μｍ）だけはある程度の時間分散していた。実際には１００ｃｍ３の水に対して、．炭素球を約０．０５ｇ、トリトンＸ−１００を１０μｌ加えた。
【００４３】
（３） 電気泳動挙動の測定法
まずあらかじめ測定前に試料のｐＨと導電率を測定する。そしてセルに入れる前に試料をよく撹拌し、セルの内部に空気が残らないようにセルを試料で満たしていく。粒子は水より密度が大きく、徐々に沈んでいくので以降は手際よく測定する。セルに試料を満たした後、ステージに固定し、顕微鏡でまず深さの基準となる溝を探す。次に上の溝から微動ネジを使って定常レベルに合わせ、焦点の合っている粒子をＸＹステージを動かして探す。粒子が見つかったら、ビデオを録画にし、電圧をかける（約５０Ｖ）。泳動挙動を緑画したら、電圧をかけるのを止めビデオを止める。このようにして数個の粒子について測定し、電極の正負を変え、上下の定常レベルについてそれぞれ測定し、この４過程で１つの試料の測定とする。測定した試料はそのままもう一度導電率を測定する。
【００４４】
（４） 電磁泳動挙動の測定法
基本的に前記（３）の電気泳動挙動の測定法と操作は変わらない。変わるのは、セルの下に磁石（１６×１６×５ｍｍ）を設置する点である。この磁石はステージの動きと関係なく常に対物レンズの真下にあるので、顕微鏡の視野内では水平な均一電場に垂直に不均一磁場が存在している（図９）。磁石には非常に強力なネオジム鉄ボロン磁石を用いた（ｌｍｍのガラスを挟んだ上の磁束密度約０．３６Ｔであった。）。
【００４５】
（５） 粘度測定
トリトンＸ−１００を加えたことによって多少セルの中を流れる試料の流れが遅くなったように感じられたので、トリトンＸ−１００水溶液の粘度を調べた。測定にはユベロード粘度計を使い、２５℃における水に対する相対粘度を求めた。
【００４６】
（６） 測定結果
まず、磁場をかけると明らかに粒子の泳動挙動に変化が見られた。粒子は電気泳動の方向とは異なる方向に泳動した。その様子を連続写真に示す（図１０及び１１）。いずれの写真も左側が正極で右側が負極で、ポリスチレンラテックス粒子の映像である。電気泳動では図１０の写真のようにＸ軸方向にのみ泳動しているが、電磁泳動では図１１の写真のようにＹ軸方向にも泳動し、ＫＣｌ濃度が増えるにしたがってＹ軸方向の泳動速度が増した。
図１１の写真のように電磁泳動では、粒子は斜めに泳動する。そこで粒子の泳動速度をＸ軸方向及びＹ軸方向の速度にベクトル分解して、電気泳動との違いについて検討した。
【００４７】
電場に平行な速度成分Ｖｘの泳動移動度のＫＣｌ濃度依存性
Ｘ軸方向の速度成分Ｖｘは電気泳動と同じ方向なので、電気泳動移動度とＶｘから求めた泳動移動度を比較することで磁場による寄与があるか否かを検討した。泳動移動度にしたのは泳動速度では単純な比較ができないからである。その結果を図１２及び１３に示す。同図から分かるように泳動移動度にほとんど違いが見られなかった。この結果から磁場の存在下での泳動におけるＶｘは電気泳動の寄与のみであることが分かった。これは電磁泳動値からが電場と磁場に垂直な方向に働くこととも一致する。
【００４８】
磁場に垂直な速度成分Ｖｙの電流依存性
Ｙ軸方向の速度成分Ｖｙは電気泳動のときには０であった。しかもＶｘは電気泳動だけであったので、このＶｙは電磁泳動そのものであると考えられる。電磁泳動力は電流密度に比例するので、このＶｙを電流に対してプロットした（図１４）。その結果、ポリスチレン、炭素両粒子とも原点を通る同一の直線に近似できた。このことは導電率の全く違う両粒子にもかかわらず、電磁泳動力に差が見られなかったことを示している。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の電磁泳動法によれば、微小物体は電場方向のみならず電場と垂直な磁場方向へも移動することから、分子などの微小物体のより詳細な分離・キャラクタリゼーションを行うことができる。また、泳動が二次元的であることから、泳動による分取を簡単に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、均一磁場における微小物体の電磁力と電磁浮力の関係を模式的に示したものである。
【図２】図２は、本発明の実施例１において使用したセルを示すものである。
【図３】図３は、本発明の実施例１において使用したセルホルダーを示すものである。
【図４】図４は、本発明の実施例１において使用したセルホルダーを磁場中に置いたところを示すものである。
【図５】図５は、本発明の実施例１において使用した本発明の装置を示すものである。
【図６】図６は、均一磁場における微小物体の泳動速度と電流の関係の実測値をグラフ化したものである。
【図７】図７は、均一磁場における微小物体の泳動速度と電流の関係の計算値をグラフ化したものである。
【図８】図８は、本発明の実施例２において使用した本発明の装置を示すものである。
【図９】図９は、本発明の実施例２において使用したセルホルダーを磁場に置いたところを示すものである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例２における電気泳動の様子を示した、図面に代わる写真である。
【図１１】図１１は、本発明の実施例２における電磁泳動の様子を示した、図面に代わる写真である。最上段はＫＣｌ濃度が０ｍＭの場合で、中段はＫＣｌ濃度が０．１ｍＭの場合で、最下段はＫＣｌ濃度が１ｍＭの場合である。
【図１２】図１２は、本発明の実施例２の電磁泳動における、電場に平行な速度成分Ｖｘの泳動移動度とＫＣｌ濃度の関係を実測値に基づいてグラフ化したものである。白丸印はポリスチレン粒子を示し、黒丸印は炭素粒子を示している。
【図１３】図１３は、本発明の実施例２の電磁泳動における、泳動移動度とＫＣｌ濃度の関係を実測値に基づいてグラフ化したものである。白丸印はポリスチレン粒子を示し、黒丸印は炭素粒子を示している。
【図１４】図１４は、本発明の実施例２の電磁泳動における、電場に垂直な速度成分Ｖｙの泳動速度と電流の関係を実測値に基づいてグラフ化したものである。白丸印はポリスチレン粒子を示し、黒丸印は炭素粒子を示している。
【発明の属する技術分野】
本発明は、分散媒中に分散された微小物体に、電場をかけ、かつ、電場と直角方向に磁場をかけて微小物体を磁場中で電磁泳動させる方法、そのための装置、及び、その方法による微小物体の分離方法並びにそのための分離装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】
荷電した又は荷電させた微小物体を電気泳動させる方法は、分析手段や分離手段として広く応用されてきている。これらの電気泳動法は、微小物体を含有する分散媒に電場をかけることにより行われてきたが、電場と同時に磁場をかけることはなかった。
【０００３】
均一電場中の液中粒子が均一磁場によって受ける電磁泳動力に関する理論式が以前提案されたが（A. Kolin, Science, 1953, 117, 134.）、実際の泳動を検討することはほとんど行われてこなかった。そこで本発明者らは、分散媒中の微小物体の電気泳動挙動に及ぼす磁場の影響を検討し、液中での微小物体の新たな分離・キャラクタリゼーション法としての可能性を検討した。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、分散媒中の分子や微粒子などの微小物体の電気泳動挙動に及ぼす磁場の影響を検討し、分散媒、特に溶液状の分散媒中での微小物体の新たな泳動方法・分離方法を提供しようとするものである。より詳細には、本発明は、分散媒中に分散された微小物体に、電場及び電場と直角方向に磁場をかけて微小物体を電磁場中で電磁泳動させる方法、そのための装置、及び、その方法による微小物体の分離方法並びに分離装置を提供するものである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】
本発明は、分散媒中に分散された微小物体に、電場をかけ、かつ、電場と垂直方向に磁場をかけて微小物体を磁場中で電磁泳動させて、当該微小物体の泳動速度を測定する方法に関する。
また、本発明は、分散媒中に分散された微小物体に、電場をかけ、かつ、電場と垂直方向に磁場をかけて微小物体を磁場中で電磁泳動させて、当該微小物体の泳動速度を測定するための装置に関する。
さらに、本発明は、分散媒中に分散された複数種の微小物体に、電場をかけ、かつ、電場と垂直方向に磁場をかけて微小物体を磁場中で電磁泳動させて、当該微小物体の泳動速度により当該微小物体を分離する方法及びその装置に関する。
【０００６】
透磁率μ、電流密度ｊ、磁場の強さＨの中で、ある体積要素Ｖを有する物体が、磁場とそれに垂直な電場によって受ける力Ｆは、次の式（１）、（２）で示される。
ｄＦ ＝ （μＨｊ）ｄＶ （１）
Ｆ ＝ （μＨｊ）Ｖ （２）
電流密度ｊが、媒体と媒体中の微小物体とで異なる場合には、それぞれにかかる力が異なることになるから、その力の差により微小物体が媒体中を泳動することになる。媒体中の微小物体と媒体の電流密度の関係は、マックスウエル（Maxwell ）の式から、次の（３）で示されることになる。
ｊ１ ＝ ｊ２（３σ１／（２σ２＋σ１）） （３）
【０００７】
ここに、ｊ１は微小物体内の電流密度、
ｊ２は媒体中の電流密度、
σ１は微小物体の電気伝導度、
σ２は媒体の電気伝導度をそれぞれ示している。
前記の（２）式によれば、電磁場中の媒体中の体積Ｖを有する微小物体が受ける力Ｆ１、及び、媒体が受ける力Ｆ２はそれぞれ次ぎの（４）及び（５）式で示されることになる。
Ｆ１ ＝ μ１Ｈｊ２Ｖ（３σ１／（２σ２＋σ１）） （４）
Ｆ２ ＝ μ２Ｈｊ２Ｖ （５）
ここに、μ１は微小物体の透磁率であり、μ２は媒体の透磁率である。
したがって、電磁場中で媒体中の微小物体が受ける相対的な力Ｆ（即ち、Ｆ１−Ｆ２）は次式（６）で示されることになる。
μ１ ≒ μ２ ＝ μ
として、
ｎ ＝ σ１／σ２
とすると相対的な力Ｆは次式（７）で示される。
Ｆ ＝ −２μＨｊ２Ｖ（（１−ｎ）／（２＋ｎ）） （７）
【０００８】
この力Ｆを重力場にたとえて説明すると、水中の物質が重力Ｆ１と浮力Ｆ２を受けているようなものである。しかし、上記で説明してきた力Ｆは、電磁場で受ける力であるから、以下においては、Ｆ１を電磁力と呼び、Ｆ２を電磁浮力と呼ぶことにする。電磁場中の微小物体が受ける前記した力の関係を図１に示す。
【０００９】
また、微小物体としてその電気伝導度σ１が０のものを使用した場合には、式（４）から電磁力Ｆ１は０になり、この結果、微小物体には電磁浮力Ｆ２のみが実質的に作用することになる。即ち、この場合の力Ｆは、次の（８）式で示される。
Ｆ ＝ −μ２Ｈｊ２Ｖ （８）
したがって、実質的に電気伝導度が０の微小物体を媒体の透磁率がμ２の媒体中に分散させて、これを電磁場中におくと、微小物体の体積Ｖ、及び、媒体中の電流密度ｊ２に比例した力Ｆが、微小物体にかかることになる。ここで、電流密度を一定にしておくと、微小物体の体積に応じて加わる力が異なることになり、体積に応じた電磁泳動がみられることになる。
理論的にはσ１＝０（ｎ＝０）ということも考えられるが、実際にはポリスチレンのような場合でもσ１は０ではなく、電磁泳動はσ１、即ち、ｎの値にも依存することになる。
【００１０】
また、この時の泳動速度ｖは、次式（９）で示されるストークスの法則の式、
Ｆ ＝ ６πηＲｖ （９）
（式中、ηは媒体の粘度であり、Ｒは微小物体の半径である。）
と前記の（７）式から、次の式（１０）で示されることになる。
ｖ ＝ （−４／９）・（μＨｊ２Ｒ２／η）（（１−ｎ）／（２＋ｎ））
（１０）
（式中、μ２は媒体の透磁率であり、Ｈは磁場の強さであり、ｊ２は媒体中の電流密度であり、ηは媒体の粘度であり、Ｒは微小物体の半径である。）
【００１１】
以上の状況は均一な磁場の場合であり、磁場が不均一な場合には媒体及び微小物体に磁場勾配に応じた力が作用することになる。体積Ｖの微小物体に作用する力（磁場吸引力）Ｆｍは次の式（１１）で示される。
Ｆｍ ＝ Ｖμ０χ（Ｈ・（ｄＨ／ｄｘ）） （１１）
ここに、μ０は真空の透磁率であり、ＣＧＳ単位系ではμ０＝１であり、χは磁化率であり、（ｄＨ／ｄｘ）は磁場勾配を示す。
【００１２】
この力Ｆｍは、式（１１）からもわかるように磁化率χが小さい物質においては余り問題にならないが、塩化マンガン水溶液のように磁化率χが大きな特に常磁性の物質である場合には大きな力として効いてくることになる。不均一磁場における媒体中の微小物体が非磁性の物質である場合には、前記式（１１）からもわかるように微小物体にかかる力は無いから、見かけ上同体積の媒体にかかる力Ｆｍが微小物体に逆向きにかかることになる。これは、前記の電磁浮力と同様な考え方によるものである。したがって、不均一磁場において磁性物質からなる媒体中の非磁性物質からなる微小物体にかかる力Ｆは、次の式（１２）で示される。
Ｆ ＝ −Ｖμ０χ（Ｈ・（ｄＨ／ｄｘ）） （１２）
ここに、μ０は真空の透磁率であり、χは媒体の磁化率であり、（ｄＨ／ｄｘ）は磁場勾配を示す。
【００１３】
本発明者らは、微小物体としてポリスチレン粒子と炭素球粒子を用いて、これらの微小物体の電気泳動挙動に及ぼす磁場の影響を検討した。
実験で用いたセルを図２に示す。図２中の単位はｍｍである。この実験に用いた磁石には縦、横１６ｍｍ、高さ５ｍｍ、表面磁場約０．３Ｔのネオジウム鉄ボロン磁石であり、これにより均一磁場を生成させた。
【００１４】
この実験で使用した電磁泳動実験装置を図３、図４、及び、図５に示す。図３は、図２に示されるセルの両開口部に電極（例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極など）を設置することができるようにしたセルホルダーを示している。図４は、前記したセルホルダーと磁石との関係を示している。即ち、セルの両端にセルホルダーにより電極が設けられ電流は図４中のｉで示される方向に流れており、これと垂直方向に磁場Ｈが掛けられるように両側に磁石が設置されており、この磁石の間隔は２３ｍｍであった。そして、セルの下側に光源が設けられており、この光源により泳動をセルの上側から観察した。光は図５に示されるように顕微鏡内蔵の光源により下から当てられた。
【００１５】
図５には、この装置の全体像を示した。この装置には、セルに電流を流すための定電流電源、観察のための顕微鏡、観察結果を記録しておくためのＣＣＤカメラとビデオ装置、及び、ステージの高さを決定するためのデジタルゲージが設けられている。
このデジタルゲージによりμｍのオーダーでステージの高さを調節できるようにした。このデジタルゲージにより焦点を合わせたステージの位置をμｍオーダーで計測することができるが、セル内に溶液を入れたときには、屈折率の違いによりデジタルゲージの値をそのままセル内の位置とすることはできなかった。例えば、セルの上面と下面に焦点を合わせたときのステージの高さの差は約１９０μｍとなり、実際のセルの深さ２５０μｍ（図２参照）よりも小さく観測される。このためにデジタルゲージで測定された値を補正する必要があり、次式（１３）及び（１４）で示す式により補正をした。
【００１６】
セル内での粒子の深さを求めるために、まずセルの上面と下面に焦点を合わし、ステージの高さを記録する。次に、粒子に焦点を合わしてステージの高さを記録する。そして以下に示す式（１３）によって粒子の相対深さの比（Ｄｒ）を求め、次いでこのＤｒの値から次式（１４）によりセルの下面からの高さ（ｈＤ）を求めた。
Ｄｒ ＝ （ｈ１−ｈ３）／（ｈ２−ｈ３） （１３）
（式中、ｈ１は粒子に焦点を合わせたときのステージの高さであり、ｈ２はセルの上面に焦点を合わせたときのステージの高さであり、ｈ３はセルの下面に焦点を合わせたときのステージの高さである。）
ｈＤ ＝ Ｄｒ×２５０μｍ （１４）
【００１７】
粒径が３μｍ、１５μｍ及び２０μｍである三種類のポリスチレン粒子を微小物体として電磁泳動させた。媒体としては、１ＭＫＣｌ溶液を用いた。その結果を図６に示す。図６の縦軸は泳動速度ｖ（μｍ／秒）を示し、横軸は電流ｉ（μＡ）を示している。
【００１８】
図６からわかるように、泳動速度ｖは電流ｉの比例しており、このことは前記式（９）で示されるとおりの結果であることがわかる。この実験においては、媒体の流動は観測されず、微小物体のみの泳動が観察された。その泳動速度ｖは粒子径が大きいほど大きく、このことは電磁浮力が粒子の体積に依存していることとよく一致していることを示す。粒径が２０μｍの微小物体の傾きは、粒径が１５μｍの微小物体の傾きの約１．７４倍であり、これは半径の二乗の倍率（１．７８倍）にほぼ一致していることもわかった。
なお、粒径３μｍの微小物体の電磁泳動は観測することができなかった。
【００１９】
この実験における泳動速度ｖを前記式（１０）においてｎ＝０として計算した結果を図７に示す。磁場の強さＨが１０５０エルステッド（Ｏｅ）で、媒体の粘度ηが８．７８８×１０−３ポイズ（ｐｏｉｓｅ）であり、ＣＧＳ単位系で計算した。
図７の計算値と図６の実測値には、電流値が大きくなるほど大きな開きが見られるが、その傾向は一致しており、量的には、実測値は前記式（１０）のｎ＝０．３２３とすると計算値と実験値が一致することがわかる。
【００２０】
次に不均一な磁場での電磁泳動の実験を行った。この実験では導電率の異なる二種類の微小物体を用いた。
導電率の小さいポリスチレンラテックス（カルボキシレート）粒子（以下ポリスチレン粒子と略す）と、導電体の粒子である炭素球粒子を微小物体として用いた。それぞれの調製方法を以下に示す。
まずポリスチレン粒子（半径１．５μｍ）は、市販のラテックス試料を精製水（蒸留水をミリポア（MILLIPORE ）で精製した水。）（以下、水と略す）、又はＫＣｌ水溶液で観測しやすい粒子数に希釈したものを用いた（粒子数 ３．３６×１０５個 ｃｍ−３）。実際には１００ｃｍ３の水に対して、ラテックス試料を２０μｌ加えた。試料は普段は冷蔵保存し、測定する前に室温（２５℃）に戻した。
【００２１】
次に炭素球粒子としてバイオテクリサーチのカーボンカラム・ビーズを用い、約０．０５％（Ｗ／Ｗ）になるように調製した。しかし、水だけでは浮かんでしまい分散しなかったので、中性の界面活性剤であるトリトンＸ−１００（ポリオキシエチレン（１０）オクチルフェニルエーテル（ＣＨ３（ＣＨ２）７Ｃ６Ｈ４（ＯＣＨ２ＣＨ２）１０ＯＨからなる中性の界面活性剤）を約０．０１％（Ｖ／Ｖ）になるように加え、振とう機で１時間程度振とうさせると、よい分散が得られた。粒子の半径は様々であったが、かなり小さい粒子（半径約１μｍ）だけはある程度の時間分散していた。実際には１００ｃｍ３の水に対して、炭素球を約０．０５ｇ、トリトンＸ−１００を１０μｌ加えた。
【００２２】
この実験に使用した実験装置を図８に示す。図８の実験装置は、図５に示した均一磁場での実験装置と、セルの部分及びデジタルゲージの部分を除きほぼ同様なものである。
ここで便宜上、図８の右上に示したセル（内径７３×２３×ｌｍｍ）に座標軸を置いた。長さ方向をＸ軸、幅方向をＹ軸、深さ方向をＺ軸とした。セルはアルミの枠に固定されていて、そのアルミ枠をステージに水平に固定し ＸＹ方向に平行に動かせるようにした。粒子の泳動の様子は、セルの真上から光学顕微鏡を用いて観察した。倍率は３００倍（接眼レンズ×１５、対物レンズ×２０）である。この顕微鏡には焦点調製のために目盛のついた微動ネジがついているので、その値から深さを求めた。
【００２３】
電磁泳動挙動の測定法は、基本的には前記の電気泳動挙動の測定法と操作は変わらない。変わった点は、セルの下に磁石（１６×１６×５ｍｍ）を設置する点である。この磁石はステージの動きと関係なく常に対物レンズの真下にあるので、顕微鏡の視野内では水平な均一電場に垂直に均一磁場が存在している（図９参照）。磁石には非常に強力なネオジム鉄ボロン磁石を用いた（ｌｍｍのガラスを挟んだ上の磁束密度約０．３６Ｔ）。図９に、この実験のセル部分を示す。
【００２４】
まず、あらかじめ測定前に試料のｐＨと導電率を測定する。セルに試料を満たした後、ステージに固定し、顕微鏡でまず深さの基準となる溝を探す。次に上の溝から微動ネジを使って定常レベルに合わせ、焦点の合っている粒子をＸＹステージを動かして探す。粒子が見つかったら、ビデオを縁画にし電圧をかける（約５０Ｖ）。泳動挙動を緑画したら、電圧をかけるのを止めビデオを止める。このようにして数個の粒子について測定し、電極の正負を変え、上下の定常レベルについてそれぞれ測定し、この４過程で１つの試料の測定とする。測定した試料はそのままもう一度導電率を測定する。
【００２５】
なお、トリトンＸ−１００を加えたことによって多少セルの中を流れる試料の流れが遅くなったように感じられたので、トリトンＸ−１００水溶液の粘度を調べた。測定にはユベロード粘度計を使い、２５℃における水に対する相対粘度を求めた。
【００２６】
まず、磁場をかけずに電気のみによる電気泳動の様子を観察した。その結果を図１０に示す。写真は左側が正極で右側が負極で、媒体として１ｍＭＫＣｌを用いたポリスチレンラテックス粒子の映像であり、右側は電圧をかけたとき（０秒）であり、真ん中は８秒後であり、左側は１６秒後の映像である。
この電気泳動ではポリスチレンラテックス粒子はＸ軸方向（図中の左右方向）にのみ泳動しており、Ｙ軸方向（図中の上下方向）への泳動はみられなかった。
【００２７】
次に、磁場をかけると明らかに粒子の泳動挙動に変化が見られた。結果を図１１に示す。いずれの写真も前記の図１０と同様であるが、図１１の上段がＫＣｌを添加していない場合（０ｍＭ）であり、２段目がＫＣｌ０．１ｍＭの場合であり、３段目（最下段）がＫＣｌ１ｍＭの場合のものである。
粒子は電気泳動の場合とは異なり、ＫＣｌ濃度が増すに連れてＹ軸方向（図中の上下方向）への大きな泳動が観察された。
【００２８】
この写真（図１１）のように粒子は斜めに泳動する。そこで粒子の泳動速度をＸ軸方向・Ｙ軸方向の速度にベクトル分解して、電気泳動との違いについて検討した。
Ｘ軸方向の速度成分Ｖｘは電気泳動と同じ方向なので、電気泳動移動度とＶｘから求めた泳動移動度を比較することで磁場による寄与があるか否かを検討した。この検討に際して泳動移動度にしたのは、泳動速度では単純な比較ができないからである。Ｖｘを電場で割って規格化した泳動移動度を、ＫＣｌ濃度に対してプロットした場合、泳動移動度が電気泳動移動度とほぼ一致した。その結果を図１２に示す。図１２の黒丸印は炭素粒子の場合を示し、白丸印はポリスチレンラテックス粒子の場合を示す。図１２の横軸はＫＣｌ濃度（１０−３モル／ｄｍ３ ）を対数で示しており、縦軸は速度成分Ｖｘの泳動移動度（１０−８ｍ２／秒／Ｖ ）を示している。図１３は同様に泳動移動度を示している。
同図から分かるように泳動移動度にほとんど違いが見られなかった。この結果から磁場の存在下での泳動におけるＶｘは電気泳動の寄与のみであることが分かった。
【００２９】
Ｙ軸方向の速度成分Ｖｙは電気泳動のときには０であった。しかもＶｘは電気泳動だけであったので、このＶｙ成分は電磁泳動そのものであると考えられる。電磁泳動力は電流密度に比例するので、このＶｙを電流に対してプロットした結果を図１４に示す。図１４の黒丸印は炭素粒子の場合を示し、白丸印はポリスチレンラテックス粒子の場合を示す。図１４の横軸は電流（１０−６Ａ）を示しており、縦軸は泳動速度（１０−６ｍ／秒）を示している。
その結果、ポリスチレン、炭素両粒子とも原点を通る同一の直線に近似できた。このことは導電率の全く違う両粒子にもかかわらず、電磁泳動力に差が見られなかったことを示している。
【００３０】
以上の結果は、不均一磁場における電磁泳動においては、電磁流動が支配的であり、開放系に近い状態では、電磁流動と電気泳動をそれぞれ直交する方向に作用させ、イオンや微粒子の分離を行うことができ、密閉系においては、バルクフローの動力源として利用が可能であることを示している。また、均一磁場における電磁泳動においては流動は起こらず、電磁浮力による粒子の泳動分離が起こり、この泳動速度は、粒子半径の二乗に比例し、電流に比例し、また、これと電気泳動との組み合わせも可能であることから、粒子の大きさ、電荷、導電率に基づく泳動分析が期待されることを示している。したがって本発明は、分散媒との組合せにより、電磁場の中での微小物体の分離又はキャラクタリゼーション法としての可能性を示すものであり、本発明は従来の電場のみを用いた電気泳動法とはことなる新たな分離・キャラクタリゼーション法を提供するものである。
【００３１】
本発明の泳動の対象となる微小物体としては、帯電している微小物体であってもよく、また、電場又は磁場をかけることにより帯電する微小物体であってもよいし、帯電しないものであってもよい。微小物体としては導電性を少しでも有するものが好ましい。
本発明における微小物体としては、例えば、ポリスチレンなどの高分子物質の粒状物、炭素などの無機物質の粒状物、分子や分子の凝集物、酵素などの蛋白質、ペプチド、細菌類や細胞などの微生物などが挙げられる。これらの微小物体には、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質などのマーカーが付されていてもよい。
これらの微小物体は、従来の電気泳動による分離だけでなく、その大きさ、例えば体積などやその形により本発明の方法により分離することが可能となる。
【００３２】
媒体としては、電導性があれば特に制限はなく、液体状であっても、ゲル状であってもよいが、水溶液が好ましい。また、分散媒中に必要に応じて界面活性剤などの他の添加物を添加することもできる。
【００３３】
本発明の方法は電場に垂直な方向に磁場をかけることを特徴とするものであるが、磁場をかける方向は媒体や分離しようとする微小物体に応じて適宜変更することもできる。また、磁場は一方向からのみではなく必要に応じて多方向からかけることも可能である。磁場はセル全体に均一になるものであってもよいが、不均一な磁場であってもよい。
【００３４】
本発明で使用されるセルは密閉型のものが好ましいが、密閉型でなくともよく、電場及び磁場に応じて適宜設計することができる。また、セルには微小物体に二次元的な泳動に応じた分画ができる分画部を有することもできる。従来の電気泳動は一次元的な泳動であり、分画することは困難であったが、本発明の電磁泳動は二次元的泳動であることから、分画部、例えば分画のための仕切板を設けた分画部などを設けることにより分離された微小物体を直接分画部に分取することが可能となる。
【００３５】
【実施例】
次に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００３６】
実施例１
（１）装置
縦と横が各々０．２５ｍｍで長さが６ｍｍの図２に示すセルに媒体及び微小物体を入れ、これを図３に示すセルの両端に電極を設けることができるセルホルダーに固定した。電極としては、直径１ｍｍの銀線をテフロンチューブに入れ、これを陽極、白金線を陰極として電気分解を行った。１００μＡの定電流を５〜１０分間流すと、銀線の先端に塩化銀が付着した。これを可逆電極として用いた。媒体及び微小物体の入ったセルをセルホルダーに固定するに際しては、セル内の溶液を密閉し、セル内に溶液を密閉する際には、作業を溶液中で行って気泡の進入を防ぎ、スクリューで締め付けることによって液漏れをなくした。
セルを固定したセルホルダーを電場に垂直方向から磁場がかかるように図４に示す磁石の間にセットした。磁石には縦、横１６ｍｍ、高さ５ｍｍ、表面磁場約０．３Ｔのネオジウム鉄ボロン磁石を用いた。
磁場の中にセットされたセルホルダーを図５に示す顕微鏡に置き、デジタルゲージを設定した。実験に用いた装置の全体像を図５に示す。
セルの両端には電極が接続され、このセルをニ枚の磁石ではさみ、光は顕微鏡内蔵の光源により下からあてた。
【００３７】
図５に示す装置には以下のものが使用された。
（２） 試薬と測定
前記（１）に記載の装置を用いて、粒径が３μｍ、１５μｍポリスチレンラテックス粒子（直径１４．５７１μｍ、標準偏差１．６５７μｍ）（以下、１５μポリスチレン粒子と略す）及び２０μｍポリスチレンラテックス粒子（直径２２．００１μｍ、標準偏差２．７１２μｍ）（以下２０μポリスチレン粒子と略す）である三種類のポリスチレン粒子を微小物体として電磁泳動させた。媒体としては、１ＭＫＣｌ溶液を用いた。これを観測しやすい粒子数に希釈した。試料は晋段は冷蔵保存し、測定する前に室温（２５℃）に戻した。
その結果を図６に示す。図６の縦軸は泳動速度ｖ（μｍ／秒）を示し、横軸は電流ｉ（μＡ）を示している。
【００３９】
実施例２
（１）装置
不均一磁場における電磁泳動の実験を行った。この実験の装置を図８に示す。この実験では、定電圧電源・光学顕微鏡・ＣＣＤカメラ・ブリッグスセル（Ｂｒｉｇｇｓ−Ｃｅｌｌ）一式からなるζ電位測定用（三田村理研工業）の装置を用いた。
ここで便宜上、図８の右上に示したセル（内径７３×２３×１ｍｍ）に座標軸を置いた。長さ方向をＸ軸、幅方向をＹ軸、深さ方向をＺ軸とした。セルはアルミの枠に固定されていて、そのアルミ枠をステージに水平に固定し、ＸＹ方向に平行に動かせるようにした。粒子の泳動の様子は、セルの真上から光学顕微鏡を用いて観察した。倍率は３００倍（接眼レンズ×１５、対物レンズ×２０）であった。この顕微鏡には焦点調整のために目盛のついた微動ネジがついているので、その値から深さを求めた。
【００４０】
この実験に用いた装置を以下に示す。
（２） 試薬
電磁泳動力の違いを見るために、この実験では導電率の異なる二種類の粒子を用いた。絶縁体であるポリスチレンラテックス（カルボキシレート）粒子（以下ポリスチレン粒子と略す）と、導電体の粒子である炭素球粒子である。それぞれの調製方法を以下に示す。
まずポリスチレン粒子（半径１．５μｍ）は、市販のラテックス試料を蒸留水をミリポア（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）によって精製した精製水（以下、水と略す）又はＫＣｌ水溶液で観測しやすい粒子数に希釈したものを用いた（粒子数 ３．３６×１０５個・ｃｍ−３）。実際には１００ｃｍ３の水に対して、ラテックス試料を２０μｌ加えた。試料は晋段は冷蔵保存し、測定する前に室温（２５℃）に戻した。
【００４２】
次に炭素球粒子としてバイオテクリサーチのカーボンカラム・ビーズを用い、約０．０５％（Ｗ／Ｗ）になるように調製した。しかし、水だけでは浮かんでしまい分散しなかったので、中性の界面活性剤であるトリトンＸ−１００を約０．０１％（Ｖ／Ｖ）になるように加え、振とう機で１時間程度振とうさせると、よい分散が得られた。粒子の半径は様々であったが、かなり小さい粒子（半径、約１μｍ）だけはある程度の時間分散していた。実際には１００ｃｍ３の水に対して、．炭素球を約０．０５ｇ、トリトンＸ−１００を１０μｌ加えた。
【００４３】
（３） 電気泳動挙動の測定法
まずあらかじめ測定前に試料のｐＨと導電率を測定する。そしてセルに入れる前に試料をよく撹拌し、セルの内部に空気が残らないようにセルを試料で満たしていく。粒子は水より密度が大きく、徐々に沈んでいくので以降は手際よく測定する。セルに試料を満たした後、ステージに固定し、顕微鏡でまず深さの基準となる溝を探す。次に上の溝から微動ネジを使って定常レベルに合わせ、焦点の合っている粒子をＸＹステージを動かして探す。粒子が見つかったら、ビデオを録画にし、電圧をかける（約５０Ｖ）。泳動挙動を緑画したら、電圧をかけるのを止めビデオを止める。このようにして数個の粒子について測定し、電極の正負を変え、上下の定常レベルについてそれぞれ測定し、この４過程で１つの試料の測定とする。測定した試料はそのままもう一度導電率を測定する。
【００４４】
（４） 電磁泳動挙動の測定法
基本的に前記（３）の電気泳動挙動の測定法と操作は変わらない。変わるのは、セルの下に磁石（１６×１６×５ｍｍ）を設置する点である。この磁石はステージの動きと関係なく常に対物レンズの真下にあるので、顕微鏡の視野内では水平な均一電場に垂直に不均一磁場が存在している（図９）。磁石には非常に強力なネオジム鉄ボロン磁石を用いた（ｌｍｍのガラスを挟んだ上の磁束密度約０．３６Ｔであった。）。
【００４５】
（５） 粘度測定
トリトンＸ−１００を加えたことによって多少セルの中を流れる試料の流れが遅くなったように感じられたので、トリトンＸ−１００水溶液の粘度を調べた。測定にはユベロード粘度計を使い、２５℃における水に対する相対粘度を求めた。
【００４６】
（６） 測定結果
まず、磁場をかけると明らかに粒子の泳動挙動に変化が見られた。粒子は電気泳動の方向とは異なる方向に泳動した。その様子を連続写真に示す（図１０及び１１）。いずれの写真も左側が正極で右側が負極で、ポリスチレンラテックス粒子の映像である。電気泳動では図１０の写真のようにＸ軸方向にのみ泳動しているが、電磁泳動では図１１の写真のようにＹ軸方向にも泳動し、ＫＣｌ濃度が増えるにしたがってＹ軸方向の泳動速度が増した。
図１１の写真のように電磁泳動では、粒子は斜めに泳動する。そこで粒子の泳動速度をＸ軸方向及びＹ軸方向の速度にベクトル分解して、電気泳動との違いについて検討した。
【００４７】
電場に平行な速度成分Ｖｘの泳動移動度のＫＣｌ濃度依存性
Ｘ軸方向の速度成分Ｖｘは電気泳動と同じ方向なので、電気泳動移動度とＶｘから求めた泳動移動度を比較することで磁場による寄与があるか否かを検討した。泳動移動度にしたのは泳動速度では単純な比較ができないからである。その結果を図１２及び１３に示す。同図から分かるように泳動移動度にほとんど違いが見られなかった。この結果から磁場の存在下での泳動におけるＶｘは電気泳動の寄与のみであることが分かった。これは電磁泳動値からが電場と磁場に垂直な方向に働くこととも一致する。
【００４８】
磁場に垂直な速度成分Ｖｙの電流依存性
Ｙ軸方向の速度成分Ｖｙは電気泳動のときには０であった。しかもＶｘは電気泳動だけであったので、このＶｙは電磁泳動そのものであると考えられる。電磁泳動力は電流密度に比例するので、このＶｙを電流に対してプロットした（図１４）。その結果、ポリスチレン、炭素両粒子とも原点を通る同一の直線に近似できた。このことは導電率の全く違う両粒子にもかかわらず、電磁泳動力に差が見られなかったことを示している。
【００４９】
【発明の効果】
本発明の電磁泳動法によれば、微小物体は電場方向のみならず電場と垂直な磁場方向へも移動することから、分子などの微小物体のより詳細な分離・キャラクタリゼーションを行うことができる。また、泳動が二次元的であることから、泳動による分取を簡単に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、均一磁場における微小物体の電磁力と電磁浮力の関係を模式的に示したものである。
【図２】図２は、本発明の実施例１において使用したセルを示すものである。
【図３】図３は、本発明の実施例１において使用したセルホルダーを示すものである。
【図４】図４は、本発明の実施例１において使用したセルホルダーを磁場中に置いたところを示すものである。
【図５】図５は、本発明の実施例１において使用した本発明の装置を示すものである。
【図６】図６は、均一磁場における微小物体の泳動速度と電流の関係の実測値をグラフ化したものである。
【図７】図７は、均一磁場における微小物体の泳動速度と電流の関係の計算値をグラフ化したものである。
【図８】図８は、本発明の実施例２において使用した本発明の装置を示すものである。
【図９】図９は、本発明の実施例２において使用したセルホルダーを磁場に置いたところを示すものである。
【図１０】図１０は、本発明の実施例２における電気泳動の様子を示した、図面に代わる写真である。
【図１１】図１１は、本発明の実施例２における電磁泳動の様子を示した、図面に代わる写真である。最上段はＫＣｌ濃度が０ｍＭの場合で、中段はＫＣｌ濃度が０．１ｍＭの場合で、最下段はＫＣｌ濃度が１ｍＭの場合である。
【図１２】図１２は、本発明の実施例２の電磁泳動における、電場に平行な速度成分Ｖｘの泳動移動度とＫＣｌ濃度の関係を実測値に基づいてグラフ化したものである。白丸印はポリスチレン粒子を示し、黒丸印は炭素粒子を示している。
【図１３】図１３は、本発明の実施例２の電磁泳動における、泳動移動度とＫＣｌ濃度の関係を実測値に基づいてグラフ化したものである。白丸印はポリスチレン粒子を示し、黒丸印は炭素粒子を示している。
【図１４】図１４は、本発明の実施例２の電磁泳動における、電場に垂直な速度成分Ｖｙの泳動速度と電流の関係を実測値に基づいてグラフ化したものである。白丸印はポリスチレン粒子を示し、黒丸印は炭素粒子を示している。
Claims (1)
- 電解質溶液の分散媒中に分散された微小物体に、電流密度を一定にした電場をかけ、かつ、電場と垂直方向に均一磁場をかけて、次の式（１０）
ｖ＝（−４／９）・（μ２Ｈｊ２Ｒ２／η）（（１−ｎ）／（２＋ｎ）） （１０）
（式中、μ２は媒体の透磁率であり、Ｈは磁場の強さであり、ｊ２は媒体中の電流密度であり、ηは媒体の粘度であり、Ｒは微小物体の半径であり、ｎは（微小物体の電気伝導度σ１）／（媒体の電気伝導度σ２）の値である。）
で示される泳動速度ｖに基づく電磁泳動による当該微小物体の電磁泳動に作用する電気伝導度の相違により当該微小物体を分離する方法。
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