JPH05505463A - 増強キャピラリーゾーン電気泳動法及びそれの実施装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はキャピラリー電気泳動分離法に関する。特に、キャピラリーゾーン電気 泳動法、例えばタンパク質とＤＮＡ断片を分離するのに使用されるもの、ミセル の動電学的キャピラリークロマトグラフィー及び関連分割（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏ ｎ）方法が、キャピラリー管に沿って加えられる直線状の電場の他に、管の外側 から内面への手段により管を横切ってｌ又は２以上の電場を加えることによって 増強される。こうした電位を管を横切る形で適用することにより巨大分子、例え ばタンパク質の吸着を実質的に防止し、かつ電気浸透流速の制御を可能にし、分 離分割及び効率を向上させる。

背景技術 キャピラリーゾーン電気泳動法（ＣＺＥ）によれば、電気泳動の解像力並びに高 速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）の容易さ及び速度によって、組換えタン パク質、合成ペプチドの純度評価、血清タンパク質の研究、ＤＮＡ断片の評価、 生物学的分解、薬剤分析、抗体のモニターリング及び生物学的に活性なペプチド の研究を行うことかできる。低容量能力、高分離効率及び高感度検知という機構 であることがらＣＺＥは今日のバイオインダストリーにおいて非常に要求の高い 分析生物工学の強力な手段である。

ＣＺＥの基本的な問題は電気浸透、即ち加えた電場内での溶媒の流れの制御であ る。二元電解質を含む通常の水溶液の条件下では、シリカの表面には表面官能基 のイオン化に起因する過剰のアニオン電荷が存在する。これらのアニオンに対す るカチオン対イオンはキャピラリー壁に隣接する拡散層中に存在する。

該拡散層を横切る電位はゼータ電位といわれる。これらの水和したカチオンはカ ソード（陰極）へ向かって移動し、溶媒を引きずって行く。従って、電気浸透の 流れの方向及び速度は、キャピラリー壁でのゼータ電位の極性及び大きさに依存 する。

電気浸透流は溶質かキャピラリー内に存在する時間の長さに影響を与える。この 意味において、分離効率も解像も、電気浸透の方向及び流速に関係がある。仮に 電気浸透流速が大きく、かつ電気浸透の方向か緩衝液中の全アニオンの電気泳動 による移動度の方向と反対であるならば、全てのイオンは同方向へ移動するであ ろう。従って、電気浸透は、電気浸透流に反抗して移動するアニオンに対してよ り良好な解像結果をもたらす。逆に、こうした条件下では、カチオンの解像はよ り劣ったものとなる。

事実、非常に近似した移動度を有する物質は、電気浸透流を電気泳動移動に対し て均衡させると解像を良好に行うことができる。本願発明によれば、こうした制 御が提供される。

電気浸透を制御することだけでなく、微少量のタンパク質試料かキャピラリー壁 の上に吸着されることにより、ＣＺＥのタンパク質分離は面倒なものとなる。こ のような相互作用はバンドのブロード化及びテーリングをもたらし、大きく分離 効率を低下させる。かかる吸着を取り除く報告されている試みは、シラン誘導に より、並びにメチルセルロースでキャピラリー壁を物理的にコートしてシリカキ ャピラリーを不活性化するものである。ギヤピラリ−表面不活性化の再現性は本 来的に困難であるので、タンパク質／キャピラリー間の相互作用の動的減少（ｄ ｙｍａｎｉｃ　ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）を利用する代替方法（複数）か開発されて いる。これらの方法は、分離緩衝液に化学試薬を添加すること、並びにタンパク 質及びシリカキャピラリー壁土の電荷を操作してクーロン斥力により吸着を防止 することからなるものである。

同様にキャピラリー動電学か、イオン性分子種のみてなく非イオン性混合物をミ セルに伴う隔壁現像により解像することに使用されている。ミセルの使用を伴う 方法はミセル動電学的キャピラリークロマトグラフィー（ＭＥＣＣ）と呼ばれて いる。例えばウオーリングフォード（Ｗａｌｌｉｎｇ　ｆｏｒｄ）ほか、ジャー ナル・オブ・クロマトグラフィー、４４１、第２９９頁以降（１９８８）参照。

発明の開示 キャピラリー電気泳動法が、キャピラリーの内壁に電位を加えることにより改良 される。この改良はその内部で電気泳動を行わせるキャピラリー管の外側に配さ れた導電部材を横切る形で電場を適用することでなされる。この外部電場は内部 に適用される直線状電場と結合してキャピラリーの側壁を横切る電場を生じる。

管に沿う、側壁での該電位は側壁の内面における表面（ゼータ）を位の極性、大 きさを制御する。実際、関心のあるイオンを斥けあるいは引きつけるし、巨大分 子を該表面から斥け、キャピラリー壁への吸着を防止する。

同時に、電気浸透流の方向と流速を、キャピラリーの外側から加えられる外部電 場を用いて制御することができる。というのは、電気浸透流の方向及び流速は表 面（ゼータ）電位の極性及び大きさに依存しているからである。これにより、分 離しようとする分子の電場での滞留時間を大きく高めることができ、その結果数 方法の解像が高まる。このようにして、キャピラリー管の外側から内側へ電場を 加える手段を付加し従来の装置を改良するか、該手段はキャピラリー管の外側上 に配置され、前記電場を創出するように電位差手段に電気的に接続される。

ＤＮＡ分割は電気浸透を阻害することにより向上する。さらに、ＤＮＡ断片分離 の間電気浸透の速度を動的に制御すると、解像力（ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ　ｐｏｗ ｅｒ）が高められる。大きなりＮＡ断片の分離分割を高分離中、アノードからカ ソードへのよりゆっくりした電気浸透が初期段階で適用される。これにより、相 対的に大きなりＮＡ断片がキャピラリー内に保持され、分離ゾーンにより長い時 間が与えられる。その大きなりＮＡ断片が検知器を移動すると、次に、加えられ ている電場に決定されるより速い電気浸透が相対的に小さなりＮＡ断片の分析時 間を減少させるように適用される。というのは、小さいＤＮＡ断片は大きな電気 泳動移動度差を有するので、分離ゾーンに要する時間がより短いからである。

電気浸透の速度（必要ならその方向さえも）を変化させ得る能力は、分離分割及 び効率を強力に高め、生体分子について革新的な分離結果を達成する手段を提供 する。

特定の実施態様においては、キャピラリー管の外面に例えば金属ゴーイングのよ うな導電性コーティングが設けられ、該コーティングの一端は高電圧電源に接続 される。該コーティングはキャピラリーの他端で適当な抵抗器を介して接地され る。電源から電圧を印加すると該導電性コーティングに電流か流れる。

適切な抵抗器の抵抗値は、外部導電性コーティングに沿うどの部分の電位もキャ ピラリー内部の電解質溶液の電位と一定率で異なったものとなるような値である 。キャピラリーの内外間のかかる電位差により、キャピラリーの長さ方向に沿っ て均一かつ一定である電場がキャピラリーを横切る形で生じる。キャピラリーの 側壁を横切るこの電場により、側壁内面の表面（ゼータ）を位の極性及び大きさ が制御される。これにより、吸着か防止され、現在必要とされている手の込んだ 複雑な装置ではなく、簡単な融着シリカ管の使用か可能になる。電気浸透流の方 向、速度は表面（ゼータ）電位の極性及び大きさに依存するので、こうした外部 電場の適用により、キャピラリー管を通る電気浸透流が高められ、遅延させられ 、及び／又はその方向が変更させられる。電気浸透の方向及び流速が操作可能で あると、分離、解像が高められる。

発明の詳細な説明 図１は装置に一実施態様を図解した説明図で、外部電場を印加するための導電性 部材をキャピラリー管の外側に備えている。

図２は図１の装置の説明図で、様々な接続、電圧及びそれにより生しる電気浸透 流を示す。

図３は、そのいずれにも均一に電圧か加えられる複数の導電性部材を備える、別 の実施態様の説明図である。

図４は、図３の装置の説明図であって、導電性部材が別々に独立した電圧源に接 続されている場合を示す。

図５は、本発明の別の実施態様の説明図であって、異なる二つの方式（ａ）及び （ｂ）で接続された状態を示す。

発明を実施するための最良の実施態様 本発明は、ＤＮＡ断片、タンパク質及びポリペプチド、並びに通常中性でイオン 性の分子の分離を初めとし、しかしこれらに限定されない広範囲の種々の溶液及 び懸濁液の電気泳動解像に使用することかできるキャピラリー電気泳動装置の提 供を目的とする。

本発明の増強キャピラリーゾーン電気泳動装置及び方法は、電気泳動の分離力並 びに高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）の容易さと速度てもって、組換え蛋 白質に品質管理、合成ペプチドの純度評価、血清蛋白質の研究、ＤＮＡ断片の評 価、生物学的分解（ｄｅｇｒａｄａｔ　１ｏｎ）チェック、薬剤分析、抗体のモ ニタリング及び生物学的に活性なペプチドの研究等の多様な作業を行うのに利用 することができる。少容量能力、高分離効率及び高感度検知機構により、ＣＺＥ は今日のバイオ産業にとり重要な要求となっている、分析バイオテクノロジーの 強力な方法となる。

該装置のキャピラリーは単純な溶融シリカ管でよい。プラスチック、シリカ又は 他の非導電性材料からなる他のキャピラリーも同様に使用することができる。該 装置を使用して行われる方法では分子の内壁への吸着は低減され、実質的に防止 されるので、内部コーティングは必要ない。しかし、勿論、意図される特定の応 用においてこのようなコーティングが必要であれば用いることができる。

キャピラリー管は、キャピラリー管の内部に対して外側に導電性部材を有する。

これは、導電性部材を管の外表面上、肢管の厚みの範囲内に、あるいは肢管の外 表面から後退させた位置に配置できるようにと意図されたものである。したがっ て、肢管にはその外表面に塗布された金属製のすなわち導電性のコーティングを 備えてもよい。代表的には、例えば金属又は金属酸化物の真空蒸気堆積法をこの ために利用することかできる。あるいは、コストが納得できる場合には、肢管の 内部表面上に存在しないように肢管をその厚さの範囲内で導電性部材で作製して もよい。このような導電性部材としては、管の厚みの範囲内に成形された金属も しくは炭素／グラファイト繊維からなる層であって、ある種の発電機への接続用 に外部へ延びる延長部分を有するものか挙げられる。

簡単な別の実施態様では、キャピラリー管は外部容器に嵌め込んでもよく、間の 環状部は導電性液体、例えばある種の緩衝液、で満たされる。したがって、キャ ピラリー管の内表面に対し離れた外部にある導電性部材の性質、配置は重要では なく、ここに記載の実施態様のいずれの均等物も本発明に用いることができる。

好ましい実施態様では、キャピラリー管の外表面の周囲に実際にコートもしくは 接着された導電性部材の作製を伴う。

本願でクレームした発明のキャピラリー電気泳動装置の使用は、管を横切る外部 電場を適用する以外は、従来のキャピラリー電気泳動方法と実質的に相違がない 。したがって、図１において、通常の長さ、直径（内径　１ｍｍ未満、長さ　代 表的にはｌＯ〜１．０００　ｍｍ）の管１０か選択された緩衝液で満たされる。

管の両端は同じ緩衝液か入っている溜１００と１０２につながっている。

溜１００に分離しようとする混合物を含む溶液又は懸濁液か注入、サイホン等に より加えられる。溜１００は電圧源に接続され、他方の１０２は電極又はその他 の電気的接続手段で接地される。試料か導入されない溜には、溶質移動の時間及 び量を測定するにある種の検知器（図示せず）がある。試料溜、即ち検知器か設 けられた溜、をプラスあるいはマイナスの電圧源に接続するかの決定は、主に、 注目している粒子の電荷、電気浸透流の方向を決定する印加電圧の方向に基づい て行われる。

本願発明によると、両溜を電圧源に接続するほかに、管の内表面に対し外側に導 電性部材１０４か管に沿って存在し、電圧源に接続されていて、電気を印加され るとこれら部材がキャピラリーの外部を横切る外部電場を創り出す。外部電位Ｖ ｏとキャピラリー内部の電位Ｖｉとの間に差があると、キャピラリー管を横切っ て電位の傾きがが働く。図示するように、Ｒ１は電圧源に接続され、一方Ｒ３は 接地される。Ｒ２／Ｒ１の比は、電位の傾き、即ち、外部電位Ｖｏと内部電位ｖ ｉとの差を決定する。Ｒ３の抵抗値によって、導電性部材１０４でコートされた キャピラリーの長さ方向に沿って、キャピラリーを横切る電位の傾きが確実に均 一かつ一定なものとなる。

キャピラリーの内部を横切る形での外部電場の実際の適用は、複数のやり方か可 能である。一実施態様においては、キャピラリー管が、管の開放端にある溜に設 けられた緩衝液と同一の緩衝液の環状の溜を通過し、しかし該溜と液通はしない 。このような環状の溜に直線状の場と同一の値の電圧を印加すると、電気浸透流 の流速は約１／３にシャープに低下する。印加直線状電位■１か５．５ｋＶであ る場合、キャピラリー管がそこを通り、しかしそれとは液通していない導電性部 材により外部電位Ｖｏを適用すると約８ｋＶの電気浸透流を約３倍低下させる。

キャピラリー管の外側周囲の導電性部材に高い電圧を適用すると、電気浸透流の 実質的に停止させることができ、さらに高い電圧を加えると電気浸透流の方向が 逆転する。勿論、反対の極性の電位を適用すると電気浸透流を増強することがで きる。したがって、どんな装置の液流条件も本発明により具体的に仕立てて高い 分割を達成することができる。

外部電場を図５に示す装置で実際に適用した。長さ２０ｃｍのキャピラリー（ポ リマイクロ・チクノロシーズ、インク、アリシナ州フェニックス）であって外径 ７５ミクロンのものを長さ１７ｃｍのより大きなキャピラリー（内径５３０ミク ロン、外径６３０　ミクロン）の中に入れた。小さいはう（内部）のキャピラリ ーを溜ｌと溜４の間に固定し、大きいほう（外部）のキャピラリーを溜２と溜３ の間に固定した。内部及び外部のキャピラリーの両方について外表面上のポリア ミドコーティング−を濃硫酸を用いて除去した。シリンジを溜ｌとして、かつ内 部キャピラリーから気泡を吹き飛ばすポンプ装置として使用した。プラチナ線電 極をこれら四つの溜全部に取りつけた。

溜２、溜３並びに内部キャピラリーと外部キャピラリーとの間の環状部にｐＨ約 ６の０．００２Ｍリン酸カリウム緩衝液を充填した。高電圧供給源を溜２または 溜３に接続し、外部電場を二つのキャピラリー間の環状空間に加えられるように なっている。

ピペット真空ポンプを使用して内部及び外部キャピラリーの間の環状部での液体 の流れを加速した。これは、外部電場の適用によって発生する余分の熱を除去す るように環状部での熱移動を促進する。溜１を溜４と接続する別の高電圧供給源 で内部キャピラリーの内側に電場（内部）を加えた。調整自在の抵抗器Ｒ３て、 溜２と溜３の間の１７ｃｍの長さの環状部に沿って、内部電場と外部電場との間 に様々な電位の傾きを形成することかできた。内部キャピラリー内における電気 浸透流の方向及び速度に生じた変化を、ザレ（Ｚａｒｅ）ほかによって開発され た電流測定法により測定した。

電気浸透流の方向及び大きさに対する外部電場の影響を表１にまとめる。溜ｌか ら溜４への電気浸透の流速は１７ｃｍの長さ環状部にわたる外部電場と内部電場 との間の一５ｋＶの電位の傾きにより３．７３から＋０．２２ｃｍ／ｍｉｎ増加 した。外部電場と内部電場との間に０から５ｋＶの正の電位傾きを与えると電気 浸透の流速を低下しはじめ、実質的に電気浸透流を停止させる。電気浸透流の方 向はさらに高い正の電位傾き、６ｋＶ、を溜４から１１１に与えると逆転させる ことさえ可能である。

水と内部キャピラリーとの界面におけるゼータ電位の絶対値は計算される。内部 電場のカソード端は溜４ないに設置される。

したかって、電気浸透の方向か溜１から溜４の方向である場合にはゼータ電位は 負であろう。該ゼータ電位は外部電場のない一２９ｍＶから一５ｋＶの電位傾き のある−３５　ｍＶに変化する。ゼータ電位の絶対値は外部電場のない−２９ｍ Ｖから＋５ｋＶの電位傾きでのＯｍＶに減少する。ゼータ電位の極性は＋６ｋＶ の電位傾きで逆転させることができる。

表　１ 外部電場の電気泳動に対する影響 １°ｌｖ目、　溜１での内部電位；　Ｖｉ２．　内部キャピラリーと外部キャピ ラリーとの間の環状部（溜２内の）の始まりにおける内部電位：　ｖｉ３．　環 状部の終り（溜３）における内部電位。Ｖｉ２とＶｉ３は内部キャピラリー内に 直線的な電位傾きを仮定して見積もられる。

Ｌｂ’　ＶＯ２，環状部の始まりにおける外部電位；　Ｖｏ３．　環状部の終り における外部電位。

（ＣＩＶＯ２−Ｖｉ２　又ハＶｉ３−　Ｖｉ３　ｏ　傾キｆ；を環状部ヲ通シテ 均一である。

＋ｄ＋　溜４内にカソード端を育する内部キャピラリーにての電気浸透、十　溜 ｌから溜４へ、−溜４から１へ。

３°１試験装置については図５ｂ参照。Ｒ３＝０゜＋ｌｌ試験装置については図 ５ａ参照。Ｒ３の値は、１７ａｍの長い環状部に沿って、内部電場と外部電場と の間に均一な電位傾きが得られるような値である。

図３に示すように、キャピラリーを横切る形で電場を適用する手段を構成する導 電性部材は一体のものである必要はない。

図３において、該手段は、キャピラリーの回りに周囲を取り巻（ように再び真空 コーティング法等によって堆積させた複数の導電性リングからなる。一般に、モ してＣＺＥに対しては特にそうであるか、外部電場と内部電場との間には一定の 電位傾きを維持することか望ましい。したがって、図３では、すべての導電性リ ング１０５（均一抵抗器という）がただ一つの電源に接続されていて、管１０を 横切る均一な傾きを形成する。

他の応用においては、管に沿う傾きを変更するのが望ましいこともある。このよ うな方法は図３に示す実施態様で実施することができ、各リング１０５、又は一 群のリング１０５を、独立に調節可能な別々の電源に接続される。管を横切って 加えられる電場をそのように変えることによって、電気浸透流と電気泳動の移動 度の異なる複数のゾーンを創り出すことができ、解像を向上させることができる 。

リングや他の途切れている導電性部材を使用する時は、リング間の長さ方向の間 隔を管の壁厚より小さくするのか好ましい。

キャピラリーの外部に加えられる電位源のインピーダンスは、該キャピラリーの 全長にわたって、キャピラリー内部の電解質溶液の電位源のインピーダンスに対 し小さくなければならない。

本発明を一般的記載及び具体的実施態様の説明により開示した。当業者は特別の 発明的な技術を行使しなくてもさらに改変した実施態様に想到するであろう。特 に、材料、組成、電圧値、寸法等は特記しない限り非限定的なものである。本発 明は、下に示す請求の範囲に記載したパラメータ以外は非限定のものである。

Ｆ’ｌＧ−７ Ｒ１＝　Ｒ２，Ｖｏ　＝　Ｖｉ　Ｒ１＝　Ｒ２，Ｖｏ　＝　ＶｉＦＩＧ−２α　 Ｆ’ＩＣニー２ｄ Ｒ１＜　Ｒ２，Ｖｏ　＞　Ｖｉ　Ｒｉ　＜　Ｒ２，Ｖｏ　＞　ＶｉＦ’ＩＣニー ２６　ＦＩＣ：、　２ｅ Ｒ１＜＜　Ｒ２，Ｖｏ　＞＞　Ｖｉ　Ｒ１＜＜　Ｒ２，Ｖｏ　＞＞　ＶｉＦＩＣ ，２ｃ　Ｉ’ＩＣ−２ｆ Ｆ’ＩＣ，３ ＦＩＣニー４ 要約書 増強キャピラリーゾーン電気泳動及びそれの実施装置キャピラリーゾーン電気泳 動がキャピラリー管の内部を横切る電場の適用により増強される。この外部電場 はキャピラリー管の外側にある導電性部材により加えられる。該外部電場は内部 電場とベクトル結合し、キャピラリー内面における表面（ゼータ）電位の極性と 大きさを制御する。表面（ゼータ）電位の制御により、巨大分子とキャピラリー 表面との間の静電的反発を誘起され、巨大分子のキャピラリー管内面への吸着が 低減される。さらに、表面（ゼータ）を位の制御により、前記電場の大きさに応 じて、電気浸透流を抑制でき、逆転さえさせることができる。

国際調査報告

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．内面及び二つの対向する端部を決定するキャピラリー管と、直線状電場を前 記キャピラリー管の端部に適用する手段と、前記のキャピラリー管の内面に対し 外側にある導電性部材とを備えてなり、前記導電性部材が該部材を電源に接続す る手段を備えていて、該接続がなされると該部材の近傍に前記キャピラリー管を 横切る電場が創り出される、キャピラリーゾーン電気泳動の実施装置。
2. ２．溶液又は懸濁液のキャピラリー電気泳動を実施する方法であって、 １）キャピラリー壁に包まれた前記の溶液又は懸濁液が充填されている内部を有 するキャピラリー管の長さを横切る形で内部電場を内側に適用し、 ２）前記のキャピラリー管の内部に対し外側にある導電性部材によって、該キャ ピラリー管の内部を横切る形で電場を外側に適用し、 ３）このとき、内部電場と外部電場との間の電位差が，前記管の長さに沿って、 キャピラリー壁を垂直に横切る電場を生成し、そして、 ４）これらの電場の作用下で前記溶液を電気泳動に供する、工程を備える方法。
3. ３．請求の範囲第１項の装置であって、前記キャピラリー管が外表面を決定し、 前記電導性部材が前記キャピラリー管外表面上に導電性材料からなるコーティン グを備えている装置。
4. ４．請求の範囲第３項の装置であって、前記導電性コーティングが導電性ポリマ ーを有する装置。
5. ５．請求の範囲第３項の装置であって、前記導電性コーティングが金属又は金属 の合金を有する装置。
6. ６．請求の範囲第１項の装置であって、前記導電性部材が該管の外面に沿って長 さ方向に間隔をおいて配置された複数の外周を取り巻くリングを有するものであ る装置。
7. ７．請求の範囲第１項の装置であって、前記導電性部材が前記キャピラリー管を 取り囲むイオン性液体を有するものである装置。
8. ８．請求の範囲第７項の装置であって、前記イオン性液体が前記キャピラリー管 を取り囲みかつ該キャピラリー管との間に環状空間を形成する液密の閉鎖容器に よって該キャピラリー管の回りに保持され、さらに前記の環状空間には前記のイ オン性液体が充填されている装置。
9. ９．請求の範囲第２項の方法であって、前記溶液が生体分子を含有するものであ る方法。
10. １０．請求の範囲第２項の方法であって、前記溶液がタンパク質分子を含有する ものである方法。
11. １１．請求の範囲第２項の方法であって、さらに、前記懸濁液中にミセル形成す る工程を有し、該ミセルはミセル動電学的キャピラリークロマトグラフィーによ り解像されるものである方法。
12. １２．請求の範囲第２項の方法であって、前記粒子がキャピラリーゾーン電気泳 動により解像される方法。