SE506461C2 - Förfarande för storleksfraktionering av molekyler med hög molekylvikt, med användande av elektroosmotiskt flöde i en kapillärtub - Google Patents

Description

sne 461 2 10 l5 20 25 30 35 en packad kolonn eller i en öppen rörformig mikrokapillär R.; J.; Anal.Chem. 58 (86) 3036) under användning av ett enkelt lösningsmedel (Tijssen, Bos, van Kreveld, M.E., för masstransport. Separationen beror på närvaron av en tryckinducerad hastighetsprofil med Poisseuille-flöde el- ler Taylor-flöde inne i röret, vari stora partiklar på basis av sin storlek exkluderas från de långsammaste strömningslinjerna närmast väggen. Detta medför att de Elektrostatiska effek- ter, speciellt uttalade i buffertar av låg jonstyrka, kan elueras före de mindre analyterna. även påverka denna separationsprocess (DosRamos, G.J.; Silebi, C.A., J.Colloid Interface Sci. 133 (89) 302) ge- nom en elektrisk dubbelskiktrepulsion mellan laddade ytor och analyter.

Det är välkänt att det elektrokinetiska bulkflödes- beteendet i en kapillär påverkas genom egenskaper hos det elektriska dubbelskikt som föreligger nära intill den ka- pillära innerytan. Kapillära elektroforesseparationer ut- föres vanligen i rör med en radie av 25-50 um och i buf- fertar med saltkoncentrationer inom mM-området. När en spänning appliceras över en sådan kapillär är den obser- verade elektroosmotiska flödesprofilen i huvudsak platt J.W.; K.D., 218 (81) 209) och överlagras den elektroforetiska separationen.

(Jorgensson, Lukacs, J.Chromatogr.

Teoretiska beräkningar har emellertid visat, att det är möjligt att erhålla en elektroosmotisk flödeshastighets- profil liknande det tryckinducerade Poisseuille-flödet i rör med små innerdiametrar och vätskemedia med låga C.L.; Whitehead, R., J.Phys.Chem. 69 Enligt dessa beräkningar alstras en nära pa- jonstyrkor (Rice, (65) 4017). rabolisk flödesprofil när de radiellt motstående elek- triska dubbelskikten börjar överlappa varandra.

Ett ändamål med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ny teknik, varmed de med den kända tekniken såsom diskuterats ovan förknippade problemen elimineras eller åtminstone väsentligt reduceras.

Ett annat ändamål med föreliggande uppfinning är att 15 20 25 30 35 3 sos 4e1 åstadkomma ett förfarande för storleksfraktionering av molekyler med hög molekylvikt, vilket förfarande baseras på användning av ett elektroosmotiskt flöde av nämnda mo- lekyler innehàllna i en buffert, företrädesvis med låg jonstyrka, såsom mindre än ca 10 mM. Den undre gränsen bestämmes av kravet att det elektriska dubbelskiktet nätt och jämnt etableras. Ännu ett ändamål med uppfinningen är att åstadkomma ett förfarande för sådan storleksfraktionering av ett spektrum av molekyler under användning av mycket trånga kapillära rör med innerdiametrar av mindre än ca l nM.

Ytterligare ett ändamål med uppfinningen är att åstadkomma separation av molekyler med hög molekylv;kt,= varav de större har tvärsnittsdimensioner som närmar sig innerdimensionerna hos de använda kapillärrören. _ Ännu ett ändamål med uppfinningen är att åstadkomma ett förfarande, varigenom ett acceptabelt flöde i ett ka- pillärrör kan alstras som ej kunde erhållas genom att tillgripa hydrodynamisk separation under användning av ett externt inloppstryck.

För dessa och andra ändamål som kommer att förstås genom följande framställning åstadkommes genom uppfin- ningen ett förfarande för storleksfraktionering av mole- kyler med hög molekylvikt under användning av ett elek- troosmotiskt flöde av nämnda molekyler innehàllna iïen buffert av låg jonstyrka, varvid nämnda förfarande utfö¥ res i ett kapillärrör. Uppfinningen baserar sig på sär- draget av att använda ett kapillärrör som har en innerdi- ameter, vilken ej överstiger de största molekylernas" tvärsnittsstorlek med en faktor större än ca 10.

I föreliggande framställning betyder uttrycket ”tvärsnittsstorlek” bruttodimensionen i ett plan vinkel~ rätt mot kapillärrörets längdriktning under driftbeting; elser.

Ett föredraget operativt intervall för en sådan fak- tor är från ca 2 till ca 10. Även om detta intervall en+ dast är föredraget kan en faktor av mindre än 2 reducera 10 15 20 25 30 35 den fria rörligheten hos större molekyler, medan vid fak- torer överstigande lO fraktioneringseffektiviteten tende- rar att minska.

Uttryckt i absoluta tal är det föredraget att inner- diametern av de använda kapillärrören företrädesvis är mindre än ca 1 um och kan speciellt vara ca 500 nm eller mindre.

Den undre gränsen för innerdiametern för de vid fraktioneringsprocessen använda kapillärrören är ej spe- ciellt kritisk och kan vara väsentligt mindre än 500 nm.

I praktiken begränsas den undre gränsen måhända av möj- ligheten att åstadkomma mycket små diametrar medan an- vändbara kapillärrör ändå erhålles.

Rörlängden kan variera inom mycket vida gränser och ett praktiskt område kan vara från ca 10 cm till ca 10 m, varvid ett speciellt föredraget område är från ca 20 cm till ca 2 m.

Med avseende på fraktioneringen av molekyler bärande en elektrisk laddning är det enligt en utföringsform av uppfinningen med användning av laddade molekyler nödvän- digt att molekylerna har ett nettoladdningstecken som är detsamma som det för kapillärrörets vägg. Genom ett så- dant arrangemang erhålles en fraktionering varigenom mindre molekyler rör sig snabbare än stora molekyler.

Om å andra sidan de molekyler som skall separeras är i huvudsak oladdade resulterar förfarandet i en situation där stora molekyler rör sig snabbare än små molekyler.

De molekyler som skall separeras genom användning av förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan ha en mo- lekylstorlek som varierar inom mycket vida gränser. Mole- kylvikten kan sålunda variera från storleksordningen 106 och kan uppnå mycket höga värden, såsom flera tiotal mil- lioner och t o m upp till flera miljarder. Vilka som helst högmolekylära molekyler kan separeras under till- gripande av tekniken enligt föreliggande uppfinning, och som exempel kan nämnas proteiner, DNA, RNA, polysackari- der, organiska polymerer etc. Föreliggande uppfinning är 10 15 20 25 30 35 5 sne 461 speciellt lämpad för fraktionering av molekyler tillhö- rande det biotekniska omràdet, såsom proteiner, DNA:n och RNA:n.

Föreliggande uppfinning är sålunda baserad på det nya konceptet med tillgripande av användning av ett elek- troosmotiskt flöde, varigenom flödesprofilen utnyttjas för storleksfraktionering. Detta àstadkommes genom an- vändning av mycket smala kapillärrör inom en diameterdi- mension inom nanometerområdet. Màlanalyterna är molekyler med molekylstorlekar som nästan närmar sig kapillärrörets innerdiameter. Det är föredraget att använda en buffert av låg jonstyrka, och ett elektriskt fält appliceras_över kapillärröret för att framdriva vätskeseparationsmediet genom röret. Det betonas åter att det ej är lämpligt att använda ett internt inloppstryck för att alstra den er- forderliga flödet i en kapillär av sådan dimensionf Tryckdriven hydrodynamisk separation är med andra ord ej praktiskt användbar för att åstadkomma den önskade frak- tioneringen. ä I V Föreliggande uppfinning kommer nu att ytterligare illustreras mera i detalj under hänvisning till bifàgda ritningar, vari: Fig. l är en schematisk illustration av flödesbe- tingelserna i ett kapillärrör, där de molekyler som ska fraktioneras har en laddning av samma tecken som den för de omgivande kapillärinnerväggarna; un Fig. 2 är en motsvarande illustration, där neutrala eller oladdade molekyler underkastas fraktionering; Fig. 3A är ett diagram som visar separation i enlig- het med uppfinningen vid 4 olika jonstyrkor i de använda buffertlösningarna; Fig. 3B visar storlekarna av de molekylära fraktio- nerna av den använda blandningen angivna i tusental bas- (kbp); Fig. 4A visar ett diagram över fraktioneringen av en par blandning av molekyler under användning av uppfinningen: och 506 461 6 10 15 20 25 30 35 Fig. 4B visar storlekarna av molekylerna i nämnda blandning àtergivna i kbp.

Två huvudtyper för det nya separationssystemet kan särskiljas, vilka baseras pà olika mekanismer.

Figur 1 visar den första typen, där analyterna har en nettoladdning med samma laddningstecken som kapillär- väggen. Figur 1 illustrerar med andra ord schematiskt principen med en separation baserad pà närvaro av en dif- ferentiell elektroosmotisk flödesprofil och en repelle- rande elektrostatisk kraft. En storleksseparation mellan de mindre molekylerna (1) och de större molekylerna (2) i analyten beror på den hastighetsskillnad som de två kom- ponenterna underkastas genom att de upptar en olikartad (4). porten av analyterna genom elektroosmotiskt flöde (3) del av tvärsnitts-ytan i kapillärröret Under trans- tvingas de samtidigt mot kapillärens centrum genom en elektrostatisk repulsion som utövas av de laddade kapil- lärväggarna (feta pilar, Fig. 1). Molekylens hastighet kan genom en första approximation beräknas genom integre- ring av dess hastighetskomponenter i olika strömningslin- jer över dess tvärsnitt och dividering av det erhållna värdet med dess tvärsnittsyta. De större komponenterna (2) kommer att påverkas mera av de långsammare ström- ningslinjerna närmare kapillärväggarna och kommer därför att inbromsas jämfört med de mindre komponenterna. De elektrostatiska krafter som repellerar negativt laddade molekyler bort från kapillärväggen och fokuserar dem i potentialkällan i kapillärens centrum nedbringar även möjligheten för skadlig provadsorption.

I den andra typen kan oladdade molekyler separeras genom samma mekanism som vid hydrodynamisk kromatografi, såsom illustreras i Figur 2. Denna figur illustrerar så- lunda schematiskt principen för separationsmekanismen för HDC i kapillärrör. De större partiklarna är i större ut- sträckning steriskt hindrade från att nå de làngsammaste strömningslinjerna nära väggen av en cylindrisk kapillär.

Här är elueringsordningen omkastad jämförd med i det 10 15 20 25 30 35 7 5Û6;461 första fallet. Eftersom molekylerna ej underkastas elek- trostatisk repellering från kapillärväggen kommer de att fördelas statistiskt över kapillärens hela tvärsnitt, varvid drivkraften utgöres av molekylär diffusion; Mole- kyler med en radie inom storleksomràdet för kapillärens innerdiameter kommer att fraktioneras alltefter storlek, eftersom hela tvärsnittet hos de mindre molekylerna kan uppehålla sig även i de långsammare regionerna näfa väg- gen, vilket ej är möjligt för de större molekylerna. I motsats till situationen i det första fallet kommer de sålunda att transporteras med lägre hastighet än de stör- re molekylerna. Denna separationsprincip är på ett grund- läggande sätt likartad den klassiska hydrodynamiska kro- matografin. Den väsentliga skillnaden som ligger i före- liggande uppfinning är emellertid det sätt varpå flödet alstras för àstadkommande av den hydrodynamiska separa- tionen. Exklusionsskiktet för smà partiklar illustreras i figur 2 med den övre streckade linjen, medan exklusions- skiktet för stora partiklar illustreras med den streckade linjen nedtill i figuren.

Den första typen som illustreras i Figur 1, där lad- dade molekyler separeras, är speciellt riktad mot store leksseparation med fritt flöde av stora biomolekyler, så- som DNA, i ett pulslöst elektriskt fält. Uppfinningen är emellertid ej inskränkt till denna speciella tillämpning.

Uppfinningen kommer nu att ytterligare illustreras genom exempel under hänvisning till figurerna 3A, SB, 4A och 4B, men det bör observeras, att dessa exempel ej är avsedda att inskränka uppfinningens omfattning.

EXEMPBL 1 I detta exempel användes en blandning av lamda-DNA- fragment digererade under användning av Bind III i en koncentration av 0,7 ng/pl. Denna blandnings sammansätt- ning återges i Figur 3B, varvid de respektive talen avser kilobaspar.

Storleksfraktioneringen i enlighet med föreliggande 506 10 15 20 25 30 35 461 8 uppfinning utföres under användning av kapillärrör med en ytterdiameter av 40 um och en innerdiameter av 0,5 um.

Kapillärrörets aktiva längd är 60 cm. Kapillärrören fyl- les från början med en boratbuffert, vars jonstyrka vari- eras från 50 mM ned till 50 uM, Varje kapillär innehållande från början boratbuffert fyl- såsom visas i Figur 3A. les sedan vid dess ena ände med DNA-blandningen genom elektrokinetisk injektion från den ena änden under 8 se- kunder vid en pàlagd spänning av 4700 V.

De sålunda fyllda kapillärrören underkastas därefter storleksfraktionering av innehàllna analyter i enlighet med föreliggande uppfinning under användning av en sepa- rationsspänning över röret av +10 000 V, en fältstyrka av ca 170 V/cm, och resultatet av fraktioneringen bestämmes genom användning av laserinducerad fluorescensdetekte- ring. För detekteringen färgas DNA-fragmenten före fyll- ningen först med en bis-interkalator YoYo (Molecular Pro- bes, Eugene OR, USA). En Ar+-laserinducerad detektor med konfokal fluroescens (488 nm exitation) användes som de- tekteringsanordning.

Figur 3 visar resultaten av fraktioneringen utförd i enlighet med föreliggande uppfinning, och det framgår att sänkning av jonstyrkan hos den använda bufferten resulte- rar i förbättrad separation. En jonstyrka av 50 uM ger sålunda effektiv separation av DNA-molekylerna, en sepa- ration som ej kunde uppnås genom att tillgripa hydrodyna- misk separation av konventionellt slag, eftersom ett ka- pillärrör med en innerdiameter av ca 0,5 uM ej genom ex- ternt applicerat tryck kunde åstadkomma ett användbart flöde genom kapillären så att en praktiskt användbar se- paration kunde uppnås.

EXEMPEL 2 Ett experiment liknande det i Exempel 1 ovan be- skrivna utföres med användning av en guideline GX-174 ladder som DNA-fragmentblandning med en sammansättning enligt Figur 4B, åter angiven som kbp. I detta exempel 10 15 20 25 30 35 9 2 soei4e1 användes en jonstyrka hos bufferten av 50 uM, och injek- tionen av provet utföres i 25 sekunder vid en applicerad spänning av 4000 V. Själva separationen utföres vid en applicerad spänning om 2000 V.

Figur 4A visar resultatet av separationen utförd i enlighet med föreliggande uppfinning, och såsom framgår av diagrammet erhålles en mycket effektiv separation el- ler fraktionering av de 25 komponenterna i blandningen. I själva verket motsvarar de individuella toppar som kan ses i Figur 4A enkla DNA-molekyler. Återigen kan sägas att denna separation kunde ej erhållas genom tillgripande av hydrodynamisk separation eller annan konventionell se- parationsteknik. få Storleken, orienteringen och konformationen av stora DNA-molekyler i vattenlösningar är beroende på etfi antal faktorer. Det är välkänt, att DNA-spiralen sväller och ökar i storlek när saltkoncentrationen minskar. Under så- dana betingelser ökar även tjockleken av det elektriska dubbelskiktet nära kapillärväggarna. Den sfäriska spira- len av DNA kan tänjas genom applicering av ett starkt elektriskt fält och/eller genom att den tvingas genom en trång passage. Storleken av formförändringen i det elek- triska fältet är vidare även beroende på saltkoncentra- tionen (Diekmann, S.: Pörschke, D., Biophys.Chem.:lG (82) 261). Sådana faktorer kan tas i beaktande i ansluäning till optimering av separationer i enlighet med principer- na för den beskrivna uppfinningen. _ Det optimala valet av innerdiameter för separa- tionskapillärer av submikronstorlek för att erhållë opti- mal separation är relaterad till den geometriska radien av de molekyler som skall separeras, såsom visas i både Fig. 1 och Fig. 2. Det är emellertid ej alltid enkelt att förutsäga molekylradien genom att endast känna molëkyl- vikten, såsom i dalton. Oftast är formen, storleken, kon- formationen och gyrationsradien för polymera molekëlerë beroende på ett antal faktorer, såsom det omgivande medi- et (jonkoncentration, solvateringkraft, dielektriska 506 461 10 10 15 .20 25 30 35 egenskaper, etc.). Polymerer av en viss molekylvikt kan sålunda svälla eller tänjas beroende pà mediet. Även det över separationsröret applicerade elektriska fältet kan förändra analyternas form (detta gäller speciellt laddade molekyler, sàsom DNA). För de laddade analyterna är jon- molnet (det elektriska dubbelskiktet) kring analyterna en väsentlig faktor som påverkar separa- som är närvarande tionen. Den differentiella hydrodynamiska kraften som ut- övas pà analyterna under separationen kan vidare förändra analyternas konformation (molekylerna sträcker sig (tän- jes) helt enkelt eller deformeras till en annan konforma- tion). Detta kan uppträda även för icke laddade typer.

Vid optimering av separationen för en speciell typ och storlek av analyt är det därför ej endast kapillärens innerdiameter utan även ovannämnda faktorer som måste tas i övervägande. .

En intressant eventuell möjlighet vid föreliggande uppfinning är användning av ett pulserat elektriskt fält (jfr. Schwarz et al,. ibid.), i stället för en kontinuer- lig elektrisk potential över separationskolonnen. Detta utnyttjas i stor utsträckning exempelvis för separation av stora DNA-fragment genom gelelektrofores. I princip tänjes DNA-molekylerna under applicering av det elektris- ka fältet. Under den efterföljande perioden när inget elektriskt fält är närvarande uppträder en relaxation av DNA-molekylerna, där molekylerna strävar att återgå till sin ursprungliga spiralkonformation. Relaxationsprocedu- ren uppträder i tidsdomänen och är beroende av molekyl- storlek. Genom att upprepa proceduren och justera frek- vensen av den intermittenta spänningsappliceringen kan separationen optimeras för en given storleksordning av molekyler. Sammma procedur kan utnyttjas vid föreliggande uppfinning för att förbättra separation av laddade analy- ter. Genom att applicera ett pulserat fält över den ka- pillära separationskolonnen av submikronstorlek äger en storleksselektiv separation rum. Den periodiska konforma- tionsändringen hos analyterna förhöjer effekten av de 10 15 20 25 30 35 11 i 5064161 hydrodynamiska effekter som beskrives i den andra typen.

Taylor-hastighetsprofilen påverkas av ett antal _ driftparametrar. Av första betydelse är kapillärens in- nerdiameter som måste vara tillräckligt liten. Av stor betydelse är även separationsmediets jonstyrka. Jp lägre jonstyrkan är desto tjockare är det elektriska dubbel- skiktet och desto bättre fraktioneringen. Alstringen av den elektroosmotiska flödesprofilen förbättras därför ge- nom reduktion av mediets jonkoncentration. För jämförel- sevis ”stora” kapillärer, såsom upp till 1 um, är det gynnsamt att använda media med låg jonstyrka.

Tjockleken hos det elektriska dubbelskiktet (och därmed tendensen att bilda en flödesprofil av Taylor-typ) kan ytterligare påverkas genom applicering av en extern spänning över kapillärens inner- och yttervägg. Det icke ledande kapillärmaterialet (glas, smält silikaf verkar som ett dielektrikum, och innerväggens laddning påverkas (jfr. med verkan av en elektrisk kondensor). För att åstadkomma detta driftsätt är det nödvändigt att täcka kapillärväggens utsida med ett ledande material, exempel- vis en metall. En spänning appliceras sedan mellan elek- trolyten inne i kapillärröret och det omgivande kondukti- va materialet. Nämnda spänning kan vara av samma sämr- leksordning som den spänning som appliceras för separa- tionen och kan även vara pulsad (jfr. Tung-Liang Huang et al., ”Mechanistic Studies of Electroosmotic Control at the Capillary-Solution Interface", Anal.Chem. 1993, 65, 2887-2893).

Ehuru föreliggande uppfinning illustrerats i huvud- sak under hänvisning till separationen av DNA-fragment eller molekyler i en blandning därav, är det väsentligt att notera att uppfinningen är lika tillämpbar på andra molekyler av hög molekylvikt. Uppfinningen skall därför anses vara inskränkt endast i enlighet med ordalydelsen i bilagda patentkrav.

Claims (12)

506 461 12 10 115 20 25 30 PATENTKRAV

1. Förfarande för storleksfraktionering av molekyler med hög molekylvikt i en blandning därav under användning av ett elektroosmotiskt flöde av nämnda molekyler inne- hållna i en buffert av låg jonstyrka, varvid nämnda för- farande utföres i ett kapillärrör, k ä n n e t e c k - n a t därav, att man använder ett kapillärrör med en in- nerdiameter ej överstigande tvärsnittsstorleken för de största molekylerna med en faktor större än ca 10 (tio).

2. Förfarande enligt patentkravet 1, k ä n n e - att nämnda faktor är från ca 2 (tio). t e c k n a t därav, (två) till ca 10

3. Förfarande enligt patentkravet 1 eller 2, k ä n - n e t e c k n a t därav, att nämnda innerdiameter är mindre än ca 1 um.

4. Förfarande enligt patentkravet 3, k ä n n e - t e c k n a t att nämnda diameter är mindre än ca 500 nm. därav,

5. Förfarande enligt något av de föregående patent- kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att rörlängden är från ca 10 cm till ca 10 m.

6. Förfarande enligt något av de föregående patent- kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att de molekyler som skall separeras har ett nettoladdningstecken, som är detsamma som det för kapillärrörväggen, varigenom små mo- lekyler rör sig snabbare än stora molekyler.

7. Förfarande enligt något av patentkraven 1 till 5, k ä n n e t e c k n a t därav, att de molekyler som skall separeras är i huvudsak oladdade, varigenom stora molekyler rör sig snabbare än små molekyler.

8. Förfarande enligt något av de föregående patent- kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att de molekyler som skall separeras är utvalda bland proteiner, polysack- 10 15 13 i 506 arider, organiska polymerer, DNA, RNA.

9. Förfarande enligt patentkravet 8, Å k ä n n e t e c k n a t därav, att de molekyler som skall separeras är DNA-molekyler omfattande upp till ca tio miljoner kbp. Å

10. Förfarande enligt något av de föregående patent- kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att en konstant separationsspänning appliceras över kapillärröret.

11. ll. Förfarande enligt något av patentkraven 1 till 9, k ä n n e t e c k n a t därav, att ett pulseranäe elektriskt separeringsfält appliceras över kapillärröret.

12. Förfarande enligt något av de föregående patent- kraven, k ä n n e t e c k n a t därav, att en konstant eller pulserande spänning appliceras mellan elektrolyten inne i kapillärröret och en ledande beläggning på utsidan av kapillärröret.