JP4066203B2 - Novel creatinine amide hydrolase - Google Patents

Description

【０００７】
また、本発明は以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であるクレアチニンアミドヒドロラーゼである。
（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
【０００８】
本発明は、以下の（ａ）又は（ｂ）のタンパク質であるクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子である。
（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質
【０００９】
また、本発明は以下の（ｃ）、（ｄ）又は（ｅ）のＤＮＡからなるクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子である。
（ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ
（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードしているＤＮＡ
（ｅ）上記（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードする細菌由来のＤＮＡ
【００１０】
本発明は上記クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターである。
【００１１】
また、本発明は上記組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
【００１２】
さらに、本発明は上記形質転換体を培地で培養し、クレアチニンアミドヒドロラーゼを生成させ、該クレアチニンアミドヒドロラーゼを採取することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼの製造法である。
【００１３】
また、本発明はアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)ＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）を培養し、クレアチニンアミドヒドロラーゼを生成させ、該クレアチニンアミドヒドロラーゼを採取することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼの製造法である。
【００１４】
【発明の実施態様】
本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼは、クレアチニンアミドヒドロラーゼ生産微生物、例えばアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)ＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）から入手し得る。しかしながら、クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を分離し、これより発現されるクレアチニンアミドヒドロラーゼを単離することにより、本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼを簡便、かつ効率的に入手することもできる。
本発明の一実施態様としては、（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質がある。
アミノ酸の欠失、置換、付加の程度については、基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善するようにしたものを含む。これらの変異体を製造する方法は、従来から公知である方法に従う。
【００１５】
本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子は、例えばアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)ＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）から抽出しても良く、また化学的に合成することもできる。ポリメラーゼチェーンリアクション法（PCR)の利用により、クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００１６】
上記遺伝子としては、例えば（ａ）配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡがある。
ＤＮＡの欠失、置換、付加の程度については、基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善するようにしたものを含む。これらの変異体を製造する方法は、従来から公知である方法に従う。
【００１７】
また、（ｃ）配列表の配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を有するアミノ酸配列をコードしているＤＮＡまたは（ｅ）上記（ｃ）の塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を有するタンパク質をコードする細菌由来のＤＮＡがある。
ここで、ストリンジェントな条件とは、×２ＳＳＣ（３００ｍＭ ＮａＣｌ、３０ｍＭ クエン酸）、６５℃、１６時間である。
【００１８】
本発明の遺伝子を得る方法としては、例えばアースロバクター・エスピー
(Arthrobacter sp.)ＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）の染色体ＤＮＡを分離、精製した後、超音波破砕、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑末端または接着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換えベクターを構築する。こうして得られた組換えベクターは複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。次いで該微生物を培養し、該培養菌体から該組換えベクターを分離・精製し、該組換えベクターからクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を採取すれば良い。
【００１９】
遺伝子供与体であるアースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)ＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）の染色体ＤＮＡは、具体的には、以下のように採取される。
すなわち、供与微生物を例えば１〜３日間撹拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次いでこれを溶菌させることによりクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼ等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（SDS)等の界面活性剤が併用され、さらに凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせても良い。
【００２０】
このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離・精製するには常法に従って、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
微生物から分離・精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するII型制限酵素が適している。
【００２１】
ベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。
ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、Lambda-gt10 、Lambda-gt11 などが使用できる。
またプラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２，ｐＵＣ１９、pBluescript 、ｐＬＥＤ−Ｍ１(Journal of Fermentation and Bioenzineering, Vol.76, 265-269 (1993))などが使用できる。
このようなベクターを、上述したクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であれば良く、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要なら、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作成することもできる。
【００２２】
宿主微生物としては、組換えベクターが安定、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーW3110 、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリーHB101 、エシェリヒア・コリーJM109 などを用いることができる。
【００２３】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などを用いることができる。
【００２４】
このようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のクレアチニンアミドヒドロラーゼを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとクレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を同時に発現する微生物を検索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつ、クレアチニンアミドヒドロラーゼを生成する微生物を選択すれば良い。
【００２５】
上記の方法により得られたクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の塩基配列はサイエンス（Science, Vol.214, 1205-1210 (1981)）に記載されたジデオキシ法により解読し、またクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列は決定した塩基配列より推定した。このようにして一度選択されたクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を保有する組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入することも容易に実施することができる。また、クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を保持する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲによりクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００２６】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常、多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。培養温度は菌が発育し、クレアチニンアミドヒドロラーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒアコリーの場合、好ましくは20〜42℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、クレアチニンアミドヒドロラーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育しクレアチニンアミドヒドロラーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００２７】
培養物中のクレアチニンアミドヒドロラーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般には、常法に従ってクレアチニンアミドヒドロラーゼが培養液中に存在する場合は濾過、遠心分離などにより、クレアチニンアミドヒドロラーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用される。クレアチニンアミドヒドロラーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してクレアチニンアミドヒドロラーゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００２８】
このようにして得られたクレアチニンアミドヒドロラーゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、精製されたクレアチニンアミドヒドロラーゼを得ることができる。
【００２９】
例えば、セファデックス(Sephadex) G-25 （ファルマシア バイオテク）などによるゲルろ過、DEAEセファロースCL-6B(ファルマシア バイオテク）、オクチルセファロースCL6-B(ファルマシア バイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素標品を得ることができる。この精製酵素標品は、電気泳動(SDS-PAGE)的に、ほぼ単一のバンドを示す程度に純化されている。
【００３０】
本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼは、以下に示す理化学的性質を有する。

【００３１】
本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼと公知のクレアチニンアミドヒドロラーゼとの性質の比較を表１に示す。また、本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列と唯一、公知であるシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PS-7が産生するクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列との相同性は37.0％であり、両者の比較を図１に示す。
本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼは、同一反応を触媒する公知の酵素とは性質の異なる新規な酵素である。
【００３２】
【表１】

【００３３】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例中、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性の測定は以下の試薬および測定条件で行った。
＜試薬＞
試薬Ａ クレアチニン測定試薬「ダイヤカラーCRE 」（東洋紡製）のＡ溶解 液（酵素試薬Ａバイアルに90mlの溶解液Ａを加えて溶解したもの）
試薬Ｂ ４００ｍＭ クレアチニン水溶液
試薬Ｃ １．５％フェノール水溶液
試薬Ｄ ０．５％４−アミノアンチピリン溶液
【００３４】
＜測定条件＞
まず、試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃ、試薬Ｄを３：１：０．０４：０．０４の割合（容量比）で混合し、試薬混液を作成する。この試薬混液３ｍｌを３７℃で約５分予備加温後、０．１ｍｌの酵素溶液を加え，３７℃で反応を開始し、４分間反応させた後、５００ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を分光光度計にて測定する。盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下同様に吸光度変化を測定する。上記条件で１分間に１マイクロモルのクレアチニンを分解する酵素量を１単位 (U)とする。
【００３５】
実施例１ 染色体ＤＮＡの分離
アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。同菌株を１００ｍｌの２×ＹＴ培地（1.6%ポリペトン、1%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム(pH7.2))で３７℃一晩振盪培養した後、遠心分離（8,000rpm、10分間）により集菌した。１５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含んだ溶液で菌体を洗浄した後、２０％シュークロース、５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍｌに懸濁し、１ｍｌのリゾチーム溶液（100mg/ml）を加えて、３７℃、３０分間保温し、次いで１１ｍｌの１％ラウロイルサルコシン酸、０．１Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ９．６）を含む溶液を加えた。この懸濁液に臭化エチジウム溶液を０．５％塩化セシウムを約１００％加え、攪拌混合し、55,000rpm 、２０時間の超遠心分離でＤＮＡを分取した。分取したＤＮＡは１ｍ ＥＤＴＡを含んだ１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０溶液（以下，ＴＥと略記）で透析し、精製ＤＮＡ標品とした。これを等量のクロロホルム・フェノール溶液で処理後遠心分離により水層を分取し、２倍量のエタノールを加えて上記方法で、もう一度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。
【００３６】
実施例２ クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片及び該ＤＮＡ断片を有する組換えベクターの調製
実施例１で得たＤＮＡ５μｇを制限酵素 Sau3AI （東洋紡製）で部分分解し、２ｋｂｐ以上の断片に分解した後、制限酵素 BamHI（東洋紡製）で切断した pBluescriptKS(+) １μｇとをＴ４−ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）１単位で、１６℃、１２時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーJM109 のコンピテントセル（東洋紡製）を用いて形質転換し、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性検出用寒天培地［1.0%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5% NaCl 、1%クレアチニン、200U/ml クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡製）、10U/mlザルコシンオキシダーゼ（東洋紡製）、5U/ml ペルオキシダーゼ（東洋紡製）、0.01% ο−ジアニシジン、50μg/mlアンピシリン、1.5%寒天］に塗布した。クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性の検出は、上記培地に生育し、且つ茶色に染色されるコロニーを指標に行った。
【００３７】
使用したＤＮＡ１μｇ当たり約100,000 個の形質転換体のコロニーが得られ、上記スクリーニングの結果、茶色に染色されるコロニーを１株見いだした。この株をＬＢ液体培地（1%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.5% NaCl 、50μg/mlアンピシリン）で培養し、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を測定したところ、該活性が検出された。この株の保有するプラスミドには約６．６ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをｐＣＮＡＢ１とした。
【００３８】
次いで、ｐＣＮＡＢ１の挿入ＤＮＡを制限酵素 ApaI （東洋紡製）にて切り出し、同制限酵素で切断した pBluescriptKS(+) に連結して、ｐＣＮＨＡＡ−１を作成した。このｐＣＮＨＡＡ−１の制限酵素地図を図２に示す。
【００３９】
実施例３ 塩基配列の決定
ｐＣＮＨＡＡ−１の約４．６ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片について種々の制限酵素にてサブクローンを調製した。種々のサブクローンは常法に従い、Radioactive Sequencing Kit（東洋紡製）を用いて、塩基配列を決定した。決定した塩基配列およびアミノ酸配列を配列表に示した。アミノ酸配列から求められる蛋白質の分子量は28,497であり、アースロバクター・エスピーＴＥ１８２６のクレアチニンアミドヒドロラーゼの分子量とほぼ一致した。
【００４０】
実施例４ 組換えベクターｐＣＮＨＡＲ−１の作成
ｐＣＮＨＡＡ−１の挿入ＤＮＡ断片よりクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子以外の部分を除くため、ＰＣＲによる挿入ＤＮＡ断片の小型化を実施した。ＰＣＲは以下に示す反応液組成及び増幅条件にて行った。
＜反応液組成＞
Pfu DNAポリメラーゼ（ストラタジーン製） 5U/100μl
10倍濃度Pfu DNA ポリメラーゼ用バッファー 10 μl/100μl
pCNHAA-1（鋳型DNA) 0.1 μg/100μl
dATP,dTTP,dGTP,dCTP 各0.2mM
２種のプライマー 各１μM
（配列表の配列番号３、４に記載）
【００４１】
＜増幅条件＞
変性 ９５℃、３０秒間
温度変更 １分３０秒間
アニーリング ４５℃、１秒間
温度変更 １秒間
反応 ７５℃、２分３０秒間
温度変更 １秒間
（上記サイクルを計３０サイクル実施）
【００４２】
増幅ＤＮＡ断片約０．８ｋｂｐを制限酵素 NdeI と BamHI（東洋紡製）にて処理し、同じ制限酵素で切断したｐＬＥＤ−Ｍ１に連結して、ｐＣＮＨＡＲ−１を作成した。ｐＣＮＨＡＲ−１の制限酵素地図を図３に示す。
ｐＣＮＨＡＲ−１の挿入ＤＮＡ断片は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子以外の部分を含まない。すなわち、挿入ＤＮＡ断片の両端には NdeI と BamHI制限酵素切断部位がそれぞれ存在し、 NdeI はクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の開始コドン(ATG) と重なり、 BamHIはクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の終止コドン(TGA) の直後に位置している。
【００４３】
実施例５ 形質転換体の作成
エシェリヒア・コリーJM109 のコンピテントセル（東洋紡製）をｐＣＮＨＡＲ−１で形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリーJM109 (pCNHAR-1)を得た。
【００４４】
実施例６ エシェリヒア・コリーJM109 （pCNHAR-1）からのクレアチニンアミドヒドロラーゼの製造
ＬＢ培地５００ｍｌを２Ｌフラスコに分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）０．５ｍｌを添加した。この培地にＬＢ培地であらかじめ，３０℃、７時間振盪培養したエシェリヒア・コリーJM109 (pCNHAR-1)の培養液５ｍｌを接種し、３７℃で１８時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアチニンアミドヒドロラーゼ活性は約１８Ｕ／ｍｌであった。
【００４５】
上記菌体を遠心分離にて集菌し、２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．５に懸濁した。上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理および硫安分画処理を行った後、セファデックス(Sephadex) G-25 （ファルマシア バイオテク）によるゲルろ過により脱塩し、DEAEセファロースCL-6B （ファルマシア バイオテク）カラムクロマトグラフィー、オクチルセファロースCL6-B(ファルマシア バイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素表品を得た。本方法により得られたクレアチニンアミドヒドロラーゼ標品は、電気泳動(SDS-PAGE)的にほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は約３０Ｕ／ｍｇ−タンパク質であった。
【００４６】
以下に、上記方法により得られたクレアチニンアミドヒドロラーゼの性質を示す。

【００４７】
実施例７
アースロバクター・エスピー(Arthrobacter sp.)ＴＥ１８２６（ＦＥＲＭ Ｐ−１０６３７）を２ＸＹＴ培地(1.6% ポリペトン、1%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム、pH7.2)にて、３７℃、約１〜３日間培養し、培養液を遠心分離して集菌し、次いで、これを溶菌させることによって、クレアチニンアミドヒロラーゼを生成させ、該クレアチニンアミドヒドロラーゼを採取した。
【００４８】
【発明の効果】
本発明により、アースロバクター属細菌から新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子が単離され、遺伝子工学的技術による該酵素の製造法が確立され、高純度な該酵素の大量供給とクレアチニンの定量への利用が可能となった。また、該遺伝子を改変することにより、理化学的性質の改良された新規なクレアチニンアミドヒドロラーゼを製造する方法を導き出すことができる。
【００４９】
【配列表】

【００５０】

【００５１】

【００５２】

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列とシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PS-7が産生するクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列との比較を示す図である。
【図２】ｐＣＮＡＡ−１の制限酵素地図を示す図である。
【図３】ｐＣＮＨＡＲ−１の制限酵素地図を示す図である。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel enzyme having creatinine amide hydrolase activity that can be used for the determination of creatinine, a gene encoding the enzyme, and a method for producing the enzyme by genetic engineering techniques.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, creatinine amide hydrolase (EC 3.5.2.10) has been used as an enzyme for measuring creatinine in body fluids, which has been clinically used as an indicator for diagnosis of muscle diseases and kidney diseases, such as creatine amidinohydrolase, monkeys. Used with cosin oxidase and peroxidase. Creatinine amide hydrolase is an enzyme that catalyzes a reversible reaction that acts on creatinine to produce creatine in the presence of water.
[0003]
Such a creatinine amide hydrolase is a genus of Pseudomonas (Journal of Biochemistry, Vol. 86, 1109-1117 (1979)) or an genus Alkagenes (Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Vol. 34, No. 1, 269-274 (1986)). Of bacteria are known to produce. In addition, other bacteria such as Flavobacterium, Corynebacterium, Micrococcus (JP 51-115989) and Penicillium (JP 47-43281) are produced. It is only known to do. Among these, the gene encoding creatinine amide hydrolase produced by Pseudomonas putida PS-7 has already been isolated and the amino acid sequence has been published (Japanese Patent No. 2527035).
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to isolate a novel creatinine amide hydrolase from a new bacterium that has not been produced so far, and to clone a gene encoding the enzyme and to produce the enzyme in large quantities by genetic engineering Is to provide. Another object of the present invention is to derive a method for producing a novel creatinine amide hydrolase having improved physicochemical properties by modifying the enzyme.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of various studies to achieve the above object, the present inventors selected Arthrobacter sp. TE1826 (FERM P-10737) as a creatinine amide hydrolase-producing bacterium, and developed a novel one from the microbial cell. Creatinine amide hydrolase was isolated, and a gene encoding creatinine amide hydrolase was successfully separated from the chromosomal DNA extracted from the cells, and a novel creatinine amide hydrolase expressed from the gene was isolated. Furthermore, the entire base sequence of the gene was determined, and the enzyme was successfully produced without the need to add an expensive inducer such as creatinine to the medium by genetic engineering techniques. It was possible to supply a large amount at a low cost.
[0006]
That is, the present invention is a novel creatinine amide hydrolase having the following physicochemical properties.

[0007]
Moreover, this invention is creatinine amide hydrolase which is a protein of the following (a) or (b).
(A) A protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
(B) a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence (a) and having creatinine amide hydrolase activity
The present invention is a gene encoding creatinine amide hydrolase which is a protein of the following (a) or (b).
(A) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (b) an amino acid sequence (a) comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added, and creatinine Protein having amide hydrolase activity
The present invention also relates to a gene encoding creatinine amide hydrolase comprising the following DNA (c), (d) or (e):
(C) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
(D) DNA in which one or more bases are added, deleted or substituted in the base sequence of (c) above, and which encodes an amino acid sequence having creatinine amide hydrolase activity
(E) DNA derived from bacteria that hybridizes under stringent conditions with the DNA comprising the base sequence of (c) above and encodes a protein having creatinine amide hydrolase activity
[0010]
The present invention is a recombinant vector containing a gene encoding the creatinine amide hydrolase.
[0011]
In addition, the present invention is a transformant transformed with the above recombinant vector.
[0012]
Furthermore, the present invention provides a method for producing creatinine amide hydrolase, wherein the transformant is cultured in a medium to produce creatinine amide hydrolase, and the creatinine amide hydrolase is collected.
[0013]
The present invention also relates to a production of creatinine amide hydrolase characterized by culturing Arthrobacter sp. TE1826 (FERM P-10737) to produce creatinine amide hydrolase and collecting the creatinine amide hydrolase. Is the law.
[0014]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The creatinine amide hydrolase of the present invention may be obtained from a creatinine amide hydrolase producing microorganism, such as Arthrobacter sp. TE1826 (FERM P-10737). However, the creatinine amide hydrolase of the present invention can also be obtained simply and efficiently by isolating the gene encoding creatinine amide hydrolase and isolating the creatinine amide hydrolase expressed therefrom.
In one embodiment of the present invention, (a) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or (b) amino acid sequence (a), one or more amino acids are deleted, substituted or added. And a protein having a creatinine amide hydrolase activity.
The degree of amino acid deletion, substitution and addition includes those in which the basic characteristics are not changed or the characteristics are improved. A method for producing these mutants follows a conventionally known method.
[0015]
The gene encoding the creatinine amide hydrolase of the present invention may be extracted from, for example, Arthrobacter sp. TE1826 (FERM P-10737) or chemically synthesized. It is also possible to obtain a DNA fragment containing a creatinine amide hydrolase gene by using the polymerase chain reaction method (PCR).
[0016]
Examples of the gene include (a) DNA encoding a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, or (b) one or more amino acids deleted or substituted in the amino acid sequence (a). Alternatively, there is DNA encoding a protein consisting of an added amino acid sequence and having creatinine amide hydrolase activity.
The degree of DNA deletion, substitution, and addition includes those in which the basic characteristics are not changed or the characteristics are improved. A method for producing these mutants follows a conventionally known method.
[0017]
(C) DNA consisting of the base sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, (d) one or more bases in the base sequence of (c) above are added, deleted or substituted, and A protein encoding an amino acid sequence having creatinine amide hydrolase activity or (e) a protein that hybridizes under stringent conditions with a DNA comprising the base sequence of (c) above and has a creatinine amide hydrolase activity There is DNA from bacteria that encodes.
Here, stringent conditions are x2 SSC (300 mM NaCl, 30 mM citric acid), 65 ° C., 16 hours.
[0018]
As a method for obtaining the gene of the present invention, for example, Arthrobacter sp.
(Arthrobacter sp.) After separating and purifying the chromosomal DNA of TE1826 (FERM P-10737), the DNA was cleaved using ultrasonic disruption, restriction enzyme treatment, etc., and a linear expression vector. A recombinant vector is constructed by binding and closing at the terminal or adhesive terminal with DNA ligase or the like. The recombinant vector thus obtained is transferred to a replicable host microorganism, and then screened using the expression of the vector marker and enzyme activity as an indicator, and the microorganism retaining the recombinant vector containing the gene encoding creatinine amide hydrolase Get. Next, the microorganism is cultured, the recombinant vector is separated and purified from the cultured cells, and the creatinine amide hydrolase gene is collected from the recombinant vector.
[0019]
Specifically, the chromosomal DNA of gene donor Arthrobacter sp. TE1826 (FERM P-10737) is collected as follows.
That is, for example, a culture obtained by stirring and cultivating a donor microorganism for 1 to 3 days is collected by centrifugation, and then lysed to prepare a lysate containing a creatinine amide hydrolase gene. As a method of lysis, for example, it is treated with a lytic enzyme such as lysozyme or β-glucanase, and if necessary, a protease, other enzyme, or a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS) is used, and further freeze-thawing. Or a physical crushing method such as a French press treatment.
[0020]
In order to separate and purify DNA from the lysate thus obtained, it is performed according to a conventional method, for example, by appropriately combining methods such as deproteinization treatment by phenol treatment or protease treatment, ribonuclease treatment, and alcohol precipitation treatment. Can do.
A method for cleaving DNA separated and purified from microorganisms can be performed by, for example, ultrasonic treatment, restriction enzyme treatment, or the like. Type II restriction enzymes that act on specific nucleotide sequences are suitable.
[0021]
Suitable vectors are those constructed for genetic recombination from phages or plasmids that can autonomously grow in the host microorganism.
As the phage, for example, when Escherichia coli is used as a host microorganism, Lambda-gt10, Lambda-gt11 and the like can be used.
As the plasmid, for example, when Escherichia coli is used as a host microorganism, pBR322, pUC19, pBluescript, pLED-M1 (Journal of Fermentation and Bioenzineering, Vol. 76, 265-269 (1993)), etc. Can be used.
A vector fragment can be obtained by cleaving such a vector with the restriction enzyme used for cleaving microbial DNA, which is the creatinine amide hydrolase gene donor described above. It is not necessary to use the same restriction enzyme. The method for binding the microbial DNA fragment and the vector DNA fragment may be a method using a known DNA ligase. For example, after annealing of the adhesive end of the microbial DNA fragment and the adhesive end of the vector fragment, an appropriate DNA ligase can be used. A recombinant vector of a microbial DNA fragment and a vector DNA fragment is prepared by use. If necessary, after annealing, it can be transferred to a host microorganism and a recombinant vector can be prepared using in vivo DNA ligase.
[0022]
As the host microorganism, any recombinant vector can be used as long as it is stable and capable of autonomous propagation and can express a foreign gene. Generally, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600, Escherichia coli HB101, Escherichia Collie JM109 or the like can be used.
[0023]
As a method for transferring the recombinant vector into the host microorganism, for example, when the host microorganism is Escherichia coli, a competent cell method using calcium treatment, an electroporation method, or the like can be used.
[0024]
The microorganism which is the transformant thus obtained can stably produce a large amount of creatinine amide hydrolase by being cultured in a nutrient medium. The selection of the presence or absence of transfer of the target recombinant vector into the host microorganism may be performed by searching for a drug resistance marker of the vector holding the target DNA and a microorganism that simultaneously expresses creatinine amide hydrolase activity. What is necessary is just to select the microorganism which grows in the selective culture medium based on and produces creatinine amide hydrolase.
[0025]
The base sequence of the creatinine amide hydrolase gene obtained by the above method was decoded by the dideoxy method described in Science (Science, Vol. 214, 1205-1210 (1981)), and the amino acid sequence of creatinine amide hydrolase was determined. Estimated from the base sequence. The recombinant vector carrying the creatinine amide hydrolase gene once selected in this way can be easily removed from the transformed microorganism and transferred to another microorganism. It is also possible to easily collect DNA, which is a creatinine amide hydrolase gene, from a recombinant vector carrying a creatinine amide hydrolase gene by restriction enzyme or PCR, bind it to another vector fragment, and transfer it to a host microorganism.
[0026]
The culture form of the host microorganism, which is a transformant, may be selected in consideration of the nutritional and physiological properties of the host. Usually, the culture is performed in liquid culture in many cases, but industrially aerated and stirred culture is used. It is advantageous to do so. As a nutrient source of the medium, those commonly used for culturing microorganisms can be widely used. Any carbon compound that can be assimilated may be used as the carbon source. For example, glucose, sucrose, lactose, maltose, fructose, molasses, pyruvic acid and the like are used. The nitrogen source may be any nitrogen compound that can be used. For example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean meal alkaline extract, and the like are used. In addition, phosphates, carbonates, sulfates, salts such as magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, and the like are used as necessary. The culture temperature can be appropriately changed within the range in which the bacteria grow and produce creatinine amide hydrolase. In the case of Escherichia coli, it is preferably about 20 to 42 ° C. Although the culture time varies slightly depending on the conditions, the culture may be terminated at an appropriate time in consideration of the time when the creatinine amide hydrolase reaches the maximum yield, and is usually about 6 to 48 hours. The pH of the medium can be appropriately changed as long as the bacteria grow and produce creatinine amide hydrolase, but is particularly preferably about pH 6.0 to 9.0.
[0027]
Although the culture solution containing the cells producing creatinine amide hydrolase in the culture can be collected and used as it is, in general, when creatinine amide hydrolase is present in the culture solution, filtration, centrifugation, etc. Is used after separating the creatinine amide hydrolase-containing solution and the microbial cells. When creatinine amide hydrolase is present in the microbial cells, the microbial cells are collected from the obtained culture by means of filtration or centrifugation, and then disrupted by mechanical methods or enzymatic methods such as lysozyme. If necessary, a chelating agent such as EDTA and / or a surfactant is added to solubilize the creatinine amide hydrolase, and it is separated and collected as an aqueous solution.
[0028]
The creatinine amide hydrolase-containing solution thus obtained is concentrated by, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting-out treatment of ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, or fractional precipitation with a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or the like. It may be allowed to settle. Heat treatment and isoelectric point treatment are also effective purification means. Subsequently, purified creatinine amide hydrolase can be obtained by performing gel filtration with an adsorbent or gel filter, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
[0029]
For example, separation and purification by gel filtration using Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech), DEAE Sepharose CL-6B (Pharmacia Biotech), octyl Sepharose CL6-B (Pharmacia Biotech) column chromatography, Goods can be obtained. This purified enzyme preparation is purified to an extent that shows almost a single band by electrophoresis (SDS-PAGE).
[0030]
The creatinine amide hydrolase of the present invention has the following physicochemical properties.

[0031]
A comparison of properties between the creatinine amide hydrolase of the present invention and known creatinine amide hydrolase is shown in Table 1. Moreover, the homology between the amino acid sequence of the creatinine amide hydrolase of the present invention and the amino acid sequence of creatinine amide hydrolase produced by the only known Pseudomonas putida PS-7 is 37.0%. As shown in FIG.
The creatinine amide hydrolase of the present invention is a novel enzyme having properties different from those of known enzymes that catalyze the same reaction.
[0032]
[Table 1]

[0033]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples.
In the examples, creatinine amide hydrolase activity was measured using the following reagents and measurement conditions.
<Reagent>
Reagent A A solution of creatinine measuring reagent “Diacolor CRE” (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) (dissolved by adding 90 ml of solution A to enzyme reagent A vial)
Reagent B 400 mM Creatinine aqueous solution reagent C 1.5% phenol aqueous solution reagent D 0.5% 4-aminoantipyrine solution
<Measurement conditions>
First, reagent A, reagent B, reagent C, and reagent D are mixed at a ratio (volume ratio) of 3: 1: 0.04: 0.04 to prepare a reagent mixture. Pre-warm 3 ml of this reagent mixture at 37 ° C. for about 5 minutes, add 0.1 ml of enzyme solution, start the reaction at 37 ° C., react for 4 minutes, and then measure the change in absorbance per minute at 500 nm. Measure with a photometer. In the blind test, distilled water is added to the reagent mixture instead of the enzyme solution, and the change in absorbance is measured in the same manner. The amount of enzyme capable of decomposing 1 micromole of creatinine per minute under the above conditions is defined as 1 unit (U).
[0035]
Example 1 Separation of Chromosomal DNA Chromosomal DNA of Arthrobacter sp. TE1826 (FERM P-10737) was isolated by the following method. The strain was cultured in 100 ml of 2 × YT medium (1.6% polypetone, 1% yeast extract, 0.5% sodium chloride (pH 7.2)) at 37 ° C. overnight, and then collected by centrifugation (8,000 rpm, 10 minutes). Fungus. The cells were washed with a solution containing 15 mM sodium citrate and 0.15 M sodium chloride, suspended in 5 ml of a solution containing 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl (pH 7.6) and 1 mM EDTA, and 1 ml of lysozyme. A solution (100 mg / ml) was added and incubated at 37 ° C. for 30 minutes, and then a solution containing 11 ml of 1% lauroyl sarcosine acid, 0.1 M EDTA (pH 9.6) was added. About 100% of 0.5% cesium chloride as an ethidium bromide solution was added to this suspension, mixed with stirring, and DNA was collected by ultracentrifugation at 55,000 rpm for 20 hours. The collected DNA was dialyzed with 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 solution (hereinafter abbreviated as TE) containing 1 m EDTA to obtain a purified DNA preparation. This was treated with an equal amount of chloroform / phenol solution, and the aqueous layer was separated by centrifugation. Then, twice the amount of ethanol was added, and the DNA was again separated by the above method and dissolved in 2 ml of TE.
[0036]
Example 2 Preparation of DNA fragment containing gene encoding creatinine amide hydrolase and recombinant vector having the DNA fragment 5 μg of DNA obtained in Example 1 was partially degraded with restriction enzyme Sau3AI (manufactured by Toyobo) and fragment of 2 kbp or more Then, 1 μg of pBluescriptKS (+) cleaved with the restriction enzyme BamHI (Toyobo) was reacted with 1 unit of T4-DNA ligase (Toyobo) at 16 ° C. for 12 hours to ligate the DNA. Ligated DNA was transformed using Escherichia coli JM109 competent cell (manufactured by Toyobo), and agar medium for detecting creatinine amide hydrolase activity [1.0% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 1% creatinine, 200 U / ml creatine amidinohydrolase (Toyobo), 10 U / ml sarcosine oxidase (Toyobo), 5 U / ml peroxidase (Toyobo), 0.01% o-dianisidine, 50 μg / ml ampicillin, 1.5% agar]. The detection of creatinine amide hydrolase activity was performed using colonies that grew in the above medium and stained brown as an index.
[0037]
About 100,000 transformant colonies were obtained per 1 μg of DNA used, and as a result of the screening, one colony that was stained brown was found. This strain was cultured in LB liquid medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 50 μg / ml ampicillin), and the creatinine amide hydrolase activity was measured to detect the activity. The plasmid possessed by this strain has an inserted DNA fragment of about 6.6 kbp, and this plasmid was designated as pCNAB1.
[0038]
Subsequently, the inserted DNA of pCNAB1 was excised with the restriction enzyme ApaI (manufactured by Toyobo) and ligated to pBluescriptKS (+) cleaved with the restriction enzyme to prepare pCNHAA-1. The restriction enzyme map of this pCNHAA-1 is shown in FIG.
[0039]
Example 3 Determination of Base Sequence Subclones were prepared using various restriction enzymes for the inserted DNA fragment of about 4.6 kbp of pCNHAA-1. The base sequences of various subclones were determined using a Radioactive Sequencing Kit (manufactured by Toyobo) according to a conventional method. The determined base sequence and amino acid sequence are shown in the sequence listing. The molecular weight of the protein determined from the amino acid sequence was 28,497, which almost coincided with the molecular weight of creatinine amide hydrolase of Arthrobacter sp. TE1826.
[0040]
Example 4 Construction of Recombinant Vector pCNHAR-1 In order to remove portions other than the creatinine amide hydrolase gene from the inserted DNA fragment of pCNHAA-1, the size of the inserted DNA fragment was reduced by PCR. PCR was performed under the following reaction solution composition and amplification conditions.
<Reaction solution composition>
Pfu DNA polymerase (Stratagene) 5U / 100μl
10-fold Pfu DNA polymerase buffer 10 μl / 100 μl
pCNHAA-1 (Template DNA) 0.1 μg / 100μl
dATP, dTTP, dGTP, dCTP 0.2mM each
2 primers each 1 μM
(Described in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing)
[0041]
<Amplification conditions>
Denaturation 95 ° C, temperature change for 30 seconds 1 minute 30 seconds annealing 45 ° C, temperature change for 1 second 1 second reaction 75 ° C, temperature change for 2 minutes 30 seconds 1 second (the above cycle is implemented 30 times in total)
[0042]
About 0.8 kbp of the amplified DNA fragment was treated with restriction enzymes NdeI and BamHI (manufactured by Toyobo) and ligated to pLED-M1 cleaved with the same restriction enzyme to prepare pCNHAR-1. A restriction enzyme map of pCNHAR-1 is shown in FIG.
The inserted DNA fragment of pCNHAR-1 does not contain a portion other than the creatinine amide hydrolase gene. That is, there are NdeI and BamHI restriction enzyme cleavage sites at both ends of the inserted DNA fragment, NdeI overlaps with the start codon (ATG) of the creatinine amide hydrolase gene, and BamHI immediately after the stop codon (TGA) of the creatinine amide hydrolase gene. Is located.
[0043]
Example 5 Preparation of Transformant Escherichia coli JM109 competent cell (Toyobo Co., Ltd.) was transformed with pCNHAR-1 to obtain a transformant Escherichia coli JM109 (pCNHAR-1).
[0044]
Example 6 Production of creatinine amide hydrolase from Escherichia coli JM109 (pCNHAR-1) 500 ml of LB medium was dispensed into a 2 L flask, autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, allowed to cool, and then separately sterile filtered 50 mg / ml ampicillin. 0.5 ml (manufactured by Nacalai Tesque) was added. This medium was inoculated with 5 ml of a culture solution of Escherichia coli JM109 (pCNHAR-1) previously cultured with shaking in LB medium at 30 ° C. for 7 hours, and cultured with aeration at 37 ° C. for 18 hours. The creatinine amide hydrolase activity at the end of the culture was about 18 U / ml.
[0045]
The cells were collected by centrifugation and suspended in 20 mM phosphate buffer, pH 7.5. The cell suspension was crushed with a French press and centrifuged to obtain a supernatant. The resulting crude enzyme solution was denucleated with polyethyleneimine and subjected to ammonium sulfate fractionation, then desalted by gel filtration with Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech), and DEAE Sepharose CL-6B (Pharmacia). Biotech) column chromatography and octyl sepharose CL6-B (Pharmacia Biotech) column chromatography were used for separation and purification to obtain a purified enzyme sample. The creatinine amide hydrolase preparation obtained by this method showed an almost single band on electrophoresis (SDS-PAGE), and the specific activity at this time was about 30 U / mg protein.
[0046]
The properties of creatinine amide hydrolase obtained by the above method are shown below.

[0047]
Example 7
Arthrobacter sp. TE1826 (FERM P-10737) in 2XYT medium (1.6% polypetone, 1% yeast extract, 0.5% sodium chloride, pH 7.2) at 37 ° C. for about 1 to 3 days After culturing, the culture broth was collected by centrifugation, and then lysed to produce creatinine amide hirolase, and the creatinine amide hydrolase was collected.
[0048]
【The invention's effect】
According to the present invention, a novel creatinine amide hydrolase gene is isolated from an Arthrobacter bacterium, a method for producing the enzyme by genetic engineering techniques is established, and a large amount of the enzyme is supplied in large quantities and used for quantification of creatinine. Became possible. Further, by modifying the gene, a method for producing a novel creatinine amide hydrolase with improved physicochemical properties can be derived.
[0049]
[Sequence Listing]

[0050]

[0051]

[0052]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a comparison between the amino acid sequence of creatinine amide hydrolase of the present invention and the amino acid sequence of creatinine amide hydrolase produced by Pseudomonas putida PS-7.
FIG. 2 is a diagram showing a restriction enzyme map of pCNAA-1.
FIG. 3 is a diagram showing a restriction enzyme map of pCNHAR-1.

Claims (8)

Creatinine amide hydrolase, which is a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.   A gene encoding creatinine amide hydrolase, which is a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. A gene encoding creatinine amide hydrolase comprising the following DNA (c) or (d):
(C) DNA comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
(D) The creatinine amide hydrolase activity, which is a protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 , wherein one or several bases are added, deleted or substituted in the base sequence of (c) above DNA encoding an amino acid sequence having   A gene encoding creatinine amide hydrolase containing DNA consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. A recombinant vector containing a gene encoding the creatinine amide hydrolase according to claim 2, 3 or 4 . A transformant obtained by transforming a host cell with the recombinant vector according to claim 5 . A method for producing creatinine amide hydrolase, comprising culturing the transformant according to claim 6 to produce creatinine amide hydrolase, and collecting the creatinine amide hydrolase.   A method for producing creatinine amide hydrolase, comprising culturing Arthrobacter sp. TE1826 (FERM P-10737), producing creatinine amide hydrolase, and collecting the creatinine amide hydrolase.

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