JP4415247B2 - Novel glycerol kinase, gene and method for producing glycerol kinase using the gene - Google Patents
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Description
本発明は、新規なグリセロールキナーゼをコードする遺伝子ならびに遺伝子組換え技術による該酵素の製造法に関する。 The present invention relates to a gene encoding a novel glycerol kinase and a method for producing the enzyme by a gene recombination technique.
グリセロールキナーゼ（ＥＣ ２．７．１．３０）は、グリセロールをマグネシウムとＡＴＰに依存したリン酸化反応によりグリセロール−３−リン酸に変える反応を触媒する酵素である。このグリセロールキナーゼは、１９３７年に、Ｋａｌｃｋａｒによって、肝臓内に発見（例えば、非特許文献１参照。）されて以来、ラット肝、ハト肝、キャンディダ・ミコデルマ（Ｃａｎｄｉｄａ ｍｙｃｏｄｅｒｍａ ）、セルロモナス フラビゲナ（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｆｌａｖｉｇｅｎａ）、サーマス フラーバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）などからの精製が報告され（例えば、非特許文献２〜５および特許文献１参照。）生物全般に広く存在する事が知られている。また、ヒト、バチルス・ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ）サッカロマイセル・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サーマス フラーバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）などから遺伝子のクローニングが報告されている（例えば、非特許文献６〜９参照。）。特に、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）において、該酵素は詳しく研究がなされており、１９６７年に、Ｈａｙａｓｈｉ らによって精製され（例えば、非特許文献１０参照。）、１９８８年にそのクローニングの報告がなされている（例えば、非特許文献１１参照。）。また、遺伝子調節の研究、アロステリック阻害剤による阻害の研究など、広い範囲においても既に研究されている。
一方グリセロールキナーゼの工業分野への応用では臨床検査薬用原料酵素として利用されている。すなわち、試料中の中性脂肪（トリグリセリド）をリパーゼで加水分解し、生じたグリセロールを該酵素によってグリセロール−３−リン酸に変換する。このグリセロールー３−リン酸はグリセロール−３−リン酸酸化酵素を用いた比色定量法やグリセロールー３−リン酸脱水素酵素を用いた紫外部吸収定量法などにより血中の中性脂質の測定に利用されている。 On the other hand, glycerol kinase is used as a raw material enzyme for clinical tests in industrial applications. That is, neutral fat (triglyceride) in a sample is hydrolyzed with lipase, and the resulting glycerol is converted into glycerol-3-phosphate by the enzyme. This glycerol-3-phosphate can be used to measure neutral lipids in blood by colorimetric determination using glycerol-3-phosphate oxidase or ultraviolet absorption determination using glycerol-3-phosphate dehydrogenase. It's being used.
最近の生化学検査用臨床検査薬は溶液状態の検査薬が主流となってきた。そのため従来から酵素に求められる特性（基質に対する高反応性、厳密な基質特異性など）に加え検査薬溶液中での高い安定性も求められるようになってきた。検査薬溶液中の安定性に寄与する特性としては種々あげられるが、一般的に液状検査薬は長期の保存を可能にするため防腐剤を添加されている。この防腐剤が酵素を不安定化することがあるため、防腐剤に対する耐性が高い事も検査薬用酵素の望まれる性質の一つである。 Recently, the clinical test drugs for biochemical tests are mainly in the state of solutions. For this reason, in addition to the properties required for enzymes conventionally (high reactivity with substrates, strict substrate specificity, etc.), high stability in a reagent solution has been required. There are various properties that contribute to the stability in the test solution. Generally, liquid test agents are added with a preservative to enable long-term storage. Since this preservative may destabilize the enzyme, high resistance to the preservative is also one of the desired properties of the enzyme for testing drugs.
これまで高い熱安定性をもつ酵素が液状診断薬で高い安定性を示すと考えられてきており、バチルス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）やサーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）など好熱菌由来のグリセロールキナーゼが汎用されていた。しかし、これらのグリセロールキナーゼは防腐剤に対する耐性が比較的低いという問題を有していた。 Enzymes with high thermostability have been considered to have high stability in liquid diagnostics, and are derived from thermophilic bacteria such as Bacillus stearothermophilus and Thermus flavus. Glycerol kinase was widely used. However, these glycerol kinases have the problem of relatively low resistance to preservatives.
防腐剤に対する耐性の高い新規なグリセロールキナーゼをコードする遺伝子の単離、ならびに遺伝子組換え技術による該酵素の製造法を確立し、該酵素の中性脂質及びグリセロールの定量への利用を可能とする。 Isolation of a gene encoding a novel glycerol kinase highly resistant to preservatives, and establishment of a method for producing the enzyme by gene recombination technology, enabling use of the enzyme for quantification of neutral lipids and glycerol .
本発明者らは上記問題を解決するため鋭意検討した結果、防腐剤に対して高い耐性を有する新規なグリセロールキナーゼを単離することに成功した。具体的には、このようなグリセロールキナーゼを生産する菌として、セルロモナス・エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）を見出した。該菌体より抽出した染
色体ＤＮＡよりグリセロールキナーゼ遺伝子の単離に成功し、そのＤＮＡの全塩基配列を決定した。さらに、グリセロールキナーゼを遺伝子組換え技術によって形質転換体に高生産させることに成功し、高純度なグリセロールキナーゼを安価に大量供給することを可能にした。なお上記菌株は、理化学研究所 生物基盤研究部微生物系統保存施設より購入可能である。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventors have succeeded in isolating a novel glycerol kinase having high resistance to preservatives. Specifically, Cellulomonas sp. JCM2471 strain (Cellulomonas sp. JCM2471) was found as a bacterium that produces such glycerol kinase. The glycerol kinase gene was successfully isolated from the chromosomal DNA extracted from the cells, and the entire nucleotide sequence of the DNA was determined. Furthermore, glycerol kinase has been successfully produced in transformants by gene recombination technology, making it possible to supply a large amount of highly pure glycerol kinase at low cost. The above strains can be purchased from the microbial strain storage facility of RIKEN Biotechnology Research Institute.
すなわち、本発明は、以下の各項のグリセロールキナーゼなどを提供する。
項１． 防腐剤に対して高い耐性を有する事を特徴とするグリセロールキナーゼ
項２． 防腐剤に対する耐性が、防腐剤１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃，１週間共存させた時の活性残存率が７０％以上ある事を特徴とする項１記載のグリセロールキナーゼ
項３． 防腐剤がＮ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ）および／またはその誘導体である、項１または２に記載のグリセロールキナーゼ
項４． 以下の（ａ）または（ｂ）のタンパク質である 項１記載のグリセロールキナーゼ。
（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質
項５． 配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるグリセロールキナーゼをコードする遺伝子。
項６． 以下の（ｃ）または（ｄ）のＤＮＡからなるグリセロールキナーゼをコードする遺伝子。
（ｃ）配列表・配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡ
項７． 項１、２または３記載のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクター。
項８． 項７記載の組換えベクターで宿主細胞を形質転換した形質転換体。
項９． 項８記載の形質転換体を培養し、グリセロールキナーゼを生成させ、該グリセロールキナーゼを採取することを特徴とするグリセロールキナーゼの製造法。
That is, the present invention provides glycerol kinase and the like of the following items.
Item 1. Glycerol kinase, characterized by high resistance to preservatives Item 2. Item 2. Glycerol kinase according to Item 1, wherein the resistance to preservatives is 70% or more when the activity remains at a concentration of 100 mg / L at 25 ° C for 1 week.
(A) a protein comprising the amino acid sequence described in the sequence listing / SEQ ID NO: 1 (b) in the amino acid sequence (a), comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and
(C) DNA comprising the base sequence described in the sequence listing / SEQ ID NO: 2 (d) In the base sequence of (c) above, one or more bases are added, deleted or substituted, and glycerol kinase DNA encoding a protein having activity
本発明により、公知のグリセロールキナーゼに比べ防腐剤に対する高い耐性を有する新規なグリセロールキナーゼをコードする遺伝子が単離され、遺伝子組換え技術による該酵素の製造法が確立され、グリセロールの定量への利用が可能となった。 According to the present invention, a gene encoding a novel glycerol kinase having higher resistance to preservatives than known glycerol kinases has been isolated, and a method for producing the enzyme by genetic recombination technology has been established. Became possible.
本発明のグリセロールキナーゼは、防腐剤に対して高い耐性を有する事を特徴とするグリセロールキナーゼである。
また、本発明は、防腐剤に対する耐性が、防腐剤１００ｍｇ／Ｌの濃度で２５℃，１週間共存させた時の活性残存率が７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上である事を特徴とするグリセロールキナーゼである。
本発明における防腐剤に対する耐性は、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．５中で約５Ｕ／ｍＬのグリセロールキナーゼを２５℃で１週間共存させた場合の活性残存率で評価することができる。
The glycerol kinase of the present invention is a glycerol kinase characterized by having high resistance to preservatives.
In the present invention, the resistance to preservatives is such that the residual activity rate when coexisting at 25 ° C. for 1 week at a concentration of 100 mg / L is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more. It is a glycerol kinase characterized by being.
The resistance to the preservative in the present invention can be evaluated by the activity remaining rate when about 5 U / mL glycerol kinase coexists at 25 ° C. for 1 week in 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.5.
防腐剤は、試薬を保存している間の微生物の増殖を抑制することを目的として、試薬に添加される物質をいう。このときの防腐剤の添加濃度は特に限定されるものではないが、十分な効果が得られる濃度であることが望ましい。防腐剤の添加濃度は、防腐剤の種類や添加する試薬の組成などによって異なるのは当然であり、適当な添加濃度の決定は当業者が適宜実施できることである。 An antiseptic is a substance added to a reagent for the purpose of suppressing the growth of microorganisms while the reagent is stored. The concentration of the preservative added at this time is not particularly limited, but is preferably a concentration at which a sufficient effect can be obtained. Naturally, the addition concentration of the preservative varies depending on the kind of the preservative and the composition of the reagent to be added, and the appropriate addition concentration can be appropriately determined by those skilled in the art.
抗生物質の使用については、近年、耐性菌の発生が問題視されていること等を考慮すると、真に必要な場合以外はのぞましくないと考えられる。また、既に存在する耐性菌の影響を受け、防腐効果が得られない可能性も考えられる。一方、蛋白質直接作用することができる防腐剤は、微生物が耐性を得ることが難しいと考えられる点でより好ましく、今後汎用されていく可能性が高い。このような防腐剤には、例えば、蛋白質のＳＨ基やアミノ基に作用すると言われているＮ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ、略称ＭＩＴ）および／またはその誘導体などが挙げられる。しかし、このような蛋白質に直接作用する防腐剤は当然、共存する酵素蛋白質にも作用するため、蛋白質の構造によっては不安定化を招く可能性がある。このように、防腐剤に対する耐性は、その防腐剤の作用機構と蛋白質の構造の両面に起因すると考えられる。 With regard to the use of antibiotics, it is thought that it is not preferable except when it is really necessary, considering the occurrence of resistant bacteria as a problem in recent years. In addition, there is a possibility that the antiseptic effect cannot be obtained due to the influence of already existing resistant bacteria. On the other hand, a preservative capable of directly acting on a protein is more preferable in that it is considered difficult for a microorganism to obtain resistance, and is likely to be widely used in the future. Examples of such preservatives include N-methylisothiazolone (abbreviated as MIT) and / or a derivative thereof, which are said to act on SH groups and amino groups of proteins. However, such a preservative that directly acts on the protein naturally acts on the coexisting enzyme protein, and thus may be destabilized depending on the structure of the protein. Thus, resistance to a preservative is considered to be due to both the mechanism of action of the preservative and the structure of the protein.
本発明のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子は、グリセロールキナーゼ生産微生物、例えばセルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）などから抽出しても良く、または化学的に合成することもできる。 The gene encoding glycerol kinase of the present invention may be extracted from a glycerol kinase-producing microorganism, for example, Cellulomonas sp. JCM2471 strain, or may be chemically synthesized.
上記遺伝子としては、例えば（ａ）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするＤＮＡ、または（ｂ）アミノ酸配列（ａ）において、１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡがある。ＤＮＡの欠失、置換、付加の程度については、基本的な特性を変化させることなく、あるいはその特性を改善するようにしたものを含む。これらの変異体を製造する方法は、従来から公知である方法に従う。
または、（ｃ）配列表・配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、（ｄ）上記（ｃ）の塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質をコードしているＤＮＡ。
Examples of the gene include (a) DNA encoding a protein comprising the amino acid sequence described in Sequence Listing / SEQ ID NO: 1, or (b) one or more amino acids deleted or substituted in amino acid sequence (a) Alternatively, there is DNA encoding a protein consisting of an added amino acid sequence and having glycerol kinase activity. The degree of DNA deletion, substitution, and addition includes those in which the basic characteristics are not changed or the characteristics are improved. A method for producing these mutants follows a conventionally known method.
Or (c) DNA consisting of the base sequence described in Sequence Listing / SEQ ID NO: 2, (d) one or more bases are added, deleted or substituted in the base sequence of (c) above, and DNA encoding a protein having glycerol kinase activity.
本発明のグリセロールキナーゼをコードする遺伝子を得る方法としては、例えばセルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）の染色体ＤＮＡを分離、精製した後、超音波破砕、制限酵素処理等を用いて、ＤＮＡを断片化したものと、リニアーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑末端または接着末端においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉鎖させて組換ベクターを構築する。こうして得られた組換えベクターは複製可能な宿主微生物に移入した後、グリセロールキナーゼ活性の発現を指標としてスクリーニングして、組換えベクターを保持する微生物を得る。 次いで該微生物を培養し、該培養菌体から該組換えベクターを分離・精製し、該組換えベクターからグリセロールキナーゼ遺伝子を採取すれば良い。 As a method for obtaining a gene encoding the glycerol kinase of the present invention, for example, chromosomal DNA of Cellulomonas sp. The fragmented product and the linear expression vector are closed by binding with DNA ligase or the like at the blunt end or adhesive end of both DNAs to construct a recombinant vector. The recombinant vector thus obtained is transferred to a replicable host microorganism and then screened using the expression of glycerol kinase activity as an index to obtain a microorganism carrying the recombinant vector. Next, the microorganism is cultured, the recombinant vector is separated and purified from the cultured cells, and the glycerol kinase gene is collected from the recombinant vector.
遺伝子供与体であるセルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）に由来するＤＮＡは、具体的には以下のように採取される。すなわち、供与微生物を例えば、１〜３日間攪拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次いでこれを溶菌させることによりグリセロールキナーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼ等の溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の界面活性剤が併用され、さらに凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせても良い。 Specifically, DNA derived from the gene donor Cellulomonas sp. JCM2471 (Cellulomonas sp. JCM2471) is collected as follows. That is, for example, a culture obtained by stirring culture of the donor microorganism for 1 to 3 days is collected by centrifugation, and then lysed to prepare a glycerol kinase gene-containing lysate. As the lysis method, for example, treatment is performed with a lytic enzyme such as lysozyme or β-glucanase, and a protease, other enzyme, or a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS) is used in combination as necessary. You may combine with the physical crushing method like a French press process.
このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離・精製するには常法、例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
また、現在市販されている各種のＤＮＡ抽出用キットを用いる事により純度の良いＤＮＡを効率的に取得する事も可能で有る。
In order to separate and purify DNA from the lysate obtained in this way, conventional methods, for example, deproteinization treatment by phenol treatment or protease treatment, ribonuclease treatment, alcohol precipitation treatment, etc., can be appropriately combined. it can.
In addition, it is possible to efficiently obtain highly pure DNA by using various DNA extraction kits that are currently available on the market.
微生物から分離・精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が適している。 A method for cleaving DNA separated and purified from microorganisms can be performed by, for example, ultrasonic treatment, restriction enzyme treatment, or the like. Type II restriction enzymes that act on specific nucleotide sequences are suitable.
ベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合には、ラムダＺＡＰＩＩ （ストラタジーン製）、λｇｔ・１０、λｇｔ・１１などが使用できる。 またプラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ、ｐＵＣＢＭ２０、ｐＵＣＢＭ２１、ｐＳＥ２８０、ｐＳＥ３８０などが使用できる。
このようなベクターを、上述したグリセロールキナーゼ遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であれば良く、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要なら、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作成することもできる。
Suitable vectors are those constructed for genetic recombination from phages or plasmids that can autonomously grow in the host microorganism. As the phage, for example, when Escherichia coli is used as the host microorganism, lambda ZAPII (manufactured by Stratagene), λgt · 10, λgt · 11 and the like can be used. As a plasmid, for example, when Escherichia coli is used as a host microorganism, pBR322, pUC19, pBluescript, pUCBM20, pUCBM21, pSE280, pSE380, etc. can be used.
A vector fragment can be obtained by cleaving such a vector with the restriction enzyme used for cleaving microbial DNA, which is the glycerol kinase gene donor, but is not necessarily identical to the restriction enzyme used for cleaving the microbial DNA. It is not necessary to use the restriction enzyme. The method for binding the microbial DNA fragment and the vector DNA fragment may be a method using a known DNA ligase. For example, after annealing with the adhesive end of the microbial DNA fragment, the microbial DNA fragment and the vector DNA fragment can be combined with each other by using an appropriate DNA ligase. A recombinant vector with a vector DNA fragment is prepared. If necessary, after annealing, it can be transferred to a host microorganism and a recombinant vector can be prepared using in vivo DNA ligase.
宿主微生物としては、組換えベクターが安定、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質発現できるものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーＫ−１２株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２）、エシェリヒア・コリーＷ３１１０株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｗ３１１０）、エシェリヒア・コリーＣ６００株（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００）、エシェリヒア・コリーＨＢ１０１株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ１０１）、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）などを用いることができる。なおグリセロール無添加の培地では宿主に由来するグリセロールキナーゼの活性は無視できる程度に低いものの、グリセロールキナーゼが欠損した変異株を宿主に用いる事がより好ましく、エシェリヒア・コリーＫＭ１株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＭ１）も利用可能で有る。 Any host microorganism may be used as long as the recombinant vector is stable and capable of autonomous growth and can express a foreign gene. Generally, Escherichia coli K-12 strain (E. coli K-12), Escherichia -Use of Collie W3110 strain (E. coli W3110), Escherichia coli C600 strain (E. coli C600), Escherichia coli HB101 strain (E. coli HB101), Escherichia coli JM109 strain (E. coli JM109), etc. Can do. In the medium without glycerol, the activity of glycerol kinase derived from the host is negligibly low, but it is more preferable to use a mutant lacking glycerol kinase as the host, and Escherichia coli KM1 strain (E. coli KM1) Is also available.
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリー（Ｅ．ｃｏｌｉ）の場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる。また、市販されている各種エシェリヒア・コリーコンピテントセルも使用可能で有る。このようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のグリセロールキナーゼを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとグリセロールキナーゼ活性を同時に発現する微生物を検索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、且つグリセロールキナーゼを生成する微生物を選択すれば良い。 As a method for transferring the recombinant vector into the host microorganism, for example, when the host microorganism is Escherichia coli (E. coli), a competent cell method using calcium treatment, an electroporation method, or the like can be used. Various commercially available Escherichia coli competent cells can also be used. The microorganism which is the transformant thus obtained can stably produce a large amount of glycerol kinase by being cultured in a nutrient medium. Selection for the presence or absence of transfer of the target recombinant vector into the host microorganism may be performed by searching for a drug resistance marker of the vector holding the target DNA and a microorganism that simultaneously expresses glycerol kinase activity, for example, based on the drug resistance marker A microorganism that grows on a selective medium and produces glycerol kinase may be selected.
上記の方法により得られたグリセロールキナーゼ遺伝子の塩基配列は、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２１４，１２０５−１２１０，１９８１）に記載されたジデオキシ法やその改良法に基づく市販の試薬と自動分析機を利用する事により解読可能で有る。またグリセロールキナーゼのアミノ酸配列は、決定した塩基配列より推定した。このようにして一度選択されたグリセロールキナーゼ遺伝子を保有する組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入することも容易に実施することができる。また、グリセロールキナーゼ遺伝子を保有する組換えベクターから制限酵素やＰＣＲ法によりグリセロールキナーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に実施できる。 The base sequence of the glycerol kinase gene obtained by the above method can be obtained by using a commercially available reagent and an automatic analyzer based on the dideoxy method described in Science (Science, 214, 1205-1210, 1981) or its improved method. Can be deciphered. The amino acid sequence of glycerol kinase was deduced from the determined base sequence. The recombinant vector carrying the glycerol kinase gene once selected in this way can be easily removed from the transformed microorganism and transferred to another microorganism. It is also possible to easily collect DNA, which is a glycerol kinase gene, from a recombinant vector carrying a glycerol kinase gene by a restriction enzyme or PCR method, bind it to another vector fragment, and transfer it to a host microorganism.
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理学的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常、多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。培地の炭素源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用される。宿主微生物が資化可能であれば良く、たとえばグルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用できる。窒素源としては、宿主微生物が利用可能な窒素化合物であれば良く、例えばペプトン、肉エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物のような有機窒素化合物や、硫安、塩安のよおおうな無機窒素化合物が使用できる。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用できる。 The culture form of the host microorganism, which is a transformant, may be selected in consideration of the nutritional physiological properties of the host. Usually, the culture is performed in a liquid culture in many cases. It is advantageous to do so. As the carbon source for the medium, those commonly used for culturing microorganisms are widely used. For example, glucose, sucrose, lactose, maltose, fructose, molasses, pyruvic acid and the like can be used as long as the host microorganism can assimilate. The nitrogen source may be any nitrogen compound that can be used by the host microorganism. For example, organic nitrogen compounds such as peptone, meat extract, casein hydrolyzate, soybean koji alkaline extract, ammonium sulfate, and ammonium sulfate. Inorganic nitrogen compounds can be used. In addition, phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, zinc and other salts, specific amino acids, specific vitamins and the like can be used as necessary.
培養温度は宿主微生物が生育し、グリセロールキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリー（Ｅ． ｃｏｌｉ）の場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は培養条件により多少変動するが、グリセロールキナーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な時期に終了すれば良く、通常２０〜４８時間程度である。培地ｐＨは宿主微生物が生育し、グリセロールキナーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、通常好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。 The culture temperature can be appropriately changed within the range in which the host microorganism grows and produces glycerol kinase, but in the case of Escherichia coli (E. coli), it is preferably about 20 to 42 ° C. Although the culture time varies somewhat depending on the culture conditions, it may be completed at an appropriate time in consideration of the time when the glycerol kinase reaches the maximum yield, and is usually about 20 to 48 hours. The pH of the medium can be appropriately changed within the range in which the host microorganism grows and produces glycerol kinase, but is usually preferably about pH 6.0 to 9.0.
培養液より菌体を回収する方法は、通常、用いられる方法により行えば良く、例えば遠心分離、濾過などにより回収することができる。培養液中のグリセロールキナーゼが菌体外にに分泌される場合は、この菌体分離液を用いれば良く、下記の菌体破砕後の方法に準じてグリセロールキナーゼを分離・精製できる。グリセロールキナーゼが菌体内に存在する場合は、前述したような酵素的または物理的破砕方法により破砕抽出することができる。このようにして得られた粗酵素抽出液から例えば硫安沈殿によりグリセロールキナーゼ画分を回収する。この粗酵素液を通常、用いる精製方法、例えば半透膜を用いた透析やセファデックスＧ−２５（アマシャムバイオサイエンス社）ゲル濾過などにより脱塩を行うことができる。 The method for recovering the bacterial cells from the culture solution is usually performed by a method used, and for example, it can be recovered by centrifugation, filtration or the like. When glycerol kinase in the culture solution is secreted outside the cells, this cell separation solution may be used, and glycerol kinase can be separated and purified according to the method after disrupting the cells below. When glycerol kinase is present in the microbial cells, it can be crushed and extracted by the enzymatic or physical crushing method as described above. The glycerol kinase fraction is recovered from the crude enzyme extract thus obtained, for example, by ammonium sulfate precipitation. The crude enzyme solution can be desalted by a purification method usually using, for example, dialysis using a semipermeable membrane or Sephadex G-25 (Amersham Biosciences) gel filtration.
この操作の後、例えばフェニルセファロースファーストフロー（アマシャムバイオサイエンス社）カラムクロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファロースファーストフロー（アマシャムバイオサイエンス社）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し精製酵素標品を得ることができる。この精製酵素標品は電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）的にほぼ単一なバンドを示す程度に純化されている。 After this operation, the purified enzyme preparation can be obtained by separation and purification by, for example, phenyl sepharose first flow (Amersham Biosciences) column chromatography or DEAE-Sepharose first flow (Amersham Biosciences) column chromatography. This purified enzyme preparation is purified to such an extent that it shows an almost single band on electrophoresis (SDS-PAGE).
本発明の製法により得られたグリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質は、以下に示す理化学的性質を有する。
（１）作用：グリセロール ＋ ＡＴＰ ←→ グリセロールー３―リン酸 ＋ ＡＤＰ
（２）至適ｐＨ：約１０．０
（３）至適温度：約５０℃（２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９、５分反応）
（４）ｐＨ安定性：約６．０−１０．０（２５℃で２０時間処理後も９０％以上の残存活性を 示す範囲）
（５）熱安定性：約４５℃以下（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で１５分処理後も９０％以上の残存活性を示す範囲）
（６）分子量：約５５，０００（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）、約１７６，０００（ゲル濾過）
（７）Ｋｍ値：約６．９×１０−６Ｍ（グリセロール）、約１．１１×１０−４Ｍ（ＡＴＰ）
（８）比活性：約４１．２Ｕ／ｍｇ
（９）５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で１００ｍｇ／Ｌ ＭＩＴと共存させた場合の活性残存率は４℃×１週間保存ではほぼ１００％（図５）、２５℃×１週間保存で約９２％（図６）であった。
The protein having glycerol kinase activity obtained by the production method of the present invention has the following physicochemical properties.
(1) Action: Glycerol + ATP ← → Glycerol-3-phosphate + ADP
(2) Optimum pH: about 10.0
(3) Optimal temperature: about 50 ° C. (20 mM HEPES buffer, pH 7.9, reaction for 5 minutes)
(4) pH stability: about 6.0 to 10.0 (range showing a residual activity of 90% or more after treatment at 25 ° C. for 20 hours)
(5) Thermal stability: about 45 ° C. or less (range showing a residual activity of 90% or more after treatment with 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 for 15 minutes)
(6) Molecular weight: about 55,000 (SDS-PAGE), about 176,000 (gel filtration)
(7) Km value: about 6.9 × 10 −6 M (glycerol), about 1.11 × 10 −4 M (ATP)
(8) Specific activity: about 41.2 U / mg
(9) The activity remaining rate when coexisting with 100 mg / L MIT at 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 is almost 100% when stored at 4 ° C. for 1 week (FIG. 5), and stored at 25 ° C. for 1 week. About 92% (FIG. 6).
本発明のグリセロールキナーゼは、特にその存在形態を問わない。必要に応じ凍結乾燥、液状及びその他いずれの状態であってもよい。凍結乾燥の場合はさらに適当な賦形剤・安定化剤などを添加されていてもよい。液状では、さらに適当な緩衝液および／またはその他の成分などを添加されていてもよい。 The existence form of the glycerol kinase of the present invention is not particularly limited. If necessary, it may be freeze-dried, liquid, or any other state. In the case of freeze-drying, an appropriate excipient / stabilizer may be further added. In the liquid state, an appropriate buffer and / or other components may be added.
以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例中、グリセロールキナーゼの活性は、以下のようにして測定した。ＡＴＰはオリエンタル酵母社より購入した。牛血清アルブミンはシグマアルドリッチ社より購入した。グリセロールー３−リン酸酸化酵素（コード番号Ｇ３Ｏ−３０１）、ペルオキシダーゼ（コード番号ＰＥＯ−３０１）は東洋紡績製を使用した。その他の試薬はナカライテスクより購入したものを使用した。
EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to these examples.
In the examples, the activity of glycerol kinase was measured as follows. ATP was purchased from Oriental Yeast. Bovine serum albumin was purchased from Sigma Aldrich. Glycerol-3-phosphate oxidase (code number G3O-301) and peroxidase (code number PEO-301) were manufactured by Toyobo. Other reagents used were purchased from Nacalai Tesque.
＜測定法１：レートアッセイによるグリセロールキナーゼ活性を測定する方法＞
通常、この方法を用いて活性測定を行った。
グリセロールを基質とし、グリセロール−３−リン酸の生成量によって酵素活性を測定した。０．５％４―アミノアンチピリン水溶液０．２ｍｌ、１．５％フェノール水溶液０．２ｍｌ、グリセロールー３―リン酸酸化酵素２００Ｕ、ペルオキシダーゼ８０Ｕ、ＡＴＰ４８．４ｍｇに０．１Ｍ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．９）を加え、総量２１ｍｌとし、これを以下の測定のための原液とした。各反応は、この測定原液を３ｍｌ取り、０．３Ｍグリセロール水溶液５０μｌ、酵素溶液１００μｌを添加し、混和後、３７℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの吸光度を３分間記録し、その初期直線部分から１分間当たりの吸光度変化を求めた（ΔＯＤｔｅｓｔ）。盲検は酵素溶液の代わりに酵素希釈液（０．２％牛血清アルブミンを含む２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液，ｐＨ７．５）を１００μｌ加え上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度変化量を求めた（ΔＯＤｂｌａｎｋ）。
得られた吸光度変化量より下記計算式に基づきグリセロールキナーゼの酵素活性を算出した。なお上記条件下で１分間に１マイクロモルのグリセロールをリン酸化する酵素量を１単位（１Ｕ）とする。
計算式
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＯＤ／ｍｉｎ（ΔＯＤｔｅｓｔ−ΔＯＤｂｌａｎｋ）×３．１５（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛１３．３×１／２×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）｝
３．１５ｍｌ＝反応混液液量
１３．３＝キノン色素の上記測定条件下でのミリモル吸光係数
１／２＝酵素反応で生成した過酸化水素の１分子から形成するキノン色素が１／２分子であることによる係数
１．０ｃｍ＝セルの光路長
０．１ｍｌ＝酵素サンプル液量
<Measurement method 1: Method for measuring glycerol kinase activity by rate assay>
Usually, the activity was measured using this method.
Using glycerol as a substrate, enzyme activity was measured by the amount of glycerol-3-phosphate produced. 0.5% 4-aminoantipyrine aqueous solution 0.2 ml, 1.5% phenol aqueous solution 0.2 ml, glycerol-3-phosphate oxidase 200 U, peroxidase 80 U, ATP 48.4 mg, 0.1 M HEPES buffer (pH 7.9) Was added to make a total volume of 21 ml, which was used as a stock solution for the following measurement. For each reaction, 3 ml of this measurement stock solution was taken, 50 μl of 0.3 M glycerol aqueous solution and 100 μl of enzyme solution were added, and after mixing, the absorbance at 500 nm was recorded for 3 minutes with a spectrophotometer controlled at 37 ° C. The change in absorbance per minute was determined from the portion (ΔODtest). In the blind test, an enzyme dilution solution (20 mM potassium phosphate buffer solution containing 0.2% bovine serum albumin, pH 7.5) was added in an amount of 100 μl instead of the enzyme solution, and the same operation as described above was performed to determine the amount of change in absorbance per minute. It was determined (ΔODblank).
The enzyme activity of glycerol kinase was calculated from the obtained change in absorbance based on the following formula. The amount of enzyme that phosphorylates 1 micromole of glycerol per minute under the above conditions is defined as 1 unit (1 U).
Formula activity value (U / ml) = {ΔOD / min (ΔODtest−ΔODblank) × 3.15 (ml) × dilution factor} / {13.3 × 1/2 × 1.0 (cm) × 0.1 (Ml)}
3.15 ml = reaction mixture volume 13.3 = molar extinction coefficient of quinone dye under the above measurement conditions 1/2 = 1/2 molecule of quinone dye formed from one molecule of hydrogen peroxide generated by enzyme reaction Coefficient 1.0 cm = cell optical path length 0.1 ml = enzyme sample solution amount
＜測定法２：至適温度を測定する方法＞
酵素の至適温度を見るためにこの方法を用いた。
３ｍｌの活性反応液（４ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ 塩化マグネシウムを含む２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．９）を試験管に分注し、適当な濃度（測定法１の活性でおよそ１Ｕ／ｍｌ）に希釈したグリセロールキナーゼ溶液０．１ｍｌを加え、良く混合した後、各反応温度で約３分間予備加温する。次いで０．３Ｍのグリセロール水溶液を０．０５ｍｌ添加混合して反応を開始する。正確に１０分間反応させた後、１ｍｌの１Ｎ塩酸を添加して酵素反応を停止する。この反応停止液０．１５ｍｌを３ｍｌの発色液（０．０１％ ４アミノアンチピリン、０．０２％ フェノール、５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ、１６Ｕ／ｍｌ グリセロールー３−リン酸オキシダーゼを含む０．２ＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９）に添加・混合し、３７℃で約５分間反応させ、５００ｎｍでの吸光度を測定した。この時、１ｍＭ Ｌ−グリセロールー３−リン酸溶液の吸光度も同時に求めて、各酵素反応により生じたＬ−グリセロールー３−リン酸の量を求めた。なお、盲検はグリセロールキナーゼ溶液の代わりに酵素希釈液を用いて各反応温度での酵素反応によらない非特異的なＬ−グリセロールー３−リン酸の生成を求めた。
<Measurement method 2: Method of measuring optimum temperature>
This method was used to see the optimum temperature of the enzyme.
3 ml of active reaction solution (20 mM HEPES buffer pH 7.9 containing 4 mM ATP, 2 mM magnesium chloride) was dispensed to a test tube and diluted to an appropriate concentration (approximately 1 U / ml for the activity of assay 1) Add 0.1 ml of solution and mix well, then pre-warm for about 3 minutes at each reaction temperature. Next, 0.05 ml of 0.3 M aqueous glycerol solution is added and mixed to start the reaction. After reacting for exactly 10 minutes, 1 ml of 1N hydrochloric acid is added to stop the enzyme reaction. 0.15 ml of this reaction stop solution was added to 3 ml of color developing solution (0.01% 4 aminoantipyrine, 0.02% phenol, 5 U / ml peroxidase, 0.2 MHEPES buffer containing 16 U / ml glycerol-3-phosphate oxidase,
＜測定法３：至適ｐＨを測定する方法＞
酵素の至適ｐＨを見るためにこの方法を用いた。
３ｍｌの活性反応液（４ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ 塩化マグネシウムを含む５０ｍＭ濃度の各ｐＨ緩衝液）を試験管に分注し、適当な濃度（測定法１の活性でおよそ１Ｕ／ｍｌ）に希釈したグリセロールキナーゼ溶液０．１ｍｌを加え、良く混合した後、３７℃で約３分間予備加温する。次いで０．３Ｍのグリセロール水溶液を０．０５ｍｌ添加混合して反応を開始する。正確に１０分間反応させた後、１ｍｌの１Ｎ塩酸を添加して酵素反応を停止する。この反応停止液０．１５ｍｌを３ｍｌの発色液（０．０１％ ４アミノアンチピリン、０．０２％ フェノール、５Ｕ／ｍｌ ペルオキシダーゼ、１６Ｕ／ｍｌ グリセロールー３−リン酸オキシダーゼを含む０．２ＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９）に添加・混合し、３７℃で約５分間反応させ、５００ｎｍでの吸光度を測定した。この時、１ｍＭ Ｌ−グリセロールー３−リン酸溶液の吸光度も同時に求めて、各酵素反応により生じたＬ−グリセロールー３−リン酸の量を求めた。なお、盲検はグリセロールキナーゼ溶液の代わりに酵素希釈液を用いて各ｐＨの緩衝液での酵素反応によらない非特異的なＬ−グリセロールー３−リン酸の生成を求めた。
<Measurement method 3: Method for measuring optimum pH>
This method was used to see the optimum pH of the enzyme.
3 ml of active reaction solution (50 mM concentration of each pH buffer solution containing 4 mM ATP, 2 mM magnesium chloride) was dispensed into a test tube and diluted to an appropriate concentration (approximately 1 U / ml with the activity of measurement method 1). Add 0.1 ml of the solution, mix well, and preheat at 37 ° C. for about 3 minutes. Next, 0.05 ml of 0.3 M aqueous glycerol solution is added and mixed to start the reaction. After reacting for exactly 10 minutes, 1 ml of 1N hydrochloric acid is added to stop the enzyme reaction. 0.15 ml of this reaction stop solution was added to 3 ml of color developing solution (0.01% 4 aminoantipyrine, 0.02% phenol, 5 U / ml peroxidase, 0.2 MHEPES buffer containing 16 U / ml glycerol-3-phosphate oxidase,
［参考例］
セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）からのグリセロールキナーゼの精製
セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）を６０ｍｌのＬＢ液体培地（５００ｍｌ容坂口フラスコ）に１白金耳植菌し３０℃で一晩振とう培養した。本培養液を６Ｌのグリセロールキナーゼ生産培地（１０Ｌ−ジャーファーメンター、２％グリセロール、２％ポリペプトン（日本製薬製）、０．２％酵母エキス（オリエンタル酵母社製）、０．２％ＮａＣｌ、０．０２％硫酸マグネシウム、０．７％リン酸２カリウム、ｐＨ７．３）に全量植菌し３５℃にて約２０時間通気攪拌培養した。この時のグリセロールキナーゼの培地あたりの生産量は凡そ３Ｕ／ｍｌであった。
本培養液より遠心分離により菌体を回収し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５に懸濁後、ダイノミル破砕機を用いたガラスビーズ破砕によりグリセロールキナーゼを抽出し粗酵素液とした。この粗酵素液より硫安を添加し３５−５５％飽和度画分を回収した。この塩析画分をセファデックスＧ−２５（アマシャムバイオサイエンス社）ゲル濾過により脱塩した後、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社）カラムクロマトグラフィー、フェニルセファロースＣＬ−６Ｂ（アマシャムバイオサイエンス社）カラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２５ゲル濾過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムクロマトグラフィーに順次供して精製酵素標品を得た。上記精製結果を表１に示した。
[Reference example]
Purification of glycerol kinase from Cellulomonas sp. JCM2471 strain (Cellulomonas sp. JCM2471) Cellulomonas sp. JCM2471 strain (Cellulomonas sp. JCM2471) was inoculated into one 60 ml LB liquid medium (500 ml Sakaguchi flask) at 30 ° C overnight. Cultured with shaking. The main culture was treated with 6 L of glycerol kinase production medium (10 L-jar fermenter, 2% glycerol, 2% polypeptone (manufactured by Nippon Pharmaceutical), 0.2% yeast extract (oriental yeast), 0.2% NaCl, 0 The whole amount was inoculated in 0.02% magnesium sulfate, 0.7% dipotassium phosphate, pH 7.3), and cultured at 35 ° C. for about 20 hours with aeration and stirring. At this time, the production amount of glycerol kinase per medium was about 3 U / ml.
Bacterial cells were collected from the main culture solution by centrifugation, suspended in 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5, and glycerol kinase was extracted by crushing glass beads using a dynomill crusher to obtain a crude enzyme solution. From this crude enzyme solution, ammonium sulfate was added to recover a 35-55% saturation fraction. This salted-out fraction was desalted by Sephadex G-25 (Amersham Biosciences) gel filtration, then DEAE Sepharose CL-6B (Amersham Biosciences) column chromatography, phenyl Sepharose CL-6B (Amersham Biosciences). ) Column chromatography, Sephadex G-25 gel filtration, and DEAE Sepharose CL-6B column chromatography were sequentially used to obtain a purified enzyme preparation. The purification results are shown in Table 1.
上記方法により精製した蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ均一なバンドを示しその比活性は凡そ４０．９Ｕ／ｍｇ−タンパクであった。なお、蛋白質濃度は酵素溶液の２８０ｎｍでの吸光度が１Ａｂｓの時１ｍｇ／ｍｌの蛋白質濃度になるとしてし概算した。
また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥより推定されるサブユニットの分子量は約５５，０００であった。更に、そのＮ末端アミノ酸配列をエドマン分解法を原理としたアミノ酸配列解析装置により解析した結果、Ｎ末端からの配列はＡｌａ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒａ−Ｉｌｅと同定された。
The protein purified by the above method showed an almost uniform band in SDS-PAGE and its specific activity was about 40.9 U / mg protein. The protein concentration was estimated assuming that the protein concentration was 1 mg / ml when the absorbance at 280 nm of the enzyme solution was 1 Abs.
Moreover, the molecular weight of the subunit estimated from SDS-PAGE was about 55,000. Furthermore, as a result of analyzing the N-terminal amino acid sequence with an amino acid sequence analyzer based on the Edman degradation method, the sequence from the N-terminal was identified as Ala-Asp-Tyr-Val-Leu-Ara-Ile.
［実施例１］
セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）からの染色体ＤＮＡの分離
セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株をＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管；１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１白金耳植菌し、３０℃にて一晩振とう培養した。この菌体１ｍｌ分から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により菌体を回収した。回収した菌体よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ｇｅｎｏｍ−キット（東洋紡績製）を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体ＤＮＡを抽出した。１ｍｌの菌体より約２０μｇの染色体ＤＮＡを取得できた。
[Example 1]
Isolation of chromosomal DNA from Cellulomonas sp. JCM2471 strain (Cellulomonas sp. JCM2471) Chromosomal DNA of Cellulomonas sp. JCM2471 strain (Cellulomonas sp. JCM2471) was isolated by the following method. The strain was inoculated with 1 platinum ear in LB liquid medium (5 ml preparation / 30 ml test tube; 1.0% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1.0% NaCl, pH 7.4) at 30 ° C. Cultured overnight with shaking. The bacterial cells were collected from 1 ml of the bacterial cells by centrifugation (12000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.). Chromosomal DNA was extracted from the collected cells using the MagExtractor-genom-kit (manufactured by Toyobo) according to the procedure described in the instruction manual. About 20 μg of chromosomal DNA could be obtained from 1 ml of cells.
［実施例２］ ＰＣＲによるグリセロールキナーゼ遺伝子の増幅
ポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）用プライマーは、現在クローニングの報告がされているエシェリヒア・コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）、バチルス・ズブリルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のグリセロールキナーゼの塩基配列を基にして作製した。配列表・配列番号３、配列表・配列番号４に記載される塩基配列はＰＣＲ用プライマーを示す。実施例１で得たＤＮＡ１００ｎｇ、各プライマー２００ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物１０μｌ、反応緩衝液１０μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー製）２．５Ｕを混和し１００μｌとした。これを９４℃、１分間の変性反応、４５℃、１分間のアニーリング反応、および７２℃、３分間の伸長反応を３０サイクル繰り返してＰＣＲを行った。その結果、目的の大きさである約８００ｂｐのフラグメントが増幅された。このＰＣＲ産物の塩基配列を決定し、推定されるアミノ酸配列をシュードモナス アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のグリセロールキナーゼのアミノ配列と比較したところ、高い相同性を示したので、目的のグリセロールキナーゼ遺伝子の一部が増幅されたことが明らかとなった。
[Example 2] Amplification of glycerol kinase gene by PCR Primers for polymerase chain reaction (PCR) are currently reported for cloning, such as E. coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa ( It was prepared based on the base sequence of glycerol kinase of Pseudomonas aeruginosa). The base sequences described in Sequence Listing / SEQ ID NO: 3 and Sequence Listing / SEQ ID NO: 4 represent PCR primers. 100 ng of the DNA obtained in Example 1, 200 pmol of each primer, 10 μl of dNTP mixture, 10 μl of reaction buffer, and 2.5 U of AmpliTaq DNA polymerase (manufactured by PerkinElmer) were mixed to make 100 μl. PCR was performed by repeating 30 cycles of a denaturation reaction at 94 ° C. for 1 minute, an annealing reaction at 45 ° C. for 1 minute, and an extension reaction at 72 ° C. for 3 minutes. As a result, an about 800 bp fragment of the desired size was amplified. The nucleotide sequence of this PCR product was determined, and the deduced amino acid sequence was compared with the amino acid sequence of Pseudomonas aeruginosa glycerol kinase. As a result, it showed a high degree of homology. It became clear that it was amplified.
［実施例３］ グリセロールキナーゼ遺伝子全長のクローニング
実施例１で取得した染色体ＤＮＡ約２μｇを種々の制限酵素で消化後、０．７％アガロースゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを、実施例２で得たＰＣＲ産物をプローブとしＥＣＬ ｄｉｒｅｃｔ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（アマシャムバイオサイエンス社製）を用い、試薬に添付されたプロトコールに準じてサザンハイブリダイゼーションによりグリセロールキナーゼ遺伝子の断片をスクリーニングした。その結果、グリセロールキナーゼ遺伝子全長を含むＤＮＡ断片はＫｐｎＩ（東洋紡績製）とＮｏｔＩ（東洋紡績製）により切断された約６．５ｋｂの断片として検出された。
次いでこのＤＮＡ断片をＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キット（東洋紡績製）を用いて、取扱説明書に記載された手順によりアガロースゲルより回収した。一方０．５μｇのｐｕＣＢＭ２１（ベーリンガーマンハイム社）を同じくＫｐｎＩとＮｏｔＩで切断し、バクテリアルアルカリホスファターゼ（東洋紡績製）にて脱リン酸化処理した。その後、両ＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキット（東洋紡績製）にて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒアコリーＪＭ１０９のコンピテントセル（東洋紡績製）を形質転換した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。なおこの組換えベクターはｐＣＧＫ１と命名した。
[Example 3] Cloning of full length of glycerol kinase gene About 2 μg of chromosomal DNA obtained in Example 1 was digested with various restriction enzymes, separated by 0.7% agarose gel electrophoresis, and transferred to a nitrocellulose filter. Using this filter, the PCR product obtained in Example 2 as a probe and ECL direct nucleic acid labeling and detection system (manufactured by Amersham Biosciences), by Southern hybridization according to the protocol attached to the reagent, the glycerol kinase gene Fragments were screened. As a result, a DNA fragment containing the full length of the glycerol kinase gene was detected as an approximately 6.5 kb fragment cleaved by KpnI (manufactured by Toyobo) and NotI (manufactured by Toyobo).
Next, this DNA fragment was recovered from an agarose gel by using a MagExtractor-PCR & gel clean up-kit (manufactured by Toyobo) according to the procedure described in the instruction manual. On the other hand, 0.5 μg of puCBM21 (Boehringer Mannheim) was similarly cut with KpnI and NotI, and dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase (manufactured by Toyobo). Subsequently, both DNA fragments were ligated by reaction at 16 ° C. for 1 hour with a Ligation High kit (Toyobo), and then transformed into competent cells of Escherichia coli JM109 (Toyobo). The transformant was applied to an LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin, and cultured at 37 ° C. overnight to obtain a transformant. This recombinant vector was named pCGK1.
［実施例４］ グリセロールキナーゼ酵素遺伝子の塩基配列決定
ｐＣＧＫ１にクローニングされたグリセロールキナーゼ遺伝子の塩基配列はｐＵＣ系ベクターの汎用シークエンシング用プライマーを用い、ビッグダイターミネーターサイクルシーケンシングＦＳレディーリアクションキット（アプライドバイオシステムズ社製）及びＡＢＩ ＰＲＩＳＭ３１０ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（パーキンエルマー社製）により挿入ＤＮＡの両端よりＤＮＡ配列を決定した。更にこの確認した配列を基に更にプライマーを作成しプライマーウォーキングにより挿入ＤＮＡ配列の全長を決定した。
決定したグリセロールキナーゼ遺伝子のオープンリーディングフレームに該当するＤＮＡ配列及びＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列を配列表配列番号２に示した。またＤＮＡ配列より推定されるアミノ酸配列の内、第２残基目のＡｌａを含む７残基分の配列が精製酵素のアミノ酸配列解析により得られた結果と完全に一致していた。また開始コドンのメチオニンを除いた推定アミノ酸配列より算出されるグリセロールキナーゼの分子量は５５１４２であり、セルロモナス エスピーＪＣＭ２４７１株（Ｃｅｌｌｕｌｏｍｏｎａｓ ｓｐ． ＪＣＭ２４７１）から精製された酵素のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析より求められた分子量と良く一致した。
[Example 4] Determination of the base sequence of the glycerol kinase enzyme gene The base sequence of the glycerol kinase gene cloned into pCGK1 uses a primer for general-purpose sequencing of a pUC vector, and Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Bio The DNA sequence was determined from both ends of the inserted DNA by Systems) and ABI PRISM310 Genetic Analyzer (PerkinElmer). Furthermore, a primer was further prepared based on the confirmed sequence, and the total length of the inserted DNA sequence was determined by primer walking.
The DNA sequence corresponding to the determined open reading frame of the glycerol kinase gene and the amino acid sequence deduced from the DNA sequence are shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. Of the amino acid sequence deduced from the DNA sequence, the 7-residue sequence containing Ala as the second residue was completely consistent with the results obtained by amino acid sequence analysis of the purified enzyme. The molecular weight of glycerol kinase calculated from the deduced amino acid sequence excluding the methionine of the start codon is 55142, and the molecular weight determined by SDS-PAGE analysis of the enzyme purified from Cellulomonas sp. JCM2471 strain (Cellulomonas sp. JCM2471) Matched well.
［実施例５］ グリセロール欠損宿主の造成
ＧｅｎＢａｎｋデータベースに登録されているエシェリヒア・コリー（Ｅ． ｃｏｌｉ）由来グリセロールキナーゼの塩基配列より配列表・配列番号５及び配列表・配列番号６のプライマーを作成した。またエシェリヒア・コリー（Ｅ． ｃｏｌｉ）Ｋ１２株の染色体ＤＮＡは実施例１と同様の方法により取得した。
この染色体ＤＮＡ１００ｎｇ、各プライマー２００ｐｍｏｌ、２ｍＭ ｄＮＴＰ混合物１０μｌ、反応緩衝液１０μｌ、ＡｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー製）２．５Ｕを混和し１００μｌとした。これを９４℃、３分間の変性反応、９８℃、３０秒間の変性反応、６８℃、３分間のアニーリング＋伸長反応を４１サイクル繰り返し、次いで９８℃、３０秒間の変性反応、６８℃、３分間のアニーリング＋伸長反応、７２℃、１０分間の伸長反応を１サイクルしてＰＣＲを行った。この結果目的遺伝子と同じ約１．５ｋｂのＰＣＲ産物を取得した。
このＰＣＲ産物をＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キットを用いて、取扱説明書に記載された手順により精製した後、約０．２μｇのＰＣＲ産物と制限酵素ＳｍａＩで切断した０．５μｇのｐＵＣ１９とをＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキットにて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒアコリーＪＭ１０９（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。なおこの組換えベクターはｐＵＣＧＫと命名した。
このｐＵＣＧＫを制限酵素ＢｓｔＥＩＩ（東洋紡績製）で切断し、Ｂｌｕｎｔｉｎｇ Ｈｉｇｈハイキット（東洋紡績製）を用いて取扱い説明書に記載された手順で切断末端を平滑化した。一方、ｐＵＣＫ４（アマシャムバイオサイエンス社製）をＨｉｎｃＩＩで切断し、アガロースゲル電気泳動でカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を分離後、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キットを用いて精製回収した。この両断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキットにて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒアコリーＪＭ１０９（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）のコンピテントセルを形質転換した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンをを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。この組換えベクターはｐＵＣＧＫｍと命名した。更にこのｐＵＣＧＫｍを制限酵素ＥｃｏＲＩ（東洋紡績製）とＳａｌＩ（東洋紡績製）で切断し、アガロースゲル電気泳動でグリセロールキナーゼ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子を含む断片を分離後、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キットを用いて精製回収した。一方温度感受性プラスミドｐＣＨ０２（ｐＳＣ１０１プラスミドからの誘導体；Ｓ．Ｍａｔｓｕｙａｍａら、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．，１７５，３３１（１９８４））もＥｃｏＲＩ（東洋紡績製）とＳａｌＩ（東洋紡績製）で切断しグリセロールキナーゼ遺伝子とカナマイシン耐性遺伝子を含む断片とＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキットにて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒア・コリーＫ−１２株（Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ−１２）をジーン・パルサー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）を用いたエレクトロポレーション法により形質転換した。なお、エレクトロポレーションの条件はジーンパルサーの使用マニュアルのエシェリヒア・コリーの条件に従った。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンをを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃，終夜培養して形質転換体を取得した。
この形質転換体を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／２０ｍｌ試験管）に植菌し、３７℃にて２４時間振とう培養した。この培養液を更に新たなカナマイシンを含むＬＢ液体培地に植え継ぐことを４回繰返した。この培養液を滅菌した生理食塩水で希釈した後、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地に塗布してシングルコロニーを分離した後、アンピシリン感受性でかつカナマイシン耐性のコロニーを分離しエシェリヒア・コリーＫＭ１株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＫＭ１）とした。
このエシェリヒア・コリーＫＭ１株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＫＭ１）を５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むトレフィックブロス（５ｍｌ仕込み／２０ｍｌ試験管；１．２％ポリペプトン、２．４％酵母エキス、０．５％グリセロール、０．２３１％リン酸１カリウム、１．２５４％リン酸２カリウム）に植菌し、３７℃で２４時間振とう培養した後、１ｍｌの培養液から遠心分離により菌体を回収し、１ｍｌの５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５に懸濁した。この懸濁液を超音波破砕機により菌体を破砕し、遠心分離の後の上清を粗酵素としてグリセロールキナーゼの活性を測定したが有意な酵素活性は検出されなかった。
[Example 5] Construction of glycerol-deficient host Primers of Sequence Listing / SEQ ID NO: 5 and Sequence Listing / SEQ ID NO: 6 were prepared from the base sequence of glycerol kinase derived from Escherichia coli (E. coli) registered in the GenBank database. . Further, the chromosomal DNA of Escherichia coli K12 strain was obtained in the same manner as in Example 1.
100 ng of this chromosomal DNA, 200 pmol of each primer, 10 μl of 2 mM dNTP mixture, 10 μl of reaction buffer, and 2.5 U of AmpliTaq DNA polymerase (manufactured by Perkin Elmer) were mixed to make 100 μl. This was repeated for 41 cycles of a denaturation reaction at 94 ° C. for 3 minutes, a denaturation reaction at 98 ° C. for 30 seconds, an annealing + extension reaction at 68 ° C. for 3 minutes, and then a denaturation reaction at 98 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 3 minutes. PCR was performed by one cycle of annealing + extension reaction at 72 ° C. for 10 minutes. As a result, the same 1.5 kb PCR product as the target gene was obtained.
The PCR product was purified using the MagExtractor-PCR & gel clean up kit according to the procedure described in the instruction manual, and then ligated with about 0.2 μg of the PCR product and 0.5 μg of pUC19 cleaved with the restriction enzyme SmaI. After ligation by reaction at 16 ° C. for 1 hour with a High kit, competent cells of Escherichia coli JM109 (E. coli JM109) were transformed. The transformant was applied to an LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin, and cultured at 37 ° C. overnight to obtain a transformant. This recombinant vector was named pUCGK.
This pUCGK was cleaved with the restriction enzyme BstEII (manufactured by Toyobo), and the cleaved ends were blunted by using the Blunting High Hikit (manufactured by Toyobo) according to the procedure described in the instruction manual. On the other hand, pUCK4 (manufactured by Amersham Biosciences) was cleaved with HincII, a DNA fragment containing a kanamycin resistance gene was separated by agarose gel electrophoresis, and then purified and recovered using MagExtractor-PCR & gel clean up-kit. These fragments were ligated by reaction at 16 ° C. for 1 hour using a Ligation High kit, and then competent cells of Escherichia coli JM109 (E. coli JM109) were transformed. The transformant was applied to an LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin and 50 μg / ml kanamycin, and cultured at 37 ° C. overnight to obtain a transformant. This recombinant vector was named pUCGKm. Further, this pUCCGKm was cleaved with restriction enzymes EcoRI (Toyobo) and SalI (Toyobo), and a fragment containing a glycerol kinase gene and a kanamycin resistance gene was separated by agarose gel electrophoresis, and then a MagExtractor-PCR & gel clean up-kit was prepared. Used for purification and recovery. On the other hand, temperature sensitive plasmid pCH02 (derivative from pSC101 plasmid; S. Matsuyama et al., J. Mol. Biol., 175, 331 (1984)) was also digested with EcoRI (Toyobo) and SalI (Toyobo) and glycerol kinase. The fragment containing the gene and the kanamycin resistance gene was ligated by ligation with a Ligation High kit at 16 ° C. for 1 hour, and then Escherichia coli K-12 strain (E. coli K-12) was produced by Gene Pulser (manufactured by Bio-Rad). ) Was transformed by electroporation method. The electroporation conditions were in accordance with the conditions of Escherichia Collie in the Gene Pulser manual. The transformant was applied to an LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin and 50 μg / ml kanamycin, and cultured at 30 ° C. overnight to obtain a transformant.
This transformant was inoculated into an LB liquid medium (5 ml prepared / 20 ml test tube) containing 50 μg / ml kanamycin and cultured with shaking at 37 ° C. for 24 hours. Inoculation of this culture broth to an LB liquid medium containing new kanamycin was repeated four times. This culture solution is diluted with sterilized physiological saline and applied to an LB agar medium containing 50 μg / ml kanamycin to separate single colonies. Then, an ampicillin-sensitive and kanamycin-resistant colony is isolated and Escherichia coli KM1. Strain (E. coli KM1).
This Escherichia coli KM1 strain (E. coli KM1) was added to Trephic broth containing 5 μg / ml kanamycin (5 ml preparation / 20 ml test tube; 1.2% polypeptone, 2.4% yeast extract, 0.5% glycerol, 0.231% monopotassium phosphate, 1.254% dipotassium phosphate), and cultured with shaking at 37 ° C. for 24 hours. The cells were collected from 1 ml of the culture solution by centrifugation, and 1 ml of Suspended in 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5. The suspension was crushed by an ultrasonic crusher, and the activity of glycerol kinase was measured using the supernatant after centrifugation as a crude enzyme, but no significant enzyme activity was detected.
［実施例６］ グリセロールキナーゼ発現ベクターｐＣＧＫ１２の構築
ｐＣＧＫ１を制限酵素ＮｃｏＩ（東洋紡績製）とＮｏｔＩで切断し、１％アガロースゲル電気泳動によりグリセロールキナーゼ遺伝子を含む約２ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。次いでこのＤＮＡ断片をＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−ＰＣＲ＆ｇｅｌ ｃｌｅａｎ ｕｐ−キットを用いて、取扱説明書に記載された手順によりアガロースゲルより回収した。一方０．５μｇのｐＳＥ３８０（インビトロゲン社製）を同じくＮｃｏＩとＮｏｔＩで切断し、バクテリアルアルカリホスファターゼ（東洋紡績製）にて脱リン酸化処理した。その後、両ＤＮＡ断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈキットにて１６℃，１時間反応させ連結した後、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）のコンピテントセル（東洋紡績製）を形質転換した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃，終夜培養して形質転換体を取得した。なおこの組換えベクターはｐＣＧＫ１２と命名した。
次いでｐＣＧＫ１２により形質転換されたエシェリヒア・コリーＪＭ１０９株（Ｅ． ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ液体培地（５ｍｌ／３０ｍｌ試験管仕込み）に植菌し、３７℃で終夜振とう培養した。培養終了後、遠心分離により菌体を回収し、ＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ−Ｐｌａｓｍｉｄ−キット（東洋紡績製）を用いてｐＣＧＫ１２を精製した。５ｍｌの菌体より約２０μｇの精製ｐｌａｓｍｉｄを得た。
更にこのｐＣＧＫ１２を０．０５μｇ／μｌ濃度に調整し、実施例５で取得したグリセロールキナーゼ欠損株であるエシェリヒア・コリーＫＭ１株（Ｅ．ｃｏｌｉ ＫＭ１）を宿主とし、ジーン・パルサーを用いたエレクトロポレーション法によりｐＣＧＫ１２を導入した。形質転換体は１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地で選択し、３０℃終夜培養で２種の抗生物質に対して同時に耐性を示すコロニーを形質転換体として選抜した。この時の形質転換効率はおよそ１×１０６ｃｆｕ／μｇ−ＤＮＡであった。
なお、本形質転換体であるエシェリヒア・コリーＫＭ１（ｐＣＧＫ１２）株（E.coli KM1(pCGK12)）は独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに微生物寄託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１８９９２として平成１４（２００２）年９月３日に寄託した。
[Example 6] Construction of glycerol kinase expression vector pCGK12 pCGK1 was cleaved with restriction enzymes NcoI (manufactured by Toyobo) and NotI, and a DNA fragment of about 2 kb containing the glycerol kinase gene was separated by 1% agarose gel electrophoresis. Subsequently, this DNA fragment was recovered from the agarose gel using the MagExtractor-PCR & gel clean up-kit according to the procedure described in the instruction manual. On the other hand, 0.5 μg of pSE380 (manufactured by Invitrogen) was similarly cut with NcoI and NotI, and dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase (manufactured by Toyobo). Subsequently, both DNA fragments were reacted and ligated with a Ligation High kit at 16 ° C. for 1 hour, and then transformed into competent cells (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) of Escherichia coli JM109 strain (E. coli JM109). The transformant was applied to an LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin, and cultured at 37 ° C. overnight to obtain a transformant. This recombinant vector was named pCGK12.
Subsequently, Escherichia coli JM109 strain transformed with pCGK12 (E. coli JM109) was inoculated into LB liquid medium (5 ml / 30 ml in a test tube) containing 100 μg / ml ampicillin, and cultured with shaking at 37 ° C. overnight. . After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation, and pCGK12 was purified using a MagExtractor-Plasmid-kit (manufactured by Toyobo). About 20 μg of purified plasmid was obtained from 5 ml of cells.
Furthermore, this pCGK12 was adjusted to a concentration of 0.05 μg / μl, and the glycerol kinase-deficient strain obtained in Example 5, Escherichia coli KM1 strain (E. coli KM1), was used as the host, and electroporation using Gene Pulsar. PCGK12 was introduced by the method. Transformants were selected on an LB agar medium containing 100 μg / ml ampicillin and 50 μg / ml kanamycin, and colonies showing resistance to two antibiotics simultaneously at 30 ° C. overnight were selected as transformants. The transformation efficiency at this time was approximately 1 × 10 6 cfu / μg-DNA.
In addition, Escherichia coli KM1 (pCGK12) strain (E. coli KM1 (pCGK12)), which is this transformant, was instituted as an microbial deposit number FERM P-1892 in the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) in 2002 ( 2002) Deposited on 3 September.
［実施例７］組換えグリセロールキナーゼの発現及び精製酵素の取得
実施例６で得られた形質転換体を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含むＬＢ培地（５ｍｌ仕込み／２０ｍｌ試験管）に１白金耳植菌し３０℃で一晩振とう培養を行い種培養液とした。この培養液を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンと５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む１Ｌのトレフィックブロス（１本当り２５０ｍｌ仕込み／２Ｌ容坂口フラスコ）に１％植菌し３７℃にて２０時間振とう培養を実施した。培養終了時のグリセロールキナーゼ活性は培養液１ｍｌ当り約６．８Ｕ／ｍｌであった。
この培養液より遠心分離により菌体を回収後、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５に菌体を懸濁し、フレンチプレスにより菌体を破砕した。次いで菌体破砕液に０．１ＭになるようＮａＣｌを溶解し、更に５％ポリエチレンイミン水溶液を対液０．５％添加し遠心分離により不溶物を除去して粗酵素液とした。
次いで、該粗酵素液に６０％飽和度になるよう硫安塩析を行い、沈殿物を遠心分離により回収した後５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５にて再溶解した。更にセファデックスＧ−２５（アマシャムバイオサイエンス社製）ゲル濾過により脱塩した後、ＨｉＴｒａｐ Ｑ ＨＰ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムにアプライし、０．２Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、０．２Ｍ〜０．６Ｍ ＮａＣｌのリニアグラジェントにより溶出した。
更にこのグリセロールキナーゼ活性画分を集め、２０％飽和度になるよう硫安を添加し、不溶物を遠心分離により除去した。この酵素液を２０％飽和度硫安を含んだ５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で緩衝化したＨｉＴｒａｐ Ｐｈｅｎｙｌ ＦＦ（アマシャムバイオサイエンス社製）カラムにアプライし、同緩衝液で洗浄した後、２０％〜０％飽和度硫安のリニアグラジェントにより溶出した。このグリセロールキナーゼ活性画分を回収し、セファデックスＧ−２５ゲル濾過により脱塩して精製酵素標品とした。上記精製結果を表２に示した。
上記方法により精製した蛋白質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ的にほぼ均一なバンドを示しその比活性は凡そ４１．２Ｕ／ｍｇ−タンパクであった。蛋白質濃度は参考例１と同様に概算した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥより推定されるサブユニットの分子量は約５５，０００であり、ＴＳＫ−Ｇ３０００ ＳＷ（直径７．６ｍｍ、高さ３０ｃｍ、東ソー（株）製）ゲル濾過によるネイティブ酵素の分子量は約１７６，０００であった。
[Example 7] Expression of recombinant glycerol kinase and acquisition of purified enzyme The transformant obtained in Example 6 was treated with LB medium containing 100 µg / ml ampicillin and 50 µg / ml kanamycin (5 ml prepared / 20 ml test tube). One platinum ear was inoculated and cultured with shaking overnight at 30 ° C. to obtain a seed culture solution. 1% of this culture solution was inoculated into 1 L of Treffic broth (250 ml per bottle / 2 liter Sakaguchi flask) containing 100 μg / ml ampicillin and 50 μg / ml kanamycin, and cultured with shaking at 37 ° C. for 20 hours. Carried out. The glycerol kinase activity at the end of the culture was about 6.8 U / ml per 1 ml of the culture solution.
The cells were collected from the culture solution by centrifugation, suspended in 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5, and disrupted by a French press. Next, NaCl was dissolved in the cell disruption solution to a concentration of 0.1 M, and a 0.5% aqueous solution of 5% polyethyleneimine was added to the solution, and insoluble matter was removed by centrifugation to obtain a crude enzyme solution.
Subsequently, the crude enzyme solution was subjected to ammonium sulfate salting out to 60% saturation, and the precipitate was collected by centrifugation and then redissolved in 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5. Further, Sephadex G-25 (Amersham Biosciences) was desalted by gel filtration, then applied to a HiTrap Q HP (Amersham Biosciences) column, washed with 0.2M NaCl, and then 0.2M-0. Elute with a linear gradient of 6M NaCl.
Further, this glycerol kinase activity fraction was collected, ammonium sulfate was added to 20% saturation, and insoluble matters were removed by centrifugation. This enzyme solution was applied to a HiTrap Phenyl FF (manufactured by Amersham Biosciences) column buffered with 50 mM potassium phosphate buffer solution, pH 7.5 containing 20% saturated ammonium sulfate, and washed with the same buffer solution. Elution was performed with a linear gradient of 0% to 0% saturated ammonium sulfate. This glycerol kinase activity fraction was collected and desalted by Sephadex G-25 gel filtration to obtain a purified enzyme preparation. The purification results are shown in Table 2.
The protein purified by the above method showed an almost uniform band in SDS-PAGE, and the specific activity was about 41.2 U / mg protein. The protein concentration was estimated in the same manner as in Reference Example 1. The molecular weight of the subunit estimated from SDS-PAGE is about 55,000, and the molecular weight of the native enzyme by gel filtration is about 176, TSK-G3000 SW (diameter 7.6 mm,
上記方法により得られたグリセロールキナーゼは下記特性を有していた。
（１）作用：下記の反応を触媒した。
グリセロール ＋ ＡＴＰ ←→ グリセロールー３―リン酸 ＋ ＡＤＰ
（２）作用ｐＨ：反応ｐＨと相対活性との関係を図１に示した。
至適ｐＨは約１０．０であった。
（３）作用温度：反応温度と相対活性との関係を図２に示した。
至適温度：約５０℃（２０ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液、ｐＨ７．９、５分反応）
（４）ｐＨ安定性：ｐＨ安定性を図３に示した。
約６．０〜１０．０（２５℃で２０時間後も９０％以上の残存活性を示す範囲）で安定であった。
（５）熱安定性：熱安定性を図４に示した。
約４５℃以下（５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で１５分間処理後も９０％以上の残存活性を示す範囲）で安定であった。
（６）分子量：約５５，０００（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）、約１７６，０００（ゲル濾過）
（７）Ｋｍ値：約６．９×１０−６Ｍ（グリセロール）、約１．１１×１０−４Ｍ（ＡＴＰ）グリセロール及びＡＴＰに対するＫｍ値はグリセロールキナーゼの活性測定法＜測定法１＞に記載の方法に準拠し、グリセロールまたはＡＴＰの濃度を変更して各基質濃度でのグリセロールキナーゼ活性を測定し、ラインウィーバー バークの式（Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ ｅｑｕａｔｉｏｎ）よりＫｍ値を算出した。
（８）比活性：約４１．２Ｕ／ｍｇ
（９）防腐剤存在耐性：５０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５で１００ｍｇ／Ｌ ＭＩＴと共存させた場合の活性残存率を図５及び図６に示した。活性測定は、測定法１で行った。
４℃×１週間保存ではほぼ１００％、２５℃×１週間保存でも約９２％の活性残存率であった。その他の防腐剤と共存させた場合の活性残存率も合わせて示した。
尚、比較対象の他起源グリセロールキナーゼはサーマス・フラーバス（Ｔｈｅｒｍｕｓｆｌａｖｕｓ；東洋紡績製）以外はシグマアルドリッチジャパン社より購入した。また使用した防腐剤の内Ｎ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ、略号ＭＩＴ）とイミダゾリヂニルウレア（Ｉｍｉｄａｚｏｌｉｄｉｎｙｌｕｒｅａ、略号ＩＺＵ）はロッシュダイアグノステッィク社より購入し、プロクリン１５０（ＰｒｏＣｌｉｎ １５０）とプロクリン３００（ＰｒｏＣｌｉｎ ３００）はシグマアルドリッチジャパン社より購入した。
本発明のグリセロールキナーゼは２５℃、１週間保存でも９０％以上の活性残存率を示した。
また比較例として図７にサーマス・フラーバス（Ｔ． ｆｌａｖｕｓ）との熱安定性比較を図７に示した。サーマス・フラーバス（Ｔ． ｆｌａｖｕｓ）由来グリセロールキナーゼが本発明に比べ明らかに高い熱安定性を有するにも関わらず、本発明のグリセロールキナーゼの方が防腐剤共存下の安定性が高い事が示されており、本発明のグリセロールキナーゼが防腐剤に対して優れた耐性能を有する事が示された。
The glycerol kinase obtained by the above method had the following characteristics.
(1) Action: The following reaction was catalyzed.
Glycerol + ATP ← → Glycerol-3-phosphate + ADP
(2) Action pH: The relationship between reaction pH and relative activity is shown in FIG.
The optimum pH was about 10.0.
(3) Working temperature: The relationship between reaction temperature and relative activity is shown in FIG.
Optimal temperature: about 50 ° C. (20 mM HEPES buffer, pH 7.9, reaction for 5 minutes)
(4) pH stability: pH stability is shown in FIG.
It was stable at about 6.0 to 10.0 (a range showing a residual activity of 90% or more after 20 hours at 25 ° C.).
(5) Thermal stability: The thermal stability is shown in FIG.
It was stable at about 45 ° C. or less (a range showing a residual activity of 90% or more even after treatment with 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5 for 15 minutes).
(6) Molecular weight: about 55,000 (SDS-PAGE), about 176,000 (gel filtration)
(7) Km value: about 6.9 × 10 −6 M (glycerol), about 1.11 × 10 −4 M (ATP) glycerol and the Km value for ATP are described in the measurement method of glycerol kinase <Measurement method 1> In accordance with the method, glycerol kinase activity at each substrate concentration was measured by changing the concentration of glycerol or ATP, and the Km value was calculated from the Lineweaver-Burk equation.
(8) Specific activity: about 41.2 U / mg
(9) Preservative presence tolerance: FIG. 5 and FIG. 6 show the residual activity when coexisting with 100 mg / L MIT at 50 mM potassium phosphate buffer, pH 7.5. The activity was measured by Measurement Method 1.
The activity remaining rate was almost 100% when stored at 4 ° C for 1 week, and about 92% when stored at 25 ° C for 1 week. The residual activity rate when coexisting with other preservatives is also shown.
Other glycerol kinases to be compared were purchased from Sigma-Aldrich Japan except for Thermus Flabus (Toyobo). Among the preservatives used, N-methylisothiazolone (abbreviation MIT) and imidazolidinylurea (abbreviation IZU) were purchased from Roche Diagnostics, Inc. and Proclin 150 (ProClin 150). ProClin 300) was purchased from Sigma-Aldrich Japan.
The glycerol kinase of the present invention showed an activity remaining rate of 90% or more even after storage at 25 ° C. for 1 week.
As a comparative example, FIG. 7 shows a comparison of thermal stability with Thermus Flabus (T. flavus). Despite the apparently higher thermal stability of T. flavus-derived glycerol kinase than that of the present invention, it is shown that the glycerol kinase of the present invention is more stable in the presence of preservatives. It was shown that the glycerol kinase of the present invention has excellent resistance to preservatives.
本発明のグリセロールキナーゼは、防腐剤に対して高い耐性を有し、液状検査薬中での安定性に優れる等の特性を持つため、臨床検査分野で用いられる酵素として優れており、産業界に寄与することが大である。 The glycerol kinase of the present invention has high resistance to preservatives and has characteristics such as excellent stability in liquid test agents, and is therefore excellent as an enzyme used in the clinical test field. It is important to contribute.
Claims (1)
（１）試料中の中性脂肪をリパーゼで加水分解しグリセロールを得る工程
（２）グリセロールをグリセロールキナーゼによってグリセロール−３−リン酸に変換する工程
（３）グリセロールー３−リン酸を、グリセロール−３−リン酸酸化酵素を用いた比色定量法やグリセロールー３−リン酸脱水素酵素を用いた紫外部吸収定量法などにより、定量する工程
（４）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（５）配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質
（６）配列表・配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡによりコードされ、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質
（７）配列表・配列番号２に記載される塩基配列において、１もしくは数個の塩基が付加、欠失または置換された塩基配列からなるＤＮＡによりコードされ、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質
（８）配列表・配列番号２に記載される塩基配列からなるＤＮＡ、
または、該塩基配列において１もしくは数個の塩基が付加、欠失または置換された塩基配列からなるＤＮＡ、
または、配列表・配列番号１に記載されるアミノ酸配列からなるタンパク質であるグリセロールキナーゼをコードするＤＮＡ、
または、配列表・配列番号１に記載されたアミノ酸配列において、１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であるグリセロールキナーゼをコードするＤＮＡを、
宿主・ベクター系に適用し、得られた形質転換体を培養して得られたタンパク質であり、かつ、グリセロールキナーゼ活性を有するタンパク質
（ａ）１００ｍｇ／ＬのＮ−メチルイソチアゾロン（Ｎ−Ｍｅｔｈｙｌｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｏｎｅ）および／またはその誘導体
（ｂ）０．８ｍｌ／Ｌのプロクリン（ＰｒｏＣｌｉｎ）（登録商標）１５０（５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、および、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）および／またはその誘導体
（ｃ）０．３ｍｌ／Ｌのプロクリン（登録商標）３００（５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、および、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン）および／またはその誘導体） In the measurement of neutral fat (triglyceride) including the steps shown in the following (1) to (3), the glycerol kinase shown in any of the following (4) to (8) is used, The method to improve the tolerance with respect to either of the substances shown by the group which consists of following (a)-(c) in sex fat measurement.
(1) A step of hydrolyzing neutral fat in a sample with lipase to obtain glycerol
(2) Step of converting glycerol into glycerol-3-phosphate by glycerol kinase
(3) A step of quantifying glycerol-3-phosphate by a colorimetric quantification method using glycerol-3-phosphate oxidase or an ultraviolet absorption quantification method using glycerol-3-phosphate dehydrogenase (4) ) A protein comprising the amino acid sequence described in the sequence listing / SEQ ID NO: 1 (5) an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in the sequence listing / SEQ ID NO: 1 A protein having a glycerol kinase activity (6) and a protein having a glycerol kinase activity encoded by a DNA comprising the nucleotide sequence set forth in the sequence listing SEQ ID NO: 2 (7) In a DNA comprising a nucleotide sequence to which one or several bases are added, deleted or substituted. Ri is encoded, and comprising the nucleotide sequence set forth in protein (8) Sequence Listing, SEQ ID NO: 2 with glycerol kinase activity DNA,
Or a DNA comprising a base sequence in which one or several bases are added, deleted or substituted in the base sequence,
Or DNA encoding glycerol kinase, which is a protein consisting of the amino acid sequence described in Sequence Listing / SEQ ID NO: 1,
Alternatively, a DNA encoding glycerol kinase, which is a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence described in Sequence Listing / SEQ ID NO: 1,
A protein obtained by culturing the resulting transformant applied to a host / vector system and having glycerol kinase activity
(A) 100 mg / L N-methylisothiazolone and / or derivatives thereof (b) 0.8 ml / L ProClin® 150 (5-chloro-2-methyl-4- Isothiazolin-3-one and 2-methyl-4-isothiazolin-3-one) and / or its derivatives (c) 0.3 ml / L of Procrine® 300 (5-chloro-2-methyl-4 -Isothiazoline-3-one and 2-methyl-4-isothiazolin-3-one) and / or its derivatives)
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