JP3829950B2 - Novel creatinine amide hydrolase - Google Patents

Description

【０００７】
また、本発明は配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失または置換されており、且つクレアチニンアミドヒドロラーゼの酵素活性をもたらすポリペプチドをコードしている塩基配列を含有することを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子である。好ましくは、配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列をコードしている塩基配列を含有するクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子である。
【０００８】
また、本発明は配列表の配列番号２に記載される塩基配列または該塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており且つクレアチニンアミドヒドロラーゼの酵素活性をもたらすポリペプチドをコードしている塩基配列であることを特徴とするクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子である。本発明のクレアチニンアミノヒドロラーゼをコードする遺伝子は、好ましくは配列表の配列番号２に記載される塩基配列を含有する遺伝子である。
【０００９】
本発明は上記遺伝子を含有することを特徴とする組換えベクターである。
【００１０】
さらに本発明は上記組換えベクターにより形質転換された形質転換体である。
【００１１】
本発明は上記形質転換体を培地で培養し、クレアチニンアミノヒドロラーゼを生成させ、該クレアチニンアミドヒドロラーゼを採取することを特徴とするクレアチニンアミノヒドロラーゼの製造法である。
【００１２】
なお、アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１（ＦＥＲＭ Ｐ−１４２３７）を培地で培養し、クレアチニンアミドヒドロラーゼを生成させ、該クレアチニンアミドヒドロラーゼを採取することも可能である。
【００１３】
【発明の実施態様】
本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼは、クレアチニンアミドヒドロラーゼ生産微生物、例えばアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１（FERM P-14237）から入手し得るが、好ましくは、これらの微生物からクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を分離し、これにより他の宿主細胞を形質転換して、クレアチニンアミドヒドロラーゼを発現させ、単離することにより、本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼを簡便且つ効率的に入手する。
【００１４】
本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子は、例えばアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１（FERM P-14237）菌体から抽出しても良く、また化学的に合成することもできる。さらにポリメラーゼチェーンリアクション法 (PCR)の利用により、クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得ることも可能である。
【００１５】
上記クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子としては、例えば配列表の配列番号１に記載されるアミノ酸配列または該アミノ酸配列において、１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失または置換されており、且つクレアチニンアミノヒドロラーゼの酵素活性をもたらすポリペプチドをコードしている塩基配列が挙げられる。
また、配列表の配列番号２に記載される塩基配列または該塩基配列において、１もしくは複数の塩基が付加、欠失または置換されており且つクレアチニンアミドヒドロラーゼの酵素活性をもたらすポリペプチドをコードしている塩基配列であるクレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
【００１６】
本発明の遺伝子を得る方法としては、例えばアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１（FERM P-14237）の染色体ＤＮＡを分離、精製した後、超音波破砕、制限酵素処理等を用いてＤＮＡを切断したものと、リニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑末端または接着末端において、ＤＮＡリガーゼなどにより結合、かつ閉鎖させて組換えベクターを構築する。このようにして得られた組換えベクターは、複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、クレアチニンアミドヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する微生物を得る。次いで該微生物を培養し、該培養菌体から該組換えベクターを分離・精製し、該組換えベクターからクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を採取すれば良い。
【００１７】
遺伝子供与体であるアルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）ＴＥ３５８１（FERM P-14237）の染色体ＤＮＡは、具体的には、以下のようにして採取される。
すなわち、供与微生物を例えば１〜３日間撹拌培養して得られた培養物を遠心分離にて集菌し、次いで、これを溶菌させることによりクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製する。溶菌の方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼ等の溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼや他の酵素やラウリル硫酸ナトリウム(SDS) 等の界面活性剤が併用され、さらに凍結融解やフレンチプレス処理のような物理的破砕方法と組み合わせても良い。
【００１８】
このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離、精製するには常法に従う。例えばフェノール処理やプロテアーゼ処理による除蛋白処理や、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱処理などの方法を適宜組み合わせることにより行うことができる。
微生物から分離、精製されたＤＮＡを切断する方法は、例えば超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる。好ましくは特定のヌクレオチド配列に作用するII型制限酵素が適している。
【００１９】
ベクターとしては、宿主微生物内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。
ファージとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、Lambda-gt10 、Lambda-gt11 などが使用できる。
またプラスミドとしては、例えばエシェリヒア・コリー（Escherichia coli）を宿主微生物とする場合には、pBR322、pUC19 、pBluescript 、pLED-M1 （Journal of Fermentation and Bioenzineering, Vol.76, 265-269 (1993)）などが使用できる。
このようなベクターを上記したクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子供与体である微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素で切断してベクター断片を得ることができるが、必ずしも該微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同一の制限酵素を用いる必要はない。微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片とを結合させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であれば良く、例えば微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベクター断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮＡリガーゼの使用により微生物ＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片との組換えベクターを作成する。必要なら、アニーリングの後、宿主微生物に移入して生体内のＤＮＡリガーゼを利用し組換えベクターを作成することもできる。
【００２０】
宿主微生物としては、組換えベクターが安定かつ自律増殖可能であり、外来性遺伝子の形質が発現できるものであれば良く、一般的にはエシェリヒア・コリーW3110 、エシェリヒア・コリーC600、エシェリヒア・コリーHB101 、エシェリヒア・コリーJM109 などを用いることができる。
【００２１】
宿主微生物に組換えベクターを移入する方法としては、例えば宿主微生物がエシェリヒア・コリーの場合には、カルシウム処理によるコンピテントセル法やエレクトロポレーション法などが用いることができる
このようにして得られた形質転換体である微生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のクレアチニンアミドヒドロラーゼを安定に生産し得る。宿主微生物への目的組換えベクターの移入の有無についての選択は、目的とするＤＮＡを保持するベクターの薬剤耐性マーカーとクレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を同時に発現する微生物を同時に発現する微生物を検索すれば良く、例えば薬剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつクレアチニンアミドヒドロラーゼを生成する微生物を選択すれば良い。
【００２２】
上記の方法により得られたクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の塩基配列は、サイエンス（Science, Vol.214, 1205-1210 (1981)）に記載されたジデオキシ法により解読し、またクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列は決定した塩基配列より推定した。このようにして一度選択されたクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を保有する組換えベクターは、形質転換微生物から取り出され、他の微生物に移入することも容易に実施することができる。また、クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子を保持する組換えベクターから、制限酵素やＰＣＲによりクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子であるＤＮＡを回収し、他のベクター断片と結合させ、宿主微生物に移入することも容易に実施できる。
【００２３】
形質転換体である宿主微生物の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、通常、多くの場合は液体培養で行うが、工業的には通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であればよく、例えばグルコ−ス、シュークロース、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使用される。窒素源としては、利用可能な窒素化合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用される。
【００２４】
培養温度は菌が発育し、クレアチニンアミドヒドロラーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリーの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。培養時間は条件によって多少異なるが、クレアチニンアミドヒドロラーゼが最高収量に達する時期を見計らって、適当時期に培養を終了すればよく、通常は６〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、クレアチニンアミドヒドロラーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６．０〜９．０程度である。
【００２５】
培養物中のクレアチニンアミドヒドロラーゼを生産する菌体を含む培養液をそのまま採取し、利用することもできるが、一般には常法に従って、クレアチニンアミドヒドロラーゼが培養液中に存在する場合は、濾過，遠心分離などにより、クレアチニンアミドヒドロラーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に利用する。クレアチニンアミドヒドロラーゼが菌体内に存在する場合には、得られた培養物から濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及びまたは界面活性剤を添加してクレアチニンアミドヒドロラーゼを可溶化し、水溶液として分離採取する。
【００２６】
このようにして得られたクレアチニンアミドヒドロラーゼ含有溶液を、例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、或いは親水性有機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱せしめればよい。また、加熱処理や等電点処理も有効な精製手段である。その後、吸着剤或いはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを行うことにより、精製されたクレアチニンアミノヒドロラーゼを得ることができる。
例えば、セファデックス（Sephadex）Ｇ−２５（ファルマシア バイオテク）などによるゲルろ過、ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂ（ファルマシア バイオテク）、オクチルセファロースＣＬ６−Ｂ（ファルマシア バイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離、精製し、精製酵素標品を得ることができる。この精製酵素標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥＤでほぼ単一のバンドを示す程度に純化されている。
【００２７】
本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼの一例は、以下に示す理化学的性質を有する。
【化３】

【００２８】
本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼと公知のクレアチニンアミドヒドロラーゼとの性質の比較を下記表１に示す。この表１から、本発明の酵素は従来の酵素に比べて、分子量、サブユニット数、クレアチニンに対するＫｍ値が相違する。
【００２９】
また、本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列と公知であるシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PS-7が産生するクレアチニンアミノヒドロラーゼのアミノ酸配列との相同性は６５．５％であり、両者の比較を図１に示す。
したがって、 本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼは、同一反応を触媒する公知の酵素とは性質の異なる新規な酵素である。また、本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列に関する情報は、該酵素のアミノ酸レベルでの置換、挿入、欠失による酵素的性質の改善を容易ならしめるものである。
【００３０】
【表１】

【００３１】
【実施例】
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。
実施例中、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性の測定は、下記試薬を使用し、下記測定条件で行った。
試薬
試薬Ａ：ダイヤカラーCRE クレアチニン測定試薬（東洋紡製）のＡ溶解液
（酵素試薬Ａバイアルに90mlの溶解液Ａを加えて溶解したもの）
試薬Ｂ：４００ｍＭクレアチニン水溶液
試薬Ｃ：１．５％フェノール水溶液
試薬Ｄ：０．５％４−アミノアンチピリン水溶液
測定条件
まず試薬Ａ、試薬Ｂ、試薬Ｃ、試薬Ｄを３：１：０．０４：０．０４の割合（容量比）で混合し、試薬混液を作成する。この試薬混液 3mlを37℃で、約５分予備加温後、０．１ｍｌの酵素溶液を加え、３７℃で反応を開始し、４分間反応させた後、５００ｎｍにおける１分間当たりの吸光度変化を分光光度計にて測定する。
盲検は酵素溶液の代わりに蒸留水を試薬混液に加えて、以下、同様に吸光度変化を測定する。上記条件で１分間に１マイクロモルのクレアチニンを分解する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００３２】
実施例１ 染色体ＤＮＡの分離
アルカリゲネス・フェカリスＴＥ３５８１(FERM P-14237)の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株を１５０ｍｌの普通ブイヨン培地で、３０℃で一晩振盪培養した後、遠心分離（8,000rpm、10分間）により集菌した。１０％シュークロース、５０ｍＭトリス塩酸 (pH 8.0) 、５０ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ溶液５ｍｌに懸濁し、１ｍｌのリゾチーム溶液（10mg/ml)を加えて、３７℃、１５分間保温し、次いで１ｍｌの１０％ ＳＤＳ溶液を加えた。この溶液に等量のクロロホルム・フェノール溶液（１：１）を加え、撹拌混合し、10,000rpm、３分間の遠心分離して水層と溶媒層に分離し、水層を分取した。この水層に２倍量のエタノールを静かに重層し、ガラス棒でゆっくり撹拌しながらＤＮＡをガラス棒に巻き付かせて分離した。
これを１ｍＭ ＥＤＴＡを含んだ１０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０溶液（以下、ＴＥと略記）で溶解した。これを等量のクロロホルム・フェノール溶液で処理後、遠心分離により水層を分取し、２倍量のエタノールを加えて上記方法で、もう一度、ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。
【００３３】
実施例２ クレアチニンアミノヒドロラーゼをコードする遺伝子を含有するＤＮＡ断片および該ＤＮＡ断片を有する組換えベクターの調製
実施例１で得たＤＮＡ２０μｇを制限酵素 Sau3AI(東洋紡製）で部分分解し、シュークロース密度勾配遠心分離法により、２〜１０ｋｂｐの断片を回収した。一方、制限酵素 BamHI（東洋紡製）で切断した pBluescriptKS(+) をバクテリアルアルカリホスファターゼ（東洋紡製）により脱リン酸化処理した後、両ＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼ（東洋紡製）１単位で１６℃、１２時間反応させ、ＤＮＡを連結した。連結したＤＮＡはエシェリヒア・コリーJM109 のコンピテントセル（東洋紡製）を用いて形質転換し、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性検出用寒天培地［ 1.0％ポリペプトン、 0.5％酵母エキス、 0.5％ＮａＣｌ、 1％クレアチニン、200U/ml クレアチンアミジノヒドロラーゼ（東洋紡製）、10U/mlザルコシンオキシダーゼ（東洋紡製）、5U/ml ペルオキシダーゼ（東洋紡製）、0.01％ o−ジアニシジン、50μg/mlアンピシリン、 1.5％寒天］に塗布した。クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性の検出は、上記培地に生育し、且つ茶色に染色されるコロニーを指標に行った。
【００３４】
使用したＤＮＡ１μg 当たり約 100,000個の形質転換体のコロニーが得られ、上記スクリーニングの結果、茶色に染色されるコロニーを１株見いだした。この株をＬＢ液体培地（ 1％ポリペプトン、 0.5％酵母エキス、 0.5％ＮａＣｌ、50μg/mlアンピシリン）で培養し、クレアチニンアミドヒドロラーゼ活性を測定したところ、該活性が検出された。
この株の保有するプラスミドには約５ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片が存在しており、このプラスミドをｐＣＮＨＡ１７とした。
次いでｐＣＮＨＡ１７の挿入ＤＮＡを制限酵素 SacIIとPstI（東洋紡製）にて切り出し、同制限酵素で切断した pBluescriptKS(+) に連結して、ｐＣＮＨＡ−１を作成した。これらのｐＣＮＨＡ１７、ｐＣＮＨＡ−１の制限酵素地図を図２に示す。
【００３５】
実施例３ 塩基配列の決定
ｐＣＮＨＡ−１の約１．２ｋｂｐの挿入ＤＮＡ断片について、種々の制限酵素にてサブクローンを調製した。種々のサブクローンは常法に従い、Radioactive Sequencing Kit（東洋紡製）を用いて塩基配列を決定した。決定した塩基配列及びアミノ酸配列を配列表に示す。
アミノ酸配列から求められる蛋白質の分子量は、２８，７４４であり、アルカリゲネス・フェカリスＴＥ３５８１のクレアチニンアミノヒドロラーゼの分子量とほぼ一致した。
【００３６】
実施例４ 組換えベクターｐＣＮＨＡ−１１の作成
ｐＣＮＨＡ−１の挿入ＤＮＡ断片よりクレアチニンアミノヒドロラーゼ遺伝子以外の部分を除くため、ＰＣＲによる挿入ＤＮＡ断片の小型化を実施した。ＰＣＲは、以下に示す反応液組成および増幅条件にて行った。
反応液組成
Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（ストラタジーン製） 5U/100 μl
10倍濃度Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ用バッファー 10μl/100 μl
ｐＣＮＨＡ−１（鋳型ＤＮＡ） 0.1μg/100 μl
dATP,dTTP,dGTP,dCTP 各 0.2mM
プライマー 各 1μM
（配列表の配列番号３、４に記載）
増幅条件
変性 ９４℃、３０秒間
温度変更 １分、３０秒間
アニーリング ４５℃、 １秒間
温度変更 １秒間
反応 ７５℃、３０秒間
温度変更 １秒間
（上記サイクルを３０回繰り返す)
【００３７】
増幅ＤＮＡ断片、約０．８ｋｂｐを制限酵素 NdeI と BamHI（東洋紡製）にて処理し、同じ制限酵素で切断したｐＬＥＤ−Ｍ１に連結してｐＣＮＨＡ−１１を作成した。ｐＣＮＨＡ−１１の制限酵素地図を図２に示す。
ｐＣＮＨＡ−１１の挿入ＤＮＡ断片は、クレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子以外の部分を含まない。すなわち、挿入ＤＮＡ断片の両端には、NdeIとBamHI 制限酵素切断部位がそれぞれ存在し、NdeIはクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の開始コドン(ATG) と重なり、BamHI はクレアチニンアミドヒドロラーゼ遺伝子の終止コドン(TGA) の直後に位置している。
【００３８】
実施例５ 形質転換体の作成
エシェリヒア・コリーJM109 のコンピテントセル（東洋紡製）をｐＣＮＨＡ−１１で形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリーJM109(pCNHA-11）を得た。
【００３９】
実施例６ エシェリヒア・コリーJM109(pCNHA-11）からのクレアチニンアミノヒドロラーゼの製造
ＬＢ培地５００ｍｌを２Ｌフラスコに分注し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌ろ過した５０ｍｇ／ｍｌアンピシリン（ナカライテスク製）０．５ｍｌ添加した。この培地にＬＢ培地であらかじめ、３０℃、７時間振盪培養したエシェリヒア・コリーJM109(pCNHA-11）の培養液５ｍｌを接種し、３７℃で１８時間通気撹拌培養した。培養終了時のクレアニチンアミドヒドロラーゼ活性は約５０Ｕ／ｍｌであった。
上記菌体を遠心分離にて集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．８に懸濁した。上記菌体懸濁液をフレンチプレスで破砕し、遠心分離を行い上清液を得た。得られた粗酵素液をポリエチレンイミンによる除核酸処理および硫安分画処理を行った後、Sephadex G-25 （ファルマシア・バイオテク）によるゲルろ過により脱塩し、、DEAEセファロースCL-6B (ファルマシア バイオテク）カラムクロマトグラフィー、オクチルセファロースCL6-B （ファルマシア バイオテク）カラムクロマトグラフィーにより分離・精製し、精製酵素表品を得た。
該方法により得られたクレアチニンアミノヒドロラーゼ標品は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動でほぼ単一なバンドを示し、この時の比活性は８３Ｕ／ｍｇ−タンパクであった。
【００４０】
以下に、上記方法により得られたクレアチニンアミドヒドロラーゼの性質を示す。
【化４】

【００４１】
【発明の効果】
本発明の酵素は従来公知であるクレアチニアミドヒドロラーゼと比べて、分子量、サブユニット数、クレアチニンに対するＫｍ値において、相違が見られ、新規な酵素である。また、従来の酵素、シュードモナス・プチダPS-7の遺伝子を利用した遺伝子組換え技術によって生産されるクレアチニンアミドヒドロラーゼの生産性が、１５．７Ｕ／ｍｌであるのに対して、本発明の酵素の生産性は５０Ｕ／ｍｌであり、高純度の酵素が生産されうる。
また、本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列に関する情報は、該酵素のアミノ酸レベルでの置換、挿入、欠失による酵素的性質の改善を容易にならしめるという効果がある。
【００４２】
【配列表】
配列番号：１
配列の長さ：258
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：蛋白質
起源
生物名：アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）
株名：TE3581（FERM P-14237）
配列

【００４３】
配列番号：２
配列の長さ：777
配列の型：核酸
トポロジー：直鎖状
配列の種類：ゲノムDNA
起源
生物名：アルカリゲネス・フェカリス（Alcaligenes faecalis）
株名：TE3581（FERM P-14237）
配列

【００４４】
配列番号：３
配列の長さ：49
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列

【００４５】
配列番号：４
配列の長さ：49
配列の型：核酸
鎖の数：一本鎖
トポロジー：直鎖状
配列の種類：合成DNA
配列

【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列とシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）PS-7が産生するクレアチニンアミドヒドロラーゼのアミノ酸配列との比較を示す。
【図２】ｐＣＮＨＡ１７、ｐＣＮＨＡ−１、ｐＣＮＨＡ−１１の制限酵素地図を示す。[0001]
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to a novel enzyme having creatinine amide hydrolase activity that can be used for quantification of creatinine, a gene encoding the enzyme, and a method for producing the enzyme by genetic engineering techniques.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, creatinine amide hydrolase (EC 3.5.2.10) has been used in combination with creatine amidinohydrolase, sarcosine oxidase, peroxidase as an enzyme for measuring creatinine in body fluids, which is an index for diagnosis of muscle disease and kidney disease. in use. That is, creatinine amide hydrolase is allowed to act on creatinine in a sample, creatine amidinohydrolase is allowed to act on creatine to be produced, sarcosine oxidase is further caused to act on sarcosine to be produced, and hydrogen peroxide produced is converted to peroxidase and color former ( For example, the color is developed with 4-aminoantipyrine and an aniline derivative), and the color intensity is measured by absorbance to measure the amount of creatinine in the sample.
[0003]
Creatinine amide hydrolase is an enzyme that catalyzes a reversible reaction that acts on creatinine to produce creatine. Such creatinine amide hydrolase is a genus of Pseudomonas (Journal of Biochemistry, Vol.86, 1109-1117 (1979)) or Alkaligenes (Chemical and Pharmaceutical Bulletin, Vol.34, No.1, 269-274 (1986)). It is known that bacteria such as Among these, a gene encoding creatinine amide hydrolase produced by Pseudomonas putida PS-7 has already been isolated and an amino acid sequence has been published (Japanese Patent Laid-Open No. 3-19690). However, the production level of Pseudomonas putida PS-7 creatinine amide hydrolase by genetic engineering technology is 15.7 U / ml according to JP-A-3-19690, which is a higher production. Sex is desired.
On the other hand, the genetic information of creatinine amide hydrolase produced by microorganisms other than Pseudomonas putida PS-7 and the primary structure of the enzyme have not yet been obtained.
[0004]
[Problems to be solved by the invention]
The purpose of the present invention is to provide a creatinine amide hydrolase having a higher purity than conventional enzymes, and to establish a novel creatinine amide hydrolase isolation method and a method for producing the enzyme by genetic engineering techniques. It enables mass supply of the enzyme with high purity and utilization for determination of creatinine.
[0005]
[Means for Solving the Problems]
As a result of various investigations to achieve the above object, the present inventors have selected Alcaligenes faecalis TE3581 (FERM P-14237) as a creatinine amide hydrolase producing bacterium, and chromosomal DNA extracted from the microbial cell. The gene encoding creatinine amide hydrolase was successfully separated from the protein, and a novel creatinine amide hydrolase expressed from the gene was isolated. Furthermore, the entire base sequence of the gene was determined, and the enzyme was successfully produced by genetic engineering techniques without the need to add an expensive inducer such as creatinine to the medium. It became possible to supply a large quantity to.
[0006]
That is, the present invention is a creatinine aminohydrolase having the following physicochemical properties.
[Chemical 2]

[0007]
The present invention also relates to an amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or a polypeptide in which one or more amino acids are added, deleted or substituted in the amino acid sequence, and which brings about the enzymatic activity of creatinine amide hydrolase A gene encoding creatinine amide hydrolase, characterized in that it contains a base sequence encoding Preferably, it is a gene encoding creatinine amide hydrolase containing a base sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0008]
The present invention also relates to a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 of the Sequence Listing or a polypeptide in which one or more bases are added, deleted or substituted in the nucleotide sequence, and which bring about the enzyme activity of creatinine amide hydrolase. It is a gene encoding creatinine amide hydrolase characterized by being a base sequence encoding. The gene encoding the creatinine aminohydrolase of the present invention is preferably a gene containing the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
[0009]
The present invention is a recombinant vector containing the above gene.
[0010]
Furthermore, the present invention is a transformant transformed with the above recombinant vector.
[0011]
The present invention is a method for producing creatinine aminohydrolase, comprising culturing the above transformant in a medium to produce creatinine aminohydrolase, and collecting the creatinine amide hydrolase.
[0012]
Alcaligenes faecalis TE3581 (FERM P-14237) can be cultured in a medium to produce creatinine amide hydrolase, and the creatinine amide hydrolase can be collected.
[0013]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
The creatinine amide hydrolase of the present invention can be obtained from creatinine amide hydrolase producing microorganisms such as Alcaligenes faecalis TE3581 (FERM P-14237), but preferably a gene encoding creatinine amide hydrolase from these microorganisms. By separating and thereby transforming other host cells to express and isolate creatinine amide hydrolase, the creatinine amide hydrolase of the present invention is obtained conveniently and efficiently.
[0014]
The gene encoding the creatinine amide hydrolase of the present invention may be extracted from, for example, Alcaligenes faecalis TE3581 (FERM P-14237) or chemically synthesized. Furthermore, a DNA fragment containing the creatinine amide hydrolase gene can be obtained by using the polymerase chain reaction method (PCR).
[0015]
Examples of the gene encoding creatinine amide hydrolase include, for example, the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, or one or more amino acids added, deleted or substituted in the amino acid sequence, and creatinine aminohydrolase And a base sequence encoding a polypeptide that brings about the enzyme activity.
In addition, it encodes a base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing or a polypeptide in which one or more bases are added, deleted or substituted in the base sequence, and which brings about the enzyme activity of creatinine amide hydrolase And a gene encoding creatinine amide hydrolase which is a base sequence.
[0016]
As a method for obtaining the gene of the present invention, for example, chromosomal DNA of Alcaligenes faecalis TE3581 (FERM P-14237) is isolated and purified, and then cleaved using ultrasonic disruption, restriction enzyme treatment, or the like. A recombinant vector is constructed by binding and closing a linear expression vector and a linear expression vector at the blunt end or cohesive end of both DNAs with DNA ligase or the like. The recombinant vector thus obtained is transferred to a replicable host microorganism, screened using the expression of the vector marker and enzyme activity as an indicator, and a recombinant vector containing a gene encoding creatinine amide hydrolase Get the microorganisms that hold. Next, the microorganism is cultured, the recombinant vector is separated and purified from the cultured cells, and the creatinine amide hydrolase gene is collected from the recombinant vector.
[0017]
Specifically, the chromosomal DNA of the gene donor Alcaligenes faecalis TE3581 (FERM P-14237) is collected as follows.
That is, for example, a culture obtained by stirring and cultivating a donor microorganism for 1 to 3 days is collected by centrifugation, and then lysed to prepare a lysate containing a creatinine amide hydrolase gene. As a method of lysis, for example, a treatment with a lytic enzyme such as lysozyme or β-glucanase is performed, and if necessary, a protease, other enzyme, or a surfactant such as sodium lauryl sulfate (SDS) is used in combination. You may combine with the physical crushing method like a French press process.
[0018]
In order to separate and purify DNA from the lysate thus obtained, conventional methods are followed. For example, it can be performed by appropriately combining methods such as deproteinization treatment by phenol treatment or protease treatment, ribonuclease treatment, alcohol precipitation treatment and the like.
A method of cleaving DNA separated and purified from microorganisms can be performed by, for example, ultrasonic treatment, restriction enzyme treatment, or the like. Type II restriction enzymes that act on specific nucleotide sequences are suitable.
[0019]
Suitable vectors are those constructed for genetic recombination from phages or plasmids that can autonomously grow in the host microorganism.
As the phage, for example, when Escherichia coli is used as a host microorganism, Lambda-gt10, Lambda-gt11 and the like can be used.
As the plasmid, for example, when Escherichia coli is used as the host microorganism, pBR322, pUC19, pBluescript, pLED-M1 (Journal of Fermentation and Bioenzineering, Vol. 76, 265-269 (1993)), etc. Can be used.
A vector fragment can be obtained by cleaving such a vector with the restriction enzyme used for cleaving microbial DNA as the creatinine amide hydrolase gene donor described above, but it is not necessarily the same as the restriction enzyme used for cleaving the microbial DNA. It is not necessary to use the restriction enzyme. The method for binding the microbial DNA fragment and the vector DNA fragment may be a method using a known DNA ligase. For example, after annealing of the adhesive end of the microbial DNA fragment and the adhesive end of the vector fragment, an appropriate DNA ligase can be used. A recombinant vector of a microbial DNA fragment and a vector DNA fragment is prepared by use. If necessary, after annealing, it can be transferred to a host microorganism and a recombinant vector can be prepared using in vivo DNA ligase.
[0020]
As the host microorganism, any recombinant vector can be used as long as it can stably and autonomously propagate and can express a trait of a foreign gene.Generally, Escherichia coli W3110, Escherichia coli C600, Escherichia coli HB101, Escherichia coli JM109 or the like can be used.
[0021]
As a method for transferring a recombinant vector into a host microorganism, for example, when the host microorganism is Escherichia coli, a competent cell method by calcium treatment, an electroporation method, or the like can be used. A microorganism that is a transformant can stably produce a large amount of creatinine amide hydrolase by being cultured in a nutrient medium. The selection of whether or not the target recombinant vector is transferred to the host microorganism may be performed by searching for a microorganism that simultaneously expresses a drug resistance marker of a vector holding the target DNA and a microorganism that simultaneously expresses creatinine amide hydrolase activity, For example, a microorganism that grows in a selective medium based on a drug resistance marker and produces creatinine amide hydrolase may be selected.
[0022]
The base sequence of the creatinine amide hydrolase gene obtained by the above method was decoded by the dideoxy method described in Science (Science, Vol. 214, 1205-1210 (1981)), and the amino acid sequence of creatinine amide hydrolase was determined. It was estimated from the obtained base sequence. The recombinant vector carrying the creatinine amide hydrolase gene once selected in this way can be easily removed from the transformed microorganism and transferred to another microorganism. It is also possible to easily collect DNA, which is a creatinine amide hydrolase gene, from a recombinant vector carrying a creatinine amide hydrolase gene by restriction enzyme or PCR, bind it to another vector fragment, and transfer it to a host microorganism.
[0023]
The culture form of the host microorganism, which is a transformant, may be selected in consideration of the nutritional and physiological properties of the host. Usually, the culture is performed in liquid culture in many cases, but industrially aerated and stirred culture is used. It is advantageous to do so. As a nutrient source of the medium, those commonly used for culturing microorganisms can be widely used. Any carbon compound that can be assimilated may be used as the carbon source. For example, glucose, sucrose, lactose, maltose, fructose, molasses, pyruvic acid and the like are used. The nitrogen source may be any available nitrogen compound. For example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean meal alkaline extract, and the like are used. In addition, phosphates, carbonates, sulfates, salts such as magnesium, calcium, potassium, iron, manganese, and zinc, specific amino acids, specific vitamins, and the like are used as necessary.
[0024]
The culture temperature can be appropriately changed within the range in which the bacteria grow and produce creatinine amide hydrolase. In the case of Escherichia coli, it is preferably about 20 to 42 ° C. Although the culture time varies slightly depending on the conditions, the culture may be terminated at an appropriate time in consideration of the time when the creatinine amide hydrolase reaches the maximum yield, and is usually about 6 to 48 hours. The pH of the medium can be appropriately changed as long as the bacteria grow and produce creatinine amide hydrolase, but is particularly preferably about pH 6.0 to 9.0.
[0025]
Although the culture solution containing the cells producing creatinine amide hydrolase in the culture can be collected and used as it is, generally, when creatinine amide hydrolase is present in the culture solution, it is filtered and centrifuged. It is used after separating the creatinine amide hydrolase-containing solution and the microbial cells by separation or the like. When creatinine amide hydrolase is present in the microbial cells, the microbial cells are collected from the obtained culture by means of filtration or centrifugation, and then disrupted by mechanical methods or enzymatic methods such as lysozyme. If necessary, a chelating agent such as EDTA and / or a surfactant is added to solubilize the creatinine amide hydrolase, and it is separated and collected as an aqueous solution.
[0026]
The creatinine amide hydrolase-containing solution thus obtained is concentrated by, for example, vacuum concentration, membrane concentration, salting-out treatment of ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, or fractional precipitation with a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or the like. It may be allowed to settle. Heat treatment and isoelectric point treatment are also effective purification means. Thereafter, purified creatinine aminohydrolase can be obtained by performing gel filtration with an adsorbent or gel filtration agent, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
For example, it is separated and purified by gel filtration using Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech), DEAE Sepharose CL-6B (Pharmacia Biotech), octyl Sepharose CL6-B (Pharmacia Biotech) column chromatography, and purified enzyme standard Goods can be obtained. This purified enzyme preparation is purified to such an extent that it shows an almost single band by SDS-PAGE.
[0027]
An example of the creatinine amide hydrolase of the present invention has the following physicochemical properties.
[Chemical 3]

[0028]
Table 1 below shows a comparison of properties between the creatinine amide hydrolase of the present invention and known creatinine amide hydrolase. From Table 1, the enzyme of the present invention differs in molecular weight, number of subunits, and Km value for creatinine as compared with the conventional enzyme.
[0029]
Moreover, the homology between the amino acid sequence of the creatinine amide hydrolase of the present invention and the amino acid sequence of the creatinine aminohydrolase produced by the known Pseudomonas putida PS-7 is 65.5%. As shown in FIG.
Therefore, the creatinine amide hydrolase of the present invention is a novel enzyme having properties different from those of known enzymes that catalyze the same reaction. In addition, the information on the amino acid sequence of the creatinine amide hydrolase of the present invention facilitates improvement of enzymatic properties by substitution, insertion and deletion at the amino acid level of the enzyme.
[0030]
[Table 1]

[0031]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be specifically described by way of examples.
In the examples, creatinine amide hydrolase activity was measured using the following reagents under the following measurement conditions.
Reagent Reagent A: Diamond color CRE Creatinine measuring reagent (Toyobo Co., Ltd.) A solution (dissolved by adding 90 ml of solution A to enzyme reagent A vial)
Reagent B: 400 mM creatinine aqueous solution reagent C: 1.5% phenol aqueous solution reagent D: 0.5% 4-aminoantipyrine aqueous solution
Measurement conditions First, reagent A, reagent B, reagent C, and reagent D are mixed at a ratio (volume ratio) of 3: 1: 0.04: 0.04 to prepare a reagent mixture. Pre-warm 3 ml of this reagent mixture at 37 ° C for about 5 minutes, add 0.1 ml of enzyme solution, start the reaction at 37 ° C, react for 4 minutes, and then change the absorbance per minute at 500 nm. Measure with a spectrophotometer.
In the blind test, distilled water is added to the reagent mixture instead of the enzyme solution, and the change in absorbance is measured in the same manner. The amount of enzyme that decomposes 1 micromole of creatinine per minute under the above conditions is defined as 1 unit (U).
[0032]
Example 1 Separation of Chromosomal DNA Chromosomal DNA of Alcaligenes faecalis TE3581 (FERM P-14237) was isolated by the following method. The strain was cultured in 150 ml of ordinary bouillon medium with shaking at 30 ° C. overnight, and then collected by centrifugation (8,000 rpm, 10 minutes). Suspend in 5 ml of a solution containing 10% sucrose, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 50 mM EDTA, add 1 ml of lysozyme solution (10 mg / ml), incubate at 37 ° C. for 15 minutes, then 1 ml of 10% SDS solution was added. An equal amount of chloroform / phenol solution (1: 1) was added to this solution, mixed with stirring, centrifuged at 10,000 rpm for 3 minutes to separate into an aqueous layer and a solvent layer, and the aqueous layer was separated. This aqueous layer was gently overlaid with twice the amount of ethanol, and the DNA was wound around the glass rod while being slowly stirred with a glass rod to separate it.
This was dissolved in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 solution (hereinafter abbreviated as TE) containing 1 mM EDTA. After treating this with an equal volume of chloroform / phenol solution, the aqueous layer was separated by centrifugation, and twice the amount of ethanol was added, and the DNA was again separated by the above method and dissolved in 2 ml of TE.
[0033]
Example 2 Preparation of DNA fragment containing gene encoding creatinine aminohydrolase and recombinant vector having the DNA fragment 20 μg of DNA obtained in Example 1 was partially digested with restriction enzyme Sau3AI (manufactured by Toyobo), and sucrose density gradient A 2 to 10 kbp fragment was recovered by centrifugation. On the other hand, pBluescriptKS (+) cleaved with the restriction enzyme BamHI (manufactured by Toyobo) was dephosphorylated with bacterial alkaline phosphatase (manufactured by Toyobo). The DNA was ligated by reacting. The ligated DNA was transformed using Escherichia coli JM109 competent cell (Toyobo Co., Ltd.) and agar medium for detecting creatinine amide hydrolase activity [1.0% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 1% creatinine, 200 U / ml creatine amidinohydrolase (Toyobo), 10 U / ml sarcosine oxidase (Toyobo), 5 U / ml peroxidase (Toyobo), 0.01% o-dianisidine, 50 μg / ml ampicillin, 1.5% agar]. The detection of creatinine amide hydrolase activity was performed using colonies that grew in the above medium and stained brown as an index.
[0034]
About 100,000 transformant colonies were obtained per 1 μg of DNA used, and as a result of the screening, one colony that was stained brown was found. This strain was cultured in an LB liquid medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 50 μg / ml ampicillin), and when the creatinine amide hydrolase activity was measured, the activity was detected.
The plasmid possessed by this strain contained an inserted DNA fragment of about 5 kbp, and this plasmid was designated as pCNHA17.
Subsequently, the inserted DNA of pCNHA17 was excised with restriction enzymes SacII and PstI (manufactured by Toyobo) and ligated to pBluescriptKS (+) cleaved with the same restriction enzymes to prepare pCNHA-1. Restriction enzyme maps of these pCNHA17 and pCNHA-1 are shown in FIG.
[0035]
Example 3 Determination of Base Sequence Subclones were prepared with various restriction enzymes for the about 1.2 kbp inserted DNA fragment of pCNHA-1. The nucleotide sequences of various subclones were determined using a Radioactive Sequencing Kit (manufactured by Toyobo) according to a conventional method. The determined base sequence and amino acid sequence are shown in the sequence listing.
The molecular weight of the protein determined from the amino acid sequence was 28,744, which almost coincided with the molecular weight of the creatinine aminohydrolase of Alcaligenes faecalis TE3581.
[0036]
Example 4 Construction of Recombinant Vector pCNHA-11 In order to remove the portion other than the creatinine aminohydrolase gene from the inserted DNA fragment of pCNHA-1, the size of the inserted DNA fragment was reduced by PCR. PCR was performed under the following reaction solution composition and amplification conditions.
Reaction solution composition Pfu DNA polymerase (Stratagene) 5U / 100 μl
10-fold Pfu DNA polymerase buffer 10 μl / 100 μl
pCNHA-1 (template DNA) 0.1 μg / 100 μl
dATP, dTTP, dGTP, dCTP 0.2mM each
1 μM of each primer
(Described in SEQ ID NOs: 3 and 4 in the sequence listing)
Amplification conditions Denaturation 94 ° C, 30 seconds temperature change 1 minute, 30 seconds annealing 45 ° C, 1 second temperature change 1 second reaction 75 ° C, 30 seconds temperature change 1 second (the above cycle is repeated 30 times)
[0037]
The amplified DNA fragment, about 0.8 kbp, was treated with restriction enzymes NdeI and BamHI (manufactured by Toyobo) and ligated to pLED-M1 cleaved with the same restriction enzyme to prepare pCNHA-11. A restriction enzyme map of pCNHA-11 is shown in FIG.
The inserted DNA fragment of pCNHA-11 does not contain a part other than the creatinine amide hydrolase gene. That is, there are NdeI and BamHI restriction enzyme cleavage sites at both ends of the inserted DNA fragment, NdeI overlaps with the start codon (ATG) of the creatinine amide hydrolase gene, and BamHI is the stop codon (TGA) of the creatinine amide hydrolase gene. Located immediately after.
[0038]
Example 5 Preparation of Transformant Escherichia coli JM109 competent cells (Toyobo) were transformed with pCNHA-11 to obtain transformant Escherichia coli JM109 (pCNHA-11).
[0039]
Example 6 Production of creatinine aminohydrolase from Escherichia coli JM109 (pCNHA-11) 500 ml of LB medium was dispensed into a 2 L flask, autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, allowed to cool, and then separately sterile filtered at 50 mg / ml. 0.5 ml of ampicillin (manufactured by Nacalai Tesque) was added. This medium was inoculated with 5 ml of a culture solution of Escherichia coli JM109 (pCNHA-11) previously shake-cultured in LB medium at 30 ° C. for 7 hours, and cultured with aeration at 37 ° C. for 18 hours. Creanitinamide hydrolase activity at the end of the culture was about 50 U / ml.
The cells were collected by centrifugation and suspended in 50 mM phosphate buffer, pH 7.8. The cell suspension was crushed with a French press and centrifuged to obtain a supernatant. The resulting crude enzyme solution was denucleated with polyethyleneimine and subjected to ammonium sulfate fractionation, then desalted by gel filtration with Sephadex G-25 (Pharmacia Biotech), and DEAE Sepharose CL-6B (Pharmacia Biotech). Separation and purification were performed by column chromatography and octyl sepharose CL6-B (Pharmacia Biotech) column chromatography to obtain a purified enzyme surface product.
The creatinine aminohydrolase preparation obtained by this method showed almost a single band by SDS-PAGE electrophoresis, and the specific activity at this time was 83 U / mg protein.
[0040]
The properties of creatinine amide hydrolase obtained by the above method are shown below.
[Formula 4]

[0041]
【The invention's effect】
The enzyme of the present invention is a novel enzyme with a difference in molecular weight, number of subunits, and Km value for creatinine as compared with conventionally known creatinamide hydrolase. Further, the productivity of creatinine amide hydrolase produced by gene recombination technology using the gene of the conventional enzyme Pseudomonas putida PS-7 is 15.7 U / ml, whereas the enzyme of the present invention Productivity is 50 U / ml, and high purity enzymes can be produced.
In addition, information on the amino acid sequence of the creatinine amide hydrolase of the present invention has the effect of facilitating the improvement of enzymatic properties by substitution, insertion, and deletion at the amino acid level of the enzyme.
[0042]
[Sequence Listing]
SEQ ID NO: 1
Sequence length: 258
Sequence type: Amino acid Topology: Linear sequence type: Protein origin: Alcaligenes faecalis
Stock name: TE3581 (FERM P-14237)
Array

[0043]
SEQ ID NO: 2
Array length: 777
Sequence type: Nucleic acid Topology: Linear sequence type: Genomic DNA
Origin organism name: Alcaligenes faecalis
Stock name: TE3581 (FERM P-14237)
Array

[0044]
SEQ ID NO: 3
Sequence length: 49
Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single-stranded topology: Linear sequence type: Synthetic DNA
Array

[0045]
SEQ ID NO: 4
Sequence length: 49
Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single-stranded topology: Linear sequence type: Synthetic DNA
Array

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows a comparison between the amino acid sequence of the creatinine amide hydrolase of the present invention and the amino acid sequence of creatinine amide hydrolase produced by Pseudomonas putida PS-7.
FIG. 2 shows restriction enzyme maps of pCNHA17, pCNHA-1, and pCNHA-11.

Claims (12)

A novel creatinine amide hydrolase having the following physicochemical properties:
Action: Creatinine + H ₂ O ← → Optimum creatine temperature: 60 ° C
Optimum pH: 7.5-8.5
Thermal stability : 50 ° C. or less (pH 7.5, 30 minutes)
pH stability : 8 . 0 to 10.0 (4 ° C, 16 hours)
Molecular weight : 3 1,500 (SDS-PAGE ), 120,000 (gel filtration)
Isoelectric point : 4 . 8  The creatinine amide hydrolase according to claim 1, which contains the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.  The creatinine amide hydrolase according to claim 1, which is an enzyme produced by Alcaligenes faecalis TE3581 (FERM P-14237).  The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or a base encoding a polypeptide in which one or more amino acids are added, deleted or substituted in the amino acid sequence, and which brings about the enzymatic activity of creatinine aminohydrolase A gene encoding creatinine amide hydrolase, characterized in that it contains a sequence.  A gene encoding creatinine amide hydrolase, comprising a base sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing.  The nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing or a nucleotide encoding one or more nucleotides added, deleted or substituted in the nucleotide sequence and encoding a polypeptide that brings about the enzymatic activity of creatinine amide hydrolase A gene encoding creatinine amide hydrolase characterized by being a sequence.  A gene encoding creatinine amide hydrolase, comprising the base sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing.  A recombinant vector comprising the gene encoding the creatinine amide hydrolase according to claim 4, 5, 6 or 7.  A transformant in which a host cell is transformed with a recombinant vector containing the gene encoding creatinine amide hydrolase according to claim 4, 5, 6 or 7.  A transformant transformed with a recombinant vector containing a gene encoding the creatinine amide hydrolase according to claim 4, 5, 6 or 7 is cultured in a medium to produce creatinine amide hydrolase, and the creatinine A method for producing creatinine amide hydrolase, which comprises collecting amide hydrolase. The method for producing creatinine amide hydrolase according to claim 10, characterized in that it is not necessary to add an inducer to the medium. The method for producing creatinine amide hydrolase according to claim 10 or 11, wherein the productivity of creatinine amide hydrolase during culture exceeds 15.7 U / mL.

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