JP4053288B2 - オリゴヌクレオチドを固定化するための固形支持体 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はオリゴヌクレオチドを固定するための固形支持体に関する。本発明はまた、前記固形支持体を製造するための方法にも関係する。
【０００２】
本発明の固形支持体は特に、小型の生物学的アッセイ装置、または、バイオチップを製造することに使用される。本発明に関するこのようなバイオチップは、例えば、配列決定、一塩基多型（ＳＮＰ）のスクリーニング、遺伝子発現の研究、微生物の認定、およびトランスクリプトーム(trancriptome)の研究に使用することができる。
【０００３】
【従来の技術】
バイオチップは固形支持体の上にオリゴヌクレオチドを接合させるための技術を使用する。このようなオリゴヌクレオチドは数百の塩基のＤＮＡ断片を生じる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）によって得られる。それらは、予め合成されたものであってもよく、その場合には、６から１００の親(parents)を備え、またはin situで合成されたものであってもよく、その場合には６から６０の親を備える。
【０００４】
生物学的プローブを含むマイクロアレイの製造および使用は、急速な発展を遂げている領域の一部である。マイクロアレイは固形支持体に直接、平行合成することによって製造することができる。この場合、それらは高密度バイオチップ（５０００プローブ以上）に達することになる。マイクロアレイはまた、バイオチップの固形支持体の表面にプローブを固定することによっても製造できる。この後者の方法は、固定化の前に精製されてもよい、天然および合成の両方の生成物の使用を考慮できるので、より用途が広い。
【０００５】
生物学的分子が一般に沈着される固形支持体は、ガラス、ケイ素、ポリアクリルアミドゲル、ポリマー支持体（米国特許5 919 525参照）、またはプラスチック（マイクロウエルプレート）である。それらはナイロン膜であってもよい。
【０００６】
種々の技術を、支持体上の所定の部位に生物学的化合物を沈着させるために使用することができる。スポッティングによって、つまり、インクジェット、圧電性または、いわゆる「ピン・アンド・リング(pin and ring)」の方法によって、その部位に微小液滴を沈着させることができる。
【０００７】
使用した沈着方法に関係なく、固形支持体は生物学的分子に対する付着または接合表面を与えるように処理されなければならない。このような表面処理は一般にヒドロキシル基とされる化学的機能（官能性）の形成を確実にする。この機能は後の化学的接合工程を実行可能にする。さらに、この工程における有効部位の密度は、支持体における生物学的プローブの最終的な密度を決定する。
【０００８】
酸化物層におおわれたガラスまたはケイ素の基板は、表面の化学洗浄によりヒドロキシル基が付与され、表面のＳｉＯ2分子がＳｉＯＨとなる。洗浄は塩基性条件下（水酸化ナトリウムまたはアンモニアを使用）または酸性条件下（塩酸、スルホクロミック(sulfochromic)酸、またはスルホ酸化酸(sulfo-oxygenated acid)を使用）において実行される。水滴アングル法(droplet angle method)を利用した測定は、支持体の表面上における転換効率を調べるのに使用される。プローブの固定化における処理効率は、相補的なプローブを用いたハイブリダイゼーションによって調べられる。蛍光観察は、より支持体の表面が親水性を増すほど、プローブの固定化が良好になり、より高いプローブの密度を支持体上に得られるようにすることを示す。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来技術の固形支持体は、一般にオリゴヌクレオチドを固定するための十分に満足できる表面均一性を備えていなかった。
【００１０】
本発明によって、オリゴヌクレオチドを固定化するための均一性の欠如というこのような問題を克服することができる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一主題は、オリゴヌクレオチドを固定するための表面を備え、前記表面がＨｆＯ2、ＴｉＯ2、Ｔａ2Ｏ5、ＺｒＯ2、およびこれらの物質の少なくとも一つを含む混合物から選択された物質の表面であり、かつ、当該表面が親水性化処理されていることを特徴とする固形支持体である。
【００１２】
有利には、前記物質は基板に沈着した層の形状にある。この層の厚さは、数ナノメートルから１マイクロメートルまで変化させることができる。前記基板は、例えば、ガラス、プラスチックおよび半導体物質、ケイ素における基板から選択された基板とすることができる。
【００１３】
オリゴヌクレオチドを固定するためのこのような表面を備える物質は、ＳｉＯ2を含む混合物とすることができる。
【００１４】
本発明の第二の主題は、前記において定義されたようなオリゴヌクレオチドを固定するための固形支持体を含むバイオチップである。
【００１５】
本発明の第三の主題は、オリゴヌクレオチドを固定するための表面を備え、かつ、物質の層を有する基板を備え、前記層の自由面が前記表面を形成する固形支持体を製造する方法であって、以下の工程：
−前記基板を用意する工程、
−前記基板に、ＨｆＯ2、ＴｉＯ2、Ｔａ2Ｏ5、ＺｒＯ2およびこれらの物質の少なくとも一つを含む混合物から選択された物質の層を沈着させる工程、
−前記層の自由面を親水性化処理する工程
を含むことを特徴とする。
【００１６】
前記沈着工程は、数ナノメートルから１マイクロメートルの間の厚さを有する物質の層を沈着させることからなるとすることができる。
【００１７】
前記基板を用意する工程は、ガラス、プラスチックおよび半導体物質の基板から選択された基板を用意することからなるとすることができる。
【００１８】
前記沈着工程は、ＳｉＯ2を含有する物質を沈着させることからなるとすることができる。
【００１９】
前記沈着工程は、真空蒸着、イオンビームスパッタリング、高周波スパッタリング、マグネトロンスパッタリング、原子層化学蒸着（ＡＬＣＶＤ）およびゾル−ゲル沈着から選択された沈着方法を用いることができる。
【００２０】
沈着した層の自由面の処理工程は、塩基性溶液または酸性溶液で前記層を洗浄することからなるとすることができる。
【００２１】
前記方法は、前記層の自由面を構造化することからなるさらなる工程を含有することができる。このような構造化工程は、ドライエッチング、ウェットエッチングおよび「リフトオフ(lift-off)」から選択される技術を用いることができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
添付の図面は、本発明にかかる固形支持体１の透視図である。固形支持体１は、層の沈着を可能にする物質の基板２を備え、前記層の自由面が、オリゴヌクレオチドを固定するための表面を形成する。例えば、基板２はケイ素である。
【００２３】
層３は基板２に沈着される。これは、オリゴヌクレオチドの結合前駆体として使用される。そして、これは、その全体、または一部が耐火金属の酸化物（または複数の酸化物）、ＴｉＯ2、ＺｒＯ2、ＨｆＯ2、またはＴａ2Ｏ5から形成される。沈着した層は、数ナノメートルから１マイクロメートルの間の厚さを有する薄い層である。この層は、おおよそ５０℃から２００℃の間の温度で、電子銃による真空蒸着によって沈着させることができる。また、イオンビームスパッタリング(IBS)、高周波、またはマグネトロンスパッタリングによっても沈着させることができる。原子層化学蒸着（ＡＬＣＶＤ）のような最近の沈着法も使用できる。ゾル−ゲル沈着法も挙げることができる。
【００２４】
本発明の薄い層を形成する前記物質は、ガラス、プラスチック、ケイ素に、ピーヴイディ(PVD)蒸着法（電子銃、イオンビームスパッタリング(IBS)、スパッタリング）によって沈着させることができる。
【００２５】
このような金属酸化物は、塩基性溶液に関して非常に安定しており、表面は緩やかで一様な転換をする。
【００２６】
表面処理を行わなければ、これらの物質は疎水性である。ハフニウム酸化物では、水滴アングルは６０゜という測定値を与える。使用される塩基処理によって、水滴アングルは３５°から６°までと変化する。
【００２７】
このように処理された支持体を用いて、オリゴヌクレオチドをケイ素基板上のＨｆＯ2の層からなる支持体上で、in situ合成によって成長させた。あまり親水性でないサンプル（３５°）においては、２０の親のプローブを相補性標的を用いてハイブリダイゼーションした後の蛍光シグナルは、弱く、かつ、均一ではなかった。親水性の強いサンプル（６°）は、特に均一性に関して明確な改善を現した。
【００２８】
前記均一性を、度々使用される固形支持体、すなわち、０．５μｍの厚さを有する熱酸化物の層によって覆われているシリコーン基板から形成された支持体の均一性と比較した。従来技術のこのような固形支持体と比較して、本発明の支持体（Ｓｉ上にＨｆＯ2）は、蛍光シグナルの均一性における改善をもたらす。
【００２９】
これと同様の結果が、ＨｆＯ2の層で覆われたガラスの基板を用いて、予め合成した２０の親のプローブを共有結合により固定した後にも得られた。
【００３０】
この沈着方法は、静電気相互作用によるプローブの固定化法を利用したバイオチップにも使用される。
【００３１】
このような耐火金属酸化物の沈着は、バイオチップテクノロジーにおいて使用される接合のあらゆる手段、すなわち、あらゆる支持体（ガラス、ケイ素、プラスチック）、および生物学的接合技術のあらゆる手段（in situでの合成、共有結合、または、静電気結合による固定化）を使用可能にする。
【００３２】
この測定結果は、従来技術と比較して、蛍光シグナルの均一性における改善を示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】オリゴヌクレオチドを固定するための表面を備えた固形支持体の透視図である。
【符号の説明】
１ 固形支持体
２ 基板
３ 層
４ 表面
【発明の属する技術分野】
本発明はオリゴヌクレオチドを固定するための固形支持体に関する。本発明はまた、前記固形支持体を製造するための方法にも関係する。
【０００２】
本発明の固形支持体は特に、小型の生物学的アッセイ装置、または、バイオチップを製造することに使用される。本発明に関するこのようなバイオチップは、例えば、配列決定、一塩基多型（ＳＮＰ）のスクリーニング、遺伝子発現の研究、微生物の認定、およびトランスクリプトーム(trancriptome)の研究に使用することができる。
【０００３】
【従来の技術】
バイオチップは固形支持体の上にオリゴヌクレオチドを接合させるための技術を使用する。このようなオリゴヌクレオチドは数百の塩基のＤＮＡ断片を生じる、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法）によって得られる。それらは、予め合成されたものであってもよく、その場合には、６から１００の親(parents)を備え、またはin situで合成されたものであってもよく、その場合には６から６０の親を備える。
【０００４】
生物学的プローブを含むマイクロアレイの製造および使用は、急速な発展を遂げている領域の一部である。マイクロアレイは固形支持体に直接、平行合成することによって製造することができる。この場合、それらは高密度バイオチップ（５０００プローブ以上）に達することになる。マイクロアレイはまた、バイオチップの固形支持体の表面にプローブを固定することによっても製造できる。この後者の方法は、固定化の前に精製されてもよい、天然および合成の両方の生成物の使用を考慮できるので、より用途が広い。
【０００５】
生物学的分子が一般に沈着される固形支持体は、ガラス、ケイ素、ポリアクリルアミドゲル、ポリマー支持体（米国特許5 919 525参照）、またはプラスチック（マイクロウエルプレート）である。それらはナイロン膜であってもよい。
【０００６】
種々の技術を、支持体上の所定の部位に生物学的化合物を沈着させるために使用することができる。スポッティングによって、つまり、インクジェット、圧電性または、いわゆる「ピン・アンド・リング(pin and ring)」の方法によって、その部位に微小液滴を沈着させることができる。
【０００７】
使用した沈着方法に関係なく、固形支持体は生物学的分子に対する付着または接合表面を与えるように処理されなければならない。このような表面処理は一般にヒドロキシル基とされる化学的機能（官能性）の形成を確実にする。この機能は後の化学的接合工程を実行可能にする。さらに、この工程における有効部位の密度は、支持体における生物学的プローブの最終的な密度を決定する。
【０００８】
酸化物層におおわれたガラスまたはケイ素の基板は、表面の化学洗浄によりヒドロキシル基が付与され、表面のＳｉＯ2分子がＳｉＯＨとなる。洗浄は塩基性条件下（水酸化ナトリウムまたはアンモニアを使用）または酸性条件下（塩酸、スルホクロミック(sulfochromic)酸、またはスルホ酸化酸(sulfo-oxygenated acid)を使用）において実行される。水滴アングル法(droplet angle method)を利用した測定は、支持体の表面上における転換効率を調べるのに使用される。プローブの固定化における処理効率は、相補的なプローブを用いたハイブリダイゼーションによって調べられる。蛍光観察は、より支持体の表面が親水性を増すほど、プローブの固定化が良好になり、より高いプローブの密度を支持体上に得られるようにすることを示す。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、従来技術の固形支持体は、一般にオリゴヌクレオチドを固定するための十分に満足できる表面均一性を備えていなかった。
【００１０】
本発明によって、オリゴヌクレオチドを固定化するための均一性の欠如というこのような問題を克服することができる。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の第一主題は、オリゴヌクレオチドを固定するための表面を備え、前記表面がＨｆＯ2、ＴｉＯ2、Ｔａ2Ｏ5、ＺｒＯ2、およびこれらの物質の少なくとも一つを含む混合物から選択された物質の表面であり、かつ、当該表面が親水性化処理されていることを特徴とする固形支持体である。
【００１２】
有利には、前記物質は基板に沈着した層の形状にある。この層の厚さは、数ナノメートルから１マイクロメートルまで変化させることができる。前記基板は、例えば、ガラス、プラスチックおよび半導体物質、ケイ素における基板から選択された基板とすることができる。
【００１３】
オリゴヌクレオチドを固定するためのこのような表面を備える物質は、ＳｉＯ2を含む混合物とすることができる。
【００１４】
本発明の第二の主題は、前記において定義されたようなオリゴヌクレオチドを固定するための固形支持体を含むバイオチップである。
【００１５】
本発明の第三の主題は、オリゴヌクレオチドを固定するための表面を備え、かつ、物質の層を有する基板を備え、前記層の自由面が前記表面を形成する固形支持体を製造する方法であって、以下の工程：
−前記基板を用意する工程、
−前記基板に、ＨｆＯ2、ＴｉＯ2、Ｔａ2Ｏ5、ＺｒＯ2およびこれらの物質の少なくとも一つを含む混合物から選択された物質の層を沈着させる工程、
−前記層の自由面を親水性化処理する工程
を含むことを特徴とする。
【００１６】
前記沈着工程は、数ナノメートルから１マイクロメートルの間の厚さを有する物質の層を沈着させることからなるとすることができる。
【００１７】
前記基板を用意する工程は、ガラス、プラスチックおよび半導体物質の基板から選択された基板を用意することからなるとすることができる。
【００１８】
前記沈着工程は、ＳｉＯ2を含有する物質を沈着させることからなるとすることができる。
【００１９】
前記沈着工程は、真空蒸着、イオンビームスパッタリング、高周波スパッタリング、マグネトロンスパッタリング、原子層化学蒸着（ＡＬＣＶＤ）およびゾル−ゲル沈着から選択された沈着方法を用いることができる。
【００２０】
沈着した層の自由面の処理工程は、塩基性溶液または酸性溶液で前記層を洗浄することからなるとすることができる。
【００２１】
前記方法は、前記層の自由面を構造化することからなるさらなる工程を含有することができる。このような構造化工程は、ドライエッチング、ウェットエッチングおよび「リフトオフ(lift-off)」から選択される技術を用いることができる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
添付の図面は、本発明にかかる固形支持体１の透視図である。固形支持体１は、層の沈着を可能にする物質の基板２を備え、前記層の自由面が、オリゴヌクレオチドを固定するための表面を形成する。例えば、基板２はケイ素である。
【００２３】
層３は基板２に沈着される。これは、オリゴヌクレオチドの結合前駆体として使用される。そして、これは、その全体、または一部が耐火金属の酸化物（または複数の酸化物）、ＴｉＯ2、ＺｒＯ2、ＨｆＯ2、またはＴａ2Ｏ5から形成される。沈着した層は、数ナノメートルから１マイクロメートルの間の厚さを有する薄い層である。この層は、おおよそ５０℃から２００℃の間の温度で、電子銃による真空蒸着によって沈着させることができる。また、イオンビームスパッタリング(IBS)、高周波、またはマグネトロンスパッタリングによっても沈着させることができる。原子層化学蒸着（ＡＬＣＶＤ）のような最近の沈着法も使用できる。ゾル−ゲル沈着法も挙げることができる。
【００２４】
本発明の薄い層を形成する前記物質は、ガラス、プラスチック、ケイ素に、ピーヴイディ(PVD)蒸着法（電子銃、イオンビームスパッタリング(IBS)、スパッタリング）によって沈着させることができる。
【００２５】
このような金属酸化物は、塩基性溶液に関して非常に安定しており、表面は緩やかで一様な転換をする。
【００２６】
表面処理を行わなければ、これらの物質は疎水性である。ハフニウム酸化物では、水滴アングルは６０゜という測定値を与える。使用される塩基処理によって、水滴アングルは３５°から６°までと変化する。
【００２７】
このように処理された支持体を用いて、オリゴヌクレオチドをケイ素基板上のＨｆＯ2の層からなる支持体上で、in situ合成によって成長させた。あまり親水性でないサンプル（３５°）においては、２０の親のプローブを相補性標的を用いてハイブリダイゼーションした後の蛍光シグナルは、弱く、かつ、均一ではなかった。親水性の強いサンプル（６°）は、特に均一性に関して明確な改善を現した。
【００２８】
前記均一性を、度々使用される固形支持体、すなわち、０．５μｍの厚さを有する熱酸化物の層によって覆われているシリコーン基板から形成された支持体の均一性と比較した。従来技術のこのような固形支持体と比較して、本発明の支持体（Ｓｉ上にＨｆＯ2）は、蛍光シグナルの均一性における改善をもたらす。
【００２９】
これと同様の結果が、ＨｆＯ2の層で覆われたガラスの基板を用いて、予め合成した２０の親のプローブを共有結合により固定した後にも得られた。
【００３０】
この沈着方法は、静電気相互作用によるプローブの固定化法を利用したバイオチップにも使用される。
【００３１】
このような耐火金属酸化物の沈着は、バイオチップテクノロジーにおいて使用される接合のあらゆる手段、すなわち、あらゆる支持体（ガラス、ケイ素、プラスチック）、および生物学的接合技術のあらゆる手段（in situでの合成、共有結合、または、静電気結合による固定化）を使用可能にする。
【００３２】
この測定結果は、従来技術と比較して、蛍光シグナルの均一性における改善を示している。
【図面の簡単な説明】
【図１】オリゴヌクレオチドを固定するための表面を備えた固形支持体の透視図である。
【符号の説明】
１ 固形支持体
２ 基板
３ 層
４ 表面
Claims (13)
- オリゴヌクレオチドを固定するための表面（４）を備えた固形支持体（１）であって、前記表面（４）がＨｆＯ2、ＴｉＯ2、Ｔａ2Ｏ5、ＺｒＯ2およびこれらの物質の少なくとも一つを含む混合物から選択された物質の表面であり、前記物質が、基板（２）に沈着された層（３）の形態であり、かつ、当該表面が塩基溶液または酸溶液で前記層（３）を洗浄することからなる親水性化処理をされていることを特徴とする固形支持体。
- 前記層（３）が、数ナノメートルから１マイクロメートルの間の厚さを有することを特徴とする、請求項１記載の固形支持体。
- 前記基板（２）が、ガラス、プラスチックおよび半導体物質の基板から選択された基板であることを特徴とする、請求項１または２記載の固形支持体。
- 前記基板（２）がケイ素であることを特徴とする、請求項３記載の固形支持体。
- 前記物質が、ＳｉＯ2を含む混合物であることを特徴とする、請求項１ないし４のいずれか一項に記載の固形支持体。
- 請求項１ないし５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを固定するための固形支持体（１）を備えることを特徴とするバイオチップ。
- オリゴヌクレオチドを固定するための表面（４）を備え、かつ、物質の層（３）を支持する基板（２）を備え、前記層（３）の自由面が前記表面（４）を形成する固形支持体（１）を製造する方法であって、以下の工程：
−前記基板（２）を用意する工程、
−前記基板（２）に、ＨｆＯ2、ＴｉＯ2、Ｔａ2Ｏ5、ＺｒＯ2およびこれらの物質の少なくとも一つを含む混合物から選択された物質の層（３）を沈着させる工程、
−前記層（３）の自由面を、塩基溶液または酸溶液で前記層を洗浄することからなる親水性化処理をする工程
を含むことを特徴とする固形支持体の製造方法。 - 前記沈着工程が、数ナノメートルから１マイクロメートルの間の厚さを有する物質の層（３）を沈着させることからなることを特徴とする、請求項７記載の方法。
- 前記基板（２）を用意する工程が、ガラス、プラスチックおよび半導体基板から選択された基板を用意することからなることを特徴とする、請求項７記載の方法。
- 前記沈着工程が、ＳｉＯ2を含有する物質を沈着させることからなることを特徴とする、請求項７記載の方法。
- 前記沈着工程が、真空蒸着、イオンビームスパッタリング、高周波スパッタリング、マグネトロンスパッタリング、原子層化学蒸着（ＡＬＣＶＤ）およびゾル−ゲル沈着から選択された沈着方法を用いることを特徴とする、請求項７記載の方法。
- 前記層（３）の自由面を構造化することからなるさらなる工程を含むことを特徴とする、請求項７記載の方法。
- 前記構造化工程が、ドライエッチング、ウェットエッチングおよび「リフトオフ」から選択される技術を用いることを特徴とする、請求項１２記載の方法。
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