JP4047270B2

JP4047270B2 - Ｒｆｈｒ二次元電気泳動法及び装置

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Publication number: JP4047270B2
Application number: JP2003427721A
Authority: JP
Inventors: 明和田
Original assignee: 有限会社バイオ情報技術研究所
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2003-12-24
Publication date: 2008-02-13
Anticipated expiration: 2023-12-24
Also published as: US20050139471A1; JP2005188977A; US7572358B2

Description

本発明は、二次元電気泳動法、特にポリアクリルアミドゲルを用いた蛋白質試料の二次元電気泳動法及びその方法を実施するための装置に関するものである。

従来、試料を一次元ゲル中で電気的に泳動させ、これにより得られた一次元ゲル柱を二次元ゲルの上端に載せて、さらに電気泳動させることからなる二次元電気泳動法において、例えば前記一次元及び二次元ゲルとしてポリアクリルアミドゲルを用い、大腸菌リボソーム蛋白質を分離検出する場合、試料蛋白は溶液として円柱状の一次元ゲルに加えられ、その泳動により成分分離（一次元分離）され、その状態で固定された円柱状ゲルを二次元ゲルの上端に載置し、二次元泳動を行うものであった。

発明者は先に、試料を前処理用棒状ゲル中において電気泳動させることにより濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠かれた所望のレベル位置に挿入して一次元電気泳動を実施し、これにより蛋白質を分離した一次元ゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させることを特徴とする二次元電気泳動法を開発した（例えば、特許文献１参照）。

この零次元サンプルゲルの作成を含む二次元電気泳動法においては、試料中の蛋白分子が個々にフリーラジカルと遭遇するのを避けるように試料を濃縮し、これにより一次元泳動、さらには二次元泳動の効果的な実施を可能にしたものである。この場合、前記前処理用棒状ゲル及び一次元ゲルが方形断面を有するようにし、これによって、零次元サンプルゲル及び一次元分離済ゲルを、それぞれ前記一次元ゲル及び二次元ゲルに対して隙間なく密着させ、接続面の両脇に隙間を生じることによって、泳動が乱れるという往時の円柱管内での一次元ゲル調製方式の欠点を完全に解消したものである。

しかし、分析精度を上げるためには一次元ゲルの作成と二次元電気泳動の過程において垂直に維持したゲル室内での、試料蛋白分子の温度による拡散を最小限に抑制するために、水性ゲルとして最も安定な温度（４℃）に制御する必要がある。従来のゲル室の温度制御は、ゲル両端に通ずるバッファー槽の収容液を介在して行っていたため、十分な制御ができなかった。

また、全蛋白質を対象としたプロテオーム解析のために、現存するあらゆる等電点の蛋白質を漏れなく検出するためには、上述の零次元サンプルゲルの作成における更なる工夫が必要である。
特公平６−４１９３３号公報（特許第１９１８９４８号）

本発明が解決しようとする第１の課題は、一次元ゲルの作成と二次元電気泳動の過程において垂直に維持したゲル室内での、試料蛋白分子の温度による拡散を最小限に抑制するために、水性ゲルとして最も安定な温度（４℃付近）に精密に制御する装置構成を提供することである。

本発明が解決しようとする第２の課題は、フリーラジカルを完全に除去し、同時に還元性の強い環境を実現することによって高い定量性を獲得しようとするＲＦＨＲ（radical-free and highly reducing)法において、零次元サンプルゲルの作成にあたり、等電点の如何に関わらず、すべての蛋白質を濃縮する方法を提供することである。

第１の課題を解決する一つの手段は、試料成分を一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次元ゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させることからなる二次元電気泳動法に用いるための、少なくとも１列の、直立した角柱状ゲル室を形成するゲルコンテナと、前記ゲルコンテナの各ゲル室に通ずる開口付きの上端及び下端を、それぞれ液密性を保って下方及び上方から突入させるための、電極を装備した上部バッファー槽及び下部バッファー槽とを備え、且つこれらのバッファー槽が冷却液中に実質的に没入可能な冷却液浸入防止構造を有する一次元電気泳動装置であって、各槽から引き出された電極引出し導体が前記冷却液と物理的及び電気的に絶縁された状態で、前記ゲルコンテナの外表面を前記冷却液と直接接触させるように構成したことを特徴とするものである。

上記の構成はまた、前記下部バッファー槽が前記ゲル室の下端開口に連通した本体部の後端から上方に折れ曲がった衝立部を有し、その衝立部の上端が前記上部バッファー槽の上端と実質的に同レベルであって、下部バッファー槽の唯一の開口として存在するように構成され、前記上部バッファー槽の上端と下部バッファー槽の衝立部上端とを残し、実質上装置全体を冷却液中に浸漬可能としたことを特徴とするものである。。

上記の構成は更に、前記ゲルコンテナの正面側における上端近傍に、各ゲル室の一部位に通ずる開口列を設けたことにより濃縮試料ゲル片の挿入口とし、これらのゲル片の挿入後に前記開口列を封ずるためのプラグ列を備えたサンプルゲルカバー板を装備したことを特徴とするものである。

第１の課題を解決する別の手段は、試料成分を一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次元ゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させることからなる二次元電気泳動法に用いるための、少なくとも１枚の方形平板状のゲル室を、各方形面が鉛直面内に位置するように形成したゲルコンテナと、前記ゲルコンテナのゲル室に通ずる開口付きの上端及び下端を、それぞれ液密性を保って下方及び上方から突入させるための、電極を装備した上部バッファー槽及び下部バッファー槽とを備え、且つこれらのバッファー槽が冷却液中に実質的に没入可能な冷却液浸入防止構造を有する二次元電気泳動装置であって、各槽から引き出された電極引出し導体が前記冷却液と物理的及び電気的に絶縁された状態で、前記ゲルコンテナの外表面を前記冷却液と接触させるように構成したことを特徴とするものである。

上記の構成はまた、前記下部バッファー槽が前記ゲル室の下端開口に連通した本体部の後端から上方に折れ曲がった衝立部を有し、その衝立部の上端が前記上部バッファー槽の上端と実質的に同レベルであって、下部バッファー槽の唯一の開口として存在するように構成され、前記上部バッファー槽の上端と下部バッファー槽の衝立部上端とを残し、実質上装置全体を冷却液中に浸漬可能としたことを特徴とするものである。

第２の課題を解決する一つの手段は、試料成分を一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次元ゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させることからなる二次元電気泳動法において、零次元サンプルゲルの作成にあたり試料をｐＨ５．５でリーディングイオンとなるＫ^＋とトレーリングイオンとなるグリシンとシステインを含む緩衝液を介して前処理用棒状ゲル中において電気泳動させることにより、ｐH約４以上のあらゆる等電点の蛋白質を負極方向に濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠かれた所望のレベル位置に挿入して一次元電気泳動を実施し、これにより二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させるべき一次元分離済ゲルを調製することを特徴とするものである。

第２の課題を解決する別の手段は、試料成分を一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次元ゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させることからなる二次元電気泳動法において、零次元サンプルゲルの作成にあたり試料をｐＨ３．０でリーディングイオンとなるＫ^＋とトレーリングイオンとなるグルタミン酸を含む緩衝液を介して前処理用棒状ゲル中において電気泳動させることにより、あらゆる等電点の蛋白質を負極方向に濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠かれた所望のレベル位置に挿入して一次元電気泳動を実施し、これにより二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させるべき一次元分離済ゲルを調製することを特徴とするものである。

第２の課題を解決する更に別の手段は、試料成分を一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次元ゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させることからなる二次元電気泳動法において、零次元サンプルゲルの作成にあたり試料をｐＨ１０．６でリーディングイオンとなるＣｌ⁻とトレーリングイオンとなるアルギニンを含む緩衝液を介して前処理用棒状ゲル中において電気泳動させることにより、ｐＨ１１以下の等電点をもつ蛋白質を正極方向に濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠かれた所望のレベル位置に挿入して一次元電気泳動を実施し、これにより二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させるべき一次元分離済ゲルを調製することを特徴とするものである。

上記した第１の課題解決手段によれば、組立てた装置全体を冷却液、特に約４℃とした水槽中に漬けて、ゲルコンテナの外壁を介し、ゲルそのものを４℃という安定な状態で泳動させる。これにより、通電に伴うジュール熱の発生が十分に抑制され、それに伴って蛋白分子の熱による拡散が顕著に抑えられる結果、高電圧下で長時間泳動できるようになり、蛋白スポットの密集する中性〜弱酸性領域を拡大した画面が可能となり、詳細な解析ができるようになった。

上記した零次元サンプルゲルの作成に関する第１の課題解決手段には、次の三つがある。すなわち（１）試料をｐＨ５．５でリーディングイオンとなるＫ^＋とトレーリングイオンとなるグリシンとシステインを含む緩衝液を介して前処理用棒状ゲル中において電気泳動させることにより、ｐH４．０以上のあらゆる等電点の蛋白質を負極方向に濃縮する。（２）試料をｐＨ３．０でリーディングイオンとなるＫ^＋とトレーリングイオンとなるグルタミン酸を含む緩衝液を介して前処理用棒状ゲル中において電気泳動させることにより、あらゆる等電点の蛋白質を負極方向に濃縮する。更に（３）試料をｐＨ１０．６でリーディングイオンとなるＣｌ⁻とトレーリングイオンとなるアルギニンを含む緩衝液を介して前処理用棒状ゲル中において電気泳動させることにより、ｐＨ１１以下の等電点をもつ蛋白質を正極方向に濃縮する、という三つの方法である。、

従って、上記三方法により、等電点の上限から下限にかけて全蛋白質を効率的に濃縮できるため、対象としたプロテオーム解析のために、一次元及び二次元電気泳動において、現存するあらゆる等電点の蛋白質を漏れなく検出することができる。

図１は、零次元電気泳動のために組立てられた零次元電気泳動装置であり、１は下部バッファー槽、２は複数本の角柱状ゲル室３を並列的に直立配置したゲルコンテナ、４は上部バッファー槽であり、いずれも耐腐食性、電気絶縁性及び機械的強度の優れたプラスチックから形成される。

ゲル室３の下端開口を有するゲルコンテナ２の下端は下部バッファー槽１の隅部仕切片５の内側と、後壁との間に架橋的に挿入され、その仕切片５／後壁間の支持段６上に載ったことにより、両側の仕切片５、５を除く実質的な長さ範囲において、槽底面との間に支持段６の高さの隙間ができ、ゲル室内の下部を占めるゲル７の下端は、バッファー液８に接触する。また、ゲルコンテナ２の上端部は、上部バッファー槽４の後部におけるコンテナ挿入口９に挿入・固着され、ゲル室３の上端開口は上部バッファー槽４内の液相と連通する。１０ａ及び１０ｂは、上部バッファー槽４及び下部バッファー槽１にそれぞれ装着された電気導体からなる電極端子である。

図２は、下部バッファー槽１の平面図であり、底板１ａは隅部仕切片５及び支持段６を設けた下部バッファー槽１の後部壁からせり出して、ゲルコンテナ２及び上部バッファー槽４を安定に支持するようになっている。

図３は、零次元ゲルコンテナ２を構成するゲルコンテナ板２aと蓋板２ｂ、及びそれらの重ね合わせ状態を示す図である。分図A、Bに示すコンテナ板２aには、常套的な細幅ゲル溝３−１（この場合、５ｍｍ）と、その２倍幅の太幅ゲル溝３−２とを、この場合、いずれも深さ２ｍｍとして、交互に配列したものである。このコンテナ板２aの溝表側には、分図C、Dに示すように、同じ大きさの平板からなる蓋板２ｂがあてがわれ、扁平で細長い並列ゲル室が形成される。

図４は、零次元上部バッファー槽４の平面図である。このバッファー槽４の後部におけるコンテナ挿入口９は、バッファー槽４の後壁と、その手前の衝立壁９ａとの間で形成される。衝立壁９ａは適当な高さを有し、その高さ範囲でゲルコンテナ２の上端部と接触することにより、零次元ゲル作成装置の最上端位置に安定的に支持される。

図５は、一次元ゲル作成のために組立てられた一次元電気泳動装置であり、１１は下部バッファー槽、１２は複数本の角柱状ゲル室１３を並列的に直立配置したゲルコンテナ、１４は上部バッファー槽である。下部バッファー槽１１及び上部バッファー槽１４はいずれも耐腐食性、電気絶縁性及び機械的強度の優れたプラスチックから形成されるが、一次元用ゲルコンテナ１２のみは熱伝導度の高いガラスから形成されることが望ましい。下部バッファー槽１１は、ゲル室１３の下端開口に連通した本体部１１ａの後端から上方に折れ曲がった衝立部１１ｂを有し、その衝立部１１ｂの上端が上部バッファー槽１４の上端と実質的に同レベルであって、使用時における下部バッファー槽の唯一の開口として存在するように構成されている。これにより、上部バッファー槽１４の上端と下部バッファー槽の衝立部１１ｂ上端とを残し、実質上装置全体を、仮想図示した冷却槽４０中の冷却液中に浸漬可能としたものである。

ゲル室１３の下端開口を有するゲルコンテナ１２の下端は、下部バッファー槽１１のせり出した前端壁と、前端壁よりやや手前の垂下壁１５との間に挿入・支持され、ゲルコンテナ１２を構成するゲルコンテナ板１２aの下端が垂下壁１５の下端と同じレベルで終わっており、蓋板１２ｂの下端が槽底面に支持されていることにより、両板１２a、１２ｂ間のゲル１７下端部の全長範囲において、槽底面との間に隙間ができ、下部バッファー槽１１内のバッファー液１８に接触する。また、ゲルコンテナ１２の上端部は、上部バッファー槽１４の中間部におけるコンテナ挿入口１９に挿入・固着され、ゲル室１３の上端開口は上部バッファー槽１４内の液相と連通する。

図６は、下部バッファー槽１１の側面図A、及びその側面図AのI−I矢視断面とII−II矢視断面とを含む部分破断平面図Bを示し、底板１１ｃは下部バッファー槽１１本体部１１ａの前端と、衝立部１１ｂの後端の両方から前後にせり出して、この下部バッファー槽１１とゲルコンテナ１２及び上部バッファー槽１４を安定に支持するようになっている。衝立部１１ｂの上端には、下部バッファー槽１１の電極端子２０ｂが装着され、この端子２０ｂは衝立部１１ｂ内のバッファー液に浸漬される白金線２０ｂ’に接続されている。この白金線２０ｂ’は、衝立部１１ｂ上端から２０ｍｍ程度垂下した下端を水平に且つ衝立部の左右いっぱいに張られた折り曲げ端を有する（平面図B参照）。

図７は、一次元ゲルコンテナ１２を構成するゲルコンテナ板１２aの平面図Aと側面図Bを示している。コンテナ板１２aには、汎用的な細幅ゲル溝１３−１（この場合、５ｍｍ）と、その２倍幅の太幅ゲル溝１３−２とを、この場合、いずれも深さ２ｍｍとして、交互に配列したものである。このコンテナ板１２aの溝表側には、図８の分図A、B、Cに示すように、上蓋板１２ｂ−１、窓蓋板１２ｂ−２、及び下蓋板１２ｂ−３があてがわれ、扁平で細長い並列ゲル室が形成される。一次元ゲル作成のための電気泳動装置として、コンテナ板１２aに対向配置される場合、上蓋板１２ｂ−１及び下蓋板１２ｂ−３は、窓蓋板１２ｂ−２の窓栓１２ｂ−２’の幅だけ間隔をあけられ、この間隔が零次元サンプル片のゲル室１３への挿入口となり、その挿入後に窓蓋板１２ｂ−２の窓栓１２ｂ−２’がその間隔（挿入口）に入れられ、窓蓋板１２ｂ−２の本体（外板）は上蓋板１２ｂ−１及び下蓋板１２ｂ−３の外面にあてがわれる（図５参照）。

図９は、一次元上部バッファー槽１４の平面図Ａ及び側面図Ｂを示している。このバッファー槽１４の中間におけるコンテナ挿入口１９は、バッファー槽１９の中間底面にあけた間隔を維持して対向した一対の衝立壁１９ａ、１９ｂとの間で形成される。衝立壁１９ａ、１９ｂは適当な高さを有し、その高さ範囲でゲルコンテナ１２の上端部と接触することにより、一次元電気泳動装置の最上端位置に安定的に支持される。上部バッファー槽１４の側壁と端壁の角部の上端には、上部バッファー槽１４の電極端子２０ａが装着されている。

図１０は、一次元ゲルを二次元ゲルに上乗せして行う二次元電気泳動装置であり、２１は下部バッファー槽、２２は複数枚の平板状ゲル室２３を重複・並列的に直立配置したゲルコンテナ、２４は上部バッファー槽であり、いずれも耐腐食性、電気絶縁性及び機械的強度の優れたプラスチックから形成される。下部バッファー槽２１は、ゲル室２３の下端開口に連通した本体部２１ａの後端から上方に折れ曲がった衝立部２１ｂを有し、その衝立部２１ｂの上端が上部バッファー槽２４の上端と実質的に同レベルであって、使用時における下部バッファー槽の唯一の開口として存在するように構成されている。これにより、上部バッファー槽２４の上端と下部バッファー槽の衝立部２１ｂ上端とを残し、実質上装置全体を、仮想図示した冷却槽４０’中の冷却液中に浸漬可能としたものである。

ゲル室２３の下端開口を有するゲルコンテナ２２の下端は、下部バッファー槽２１の本体部２１ａにおける、せり出した前端壁と、中間位置に形成された挿入口形成用の垂下壁２５との間に挿入され、垂下壁２５の下端レベルに形成された口枠２１ｃ上に支持される。ゲルコンテナ２２を構成するゲルコンテナ板２２a、蓋板２２ｂ及びコンテナ端板２２ｃの下端は、それらの外縁部のみが口枠２１ｃ上に支持されていることにより、蓋板２２ｂ及びコンテナ端板２２ｃ間の複数枚のゲル２７下端部の全長範囲において、槽底面との間に大きな間隔があき、下部バッファー槽２１内のバッファー液２８に接触する。また、ゲルコンテナ２２の上端部は、上部バッファー槽２４の中間部におけるコンテナ挿入口２９に挿入・固着され、ゲル室２３の上端開口は上部バッファー槽２４内の液相と連通する。

図１１は、下部バッファー槽２１の一部破断側面図A、及び平面図Bを示している。この図から明らかなとおり、衝立部２１ｂの上端には、下部バッファー槽２１の電極端子２０ｂが装着され、この端子２０ｂは衝立部１１ｂ内のバッファー液に浸漬される白金線２０ｂ”に接続されている。この白金線２０ｂ”は、衝立部１１ｂ上端から６０ｍｍ程度垂下した下端を水平に且つ衝立部の左右いっぱいに張られた折り曲げ端を有する（平面図B参照）ている。

図１２は、二次元ゲルコンテナ２２を構成するゲルコンテナ板２２a、蓋板２２ｂ及びコンテナ端板２２ｃのうち、図１０において左端を占める蓋板２２ｂの平面図Aと一部破断右側面（図１０における正面側）図Bを示している。蓋板本体２２ｂ−１は図Ａの背面がゲルに接し、正面には蓋枠板２２ｂ−２が下端を揃えて貼り付けられ、又は一体形成されている。蓋枠板２２ｂ−２の下端は下部バッファー槽の口枠２１ｃ上に支持され、上端は上部バッファー槽２４のゲルコンテナ挿入口２９の下端縁に接して、同槽２４の支持の一翼を担い、二次元電気泳動装置の組み立て構造の維持に寄与する。蓋枠板２２ｂ−２の枠の内側は空間であり、蓋板本体２２ｂ−１の正面を装置外部に対して（従って、装置が冷却槽に収容されたときは冷却液に対して）露出させる。

図１３は、二次元ゲルコンテナ２２の中核的要素であるゲルコンテナ板２２aの平面図Aと右側面図（図１０における正面側）B、及び下端面図Ｃを示している。コンテナ板２２aはゲル形成・維持に寄与する正面板２２a−１と、上、中、下三段のスペーサ４１ａ、４１ｂ、４１ｃを介して、正面板２２a−１の背面側に対向支持された背面板２２ａ−２とからなり、正面板２２a−１の表面両側にはゲルガイド片２２a−３が貼り付け、又は一体形成されている。従って、二次元電気泳動装置における方形状平面ゲルは、コンテナ板２２aの正面板２２a−１と、蓋板２２ｃ、又は別のゲルコンテナ板２２aと重なっている場合には、そのゲルコンテナ板２２aの背面板２２ａ−２の外表面との間の、ゲルガイド片２２a−３の厚みに対応する扁平空間内で、両側をゲルガイド片２２a−３に規制された範囲で形成され、上下両端が上部バッファー槽２４，及び下部バッファー槽２１のバッファー液相と接することになる。

図１４は、コンテナ端板２２ｃの平面図A、右側面図（図１０における正面側）B、及び下端面図Cにおいて、コンテナ端板２２ｃを示している。コンテナ端板２２ｃはゲル形成・維持に寄与する正面板２２ｃ−１と、正面板２２ｃ−１の背面側に対向支持された背面板２２ｃ−２とからなり、正面板２２ｃ−１の表面両側にゲルコンテナ板２２aのゲルガイド片２２a−３と同様なゲルガイド片２２ｃ−３が貼り付け、又は一体形成されている。従って、二次元電気泳動装置における最終列（図１０で右端）の方形状平面ゲルは、最終のゲルコンテナ板２２aの背面板２２ａ−２の外表面と、コンテナ端板２２ｃの正面板２２ｃ−１との間の、ゲルガイド片２２ｃ−３の厚みに対応する扁平空間内で、両側をゲルガイド片２２ｃ−３に規制された範囲で形成され、上下両端が上部バッファー槽２４，及び下部バッファー槽２１のバッファー液相と接することになる。背面板２２ｃ−２は蓋枠板２２ｂ−２と同様な枠板であり、枠の内側は同じく空間であり、正面板２２ｃ−１を底面とする窪みを形成する。

図１５は、二次元上部バッファー槽２４の側面図Ａ及び平面図Ｂを示している。このバッファー槽２４の中間におけるコンテナ挿入口２９は、バッファー槽２４の中間底面にあけた間隔を維持して対向した一対の衝立壁２９ａ、２９ｂとの間で形成される。衝立壁２９ａ、２９ｂは適当な高さを有し、その高さ範囲でゲルコンテナ２２の上端部と接触することにより、一次元電気泳動装置の最上端位置に安定的に支持される。更に、衝立壁２９ａ、２９ｂのやや外側におけるバッファー槽２４底面からは、これら衝立壁２９ａ、２９ｂを僅かに越える高さの栓壁２９ｃ、２９ｄが形成され、後述の如くゲルコンテナ２２によるバッファー槽２４の安定な保持に役立てられる。また、上部バッファー槽２４の側壁と端壁の角部の上端には、上部バッファー槽２４の電極端子３０ａが装着され、この端子２０ｂは衝立部１１ｂ内のバッファー液に浸漬される白金線３０ａに接続されている。この白金線３０ａは、衝立部１１ｂ上端から２０ｍｍ程度垂下した下端を水平に且つ衝立部の左右いっぱいに張られた折り曲げ端を有する（平面図B参照）ているている。

以上のごとくして、組立てられる二次元電気泳動装置は、それが図１０に示すように冷却槽４０内に入れられると、冷却液は二次元ゲルコンテナ２２の中間部においては、スペーサ４１ａ、４１ｂ、４１ｃを介して、正面板２２a−１の背面と背面板２２ａ−２との間に形成される空間内に入って、その対向面を冷却することにより、それらの薄板を介して電気泳動用ゲルを効果的に冷却し、蓋板２２ｂにおいても、蓋枠板２２ｂ−２の枠内開口に露出した薄い蓋板本体２２ｂ−を冷却することにより、電気泳動用ゲルを効果的に冷却する。背面板２２ｃ−２も蓋枠板２２ｂ−２と同様な枠板であり、コンテナ端板２２ｃの薄い本体板も直接冷却され、これによって右端の電気泳動用ゲルも効果的に冷却される。

図１６は、一次元ゲル作成のために組立てられた一次元電気泳動装置の別の実施例を示す略図であり、１１１は下部バッファー槽、１１２は複数本の角柱状ゲル室１１３を並列的に直立配置したゲルコンテナ、１１４は上部バッファー槽であり、いずれも耐腐食性、電気絶縁性及び機械的強度の優れたプラスチックから形成される。下部バッファー槽１１１は、ゲル室１１３の下端開口に連通してゲルコンテナ１１２を液密状に支持する上面蓋１１１ａを有し、その上面蓋１１１ａから垂下した下部バッファー槽電極（図示せず）のための、絶縁された電極端子部１２０ｂを有する。電極端子部１２０ｂからは、装置全体を収容した冷却槽１４０の開口部を上回る高さまで絶縁被覆付き導体柱１２０ｃを立設し、その導体柱１２０ｃの上端に下部バッファー槽電極端子１２０ｄを装備する。これらの端子部１２０ｂ、導体柱１２０ｃ及びバッファー槽電極端子１２０ｄは、通電中に下部バッファー槽において発生するガスを逃がすための狭い直通空間をもっている。上部バッファー槽１１４の上端は、少なくとも冷却槽１４０の開口部と同レベル以上の高さをであって、上面蓋又は（上面蓋がない場合の）内側壁から上方に突出した電極端子１２０ａを有する。これにより、上部バッファー槽１１４の上端と電極端子１２０ｄ、１２０ａとを残し、実質上装置全体を、仮想図示した冷却槽１４０中の冷却液中に浸漬可能としたものである。

図１７は、一次元ゲルを二次元ゲルに上乗せして行う二次元電気泳動装置の別の実施例を示す断面図であり、２２１は下部バッファー槽、２２２は複数枚の平板状ゲル室２２３を重複・並列的に直立配置したゲルコンテナ、２２４は上部バッファー槽であり、いずれも耐腐食性、電気絶縁性及び機械的強度の優れたプラスチックから形成される。下部バッファー槽２２１は、ゲル室２２３の下端開口に連通してゲルコンテナ２２２を液密状に支持した上面蓋２２１ａを有し、内部電極に通じ、図の如く側壁２２１ｂから上方に折れ曲がった絶縁被覆導体引出し部２２０を有し、その引出し部２２０の上端における端子２２０ａが上部バッファー槽２２４の上端レベルから突出し、端子２３０と実質的に同レベルとなるように構成されている。これらの引出し部２２０及びバッファー槽電極端子２２０ａは、通電中に下部バッファー槽において発生するガスを逃がすための狭い直通空間をもっている。これにより、上部バッファー槽２２４の上端と、端子２２０ａ、２３０とを残し、実質上装置全体を、仮想図示した冷却槽２４０中の冷却液中に浸漬可能としたものである。

上部バッファー槽２２４底面からは、図１５の衝立壁２９ａ、２９ｂと、それらのやや外側において、これらを僅かに越える高さの栓壁２９ｃ、２９ｄとの関係と同様、ゲルコンテナ挿入口２２９の側壁を為す衝立壁と、それらのやや外側において、これらを僅かに越える高さの栓壁２２９ａ、２２９ｂが形成され、ゲルコンテナ２２２の上端を挿入口２２９内に挿入後、ガーゼＧをその挿入口２２９の側壁（衝立壁）と栓壁２２９ａ、２２９ｂ、及びゲルコンテナ２２２の上端にあてがってから、それらの間にプラグＰＷや、ガスケットＧＳを差し込んでガーゼＧを噛ませることにより、バッファー槽２２４とゲルコンテナ２２２とを固定し、後者による前者（バッファー槽２２４）の安定な保持に役立てられる。

前述した図１〜図１５による装置構成を用いたＲＦＨＲ法による典型的な実施例の分離原理と分離ゲルについて説明する。一次元泳動の前に蛋白質を濃縮するための零次元泳動では、ディスク電気泳動法の濃縮原理を応用してｐＨ５．５でリーディングイオンとなるＫ^＋とトレーリングイオンとなるグリシンとシステインを混入した７Ｍ尿素を含む酢酸カリウム緩衝液を介して前処理用棒状ゲル中において電気泳動させることにより、ｐH４．０以上のあらゆる等電点の蛋白質を負極方向に濃縮する。

かくして得られた零次元濃縮ゲル切片を一次元ゲル素材の上端に載せて行う一次元電気泳動では、角柱状の一次元ゲル全長が、塩基性領域用としてはｐＨ８．６に設定され、上部バッファー槽の電極は陽極として、また下部バッファー槽の電極は陰極として使用される。更に中性から酸性領域用としてはｐＨ９．８に設定され、上部バッファー槽の電極は陰極として、また下部バッファー槽の電極は陽極として使用される。蛋白分子はネットチャージを駆動力として等速に泳動し、その速度の差で分離する。ゲルバッファー（緩衝液）は７Ｍ尿素と、０．３２％ＥＤＴＡ・２ナトリウムを含むトリス硼酸バッファーである。

かくして得られた一次元ゲルを二次元ゲル素材の上端に載せて行う二次元電気泳動では、７Ｍ尿素を含む酢酸カリウム緩衝液を用い、ゲル全体が一定ｐＨ３．４に設定される。このｐＨによれば、すべての蛋白質が下部バッファー槽の陰極に向かって下方に泳動する。零次元と一次元泳動におけるゲル（ポリアクリルアミドゲル）濃度は７％、二次元泳動におけるゲル濃度は１６％であるが、庄となる蛋白分子の大きさに応じて、ゲル濃度を適切に変化させることができる。二次元ゲルのサイズは厚さ２ｍｍ、幅１６５ｍｍ、高さ１３５ｍｍであり、このサイズのものを前述した装置構成により、同時に４枚使用できる。またゲル中に残存するフリーラジカルを除去するため、サンプルゲル片の挿入前において、陽極側にラジカル捕捉剤としてメルカプトエチルアミン塩酸塩をプレラン（前泳動）させる。

次に、サンプルゲルの作成と添加について説明する。通常、脱塩し凍結乾燥した蛋白試料を１．４％２−メルカプトエタノールを、８Ｍ尿素に溶かし、４０℃３０分プレインキュベートする。次いでフロントマーカーとしてピロニンＹとアクリデインオレンジを含む零次元ゲルバッファーの５０倍液を１/５０量加える。濃度は２−４ｍｇ／０．１ｍｌで、ゲル当たり数ｍｇ添加できる。

零次元泳動操作：プレランが終わった零次元ゲルにサンプル溶液を上乗せする。電極液は陽極に４Ｍ尿素と３．５％システイン塩酸塩を含むグリシン酸バッファー、陰極に零次元のゲルバッファーを用いる。室温下、定電圧１００Ｖで約１５分泳動し、ピロニンＹとアクリデインオレンジのバンドを含む上方１０ｍｍのゲルをサンプルゲルとして切り出し、一次元ゲルに挿入する。

一次元泳動操作：一次元ゲルの中間に設けられた窓を開き、一次元ゲルを約１０ｍｍ切除し、代わりに同じ長さのサンプルゲルを挿入する。電極液は一次元ゲルバッファーに同じで、陽極側に還元剤として０．５％メルカプトエチルアミン塩酸塩を加えて泳動する。温度は４℃、電圧は５００Ｖの一定値として塩基性領域の場合６時間、中性〜酸性領域の場合２０時間泳動する。

二次元泳動操作：二次元ゲル上に一次元ゲルを横たえる。電極液は陽極に４Ｍ尿素と３．５％システイン塩酸塩を含むグリシン酸バッファー、陰極にはシステイン塩酸塩を含まない以外は陽極と同じバッファーを用いる。泳動は４℃、定電圧３００Ｖで塩基性領域の場合１２時間、中性〜酸性領域を拡大する場合３０時間泳動する。全次元で蛋白分子と同時に還元剤が泳動し、高い還元的環境が維持される。

上記のように実施されるＲＦＨＲ二次元電気泳動法において、より詳細な解析を行う場合には、一、二次元操作とも泳動時間を延長するだけで拡大した二次元画面を作成することができる。例えば、中性〜酸性領域を拡大するときは、一次元操作を４０時間、二次元操作を６０時間にする。

染色と脱色：通常、クマジーブリリアントブルー（ＣＢＢ）染色を行う。１．２５％ＣＢＢＧ２００、４５％メタノール、９％酢酸で染色し、２５％メタノール、７．５％酢酸で１回脱色し、その後は２％酢酸で脱色を行う過程を繰り返す。必要に応じて、銀染色、蛍光染色又はアミドブラック染色を併用する。

上記実施例から見たＲＦＨＲ法の特徴：
（１）等電点の制約がないため、塩基性／酸性を問わず同等の分離能を持つ。すなわち、固定化ｐＨ勾配法で高い分離能が得られる範囲はせいぜいｐＨ１０より酸性側の領域に限られる。他方、本ＲＦＨＲ法では等電点の如何に関わらず同等の分離能が得られるため、等電点がｐＨ１０以上の蛋白質に対してはＲＦＨＲ法による分離能の方が高い。この違いは、蛋白質の包括的分析を目指すプロテオームにとって極めて重要である。従来のプロテオミクスは固定化ｐＨ勾配法のかかる弱点のために塩基性蛋白質の大部分を事実上無視してきたが、この弱点はＲＦＨＲ法を導入することで確実に改善される。
（２）ＲＦＨＲ法では１種類の蛋白は一つのスポットに収斂する。対するに、従来の固定化ｐＨ勾配法では、ｐＨ勾配差の狭い一次元ゲルを用いることにより、極めて精密に蛋白スポットを解析できるとされているが、逆に各蛋白質が一次元の泳動操作を受ける際にそれぞれ複数のコンフォメーションに分裂し、そのコンフォメーションに対応してそれぞれ別のスポットを形成するというスポットの激しい人為的分裂が起こる。これは固定化ｐＨ勾配法自体の欠陥であって、細胞中の修飾とは無関係である。他方、ＲＦＨＲ法では、この人為的分裂が生じないため、蛋白質とスポットとは１対１で対応するという顕著な利点を有する。この両法の差はスポットから同定できる遺伝子の数の違いとして現れる。
（３）ゲル当たりの蛋白質添加容量が大きいことも、同定率が高い要因となっている。すなわち、蛋白遺伝子同定率はゲルの蛋白質添加容量を直接的に反映する。ＲＦＨＲ法における蛋白質添加容量は５〜８ｍｇで固定化ｐＨ勾配法より数倍大きい。従って、上述した固定化ｐＨ勾配法に見られるスポットの分裂による低い同定率と相まって、ＲＦＨＲ法による同定率はその一桁近く大きくなり、ＣＢＢ染色で認識できるスポットの８０〜９０％は質量分析で同定できる。
（４）一次元でＳＤＳ（硫酸ドデシルＮａ塩）を用いないため、分離後の構造と機能回復の可能性が高い。ＲＦＨＲ法ではＳＤＳを用いず、尿素だけを可溶化剤として用いる。従って、蛋白泳動の駆動力は蛋白自身が持つｐＨ３．４における正のネットチャージであり、泳動速度は分子量当たりのネットチャージと分子篩い効果で決まる。ＳＤＳ化なしでも分離能を損なわず、逆に分離した蛋白質の機能回復の可能性が高まる。蛋白質は尿素で温和に変性しているだけであるから、二次元ゲルを適当なバッファーに浸けて平衡させることにより機能回復させ、ゲル上に分布したすべての蛋白質を対象として一挙に機能測定を行うことが可能となる。
（５）泳動時間を延長して詳細な二次元画面を作成できる。固定化ｐＨ勾配法では、ｐＨ勾配の幅が異なる一次元ゲルが用意され、必要とする精度によって使い分けられる。他方、ＲＦＨＲ法では１，２次元の泳動時間を延長することによって、二次元画面の水平方向及び垂直方向を拡大することができる。特に、中性から弱酸性にかけての領域は酵素蛋白を中心に多くの蛋白質が密集しているので、この領域を十分に拡大する泳動条件を確立することによってプロテオームへの適用が可能となる（図１８と図１９）。
（６）スポットに帰着する蛋白の定量性が高い。固定化ｐＨ勾配法の二次元ゲル上には、しばしば水平方向及び垂直方向の両方にわたり、筋状に染色する蛋白質の損失が見られ、前述したスポットの分裂と相まって本来のスポットに帰着する蛋白質の定量性が低い。ＲＦＨＲ法ではこうした筋状の染色が起こらず、また電荷をもった還元剤を同時泳動させることによってゲル中に高い還元的環境を保つことができるため、泳動中のＳＳ架橋による損失も生じない。これについては、リボソーム蛋白の数多い分析を通してＲＦＨＲ法の定量性の高さが確かめられている。

以下に、本発明のＲＦＨＲ法を大腸菌プロミオテクスに適用した例を述べる。まず、定常期に収穫した菌体を摩砕後、不溶性画分（ＣＤ）、粗リボソーム画分（ＣＲ）、及びＣＲ以外の可溶性画分（ＰＲＳ）に分け、各画分の蛋白をＲＦＨＲ法で分析した。以後すべての二次元ゲルの観察において、右方が負極（塩基性側）、左方が正極（酸性側）であるものとする。図２０はＣＲ画分の蛋白を塩基性領域重視の泳動条件で分離したものである。ここにはリボソーム蛋白がすべて含まれている。このうち、Ｌ３５，Ｌ３６及び（真の）Ｌ３１はＲＦＨＲ法の原法であるＫ−Ｗ法では検出できず、ＲＦＨＲ法で初めて発見できたリボソーム蛋白であり、この発見により、大腸菌リボソーム蛋白の定義が完了した。

図２１は同じく塩基性領域重視の泳動条件でＣＤ蛋白を分離したものである。この図２１の中性〜弱酸性領域（左上の囲み部分）を延長させて拡大したのが、左記の図１８である。次に、ＰＲＳ画分の蛋白を酸性領域重視の泳動条件で分離したものが図２２である（ＣＢＢ銀二重染色による）。先の図１９は、図２２中の上部囲み部分を拡大したものである。これらいずれの図においても固定化ｐＨ勾配法のようなスポットの人為的分裂は見られなかった。

結局、ＣＤ画分から約２５０個，ＣＲから約１５０個、ＰＲＳから約２５０個の合計役６５０個のスポットがＣＢＢ染色で検出された。これらスポットからの遺伝子同定は現在進行中であるが、今のところ全スポットの８０％近い約５００個のスポットの蛋白遺伝子が同定されている。なお、銀染色すると、ＣＢＢ染色の約２０％増のスポットが検出される。

次に、大腸菌が対数期から定常期へと増殖段階が移行するときの蛋白構成の時間変化を解析した結果を紹介する。大腸菌は約３時間の対数期の後、約７日間の定常期を生き延びる。その定常期の時間を追って上記のＣＲ、ＰＲＳ及びＣＤ画分から蛋白を調製し、ＲＦＨＲ法で調べた結果、６５個の定常期特異的蛋白質が検出された。図２３はこれらを出現時期に従って分類したものである。見出された定常期特異的蛋白質のうち、定常期のほぼ全域にわたって存在するものが約１／４、残り３／４は定常期の比較的狭い機関に出現し、消滅することが分かった。

図２４は、各時期における定常期特異的蛋白質の存在量を、最大値を示す時期に標準化したものであるが、この図から大腸菌が長い定常期を刻々に構成を変えながら、生き延びることが読みとれる。今までに検出されたスポット６５個のうち、３９個の遺伝子が同定されているが、機能不明のものが約半数を占め、それらは定常期の後期に数多く見られた。

本発明のＲＦＨＲ電気泳動法の第２の実施例においては、零次元サンプルゲルの作成にあたり、試料をｐＨ３．０でリーディングイオンとなるＫ^＋と、トレーリングイオンとなるグルタミン酸を含む緩衝液を介して前処理用棒状ゲル中において電気泳動させる。これにより、あらゆる等電点の蛋白質を負極方向に濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、このサンプルゲル切片を一次元ゲル中において切欠かれた所望のレベル位置（窓対応位置）に挿入して一次元電気泳動を実施し、これにより得られた一次元ゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させる。この結果、二次元画面上できわめて酸性度の高い２種の蛋白質を検出同定できた。

本発明のＲＦＨＲ電気泳動法の第２の実施例においては、零次元サンプルゲルの作成にあたり試料をｐＨ１０．６でリーディングイオンとなるＣｌ⁻と、トレーリングイオンとなるアルギニンを含む緩衝液を介して前処理用棒状ゲル中において電気泳動させる。これにより、ｐＨ１１以下の等電点をもつ蛋白質を正極方向に濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠かれた所望のレベル位置（窓対応位置）に挿入して一次元電気泳動を実施し、これにより得られた一次元ゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させる。この結果、きわめて酸性度の高い２種の蛋白質を検出同定できた。

本発明のＲＦＨＲ電気泳動法は、以上述べた通り、二次元画面の解析を困難としている固定化ｐＨ勾配法のようなスポット分裂が生じず、塩基性領域での分離能、全領域での高い同定率とスポットの高い定量性などで固定化ｐＨ勾配法を凌駕している。本明細書において記載した実施例は、大腸菌への適用であったが、最近、ヒトやラットなど真核生物にも適用範囲が広がり、今後ますますプロテオミクスの必須の方法として確立され、普及するものと期待される。

零次元電気泳動のために組立てられた零次元電気泳動装置を示す側断面図である。図１の零次元電気泳動装置における下部槽の平面図である。図１の零次元電気泳動装置におけるゲルコンテナ板正面図Ａ、その下側面図Ｂ、蓋板正面図Ｃ、その下側面図Ｄである。図１の零次元電気泳動装置における上部槽の平面図である。一次元ゲル作成のために組立てられた一次元電気泳動装置を示す側断面図である。図５の一次元電気泳動装置における下部槽の側面図Ａ及び部分破断平面図Ｂである。図５の一次元電気泳動装置におけるゲルコンテナ板正面図Ａ、及びその下側面図Ｂである。図５の一次元電気泳動装置におけるゲルコンテナの上蓋板正面図Ａ、窓蓋板正面図Ｂ及び下蓋板正面図Ｃである。図５の一次元電気泳動装置における上部槽の平面図Ａ及び側面図Ｂである。二次元電気泳動装置を示す側断面図である。図１０の二次元電気泳動装置における下部槽の部分破断側面図Ａ及び平面図Ｂである。二次元ゲルコンテナを構成する蓋板の平面図Aと一部破断右側面図Bである。二次元ゲルコンテナの中核的要素であるゲルコンテナ板の平面図Aと右側面図B、及び下端面図Ｃを示している。コンテナ端板の平面図A、右側面図B、及び下端面図Cであある。図１０の二次元電気泳動装置における上部槽の側面図Ａ及び平面図Ｂである。一次元ゲル作成のために組立てられた一次元電気泳動装置の別の実施例を示す略図である。二次元電気泳動装置の別の実施例を示す略図である。ＣＤ蛋白質の中性〜弱酸性領域の拡大図である。ＰＲＳ蛋白質の中性〜弱酸性領域の拡大図である。ＣＲ蛋白質の塩基性領域重視の二次元ゲル（Ｌ＝５０Ｓ、Ｓ＝３０Ｓリボソーム蛋白）を示す平面図である。ＣＤ蛋白質の塩基性領域重視の二次元ゲルを示す平面図であり、囲み部分が図１８において拡大されたものである。ＰＲＳ蛋白質の酸性領域重視の二次元ゲルを示す平面図であり、囲み部分が図１９において拡大されたものである。定常期特異的蛋白質の発現時期による分類図である。定常期特異的蛋白質の発現推移を下段水平方向に蛋白スポット名を記し、左端縦方向に定常期の経過時間を記して示す図である。

符号の説明

１、１１下部バッファー槽
２、１２ゲルコンテナ
３、１３角柱状ゲル室
４、１４上部バッファー槽
５隅部仕切片
６支持段
７、１７ゲル
８、１８バッファー液
９、１９コンテナ挿入口
１０ａ、１０ｂ、２０ａ、２０ｂ電極端子
１５垂下壁

Claims

試料成分を一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次元ゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させることからなる二次元電気泳動法に用いるための、少なくとも１列の、直立した角柱状ゲル室を形成するゲルコンテナと、前記ゲルコンテナの各ゲル室に通ずる開口付きの上端及び下端を、それぞれ液密性を保って下方及び上方から突入させるための、電極を装備した上部バッファー槽及び下部バッファー槽とを備え、且つ前記下部バッファー槽が前記ゲル室の下端開口に連通した本体部の後端から上方に折れ曲がった衝立部を有し、その衝立部の上端が前記上部バッファー槽の上端と同レベルであって、下部バッファー槽の唯一の開口として存在するように構成され、前記上部バッファー槽の上端と下部バッファー槽の衝立部上端とを残し、装置全体を冷却液中に浸漬可能とした一次元電気泳動装置であって、各槽から引き出された電極引出し導体が前記冷却液と物理的及び電気的に絶縁された状態で、前記ゲルコンテナの外表面を前記冷却液と接触させるように構成したことを特徴とする一次元電気泳動装置。
前記ゲルコンテナの正面側における上端近傍に、各ゲル室の一部位に通ずる開口列を設けたことにより試料成分を濃縮したサンプルゲルの挿入口とし、これらのサンプルゲルの挿入後に前記開口列を封ずるためのプラグ列を備えたサンプルゲルカバー板を装備したことを特徴とする請求項１に記載の一次元電気泳動装置。
試料成分を一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次元ゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させることからなる二次元電気泳動法に用いるための、少なくとも１枚の方形平板状のゲル室を、各方形面が鉛直面内に位置するように形成したゲルコンテナと、前記ゲルコンテナのゲル室に通ずる開口付きの上端及び下端を、それぞれ液密性を保って下方及び上方から突入させるための、電極を装備した上部バッファー槽及び下部バッファー槽とを備え、且つ前記下部バッファー槽が前記ゲル室の下端開口に連通した本体部の後端から上方に折れ曲がった衝立部を有し、その衝立部の上端が前記上部バッファー槽の上端と同レベルであって、下部バッファー槽の唯一の開口として存在するように構成され、前記上部バッファー槽の上端と下部バッファー槽の衝立部上端とを残し、装置全体を冷却液中に浸漬可能とした二次元電気泳動装置であって、各槽から引き出された電極引出し導体が前記冷却液と物理的及び電気的に絶縁された状態で、前記ゲルコンテナの外表面を前記冷却液と接触させるように構成したことを特徴とする二次元電気泳動装置。
試料成分を一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次元ゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させることからなり、当該電気泳動をさせる際に請求項１〜３に記載の電気泳動装置の少なくともいずれかを用いて行う二次元電気泳動法において、
零次元サンプルゲルの作成にあたり試料をｐＨ５．５で、リーディングイオンとなるＫ^＋とトレーリングイオンとなるグリシンとシステインを含む緩衝液を介して前処理用棒状ゲル中において電気泳動させることにより、ｐＨ４以上のあらゆる等電点の蛋白質を負極方向に濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠かれた所望のレベル位置に挿入して一次元電気泳動を実施し、これにより二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させるべき一次元分離済ゲルを調製することを特徴とする二次元電気泳動法。
試料成分を一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次元ゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させることからなり、当該電気泳動をさせる際に請求項１〜３に記載の電気泳動装置の少なくともいずれかを用いて行う二次元電気泳動法において、
零次元サンプルゲルの作成にあたり試料をｐＨ３．０で、リーディングイオンとなるＫ^＋とトレーリングイオンとなるグルタミン酸を含む緩衝液を介して前処理用棒状ゲル中において電気泳動させることにより、蛋白質を負極方向に濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠かれた所望のレベル位置に挿入して一次元電気泳動を実施し、これにより二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させるべき一次元分離済ゲルを調製することを特徴とする二次元電気泳動法。
試料成分を一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次元ゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させることからなり、当該電気泳動をさせる際に請求項１〜３に記載の電気泳動装置の少なくともいずれかを用いて行う二次元電気泳動法において、
零次元サンプルゲルの作成にあたり試料をｐＨ１０．６で、リーディングイオンとなるＣｌ⁻とトレーリングイオンとなるアルギニンを含む緩衝液を介して前処理用棒状ゲル中において電気泳動させることにより、ｐＨ１１以下の等電点をもつ蛋白質を正極方向に濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠かれた所望のレベル位置に挿入して一次元電気泳動を実施し、これにより二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させるべき一次元分離済ゲルを調製することを特徴とする二次元電気泳動法。