JPH0641933B2 - 二次元電気泳動法 - Google Patents
二次元電気泳動法Info
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- JPH0641933B2 JPH0641933B2 JP61285783A JP28578386A JPH0641933B2 JP H0641933 B2 JPH0641933 B2 JP H0641933B2 JP 61285783 A JP61285783 A JP 61285783A JP 28578386 A JP28578386 A JP 28578386A JP H0641933 B2 JPH0641933 B2 JP H0641933B2
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、二次元電気泳動法、特にポリアクリルアミド
ゲルを用いた蛋白質試料の二次元電気泳動法及びその方
法を実施するための装置に関するものである。
ゲルを用いた蛋白質試料の二次元電気泳動法及びその方
法を実施するための装置に関するものである。
従来の技術 従来、試料を一次元ゲル中で電気的に泳動させ、これに
より得られた一次元サンプルゲル柱を二次元ゲルの上端
に載せて、さらに電気泳動させることからなる二次元電
気泳動法において、例えば前記一次元及び二次元ゲルと
してポリアクリルアミドゲルを用い、大腸菌リボソーム
蛋白質を分離検出する場合、試料蛋白は溶液として円柱
状の一次元ゲルに加えられ、その泳動により成分分離
（一次元分離）され、その状態で固定された円柱状ゲル
を異次元ゲルの上端に載置し、二次元泳動を行うもので
あった。
より得られた一次元サンプルゲル柱を二次元ゲルの上端
に載せて、さらに電気泳動させることからなる二次元電
気泳動法において、例えば前記一次元及び二次元ゲルと
してポリアクリルアミドゲルを用い、大腸菌リボソーム
蛋白質を分離検出する場合、試料蛋白は溶液として円柱
状の一次元ゲルに加えられ、その泳動により成分分離
（一次元分離）され、その状態で固定された円柱状ゲル
を異次元ゲルの上端に載置し、二次元泳動を行うもので
あった。
発明が解決しようとする問題点 この場合、泳動前の各ゲル中に残存するフリーラジカル
は泳動中において試料蛋白を化学変化させ、試料の一部
を消耗させてしまうという欠点があった。また、泳動処
理中の各ゲルにおいては、システイン残基の酸化により
試料中の蛋白分子がＳ−Ｓ架橋し、二量体化して分離さ
れにくくなるという欠点をも有していた。さらに、二次
元ゲルに特有の問題として塩基性低分子量の蛋白質は、
泳動フロントと重なって濃縮過程が長引き、分離が不十
分になるという不都合があった。
は泳動中において試料蛋白を化学変化させ、試料の一部
を消耗させてしまうという欠点があった。また、泳動処
理中の各ゲルにおいては、システイン残基の酸化により
試料中の蛋白分子がＳ−Ｓ架橋し、二量体化して分離さ
れにくくなるという欠点をも有していた。さらに、二次
元ゲルに特有の問題として塩基性低分子量の蛋白質は、
泳動フロントと重なって濃縮過程が長引き、分離が不十
分になるという不都合があった。
また、円柱型の一次元分離剤ゲルを、二次元ゲルの上端
に置くため、両ゲルの接触面の両脇に隙間ができ、これ
が泳動の乱れの一因となっていた。
に置くため、両ゲルの接触面の両脇に隙間ができ、これ
が泳動の乱れの一因となっていた。
問題点を解決するための手段及び作用 これらの問題点を解決するため、本発明は、試料成分を
一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次
元サンプルゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気
泳動させることからなる二次元電気泳動法において、 試料を前処理用棒状ゲル中において電気泳動させること
により濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、 前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠かれた所
望のレベル位置に挿入して一次元電気泳動を実施し、こ
れにより二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させ
るべき一次元分離剤ゲルを調製することを特徴とする二
次元電気泳動法を構成したものである。
一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次
元サンプルゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気
泳動させることからなる二次元電気泳動法において、 試料を前処理用棒状ゲル中において電気泳動させること
により濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、 前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠かれた所
望のレベル位置に挿入して一次元電気泳動を実施し、こ
れにより二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させ
るべき一次元分離剤ゲルを調製することを特徴とする二
次元電気泳動法を構成したものである。
本発明は、上記の構成において一次元泳動の前段階とし
て言わば零次元泳動を行わせたことにより、試料中の蛋
白分子が個々にフリーラジカルと遭遇するのを避けるよ
うに試料を濃縮し、これにより一次元泳動、さらには二
次元泳動の効果的な実施を可能にしたものである。
て言わば零次元泳動を行わせたことにより、試料中の蛋
白分子が個々にフリーラジカルと遭遇するのを避けるよ
うに試料を濃縮し、これにより一次元泳動、さらには二
次元泳動の効果的な実施を可能にしたものである。
本発明は、また前記前処理用棒状ゲル及び一次元ゲルが
方形断面を有するようにし、これによって、サンプルゲ
ル及び一次元分離剤ゲルが、それぞれ前記一次元ゲル及
び二次元ゲルに大して隙間なく密着するようにしたもの
である。このようなゲル接続の密着性は、接続面の両脇
に隙間を生じ、泳動が乱れるという従来の円柱管内での
一次元ゲル調製方式の欠点を完全に解消するものであ
る。
方形断面を有するようにし、これによって、サンプルゲ
ル及び一次元分離剤ゲルが、それぞれ前記一次元ゲル及
び二次元ゲルに大して隙間なく密着するようにしたもの
である。このようなゲル接続の密着性は、接続面の両脇
に隙間を生じ、泳動が乱れるという従来の円柱管内での
一次元ゲル調製方式の欠点を完全に解消するものであ
る。
本発明は、さらにいずれもポリアクリルアミドからなる
前記棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白
試料を分析するにあたり、前記各ゲルにおいて対応する
試料溶液又はゲルを加えて泳動させる前に、各ゲル中に
残存するフリーラジカルを除去するための荷電体からな
るラジカル捕捉剤を泳動させることにより、各ゲルでの
泳動中における試料の、フリーラジカルによる消耗を防
止するものである。
前記棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白
試料を分析するにあたり、前記各ゲルにおいて対応する
試料溶液又はゲルを加えて泳動させる前に、各ゲル中に
残存するフリーラジカルを除去するための荷電体からな
るラジカル捕捉剤を泳動させることにより、各ゲルでの
泳動中における試料の、フリーラジカルによる消耗を防
止するものである。
本発明は、さらにいずれもポリアクリルアミドからなる
前記棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白
試料を分析するにあたり、前記各ゲルにおいて対応する
試料溶液又はゲルを加えて泳動させると共に強い還元的
状態を保つための荷電体からなる還元剤を泳動させるこ
とにより、各ゲル中で蛋白分子がＳ−Ｓ架橋し、二量体
化するのを防止するものである。
前記棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白
試料を分析するにあたり、前記各ゲルにおいて対応する
試料溶液又はゲルを加えて泳動させると共に強い還元的
状態を保つための荷電体からなる還元剤を泳動させるこ
とにより、各ゲル中で蛋白分子がＳ−Ｓ架橋し、二量体
化するのを防止するものである。
本発明は、さらにいずれもポリアクリルアミドからなる
前記棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白
試料を分析するにあたり、二次元ゲルに添加された塩基
性ラジカル促進剤を前泳動によって除去すると共に、負
電極バッファーに強酸性液を加えて同ゲルの酸度を高め
ることにより塩基性低分子量の小蛋白に対する分離能を
向上させるものである。
前記棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白
試料を分析するにあたり、二次元ゲルに添加された塩基
性ラジカル促進剤を前泳動によって除去すると共に、負
電極バッファーに強酸性液を加えて同ゲルの酸度を高め
ることにより塩基性低分子量の小蛋白に対する分離能を
向上させるものである。
実施例の説明 零次元泳動 ここにいう零次元泳動とは、一次元泳動において一次元
ゲルに試料溶液を注入する代わりに同ゲル中に挿入され
るサンプルゲルを電気泳動法により濃縮形成する処理の
ことである。この零次元泳動は、第１図(a)に示すよう
な角柱状のゲル室(1)を、一列又は二列以上形成したゲ
ルコンテナＧＣ０を上部バッファー槽(2)及び下部バッ
ファー槽(3)間に装着し、ゲル室(1)内には、例えば蛋白
試料の泳動媒体としてポリアクリルアミドゲルを収容
し、その上部より試料溶液を導入して行うものである。
この場合、上部バッファー槽(2)に設けられた陽極Ａ及
び下部バッファー槽(3)に設けられた陰極Ｂ間には適当
な電圧が印加される。この泳動前においてポリアクリル
アミドゲルにはラジカル捕捉剤としての２−メルカプト
エチルアミンを前泳動させ、これによって試料蛋白の消
耗を防止できるようになっている。また、前記試料溶液
の泳動中においては、還元剤としてのシステインも共に
泳動させ、これによって前記蛋白分子のＳ−Ｓ架橋を防
止するものである。このようにして泳動濃縮された試料
はゲルコンテナＧＣ０から摘出又はそのコンテナの解体
により取出された後、その濃縮ゲル部分(4)の適当部位
を切り取って一次元ゲルのためのサンプルゲル片ＳＧと
する。
ゲルに試料溶液を注入する代わりに同ゲル中に挿入され
るサンプルゲルを電気泳動法により濃縮形成する処理の
ことである。この零次元泳動は、第１図(a)に示すよう
な角柱状のゲル室(1)を、一列又は二列以上形成したゲ
ルコンテナＧＣ０を上部バッファー槽(2)及び下部バッ
ファー槽(3)間に装着し、ゲル室(1)内には、例えば蛋白
試料の泳動媒体としてポリアクリルアミドゲルを収容
し、その上部より試料溶液を導入して行うものである。
この場合、上部バッファー槽(2)に設けられた陽極Ａ及
び下部バッファー槽(3)に設けられた陰極Ｂ間には適当
な電圧が印加される。この泳動前においてポリアクリル
アミドゲルにはラジカル捕捉剤としての２−メルカプト
エチルアミンを前泳動させ、これによって試料蛋白の消
耗を防止できるようになっている。また、前記試料溶液
の泳動中においては、還元剤としてのシステインも共に
泳動させ、これによって前記蛋白分子のＳ−Ｓ架橋を防
止するものである。このようにして泳動濃縮された試料
はゲルコンテナＧＣ０から摘出又はそのコンテナの解体
により取出された後、その濃縮ゲル部分(4)の適当部位
を切り取って一次元ゲルのためのサンプルゲル片ＳＧと
する。
なお、この零次元泳動に用いられた上部バッファー槽
(2)及び下部バッファー槽(3)は次に述べる一次元泳動用
の上部バッファー槽及び下部バッファー槽とそれぞれ同
様な構造を有するものであり、零次元泳動は試料を濃縮
するため、一次元泳動よりも全長の短いゲルコンテナを
用いたことが機構上の唯一の相違点である。ゲルコンテ
ナＧＣ０の両板間の距離、すなわちゲルの厚みはこの場
合約３mmとしたが、１mm程度から３mmを越えるものまで
その用途に応じて、作成することができる。一次元泳動
及び二次元泳動のゲル厚についても同様である。
(2)及び下部バッファー槽(3)は次に述べる一次元泳動用
の上部バッファー槽及び下部バッファー槽とそれぞれ同
様な構造を有するものであり、零次元泳動は試料を濃縮
するため、一次元泳動よりも全長の短いゲルコンテナを
用いたことが機構上の唯一の相違点である。ゲルコンテ
ナＧＣ０の両板間の距離、すなわちゲルの厚みはこの場
合約３mmとしたが、１mm程度から３mmを越えるものまで
その用途に応じて、作成することができる。一次元泳動
及び二次元泳動のゲル厚についても同様である。
一次元泳動 一次元泳動用ゲルコンテナＧＣ１は第２図(a)に示すよ
うな角柱状、すなわち矩形断面をもった複数列のゲル室
(10)を有すると共に、一側面の比較的高レベル位置にお
いて各ゲル室(10)に通ずるサンプル挿入窓(11)を形成し
たものである。前記零次元処理によるサンプルゲル片
は、この窓の縦寸法よりやや低い高さを有するが、零次
元及びこの一次元のゲル室幅及び奥行は同じであるた
め、この窓からゲル室(10)に挿入された各サンプルゲル
片ＳＧは、同室内の泳動用ポリアクリルアミドゲルにお
けるこの窓に対応した切除部に入り、その上下切断端の
全面によく密着する。第２図(b)に示すＳＧＣはサンプ
ルゲルカバー板であり、前記ゲルコンテナＧＣ１の各窓
(11)に対応する複数の窓栓(12)を有するものである。各
窓栓(12)は対応する各窓(11)内に挿入され、これにより
ゲル室(10)内において対応する位置にあるサンプルゲル
片ＳＧの側面を支持及び被覆するものである。サンプル
ゲルカバーＳＧＣを装着したゲルコンテナＧＣ１は第３
図に示すように、その上端及び下端を上部バッファー槽
ＡＢＶ１及び下部バッファー槽ＣＢＶ１に装着し、陽極
Ａ及び陰極Ｃ間に適当な電圧を印加することにより、サ
ンプルゲルの泳動分離を行うものである。ゲルコンテナ
ＧＣ１へのサンプルゲルカバーＳＧＣの装着は、例えば
第４図に示すようなクリップ(13)を用いて行われる。ま
た、上部バッファー槽ＡＢＶ１及び下部バッファー槽Ｃ
ＢＶ１の内部構造も同じく第４図に示す通りである。
うな角柱状、すなわち矩形断面をもった複数列のゲル室
(10)を有すると共に、一側面の比較的高レベル位置にお
いて各ゲル室(10)に通ずるサンプル挿入窓(11)を形成し
たものである。前記零次元処理によるサンプルゲル片
は、この窓の縦寸法よりやや低い高さを有するが、零次
元及びこの一次元のゲル室幅及び奥行は同じであるた
め、この窓からゲル室(10)に挿入された各サンプルゲル
片ＳＧは、同室内の泳動用ポリアクリルアミドゲルにお
けるこの窓に対応した切除部に入り、その上下切断端の
全面によく密着する。第２図(b)に示すＳＧＣはサンプ
ルゲルカバー板であり、前記ゲルコンテナＧＣ１の各窓
(11)に対応する複数の窓栓(12)を有するものである。各
窓栓(12)は対応する各窓(11)内に挿入され、これにより
ゲル室(10)内において対応する位置にあるサンプルゲル
片ＳＧの側面を支持及び被覆するものである。サンプル
ゲルカバーＳＧＣを装着したゲルコンテナＧＣ１は第３
図に示すように、その上端及び下端を上部バッファー槽
ＡＢＶ１及び下部バッファー槽ＣＢＶ１に装着し、陽極
Ａ及び陰極Ｃ間に適当な電圧を印加することにより、サ
ンプルゲルの泳動分離を行うものである。ゲルコンテナ
ＧＣ１へのサンプルゲルカバーＳＧＣの装着は、例えば
第４図に示すようなクリップ(13)を用いて行われる。ま
た、上部バッファー槽ＡＢＶ１及び下部バッファー槽Ｃ
ＢＶ１の内部構造も同じく第４図に示す通りである。
上記の一次元泳動におけるポリアクリルアミドゲルは、
サンプルゲル片ＳＧの挿入前において、ラジカル捕捉剤
としての２−メルカプトプロピオン酸を前泳動させたも
のであり、さらに前記サンプルゲルの泳動中においては
還元剤としてラジカル捕捉剤と同じ２−メルカプトプロ
ピオン酸が同時に泳動処理され、ゲル中を強い還元状態
に維持するようになっている。
サンプルゲル片ＳＧの挿入前において、ラジカル捕捉剤
としての２−メルカプトプロピオン酸を前泳動させたも
のであり、さらに前記サンプルゲルの泳動中においては
還元剤としてラジカル捕捉剤と同じ２−メルカプトプロ
ピオン酸が同時に泳動処理され、ゲル中を強い還元状態
に維持するようになっている。
上記のようにサンプルゲル片を一次元ゲルとは別に作成
し、これを一次元ゲル中に挿入する方式は本発明におい
てのみ採用された独自の方式であり、これによってラジ
カル捕捉剤の前泳動処理と相俟って残存ラジカルによる
試料消耗の問題が解決したものである。
し、これを一次元ゲル中に挿入する方式は本発明におい
てのみ採用された独自の方式であり、これによってラジ
カル捕捉剤の前泳動処理と相俟って残存ラジカルによる
試料消耗の問題が解決したものである。
二次元泳動 二次元泳動のゲルコンテナは、第５図に示すような３種
類のゲルコンテナ板ＬＰ、ＭＰ、ＲＰを組み合わせ、こ
れにより形成したゲルコンテナ構体を上下バッファー槽
と接続することにより行われる。二次元ゲル室は複数枚
用いた場合のＭＰ−ＭＰ板面間及び左側コンテナ板ＬＰ
の右側面とこれに対応するコンテナ板ＭＰの左側面並び
に、右側コンテナ板ＲＰの左側面とこれに対応するコン
テナ板ＭＰの右側面との間に形成される。
類のゲルコンテナ板ＬＰ、ＭＰ、ＲＰを組み合わせ、こ
れにより形成したゲルコンテナ構体を上下バッファー槽
と接続することにより行われる。二次元ゲル室は複数枚
用いた場合のＭＰ−ＭＰ板面間及び左側コンテナ板ＬＰ
の右側面とこれに対応するコンテナ板ＭＰの左側面並び
に、右側コンテナ板ＲＰの左側面とこれに対応するコン
テナ板ＭＰの右側面との間に形成される。
コンテナ構体ＧＣ２と上部バッファー槽ＡＢＶ２及び下
部バッファー槽ＣＢＶ２を組み合わせた構造の断面は第
６図に示す通りであり、各ゲル室には上端に一次元泳動
済ゲルを載置できるだけの余裕を残して二次元泳動用ゲ
ルＢＧが挿入される。コンテナ板ＭＰの上端にはスロッ
トＤ１が形成されると共に、左側コンテナ板ＬＰ及び右
側コンテナ板ＲＰの上端外側面と上部バッファー槽ＡＢ
Ｖ２の下端に形成された突起との間には同様なスロット
Ｄ２が形成される。コンテナ構体ＧＣ２の各ゲル室の上
端からは一次元泳動済ゲルＳＧ２が挿入されると共に、
コンテナ構体ＧＣ２の上端にはガーゼが当てがわれ、各
スロットＤ１及びＤ２にはガーゼＧの上から平板くさび
ＰＷが挿入され、これにより緊張されるガーゼにより一
次元泳動済ゲルＳＧ２の上側縁が押圧され、二次元泳動
用ゲルＢＧの上端と好ましく密着するようになってい
る。
部バッファー槽ＣＢＶ２を組み合わせた構造の断面は第
６図に示す通りであり、各ゲル室には上端に一次元泳動
済ゲルを載置できるだけの余裕を残して二次元泳動用ゲ
ルＢＧが挿入される。コンテナ板ＭＰの上端にはスロッ
トＤ１が形成されると共に、左側コンテナ板ＬＰ及び右
側コンテナ板ＲＰの上端外側面と上部バッファー槽ＡＢ
Ｖ２の下端に形成された突起との間には同様なスロット
Ｄ２が形成される。コンテナ構体ＧＣ２の各ゲル室の上
端からは一次元泳動済ゲルＳＧ２が挿入されると共に、
コンテナ構体ＧＣ２の上端にはガーゼが当てがわれ、各
スロットＤ１及びＤ２にはガーゼＧの上から平板くさび
ＰＷが挿入され、これにより緊張されるガーゼにより一
次元泳動済ゲルＳＧ２の上側縁が押圧され、二次元泳動
用ゲルＢＧの上端と好ましく密着するようになってい
る。
第７図はコンテナ構体ＧＣ２を維持するための締結部材
Ｈ及び上部バッファー槽ＡＢＶ２及び下部バッファー槽
ＣＢＶ２の内部構造が示されている。
Ｈ及び上部バッファー槽ＡＢＶ２及び下部バッファー槽
ＣＢＶ２の内部構造が示されている。
この二次元泳動においても、泳動媒体であるポリアクリ
ルアミドゲルには試料ゲル柱ＳＧ２成分の泳動前におい
て、ラジカル捕捉剤としての２−メルカプトエチルアミ
ンを泳動させることにより残存するフリーラジカルを除
去し、また試料ゲル柱成分の泳動中においは、電荷をも
った還元剤としてシステインを共に泳動させ、二次元ゲ
ル内を強い還元的状態に維持するようにした。同時に、
前泳動で同ゲル内の塩基性ラジカル促進剤を除去すると
共に、下部、すなわち負電極バッファー槽ＣＢＶ２には
塩酸を加えることにより、ゲルのpHを通常の４．５から
約０．９低下させて３．６となるようにした。
ルアミドゲルには試料ゲル柱ＳＧ２成分の泳動前におい
て、ラジカル捕捉剤としての２−メルカプトエチルアミ
ンを泳動させることにより残存するフリーラジカルを除
去し、また試料ゲル柱成分の泳動中においは、電荷をも
った還元剤としてシステインを共に泳動させ、二次元ゲ
ル内を強い還元的状態に維持するようにした。同時に、
前泳動で同ゲル内の塩基性ラジカル促進剤を除去すると
共に、下部、すなわち負電極バッファー槽ＣＢＶ２には
塩酸を加えることにより、ゲルのpHを通常の４．５から
約０．９低下させて３．６となるようにした。
第８図は本発明の方法を実施して得られた試料蛋白の分
子量と泳動距離との関係を示すグラフである。この場
合、移動度に対する電荷の効果の差を消去すれば、分子
量の対数値はほぼ完全に移動度に比例しており、分子量
の測定が可能となったことを示している。
子量と泳動距離との関係を示すグラフである。この場
合、移動度に対する電荷の効果の差を消去すれば、分子
量の対数値はほぼ完全に移動度に比例しており、分子量
の測定が可能となったことを示している。
上記第８図のグラフ及び第９図に示した二次元ゲルの分
離モデルから明らかな通り、二次元ゲルの塩基性領域か
らは、既知のスポット以外に４個の未知の蛋白質による
スポット（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が検出された。第９図にお
いて、スポットＡはＬ33の右下に、スポットＢはＬ34の
左下に、スポットＣはＬ29とＬ27の中間に、そしてスポ
ットＤはＬ32の直下において見いだされる。なお、Ａ、
Ｂ、Ｃは50Ｓ亜粒子に、Ｄは30Ｓ亜粒子に存在する。な
お、還元剤を用いずに、本発明の方法を実施した場合に
は、スポットＡ、Ｂ、Ｃが消失するが、ＢとＣの消失に
伴ってその近傍にスポットＢ′とＣ′が見いだされた。
一方、Ｄは還元剤の有無と無関係に同一位置においてス
ポットを形成する。
離モデルから明らかな通り、二次元ゲルの塩基性領域か
らは、既知のスポット以外に４個の未知の蛋白質による
スポット（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ）が検出された。第９図にお
いて、スポットＡはＬ33の右下に、スポットＢはＬ34の
左下に、スポットＣはＬ29とＬ27の中間に、そしてスポ
ットＤはＬ32の直下において見いだされる。なお、Ａ、
Ｂ、Ｃは50Ｓ亜粒子に、Ｄは30Ｓ亜粒子に存在する。な
お、還元剤を用いずに、本発明の方法を実施した場合に
は、スポットＡ、Ｂ、Ｃが消失するが、ＢとＣの消失に
伴ってその近傍にスポットＢ′とＣ′が見いだされた。
一方、Ｄは還元剤の有無と無関係に同一位置においてス
ポットを形成する。
また、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄの分子量を二次元移動度を用いて
求めると、それぞれ６４００、４９００、８２００及び
５９００となった。なお、14Ｃアミノ酸標識によってコ
ピー数を測定し、それぞれ０．６、０．４、０．３及び
０．１の値を得たものである。
求めると、それぞれ６４００、４９００、８２００及び
５９００となった。なお、14Ｃアミノ酸標識によってコ
ピー数を測定し、それぞれ０．６、０．４、０．３及び
０．１の値を得たものである。
発明の効果 本発明の方法は、以上の如く構成されたため、各泳動用
ゲル内に残存するフリーラジカルを効果的に除去すると
共に、いわゆる零次元泳動法の実施による試料の濃縮に
基づいてフリーラジカルの影響（試料の消耗）を防止
し、さらにゲル内を還元状態に保つことにより試料蛋白
が従来の方法の如く還元型と酸化型の２つのスポットに
分裂するなどの不都合や、Ｓ−Ｓ架橋による二量体化を
防止し、定量性及び分解能を向上させたものである。ま
た、二次元ゲル内のpHを通常の状態より低下させたこと
により、移動度の大きい塩基性低分子量の蛋白質が泳動
フロントと重なって分離しにくくなるという欠点を改良
したものである。この結果、本発明においては、試料蛋
白の分子量の対数値と泳動度とが満足すべき比例関係を
示すようになった。
ゲル内に残存するフリーラジカルを効果的に除去すると
共に、いわゆる零次元泳動法の実施による試料の濃縮に
基づいてフリーラジカルの影響（試料の消耗）を防止
し、さらにゲル内を還元状態に保つことにより試料蛋白
が従来の方法の如く還元型と酸化型の２つのスポットに
分裂するなどの不都合や、Ｓ−Ｓ架橋による二量体化を
防止し、定量性及び分解能を向上させたものである。ま
た、二次元ゲル内のpHを通常の状態より低下させたこと
により、移動度の大きい塩基性低分子量の蛋白質が泳動
フロントと重なって分離しにくくなるという欠点を改良
したものである。この結果、本発明においては、試料蛋
白の分子量の対数値と泳動度とが満足すべき比例関係を
示すようになった。
第１図(a)及び(b)はそれぞれ本発明の零次元泳動用ゲル
コンテナ及びその使用状態を示す縦断面図、 第２図(a)及び(b)はそれぞれ一次元泳動用ゲルコンテナ
及びサンプルゲルカバーを示す斜視図、 第３図は一次元泳動用ゲルコンテナ及びこれに装着され
た上下電極槽を示す縦断面図、 第４図はその分解斜視図、 第５図は二次元泳動用の各種ゲルコンテナ板を分離して
示す斜視図、 第６図は第５図のゲルコンテナ板を組み合わせてコンテ
ナ構体とし、これに上下電極槽を装着した構造を示す縦
断面図、 第７図はその分解斜視図、 第８図は本発明の方法により得られた分子量泳動距離特
性を示すグラフ、 第９図は二次元ゲルの分離モデルを示す図である。 (1)……ゲル室 (2)……上部（陽極）バッファー槽 (3)……下部（陰極）バッファー槽 (4)……泳動用ゲル Ａ……陽極 Ｂ……陰極 ＳＧ……サンプルゲル ＳＧＣ……サンプルゲルカバー ＡＢＶ……上部（陽極）バッファー槽 ＣＢＶ……下部（陰極）バッファー槽 ＬＰ……左側コンテナ板 ＭＰ……中央コンテナ板 ＲＰ……右側コンテナ板 Ｄ……コンテナ間のスロット Ｇ……ガーゼ ＰＷ……平板くさび ＧＳ……ゲルスペーサ Ｈ……締結具
コンテナ及びその使用状態を示す縦断面図、 第２図(a)及び(b)はそれぞれ一次元泳動用ゲルコンテナ
及びサンプルゲルカバーを示す斜視図、 第３図は一次元泳動用ゲルコンテナ及びこれに装着され
た上下電極槽を示す縦断面図、 第４図はその分解斜視図、 第５図は二次元泳動用の各種ゲルコンテナ板を分離して
示す斜視図、 第６図は第５図のゲルコンテナ板を組み合わせてコンテ
ナ構体とし、これに上下電極槽を装着した構造を示す縦
断面図、 第７図はその分解斜視図、 第８図は本発明の方法により得られた分子量泳動距離特
性を示すグラフ、 第９図は二次元ゲルの分離モデルを示す図である。 (1)……ゲル室 (2)……上部（陽極）バッファー槽 (3)……下部（陰極）バッファー槽 (4)……泳動用ゲル Ａ……陽極 Ｂ……陰極 ＳＧ……サンプルゲル ＳＧＣ……サンプルゲルカバー ＡＢＶ……上部（陽極）バッファー槽 ＣＢＶ……下部（陰極）バッファー槽 ＬＰ……左側コンテナ板 ＭＰ……中央コンテナ板 ＲＰ……右側コンテナ板 Ｄ……コンテナ間のスロット Ｇ……ガーゼ ＰＷ……平板くさび ＧＳ……ゲルスペーサ Ｈ……締結具
Claims (7)
- 【請求項１】試料成分を一次元ゲル中で電気泳動させ、
これにより得られた一次元サンプルゲルを二次元ゲルの
上端に載せてさらに電気泳動させることからなる二次元
電気泳動法において、 試料を前処理用棒状ゲル中において電気泳動させること
により濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、 前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠かれた所
望のレベル位置に挿入して一次元電気泳動を実施し、こ
れにより二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させ
るべき一次元分離済ゲルを調製することを特徴とする二
次元電気泳動法。 - 【請求項２】前記前処理用棒状ゲル及び一次元ゲルが方
形断面を有するようにし、これによって、サンプルゲル
及び一次元分離済ゲルが、それぞれ前記一次元ゲル及び
二次元ゲルに対して隙間なく密着するようにしたことを
特徴とする特許請求の範囲第(1)項記載の方法。 - 【請求項３】いずれもポリアクリルアミドからなる前記
棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白試料
を分析するにあたり、前記各ゲルにおいて対応する試料
溶液又はゲルを加えて泳動させる前に、各ゲル中に残存
するフリーラジカルを除去するための荷電体からなるラ
ジカル捕捉剤を泳動させることにより、各ゲルでの泳動
中における試料の、フリーラジカルによる消耗を防止す
ることを特徴とする特許請求の範囲第(1)項又は第(2)項
記載の方法。 - 【請求項４】前記一次元ゲルに対するラジカル捕捉剤が
２−メルカプトプロピオン酸を含み、前記棒状ゲル及び
二次元ゲルに対するラジカル捕捉剤が２−メルカプトエ
チルアミンを含むものであることを特徴とする特許請求
の範囲第(3)項記載の方法。 - 【請求項５】いずれもポリアクリルアミドからなる前記
棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白試料
を分析するにあたり、前記各ゲルにおいて対応する試料
溶液又はゲルを加えて泳動させると共に強い還元的状態
を保つための荷電体からなる還元剤を泳動させることに
より、各ゲル中で蛋白分子がＳ−Ｓ架橋し、二量体化す
るのを防止することを特徴とする特許請求の範囲第(1)
〜(4)項のいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項６】前記一次元ゲルに対する還元剤が２−メル
カプトプロピオン酸を含み、前記棒状ゲル及び二次元ゲ
ルに対する還元剤がシステインを含むものであることを
特徴とする特許請求の範囲第(5)項記載の方法。 - 【請求項７】いずれもポリアクリルアミドからなる前記
棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白試料
を分析するにあたり、二次元ゲルに添加された塩基性ラ
ジカル促進剤を前泳動によって除去すると共に、負電極
バッファーに強酸性液を加えて同ゲルの酸度を高めるこ
とにより塩基性低分子量の小蛋白に対する分離能を向上
させることを特徴とする特許請求の範囲第(1)〜(6)項の
いずれか１項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61285783A JPH0641933B2 (ja) | 1986-11-29 | 1986-11-29 | 二次元電気泳動法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61285783A JPH0641933B2 (ja) | 1986-11-29 | 1986-11-29 | 二次元電気泳動法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62306174A Division JPH0641934B2 (ja) | 1987-12-02 | 1987-12-02 | 二次元電気泳動法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63138250A JPS63138250A (ja) | 1988-06-10 |
| JPH0641933B2 true JPH0641933B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=17696010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61285783A Expired - Lifetime JPH0641933B2 (ja) | 1986-11-29 | 1986-11-29 | 二次元電気泳動法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0641933B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7572358B2 (en) | 2003-12-24 | 2009-08-11 | Akira Wada | Electrophoresis method and apparatus |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000249684A (ja) * | 1999-03-02 | 2000-09-14 | Sentan Kagaku Gijutsu Incubation Center:Kk | 二次元分離方法 |
| EP1353172B1 (de) * | 2002-04-12 | 2006-03-15 | Tecan Trading AG | Kassette, System und 2D-Gelelektrophorese-Verfahren zum Trennen von Molekülen |
| JP4957917B2 (ja) | 2008-07-15 | 2012-06-20 | 凸版印刷株式会社 | 電気泳動器具および電気泳動方法 |
-
1986
- 1986-11-29 JP JP61285783A patent/JPH0641933B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7572358B2 (en) | 2003-12-24 | 2009-08-11 | Akira Wada | Electrophoresis method and apparatus |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63138250A (ja) | 1988-06-10 |
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