JPS63138250A - 二次元電気泳動法 - Google Patents
二次元電気泳動法Info
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- JPS63138250A JPS63138250A JP61285783A JP28578386A JPS63138250A JP S63138250 A JPS63138250 A JP S63138250A JP 61285783 A JP61285783 A JP 61285783A JP 28578386 A JP28578386 A JP 28578386A JP S63138250 A JPS63138250 A JP S63138250A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、二次元電気泳動法、特にポリアクリルアミド
ゲルを用いた蛋白質試料の二次元電気泳動法及びその方
法を実施するための装置に関するものである。
ゲルを用いた蛋白質試料の二次元電気泳動法及びその方
法を実施するための装置に関するものである。
従来の技術
従来、試料を一次元ゲル中で電気的に泳動させ、これに
より得られた一次元サンプルゲル柱を二次元ゲルの上端
に載せて、さらに電気泳動させることからなる二次元電
気泳動法において、例えば前記一次元及び二次元ゲルと
してポリアクリルアミドゲルを用い、大腸菌リポソーム
蛋白質を分離検出する場合、試料蛋白は溶液として円柱
状の一次元ゲルに加えられ、その泳動により成分分離（
一次元分離）され、その状態で固定された円柱状ゲルを
二次元ゲルの上端に載置し、二次元泳動を行うものであ
った。
より得られた一次元サンプルゲル柱を二次元ゲルの上端
に載せて、さらに電気泳動させることからなる二次元電
気泳動法において、例えば前記一次元及び二次元ゲルと
してポリアクリルアミドゲルを用い、大腸菌リポソーム
蛋白質を分離検出する場合、試料蛋白は溶液として円柱
状の一次元ゲルに加えられ、その泳動により成分分離（
一次元分離）され、その状態で固定された円柱状ゲルを
二次元ゲルの上端に載置し、二次元泳動を行うものであ
った。
発明が解決しようとする問題点
この場合、泳動前の各ゲル中に残存するフリーラジカル
は泳動中において試料蛋白を化学変化させ、試料の一部
を消耗させてしまうという欠点があった。また、泳動処
理中の各ゲルにおいては、システィン残基の酸化により
試料中の蛋白分子がＳ−８架橋し、二量体化して分離さ
れに（くなるという欠点をも有していた。さらに、二次
元ゲルに特有の問題として塩基性低分子量の蛋白質は、
泳動フロントと重なって濃縮過程が長引き、分離が不十
分になるという不都合があった。
は泳動中において試料蛋白を化学変化させ、試料の一部
を消耗させてしまうという欠点があった。また、泳動処
理中の各ゲルにおいては、システィン残基の酸化により
試料中の蛋白分子がＳ−８架橋し、二量体化して分離さ
れに（くなるという欠点をも有していた。さらに、二次
元ゲルに特有の問題として塩基性低分子量の蛋白質は、
泳動フロントと重なって濃縮過程が長引き、分離が不十
分になるという不都合があった。
また、円柱型の一次元分離済ゲルを、二次元ゲルの上端
に置くため、両ゲルの接触面の両脇に隙間ができ、これ
が泳動の乱れの一因となっていた。
に置くため、両ゲルの接触面の両脇に隙間ができ、これ
が泳動の乱れの一因となっていた。
問題点を解決するための手段及び作用
これらの問題点を解決するため、本発明は、試料成分を
一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次
元サンプルゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気
泳動させることからなる二次元電気泳動法において、 試料を前処理用棒状ゲル中において電気泳動させること
により濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、 前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠−かれた
所望のレベル位置に挿入して一次元電気泳動を実施し、
これにより二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動さ
せるべき一次元泳動用ゲルを調製することを特徴とする
二次元電気泳動法を構成したものである。
一次元ゲル中で電気泳動させ、これにより得られた一次
元サンプルゲルを二次元ゲルの上端に載せてさらに電気
泳動させることからなる二次元電気泳動法において、 試料を前処理用棒状ゲル中において電気泳動させること
により濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、 前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠−かれた
所望のレベル位置に挿入して一次元電気泳動を実施し、
これにより二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動さ
せるべき一次元泳動用ゲルを調製することを特徴とする
二次元電気泳動法を構成したものである。
本発明は、上記の構成において一次元泳動の前段階とし
て言わば零次元泳動を行わせたことにより、試料中の蛋
白分子が個々にフリーラジカルと遭遇するのを避けるよ
うに試料を濃縮し、これにより一次元泳動、さらには二
次元泳動の効果的な実施を可能にしたものである。
て言わば零次元泳動を行わせたことにより、試料中の蛋
白分子が個々にフリーラジカルと遭遇するのを避けるよ
うに試料を濃縮し、これにより一次元泳動、さらには二
次元泳動の効果的な実施を可能にしたものである。
本発明は、また前記前処理用棒状ゲル及び一次元ゲルが
方形断面を有するようにし、これによって、サンプルゲ
ル及び一次元分離済ゲルが、それぞれ前記一次元ゲル及
び二次元ゲルに対して隙間な（密着するようにしたもの
である。このようなゲル接続の密着性は、接続面の両脇
に隙間を生じ、泳動が乱れるという従来の円柱管内での
一次元ゲル調製方式の欠点を完全に解消するものである
。
方形断面を有するようにし、これによって、サンプルゲ
ル及び一次元分離済ゲルが、それぞれ前記一次元ゲル及
び二次元ゲルに対して隙間な（密着するようにしたもの
である。このようなゲル接続の密着性は、接続面の両脇
に隙間を生じ、泳動が乱れるという従来の円柱管内での
一次元ゲル調製方式の欠点を完全に解消するものである
。
本発明は、さらにいずれもポリアクリルアミドからなる
前記棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲ ・ルを用いて
蛋白試料を分析するにあたり、前記各ゲルにおいて対応
する試料溶液又はゲルを加えて泳動させる前に、各ゲル
中に残存するフリーラジカルを除去するための荷電体か
らなるラジカル捕捉剤を泳動させることにより、各ゲル
での泳動中における試料の、フリーラジカルによる消耗
を防止するものである。
前記棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲ ・ルを用いて
蛋白試料を分析するにあたり、前記各ゲルにおいて対応
する試料溶液又はゲルを加えて泳動させる前に、各ゲル
中に残存するフリーラジカルを除去するための荷電体か
らなるラジカル捕捉剤を泳動させることにより、各ゲル
での泳動中における試料の、フリーラジカルによる消耗
を防止するものである。
本発明は、さらにいずれもポリアクリルアミドからなる
前記棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白
試料を分析するにあたり、前記各ゲルにおいて対応する
試料溶液又はゲルを加えて泳動させると共に強い還元的
状態を保つための荷電体からなる還元剤を泳動させるこ
とにより、各ゲル中で蛋白分子がＳ−８架橋し、二量体
化するのを防止するものである。
前記棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白
試料を分析するにあたり、前記各ゲルにおいて対応する
試料溶液又はゲルを加えて泳動させると共に強い還元的
状態を保つための荷電体からなる還元剤を泳動させるこ
とにより、各ゲル中で蛋白分子がＳ−８架橋し、二量体
化するのを防止するものである。
本発明は、さらにいずれもポリアクリルアミドからなる
前記棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白
試料を分析するにあたり、二次元ゲルに添加された塩基
性ラジカル促進剤を前泳動によって除去すると共に、負
電極バッファーに強酸性液を加えて同ゲルの酸度を高め
ることにより塩基性低分子量の小蛋白に対する分離能を
向上させるものである。
前記棒状ゲル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白
試料を分析するにあたり、二次元ゲルに添加された塩基
性ラジカル促進剤を前泳動によって除去すると共に、負
電極バッファーに強酸性液を加えて同ゲルの酸度を高め
ることにより塩基性低分子量の小蛋白に対する分離能を
向上させるものである。
実施例の説明
零次元泳動
ここにいう零次元泳動とは、一次元泳動において一次元
ゲルに試料溶液を注入する代わりに同ゲル中に挿入され
るサンプルゲルを電気泳動法により濃縮形成する処理の
ことである。この零次元泳動は、第１図（ａ）に示すよ
うな角柱状のゲル室（１）を、−列又は二列以上形成し
たゲルコンテナＧＣを上部バッファ一槽（２）及び下部
バッファ〇 一槽（３）間に装着し、ゲル室（１）内には、例えば蛋
白試料の泳動媒体としてポリアクリルアミドゲルを収容
し、その上部より試料溶液を導入して行うらのである。
ゲルに試料溶液を注入する代わりに同ゲル中に挿入され
るサンプルゲルを電気泳動法により濃縮形成する処理の
ことである。この零次元泳動は、第１図（ａ）に示すよ
うな角柱状のゲル室（１）を、−列又は二列以上形成し
たゲルコンテナＧＣを上部バッファ一槽（２）及び下部
バッファ〇 一槽（３）間に装着し、ゲル室（１）内には、例えば蛋
白試料の泳動媒体としてポリアクリルアミドゲルを収容
し、その上部より試料溶液を導入して行うらのである。
この場合、上部バッファ一槽（２）に設けられた陽極Ａ
及び下部バッファ一槽（３）に設けられた陰極８間には
適当な電圧が印加される。この泳動前においてポリアク
リルアミドゲルにはラジカル捕捉剤としての２−メルカ
プトエチルアミンを前泳動させ、これによって試料蛋白
の消耗を防止できるようになっている。また、前記試料
溶液の泳動中においては、還元剤としてのシスティンも
共に泳動させ、こ打によって前記蛋白分子のＳ−３架橋
を防止するものである。このようにして泳動濃縮された
試料はゲルコンテナＧＣ８から摘出又はそのコンテナの
解体により取出された後、その濃縮ゲル部分（４）の適
当部位を切り取って一次元ゲルのためのサンプルゲル片
ＳＧとする。
及び下部バッファ一槽（３）に設けられた陰極８間には
適当な電圧が印加される。この泳動前においてポリアク
リルアミドゲルにはラジカル捕捉剤としての２−メルカ
プトエチルアミンを前泳動させ、これによって試料蛋白
の消耗を防止できるようになっている。また、前記試料
溶液の泳動中においては、還元剤としてのシスティンも
共に泳動させ、こ打によって前記蛋白分子のＳ−３架橋
を防止するものである。このようにして泳動濃縮された
試料はゲルコンテナＧＣ８から摘出又はそのコンテナの
解体により取出された後、その濃縮ゲル部分（４）の適
当部位を切り取って一次元ゲルのためのサンプルゲル片
ＳＧとする。
なお、この零次元泳動に用いられた上部バッファ一槽（
２）及び下部バッファ一槽（３）は次に述べる一次元泳
動用の上部バッファ一槽及び下部バッファ一槽とそれぞ
れ同様な構造を有するものであり、零次元泳動は試料を
濃縮するため、一次元泳動よりも全長の短いゲルコンテ
ナを用いたことが機構上の唯一の相違点である。ゲルコ
ンテナＧＣの両板間の距離、すなわちゲルの厚みはこの
場合的３１１Ｉ１１としたが、１ｍ程度から３ｉＩＩ！
ｌを越えるものまでその用途に応じて、作成することが
できる。一次元泳動及び二次元泳動のゲル厚についても
同様である。
２）及び下部バッファ一槽（３）は次に述べる一次元泳
動用の上部バッファ一槽及び下部バッファ一槽とそれぞ
れ同様な構造を有するものであり、零次元泳動は試料を
濃縮するため、一次元泳動よりも全長の短いゲルコンテ
ナを用いたことが機構上の唯一の相違点である。ゲルコ
ンテナＧＣの両板間の距離、すなわちゲルの厚みはこの
場合的３１１Ｉ１１としたが、１ｍ程度から３ｉＩＩ！
ｌを越えるものまでその用途に応じて、作成することが
できる。一次元泳動及び二次元泳動のゲル厚についても
同様である。
一次元泳動
一次元泳動用ゲルコンテナＧＣは第２図（ａ）■
に示すような角柱状、すなわち矩形断面をもった複数列
のゲル室（１０）を有すると共に、−側面の比較的高レ
ベル位置において各ゲル室（ｔｏ）Ｉこ通ずるサンプル
挿入窓（１１）を形成したものである。前記零′次元処
理によるサンプルゲル片は、この窓の縦寸法よりやや低
い高さを有するが、零次元及びこの一次元のゲル室幅及
び奥行は同じであるため、この窓からゲル室（ｌＯ）に
挿入された各サンプルゲル片ＳＧは、同室内の泳動用ポ
リアクリルアミドゲルにおけるこの窓に対応した切除部
に入り、その上下切断端の全面によく密着する。第２図
（ｂ）に示すＳＧＣはサンプルゲルカバー板であり、前
記ゲルコンテナＧＣの善意（【１）に対応する複数の窓
枠（１２）を有するものである。各窓枠（１２）は対応
する善意（１１）内に挿入され、これによりゲル室（１
０）内において対応する位置にあるサンプルゲル片ＳＧ
の側面を支持及び被覆するものである。サンプルゲルカ
バーＳＧＣを装着したゲルコンテナＧＣは第３図に示す
ように、その上端及び下端を上部バッファ一槽ＡＢＶ
ｉび下部バッファー槽ＣＢＶ に装着し、陽極Ａ及
び陰極Ｃ間に適当な電圧を印加することにより、サンプ
ルゲルの泳動分離を行うものである。ゲルコンテナＧＣ
へのサンプルゲルカバーＳＧＣの装着は、例えば第４図
に示すようなりリップ（１３）を用いて行われる。また
、上部バッファ一槽ＡＢＶ 及び下部バ■ ッファ一槽ＣＢＶ の内部構造も同じく第４図に示す
通りである。
のゲル室（１０）を有すると共に、−側面の比較的高レ
ベル位置において各ゲル室（ｔｏ）Ｉこ通ずるサンプル
挿入窓（１１）を形成したものである。前記零′次元処
理によるサンプルゲル片は、この窓の縦寸法よりやや低
い高さを有するが、零次元及びこの一次元のゲル室幅及
び奥行は同じであるため、この窓からゲル室（ｌＯ）に
挿入された各サンプルゲル片ＳＧは、同室内の泳動用ポ
リアクリルアミドゲルにおけるこの窓に対応した切除部
に入り、その上下切断端の全面によく密着する。第２図
（ｂ）に示すＳＧＣはサンプルゲルカバー板であり、前
記ゲルコンテナＧＣの善意（【１）に対応する複数の窓
枠（１２）を有するものである。各窓枠（１２）は対応
する善意（１１）内に挿入され、これによりゲル室（１
０）内において対応する位置にあるサンプルゲル片ＳＧ
の側面を支持及び被覆するものである。サンプルゲルカ
バーＳＧＣを装着したゲルコンテナＧＣは第３図に示す
ように、その上端及び下端を上部バッファ一槽ＡＢＶ
ｉび下部バッファー槽ＣＢＶ に装着し、陽極Ａ及
び陰極Ｃ間に適当な電圧を印加することにより、サンプ
ルゲルの泳動分離を行うものである。ゲルコンテナＧＣ
へのサンプルゲルカバーＳＧＣの装着は、例えば第４図
に示すようなりリップ（１３）を用いて行われる。また
、上部バッファ一槽ＡＢＶ 及び下部バ■ ッファ一槽ＣＢＶ の内部構造も同じく第４図に示す
通りである。
上記の一次元泳動におけるポリアクリルアミドゲルは、
サンプルゲル片ＳＧの挿入前において、ラジカル捕捉剤
としての２−メルカプトプロピオン酸を前泳動させたも
のであり、さらに前記サンプルゲルの泳動中においては
還元剤としてラジカル捕捉剤と同じ２−メルカプトプロ
ピオン酸が同時に泳動処理され、ゲル中を強い還元状態
に維持するようになっている。
サンプルゲル片ＳＧの挿入前において、ラジカル捕捉剤
としての２−メルカプトプロピオン酸を前泳動させたも
のであり、さらに前記サンプルゲルの泳動中においては
還元剤としてラジカル捕捉剤と同じ２−メルカプトプロ
ピオン酸が同時に泳動処理され、ゲル中を強い還元状態
に維持するようになっている。
上記のようにサンプルゲル片を一次元ゲルとは別に作成
し、これを一次元ゲル中に挿入する方式は本発明におい
てのみ採用された独自の方式であり、これによってラジ
カル捕捉剤の前泳動処理と相俟って残存ラジカルによる
試料消耗の問題が解決したものである。
し、これを一次元ゲル中に挿入する方式は本発明におい
てのみ採用された独自の方式であり、これによってラジ
カル捕捉剤の前泳動処理と相俟って残存ラジカルによる
試料消耗の問題が解決したものである。
二次元泳動
二次元泳動のゲルコンテナは、第５図に示すような３種
類のゲルコンテナ板ＬＰ、ＭＰ、ＲＰを組み合わせ、こ
れにより形成したゲルコンテナ構体を上下バッファ一槽
と接続することにより行われる。二次元ゲル室は複数枚
用いた場合のＭＰ−ＭＰ板面間及び左側コンテナ板ＬＰ
の右側面とこれに対応するコンテナ板ＭＰの左側面並び
に、右側コンテナ板ＲＰの左側面とこれに対応するコン
テナ板ＭＰの右側面との間に形成される。
類のゲルコンテナ板ＬＰ、ＭＰ、ＲＰを組み合わせ、こ
れにより形成したゲルコンテナ構体を上下バッファ一槽
と接続することにより行われる。二次元ゲル室は複数枚
用いた場合のＭＰ−ＭＰ板面間及び左側コンテナ板ＬＰ
の右側面とこれに対応するコンテナ板ＭＰの左側面並び
に、右側コンテナ板ＲＰの左側面とこれに対応するコン
テナ板ＭＰの右側面との間に形成される。
コンテナ構体ＧＣと上部バッファ一槽ＡＢＶ２及び下部
バッファ一槽ＣＢＶ を組み合わせた構造の断面は第
６図に示す通りであり、各ゲル室には上端に一次元泳動
済ゲルを載置できるだけの余裕を残して二次元泳動用ゲ
ルＢＧが挿入される。
バッファ一槽ＣＢＶ を組み合わせた構造の断面は第
６図に示す通りであり、各ゲル室には上端に一次元泳動
済ゲルを載置できるだけの余裕を残して二次元泳動用ゲ
ルＢＧが挿入される。
コンテナ板Ｍ Ｐの上端にはスロットＤ が形成される
と共に、左側コンテナ板ＬＰ及び右側コンテナ板ＲＰの
上端外側面と上部バッファ一槽Ａ Ｂ Ｖ ２の下端に
形成された突起との間には同様なスロットＤ２が形成さ
れる。コンテナ構体ＧＣ２の各ゲル室の上端からは一次
元泳動済ゲルＳ６２が挿入されると共に、コンテナ構体
ＧＣ，，の上端にはガーゼが当てがわれ、各スロットＤ
及びＤにはガー＋２ ゼＧの上から平板くさびＰ ’ｖＶが挿入され、これに
より緊張されるガーゼにより一次元泳動済ゲルＳ６２の
上側縁が押圧され、二次元泳動用ゲルＢＧの上端と好ま
しく密着するようになっている。
と共に、左側コンテナ板ＬＰ及び右側コンテナ板ＲＰの
上端外側面と上部バッファ一槽Ａ Ｂ Ｖ ２の下端に
形成された突起との間には同様なスロットＤ２が形成さ
れる。コンテナ構体ＧＣ２の各ゲル室の上端からは一次
元泳動済ゲルＳ６２が挿入されると共に、コンテナ構体
ＧＣ，，の上端にはガーゼが当てがわれ、各スロットＤ
及びＤにはガー＋２ ゼＧの上から平板くさびＰ ’ｖＶが挿入され、これに
より緊張されるガーゼにより一次元泳動済ゲルＳ６２の
上側縁が押圧され、二次元泳動用ゲルＢＧの上端と好ま
しく密着するようになっている。
第７図はコンテナ構体Ｇ Ｃ，を維持するための締結部
材Ｈ及び上部バッファーｉｆ Ａ Ｂ Ｖ、及び下部バ
ッファ一槽ＣＢＶ の内部構造が示されている。
材Ｈ及び上部バッファーｉｆ Ａ Ｂ Ｖ、及び下部バ
ッファ一槽ＣＢＶ の内部構造が示されている。
この二次元泳動においても、泳動媒体であるポリアクリ
ルアミドゲルには試料ゲル柱ＳＧ２成分の泳動前におい
て、ラジカル捕捉剤としての２−メルカプトエチルアミ
ンを泳動させることにより残存するフリーラジカルを除
去し、また試料ゲル柱成分の泳動中においは、電荷をも
った還元剤としてシスティンを共に泳動させ、二次元ゲ
ル内を強い還元的状態に維持するようにした。同時に、
前泳動で同ゲル内の塩基性ラジカル促進剤を除去すると
共に、下部、すなわち負電極バッファ一槽ＣＢＶ に
は塩酸を加えることにより、ゲルのｐＨを通常の４．５
から約０．９低下させて３．６となるようにした。
ルアミドゲルには試料ゲル柱ＳＧ２成分の泳動前におい
て、ラジカル捕捉剤としての２−メルカプトエチルアミ
ンを泳動させることにより残存するフリーラジカルを除
去し、また試料ゲル柱成分の泳動中においは、電荷をも
った還元剤としてシスティンを共に泳動させ、二次元ゲ
ル内を強い還元的状態に維持するようにした。同時に、
前泳動で同ゲル内の塩基性ラジカル促進剤を除去すると
共に、下部、すなわち負電極バッファ一槽ＣＢＶ に
は塩酸を加えることにより、ゲルのｐＨを通常の４．５
から約０．９低下させて３．６となるようにした。
第８図は本発明の方法を実施して得られた試料蛋白の分
子量と泳動距離との関係を示すグラフである。この場合
、移動度に対する電荷の効果の差を消去すれば、分子量
の対数値はほぼ完全に移動度に比例しており、分子量の
測定が可能となったことを示している。
子量と泳動距離との関係を示すグラフである。この場合
、移動度に対する電荷の効果の差を消去すれば、分子量
の対数値はほぼ完全に移動度に比例しており、分子量の
測定が可能となったことを示している。
上記第８図のグラフ及び第９図に示した二次元ゲルの分
離モデルから明らかな通り、二次元ゲルの塩基性領域か
らは、既知のスポット以外に４個の未知の蛋白質による
スポット（Ａ、Ｂ、Ｃ１Ｄ）が検出された。第９図にお
いて、スポットＡはＬ３３の右下に、スポットＢはＬ３
４の左下に、スポットＣはＬ２９とＬ２７の中間に、そ
してスポットＤはＬ３２の直下において見いだされる。
離モデルから明らかな通り、二次元ゲルの塩基性領域か
らは、既知のスポット以外に４個の未知の蛋白質による
スポット（Ａ、Ｂ、Ｃ１Ｄ）が検出された。第９図にお
いて、スポットＡはＬ３３の右下に、スポットＢはＬ３
４の左下に、スポットＣはＬ２９とＬ２７の中間に、そ
してスポットＤはＬ３２の直下において見いだされる。
なお、Ａ、Ｂ、Ｃは５０Ｓ亜粒子に、Ｄは３０Ｓ亜粒子
に存在する。なお、還元剤を用いずに、本発明の方法を
実施した場合には、スポットＡ、Ｂ、Ｃが消失するが、
ＢとＣの消失に伴ってその近傍にスポットＢ’とＣ゛が
見いだされた。一方、Ｄは還元剤の有無と無関係に同一
位置においてスポットを形成する。
に存在する。なお、還元剤を用いずに、本発明の方法を
実施した場合には、スポットＡ、Ｂ、Ｃが消失するが、
ＢとＣの消失に伴ってその近傍にスポットＢ’とＣ゛が
見いだされた。一方、Ｄは還元剤の有無と無関係に同一
位置においてスポットを形成する。
また、Ａ、Ｂ、Ｃ，Ｄの分子量を二次元移動度を用いて
求めると、それぞれ６４００，４９００゜８２００及び
５９００となった。なお、＋４０アミノ酸標識によって
コピー数を測定し、それぞれ０゜６．０．４．０．３及
び０．１の値を得たものである。
求めると、それぞれ６４００，４９００゜８２００及び
５９００となった。なお、＋４０アミノ酸標識によって
コピー数を測定し、それぞれ０゜６．０．４．０．３及
び０．１の値を得たものである。
発明の効果
本発明の方法は、以上の如（構成されたため、各泳動用
ゲル内に残存するフリーラジカルを効果的に除去すると
共に、いわゆる零次元泳動法の実施による試料の濃縮に
基づいてフリーラジカルの影響（試料の消耗）を防止し
、さらにゲル内を還元状態に保つことにより試料蛋白が
従来の方法の如（還元型と酸化型の２つのスポットに分
裂するなどの不都合や、Ｓ−８架橋による二量体化を防
止し、定量性及び分解能を向上させたものである。また
、二次元ゲル内のｐＨを通常の状態より低下させたこと
により、移動度の大きい塩基性低分子量の蛋白質が泳動
フロントと重なって分離しにくくなるという欠点を改良
したものである。この結果、本発明においては、試料蛋
白の分子量の対数値と泳動度とが満足すべき比例関係を
示すようになった。
ゲル内に残存するフリーラジカルを効果的に除去すると
共に、いわゆる零次元泳動法の実施による試料の濃縮に
基づいてフリーラジカルの影響（試料の消耗）を防止し
、さらにゲル内を還元状態に保つことにより試料蛋白が
従来の方法の如（還元型と酸化型の２つのスポットに分
裂するなどの不都合や、Ｓ−８架橋による二量体化を防
止し、定量性及び分解能を向上させたものである。また
、二次元ゲル内のｐＨを通常の状態より低下させたこと
により、移動度の大きい塩基性低分子量の蛋白質が泳動
フロントと重なって分離しにくくなるという欠点を改良
したものである。この結果、本発明においては、試料蛋
白の分子量の対数値と泳動度とが満足すべき比例関係を
示すようになった。
第１図（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ本発明の零次元泳動
用ゲルコンテナ及びその使用状態を示す縦断面図、 第２図（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ一次元泳動用ゲルコ
ンテナ及びサンプルゲルカバーを示す斜視図、 第３図は一次元泳動用ゲルコンテナ及びこれに装着され
た上下電極槽を示す縦断面図、第４図はその分解斜視図
、 第５図は二次元泳動用の各種ゲルコンテナ板を分離して
示す斜視図、 第６図は第５図のゲルコンテナ板を組み合わせてコンテ
ナ構体とし、これに上下電極槽を装着した構造を示す縦
断面図、 第７図はその分解斜視図、 第８図は本発明の方法により得られた分子量−泳動距離
特性を示すグラフ、 第９図は二次元ゲルの分離モデルを示す図である。 （１）・・・・・・・・・・・・・・・ゲル室（２）・
・・・・・・・・・・・・・・上部（陽極）バッファ一
槽（３）・・・・・・・・・・・・・・・下部（陰極）
バッファ一槽（４）・・・・・・・・・・・・・・・泳
動用ゲルＡ・・・・・・・・・・・・・・・・・・陽極
Ｂ・・・・・・・・・・・・・・・・・・陰極ＳＧ・・
・・・・・・・・・・・・・サンプルゲルＳＧＣ・・・
・・・・・・・・・サンプルゲルカバーＡＢＶ・・・・
・・・・・・・・上部（陽極）バッファ一槽ＣＢＶ・・
・・・・・・・・・・下部（陰極）バッファ一槽ＬＰ・
・・・・・・・・・・・・・・左側コンテナ板ＭＰ・・
・・・・・・・・・・・・・中央コンテナ板ＲＰ・・・
・・・・・・・・・・・・右側コンテナ板Ｄ・・・・・
・・・・・・・・・・・・・コンテナ間のスロットＧ・
・・・・・・・・・・・・・・・・・ガーゼＰＷ・・・
・・・・・・・・・・・・平板（さびＧＳ・・・・・・
・・・・・・・・・ゲルスペーサＨ・・・・・・・・・
・・・・・・・・・締結具５１１ （ト） 第２図 （α〕 第３図 第５図 。 ＬＰ ＭＰ ＲＰ １５１：需５１ 第６図 ／ＶＩｌ′ＭＰＩ″ｌ）ｌ 第す図 第９図
用ゲルコンテナ及びその使用状態を示す縦断面図、 第２図（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ一次元泳動用ゲルコ
ンテナ及びサンプルゲルカバーを示す斜視図、 第３図は一次元泳動用ゲルコンテナ及びこれに装着され
た上下電極槽を示す縦断面図、第４図はその分解斜視図
、 第５図は二次元泳動用の各種ゲルコンテナ板を分離して
示す斜視図、 第６図は第５図のゲルコンテナ板を組み合わせてコンテ
ナ構体とし、これに上下電極槽を装着した構造を示す縦
断面図、 第７図はその分解斜視図、 第８図は本発明の方法により得られた分子量−泳動距離
特性を示すグラフ、 第９図は二次元ゲルの分離モデルを示す図である。 （１）・・・・・・・・・・・・・・・ゲル室（２）・
・・・・・・・・・・・・・・上部（陽極）バッファ一
槽（３）・・・・・・・・・・・・・・・下部（陰極）
バッファ一槽（４）・・・・・・・・・・・・・・・泳
動用ゲルＡ・・・・・・・・・・・・・・・・・・陽極
Ｂ・・・・・・・・・・・・・・・・・・陰極ＳＧ・・
・・・・・・・・・・・・・サンプルゲルＳＧＣ・・・
・・・・・・・・・サンプルゲルカバーＡＢＶ・・・・
・・・・・・・・上部（陽極）バッファ一槽ＣＢＶ・・
・・・・・・・・・・下部（陰極）バッファ一槽ＬＰ・
・・・・・・・・・・・・・・左側コンテナ板ＭＰ・・
・・・・・・・・・・・・・中央コンテナ板ＲＰ・・・
・・・・・・・・・・・・右側コンテナ板Ｄ・・・・・
・・・・・・・・・・・・・コンテナ間のスロットＧ・
・・・・・・・・・・・・・・・・・ガーゼＰＷ・・・
・・・・・・・・・・・・平板（さびＧＳ・・・・・・
・・・・・・・・・ゲルスペーサＨ・・・・・・・・・
・・・・・・・・・締結具５１１ （ト） 第２図 （α〕 第３図 第５図 。 ＬＰ ＭＰ ＲＰ １５１：需５１ 第６図 ／ＶＩｌ′ＭＰＩ″ｌ）ｌ 第す図 第９図
Claims (7)
- （１）試料成分を一次元ゲル中で電気泳動させ、これに
より得られた一次元サンプルゲルを二次元ゲルの上端に
載せてさらに電気泳動させることからなる二次元電気泳
動法において、 試料を前処理用棒状ゲル中において電気泳動させること
により濃縮して零次元サンプルゲルを作成し、 前記サンプルゲルを一次元ゲル中において切欠かれた所
望のレベル位置に挿入して一次元電気泳動を実施し、こ
れにより二次元ゲルの上端に載せてさらに電気泳動させ
るべき一次元分離済ゲルを調製することを特徴とする二
次元電気泳動法。 - （２）前記前処理用棒状ゲル及び一次元ゲルが方形断面
を有するようにし、これによって、サンプルゲル及び一
次元分離済ゲルが、それぞれ前記一次元ゲル及び二次元
ゲルに対して隙間なく密着するようにしたことを特徴と
する特許請求の範囲第（１）項記載の方法。 - （３）いずれもポリアクリルアミドからなる前記棒状ゲ
ル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白試料を分析
するにあたり、前記各ゲルにおいて対応する試料溶液又
はゲルを加えて泳動させる前に、各ゲル中に残存するフ
リーラジカルを除去するための荷電体からなるラジカル
捕捉剤を泳動させることにより、各ゲルでの泳動中にお
ける試料の、フリーラジカルによる消耗を防止すること
を特徴とする特許請求の範囲第（１）項又は第（２）項
記載の方法。 - （４）前記一次元ゲルに対するラジカル捕捉剤が２−メ
ルカプトプロピオン酸を含み、前記棒状ゲル及び二次元
ゲルに対するラジカル捕捉剤が２−メルカプトエチルア
ミンを含むものであることを特徴とする特許請求の範囲
第（３）項記載の方法。 - （５）いずれもポリアクリルアミドからなる前記棒状ゲ
ル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白試料を分析
するにあたり、前記各ゲルにおいて対応する試料溶液又
はゲルを加えて泳動させると共に強い還元的状態を保つ
ための荷電体からなる還元剤を泳動させることにより、
各ゲル中で蛋白分子がＳ−Ｓ架橋し、二量体化するのを
防止することを特徴とする特許請求の範囲第（１）〜（
４）項のいずれか１項に記載の方法。 - （６）前記一次元ゲルに対する還元剤が２−メルカプト
プロピオン酸を含み、前記棒状ゲル及び二次元ゲルに対
する還元剤がシステインを含むものであることを特徴と
する特許請求の範囲第（５）項記載の方法。 - （７）いずれもポリアクリルアミドからなる前記棒状ゲ
ル、一次元ゲル及び二次元ゲルを用いて蛋白試料を分析
するにあたり、二次元ゲルに添加された塩基性ラジカル
促進剤を前泳動によって除去すると共に、負電極バッフ
ァーに強酸性液を加えて同ゲルの酸度を高めることによ
り塩基性低分子量の小蛋白に対する分離能を向上させる
ことを特徴とする特許請求の範囲第（１）〜（６）項の
いずれか１項に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61285783A JPH0641933B2 (ja) | 1986-11-29 | 1986-11-29 | 二次元電気泳動法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP61285783A JPH0641933B2 (ja) | 1986-11-29 | 1986-11-29 | 二次元電気泳動法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62306174A Division JPH0641934B2 (ja) | 1987-12-02 | 1987-12-02 | 二次元電気泳動法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63138250A true JPS63138250A (ja) | 1988-06-10 |
| JPH0641933B2 JPH0641933B2 (ja) | 1994-06-01 |
Family
ID=17696010
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61285783A Expired - Lifetime JPH0641933B2 (ja) | 1986-11-29 | 1986-11-29 | 二次元電気泳動法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0641933B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000052458A1 (fr) * | 1999-03-02 | 2000-09-08 | Isao Karube | Procede de separation bidimensionnelle |
| JP2003315312A (ja) * | 2002-04-12 | 2003-11-06 | Tecan Trading Ag | 分子分離用カセット、システム、および２ｄゲル電気泳動方法 |
| EP2315014A1 (en) * | 2008-07-15 | 2011-04-27 | Toppan Printing Co., Ltd. | Electrophoresis apparatus and electrophoresis method |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4047270B2 (ja) | 2003-12-24 | 2008-02-13 | 有限会社バイオ情報技術研究所 | Ｒｆｈｒ二次元電気泳動法及び装置 |
-
1986
- 1986-11-29 JP JP61285783A patent/JPH0641933B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2000052458A1 (fr) * | 1999-03-02 | 2000-09-08 | Isao Karube | Procede de separation bidimensionnelle |
| JP2003315312A (ja) * | 2002-04-12 | 2003-11-06 | Tecan Trading Ag | 分子分離用カセット、システム、および２ｄゲル電気泳動方法 |
| EP2315014A1 (en) * | 2008-07-15 | 2011-04-27 | Toppan Printing Co., Ltd. | Electrophoresis apparatus and electrophoresis method |
| EP2315014A4 (en) * | 2008-07-15 | 2012-04-11 | Toppan Printing Co Ltd | ELECTROPHORESIS APPARATUS AND ELECTROPHORESIS METHOD THEREOF |
| US8500981B2 (en) | 2008-07-15 | 2013-08-06 | Toppan Printing Co., Ltd. | Electrophoresis apparatus and electrophoresis method |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0641933B2 (ja) | 1994-06-01 |
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