JP4036327B2 - 抗インフルエンザウイルス剤 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗インフルエンザ剤に関する。詳しくは、カフェー酸フェネチルエステルを有効成分とする抗インフルエンザ剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カフェー酸フェネチルエステルは、プロポリス等に微量含まれる成分で、消炎作用、抗がん活性（例えば、非特許文献１または非特許文献２を参照）、Salmonella typhimurim に対する抗変異原活性、抗酸化活性、植物病原性糸状菌の発育阻害活性を有することが知られている。
【０００３】
カフェー酸フェネチルエステルを含むカフェー酸誘導体の工業分野への応用は最近になって行われるようになり、カフェー酸誘導体の日焼け防止組成物が（例えば、特許文献１参照）、あるいはカフェー酸誘導体を含むＨＩＶおよびレトロウイルスに関連する障害の処置または予防のための薬学的組成物が報告されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
【特許文献１】
特表平１０−５０１２１６号公報
【特許文献２】
特開２００２−２０２８３号公報
【非特許文献１】
「Cancer Letters」Elsevier Science Ireland Ltd. 2000, 157, p.31-38
【非特許文献２】
「Anti-Cancer Drugs 」Lippincott Williams & Wilkins 2001, 12, p.143-149 。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
カフェー酸フェネチルエステルの用途は、上記に示した如く限られており、その他の薬学的または機能的な利用、例えば医薬品、医薬部外品、さらには化粧品分野で有効に利用されたものは見当たらない。そこで、本発明の目的は、カフェー酸フェネチルエステルの新規かつ有用な用途を提供することにある。
【０００６】
【発明が解決するための手段】
本発明者らは、カフェー酸フェネチルエステルを合成、精製した後、その作用に関して鋭意研究を進めてきたところ、カフェー酸フェネチルエステルの抗酸化作用や抗菌作用を確認し、さらにはインフルエンザウイルスの増殖を抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明のインフルエンザウイルスの増殖抑制剤は、下記式：
【化３】
で表されるカフェー酸フェネチルエステルを有効成分として含有することを特徴とする。
【０００８】
前記増殖抑制剤は、Ａ型インフルエンザウイルスの増殖を抑制することが好ましい。
【０００９】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、下記式：
【化４】
で表されるカフェー酸フェネチルエステルを有効成分として含有することを特徴とする。
【００１０】
前記抗インフルエンザウイルス剤は、Ａ型インフルエンザウイルスを対象とすることが好ましい。
【００１１】
［作用効果］
本発明のインフルエンザウイルスの増殖抑制剤によれば、インフルエンザウイルス、特にＡ型インフルエンザウイルスの増殖を有効に抑制するという効果を奏する。
【００１２】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤によれば、インフルエンザウイルス、特にＡ型インフルエンザウイルスの増殖を抑制するとともに抗酸化作用および抗菌作用をも併せもつことにより、インフルエンザ予防剤または治療剤として有用である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明においてインフルエンザウイルスとは、オルソミクソウイルス科に属し、ヒトまたはトリ、ブタ、ウマ等の動物に感染し、急性呼吸器感染症状と全身症状（インフルエンザ）を発症させるウイルスである。ヒトに感染するウイルスとして、Ａ型、Ｂ型およびＣ型インフルエンザウイルスが挙げられる。
【００１４】
本発明のインフルエンザウイルスの増殖抑制剤は、下記式：
【化５】
で表されるカフェー酸フェネチルエステルを有効成分として含有することを特徴とする。
【００１５】
前記増殖抑制剤に有効成分として含まれるカフェー酸フェネチルエステルは、プロポリス等から単離された天然物でもよく、化学的に合成されたものでもよく、酵素を用いて生化学的に合成されたものでもよい。
【００１６】
化学的な合成方法としては、公知の化学合成法、例えば、カフェー酸とフェネチルアルコールを酸触媒存在下高温で反応させる方法、または塩化チオニルなどを用いてカフェー酸を塩素化した後フェネチルアルコールと反応させて合成する方法などが挙げられる。
【００１７】
酵素を用いた生化学的合成方法としては、例えば、前記特許文献１に記載のリパーゼ、エステラーゼなどの酵素によるクロロゲン酸のエステル交換反応が挙げられる。
【００１８】
前記増殖抑制剤中のカフェー酸フェネチルエステルの含有量は、インフルエンザウイルスの増殖を抑制しうる限り特に限定されるものではないが、通常０．００００３〜９９．９重量％程度であり、０．０００１〜０．０１重量％が好ましい。
【００１９】
インフルエンザウイルスの増殖抑制率は、インフルエンザウイルス感受性細胞に当該ウイルスを感染させ、感染前または感染後に被験物質を加え、感染後所定の期間に細胞内に存在するウイルスの力価をプラーク法にて定量することにより調べることができる。前記増殖抑制率は、被験物質を添加しないコントロールに対して５０％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましい。
【００２０】
カフェー酸フェネチルエステルは、固体状でもよく、有機溶媒、水もしくは熱水、またはこれらの混合溶媒に溶解させた状態でもよく、あるいは、精製過程で有機溶媒抽出と水抽出とが組み合わされた状態でもよい。前記有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−ブタノール、アセトン、クロロホルム、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、1,3 −ブチレングリコール、プロピレングリコールなどを用いることができる。
【００２１】
前記増殖抑制剤の剤型は、溶液状、ペースト状、ゲル状または粉末状が挙げられる。
【００２２】
また、前記増殖抑制剤には、使用目的により、または前記剤型になるように、本発明の効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬品、医薬部外品等に一般的に用いられる各種成分を配合することができる。前記成分としては、例えば、油分（動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス油、シリコン油、高級アルコール、リン脂質類、脂肪酸類等）、界面活性剤（アニオン性、カチオン性、両性または非イオン性界面活性剤）、ビタミン類（ビタミンＡ群、ビタミンＢ群、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、ビタミンＣ群、ビタミンＤ群、ビタミンＥ群、その他フェルラ酸、γ−オリザノール等）、紫外線吸収剤（ｐ−アミノ安息香酸、アントラニル、サルチル酸、クマリン、ベンゾトリアゾール、テトラゾール、イミダゾリン、ピリミジン、ジオキサン、フラン、ピロン、カンファー、核酸、アラントインおよびそれらの誘導体、アミノ酸系化合物、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリン等）、抗酸化剤（ステアリン酸エステル、ノルジヒドログアセレテン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、パラヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、セサモール、セサモリン、ゴシポール等）、増粘剤（ヒドキシエチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、カルボキシビニルポリマー、アラビアゴム、トラガントゴム、寒天、カゼイン、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、アルギン酸およびその塩等）、保湿剤（プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、コンドロイチン硫酸およびその塩、ヒアルロン酸およびその塩、乳酸ナトリウム等）、低級アルコール、多価アルコール、水溶性高分子、ｐＨ調整剤、防腐・防バイ剤、着色料、香料、清涼剤、安定化剤、動・植物抽出物、動・植物性蛋白質およびその分解物、動・植物性多糖類およびその分解物、動・植物性糖蛋白質およびその分解物、微生物培養代謝成分、血流促進剤、消炎剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、細胞賦活剤、アミノ酸およびその塩、角質溶解剤、収斂剤、創傷治療剤、増泡剤、口腔用剤、消臭・脱臭剤が挙げられる。
【００２３】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、前記カフェー酸フェネチルエステルを有効成分として含有するものである。
【００２４】
前記抗インフルエンザウイルス剤は、インフルエンザウイルスの感染に対する予防剤または治療剤として有用である。
【００２５】
前記抗インフルエンザウイルス剤中のカフェー酸フェネチルエステルの含有量は、インフルエンザウイルスの増殖を抑制しうる限り特に限定されるものではないが、通常０．００００３〜９９．９重量％程度であり、０．０００１〜０．０１重量％が好ましい。
【００２６】
前記抗インフルエンザウイルス剤の剤型は、溶液状、ペースト状、ゲル状または粉末状が挙げられ、感染予防剤または治療剤として適用する目的または部位に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
前記抗インフルエンザウイルス剤には、選択する剤型に応じて、前記溶媒および各種成分の中から医薬品として許容されうるものを任意に配合することができる。
【００２８】
本発明のインフルエンザウイルスの増殖抑制剤および抗インフルエンザウイルス剤は、世界的な流行が繰り返され、症状の重いインフルエンザの原因ウイルス（Ａ型インフルエンザウイルス）の増殖を特に抑制することから、インフルエンザの流行を防止することが考えられる。また、抗インフルエンザウイルス剤は、ワクチンとの併用も効果的であると考えられる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例等について説明するが、本発明は、これらの実施例等により限定されるものではない。
【００３０】
（製造例１）
カフェー酸フェネチルエステル（ＣＡＰＥ）の製造
本製造例で用いた方法は、クロロゲン酸を原料とし、酵素（エステラーゼ）によるエステル交換反応による酵素合成である。
フェネチルアルコール( 和光純薬工業株式会社) は、最終濃度で21.6%(v/v)とし、20.3mMクロロゲン酸( 東京化成工業株式会社) を含む0.05M リン酸緩衝液(pH 6.5)( フェネチルアルコール- 緩衝液)1.44ml を40℃で10分間予備加温後、同緩衝液でタンパク量を0.24mg/ml に調整したクロロゲン酸エステラーゼ( キッコーマン株式会社) 溶液0.36mlを添加して反応を開始した。40℃で60分間反応後、2Mトリクロロ酢酸を0.2ml 添加して、酵素反応を停止した。
【００３１】
反応生成物を分取用HPLCにかけ、目的のピークを分取した。分取した反応生成物画分をエバポレーターで減圧濃縮し、エタノールに溶解し、LC-MS で分子量を測定した。その結果を図１および図２に示す。
【００３２】
図１および図２より、得られた化合物は、カフェー酸フェネチルエステルであることが確認された。
【００３３】
（試験例１）
抗酸化効果
製造例１で得られた化合物がカフェー酸フェネチルエステルの公知の作用効果である抗酸化活性を有するかどうかを下記の方法に従って測定した。
0.1M酢酸緩衝液(pH5.5)2.0mlに、50%(v/v)エタノール-0.1M 酢酸緩衝液(pH5.5) に溶解したカフェー酸フェネチルエステル2.0ml と20mM 1,1- ジフェニル-2- ピクリルヒドラジル(DPPH, nacalai tesque Inc.)-エタノール溶液1.0ml を添加して、室温、暗黒条件下で正確に30分間保ち、 その溶液の吸光度(517nm) を測定した。カフェー酸フェネチルエステル濃度を変えて吸光度を測定し、横軸にカフェー酸フェネチルエステル濃度を縦軸に吸光度をプロットしてグラフを描き、近似直線からDPPHラジカルの吸光度( カフェー酸フェネチルエステル無添加のコントロール) を50% 減少させるのに必要なカフェー酸フェネチルエステル濃度(50%還元) を算出した。比較対照として、カフェー酸、アスコルビン酸、α- トコフェロールも同様の方法で測定した。結果を図３に示す。
【００３４】
図３より、カフェー酸フェネチルエステルは、22.47 μM の濃度でDPPHラジカルの吸光度を半減させた。また、同時に検討したカフェー酸の50% 還元は23.22 μM 、アスコルビン酸では30.67 μM 、α- トコフェロールでは26.77 μM であったことから、カフェー酸フェネチルエステルは、アスコルビン酸やα- トコフェロールよりも強いラジカル消去活性を示すことが示唆された。
【００３５】
本実験で検討したin vitroでのカフェー酸とカフェー酸フェネチルエステルのラジカル消去活性に顕著な差は認められなかったが、カフェー酸フェネチルエステルは細胞膜を通過して、細胞内で発生するH2O2が引き起こす障害を防御できるといわれており、in vivo ではカフェー酸よりカフェー酸フェネチルエステルの方が生理機能を発揮できると期待される。
【００３６】
（試験例２）
抗菌活性
抗菌活性は、日本化学療法学会標準法で示された固体培地法に従って最小発育阻止濃度(MIC) を測定することにより調べた。
被検菌にはStaphylococcus aureus IFO 12732 、Bacillus subtilis IFO 3134、Escherichia coli IFO 3301 、Pseudomonas aeruginosa IFO 3080 、Candida albicans IFO 1385 、Aspergillus niger IFO 4414を用いた。S. aureus ，B. subtilis ，E. coli ，P. aeruginosa はMuller-hinton broth(MHB)培地(Difco Lab.)、C.albicansとA.niger はサブロー培地(Difco Lab.)を用いて培養した。
【００３７】
細菌は37℃で18〜24時間、酵母は28℃で24時間培養し、1 ×106CFU/ml となるように菌液を調製した。カビはポテトデキストロース寒天(PDA) 培地( 日水製薬株式会社) に植菌し、28℃で72時間培養して形成された胞子を無菌的に集め、滅菌した0.05% Tween 80生理食塩水に懸濁し、1 ×106spore/ml となるように胞子を懸濁した。菌懸濁液および胞子懸濁液は、MHB およびPDA 平板培地に10倍段階希釈した液を塗抹、培養して形成されたコロニー数から濁度(660nm) と生菌数(CFU/ml)の関係をあらかじめ求めておいた。
フィルター(0.2μm, Millipore Co. USA) 滅菌した2 倍段階希釈のカフェー酸フェネチルエステル（CAPE）溶液1.5ml を高圧滅菌したMHB 寒天培地あるいはサブロー寒天培地13.5mlに添加し、滅菌シャーレに注ぎ込んでカフェー酸フェネチルエステル添加寒天培地を作成した。1 ×106CFU/ml に調製した菌液を、白金耳2cm 程度CAPE添加寒天培地に画線塗抹し、細菌は37℃で18〜20時間、酵母は28℃で24〜30時間、カビは28℃で48〜60時間培養して判定を行った。 カフェー酸フェネチルエステルの抗菌活性の結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
表１より、S. aureus とB. subtilis のMIC が703 μM 、E. coli とP. aeruginosa のMIC が352 μM であった。これら四種の細菌を比較すると、S. aureus とB. subtilis がグラム陽性菌で、E. coli とP. aeruginosa がグラム陰性菌であることから、カフェー酸フェネチルエステルはグラム陰性菌に対してより強い抗菌活性を示した。また、酵母であるC. albicans に対するMIC は175 μM と最も高い活性を示し、カフェー酸フェネチルエステルは酵母の生育をよく抑制することが明らかになった。また、A. nigerに対するMIC は703 μM であった。
【００３９】
（実施例１）
抗ウイルス活性
製造例１で得られたカフェー酸フェネチルエステルを1 ％(v/v) エタノール溶液に10ppm となるように溶解し、培地で2 倍段階希釈した。抗ウイルス活性の測定に用いたインフルエンザウイルスは、国立感染症研究所より分与を得たInfluenzaAH1N1型ウイルス(A/USSR/92/77 株, A ソ連型) である。インフルエンザウイルス感受性細胞としては、 国立公衆衛生院より分与されたイヌの腎臓由来のMadin Darby Canine Kidney(MDCK) 細胞を用いた。
MDCK細胞の培養にはプラスチック組織培養シャーレ(Nunc. A/S, Denmark)を用い、7.0%炭酸水素ナトリウム水溶液( 大塚製薬株式会社) でpH 7.4に調整した次の培地を使用した。すなわち10% 仔牛血清(CS, Flow Laboratories) 、L-グルタミン(2.92 μg/ml) 、ペニシリンG カリウム(100U/ml) 、カナマイシン(60 μg/ml) 、硫酸ストレプトマイシン(100μg/ml) をふくむEagle's minimal essential medium(MEM, 日水製薬株式会社)5ml中で、37℃、5%炭酸ガス孵卵器培養を行った。抗ウイルス活性の測定には、48時間培養後の対数増殖期にあるMDCK細胞を用いた。
【００４０】
インフルエンザウイルス増殖阻止実験は次の方法で行った。 12穴組織培養プレート(Nunc)に培養したMDCK細胞にインフルエンザウイルス(20PFU/well)を接種し、35℃で60分間MDCK細胞にウイルスを吸着させた。その後、リン酸緩衝食塩水(PBS, Sigma Co.)で細胞を2 回洗浄した。これにカフェー酸フェネチルエステル(CAPE)を添加した維持培養液(7.0% NaHCO3 (大塚製薬)5ml、5%牛血清アルブミン(BSA）8.0ml 、trypsin(2000単位)1.0ml、30% グルコース 2.0mlを含むDullubecco's modified eagle's medium(Gibco)200ml)2.0mlを加えた。コントロールとして、無添加またはカフェー酸（100ppm) 、カフェー酸メチル（100ppm) もしくはカフェー酸エチル（100ppm) 添加の維持培養液も同様に加えた。さらに35℃にした5%炭酸ガス孵卵器内で72時間培養後、プレートをそのまま凍結保存( −20℃) し、プラーク法でウイルス力価を測定した。なお、ウイルス力価を測定するときに、前記凍結培養物を2 回凍結融解させて細胞内に存在するウイルスを取り出し、遠心分離(2,000rpm, 10min) を行い、 細胞片を沈殿させ、上清のウイルスを含む溶液を回収し、これをウイルス液とした。
プラーク法は次の方法で行った。直径35mmのプラスチック組織培養シャーレ(Nunc)にMDCK細胞(2×105 個) を播込み、37℃、5%炭酸ガス孵卵器で培養して単層を形成させた。4 日後培養液を除いて、PBS で細胞を2 回洗浄した。次に10倍段階希釈した前記ウイルス液0.2ml をシャーレに接種し、35℃で60分間ウイルスをMDCK細胞に吸着させた。吸着後、PBS で細胞を2 回洗浄し、1.15% 寒天(Bact agar, Gibco)を含む維持培養液2ml を重層した。そのままの状態で35℃、5%炭酸ガス孵卵器を用いて培養を行い、3 日後、ニュートラルレッドを含む維持培養液を重層し、プラーク数を数えウイルス力価を算出した。そして、コントロールに対する比をインフルエンザウイルス増殖抑制率(%) とし、次式によりもとめた：
インフルエンザウイルスの増殖抑制率（％）＝[(Ｃ−Ｓ）／Ｃ] ×１００
Ｃ＝コントロールのウイルス力価
Ｓ＝供試試料のウイルス力価
結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
結果
インフルエンザウイルスは、感受性細胞に感染すると増殖にともない細胞の変性・壊死を引き起こす。これを細胞変性効果(Cytopathic effet, CPE) という。MDCK細胞を組織培養プレートで培養すると底面に単層を形成し、実体顕微鏡で観察すると図４Ａに示したように一面に細胞が増殖し、所々に腎細胞特有の細胞形態を観察することができた。次に、培養したMDCK細胞にウイルスを接種して60分間吸着させ、洗浄後、維持培養液を加え37℃で48時間培養すると、MDCK細胞の一部が丸く白い細胞に変性している様子 (CPE)を顕微鏡で観察することができた（図４Ｂ）。これら丸くて白い細胞はウイルスの増殖によって変性・壊死した細胞で、これによりウイルスがMDCK細胞に感染して増殖していること、つまり、CPE を確認することができた。さらに、培養したMDCK細胞にウイルスを接種して60分間吸着させ、洗浄後、カフェー酸フェネチルエステル(10ppm) を添加した維持培養液を加え37℃で48時間培養すると、CPE がほとんど観察されなかった（図４Ｃ）。
【００４２】
表２より、カフェー酸やカフェー酸のメチルまたはエチルエステルにはインフルエンザー増殖抑制効果は認められなかったのに対し、カフェー酸フェネチルエステル(10ppm) には高いインフルエンザウイルス増殖抑制効果(98.5%) が認められた。
【図面の簡単な説明】
【図１】製造例１で得られた化合物（カフェー酸フェネチルエステル）のＨＰＬＣの結果を示すグラフ
【図２】製造例１で得られた化合物（カフェー酸フェネチルエステル）のＬＣ−ＭＳの結果を示すグラフ
【図３】カフェー酸フェネチルエステルの抗酸化活性を示すグラフ
【図４】 MDCK細胞におけるインフルエンザウイルスの増殖抑制作用を示す顕微鏡写真（×１００）図中Ａはウイルス感染していないMDCK細胞、Ｂはウイルス感染したMDCK細胞、Ｃはウイルス感染後カフェー酸フェネチルエステルを添加（１０ｐｐｍ）して培養したMDCK細胞を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、抗インフルエンザ剤に関する。詳しくは、カフェー酸フェネチルエステルを有効成分とする抗インフルエンザ剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
カフェー酸フェネチルエステルは、プロポリス等に微量含まれる成分で、消炎作用、抗がん活性（例えば、非特許文献１または非特許文献２を参照）、Salmonella typhimurim に対する抗変異原活性、抗酸化活性、植物病原性糸状菌の発育阻害活性を有することが知られている。
【０００３】
カフェー酸フェネチルエステルを含むカフェー酸誘導体の工業分野への応用は最近になって行われるようになり、カフェー酸誘導体の日焼け防止組成物が（例えば、特許文献１参照）、あるいはカフェー酸誘導体を含むＨＩＶおよびレトロウイルスに関連する障害の処置または予防のための薬学的組成物が報告されている（例えば、特許文献２参照）。
【０００４】
【特許文献１】
特表平１０−５０１２１６号公報
【特許文献２】
特開２００２−２０２８３号公報
【非特許文献１】
「Cancer Letters」Elsevier Science Ireland Ltd. 2000, 157, p.31-38
【非特許文献２】
「Anti-Cancer Drugs 」Lippincott Williams & Wilkins 2001, 12, p.143-149 。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
カフェー酸フェネチルエステルの用途は、上記に示した如く限られており、その他の薬学的または機能的な利用、例えば医薬品、医薬部外品、さらには化粧品分野で有効に利用されたものは見当たらない。そこで、本発明の目的は、カフェー酸フェネチルエステルの新規かつ有用な用途を提供することにある。
【０００６】
【発明が解決するための手段】
本発明者らは、カフェー酸フェネチルエステルを合成、精製した後、その作用に関して鋭意研究を進めてきたところ、カフェー酸フェネチルエステルの抗酸化作用や抗菌作用を確認し、さらにはインフルエンザウイルスの増殖を抑制することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【０００７】
すなわち、本発明のインフルエンザウイルスの増殖抑制剤は、下記式：
【化３】
【０００８】
前記増殖抑制剤は、Ａ型インフルエンザウイルスの増殖を抑制することが好ましい。
【０００９】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、下記式：
【化４】
【００１０】
前記抗インフルエンザウイルス剤は、Ａ型インフルエンザウイルスを対象とすることが好ましい。
【００１１】
［作用効果］
本発明のインフルエンザウイルスの増殖抑制剤によれば、インフルエンザウイルス、特にＡ型インフルエンザウイルスの増殖を有効に抑制するという効果を奏する。
【００１２】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤によれば、インフルエンザウイルス、特にＡ型インフルエンザウイルスの増殖を抑制するとともに抗酸化作用および抗菌作用をも併せもつことにより、インフルエンザ予防剤または治療剤として有用である。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本発明においてインフルエンザウイルスとは、オルソミクソウイルス科に属し、ヒトまたはトリ、ブタ、ウマ等の動物に感染し、急性呼吸器感染症状と全身症状（インフルエンザ）を発症させるウイルスである。ヒトに感染するウイルスとして、Ａ型、Ｂ型およびＣ型インフルエンザウイルスが挙げられる。
【００１４】
本発明のインフルエンザウイルスの増殖抑制剤は、下記式：
【化５】
【００１５】
前記増殖抑制剤に有効成分として含まれるカフェー酸フェネチルエステルは、プロポリス等から単離された天然物でもよく、化学的に合成されたものでもよく、酵素を用いて生化学的に合成されたものでもよい。
【００１６】
化学的な合成方法としては、公知の化学合成法、例えば、カフェー酸とフェネチルアルコールを酸触媒存在下高温で反応させる方法、または塩化チオニルなどを用いてカフェー酸を塩素化した後フェネチルアルコールと反応させて合成する方法などが挙げられる。
【００１７】
酵素を用いた生化学的合成方法としては、例えば、前記特許文献１に記載のリパーゼ、エステラーゼなどの酵素によるクロロゲン酸のエステル交換反応が挙げられる。
【００１８】
前記増殖抑制剤中のカフェー酸フェネチルエステルの含有量は、インフルエンザウイルスの増殖を抑制しうる限り特に限定されるものではないが、通常０．００００３〜９９．９重量％程度であり、０．０００１〜０．０１重量％が好ましい。
【００１９】
インフルエンザウイルスの増殖抑制率は、インフルエンザウイルス感受性細胞に当該ウイルスを感染させ、感染前または感染後に被験物質を加え、感染後所定の期間に細胞内に存在するウイルスの力価をプラーク法にて定量することにより調べることができる。前記増殖抑制率は、被験物質を添加しないコントロールに対して５０％以上が好ましく、７０％以上がより好ましく、９０％以上がさらに好ましい。
【００２０】
カフェー酸フェネチルエステルは、固体状でもよく、有機溶媒、水もしくは熱水、またはこれらの混合溶媒に溶解させた状態でもよく、あるいは、精製過程で有機溶媒抽出と水抽出とが組み合わされた状態でもよい。前記有機溶媒としては、メタノール、エタノール、ｎ−ブタノール、アセトン、クロロホルム、酢酸エチル、ｎ−ヘキサン、1,3 −ブチレングリコール、プロピレングリコールなどを用いることができる。
【００２１】
前記増殖抑制剤の剤型は、溶液状、ペースト状、ゲル状または粉末状が挙げられる。
【００２２】
また、前記増殖抑制剤には、使用目的により、または前記剤型になるように、本発明の効果を損なわない範囲内で、化粧品、医薬品、医薬部外品等に一般的に用いられる各種成分を配合することができる。前記成分としては、例えば、油分（動植物油、鉱物油、エステル油、ワックス油、シリコン油、高級アルコール、リン脂質類、脂肪酸類等）、界面活性剤（アニオン性、カチオン性、両性または非イオン性界面活性剤）、ビタミン類（ビタミンＡ群、ビタミンＢ群、葉酸類、ニコチン酸類、パントテン酸類、ビオチン類、ビタミンＣ群、ビタミンＤ群、ビタミンＥ群、その他フェルラ酸、γ−オリザノール等）、紫外線吸収剤（ｐ−アミノ安息香酸、アントラニル、サルチル酸、クマリン、ベンゾトリアゾール、テトラゾール、イミダゾリン、ピリミジン、ジオキサン、フラン、ピロン、カンファー、核酸、アラントインおよびそれらの誘導体、アミノ酸系化合物、シコニン、バイカリン、バイカレイン、ベルベリン等）、抗酸化剤（ステアリン酸エステル、ノルジヒドログアセレテン酸、ジブチルヒドロキシトルエン、ブチルヒドロキシアニソール、パラヒドロキシアニソール、没食子酸プロピル、セサモール、セサモリン、ゴシポール等）、増粘剤（ヒドキシエチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドキシプロピルセルロース、ニトロセルロース、ポリビニルアルコール、ポリビニルメチルエーテル、ポリビニルピロリドン、ポリビニルメタアクリレート、ポリアクリル酸塩、カルボキシビニルポリマー、アラビアゴム、トラガントゴム、寒天、カゼイン、デキストリン、ゼラチン、ペクチン、デンプン、アルギン酸およびその塩等）、保湿剤（プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセリン、コンドロイチン硫酸およびその塩、ヒアルロン酸およびその塩、乳酸ナトリウム等）、低級アルコール、多価アルコール、水溶性高分子、ｐＨ調整剤、防腐・防バイ剤、着色料、香料、清涼剤、安定化剤、動・植物抽出物、動・植物性蛋白質およびその分解物、動・植物性多糖類およびその分解物、動・植物性糖蛋白質およびその分解物、微生物培養代謝成分、血流促進剤、消炎剤、抗炎症剤、抗アレルギー剤、細胞賦活剤、アミノ酸およびその塩、角質溶解剤、収斂剤、創傷治療剤、増泡剤、口腔用剤、消臭・脱臭剤が挙げられる。
【００２３】
本発明の抗インフルエンザウイルス剤は、前記カフェー酸フェネチルエステルを有効成分として含有するものである。
【００２４】
前記抗インフルエンザウイルス剤は、インフルエンザウイルスの感染に対する予防剤または治療剤として有用である。
【００２５】
前記抗インフルエンザウイルス剤中のカフェー酸フェネチルエステルの含有量は、インフルエンザウイルスの増殖を抑制しうる限り特に限定されるものではないが、通常０．００００３〜９９．９重量％程度であり、０．０００１〜０．０１重量％が好ましい。
【００２６】
前記抗インフルエンザウイルス剤の剤型は、溶液状、ペースト状、ゲル状または粉末状が挙げられ、感染予防剤または治療剤として適用する目的または部位に応じて適宜選択することができる。
【００２７】
前記抗インフルエンザウイルス剤には、選択する剤型に応じて、前記溶媒および各種成分の中から医薬品として許容されうるものを任意に配合することができる。
【００２８】
本発明のインフルエンザウイルスの増殖抑制剤および抗インフルエンザウイルス剤は、世界的な流行が繰り返され、症状の重いインフルエンザの原因ウイルス（Ａ型インフルエンザウイルス）の増殖を特に抑制することから、インフルエンザの流行を防止することが考えられる。また、抗インフルエンザウイルス剤は、ワクチンとの併用も効果的であると考えられる。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明の構成と効果を具体的に示す実施例等について説明するが、本発明は、これらの実施例等により限定されるものではない。
【００３０】
（製造例１）
カフェー酸フェネチルエステル（ＣＡＰＥ）の製造
本製造例で用いた方法は、クロロゲン酸を原料とし、酵素（エステラーゼ）によるエステル交換反応による酵素合成である。
フェネチルアルコール( 和光純薬工業株式会社) は、最終濃度で21.6%(v/v)とし、20.3mMクロロゲン酸( 東京化成工業株式会社) を含む0.05M リン酸緩衝液(pH 6.5)( フェネチルアルコール- 緩衝液)1.44ml を40℃で10分間予備加温後、同緩衝液でタンパク量を0.24mg/ml に調整したクロロゲン酸エステラーゼ( キッコーマン株式会社) 溶液0.36mlを添加して反応を開始した。40℃で60分間反応後、2Mトリクロロ酢酸を0.2ml 添加して、酵素反応を停止した。
【００３１】
反応生成物を分取用HPLCにかけ、目的のピークを分取した。分取した反応生成物画分をエバポレーターで減圧濃縮し、エタノールに溶解し、LC-MS で分子量を測定した。その結果を図１および図２に示す。
【００３２】
図１および図２より、得られた化合物は、カフェー酸フェネチルエステルであることが確認された。
【００３３】
（試験例１）
抗酸化効果
製造例１で得られた化合物がカフェー酸フェネチルエステルの公知の作用効果である抗酸化活性を有するかどうかを下記の方法に従って測定した。
0.1M酢酸緩衝液(pH5.5)2.0mlに、50%(v/v)エタノール-0.1M 酢酸緩衝液(pH5.5) に溶解したカフェー酸フェネチルエステル2.0ml と20mM 1,1- ジフェニル-2- ピクリルヒドラジル(DPPH, nacalai tesque Inc.)-エタノール溶液1.0ml を添加して、室温、暗黒条件下で正確に30分間保ち、 その溶液の吸光度(517nm) を測定した。カフェー酸フェネチルエステル濃度を変えて吸光度を測定し、横軸にカフェー酸フェネチルエステル濃度を縦軸に吸光度をプロットしてグラフを描き、近似直線からDPPHラジカルの吸光度( カフェー酸フェネチルエステル無添加のコントロール) を50% 減少させるのに必要なカフェー酸フェネチルエステル濃度(50%還元) を算出した。比較対照として、カフェー酸、アスコルビン酸、α- トコフェロールも同様の方法で測定した。結果を図３に示す。
【００３４】
図３より、カフェー酸フェネチルエステルは、22.47 μM の濃度でDPPHラジカルの吸光度を半減させた。また、同時に検討したカフェー酸の50% 還元は23.22 μM 、アスコルビン酸では30.67 μM 、α- トコフェロールでは26.77 μM であったことから、カフェー酸フェネチルエステルは、アスコルビン酸やα- トコフェロールよりも強いラジカル消去活性を示すことが示唆された。
【００３５】
本実験で検討したin vitroでのカフェー酸とカフェー酸フェネチルエステルのラジカル消去活性に顕著な差は認められなかったが、カフェー酸フェネチルエステルは細胞膜を通過して、細胞内で発生するH2O2が引き起こす障害を防御できるといわれており、in vivo ではカフェー酸よりカフェー酸フェネチルエステルの方が生理機能を発揮できると期待される。
【００３６】
（試験例２）
抗菌活性
抗菌活性は、日本化学療法学会標準法で示された固体培地法に従って最小発育阻止濃度(MIC) を測定することにより調べた。
被検菌にはStaphylococcus aureus IFO 12732 、Bacillus subtilis IFO 3134、Escherichia coli IFO 3301 、Pseudomonas aeruginosa IFO 3080 、Candida albicans IFO 1385 、Aspergillus niger IFO 4414を用いた。S. aureus ，B. subtilis ，E. coli ，P. aeruginosa はMuller-hinton broth(MHB)培地(Difco Lab.)、C.albicansとA.niger はサブロー培地(Difco Lab.)を用いて培養した。
【００３７】
細菌は37℃で18〜24時間、酵母は28℃で24時間培養し、1 ×106CFU/ml となるように菌液を調製した。カビはポテトデキストロース寒天(PDA) 培地( 日水製薬株式会社) に植菌し、28℃で72時間培養して形成された胞子を無菌的に集め、滅菌した0.05% Tween 80生理食塩水に懸濁し、1 ×106spore/ml となるように胞子を懸濁した。菌懸濁液および胞子懸濁液は、MHB およびPDA 平板培地に10倍段階希釈した液を塗抹、培養して形成されたコロニー数から濁度(660nm) と生菌数(CFU/ml)の関係をあらかじめ求めておいた。
フィルター(0.2μm, Millipore Co. USA) 滅菌した2 倍段階希釈のカフェー酸フェネチルエステル（CAPE）溶液1.5ml を高圧滅菌したMHB 寒天培地あるいはサブロー寒天培地13.5mlに添加し、滅菌シャーレに注ぎ込んでカフェー酸フェネチルエステル添加寒天培地を作成した。1 ×106CFU/ml に調製した菌液を、白金耳2cm 程度CAPE添加寒天培地に画線塗抹し、細菌は37℃で18〜20時間、酵母は28℃で24〜30時間、カビは28℃で48〜60時間培養して判定を行った。 カフェー酸フェネチルエステルの抗菌活性の結果を表１に示す。
【００３８】
【表１】
【００３９】
（実施例１）
抗ウイルス活性
製造例１で得られたカフェー酸フェネチルエステルを1 ％(v/v) エタノール溶液に10ppm となるように溶解し、培地で2 倍段階希釈した。抗ウイルス活性の測定に用いたインフルエンザウイルスは、国立感染症研究所より分与を得たInfluenzaAH1N1型ウイルス(A/USSR/92/77 株, A ソ連型) である。インフルエンザウイルス感受性細胞としては、 国立公衆衛生院より分与されたイヌの腎臓由来のMadin Darby Canine Kidney(MDCK) 細胞を用いた。
MDCK細胞の培養にはプラスチック組織培養シャーレ(Nunc. A/S, Denmark)を用い、7.0%炭酸水素ナトリウム水溶液( 大塚製薬株式会社) でpH 7.4に調整した次の培地を使用した。すなわち10% 仔牛血清(CS, Flow Laboratories) 、L-グルタミン(2.92 μg/ml) 、ペニシリンG カリウム(100U/ml) 、カナマイシン(60 μg/ml) 、硫酸ストレプトマイシン(100μg/ml) をふくむEagle's minimal essential medium(MEM, 日水製薬株式会社)5ml中で、37℃、5%炭酸ガス孵卵器培養を行った。抗ウイルス活性の測定には、48時間培養後の対数増殖期にあるMDCK細胞を用いた。
【００４０】
インフルエンザウイルス増殖阻止実験は次の方法で行った。 12穴組織培養プレート(Nunc)に培養したMDCK細胞にインフルエンザウイルス(20PFU/well)を接種し、35℃で60分間MDCK細胞にウイルスを吸着させた。その後、リン酸緩衝食塩水(PBS, Sigma Co.)で細胞を2 回洗浄した。これにカフェー酸フェネチルエステル(CAPE)を添加した維持培養液(7.0% NaHCO3 (大塚製薬)5ml、5%牛血清アルブミン(BSA）8.0ml 、trypsin(2000単位)1.0ml、30% グルコース 2.0mlを含むDullubecco's modified eagle's medium(Gibco)200ml)2.0mlを加えた。コントロールとして、無添加またはカフェー酸（100ppm) 、カフェー酸メチル（100ppm) もしくはカフェー酸エチル（100ppm) 添加の維持培養液も同様に加えた。さらに35℃にした5%炭酸ガス孵卵器内で72時間培養後、プレートをそのまま凍結保存( −20℃) し、プラーク法でウイルス力価を測定した。なお、ウイルス力価を測定するときに、前記凍結培養物を2 回凍結融解させて細胞内に存在するウイルスを取り出し、遠心分離(2,000rpm, 10min) を行い、 細胞片を沈殿させ、上清のウイルスを含む溶液を回収し、これをウイルス液とした。
プラーク法は次の方法で行った。直径35mmのプラスチック組織培養シャーレ(Nunc)にMDCK細胞(2×105 個) を播込み、37℃、5%炭酸ガス孵卵器で培養して単層を形成させた。4 日後培養液を除いて、PBS で細胞を2 回洗浄した。次に10倍段階希釈した前記ウイルス液0.2ml をシャーレに接種し、35℃で60分間ウイルスをMDCK細胞に吸着させた。吸着後、PBS で細胞を2 回洗浄し、1.15% 寒天(Bact agar, Gibco)を含む維持培養液2ml を重層した。そのままの状態で35℃、5%炭酸ガス孵卵器を用いて培養を行い、3 日後、ニュートラルレッドを含む維持培養液を重層し、プラーク数を数えウイルス力価を算出した。そして、コントロールに対する比をインフルエンザウイルス増殖抑制率(%) とし、次式によりもとめた：
インフルエンザウイルスの増殖抑制率（％）＝[(Ｃ−Ｓ）／Ｃ] ×１００
Ｃ＝コントロールのウイルス力価
Ｓ＝供試試料のウイルス力価
結果を表２に示す。
【００４１】
【表２】
インフルエンザウイルスは、感受性細胞に感染すると増殖にともない細胞の変性・壊死を引き起こす。これを細胞変性効果(Cytopathic effet, CPE) という。MDCK細胞を組織培養プレートで培養すると底面に単層を形成し、実体顕微鏡で観察すると図４Ａに示したように一面に細胞が増殖し、所々に腎細胞特有の細胞形態を観察することができた。次に、培養したMDCK細胞にウイルスを接種して60分間吸着させ、洗浄後、維持培養液を加え37℃で48時間培養すると、MDCK細胞の一部が丸く白い細胞に変性している様子 (CPE)を顕微鏡で観察することができた（図４Ｂ）。これら丸くて白い細胞はウイルスの増殖によって変性・壊死した細胞で、これによりウイルスがMDCK細胞に感染して増殖していること、つまり、CPE を確認することができた。さらに、培養したMDCK細胞にウイルスを接種して60分間吸着させ、洗浄後、カフェー酸フェネチルエステル(10ppm) を添加した維持培養液を加え37℃で48時間培養すると、CPE がほとんど観察されなかった（図４Ｃ）。
【００４２】
表２より、カフェー酸やカフェー酸のメチルまたはエチルエステルにはインフルエンザー増殖抑制効果は認められなかったのに対し、カフェー酸フェネチルエステル(10ppm) には高いインフルエンザウイルス増殖抑制効果(98.5%) が認められた。
【図面の簡単な説明】
【図１】製造例１で得られた化合物（カフェー酸フェネチルエステル）のＨＰＬＣの結果を示すグラフ
【図２】製造例１で得られた化合物（カフェー酸フェネチルエステル）のＬＣ−ＭＳの結果を示すグラフ
【図３】カフェー酸フェネチルエステルの抗酸化活性を示すグラフ
【図４】 MDCK細胞におけるインフルエンザウイルスの増殖抑制作用を示す顕微鏡写真（×１００）図中Ａはウイルス感染していないMDCK細胞、Ｂはウイルス感染したMDCK細胞、Ｃはウイルス感染後カフェー酸フェネチルエステルを添加（１０ｐｐｍ）して培養したMDCK細胞を示す。
Claims (4)
- 下記式：
- 前記インフルエンザウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである請求項１に記載の増殖抑制剤。
- 下記式：
- 前記インフルエンザウイルスがＡ型インフルエンザウイルスである請求項３に記載の抗インフルエンザウイルス剤。
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