JP4024313B2 - 新規なmapkキナーゼ - Google Patents
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Description
本発明は、脊椎動物に由来する新規なMAPKキナーゼ及びそれをコードするDNAに関する。更に詳細には、TNF−αによる刺激及び/又はFas抗原に対する刺激で活性化されてSAPK/JNKを活性化するが、p38は活性化しないMAPKキナーゼ及びそれをコードするDNAに関する。本発明のMAPKキナーゼ及びそれをコードするDNAを用いると、MAPKキナーゼカスケードの過剰な活性化又は阻害が関与する疾患の治療又は予防に有用な化合物のスクリーニングや、そのような疾患の診断剤を作成することができる。又、本発明は、上記DNAを複製可能なベクターに組込んでなる組換え体DNA;上記複製可能な組換え体DNAで形質転換された微生物又は細胞;上記MAPKキナーゼのドミナントネガティブ型のポリペプチド及びそれをコードするDNA;並びに上記MAPKキナーゼと結合しうる抗体に関する。
従来技術
MAP(mitogen-activated protein)キナーゼ(MAPK)は、当初インスリン〔Sturgill,T.W. et al., Biochim. Biophys.Acta 1092:350-357(1991)〕や種々の細胞増殖因子、又は発癌プロモーター〔Nishida,E. et al., Int.Rev.Cytol.138:211-238(1992)〕等の刺激によって活性化されるセリン/スレオニンキナーゼ(Ser/Thr kinase;即ち、蛋白質のセリン残基もしくはスレオニン残基をリン酸化することができる酵素)として1980年代後半に見出された。そして、およそ10年の研究の結果、MAPキナーゼは外界刺激に応答して、真核細胞の運命決定並びに機能制御を仲介する細胞内シグナル伝達の主要な構成要素であることが判明した〔Nishida,E et al., Trends Biochem.Sci.,18:128-131(1993);Marshall, C.J., Curr.Opin.Genet.Dev.,4:82-89(1994);Cobb,M.H. et al., J.Biol.Chem.,270:14843-14846(1995)〕。特に、1990年代の細胞生物学の大きな成果として、チロシンキナーゼ活性を有する細胞増殖因子受容体から、SH2(Src homology 2)とSH3(Src homology 3)からなるアダプター分子を経て、癌遺伝子産物であるGTP結合蛋白質のRas、更にセリン/スレオニンキナーゼをコードする癌遺伝子産物Raf−1を介してMAPキナーゼへ至るシグナル伝達経路が解明され、この経路が高等真核生物の増殖、分化及び発生を規定する中枢経路であることが明らかとなった。
シグナル伝達分子は、シグナル伝達経路の上流のシグナルを受けて活性型(on)になり、下流にシグナルを伝達した後に不活性型(off)へと戻るが、MAPキナーゼのon/offの調節機構には興味深い特徴がある。MAPキナーゼの活性化には、キナーゼサブドメインVIIとVIIIの境界領域にあるTEY(3文字略記ではThr-Glu-Tyr)の配列中のTとYがリン酸化されることが必須である。この両アミノ酸残基のリン酸化(即ち活性化)を触媒する酵素として見出されたのが、MAPKキナーゼ(MAPKK)又はMAPK/ERKキナーゼ(MEK)と呼ばれる酵素である。MAPKキナーゼはセリン/スレオニンと共にチロシンをリン酸化することもできるdual-specificity kinaseである。
更に、MAPKキナーゼの活性化には、キナーゼドメインVIIとVIIIの境界領域にある2つのセリン及び/又はスレオニン残基(即ち、2つのセリン残基、2つのスレオニン残基又はセリンとスレオニン残基)のリン酸化が必要で、このリン酸化を担うセリン/スレオニンキナーゼをMAPKKキナーゼ(MAPKKK)と総称する。前記のRaf-1はMAPKKキナーゼの一種であり、Ras→Raf-1(即ち、MAPKKK)→MAPKK→MAPKという連鎖は、シグナル伝達の主要経路の一つである。MAPKKK→MAPKK→MAPKという3分子からなるキナーゼの連鎖をMAPキナーゼシグナルカスケードと呼ぶ。
上記したRaf-1/MAPKKK→MAPKK→MAPKのシグナル伝達系は、MAPキナーゼシグナルカスケードで最初に同定されたことから、屡々、古典的MAPキナーゼシグナル経路とも呼ばれる。その後、この古典的MAPキナーゼに類似したキナーゼが多数存在することが明らかになった。一つはStress-Activated Protein Kinase(SAPK)と呼ばれるキナーゼで、細胞に蛋白合成阻害剤などの化学的ストレス、又は熱ショックや浸透圧変化などの物理的ストレスが加わった時に活性化されるキナーゼとして同定された〔Kyriakis,J.M., Nature,369:156-160(1994)〕。SAPKは、転写因子JunのN末端をリン酸化して転写活性を上昇させるキナーゼとして同時期に独立に同定されたc-Jun N-terminal Kinase(JNK)〔Derijard,B., Cell,76:1025-1037(1994)〕と同一である(以下、屡々、この酵素を“SAPK/JNK”と呼ぶ)。SAPK/JNKは古典的MAPキナーゼとの相同性を有し、MAPキナーゼが活性化される際に必要なTEY配列がTPY(Thr-Pro-Tyr)となっている。この配列のThrとTyrが単一の上流MAPKキナーゼによるリン酸化を受けて活性化されるというメカニズムは古典的MAPキナーゼと同じであるが、SAPK/JNKを活性化するMAPKキナーゼは、主にSAPK/ERK kinase-1(SEK1)又はmitogen-activated protein kinase kinase 4(MKK4)である(以下、屡々、この酵素を“SEK1/MKK4”と呼ぶ)〔Lin,A., et al., Science,268:286-290(1995), Sanchez,I., Nature,372:794-798(1994);Moriguchi,T., et al., J.Biol.Chem.,270:12969-12972(1995)〕。従って、古典的なMAPキナーゼに対しては古典的なMAPKキナーゼがシグナル伝達経路の上流因子として働き、別の新しいMAPキナーゼは別のMAPKキナーゼによって特異的にリン酸化(活性化)される。又、SAPK/JNKに至る経路の上流のMAPKKキナーゼとしてMEKKというキナーゼが知られているが、他にもMAPKKキナーゼとして働くキナーゼが存在すると予想される。
上記SAPK/JNKの他に、その分子量から単にp38と呼ばれるMAPキナーゼと類縁のキナーゼが知られており、リンパ球細胞を刺激した時に、早期にチロシンリン酸化される蛋白質として同定・クローニングされている〔Han,J., et al., Science,265:808-811(1994)〕。同時期に、リンパ球における炎症性のサイトカインの産生を抑制する薬剤cytokine-suppressive antiinflammatory drug(CSAID)に結合する蛋白質〔CSAID binding protein(CSBP)〕〔Lee,J.C., et al., Nature,372:739-746(1994)〕が同定されたが、この蛋白質も現在では、p38と同一であることが確認されている。更に、ストレス刺激で活性化するキナーゼとして独立に単離されたMPK2もp38と同じ分子である〔Rouse,J., et al., Cell,78:1027-1037(1994)〕(以下、屡々、この酵素を単に“p38”と呼ぶ)。p38においては、前述のTXY配列(ただし、Xは、任意のアミノ酸を示す)の真ん中がGであり、やはりこのThrとTyrが単一の上流MAPKキナーゼによってリン酸化された結果、活性化される。p38を特異的に活性化するMAPKキナーゼとしては、MKK3とMKK6が知られている〔Moriguchi,T., et al., J.Biol.Chem.,271:26981-26988(1996);Cuenda,A., et al., EMBO J.,15:4156-4164(1996)〕。古典的MAPキナーゼ、SAPK/JNK及びp38は互いに配列の相同性を有することからスーパーファミリーを形成しており、3者にそれぞれ特異的なMAPKキナーゼも互いに相同性を有し、MEK,SEK1/MKK4,MKK3,MKK6などが属するスーパーファミリーを形成している〔Kyriakis,J.M., et al., J.Biol.Chem.,271:24313-24316(1996);Davis,R.J., Trends Biochem.Sci.,19:470-473(1994)〕。一方、それぞれのMAPKキナーゼをリン酸化によって活性化する更に上流のMAPKKキナーゼどうしの相同性は比較的低く、Raf,TAK1,MEKK,MLK3,Ask1,MosなどのMAPKKキナーゼ活性を持つキナーゼ同士では、キナーゼドメイン内でも30%程度の相同性しかない。このことは、非常にバラエティーに富んだ刺激に応じて必要なMAPキナーゼシグナル伝達経路を特異的に起動するというシステムの合目的性とよく一致している。
SAPK/JNKとp38は、古典的MAPキナーゼを活性化する増殖因子の刺激ではほとんど活性化されないが、いずれも浸透圧ショックや熱ショックなどのストレスや、TNF−α(腫瘍壊死因子−α又はカケクチン)、IL−1などのサイトカインによって活性化される〔Kyriakis,J.M., et al., J.Biol.Chem.,271:24313-24316(1996);Davis,R.J., Trends Biochem.Sci.,19:470-473(1994)〕。又、細胞死を誘導するUV照射や血清・増殖因子除去などによっても活性化される〔Kyriakis,J.M., et al., J.Biol.Chem.,271:24313-24316(1996);Davis,R.J., Trends Biochem.Sci.,19:470-473(1994)〕。古典的なMAPキナーゼが、チロシンキナーゼ型の受容体から発せられるシグナルによって活性化されるのに対し、SAPK/JNKやp38の系は、その開始シグナルが非常に多様なのが特徴である。
上記したTNF−αは、炎症、組織障害、免疫応答、及び病変部への細胞侵入に多様な影響を及ぼすことから、自己免疫疾患や移植片対宿主病(GVHD)における関与が示唆されており〔J.Exp.Med., 166:1280(1987)〕、特にリウマチ様関節炎をはじめとする炎症性関節疾患の発症に関与すると考えられている〔Lancet, 11:244-247(1989), Ann.Rheumatic Dis. 51:480-486(1990)〕。抗TNF−α抗体は、投与を関節炎発症前に開始するか後に開始するかに関わらず、DBA/1マウスのコラーゲン関節炎に伴う炎症を軽減し、関節破壊の程度を顕著に低下させる〔Williams,R.O. et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 89:9784-9788(1992)〕。臨床的にも、キメラ抗TNF−α抗体が、慢性関節リウマチやクローン病の治療に有効であることが確認されている〔Derkx,B. et al., Lancet, 342:173-174(1993);Elliott,M.J. et al., Lancet, 344:1105-1110(1994);Elliott M.J. et al., Lancet, 344:1125-1127(1994)〕。
TNF−αのシグナル伝達機構の解析も進んでいる。TNF−αには2種類のリセプター、分子量55kDのTNF−R1と分子量75kDのTNF−R2があるが、最近、TNFレセプターに会合している分子群が酵母のtwo-hybrid systemを用いて直接クローニングされている。TNF−R1に会合している分子群としては、TRADD(TNF-R1 associated death domain protein)〔Hsu,H. et al., Cell, 81:495-504(1995)〕、TRAP1、TRAP2〔Song,H.Y. et al., J.Biol.Chem., 270:3574-3581(1995)〕、RIP〔Stanger,B.Z. et al., Cell, 81:513-523(1995)〕など、TNF−R2に会合する分子としては、TRAF1やTRAF2がクローニングされている〔Rothe,M. et al., Cell, 78:681-692(1994)〕。このようにTNFリセプターと会合する分子が同定される一方、近年、TNF−αでNF−κB、セラミドキナーゼ、MAPキナーゼも活性化されることが明らかになった。細胞透過性のセラミド誘導体であるC8−Cer(N−オクタノイルスフィンゴシン)やC2−Cer(N−アセチルスフィンゴシン)がTNF−αに類似した作用を発揮することが報告されており〔Kolesnick,R. et al., Cell, 77:325-328(1994)〕、MAPキナーゼやセラミドキナーゼを活性化するとされている。このように、TNF−αのシグナル伝達機構に関する理解は急速に進んでいるが、TRADDをはじめとするレセプター会合蛋白質とキナーゼとの活性化機構の関係や、TNF−αで活性化されるMAPキナーゼカスケードなど、未解決の問題も数多く残されている。
上記したSEK1/MKK4は、SAPK/JNKをリン酸化することが現在知られている唯一のMAPKキナーゼである。しかし、TNF−αによる刺激でSAPK/JNKはリン酸化されるが、SEK1/MKK4は活性化されない。このことから、本発明者らは、TNF−αで活性化され、SAPK/JNKを基質として活性化する未同定のMAPKキナーゼが存在すると推測した。即ち、本発明の課題は、TNF−αで活性化され、SAPK/JNKをリン酸化する新規なMAPKキナーゼ遺伝子とその蛋白質を見出し、これを医薬・医療の分野で利用する方法を提供することにある。
発明の概要
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、Xenopus Oocytes(アフリカツメガエル卵母細胞)のcDNAライブラリーから、ショウジョウバエのMAPKキナーゼであるHepに類似する新規なMAPKキナーゼの断片をクローニングすることに成功した。そしてこの新規MAPKキナーゼ断片をプローブとしてMouse Brain(マウス脳)のcDNAライブラリーのスクリーニングを行い、構造上MAPKキナーゼファミリーに属する新規なマウスのMAPKキナーゼ(以下、屡々、MKK7という)をクローニングすることに成功した。更に発明者らは、この新規マウスMAPKキナーゼの塩基配列をもとに、EST(Expressed Sequence Tag)データベース上でヒト型MKK7と推定されるクローンを発見し、その配列をもとに、ヒト心臓mRNAからヒト型MKK7の全長塩基配列をクローニングすることに成功した。そして、更に上記マウスMKK7が公知のSEK1やMKK6とは異なり、p38やSAPK3を活性化することなく、SAPKを特異的に活性化するMAPKキナーゼであり、生体内でTNF−αからSAPK/JNKへのシグナル伝達に深く関与していることを確認した。又、MKK7がFas抗原から誘導されるアポトーシスシグナルにも関与している可能性を見出し、本発明を完成させるに至った。
従って、本発明の主たる1つの目的は、以下のMAPKキナーゼを提供することにある。脊椎動物に由来する実質的に純粋なMAPKキナーゼであって、次の特徴を有するMAPKキナーゼ。
(a)TNF−αによる刺激及び/又はFas抗原に対する刺激で活性化される。
(b)SAPK/JNKを活性化する。
(c)p38は活性化しない。
本発明の他の1つの目的は、上記MAPKキナーゼをコードするDNAを提供することにある。
本発明の更に他の1つの目的は、上記MAPKキナーゼのドミナントネガティブ型であって、TNF−αによって誘導されるSAPK/JNKの活性化を抑制するポリペプチドを提供することである。
本発明の更に他の1つの目的は、上記MAPKキナーゼによるSAPK/JNKの活性化を阻害する物質をスクリーニングする方法を提供することにある。
本発明の上記及び他の諸目的、諸特徴並びに諸利益は、添付の配列表を参照しながら述べる次の詳細な説明及び請求の範囲の記載から明らかになる。
配列表の簡単な説明
以下に述べる各配列番号の塩基配列において、左側端部及び右側端部はそれぞれ5’末端及び3’末端であり、アミノ酸配列においては、左側端部及び右側端部はそれぞれN末端及びC末端である。
配列番号1は、ヒト心臓由来のMKK7のcDNA塩基配列と、該配列がコードする全長アミノ酸配列であり;
配列番号2は、ヒト心臓由来のMKK7の全長アミノ酸配列であり;
配列番号3は、マウス脳由来のMKK7のcDNA塩基配列と、該配列がコードする全長アミノ酸配列であり;
配列番号4は、マウス脳由来のMKK7の全長アミノ酸配列であり;
配列番号5は、マウス脳由来のMKK7のオルタナティブスプライシング(alternative splicing)産物のcDNA塩基配列と、該配列がコードするアミノ酸配列であり;
配列番号6は、マウス脳由来のMKK7のオルタナティブスプライシング産物のアミノ酸配列であり;
配列番号7は、Xenopus由来のMKK7の断片のcDNA塩基配列と、該配列がコードするアミノ酸配列であり;
配列番号8は、Xenopus由来のMKK7断片のアミノ酸配列であり;
配列番号9は、配列番号3の塩基配列を基に合成したドミナントネガティブ型MKK7の塩基配列と、該配列がコードするアミノ酸配列であり;
配列番号10は、合成したドミナントネガティブ型MKK7のアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
添付の図面において、
図1は、マウスMKK7、ショウジョウバエ(Drosophila)のHep、及びマウスSEK1のアミノ酸配列を比較した図であり、図中−は、空欄、影は影内のアミノ酸配列が同一であることを表し;
図2は、実施例3で行ったマウスの各臓器におけるMKK7のNorthern blotであり;
図3は、実施例5において確認したマウスMAPKキナーゼ(MKK7,MKK6,SEK1)のMAPキナーゼ(MAPK,SAPK,p38,SAPK3)に対する基質特異性を示すSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動図であり、図中+は、測定系にそのキナーゼを添加したことを示し、−は添加しなかったことを示し;
図4は、実施例6で行ったSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果であり、マウスMKK7がTNF−αで活性化されるが、マウスSEKl/MKK4は活性化されないことを示す図であり;
図5は、実施例7で行ったマウスMKK7のドミナントネガティブ型であるMKK7KLを発現させると、SAPK/JNKの活性化が抑制されることを示す電気泳動の結果であり;
図6は、実施例8で行ったマウスSAPK/JNKとMKK7はFas抗原に対する刺激で活性化されることを示す電気泳動の結果であり;
図7は、実施例9で行った活性化型MKK7がJNK1をリン酸化することを示すドットハイブリダイゼーションの結果であり、活性型MKK7の濃度に依存して、JNK1のリン酸化を意味するドットの濃さが増大することを示す。
発明の詳細な説明
本発明の一つの態様によれば、脊椎動物に由来する実質的に純粋なMAPK(mitogen-activated protein kinase)キナーゼであって、次の特徴を有するMAPKキナーゼが提供される。
(a)TNF−αによる刺激及び/又はFas抗原に対する刺激で活性化される。
(b)SAPK/JNKを活性化する。
(c)p38は活性化しない。
次に、本発明の理解を容易にするために、まず本発明の基本的特徴及び好ましい態様を列挙する。
1.脊椎動物に由来する実質的に純粋なMAPK(mitogen-activated protein kinase)キナーゼであって、次の特徴を有するMAPKキナーゼ。
(a)TNF−αによる刺激及び/又はFas抗原に対する刺激で活性化される。
(b)SAPK/JNKを活性化する。
(c)p38は活性化しない。
2.該MAPKキナーゼが、配列番号2、4及び6からなる群より選ばれるアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなることを特徴とする前項1に記載のMAPKキナーゼ。
3.前項1又は2に記載のMAPKキナーゼをコードするDNA。
4.該DNAが、配列番号1、3及び5からなる群より選ばれる塩基配列、あるいは該塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなることを特徴とする前項3に記載のDNA。
5.前項3又は4に記載のDNAを複製可能なベクターに組み込んでなる複製可能な組換え体DNA
6.前項5に記載の複製可能な組換え体DNAで形質転換された微生物又は細胞。
7.前項1又は2に記載のMAPKキナーゼのドミナントネガティブ型のポリペプチドであって、該ポリペプチドはキナーゼ活性のみを欠損した該MAPKキナーゼであり、TNF−αによって誘導されるMAPKキナーゼによるSAPK/JNKの活性化を抑制するポリペプチド。
8.該ポリペプチドが、配列番号10のアミノ酸配列、あるいは該アミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなることを特徴とする前項7に記載のポリペプチド。
9.前項7又は8に記載のポリペプチドをコードするDNA。
10.該DNAが、配列番号9の塩基配列、あるいは該塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなることを特徴とする前項9に記載のDNA。
11.前項9又は10に記載のDNAを複製可能なベクターに組込んでなる複製可能な組換え体DNA。
12.前項11に記載の複製可能な組換え体DNAで形質転換された微生物又は細胞。
13.前項1又は2に記載のMAPKキナーゼであって、活性化に必要なセリン残基及び/又はスレオニン残基がリン酸化されていることを特徴とする活性型MAPKキナーゼ。
14.MAPKキナーゼの活性を阻害する物質をスクリーニングする方法にして、前項1又は2に記載のMAPKキナーゼ及び/又は前項13に記載の活性型MAPKキナーゼを、SAPK/JNKと共に、サンプル材料と接触せしめ、そしてSAPK/JNKの活性化の阻害を指標として、MAPKキナーゼの活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
15.前項1又は2に記載のMAPKキナーゼ、あるいは前項13に記載の活性型MAPKキナーゼと特異的に結合しうる抗体。
以下、本発明について具体的に説明する。
尚、本発明において、DNA塩基配列中のAはアデニン、Cはシトシン、Gはグアニン、Tはチミンを示す。
また、本発明においては、3文字表示で、アミノ酸配列中のAlaはアラニン、Argはアルギニン、Asnはアスパラギン、Aspはアスパラギン酸、Cysはシステイン、Glnはグルタミン、Gluはグルタミン酸、Glyはグリシン、Hisはヒスチジン、Ileはイソロイシン、Leuはロイシン、Lysはリジン、Metはメチオニン、Pheはフェニルアラニン、Proはプロリン、Serはセリン、Thrはスレオニン、Trpはトリプトファン、Tyrはチロシン、Valはバリンである。
更に、本発明においては、1文字表示で、アミノ酸配列中のAはアラニン、Rはアルギニン、Nはアスパラギン、Dはアスパラギン酸、Cはシステイン、Qはグルタミン、Eはグルタミン酸、Gはグリシン、Hはヒスチジン、Iはイソロイシン、Lはロイシン、Kはリジン、Mはメチオニン、Fはフェニルアラニン、Pはプロリン、Sはセリン、Tはスレオニン、Wはトリプトファン、Yはチロシン、Vはバリンである。
本発明において「ポリペプチド」とは、一般的に当業者にペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、蛋白質等として理解されているものを含む。従って、天然の蛋白質や、化学合成又は組換え技術によって得られたポリペプチドやペプチドも含まれており、ポリペプチドは糖鎖の結合やリン酸化などの翻訳後修飾を受けていても、受けていなくても良い。
本発明でいう「MAPKキナーゼ」とは、MAPキナーゼカスケード系において、MAPキナーゼをリン酸化して活性化する蛋白質リン酸化酵素群である。公知のMAPKキナーゼとしては、MKK3、MKK4、MKK6等が挙げられる。例えば、MKK4は、MAPキナーゼの一つであるp38の180番目のThrと182番目のTyrをリン酸化して活性化し、更に、別のMAPキナーゼであるSAPK/JNKの183番目のThrと185番目のTyrをリン酸化して活性化する。本発明の新規MAPKキナーゼであるMKK7もMAPキナーゼをリン酸化することによって活性化する酵素であり、具体的には、上記MKK4とは異なり、SAPK/JNKを特異的に活性化するが、p38は活性化しない酵素である。
本発明でいう「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」とは、自然界において見出される対立遺伝子変異や自然突然変異、更には、人為的な突然変異や遺伝子組換え技術を用いて得られる変異体のアミノ酸配列を意味する。又、MKK7のオルタナティブスプライシング(alternative splicing)産物が本発明者らによってcDNAレベル及びWestern Blottingで確認されているため、オルタナティブスプライシング産物も本発明のMKK7に含まれる。マウスMKK7のオルタナティブスプライシング産物は、N末端付近及びC末端のアミノ酸配列が一部欠失しているが、本発明の新規MAPKキナーゼの特徴を有するものである(その配列を配列番号5及び6に記載した)。
本発明に包含されるアミノ酸配列は、全て本発明の新規MAPKキナーゼの活性を有するポリペプチドであり、たとえ1つのアミノ酸残基の改変であっても、その活性を損失させるような変化を含むアミノ酸配列は本発明には含まれない。従って、「1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」は、配列番号2、4又は6に記載した本発明のMAPKキナーゼのアミノ酸配列に存在するキナーゼドメインI〜XIからなる領域(セリン/スレオニンキナーゼに共通する、活性に携わる領域)を保存するアミノ酸配列であり、特にその中でも活性に非常に重要であると考えられる15個のアミノ酸残基[Hanks, S.K. and Quinn, A.M., Method in Enzymology, vol. 200, pp. 38-62(1991)]を有するアミノ酸配列である。具体的には、本発明のマウスMKK7のキナーゼ領域は、配列番号4のアミノ酸配列の136番〜396番からなる配列であり、その中で非常に重要であると考えられる15個のアミノ酸残基は、143番のGly、145番のGly、150番のVal、165番のLys、175番のGlu、259番のAsp、261番のLys、264番のAsn、277番のAsp、279番のGly、302番のPro、303番のGlu、320番のAsp、325番のGly、及び384番のArgである。尚、本発明のヒトMKK7(配列番号2)にも、上記のマウスMKK7のキナーゼ領域に対応する領域及び重要であると考えられる15個のアミノ酸が存在する。
本発明でいう「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列」とは、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件、例えば温度や塩濃度を適当に変化させることにより、非特異的なハイブリダイゼーションを減少させた条件下で同定される、高度に相補的な塩基配列を意味する。具体的には、1.0×SSC、0.1%SDS、55℃のような、ハイブリダイズするポリヌクレオチド間の特異性を保証する条件でハイブリダイズする塩基配列であり、本発明のMAPKキナーゼをコードするDNAの塩基配列と少なくとも80%の相同性を有する塩基配列である。
本発明でいう「ドミナントネガティブ型」のポリペプチドとは、キナーゼ活性だけを欠いたMKK7であり、上記のMKK7のキナーゼドメインを一部を改変したポリペプチドである。ドミナントネガティブ型のポリペプチドは、キナーゼネガティブとも呼ばれ、MKK7と共存すると、MKK7のキナーゼ活性を阻害することができる。本発明のドミナントネガティブ型のポリペプチドの一例であるMKK7KLは、MKK7によるSAPK/JNKの活性化を阻害するポリペプチドであり、配列番号4のマウスMKK7のキナーゼドメインに存在する165番目のLys(K)をLeu(L)に置換したアミノ酸配列である(MKK7KLの配列を配列番号9及び10に記載した)。本発明に包含されるMAPKキナーゼのドミナントネガティブ型は上記のMKK7KLに限定されるものではなく、配列番号1〜6に記載のヒト及びマウスの塩基及びアミノ酸配列を基に、キナーゼ活性のみを欠いたポリペプチドを作成することは容易である。又、配列番号10のMKK7KLのアミノ酸配列に限定されるものでもなく、そのドミナントネガティブ型としての機能を損失させない範囲でアミノ酸配列を改変することもできる。具体的には、配列番号10のMKK7KLのアミノ酸配列に存在するキナーゼ領域を保存するアミノ酸配列であれば、その他の部分に1若しくは数個のアミノ酸の欠失、置換若しくは付加が存在するMKK7KLの変異体であってもよい。
次に、本発明の基本的特徴を更に明らかにするために、本発明の完成に至る経緯を追いながら、本発明に包含される技術的諸特徴について説明する。
新規MAPKキナーゼをクローニングする目的で公知のヒトMKK3をプローブとし、Xenopus Oocytes(アフリカツメガエル卵母細胞)のcDNAライブラリーをクロスハイブリダイゼーションによってスクリーニングした。その結果、ショウジョウバエのMAPKキナーゼであるHepに類似する、配列番号7及び8に記載した新規Xenopus MAPKキナーゼの断片をクローニングすることに成功した。Hepはショウジョウバエの胚発生において重要な役割を担う酵素であると考えられており〔Glise,B. et al., Cell,83:451-461(1995)〕、従来、Hepに対応する哺乳類のMAPKキナーゼは見つかっておらず、Hepと、ヒトのMAPKキナーゼであるMKK3及びMKK4とのアミノ酸配列の相同性は、それぞれ48%及び56%である。
ショウジョウバエ以外の生物にもHepに相同なMAPK、キナーゼが見出されたことから、哺乳類にも同様のMAPKキナーゼが存在する可能性が示唆された。哺乳類におけるHep相同キナーゼをクローニングする目的で、上記のXenopus由来の新規MAPKキナーゼ断片をプローブとしてMouse Brain(マウス脳)のcDNAライブラリーのスクリーニングを行った。その結果、構造上MAPKキナーゼファミリーに属する、配列番号3及び4に記載した新規なマウスMAPKキナーゼをクローニングすることに成功した。
このマウスMAPKキナーゼは、これまでに知られているどの哺乳類のMAPKキナーゼとも異なり、最も相同性の高いキナーゼがショウジョウバエのHepである。キナーゼドメインにおける、このマウスMAPKキナーゼとショウジョウバエのHepとのアミノ酸配列の相同性は69%であるが、このマウスキナーゼとマウスSEK1/MKK4との相同性はわずか53%であるため、今回クローニングに成功したMAPKキナーゼはよりHepに近い分子であることが判明した(図1を参照)。従って、このMAPKキナーゼは哺乳類におけるHepのホモログであると考えられる。
この新規MAPKキナーゼをMKK7と命名した。マウスMKK7をコードするプラスミドベクターをE. coliに導入し、E. coli: DH5-pBluemMKK7(受託番号FERM BP-6397)として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所[日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号(郵便番号305−0046)]に平成9年6月26日(原寄託日)に国際寄託した。
本発明者らは、更にこのマウスMKK7の塩基配列をもとにESTデータベースを検索したところ、ヒト型MKK7と推定されるクローン2種(共に無作為に抽出したヒトmRNAから作ったcDNA)を発見した。データベースから得られた配列をもとに、ヒト心臓mRNAより5’RACE(rapid amplification of cDNA end)法、3’RACE法及びPCR法を用いて、配列番号1及び2に記載のヒトのMKK7の全長をクローニングした。マウスMKK7とヒトMKK7とのアミノ酸配列の相同性は91%であった。
ヒトMKK7をE. Coliに導入し、E. Coli:DH5-pTrCHisBhMKK7(寄託番号:FERM BP-6398)として通商産業省工業技術院生命工学技術研究所[日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号(郵便番号305−0046)に平成9年8月8日(原寄託日)に国際寄託した。
次に、マウスMKK7の生体内における発現をノザンブロット法により調べたところ、ほぼすべての臓器でmRNAは発現しており、特に心臓や骨格筋で強く発現していることが確認された(図2を参照)。
MKK7はその一次構造からMAPKキナーゼファミリーに属することはほぼ確実であったため、次に各種MAPキナーゼを基質として用い、MAPKキナーゼによるMAPキナーゼの活性化を測定した。MAPKキナーゼとしてはMKK7、MKK6、SEK1を、MAPキナーゼとしてはMAPK、SAPK、p38、SAPK3をそれぞれ異なる組み合わせで細胞内に共導入し、その後、各MAPキナーゼの活性を、遺伝子導入細胞によるMAPキナーゼに対応する基質のリン酸化を測定することにより決定した。すると、マウスMKK7は、SEK1やMKK6とは異なり、p38やSAPK3を活性化することなく、SAPKのみを特異的に活性化した(図3を参照)。更に、MKK7がむしろp38の活性を抑制する可能性が実験結果によって示唆された。又、MKK7の至適pHはpH7〜8の間であり、70℃以上で失活することが判明した。
これまではin vitroの実験結果などから、MAPキナーゼシグナルカスケードにおけるSAPK/JNKの上流のMAPKキナーゼはSEK1/MKK4であると考えられていたが、SAPK/JNKがTNF−αによって強く活性化を受けるのに対し、SEK1/MKK4の活性化はTNF−αによる刺激に依存しない(図4を参照)。従って、実際に生体内でSAPK/JNKの上流のMAPKキナーゼとして働いているキナーゼは、SEK1/MKK4以外にも存在する可能性が考えられていた。そして、上記の結果から、本発明のMAPKキナーゼであるMKK7が、SAPK/JNKの上流のMAPKキナーゼであって、TNF−αによって誘導されるMAPKKK→MKK7→SAPK/JNKというシグナルカスケードを形成していることが明らかとなった。
更にMKK7が真のSAPK/JNKを活性化する上流のMAPKキナーゼであることを実証するために、まずマウスMKK7の活性化がTNF−αによって誘導されることを確認した(図4を参照)。次に、ドミナントネガティブ型のマウスMKK7を作成して細胞内で発現させたところ、このドミナントネガティブ型MKK7を発現する細胞においては、TNF−αによる刺激に依存するSAPK/JNKの活性化は抑制された(図5を参照)。以上の結果から、MKK7が生体内でTNF−αからSAPK/JNKへのシグナル伝達に深く関与しているキナーゼであることを実証した。
又、SAPK/JNKやp38がアポトーシスへ関与しているという近年のデータ[Xia,Z. et al., Science,270:1326-1331(1995); Verheij,M. et al., Nature,380:75-79(1996); Santana,P. et al., Cell,86:189-199(1996)]や、アポトーシスを誘導するASK1というMAPKKキナーゼ[Ichijo,H.et al., Science,275:90-94(1997)]についての報告などから、MAPキナーゼカスケードがアポトーシスに関与すると考えられており、この考えに基づき、本発明者らはMKK7のアポトーシスへの関与をFas抗原を刺激することによって検討した。Fas抗原は、APO−1、CD95とも呼ばれる細胞にアポトーシスを誘導するリセプターで、TNF/NGFレセプターファミリーに属するI型膜蛋白質である[Suda,T. et al., Cell,75:1169-1178(1993)]。抗Fas抗体(CH-11)を用いて細胞のFas抗原を刺激し、その際のSAPK/JNK及びMKK7の活性を測定した。その結果、SAPK/JNKとMKK7は共にFas抗原からのシグナルによって活性化されることが明らかとなった(図6を参照)。上記の結果は、MKK7がSAPK/JNKと共に、Fas抗原によって伝達されるアポトーシスシグナルの伝達に関与している可能性を示唆している。
本発明では、TNF−αによる刺激又はFas抗原が刺激されることによって活性化され、SAPK/JNKを活性化するがp38は活性化しない、新規MAPKキナーゼMKK7をコードするcDNAがクローニングされた。本発明でクローニングされたDNAの塩基配列は、プロモーター、オペレーター、エンハンサーのような転写調節配列や、終止配列、並びにMKK7の発現を制御する他の調節配列を含む、宿主細胞内で発現可能な発現ベクターに連結させることができる。本発明で用いられる発現ベクターは、宿主細胞に導入することが可能であり、宿主細胞内で複製し、ベクターに挿入されたDNAを発現することが可能なベクターであれば特に限定されない。発現ベクターは、原核生物性もしくは真核生物性のいずれでもよく、典型的なベクターとしてはウィルスもしくはプラスミドが用いられる。
本発明のいずれかの塩基配列を含む組換えDNAで形質転換された微生物又は細胞は、形質転換、即ち、塩基配列を細胞内へ導入する方法を用いて作成することができる。形質転換技術としては、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション等が挙げられるが、これらには限定されるものではない。又、上記したように、組換えDNA技術を用いて、MKK7の発現を調節することもできる。例えば、適切な制御因子をMKK7配列と連結させた後で、宿主細胞をこの組換えMKK7配列で形質転換することにより、所望の発現を達成することができる。宿主細胞内での塩基配列のコピー数、それらの塩基配列が転写される効率、翻訳される効率及び翻訳後修飾等の効率は、宿主となる微生物又は細胞や、組換えDNAの構成を操作することによって、制御することが可能である。
本発明のMKK7のポリペプチド及びDNAは、MAPキナーゼカスケードにおいて、MKK7の機能を調節する化合物の同定に有用である。上記した「MKK7の機能の調節」には、MKK7の活性化とその活性の阻害が含まれるが、特にMKK7の活性を阻害する化合物には様々な用途がある。このような化合物は、MKK7によるMAPキナーゼカスケードの過剰な活性化又は阻害が、少なくとも部分的には発症に関与するような疾患の治療又は予防に有効である。本発明において、MKK7のドミナントネガティブ型が、TNF−αによるSAPK/JNKの活性化を抑制することから、MKK7が実際にTNF−αによって誘導される細胞内シグナル伝達の一部を担っていることを証明した。TNF−αが自己免疫疾患や炎症反応の誘因もしくは進展に関与していることを考慮すると、MKK7も上記の疾患において重要な役割を担うものと予想される。
上記したように、本発明では、Fas抗原が刺激されることによってもMKK7が活性化されて、SAPK/JNKを活性化することを明らかにした。このことは、MKK7がFas抗原に対する刺激やTNF−αによって誘導されるアポトーシスシグナルの伝達に関わっている可能性を示唆している。アポトーシスの抑制が治療につながる疾患としては、GVHD、Toxic epidermal necrolysis(TEN)などの皮膚疾患、増殖性腎炎(IgA腎症、紫斑病性腎炎、ループス腎炎)、劇症肝炎などが挙げられる。逆に、アポトーシスの誘導が治療につながる疾患としては、腫瘍が挙げられる。MKK7は、ストレスによっても活性化されることが明らかとなっており、ストレスによって起こる病態である虚血性心疾患、熱や放射線(UV、X線、γ線、β線など)による火傷などの治療への応用も考えられる。
本発明のMKK7に特異的に作用する化合物、特にMKK7の活性を阻害する化合物のスクリーニング方法としては、例えば実施例5の実験系を使用することができる。具体的には、図3に示す+MKK7+SAPK+c-Junの系において、c-Junのリン酸化のみが抑制され、他の系には影響しない化合物をスクリーニングすれば、MKK7に特異的な阻害剤を選択することができる。別のスクリーニング方法としては、細胞表面レセプター、例えばTNFレセプターやFas抗原から開始するシグナルを調節することが可能な化合物を同定する方法も考えられる。この方法においては、(1)レセプターとMKK7を発現する細胞を化合物と接触させ、(2)次に細胞をレセプターのリガンドと接触させ、(3)SAPK/JNKの活性を測定することにより、化合物がMKK7の活性に与える影響を評価することができる。しかしながら、本発明のスクリーニング方法は上記の方法に限定されるものではない。上記の方法においては、MKK7は細胞内で自然にリン酸化を受けることによって活性化されているが、別の方法として、実施例9に示した実験系を用いてMKK7を積極的にリン酸化し、活性化することによってスクリーニングを実行することもできる。活性化されているMKK7においでは、MAPKキナーゼの活性化に必要なセリン残基及び/又はスレオニ残基がリン酸化されている。又、リン酸化を受けないMKK7が極めて弱いながらも活性を持つ可能性も考えられるので、大量の非リン酸化型MKK7を用いてその阻害剤をスクリーニングすることも可能である。
スクリーニングに使用できる化合物は、高分子であっても経口投与可能な低分子化合物であってもよい。このようにしてスクリーニングされたMKK7特異的阻害剤は、例えばTNF−αの作用の一部をブロックするが、それ以外には影響しない、特異的な抗炎症剤又は慢性関節リウマチなどの自己免疫疾患の治療薬としての用途が考えられる。
又、本発明のMKK7の塩基配列をもとに、それと相補的なMKK7に特異的アンチセンスを設計することは容易である。ここでいうアンチセンスとは、MKK7をコードするmRNA又はDNAの少なくとも一部に相補的なポリヌクレオチド(DNA,RNAなど)であり、MKK7の転写及び翻訳を阻害するものをいう。具体的には、アンチセンスとして用いることができるポリヌクレオチドは、MKK7をコードする塩基配列の連続した12塩基以上の配列に対して100%の相同性を有するポリヌクレオチド配列である。更に、本発明の形質転換体を用いて、そのアンチセンスの効果を確認することもできる。更に、MKK7遺伝子は、癌、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、及び炎症性応答を初めとする様々な疾患の治療を目的とした遺伝子治療にも有用である。遺伝子治療とは、疾病の治療を目的として、遺伝子又は遺伝子を導入した細胞をヒトの体内に投与することを意味する。
本発明のMKK7蛋白質やDNAは、診断目的にも使用できる。本発明のMKK7で形質転換された細胞を使ってMKK7を大量に生産し、その蛋白質を用いて、MKK7に特異的なモノクローナル抗体を得ることは容易である。免疫抗原としては、ヒト又はマウスMKK7の全長を用いても、MKK7のアミノ酸配列の連続した少くとも5アミノ酸残基からなる断片を用いても良い。抗体には、完全な抗体の他に、抗原結合部位を含んだ断片であるFab, F(ab')2, Fv, scFvなども含まれる。このような抗体を用いれば、細胞や組織中のMKK7蛋白質の検出を目的としたELISAやRIA、又はウェスタンブロット系を構築することが可能である。このような検出系は診断目的に使用できる。又、MKK7のmRNAに特異的なプローブを用いて細胞や組織のMKK7の発現を検出することもできるので(実施例3及び図2を参照)、この様なプローブも診断的アッセイに利用することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例に何ら限定されるものではない。
実施例1
マウスMKK7のクローニング
まず、本発明の新規マウスMKK7遺伝子のクローニングについて具体的に説明する。ヒトMKK3遺伝子の翻訳領域全体をプローブとして用い、アフリカツメガエル卵母細胞のライブラリー(Xenopus laevis, oocytes 5'-STRETCH cDNA library;米国、CLONTECH社製)に対して、プラークハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のフィルターを2×SSC、0.1%SDS存在下、42℃の条件で洗浄したところ、合計12万個のプラークから10個の陽性クローンが得られた。得られた陽性クローンの塩基配列を解析したところ、ショウジョウバエのHepと相同性の高い新規なキナーゼをコードしているクローンが3個単離された。このXenopusのキナーゼ遺伝子断片の塩基配列を配列番号7に示した。
次に、この新規なXenopus laevisのキナーゼ遺伝子断片をプローブとしてマウス脳cDNAライブラリー(Mouse brain cDNA library Uni-ZapTM XR vector;米国、STRATAGENE CLONING SYSTEMS社製)に対してプラークハイブリダイゼーションによるスクリーニングを行った。ハイブリダイゼーション後のフィルターを2×SSC、0.1%SDS、42℃の条件で洗浄したところ、20万個のプラークから11個の陽性クローンが得られた。こうして得られたクローンの塩基配列を決定したところ、配列番号3に示す、新規キナーゼ蛋白質をコードする塩基配列が得られた。この配列によってコードされる蛋白質をMKK7と名付けた。又、配列番号5に記載したN末端付近及びC末端に欠失のあるクローンも同時に得られた。このクローンは、配列番号3のクローンとは異なった位置でスプライシングされているクローン(即ち、オルタナティブスプライシング産物)と推定された。
陽性クローンのUni-ZapTM XR vectorからマウスMKK7遺伝子を切り出し、Bluescript Vectorに挿入した組換えプラスミドをE. Coliに導入して得た形質転換体を、E. Coli:DH5-pBluemMKK7として通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所[日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号(郵便番号305−0046)]に平成9年6月26日(原寄託日)に寄託した(受託番号:FERM BP-6397)。
実施例2
ヒトMKK7のクローニング
実施例1で得られたマウスMKK7の塩基配列を用いて、EST データベース(ヒト及びマウスの様々な組織から無作為に抽出したmRNAから作ったcDNAの配列を公表しているデータベース)をホモロジー検索したところ、マウスMKK7の配列と相同性の高いヒト由来の2クローンが発見された(Homo sapiens cDNA clone 665682及びclone 363521)。クローン665682はマウスMKK7のN末側に極めて高い相同性を持った断片(配列番号1の961〜1190bpに相当)であり、又クローン363521はマウスMKK7のC末側に極めて高い相同性を持った断片(配列番号1の360〜820bpに相当)であった。この2クローンを基に、ヒトMKK7の塩基配列を決定した。具体的には、データベースから見出された塩基配列の情報をもとに、ヒト心臓のpolyA RNA(米国、CLONTECH社製)を材料として、米国、GIBCO BRL社製の5’RACE System,3’RACE Systemをそれぞれ用いて、添付のプロトコールに従ってMKK7の塩基配列を決定した。5’RACE法によるcDNA合成のプライマーとしては、合成オリゴヌクレオチド5'-TTTGGTCTCTTCCTGTGATC-3'を用いた。又実際に5’末端のクローニングを行う際には、キットに添付されたAUAPプライマーと共に、合成オリゴヌクレオチド5'-TGCTTAACGGCAATGACGTG-3'を用いてPCRを15サイクル行い、得られたPCR産物1μlを用いて、更にAUAPプライマーと合成オリゴヌクレオチド5'-TTGATTTCTGCCTGGTAGCG-3'を用いたPCRを25サイクル行い、最終的にヒトMKK7の5’末端を持つクローンをクローニングするに至った。3’RACE法は、添付のプロトコールに従ってcDNAを合成した後に添付のAUAPプライマーと合成オリゴヌクレオチド5'-CAGTCCTTCGTCAAAGACTG-3'とを用いたPCRを34サイクル行い、更にそのPCR産物1μlを用いて、AUAPプライマーと合成オリゴヌクレオチド5'-CAGTCCTTCGTCAAAGACTG-3'を用いたPCRを25サイクル行い、最終的にヒトMKK7の3’末端を持つクローンをクローニングするに至った。又、両末端の間の配列に関しては、5’側のプライマーとして合成オリゴヌクレオチド5'-CGCTACCAGGCAGAAATCAA-3'を、又3’側のプライマーとして合成オリゴヌクレオチド5'-TTTGGTCTCTTCCTGTGATC-3'を用い、5’RACE法に用いたcDNAを鋳型としてPCRを34サイクル行い、ヒトMKK7全長クローンを得た。得られたクローンの塩基配列を決定し、ヒトMKK7の全長塩基配列として配列番号1に記載した。
上記のヒトMKK7の全長塩基配列を大腸菌の発現ベクターpTrCHisB(オランダ国、Invitrogen Corporation社製)に組込み、この組換えプラスミドをE. Coli(DH5)に導入して得られた形質転換体を、E. Coli:DH5-pTrCHisBhMKK7として通商産業省工業技術院生命工学技術研究所[日本国茨城県つくば市東1丁目1番3号(郵便番号305−0046)]に平成9年8月8日(原寄託日)に寄託した(寄託番号:FERM BP-6398)。
実施例3
ノーザンハイブリダイゼーション
本発明の新規なMAPKキナーゼのmRNAの発現を調べるために、マウスMKK7の翻訳領域をプローブとして、マウスの心臓、脳、脾臓、肺臓、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣について、Mouse Multiple Tissue Northern Blot(米国、CLONTECH社製)に対してノザンハイブリダイゼーションを行った。プローブの放射標識は、deoxynucleotidyl transferase(日本国、東洋紡社製)と[α-32P]CTP(英国、Amersham International社製)を用いて行った。ハイブリダイゼーション後のフィルターの洗浄条件としては2×SSC、0.04%SDS、室温で20分間の洗浄を2回行い、その後0.1×SSC、0.1%SDS、50℃で20分間の洗浄を2回行った。洗浄後、オートラジオグラフィーによって放射活性を測定した。結果を図2に示した。
図2からも明らかなように、MAPKキナーゼのmRNAは、いずれの臓器でも発現していることが判明し、特に、心臓や骨格筋で強く発現していることが判明した。
実施例4
ドミナントネガティブ型MKK7の作成
マウスMKK7の165番目のリジン(K)をロイシン(L)に置換することにより、ドミナントネガティブ型MKK7を作成した。具体的には、合成オリゴヌクレオチド5'-CAGGGCACATCATTGCTGTTCTGCAGATGCGGCGCTCTGGGAAC-3'と共に、米国、CLONTECH社製のTransformer Site-Directed Mutagenesis Kitを用い、添付のプロトコールに従ってドミナントネガティブ型MKK7を作成し、「MKK7KL」と命名した。作成したドミナントネガティブ型MKK7の配列を配列番号9及び10に記載した。
実施例5
(1)各種発現ベクター及び組換え蛋白質の作成
哺乳動物細胞発現ベクターpSRα456のBglII及びEcoRIサイトに合成オリゴヌクレオチド5'-GATCGCCGCCACCATGTACCCATACGACGTCCCAGATTACGCTCCCGGGAGATCTG-3'と合成オリゴヌクレオチド5'-AATTCAGATCTCCCGGGAGCGTAATCTGGGACGTCGTATGGGTACATGGTGGCGGC-3'をそれぞれ挿入することにより、ベクターpSRα-HA1を作成した。実施例4で作成したドミナントネガティブ型MKK7遺伝子のコード領域も、ベクターpSRα456の上記サイトに挿入することによって、ベクターpSRα-MKK7KLを作成した。又マウスSAPKα遺伝子のコード領域も、ベクターpSRα-HA1のBglIIサイトに挿入し、ベクターpSRα-HA-SAPKαを作成した。
各種MAPKキナーゼについては、以下の発現プラスミドを作成した。GST−SEK1の発現プラスミドは、ベクターpGEX-2T(スウェーデン国、ファルマシア社製)にマウスSEK1遺伝子を挿入することにより作成した。His−MKK6、His−MKK7の発現プラスミドは、それぞれヒトMKK6、マウスMKK7遺伝子をベクターpET28(米国、Novagen Inc. 社製)に挿入することにより作成した。
又、各種MAPキナーゼについては、以下の発現プラスミドを作成した。His−MAPKの発現プラスミドは、ベクターpTrcHisC(オランダ国、Invitrogen Corporation社製)にXenopusMAPK遺伝子を組み込むことによって作成した。His−SAPKα、His−p38、His−SAPK3はそれぞれマウスSAPKα、p38、SAPK3遺伝子をpET28(米国、Novagen Inc. 社製)に組み込むことにより発現プラスミドを作成した。GST−cJunは、pGEX-3X(スウェーデン国、ファルマシア社製)にヒトcJUN遺伝子のアミノ酸1番目から79番目をコードする領域を挿入することにより、発現プラスミドを作成した。
上記の発現プラスミドを大腸菌に導入した後、GST(glutathione-S-transferase)フュージョン蛋白質の精製にはglutathione-Sepharose 4Bカラム(スウェーデン国、ファルマシア社製)を用い、His(Histidine cluster)タグ付きの蛋白質に関してはpET Expression Systems(米国、Novagen Inc. 社製)のプロトコールに従って精製した。
(2)MKK7によるSAPKの特異的活性化
上記(1)で作成したHis−MKK7、GST−SEK1又はHis−MKK6を0.1μg、His−MAPK、His−SAPK、His−p38又はHis−SAPK3を0.5μgと、100μM ATP、20mM MgCl2,2mM EGTA,20mM Tris−HCl(pH7.5)からなる溶液10μlを30℃で30分間インキュベートしてMAPキナーゼを活性化した。その後MAPKとSAPK3の場合は基質としてmyelin basic protein(MBP)3μgと1μCiの[γ−32P]ATP(英国、Amersham International社製)を含む溶液5μl、SAPKの場合はGST−cJun(1−79)3μgと1μCiの[γ-32P]ATPを含む溶液5μl、p38の場合はATF−2を34μgと1μCiの[γ-32P]ATPを含む溶液5μlをそれぞれ加えて20℃にて20分間インキュベートした。尚、基質として用いたMBPは、Brain Acetone Powder(米国、シグマ社製)を精製したものを用い、ATF−2はDr.Suzanne J.BakerとDr.Tom Curran(St.Jude Children's Research Hospital)より供与を受けた。インキュベート後のサンプルのSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、MBP,c−Jun,ATF−2の放射活性をオートラジオグラフィーによって検出した。図3から明らかなように、マウスMKK7は、p38やSAPK3を活性化することなく、SAPKを特異的に活性化し、その結果としてcJunをリン酸化している。又、p38の活性に関しては、抑制作用をも示唆している。これに対し、マウスSEK1は、SAPK、p38、SAPK3のすべてを活性化し、又、MKK6は、SAPKを活性化することなくp38とSAPK3を活性化している。
実施例6
TNF−αによるMKK7の活性化
KB細胞は10%の牛血清を含むDulbecco's modified Eagle's medium(DMEM)で培養し、20ng/mlのヒトTNF−α(米国、BECTON DIKKINSON AND COMPANY社製Collaborative Biomedical Productsブランド)で刺激した。U937細胞は10%の仔牛血清を含むRPMI1640で培養し、100ng/mlのヒトTNF−αで刺激した。刺激開始から5、15、30、60、120、180分後にそれぞれの細胞抽出液を調製した。細胞抽出液の調製は、細胞を0.7M NaClにさらし、氷冷したHepes-buffered salineで一度洗浄し、20mM Tris−HCl(pH7.5),2mM EGTA,25mM β-glycerophosphate,2mM DTT,1mM vanadate,1mM Phenylmethylsulfonyl fluoride及び1% aprotininからなるバッファー300μlを、直径100mmのシャーレより得られた細胞に対して用い、細胞をホモジナイズした。ホモジネートを1000×gで3分間、その後400,000×gで20分間遠心し、その上清を細胞抽出液とした。細胞抽出液200μlに3μlの抗MKK7抗血清又は抗SEK1/MKK4抗血清を加えて4℃で1時間インキュベートした。インキュベート後の混合物に30μlの50%スラリーのProtein A Sepharose Beads(スウェーデン国、ファルマシア社製)を加え、4℃で1時間インキュベートした。Beads上の免疫複合体を20mM Tris−HCl(pH7.5),500mM NaCl,2mM DTT,0.05% Tween20からなる溶液で3回洗浄した後に、1μgのHis−SAPK及び3μgのGST−cJun(1〜79アミノ酸残基)とともに20mM Tris−HCl(pH7.5),20mM MgCl2,100μM[γ-32P]ATP(3μCi)からなる溶液15μl中で30℃、20分間インキュベートした。インキュベート後の反応混合物をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。泳動後、cJunのリン酸化をオートラジオグラフィーで測定し、それをTNF−αによるMKK7の活性化の指標とした。結果を図4に示した。
図4から明らかなように、マウスMKK7は、TNF−αで活性化されるが、マウスSEK1/MKK4は活性化されないことが判明した。
尚、抗MKK7抗血清と抗SEK1/MKK4抗血清は、それぞれ実施例5の方法で調製したHis−MKK7又はHis−XMEK2(XenopusのSEK1/MKK4ホモログ)を抗原として用い、ウサギを免疫して作製した。免疫には1回当たり1mgの蛋白質を用い、初回免疫から4週間後に2回目の免疫を行い、それ以降は3週間ごとに免疫した。抗血清の力価はELISAで評価し、10万倍の希釈で反応する抗血清が最終的に得られた。
実施例7
ドミナントネガティブ型MKK7による、TNF−αによって誘導されるSAPKの活性化の阻害
ベクターpSRα又はベクターpSRα-MKK7KL(1.5μg)と、ベクターpSRα-HA-SAPKα(0.5μg)をKB細胞にリポフェクトアミン(米国、GibcoBRL社製)を用いてco-transfectionし、24時間後にTNF−α(100ng/ml)、sorbitol(0.5M)、アニソマイシン(anisomycin)(100μg/ml)をそれぞれ用いて細胞を15分間刺激した。刺激した細胞の細胞抽出液の調製には、細胞を0.7M NaClにさらし、氷冷したHepes-buffered salineで一度洗浄し、20mM Tris−HCl(pH7.5), 2mM EGTA, 25mM β-glycerophosphate, 2mM DTT, 1mM vanadate, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1% aprotininからなるバッファー300μlを、直径100mmのシャーレより得られた細胞に対して用い、細胞をホモジナイズした。ホモジネートを1000×gで3分間、400,000×gで20分間遠心し、その上清を細胞抽出液とした。細胞抽出液を抗HA抗体(抗ヘマグルチニン抗体)(12CA5)で免疫沈降し、HA−SAPKのキナーゼ活性を測定した。結果を図5に示した。
図5から明らかなように、ドミナントネガティブ型MKK7(MKK7KL)を発現させた細胞では、TNF−αによるSAPK/JNKの活性化のみが抑えられた。このことから、TNF−αによるSAPK/JNKの活性化はMKK7を介するが、sorbitolやanisomycinによるSAPK/JNKの活性化は、MKK7とは異なるMAPKキナーゼを介して起こることが示された。
実施例8
MKK7のFAS抗原刺激による活性化
Jurkat細胞を抗Fas抗体[CH−11;日本国、(株)医学生物学研究所(MBL)社製]250ng/mlで刺激し、刺激開始から1、2、3、4、5及び6時間後に細胞抽出液を調製した。細胞抽出液の調製は、細胞を0.7M NaClにさらし、氷冷したHepes-buffered salineで一度洗浄し、20mM Tris−HCl(pH7.5), 2mM EGTA, 25mMβ-glycerophosphate, 2mM DTT, 1mM vanadate, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 1% aprotininからなるバッファー300μlを、直径100mmのシャーレより得られる細胞に対して用い、細胞をホモジナイズした。ホモジネートを1000×gで3分間、400,000×gで20分間遠心し、その上清を細胞抽出液とした。
細胞抽出液200μlに3μlの抗SAPK抗血清又は抗MKK7抗血清を加えて4℃で1時間インキュベートした。抗SAPK抗血清としては、米国、Santa Cruz Biotechnology, Inc. 社製のJNK1抗体(ウサギポリクローナル抗体)を使用した。その後に30μlの50%スラリーのProtein A Sepharose Beadsを加え4℃で1時間インキュベートした。Beads上の免疫複合体を20mM Tris−HCl(pH7.5),500mM NaCl, 2mM DTT, 0.05% Tween20からなるバッファーで3回洗浄した。抗SAPK抗血清免疫複合体とHis−Jun 3μgを、20mM Tris−HCl(pH7.5),10mM MgCl2, 100mM[γ-32P]ATP(3μCi)15mlからなるバッファー中で30℃,30分間インキュベートした。
抗MKK7抗血清免疫複合体に関しては、同じバッファー中で、ドミナントネガティブ型のSAPKをGSTとの融合蛋白質として発現させたGST-KN-SAPKを基質に用い、SAPKリン酸化活性を指標に測定した。KN−SAPKは、SAPKのキナーゼサブドメインIIのリジン残基をメチオニン残基になるように変異を入れたもので、変異体の作製はKunkel法で行った。
結果を図6に示した。SAPK/JNKとMKK7は共にFAS抗原に対する刺激によって同じ様なtime courseで活性化されることが判明した。上記の結果から、Fas抗原に対する刺激によって誘導されるSAPK/JNKの活性化は、MKK7を介すると考えられた。
実施例9
本発明のMAPKキナーゼMKK7を用いたMKK7阻害剤のスクリーニング
MKK7の活性阻害剤をスクリーニングするために、完全に活性化されたMKK7を調製した。具体的には、MKK7の上流でその活性化を行うと予想されるMEKK1を活性化因子として使用した。市販のMEKK1遺伝子(米国、STRATAGENE CLONING SYSTEMS社製)を、p15Aを複製起点(ori)とする大腸菌の発現ベクターに組み込み、更に、ヒトMKK7の全長DNAをベクターpGEX-4T1(スウェーデン国、ファルマシア社製)に組み込み、2種類の発現ベクターを同時に大腸菌DH5αに導入した。この大腸菌から、Glutathione-Sepharose 4Bカラム(スウェーデン国、ファルマシア社製)を用いて活性化されたGST-MKK7を精製した。
ヒトJNK1をコードする遺伝子をpGEX-4T1に組み込み、GST−JNK1として大腸菌で発現させた。GST−JNK1をGlutathione-Sepharose 4Bカラム(スウェーデン国、ファルマシア社製)で精製し、後の活性測定の際に基質として用いた。
上記の方法で調製した活性型MKK7とその基質であるJNK1を用いて、以下の条件でMKK7の活性を測定した。最終濃度が、0.1μM MKK7、0.2μM JNK1、50mM Tris−HCl(pH7.5)、0.1mM EGTA、0.1% β-mercaptoethanol、10mM酢酸マグネシウム、0.1mM ATPとなるように50μlの反応系を調製した。30℃で2時間の反応後、反応溶液をPVDF膜に転写し、抗活性型JNK抗体(米国、Promega社製)を用いてドトハイブリダイゼーション法で活性型JNKを検出した。その結果、図7に示すように、MKK7の活性が確認された。
以上のMKK7活性測定法を用いて、それを阻害する物質の精製ならびに同定を行うことが可能である。具体的には、様々な菌体や培養細胞等の培養上清や化合物バンクから得られた物質を上記のMKK7活性測定系に加え、ドットハイブリダイゼーションのドットの濃さがそれらを加えない場合に比べて明らかに薄くなった場合に、MKK7の活性を阻害する物質が存在することを確認することができる。このような方法を用いてMKK7の活性阻害剤をスクリーニングすることが可能である。
産業上の利用可能性
本発明の新規なMAPKキナーゼ及びそれをコードするDNAを用いると、MAPKキナーゼカスケードの過剰な活性化又は阻害が関与する疾患の治療や予防に有用な化合物のスクリーニング、更にそのような疾患の診断剤を作成することが可能である。更に、本発明のMAPKキナーゼをコードするDNAは、遺伝子治療に用いられる遺伝子ソースとしても有用である。
配列表
配列番号:1
配列の長さ:1308
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
起源
生物名:ヒト
組織の種類:心臓
配列:
配列番号:2
配列の長さ:435
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:ヒト
組織の種類:心臓
配列:
配列番号:3
配列の長さ:1518
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
起源
生物名:マウス
組織の種類:脳
配列:
配列番号:4
配列の長さ:468
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:マウス
組織の種類:脳
配列:
配列番号:5
配列の長さ:1260
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
起源
生物名:マウス
組織の種類:脳
配列:
配列番号:6
配列の長さ:419
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:マウス
組織の種類:脳
配列:
配列番号:7
配列の長さ:477
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:cDNA
起源
生物名:Xenopus laevis
細胞の種類:卵母細胞
配列:
配列番号:8
配列の長さ:158
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
起源
生物名:Xenopus laevis
細胞の種類:卵母細胞
配列:
配列番号:9
配列の長さ:1518
配列の型:核酸
鎖の数:二本鎖
トポロジー:直鎖状
配列の種類:他の核酸 突然変異体
配列の特徴
特徴を表す記号:mutation
存在位置:493..495
特徴を決定した方法:E
配列:
配列番号:10
配列の長さ:468
配列の型:アミノ酸
トポロジー:直鎖状
配列の種類:ペプチド
配列の特徴
特徴を表す記号:mutation
存在位置:165
特徴を決定した方法:E
配列:
Claims (13)
- 脊椎動物に由来する実質的に純粋なMAPK(mitogen-activated protein kinase)キナーゼであって、次の特徴を有するMAPKキナーゼ。
(a)TNF−αによる刺激及び/又はFas抗原に対する刺激で活性化される
(b)SAPK/JNKを活性化する
(c)p38は活性化しない
(d)配列番号2若しくは配列番号4に示されるアミノ酸配列又は該アミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなる - 請求項1に記載のMAPKキナーゼをコードするDNA。
- 配列番号1又は3に示される塩基配列からなるDNA。
- 請求項2又は3に記載のDNAを複製可能なベクターに組み込んでなる複製可能な組換え体DNA。
- 請求項4に記載の複製可能な組換え体DNAで形質転換された微生物又は細胞。
- 請求項1に記載のMAPKキナーゼのドミナントネガティブ型のポリペプチドであって、次の特徴を有するポリペプチド。
(a)キナーゼ活性を欠損した
(b)TNF−αによって誘導されるMAPKキナーゼによるSAPK/JNKの活性化を抑制する
(c)配列番号10のアミノ酸配列又は配列番号10のアミノ酸配列においてキナーゼドメイン以外のその他の部分において1又は数個のアミノ酸を欠失、置換もしくは付加したアミノ酸配列からなる - 請求項6に記載のポリペプチドをコードするDNA。
- 配列番号9に示される塩基配列からなるDNA。
- 請求項7又は8に記載のDNAを複製可能なベクターに組込んでなる複製可能な組換え体DNA。
- 請求項9に記載の複製可能な組換え体DNAで形質転換された微生物又は細胞。
- 請求項1に記載のMAPKキナーゼであって、MAPKキナーゼの活性化に必要な、キナーゼドメインVIIとVIIIの境界領域にある2つのセリン残基及び/又はスレオニン残基がリン酸化されていることを特徴とする活性型MAPKキナーゼ。
- MAPKキナーゼの活性を阻害する物質をスクリーニングする方法において、請求項1に記載のMAPKキナーゼを、SAPK/JNKと共に、サンプル材料と接触せしめ、そしてSAPK/JNKの活性化の阻害を指標として、MAPKキナーゼの活性を阻害する物質をスクリーニングする方法。
- 請求項1に記載のMAPKキナーゼ、あるいは請求項11に記載の活性型MAPKキナーゼと特異的に結合しうる抗体。
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