JP3979304B2

JP3979304B2 - Flow cell positioning method and flow cytometer with adjustable flow cell position

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Publication number: JP3979304B2
Application number: JP2003046117A
Authority: JP
Inventors: 良之高原; 伸佐々木; 時弘新山
Original assignee: Nihon Kohden Corp
Current assignee: Nihon Kohden Corp
Priority date: 2003-02-24
Filing date: 2003-02-24
Publication date: 2007-09-19
Anticipated expiration: 2023-02-24
Also published as: JP2004257756A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、フローセルに流通させるサンプル流の中心に照射する光の光軸を合わせる位置決めを行う（フローセル位置調整）フローサイトメータおよびその位置決め方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
フローサイトメータとは、フローセルにシース液に包まれるようにサンプル流（検体）を流し、レーザー光源を用いてそのサンプル流に対して垂直にレーザーを照射し、サンプル流内に流れる血球等の粒子にレーザーが当たることにより発生する散乱または透過する光を検出して粒子を測定する装置である。このようなフローサイトメータでは、レーザー光がサンプル流に照射される位置は粒子測定の精度に大きな影響を与える。そこで、レーザー光の光軸のフローセルに対する位置決めに関して、従来より種々の提案がなされている。
【０００３】
例えば特公平５−１３４５４号（特許文献１）では、フローセルに対してレーザー光と光アレイセンサを共益な位置に配置し、光アレイセンサによるレーザー光の受光出力の強度分布の乱れからフローセルの流通部の両側のエッジを検出する。そして、エッジ検出された２つの位置の中央にレーザー光の光軸が合うように調整する装置が開示されている。
【０００４】
また、血球を測定するために前方散乱光および側方散乱光を検出するフローサイトメータでは、レーザー光の光軸をフローセルに位置決めするために、フローサイトメータの筐体を取り外し、フローサイトメータにサンプル流としてのラテックス粒子を含む液を吸引させてサンプル流をフローセルに流し、その粒子の散乱光のヒストグラムを見ながら、集団のばらつき度合いＣＶ（Coefficient of Variation）が血球を測定するために適切になるように、フローサイトメータ内部のフローセル位置を調整するためのマイクロメータのつまみを手動で操作しミクロンオーダーで移動させていた。
【０００５】
【特許文献１】
特公平５−１３４５４号（請求項１；コラム５、２６−３５行）
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、フローセルにおいてシース液内を流れるサンプル流は、必ずしもフローセルの流通部の中心を流れているとは限らず、設計公差その他の理由によりずれている場合がある。
このような場合、特許文献１のような装置では、フローセルの流通部の中心にレーザー光を照射しても、サンプル流の中心にレーザー光を照射したことにはならない。
さらに、サンプル流の幅よりも大きい幅を持つレーザー光を用いて、レーザー光がサンプル流に照射される位置をずらしながらサンプル流内を流れる粒子をカウントすると、そのヒストグラムはガウス分布とならない場合もあり、これもサンプル流の中心であるガウス分布のピークが検出できないこともある。
【０００６】
フローセルの位置決めはフロサイトメータの生産組立て時に必要であるほか、使用時においても使用環境温度の変化、経年変化によるフローセルのずれの修正、フローセルの取り替え時等においても必要であり、簡易にフローセルの位置決めができることが望まれていた。
【０００７】
本発明は、このような問題を解決するためになされたものであって、その目的は、サンプル流の種類に拘わらず、レーザー光とサンプル流の幅の大小関係に拘わらず、サンプル流の中心を決定し、その中心にレーザー光を照射するように位置決めが簡便に調整できるフローサイトメータないしその位置決め方法を提案することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
このような目的を達成するために、本発明のフローサイトメータにおけるフローセル位置決め方法の１つとして、
フローセル内の流通部にシース液に内包されて流れるサンプル流を光源から発せられる光が横切るように照射していき、その過程で検出される散乱光からサンプル流の両側のエッジ位置を検出するステップと、
その両側のエッジ位置の中心に対して光を照射するように、フローセルと光源との相対的位置を位置決めするステップと、
を含むことを特徴とする方法とする。（請求項１）
このように、サンプル流のエッジを検出して、その中心に対して光を照射するように、フローセルと光源との相対的位置を位置決めすることにより、正確なフローセルの位置決めが可能となる。
【０００９】
また、この方法をフローサイトメータにおいて実現させるならば、
光源に対する前記フローセルの位置を相対的に移動させる移動手段と、
前記移動手段により前記光源に対する前記フローセルの位置を相対的に移動させつつ、前記検出器により検出された出力から前記サンプル流の両側のエッジ位置を検出し、その両側のエッジ位置の中心に対して前記光源により光を照射するように前記移動手段に指示する処理部と、
を具備するようにすればよい。（請求項２）
【００２０】
また、フローセル位置調整を効率よく行うための方法として、
光源から発せられる光がフローセルを横切るように照射していき、その過程で検出される散乱光からフローセル内の流通部の両エッジ位置を検出してその両エッジ位置を記憶する第１ステップの処理を行なった後において、サンプル流の中心に対して光を照射するようにフローセル位置の調節を行なう場合のフローセル位置決め方法であって、
前記記憶したフローセル内の流通部の両エッジ位置間において、フローセル内の流通部にシース液に内包されて流れるサンプル流を光源から発せられる光が横切るように照射していき、その過程で検出される散乱光からサンプル流の中心を決定する第２ステップと、前記決定したサンプル流の中心に対して光を照射するように、フローセルと光源との相対的位置を位置決めするステップとを含み、
前記第２ステップでは、サンプル流の両側のエッジを検出し、そのエッジの中心を決定する方法を適用する（請求項３）。
【００２４】
【発明の実施の形態】
図１は、本発明のフローサイトメータにおけるフローセルの付近の流路系および光学検出系の構造を示している。
フローセル（１ｂ）内の流通部（２ｃ）へ向けて、管路（１ａ）内にサンプル液(Sample Liquid) を流出する内管路（２ａ）とシース液(Sheath Liquid) を流出する外周路（２ｂ）がある。内管路（２ａ）から流出されたサンプル液はサンプル流（３）を形成してシース液に包まれつつ、フローセル（１ｂ）を流れるようになっている。流通部（２ｃ）の大きさは約数百μｍ角が適切である。また、サンプル流（３）の直径は数十μｍとなる。また、サンプル流（３）内では粒子は１つ１つ列になって流れていく。
このサンプル流（３）に対し、垂直方向からレーザー光源（４）からレーザー光（５ａ）が照射される。サンプル流内に流れる粒子がレーザー光（５ａ）に照射されると光散乱を生じる。
フローセル（１ｂ）と管路（１ａ）の流出入両側には、図示しないが、サンプル液、シース液を流出入させるためのチューブが接続されている。
【００２５】
図１に示すフローサイトメータは白血球を測定し、各種白血球に分類するためのフローサイトメータを例としているため、前方散乱光（５ｂ）を受光するためのレンズ（６）、前方小角散乱光(FS:Forward Small scattered light)を検出するための検出器（７ａ）、前方大角散乱光(FL:Forward Large scattered light)を検出するための検出器（７ｂ）と、側方散乱光(SD:Side scattered light) （５ｃ）を受光するためのレンズ（８）、側方散乱光を検出するための検出器（９）が設けられている。
レンズ（６）は内円状フレネルレンズ（６ａ）と外環状フレネルレンズ（６ｂ）が同心状で一体に形成されたものである。そして、内円状フレネルレンズ（６ａ）は、レーザー光照射軸に近い所定角度の範囲に散乱した散乱光を受光し、検出器（７ａ）に集光するようになっている。そして、その集光強度が検出器（７ａ）により検出される（前方小角散乱光の検出）。
また、外環状フレネルレンズ（６ｂ）は内円状フレネルレンズ（６ａ）の外側の所定角度の範囲に散乱した散乱光を受光し、検出器（７ｂ）に集光するようになっている。そして、その集光強度が検出器（７ｂ）により検出される（前方大角散乱光の検出）。
レーザー光照射方向から垂直方向に散乱した散乱光（５ｃ）がレンズ（８）により受光され、検出器（９）に集光される。そして、その集光強度が検出器（９）により検出される（側方散乱光の検出）。
【００２６】
図２は、本発明のフローサイトメータにおける全体的な構成ブロック図を示している。図１で示した構成は同じ番号を付している。
フローセル可動部（１０）は、フローセル（１ｂ）を載置した基台（１２）を移動させることでフローセル（１ｂ）を移動させるアクチュエータ（モータなど）を有する。その他、位置決め処理を行う際にフローセル（１ｂ）を初期位置に配置されたことを検出する初期位置検出センサやフローセル（１ｂ）の移動距離に対応するモータ回転数を検出するセンサをフローセル可動部（１０）に搭載させてもよい。
【００２７】
フローセル可動部（１０）は、検出器（７ａ）、（７ｂ）、（９）から出力された検出信号を受けた処理部（１１）の指示信号に基づいて、フローセル（１ｂ）を少なくともレーザー光（５ａ）の照射方向に対して直角方向に移動させ、サンプル流（３）の中心にレーザー光（５ａ）が照射するように位置決めする。
表示／操作部（１３）は、入力操作はタッチパネル方式となっており、フローセル（１ｂ）位置の自動調節等のための画面が表示される。なお、タッチパネル方式の代わりに表示部と操作部とが別に分かれていてもよい。
【００２８】
次に、フローセル（１ｂ）の自動調節等について、表示／操作部（１３）に表示される画面とフローチャートと参照しながら説明する。
【００２９】
図３は、フローセル調整を行うときの表示／操作部（１３）に表示されるメニュー画面の例である。
フローセル調整の画面では、血液サンプルを用いて自動でフローセル調節を行う「オート調節（血液）」キー（３１）、ＣＲＰなどの粒子を含むサンプルを用いて自動でフローセル調節を行う「オート調節（粒子）」キー（３２）、フローセル移動の微調節をマニュアルでできる「マニュアル調整」キー（３３）、流通部（２ｃ）のエッジを検出することでフローセル調節を行う「フローセルエッジ検出」キー（３４）、これまでのフローセル調節の履歴を表示する「調整履歴」キー（３５）が表示されている。
【００３０】
＜「オート調節（血液）」機能によるフローセル調節について＞
「オート調節（血液）」機能によるフローセル調節について説明する。
図３において、「オート調節（血液）」キー（３１）をタッチ操作すると、タッチパネル方式の画面であるので画面が展開し、図４の「オート調節（血液）」画面が表示される。
フローサイトメータのサンプル吸引部（図示していない）に血液サンプルをセットし、図４右下の開始ボタンをタッチ操作すると、フローセル調節が開始される。
【００３１】
まず、図７（ａ）に示すように、レーザーの照射位置がフローセル（１ｂ）の左側に位置するように、フローセル（１ｂ）を移動させる（フローセル初期位置）。この場合、後述する「フローセルエッジ検出」機能により、フローセル（１ｂ）の流通路（２ｃ）のエッジが既に検出されている場合には、レーザー光（５ａ）の照射位置がフローセル（１ｂ）の流通路（２ｃ）の左側エッジに位置するようにしてもよい。
【００３２】
それとともに、サンプル流（血液サンプル）（３）がシース液に内包されつつ流通部（２ｃ）に流される（図９：ステップ１−１）。
【００３３】
そして、図７（ｂ）に示すように、レーザー（５ａ）が右側へサンプル流（３）を横切るように、処理部（１１）の指示によりフローセル可動部（１０）が初期位置からフローセル（１ｂ）を移動させていく。
そして検出器（７ａ）、（７ｂ）、（９）のいずれかにより出力される信号（複数の検出器からの信号であってもよい）からサンプル流（３）内に流れる粒子を処理部（１１）によりカウントしていく（図９：ステップ１−２）。
【００３４】
表示／操作部（１３）には、図５に示すように、ほぼリアルタイムでフローセルの位置（フローセル可動部（１０）のモータの回転角度に比例する）が表の「フローセルＰＯＳ．」の欄に表示され、その位置でのレーザー散乱光パルスによるカウント数が「カウント」の欄に表示されてていく。なお、表の下には、動作中であることを示す「オート調整（血液）動作中です・・・」と表示される。
また、表の右側には「フローセル位置」が表示されており、「初期：」の欄にはフローセル（１ｂ）の初期位置が、「現在：」の欄には現在のフローセル（１ｂ）の位置が表示される。
【００３５】
一連のカウント測定が終了すると、図６に示すように、表に測定されたデータがすべて表示される。さらに、データから、サンプル流の左側のエッジ、右側のエッジの位置が分析され、「サンプル流」の「左エッジ」欄、「右エッジ」欄に表示される。
【００３６】
図６に示される結果では、フローセル（１ｂ）の位置を初期値「−８６」から「３１４」まで移動させて測定されている。
フローセル位置が「−８６」〜「−２６」までと「２５４」〜「３１４」までは、カウントは「０」である。このフローセル位置の範囲では、シース流にレーザー光（５ａ）が照射されているので血球がカウントされていないのである。
そして、フローセル位置が「−６」〜「２３４」の範囲での測定では、カウントがある。このフローセル位置の範囲では、サンプル流（３）にレーザー光（５ａ）が照射されているので、血球がカウントされ、ほぼガウス分布を描くように測定されている。
したがって、サンプル流は、図６の表右側にあるように、「サンプル流」の「左エッジ：−６」、「右エッジ：２３４」と表示される。つまり、カウント数があるフローセル位置の範囲をサンプル流の領域として、サンプル流のエッジを決定している（図９：ステップ１−３）。
【００３７】
そして、決定された「サンプル流」の「左エッジ」と「右エッジ」の中心をサンプル流の中心と決め、「フローセル位置」の「センタ」の欄に表示される。
図６では、「サンプル流」の「左エッジ：−６」、「右エッジ：２３４」の中心として「センタ：１１４」と表示されている。
【００３８】
その後、この「センタ」の位置にフローセル（１ｂ）が処理部（１１）の制御信号を受けたフローセル可動部（１０）により移動され位置決めされる（図９：ステップ１−４）。
【００３９】
ここで、図６の画面において、「グラフ」のキーをタッチ操作すると、図８に示すように、フローセル位置（横軸）に対するカウント数（縦軸）のグラフが表示される。これによりサンプル流におけるガウス分布、サンプル流のエッジが視覚的に確認できる。
【００４０】
なお、図６の画面における「↑」「↓」のキーは数値データの表のスクロール・キーである。
【００４１】
＜「オート調節（粒子）」機能によるフローセル調節について＞
次に、「オート調節（粒子）」機能によるフローセル調節について、表示／操作部（１３）の画面表示と図１４のフローチャートを参照して説明する。
図３において、「オート調節（粒子）」キー（３２）をタッチ操作すると、図１０の「オート調節（粒子）」画面が表示される。
フローサイトメータのサンプル吸引部（図示していない）に、例えば免疫測定に用いるＣＲＰなどのプラスチック粒子を含むサンプルをセットし、図１０右下の開始ボタンをタッチ操作すると、フローセル調節が開始される。粒子は約３〜２０[ μｍ] の大きさがよい。
【００４２】
上述の「オート調節（血液）」機能と同様に、図７（ａ）に示すように、レーザーの照射位置がフローセル（１ｂ）の左側に位置するように、フローセル（１ｂ）を移動させる（フローセル初期位置）。この場合、後述する「フローセルエッジ検出」機能により、フローセル（１ｂ）の流通路（２ｃ）のエッジが既に検出されている場合には、レーザー光（５ａ）の照射位置がフローセル（１ｂ）の流通路（２ｃ）の左側エッジに位置するようにしてもよい。
【００４３】
それとともに、サンプル流（３）がシース液に内包されつつ流通部（２ｃ）に流す（図１４：ステップ２−１）。
【００４４】
そして、図７（ｂ）に示すように、レーザー光（５ａ）が右側へサンプル流（３）を横切るように、処理部（１１）の指示によりフローセル可動部（１０）が初期位置からフローセル（１ｂ）を移動させていく。
そして検出器（７ａ）、（７ｂ）により出力される信号からサンプル流（３）内に流れる粒子を検出し、処理部（１１）によりＣＶ値とピーク値を測定していく（図１４：ステップ２−２）。つまり、前方小角散乱光（ＦＳ）と前方大角散乱光（ＦＬ）の検出を行い、それぞれのＣＶ値とピーク値を求める。
【００４５】
ここで、ＣＶ値とは、横軸を散乱光強度、縦軸をカウント数としたヒストグラムの分布のばらつき度を示す値である。
また、ここでのピーク値とは、そのヒストグラムにおけるカウント数のピーク値である。なお、このピーク値の代わりに、ヒストグラムの分布における重心でのカウント数であってもよい。カウント数のピーク値が最大となるフローセル位置と、ヒストグラムの分布にける重心のカウント数が最大となるフローセル位置はほぼ一致するからである。
サンプル流の中心を求めるため、本実施例では、ＣＶ値とピーク値の両方を検出、処理、表示しているが、その代わりにＣＶ値とピーク値のいずれか一方を検出、処理、表示するようにしてもよい。
【００４６】
表示／操作部（１３）には、図１１に示すように、ほぼリアルタイムでフローセルの位置（フローセル可動部（１０）のモータの回転角度に比例する）が表の「フローセルＰＯＳ．」の欄に表示される。そして、その位置でのレーザー散乱光パルス検出によるＣＶ値が「ＣＶ」の欄に表示されてていく。それとともに、その位置でのレーザー散乱光パルス検出によるピーク値が「ピーク」の欄に表示されてていく。
なお、表の下には、動作中であることを示す「オート調整（粒子）動作中です・・・」と表示される。
また、表の右側には「フローセル位置」が表示されており、「初期：」の欄にはフローセル（１ｂ）の初期位置が、「現在：」の欄には現在のフローセル（１ｂ）の位置が表示される。
【００４７】
一連の測定が終了すると、図１２に示すように、表に測定されたデータがすべて表示される。なお、全データ数が一度に表示できるデータ数を超えるときは、「↑」「↓」キーによりスクロールすると、全データが確認できる。
【００４８】
図１１、図１２に示される結果では、フローセル（１ｂ）の位置を初期値「−８６」から「３１６」まで移動させて測定されている。
フローセル位置が「−８６」〜「−２６」までと「２５６」〜「３１６」までは、カウントは「−」（データなし）である。このフローセル位置の範囲では、シース流にレーザー（５ａ）が照射されているのでＣＶ値、ピーク値が測定されていない。
そして、フローセル位置が「−６」〜「２３４」の範囲での測定では、ＣＶ値とピーク値が測定されている。このフローセル位置の範囲では、サンプル流（３）にレーザー（５ａ）が照射されているので、ＣＶ値、ピーク値が測定されているのである。
【００４９】
サンプル流がレーザーの中心で照射されているときはＣＶ値が最小となり、ピーク値は最大となる。逆に、サンプル流への照射がレーザーの中心から外れてくるほど、ＣＶ値は大きくなりピーク値は小さくなっていく。このことから、ＣＶ値が最小となる点あるいはピーク値が最大となる点をフローセル（１ｂ）の最適な位置と決定する（図１４：ステップ２−３）。
【００５０】
ここでは、図１２に示すように、前方小角散乱光（ＦＳ）と前方大角散乱光（ＦＬ）においていずれも、フローセル位置が「１１４」においてＣＶ値が最小の「５．０」となっていることから、フローセル位置の最適位置を「センタ」として「１１４」と決定している（図１４：ステップ２−４）。
【００５１】
その後、この「センタ」の位置にフローセル（１ｂ）が処理部（１１）の制御信号を受けたフローセル可動部（１０）により移動され位置決めされる。
【００５２】
ここで、図１２の画面において、「グラフ」のキーをタッチ操作すると、図１３に示すように、フローセル位置（横軸）に対するＣＶ値（縦軸）のグラフが表示される。これによりＣＶ値が最小となるフローセル位置が視覚的に確認できる。
【００５３】
なお、この実施例では、ＣＶ値が最小値となるフローセル位置を最適位置と決定したが、ピーク値が最大値となるフローセル位置を最適位置としてもよく、その場合は図１３におけるグラフは、フローセル位置（横軸）に対するピーク値（縦軸）のグラフを表示するとよい。あるいは前述のようにヒストグラムの重心のカウント数が最大値となるフローセル位置を最適位置として決定してもよい。このときには図１３におけるグラフはフローセル位置（横軸）におけるヒストグラムの重心のカウント数（縦軸）のグラフであるとよい。
また、ＣＶ値の最小値をフローセル位置の最適位置と決定する代わりに、ＣＶ値またはピーク値が測定された範囲の端をサンプル流のエッジとし、その中心位置をフローセル位置の最適位置として決定してもよい。
また、ＣＶ値、ピーク値を求めるのに、上記のように前方小角散乱光、前方大角散乱光に加えて、側方散乱光のＣＶ値、ピーク値を求めてもよい。あるいは前方小角散乱光、前方大角散乱光、側方散乱光のうち少なくともいずれか１つのＣＶ値、ピーク値を求めるようにしてもよい。
【００５４】
＜「マニュアル調節」機能によるフローセル調節について＞
次に、「マニュアル調節」機能によるフローセル調節について、表示／操作部（１３）の画面表示と図１８のフローチャートを参照して説明する。
フローセル位置が若干ずれている場合に、そのずれを簡易に調節したいときには手動で微調整することができる。
図３において、「マニュアル調節」キー（３３）をタッチ操作すると、図１５の「マニュアル調節」画面が表示される。
フローサイトメータのサンプル吸引部（図示していない）にプラスチック粒子を含むサンプルをセットし、図１５右下の開始ボタンをタッチ操作し、フローセル調節を開始する。
【００５５】
フローセル（１ｂ）が現在ある位置において、サンプル流（３）が吸引されシース液に内包されつつ流通部（２ｃ）に流される（図１８：ステップ３−１）。画面右下の「フローセル位置」にはフローセル（１ｂ）の現在位置と初期位置が表示される。「←」「→」のキーをタッチ操作すると、それを表示／操作部（１３）が処理部（１１）に伝え、処理部（１１）がフローセル可動部（１０）に制御信号を送り、それに応じてフローセル（１ｂ）が、その矢印の方向に数μｍずつ移動するようになっている。
【００５６】
そして検出器（７ａ）、（７ｂ）により出力される信号からサンプル流（３）内に流れる粒子を検出し、処理部（１１）によりＣＶ値とピーク値を測定する。（図１８：ステップ３−２）。つまり、前方小角散乱光（ＦＳ）と前方大角散乱光（ＦＬ）の検出を行い、それぞれのＣＶ値とピーク値を求める。すると図１６に示すように、ＣＶ値とピーク値がリアルタイムに表示される。
さらに、前方小角散乱光（ＦＳ）と前方大角散乱光（ＦＬ）それぞれについての散乱光強度(INTENSITY) （横軸）に対するカウント数(COUNT) （縦軸）のグラフを表示する。
測定中であるときには、図１６の右下にあるように「粒子測定中」と表示される。
なお、図１６はフローセル位置が「１３６」である位置での測定を示す。
【００５７】
図１７は、「←」を押してフローセル位置を「１１６」にしたときの測定結果を表示した画面である。
このように、「←」「→」のキーをタッチ操作するごとに、フローセル（１ｂ）がその矢印の方向に移動し、そのフローセル位置においてのＣＶ値、ピーク値が測定され、表示される。また、散乱光強度(INTENSITY) （横軸）に対するカウント数(COUNT) （縦軸）のグラフも表示される（図１８：ステップ３−２）。
【００５８】
操作者は、「←」「→」キーをタッチ操作することによって、測定されるＣＶ値が小さくなり、ピーク値が大きくなる方に、フローセル（１ｂ）の位置を微調節する。
そして、ＣＶ値が最も小さくなり、ピーク値が最も大きくなるフローセル位置を決定しする（図１８：ステップ３−３）。
そして、その位置にフローセル（１ｂ）を「←」「→」キーのタッチ操作により移動させる（図１８：ステップ３−４）。
【００５９】
なお、このとき、散乱光強度(INTENSITY) （横軸）に対するカウント数(COUNT) （縦軸）のグラフに現れる三角状の分布が最も鋭くなる。そのため、このグラフを参照することもできる。
また、ピーク値の代わりに、ヒストグラムの重心のカウント数を用いてもよい。
【００６０】
＜「フローセルエッジ検出」機能によるフローセル調節について＞
次に、「フローセルエッジ検出」機能によるフローセル調節について説明する。
図３において、「フローセルエッジ検出」キー（３４）をタッチ操作すると、図１９の「フローセルエッジ検出」画面が表示される。
図１９右下の「開始」ボタンをタッチ操作するとフローセル調節を開始する。
【００６１】
まず、図７（ａ）に示すように、レーザーの照射位置がフローセル（１ｂ）の左側（フローセル初期位置）に位置するように、フローセル（１ｂ）を移動させる（図２３：ステップ４−１）。
【００６２】
そして、図７（ｂ）に示すように、レーザー（５ａ）が右側へサンプル流（３）を横切るように、処理部（１１）の指示によりフローセル可動部（１０）が初期位置からフローセル（１ｂ）を移動させていく。
そして検出器（７ａ）、（７ｂ）、（９）のいずれかにより（複数の検出器からの信号であってもよい）検出される散乱光パルスを処理部（１１）によりカウントしていく（図２３：ステップ４−２）。
【００６３】
表示／操作部（１３）には、図２０に示すように、ほぼリアルタイムでフローセルの位置（フローセル可動部（１０）のモータの回転角度に比例する）が表の「フローセルＰＯＳ．」の欄に表示され、その位置でのレーザー散乱光パルスによるカウント数が「カウント」の欄に表示されていく。なお、表の下には、動作中であることを示すため「フローセルエッジ検出操作中です。」と表示される。
また、表の右側には「フローセル位置」が表示されており、「初期：」の欄にはフローセル（１ｂ）の初期位置が、「現在：」の欄には現在のフローセル（１ｂ）の位置が表示される。
【００６４】
一連のカウント測定が終了すると、図２１に示すように、表に測定されたデータがすべて表示される。さらに、データから、フローセル（１Ｂ）内の流通部（２c ）の左側のエッジ、右側のエッジの位置が分析され、「フローセルエッジ」の「左エッジ」欄、「右エッジ」欄に表示される。
【００６５】
図２１において「グラフ」キーをタッチ操作すると図２２に示される画面となる。図２２では、フローセル位置に対するカウント数がグラフとして表示されている。
ここで、レーザーがフローセル（１b ）のエッジに照射されているときは、レーザーの散乱が生じる。したがって、検出器（７ａ）、（７ｂ）ではその散乱光パルスを検出することになる。したがって、処理部（１１）では、散乱光パルスのカウント数が多い位置がフローセル（１ｂ）内の流通部（２ｃ）のエッジにレーザーを照射していると判断している。
【００６６】
図２２では、フローセル位置が「−８６」と「３２４」のときに、カウント数がピークであるため、これらの位置をエッジとして決定する（図２３：ステップ４−３）。
【００６７】
そして、決定された「フローセル」の「左エッジ」と「右エッジ」の中心を算出し、「フローセル位置」の「センタ」の欄に表示される。
図２１、図２２では、「フローセルエッジ」の「左エッジ：−８６」、「右エッジ：３２４」の中心として「センタ：１１９」と表示されている。
【００６８】
その後、この「センタ」の位置にフローセル（１ｂ）が処理部（１１）の制御信号を受けたフローセル可動部（１０）により移動され位置決めされる（図２３：ステップ４−４）。
【００６９】
＜「フローセルエッジ検出」機能によるフローセルエッジ検出後のサンプル流中心へのフローセル位置調節について＞
上述のように、「フローセルエッジ検出」機能により、フローセル（１ｂ）内の流通部（２ｃ）のエッジが検出される。
したがって、「フローセルエッジ検出」機能の実行後に、「オート調節（血液）」機能あるいは「オート調節（粒子）」機能を実行するときには、「フローセルエッジ検出」機能の実行により得られメモリ（図示せず）に記憶しておいたエッジ位置のデータを用いて、フローセル（１ｂ）の移動の初期位置と終了位置を両エッジ位置またはそれらの内側とする。
これによりフローセルエッジの外側での散乱光の測定を行うことを回避でき、フローセル位置調節のための時間を短縮することができる。
【００７０】
なお、「オート調整（血液）」機能、「オート調整（粒子）」機能、「フローセルエッジ検出」機能、マニュアル調整は、フロセール位置調整の精度、信頼性、確実性と、ユーザーによる操作の簡便性から適宜、選択するとよい。
【００７１】
＜「調整履歴」機能について＞
図３において「調整履歴」キー（３５）をタッチ操作すると、次の画面に展開し、これまでのフローセル位置を調整した調整日時、調整方法（「オート調整（血液）」など、どの機能を用いたかについて）、位置決めデータなどの調整主張データなどがリストされた表が表示される（図示省略）。これにより、これまでに必要とされたフローセル位置調整の履歴が確認でき、フローサイトメータの今後のメンテナンスのうえで参照とできる。
【００７２】
なお、上記これらの実施の態様では、白血球を分類するためのフローサイトメータを例としたので前方大角散乱光検出、前方小角散乱光検出および側方散乱光検出を行う光学系となっているが、これに限られず、少なくともこれらのうちいずれか１つの散乱光の検出だけで粒子カウントするような光学系の構成や、その他の光学系の構成であってもよい。
また、散乱光の検出は、本実施の態様のようにフレネルレンズを用いてもよいが、直接検出器により検出してもよい。前方小角散乱光と前方大角散乱光の検出にあたっては、上記の実施の態様のような同心円状の形成されたフレネルレンズを用いる代わりに、本出願人が保有する特許第3350775 号に記載したようにミラーを使って前方小角散乱光と前方大角散乱光を分光して検出してもよく、あるいは同心円上に検出領域が形成されたリングディテクタを用いて検出してもよい。また本実施例では、サンプル流内を流れる粒子を散乱光検出によってカウントしサンプル流のエッジを検出したが、これに限られず、サンプル流を透過する光あるいはサンプル流により散乱する光を光アレイセンサにより、サンプル流のエッジを検出してもよい。
また、フローセルと散乱光検出用のレンズ、検出器を同じ基台に搭載して、フローセルとともに移動させてもよい。
また本実施例ではフローセルを移動させたが、フローセルと光源との相対的位置関係が位置決めされれば目的が達せられるから、フローセルを移動させる代わりに、レーザー光源を移動させてもよい。
【００７３】
【発明の効果】
以上詳記したように、本発明によれば、サンプル流の中心に対して光を照射するように、フローセルの光源に対する位置決めができるため、測定精度が向上する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明のフローサイトメータにおけるフローセルの付近の流路系および光学検出系の構造を示す図。
【図２】本発明のフローサイトメータの構成ブロック図を示す図。
【図３】本発明のフローサイトメータにおけるフローセル位置調整を行うときの表示／操作部に表示される画面を示す図。
【図４】フローセル位置調整の「オート調節（血液）」機能を選択したときの画面を示す図。
【図５】「オート調節（血液）」機能における測定過程の画面を示した図。
【図６】「オート調節（血液）」機能における測定終了時の画面を示した図。
【図７】（ａ）はフローセルが初期位置にあるときのフローセルの断面図、（ｂ）はフローセルが終了位置にあるときのフローセルの断面図を示す図。
【図８】「オート調節（血液）」機能における測定終了後においてフローセル位置に対するカウント数のグラフが表示された図。
【図９】「オート調節（血液）」機能におけるフローチャート図。
【図１０】フローセル位置調整の「オート調節（粒子）」機能を選択したときの画面を示す図。
【図１１】「オート調節（粒子）」機能における測定過程の画面を示した図。
【図１２】「オート調節（粒子）」機能における測定終了時の画面を示した図。
【図１３】「オート調節（粒子）」機能における測定終了後においてフローセル位置に対するＣＶ値のグラフが表示された図。
【図１４】「オート調節（粒子）」機能におけるフローチャート図。
【図１５】フローセル位置調整の「マニュアル調整」機能を選択したときの画面を示す図。
【図１６】「マニュアル調整」機能におけるあるフローセル位置での測定を表示した画面を示した図。
【図１７】「マニュアル調整」機能における別のあるフローセル位置での測定を表示した画面を示した図。
【図１８】「マニュアル調整」機能におけるフローチャート図。
【図１９】フローセル位置調整の「フローセルエッジ検出」機能を選択したときの画面を示す図。
【図２０】「フローセルエッジ検出」機能における測定過程の画面を示した図。
【図２１】「フローセルエッジ検出」機能における測定終了時の画面を示した図。
【図２２】「フローセルエッジ検出」機能における測定終了後においてフローセル位置に対するカウント数のグラフが表示された図。
【図２３】「フローセルエッジ検出」機能におけるフローチャート図。
【符号の説明】
１ａ管路
１ｂフローセル
２ａ内管路
２ｂ外周路
２ｃ流通部
３サンプル流
４レーザー光源
５a レーザー光
５ｂ前方散乱光
５ｃ側方散乱光
６、８レンズ
６ａ内円状フレネルレンズ
６ｂ外還状フレネルレンズ
７ａ、７ｂ、９検出器
１０フローセル可動部
１１処理部
１２基台
１３表示／操作部
３１「オート調整（血液）」キー
３２「オート調整（粒子）」キー
３３「マニュアル調整」キー
３４「フローセルエッジ検出」キー
３５「調整履歴」キー[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a flow cytometer that performs positioning (flow cell position adjustment) for aligning the optical axis of light applied to the center of a sample flow that flows through a flow cell and a positioning method thereof.
[0002]
[Prior art]
A flow cytometer is a particle such as blood cells that flows in a sample flow by flowing a sample flow (specimen) in a flow cell so that it is wrapped in a sheath liquid, irradiating a laser perpendicularly to the sample flow using a laser light source. Is a device for measuring particles by detecting scattered or transmitted light generated when a laser hits a laser beam. In such a flow cytometer, the position at which the laser beam is applied to the sample flow greatly affects the accuracy of particle measurement. Therefore, various proposals have heretofore been made regarding the positioning of the optical axis of the laser beam with respect to the flow cell.
[0003]
For example, in Japanese Patent Publication No. 5-13454 (Patent Document 1), a laser beam and an optical array sensor are arranged in a mutually beneficial position with respect to the flow cell, and the flow cell is circulated due to the disturbance of the intensity distribution of the light reception output of the laser beam by the optical array sensor. Detect edges on both sides of the part. And the apparatus which adjusts so that the optical axis of a laser beam may align with the center of two positions by which edge detection was disclosed.
[0004]
Also, in a flow cytometer that detects forward scattered light and side scattered light to measure blood cells, the flow cytometer housing is removed to position the optical axis of the laser light in the flow cell, and the flow cytometer As the sample flow, the liquid containing latex particles is aspirated and the sample flow is flowed to the flow cell, and while looking at the histogram of the scattered light of the particles, the variation degree of population CV (Coefficient of Variation) is suitable for measuring blood cells. Thus, the knob of the micrometer for adjusting the position of the flow cell inside the flow cytometer is manually operated and moved in the micron order.
[0005]
[Patent Document 1]
Japanese Patent Publication No. 5-13454 (Claim 1; Column 5, lines 26-35)
[Problems to be solved by the invention]
However, the sample flow that flows in the sheath liquid in the flow cell does not necessarily flow in the center of the flow cell flow section, and may deviate due to design tolerances or other reasons.
In such a case, in an apparatus such as Patent Document 1, even if the center of the flow cell circulation part is irradiated with laser light, the center of the sample flow is not irradiated with laser light.
In addition, when laser particles with a width larger than the width of the sample flow are used to count particles flowing in the sample flow while shifting the position where the laser light is applied to the sample flow, the histogram may not be Gaussian. In some cases, the peak of the Gaussian distribution, which is the center of the sample flow, cannot be detected.
[0006]
Positioning the flow cell is necessary at the time of production and assembly of the flow cytometer.Also, it is necessary at the time of use to correct changes in the operating environment temperature, correction of flow cell displacement due to aging, and replacement of the flow cell. It was desired that positioning could be performed.
[0007]
The present invention has been made to solve such a problem. The purpose of the present invention is to determine the center of the sample flow regardless of the size of the laser beam and the width of the sample flow regardless of the type of the sample flow. Is to propose a flow cytometer or a positioning method thereof in which the positioning can be easily adjusted so that the center is irradiated with laser light.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
In order to achieve such an object, as one of the flow cell positioning methods in the flow cytometer of the present invention,
A step of irradiating the flow of the sample contained in the sheath liquid in the flow cell so that the light emitted from the light source crosses the sample flow and detecting edge positions on both sides of the sample flow from the scattered light detected in the process. When,
Positioning the relative position of the flow cell and the light source so as to irradiate light to the center of the edge positions on both sides thereof;
It is set as the method characterized by including. (Claim 1)
As described above, the relative position of the flow cell and the light source is positioned so as to detect the edge of the sample flow and irradiate light to the center of the sample flow, thereby enabling accurate positioning of the flow cell.
[0009]
  If this method is realized in a flow cytometer,
  Moving means for moving the position of the flow cell relative to the light source;
  The detection means while moving the position of the flow cell relative to the light source by the moving means.vesselA processing unit that detects edge positions on both sides of the sample flow from the output detected by the step and instructs the moving means to irradiate light from the light source with respect to the centers of the edge positions on both sides;
May be provided. (Claim 2)
[0020]
  In addition, as a method for efficiently adjusting the flow cell position,
  A first step process of irradiating light emitted from a light source so as to cross the flow cell, detecting both edge positions of the flow section in the flow cell from scattered light detected in the process, and storing both edge positions Is a flow cell positioning method in the case of adjusting the flow cell position so as to irradiate light to the center of the sample flow,
  Between the two edge positions of the flow part in the stored flow cell, the light emitted from the light source irradiates the sample flow that is encapsulated in the sheath liquid in the flow part in the flow cell and is detected in the process. A second step of determining a center of the sample flow from the scattered light, and a step of positioning a relative position of the flow cell and the light source so as to irradiate the center of the determined sample flow.Including
  In the second step, a method of detecting edges on both sides of the sample flow and determining the center of the edges is applied (Claim 3).
[0024]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
FIG. 1 shows the structure of the flow path system and the optical detection system in the vicinity of the flow cell in the flow cytometer of the present invention.
To the flow part (2c) in the flow cell (1b), an inner pipe (2a) for flowing the sample liquid (Sample Liquid) into the pipe (1a) and an outer path (Sheath Liquid) for flowing the sheath liquid (Sheath Liquid) 2b). The sample liquid flowing out from the inner pipe (2a) forms the sample flow (3) and is wrapped in the sheath liquid, and flows through the flow cell (1b). The size of the circulation part (2c) is appropriately about several hundred μm square. Further, the diameter of the sample flow (3) is several tens of μm. In the sample flow (3), the particles flow in a line.
The sample stream (3) is irradiated with laser light (5a) from the laser light source (4) from the vertical direction. When particles flowing into the sample stream are irradiated with laser light (5a), light scattering occurs.
Although not shown, tubes for allowing the sample liquid and the sheath liquid to flow in and out are connected to both sides of the flow cell (1b) and the flow path (1a).
[0025]
The flow cytometer shown in FIG. 1 is an example of a flow cytometer for measuring white blood cells and classifying them into various white blood cells. Therefore, a lens (6) for receiving forward scattered light (5b), forward small angle scattered light ( A detector (7a) for detecting FS (Forward Small scattered light), a detector (7b) for detecting forward large scattered light (FL), and a side scattered light (SD: Side) A lens (8) for receiving (scattered light) (5c) and a detector (9) for detecting side scattered light are provided.
The lens (6) is formed by concentrically and integrally forming an inner circular Fresnel lens (6a) and an outer annular Fresnel lens (6b). The inner circular Fresnel lens (6a) receives the scattered light scattered in a range of a predetermined angle close to the laser beam irradiation axis and condenses it on the detector (7a). And the condensing intensity | strength is detected by the detector (7a) (detection of forward small angle scattered light).
The outer annular Fresnel lens (6b) receives scattered light scattered within a predetermined angle range outside the inner circular Fresnel lens (6a) and condenses it on the detector (7b). And the condensing intensity | strength is detected by the detector (7b) (detection of a front large angle scattered light).
Scattered light (5c) scattered in the vertical direction from the laser light irradiation direction is received by the lens (8) and collected on the detector (9). Then, the intensity of the collected light is detected by the detector (9) (detection of side scattered light).
[0026]
FIG. 2 shows an overall configuration block diagram of the flow cytometer of the present invention. The configurations shown in FIG. 1 are given the same numbers.
The flow cell movable part (10) has an actuator (such as a motor) that moves the flow cell (1b) by moving the base (12) on which the flow cell (1b) is placed. In addition, an initial position detection sensor for detecting that the flow cell (1b) is placed at the initial position when performing the positioning process, and a sensor for detecting the motor rotation speed corresponding to the moving distance of the flow cell (1b) are provided as a flow cell movable part ( 10).
[0027]
The flow cell movable part (10) moves the flow cell (1b) to at least a laser beam based on the instruction signal of the processing part (11) that has received the detection signals output from the detectors (7a), (7b), (9). The sample is moved in a direction perpendicular to the irradiation direction of (5a) and positioned so that the laser beam (5a) is irradiated to the center of the sample flow (3).
The display / operation unit (13) has a touch panel method for input operation, and displays a screen for automatic adjustment of the position of the flow cell (1b). Note that the display unit and the operation unit may be separately provided instead of the touch panel method.
[0028]
Next, automatic adjustment and the like of the flow cell (1b) will be described with reference to a screen and a flowchart displayed on the display / operation unit (13).
[0029]
FIG. 3 is an example of a menu screen displayed on the display / operation unit (13) when performing flow cell adjustment.
On the flow cell adjustment screen, the “auto adjustment (blood)” key (31), which automatically adjusts the flow cell using a blood sample, and “auto adjustment (particle), which automatically adjusts the flow cell using a sample containing particles such as CRP. ) "Key (32)," Manual adjustment "key (33) for fine adjustment of flow cell movement manually, and" Flow cell edge detection "key (34) for performing flow cell adjustment by detecting the edge of the flow section (2c) An “adjustment history” key (35) for displaying the history of flow cell adjustments so far is displayed.
[0030]
<Regarding flow cell control using the "automatic control (blood)" function>
The flow cell adjustment by the “auto adjustment (blood)” function will be described.
In FIG. 3, when an “automatic adjustment (blood)” key (31) is touch-operated, the screen is expanded because it is a touch panel screen, and the “automatic adjustment (blood)” screen of FIG. 4 is displayed.
When a blood sample is set in a sample aspiration part (not shown) of the flow cytometer and the start button on the lower right of FIG. 4 is touched, flow cell adjustment is started.
[0031]
First, as shown in FIG. 7A, the flow cell (1b) is moved so that the laser irradiation position is located on the left side of the flow cell (1b) (initial position of the flow cell). In this case, when the edge of the flow path (2c) of the flow cell (1b) has already been detected by the “flow cell edge detection” function to be described later, the irradiation position of the laser beam (5a) is determined as the flow cell (1b) distribution. It may be located at the left edge of the path (2c).
[0032]
At the same time, the sample flow (blood sample) (3) is flowed to the flow part (2c) while being included in the sheath liquid (FIG. 9: step 1-1).
[0033]
Then, as shown in FIG. 7 (b), the flow cell movable unit (10) is moved from the initial position to the flow cell (1b) by the instruction of the processing unit (11) so that the laser (5a) crosses the sample flow (3) to the right. ).
And the particle | grains which flow into the sample flow (3) from the signal (it may be a signal from a some detector) output by any of detector (7a), (7b), (9) are processed ( 11) (FIG. 9: Step 1-2).
[0034]
In the display / operation unit (13), as shown in FIG. 5, the position of the flow cell (proportional to the rotation angle of the motor of the flow cell movable unit (10)) is displayed in the “flow cell POS.” Column of the table as shown in FIG. The count number by the laser scattered light pulse at that position is displayed in the “Count” column. Note that “automatic adjustment (blood) operation is being performed” is displayed below the table, indicating that the operation is in progress.
The “flow cell position” is displayed on the right side of the table, the initial position of the flow cell (1b) is displayed in the “initial:” column, and the current flow cell (1b) position is displayed in the “current:” column. Is displayed.
[0035]
When the series of count measurements is completed, all measured data is displayed in a table as shown in FIG. Further, from the data, the positions of the left edge and right edge of the sample stream are analyzed and displayed in the “left edge” column and “right edge” column of “sample stream”.
[0036]
In the result shown in FIG. 6, the position of the flow cell (1b) is measured by moving from the initial value “−86” to “314”.
When the flow cell positions are “−86” to “−26” and “254” to “314”, the count is “0”. In the range of the flow cell position, since the sheath flow is irradiated with the laser light (5a), blood cells are not counted.
In the measurement in the range where the flow cell position is “−6” to “234”, there is a count. In the range of the flow cell position, the sample stream (3) is irradiated with the laser beam (5a), so that blood cells are counted and measured so as to draw a substantially Gaussian distribution.
Therefore, the sample stream is displayed as “left edge: −6” and “right edge: 234” of “sample stream” as shown on the right side of FIG. That is, the edge of the sample flow is determined using the range of the flow cell position where the count number is present as the sample flow region (FIG. 9: Step 1-3).
[0037]
Then, the center of the “left edge” and “right edge” of the determined “sample flow” is determined as the center of the sample flow, and is displayed in the “center” column of “flow cell position”.
In FIG. 6, “center: 114” is displayed as the center of “left edge: −6” and “right edge: 234” of “sample flow”.
[0038]
After that, the flow cell (1b) is moved and positioned by the flow cell movable part (10) that has received the control signal from the processing part (11) at this "center" position (FIG. 9: step 1-4).
[0039]
Here, when the “graph” key is touched on the screen of FIG. 6, a graph of the count number (vertical axis) with respect to the flow cell position (horizontal axis) is displayed as shown in FIG. Thereby, the Gaussian distribution in the sample flow and the edge of the sample flow can be visually confirmed.
[0040]
Note that the keys “↑” and “↓” in the screen of FIG. 6 are scroll keys for the numerical data table.
[0041]
<Regarding flow cell control using the "automatic control (particle)" function>
Next, flow cell adjustment by the “automatic adjustment (particle)” function will be described with reference to the screen display of the display / operation unit (13) and the flowchart of FIG.
In FIG. 3, when the “automatic adjustment (particle)” key (32) is touched, the “automatic adjustment (particle)” screen of FIG. 10 is displayed.
When a sample containing plastic particles such as CRP used for immunoassay is set in a sample aspirating portion (not shown) of the flow cytometer and the start button at the lower right of FIG. 10 is touched, flow cell adjustment is started. . The size of the particles is preferably about 3 to 20 [μm].
[0042]
Similarly to the above-mentioned “automatic adjustment (blood)” function, as shown in FIG. 7A, the flow cell (1b) is moved so that the laser irradiation position is located on the left side of the flow cell (1b) (flow cell). Initial position). In this case, when the edge of the flow path (2c) of the flow cell (1b) has already been detected by the “flow cell edge detection” function to be described later, the irradiation position of the laser beam (5a) is determined as the flow cell (1b) distribution. It may be located at the left edge of the path (2c).
[0043]
At the same time, the sample flow (3) is flowed to the flow part (2c) while being included in the sheath liquid (FIG. 14: step 2-1).
[0044]
Then, as shown in FIG. 7 (b), the flow cell movable unit (10) is moved from the initial position to the flow cell (10) by the instruction of the processing unit (11) so that the laser beam (5a) crosses the sample flow (3) to the right. 1b) is moved.
Then, particles flowing into the sample stream (3) are detected from the signals output from the detectors (7a) and (7b), and the CV value and the peak value are measured by the processing unit (11) (FIG. 14: step). 2-2). That is, forward small angle scattered light (FS) and forward large angle scattered light (FL) are detected, and the respective CV values and peak values are obtained.
[0045]
Here, the CV value is a value indicating the degree of dispersion of the histogram distribution with the horizontal axis representing the scattered light intensity and the vertical axis representing the number of counts.
Further, the peak value here is a peak value of the count number in the histogram. Note that the count value at the center of gravity in the histogram distribution may be used instead of the peak value. This is because the flow cell position where the peak value of the count number becomes the maximum and the flow cell position where the count number of the center of gravity in the distribution of the histogram becomes maximum coincide.
In this embodiment, both the CV value and the peak value are detected, processed, and displayed in order to obtain the center of the sample flow. Instead, either the CV value or the peak value is detected, processed, and displayed. You may do it.
[0046]
In the display / operation unit (13), as shown in FIG. 11, the position of the flow cell (proportional to the rotation angle of the motor of the flow cell movable unit (10)) is displayed in the “flow cell POS.” Column of the table almost in real time. Is displayed. Then, the CV value obtained by detecting the laser scattered light pulse at that position is displayed in the “CV” column. At the same time, the peak value obtained by detecting the laser scattered light pulse at that position is displayed in the “peak” column.
Note that “automatic adjustment (particle) operation is in progress” is displayed below the table indicating that the operation is in progress.
The “flow cell position” is displayed on the right side of the table, the initial position of the flow cell (1b) is displayed in the “initial:” column, and the current flow cell (1b) position is displayed in the “current:” column. Is displayed.
[0047]
When a series of measurements is completed, all measured data are displayed in a table as shown in FIG. If the total number of data exceeds the number of data that can be displayed at one time, scrolling with the “↑” and “↓” keys allows all the data to be confirmed.
[0048]
In the results shown in FIG. 11 and FIG. 12, the measurement is performed by moving the position of the flow cell (1b) from the initial value “−86” to “316”.
When the flow cell positions are “−86” to “−26” and “256” to “316”, the count is “−” (no data). In the range of the flow cell position, the laser flow (5a) is applied to the sheath flow, so the CV value and the peak value are not measured.
In the measurement in the flow cell position range of “−6” to “234”, the CV value and the peak value are measured. In this flow cell position range, the sample stream (3) is irradiated with the laser (5a), so the CV value and the peak value are measured.
[0049]
When the sample stream is illuminated at the center of the laser, the CV value is minimized and the peak value is maximized. Conversely, the CV value increases and the peak value decreases as the irradiation of the sample stream deviates from the center of the laser. From this, the point at which the CV value is minimized or the point at which the peak value is maximized is determined as the optimum position of the flow cell (1b) (FIG. 14: step 2-3).
[0050]
Here, as shown in FIG. 12, in both the forward small angle scattered light (FS) and the forward large angle scattered light (FL), the flow cell position is “114” and the CV value is “5.0” which is the minimum. Therefore, the optimum position of the flow cell position is determined as “114” as “center” (FIG. 14: step 2-4).
[0051]
Thereafter, the flow cell (1b) is moved to the position of the “center” and positioned by the flow cell movable unit (10) that has received the control signal of the processing unit (11).
[0052]
Here, when the “graph” key is touched on the screen of FIG. 12, a graph of the CV value (vertical axis) with respect to the flow cell position (horizontal axis) is displayed as shown in FIG. Thereby, the flow cell position where the CV value becomes the minimum can be visually confirmed.
[0053]
In this embodiment, the flow cell position where the CV value becomes the minimum value is determined as the optimum position, but the flow cell position where the peak value becomes the maximum value may be set as the optimum position. In this case, the graph in FIG. A graph of the peak value (vertical axis) with respect to the position (horizontal axis) may be displayed. Alternatively, as described above, the flow cell position where the count of the center of gravity of the histogram is the maximum value may be determined as the optimum position. In this case, the graph in FIG. 13 may be a graph of the count number (vertical axis) of the center of gravity of the histogram at the flow cell position (horizontal axis).
Further, instead of determining the minimum value of the CV value as the optimum position of the flow cell position, the end of the range in which the CV value or peak value is measured is set as the edge of the sample flow, and the center position is determined as the optimum position of the flow cell position. May be.
Further, in order to obtain the CV value and the peak value, in addition to the forward small angle scattered light and the forward large angle scattered light as described above, the CV value and the peak value of the side scattered light may be obtained. Or you may make it obtain | require at least any one CV value and peak value among forward small angle scattered light, forward large angle scattered light, and side scattered light.
[0054]
<Regarding the flow cell adjustment using the "Manual adjustment" function>
Next, the flow cell adjustment by the “manual adjustment” function will be described with reference to the screen display of the display / operation unit (13) and the flowchart of FIG.
If the flow cell position is slightly deviated, it can be finely adjusted manually to easily adjust the deviation.
In FIG. 3, when the “manual adjustment” key (33) is touched, the “manual adjustment” screen of FIG. 15 is displayed.
A sample containing plastic particles is set in a sample suction section (not shown) of the flow cytometer, and the start button at the lower right of FIG. 15 is touched to start the flow cell adjustment.
[0055]
At the position where the flow cell (1b) is present, the sample flow (3) is sucked and flowed to the flow part (2c) while being included in the sheath liquid (FIG. 18: step 3-1). In the “flow cell position” at the lower right of the screen, the current position and the initial position of the flow cell (1b) are displayed. When the “←” and “→” keys are touch-operated, the display / operation unit (13) notifies the processing unit (11), and the processing unit (11) sends a control signal to the flow cell movable unit (10). Accordingly, the flow cell (1b) moves by several μm in the direction of the arrow.
[0056]
And the particle | grains which flow into sample flow (3) are detected from the signal output by detector (7a), (7b), and a CV value and a peak value are measured by a process part (11). (FIG. 18: Step 3-2). That is, forward small angle scattered light (FS) and forward large angle scattered light (FL) are detected, and the respective CV values and peak values are obtained. Then, as shown in FIG. 16, the CV value and the peak value are displayed in real time.
Further, a graph of count number (COUNT) (vertical axis) against scattered light intensity (INTENSITY) (horizontal axis) for each of forward small angle scattered light (FS) and forward large angle scattered light (FL) is displayed.
When measurement is in progress, “particle measurement in progress” is displayed as shown in the lower right of FIG.
FIG. 16 shows the measurement at the position where the flow cell position is “136”.
[0057]
FIG. 17 is a screen displaying the measurement result when the flow cell position is set to “116” by pressing “←”.
Thus, each time the “←” and “→” keys are touched, the flow cell (1b) moves in the direction of the arrow, and the CV value and peak value at the flow cell position are measured and displayed. In addition, a graph of the count number (COUNT) (vertical axis) against the scattered light intensity (INTENSITY) (horizontal axis) is also displayed (FIG. 18: Step 3-2).
[0058]
The operator touches the “←” and “→” keys to finely adjust the position of the flow cell (1b) so that the measured CV value decreases and the peak value increases.
Then, the flow cell position where the CV value becomes the smallest and the peak value becomes the largest is determined (FIG. 18: Step 3-3).
Then, the flow cell (1b) is moved to that position by touch operation of the “←” and “→” keys (FIG. 18: step 3-4).
[0059]
At this time, the triangular distribution appearing in the graph of the count number (COUNT) (vertical axis) with respect to the scattered light intensity (INTENSITY) (horizontal axis) becomes the sharpest. Therefore, this graph can also be referred to.
Further, the count number of the center of gravity of the histogram may be used instead of the peak value.
[0060]
<Regarding flow cell adjustment with the "flow cell edge detection" function>
Next, flow cell adjustment by the “flow cell edge detection” function will be described.
In FIG. 3, when the “flow cell edge detection” key (34) is touched, the “flow cell edge detection” screen of FIG. 19 is displayed.
When the “start” button at the lower right of FIG. 19 is touched, flow cell adjustment is started.
[0061]
First, as shown in FIG. 7 (a), the flow cell (1b) is moved so that the laser irradiation position is positioned on the left side (flow cell initial position) of the flow cell (1b) (FIG. 23: step 4-1). .
[0062]
Then, as shown in FIG. 7 (b), the flow cell movable unit (10) is moved from the initial position to the flow cell (1b) by the instruction of the processing unit (11) so that the laser (5a) crosses the sample flow (3) to the right. ).
The scattered light pulses detected by any one of the detectors (7a), (7b), and (9) (may be signals from a plurality of detectors) are counted by the processing unit (11) ( FIG. 23: Step 4-2).
[0063]
In the display / operation unit (13), as shown in FIG. 20, the position of the flow cell (proportional to the rotation angle of the motor of the flow cell movable unit (10)) is displayed in the “flow cell POS.” Column of the table as shown in FIG. The count number by the laser scattered light pulse at that position is displayed in the “Count” column. It should be noted that “flow cell edge detection operation is in progress” is displayed below the table to indicate that it is operating.
The “flow cell position” is displayed on the right side of the table, the initial position of the flow cell (1b) is displayed in the “initial:” column, and the current flow cell (1b) position is displayed in the “current:” column. Is displayed.
[0064]
When the series of count measurements is completed, all measured data is displayed in a table as shown in FIG. Further, from the data, the positions of the left edge and right edge of the flow section (2c) in the flow cell (1B) are analyzed and displayed in the “left edge” column and “right edge” column of “flow cell edge”. .
[0065]
When the “graph” key is touched in FIG. 21, the screen shown in FIG. 22 is displayed. In FIG. 22, the count number with respect to the flow cell position is displayed as a graph.
Here, when the laser is applied to the edge of the flow cell (1b), laser scattering occurs. Therefore, the detectors (7a) and (7b) detect the scattered light pulse. Therefore, the processing unit (11) determines that the position where the number of scattered light pulses is large is irradiating the edge of the flow unit (2c) in the flow cell (1b) with laser.
[0066]
In FIG. 22, when the flow cell positions are “−86” and “324”, since the count number is a peak, these positions are determined as edges (FIG. 23: Step 4-3).
[0067]
Then, the centers of the “left edge” and “right edge” of the determined “flow cell” are calculated and displayed in the “center” column of “flow cell position”.
21 and 22, “center: 119” is displayed as the center of “left edge: −86” and “right edge: 324” of “flow cell edge”.
[0068]
Thereafter, the flow cell (1b) is moved and positioned at the position of the “center” by the flow cell movable unit (10) that has received the control signal of the processing unit (11) (FIG. 23: step 4-4).
[0069]
<Adjusting the flow cell position to the center of the sample flow after detecting the flow cell edge by the "flow cell edge detection" function>
As described above, the edge of the flow part (2c) in the flow cell (1b) is detected by the “flow cell edge detection” function.
Therefore, when the “auto adjustment (blood)” function or the “auto adjustment (particle)” function is executed after the “flow cell edge detection” function is executed, the memory (not shown) obtained by the execution of the “flow cell edge detection” function. ), The initial position and the end position of the movement of the flow cell (1b) are set as both edge positions or inside thereof.
As a result, it is possible to avoid measuring scattered light outside the flow cell edge, and to shorten the time for adjusting the flow cell position.
[0070]
In addition, "auto adjustment (blood)" function, "auto adjustment (particle)" function, "flow cell edge detection" function, manual adjustment is the accuracy, reliability and certainty of fro-sail position adjustment, and easy operation by the user It is good to select suitably from.
[0071]
<About the “Adjustment History” function>
In FIG. 3, when the “adjustment history” key (35) is touched, the next screen is displayed. Which function is used, such as the adjustment date and time and the adjustment method (“automatic adjustment (blood)”). A table listing adjustment claim data such as positioning data is displayed (not shown). Thereby, the history of the flow cell position adjustment required so far can be confirmed, and can be referred to in the future maintenance of the flow cytometer.
[0072]
In these embodiments, the flow cytometer for classifying white blood cells is used as an example, so that the optical system performs forward large angle scattered light detection, forward small angle scattered light detection, and side scattered light detection. However, the present invention is not limited to this, and it may be a configuration of an optical system that counts particles only by detecting at least one of these scattered lights, or a configuration of other optical systems.
The scattered light may be detected using a Fresnel lens as in this embodiment, but may be detected directly by a detector. For detection of forward small angle scattered light and forward large angle scattered light, instead of using a concentric formed Fresnel lens as in the above embodiment, as described in Japanese Patent No. 3350775 owned by the present applicant. The forward small angle scattered light and the forward large angle scattered light may be spectroscopically detected using a mirror, or may be detected using a ring detector in which a detection region is formed on a concentric circle. In this embodiment, the particles flowing in the sample flow are counted by detecting scattered light and the edge of the sample flow is detected. However, the present invention is not limited to this, and the light passing through the sample flow or the light scattered by the sample flow is detected by the optical array sensor. Thus, the edge of the sample flow may be detected.
Further, the flow cell, the lens for detecting scattered light, and the detector may be mounted on the same base and moved together with the flow cell.
In the present embodiment, the flow cell is moved. However, if the relative positional relationship between the flow cell and the light source is determined, the purpose can be achieved. Instead of moving the flow cell, the laser light source may be moved.
[0073]
【The invention's effect】
As described above in detail, according to the present invention, since the flow cell can be positioned with respect to the light source so as to emit light to the center of the sample flow, the measurement accuracy is improved.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the structure of a flow path system and an optical detection system in the vicinity of a flow cell in a flow cytometer of the present invention.
FIG. 2 is a block diagram showing a configuration of a flow cytometer according to the present invention.
FIG. 3 is a diagram showing a screen displayed on a display / operation unit when performing flow cell position adjustment in the flow cytometer of the present invention.
FIG. 4 is a diagram showing a screen when an “automatic adjustment (blood)” function of flow cell position adjustment is selected.
FIG. 5 is a diagram showing a screen of a measurement process in the “auto adjustment (blood)” function.
FIG. 6 is a diagram showing a screen at the end of measurement in the “automatic adjustment (blood)” function.
7A is a cross-sectional view of the flow cell when the flow cell is in the initial position, and FIG. 7B is a cross-sectional view of the flow cell when the flow cell is in the end position.
FIG. 8 is a diagram showing a graph of the number of counts with respect to the flow cell position after completion of measurement in the “automatic adjustment (blood)” function.
FIG. 9 is a flowchart of the “automatic adjustment (blood)” function.
FIG. 10 is a diagram showing a screen when an “automatic adjustment (particle)” function of flow cell position adjustment is selected.
FIG. 11 is a diagram showing a screen of a measurement process in the “automatic adjustment (particle)” function.
FIG. 12 is a diagram showing a screen at the end of measurement in the “automatic adjustment (particle)” function.
FIG. 13 is a diagram in which a graph of CV values with respect to the flow cell position is displayed after completion of measurement in the “automatic adjustment (particle)” function.
FIG. 14 is a flowchart in the “automatic adjustment (particle)” function.
FIG. 15 is a diagram showing a screen when a “manual adjustment” function of flow cell position adjustment is selected.
FIG. 16 is a diagram showing a screen displaying measurement at a certain flow cell position in the “manual adjustment” function.
FIG. 17 is a diagram showing a screen displaying measurement at another certain flow cell position in the “manual adjustment” function.
FIG. 18 is a flowchart of the “manual adjustment” function.
FIG. 19 is a diagram showing a screen when a “flow cell edge detection” function of flow cell position adjustment is selected.
FIG. 20 is a diagram showing a screen of a measurement process in the “flow cell edge detection” function.
FIG. 21 is a diagram showing a screen at the end of measurement in the “flow cell edge detection” function.
FIG. 22 is a diagram in which a graph of the number of counts with respect to the flow cell position is displayed after completion of measurement in the “flow cell edge detection” function.
FIG. 23 is a flowchart of the “flow cell edge detection” function.
[Explanation of symbols]
1a pipeline
1b Flow cell
2a Inner pipeline
2b Peripheral road
2c Distribution Department
3 Sample flow
4 Laser light source
5a Laser light
5b Forward scattered light
5c Side scattered light
6, 8 lenses
6a Inner circular Fresnel lens
6b Fresnel lens
7a, 7b, 9 detector
10 Flow cell moving part
11 Processing section
12 base
13 Display / Operation section
31 “Auto adjustment (blood)” key
32 “Auto Adjustment (Particle)” key
33 “Manual Adjustment” Key
34 "Flow cell edge detection" key
35 “Adjustment History” key

Claims

A step of irradiating the flow of the sample contained in the sheath liquid in the flow cell so that the light emitted from the light source crosses the sample flow and detecting edge positions on both sides of the sample flow from the scattered light detected in the process. When,
Positioning the relative position of the flow cell and the light source so as to irradiate light to the center of the edge positions on both sides thereof;
A flow cell positioning method in a flow cytometer, comprising:

In the flow cytometer that irradiates light from the light source to the sample flow that is encapsulated in the sheath liquid in the flow part in the flow cell and measures particles based on the scattered light detected by the detector,
Moving means for moving the position of the flow cell relative to the light source;
While moving the position of the flow cell relative to the light source by the moving means, the edge positions on both sides of the sample flow are detected from the output detected by the detector, and the center of the edge positions on both sides is detected. A processing unit that instructs the moving means to irradiate light from the light source;
A flow cytometer characterized by comprising:

A first step process of irradiating light emitted from a light source so as to cross the flow cell, detecting both edge positions of the flow section in the flow cell from scattered light detected in the process, and storing both edge positions Is a flow cell positioning method for adjusting the flow cell position so that light is emitted to the center of the sample flow after
Between the two edge positions of the flow part in the stored flow cell, the light emitted from the light source irradiates the sample flow that is encapsulated in the sheath liquid in the flow part in the flow cell and is detected in the process. A second step of determining a center of the sample flow from the scattered light, and positioning a relative position of the flow cell and the light source so as to irradiate the center of the determined sample flow ,
In the second step, a flow cell positioning method in a flow cytometer , wherein edges on both sides of the sample flow are detected and the centers of the edges are determined .