CZ2015590A3 - A method of implementing the flow-cytometric measurement - Google Patents
A method of implementing the flow-cytometric measurement Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2015590A3 CZ2015590A3 CZ2015-590A CZ2015590A CZ2015590A3 CZ 2015590 A3 CZ2015590 A3 CZ 2015590A3 CZ 2015590 A CZ2015590 A CZ 2015590A CZ 2015590 A3 CZ2015590 A3 CZ 2015590A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cuvette
- photoluminescence
- particles
- signal
- optical
- Prior art date
Links
- 238000005259 measurement Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 70
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 57
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims abstract description 42
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims abstract description 36
- 238000005424 photoluminescence Methods 0.000 claims abstract description 34
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 4
- 239000002002 slurry Substances 0.000 abstract description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- -1 etc. Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 1
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
Abstract
Způsob provádění průtokového cytometrického měření, při kterém se suspenze měřených částic (30) strhává nosnou tekutinou z kapiláry (2) do vnitřního prostoru kyvety (3), kterým se vede do měřicího bodu průtokového cytometru (1), ve kterém se měřené částice (30) osvětlují excitačním zářením z alespoň jednoho zdroje (4) excitačního záření, přičemž se alespoň jedním optickým detektorem fotoluminiscence (71, 72, 73) snímá fotoluminiscence těchto měřených částic (30). Před průtokovým cytometrickým měřením měřených částice (30) a/nebo v jeho průběhu se přitom do kapiláry (3) přivede suspenze referenčních částic známé velikosti a charakteru, kyveta (2) se uvede do lineárního krokového pohybu s krokem v řádu jednotek až desítek mikrometrů postupně ve dvou vzájemně kolmých osách (x, y), které jsou současně kolmé k podélné ose (20) kyvety (2), přičemž se alespoň jedním optickým detektorem (71, 72, 73) fotoluminiscence snímá fotoluminiscence referenčních částic, načež se z histogramu digitalizovaného signálu tohoto optického detektoru/detektorů (71, 72, 73) fotoluminiscence stanoví poloha kyvety (2) s největší intenzitou tohoto signálu, do které se kyveta (2) přesune. V této poloze se pak zahájí nebo znovuzahájí průtokové cytometrické měření měřených částic (30).A method for performing a flow cytometric measurement in which a slurry of measured particles (30) is entrained by a carrier fluid from the capillary (2) into the interior of the cuvette (3) through which it is directed to a measuring point of the flow cytometer (1) in which the particles (30) are measured. ) illuminating with excitation radiation from at least one excitation radiation source (4), wherein photoluminescence of the measured particles (30) is sensed by at least one optical photoluminescence detector (71, 72, 73). Before and / or during the flow cytometric measurement of the measured particles (30), a suspension of reference particles of known size and character is introduced into the capillary (3), the cuvette (2) is introduced into a linear step motion with a step in the order of units to tens of micrometers in succession in two mutually perpendicular axes (x, y), which are simultaneously perpendicular to the longitudinal axis (20) of the cuvette (2), wherein at least one photoluminescence photoluminescence of the reference particles is sensed by at least one photoluminescence optical detector (71), followed by a digitized histogram the signal of the optical detector / detectors (71, 72, 73) of the photoluminescence determines the position of the cuvette (2) with the highest intensity of this signal into which the cuvette (2) is moved. Flow cytometric measurement of the measured particles (30) is then initiated or restarted in this position.
Description
Způsob provádění průtokového cytometrického měření Oblast technikyMethod of performing flow cytometric measurement
Vynález se týká způsobu provádění průtokového cytometrického měřené, při kterém se suspenze' měřených částic strhává nosnou tekutinou z kapiláry do vnitřního prostoru kyvety, kterým se vede do měřicího bodu cytometru.BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to a method for performing a flow cytometric measurement, wherein a suspension of the measured particles is entrained by the carrier fluid from the capillary to the interior of the cuvette through which it is directed to the cytometer measuring point.
Dosavadní stav technikyBackground Art
Průtokové cytometrické měření je přístrojová metoda, který umožňuje měřit různé vlastnosti velkého množství pevných částic malých rozměrů, nejčastěji biologického původu - např. různých typů buněk, virů, chromozomů, apod., ale také různých anorganických materiálů - např. částic prachu, apod. Během měření jsou tyto částice ve formě suspenze nasávány ze zkumavky cytometru do otevřené kapiláry, která je uložená v průhledné kyvetě, přičemž kyvetou protéká laminárním prouděním nosná tekutina, která při obtékání kapiláry strhává z jejího ústí vzorek suspenze, a nese ho do měřicího bodu cytometru. V tomto měřicím bodu jsou pak částice ve vzorku suspenze ozařovány excitačním zářením z alespoň jednoho zdroje monochromatického excitačního záření, nejčastěji laserem, přičemž se soustavou optických detektorů sleduje přímý rozptyl (FSC - forward scatter) a boční rozptyl (SSC -side scatter) tohoto záření způsobený průchodem jednotlivých částic měřicím bodem cytometru, a současně fotoluminiscence (FL) fluorochromů přirozeně přítomných vdaných částicích a/nebo jim pro účely cytometrického měření dodaných. Intenzita přímého rozptylu excitačního záření je pak úměrná velikosti dané částice, přičemž v případě buněk také umožňuje odlišit živé buňky od mrtvých; intenzita bočního rozptylu excitačního záření je přímo úměrná vnitřní komplexitě dané částice, resp. granularitě (charakteru povrchu a tvaru) buňky; z fotoluminiscence dané částice lze určit její typ či velikost, a případně i roztřídit směs částic různých typů.Flow cytometric measurement is an instrumental method that allows to measure the various properties of a large number of small particles, most often of biological origin - eg different cell types, viruses, chromosomes, etc., but also various inorganic materials - eg dust particles, etc. Measurements, these suspension particles are aspirated from the cytometer tube into an open capillary that is embedded in a transparent cuvette, with the carrier fluid flowing through the laminar flow, which entrains a suspension sample from its mouth, and carries it to the cytometer measuring point. At this measuring point, the particles in the slurry sample are then irradiated with excitation radiation from at least one source of monochromatic excitation radiation, most often by laser, with a direct scatter (FSC) and a side scatter (SSC -side scatter) of the radiation caused by the optical detector array. by passing the individual particles through the cytometer measuring point, and simultaneously the photoluminescence (FL) of the fluorochromes naturally present in the married particles and / or delivered for cytometric measurement. The intensity of the direct dispersion of the excitation radiation is then proportional to the size of the particle, and in the case of cells it also makes it possible to distinguish the living cells from the dead; the intensity of the lateral dispersion of the excitation radiation is directly proportional to the intrinsic complexity of the particle, respectively. granularity (surface character and shape) of the cell; the photoluminescence of a given particle can determine its type or size, and optionally sort a mixture of particles of different types.
Kyveta je v současné době v cytometru uložena vyjímatelně, a s možností jednoduchého mechanického polohování prostřednictvím manuálně ovládaných stavěčích šroubů. Toto její uložení má řadu nedostatků, přičemž nejpodstatnějším z nich je, že při jakékoliv manipulaci s kyvetou, např. při jejím čistění, však i přes použití různých tvarových prvků či značek, které by měly zabezpečit její optimální polohu, dochází k upnutí kyvety mimo optickou osu (některého z) optických prvků cytometru (tj. detektoru/ů a/nebo objektivu/ů). Vzhledem k tomu, že i jen velmi malá odchylka (v řádu desítek mikrometrů) může mít značný vliv na výsledky a přesnost měření, vyžaduje každé nové upnutí kyvety do držáku cytometru zdlouhavé odborné seřizování její polohy.The cuvette is currently removable in the cytometer and with the possibility of simple mechanical positioning by manually operated setscrews. This deposit has a number of drawbacks, the most important of which is that any cuvette manipulation, for example, when cleaning the cuvette, does not allow the cuvette to be clamped outside of the optical device, despite the use of different shape elements or marks to ensure its optimal position. the axis (any of) of the optical elements of the cytometer (ie, the detector (s) and / or objective (s)). Since even a very small deviation (in the order of tens of micrometers) can have a significant effect on the results and the accuracy of the measurement, each new clamping of the cuvette requires a lengthy professional adjustment of its position.
Kromě upnutí kyvety mimo optickou osu optických prvků cytometru ovlivňují výsledek měření a jeho přesnost také nečistoty, které se v kyvetě průběžně usazují, a které svou přítomností vychylují dráhu suspenze měřených částic. Cílem vynálezu je navrhnout způsob provádění průtokového cytometrického měření, který by umožňoval před a/nebo během samotného měření automatické přesunutí kyvety cytometru do její optimální polohy vůči zdroji excitačního záření a ostatním optickým prvkům cytometru.In addition to clamping the cuvette outside the optical axis of the optical elements of the cytometer, the measurement result and its accuracy also affect the impurities that are continuously deposited in the cuvette and which, by their presence, deflect the suspension of the measured particles. SUMMARY OF THE INVENTION It is an object of the present invention to provide a method for performing flow cytometric measurements that allows the cytometer cell to be automatically moved to its optimal position relative to the excitation radiation source and other optical elements of the cytometer before and / or during measurement.
Podstata vynálezu Cíle vynálezu se dosáhne způsobem provádění průtokového cytometrického měření, při kterém se suspenze měřených částic strhává nosnou tekutinou z kapiláry do vnitřního prostrou kyvety, kterým se vede do měřicího bodu průtokového cytometru, ve kterém se měřené částice osvětlují excitačním zářením z alespoň jednoho zdroje excitačního záření, přičemž se alespoň jedním optickým detektorem fotoluminiscence snímá fotoluminiscence těchto měřených částic. Podstata tohoto způsobu pak spočívá v tom, že před průtokovým cytometrickým měřením měřených částic a/nebo v jeho průběhu se do kapiláry přivede suspenze referenčních částic známé velikosti a charakteru, kyveta se uvede do lineárního krokového pohybu s krokem v řádu jednotek až desítek mikrometrů postupně ve dvou vzájemně kolmých osách, které jsou současně kolmé k podélné ose kyvety, a jedna z nich je kolmá na paprsek excitačního záření, přičemž se alespoň jedním optickým detektorem fotoluminiscence snímá fotoluminiscence referenčních částic. Z histogramu digitalizovaného signálu tohoto optického detektoru/detektorů fotoluminiscence se pak stanoví poloha kyvety s nejvyšší intenzitou tohoto signálu, do které se kyveta přesune, a v této poloze se zahájí nebo znovuzahájí průtokové cytometrické měření měřených částic. Tato poloha představuje optimální polohu kyvety, ve které je fluidní kanál kyvety s měřenými částicemi vystaven maximální možné intenzitě excitačního záření ze zdroje excitačního záření a zároveň je optickými detektory cytometru detekován nejlepší poměr užitečného signálu vzhledem k šumovému pozadí. Před nalezením a přesunutím kyvety do polohy s nejvyšší intenzitou signálu optického detektoru fotoluminiscence se kyveta uvede do krokového lineárního pohybu s krokem v řádu desítek až stovek mikrometrů v ose kolmé na paprsek excitačního záření, přičemž se alespoň jedním optickým detektorem přímého rozptylu snímá přímý rozptyl excitačního záření způsobený referenčními částicemi v měřicím bodu průtokového cytometru, a z histogramu digitalizovaného signálu tohoto optického detektoru se stanoví poloha kyvety s nejužším pikem tohoto signálu, do které se kyveta v této ose přesune. Poté se kyveta uvede do krokového lineárního pohybu s krokem v řádu desítek až stovek mikrometrů v ose rovnoběžné s paprskem excitačního záření, přičemž se alespoň jedním optickým detektorem bočního rozptylu snímá boční rozptyl excitačního záření způsobený referenčními částicemi v měřicím bodě průtokového cytometru, a z histogramu digitalizovaného signálu tohoto optického detektoru se stanoví poloha kyvety s nejvyšší intenzitou tohoto signálu, do které se kyveta v této ose přesune. Tímto způsobem se kyveta přesune do výhodné pozice pro hledání optimální pozice. V jiné variantě způsobu provádění průtokového cytometrického měření se kyveta před nalezením a přesunutím do polohy s nejvyšší intenzitou signálu optického detektoru fotoluminiscence přesune do polohy, ve které probíhalo některé z předcházejících cytometrických měření. V další variantě způsobu provádění průtokového cytometrického měření se kyveta před nalezením a přesunutím do polohy s nejvyšší intenzitou signálu optického detektoru fotoluminiscence přesune do polohy, ve které je v pomocném objektivu průtokového cytometru viditelný proud vzorku.SUMMARY OF THE INVENTION The object of the invention is achieved by a method of performing flow cytometric measurement in which a suspension of the measured particles is entrained by the carrier fluid from the capillary into the inner space of the cuvette through which the measured particles are illuminated by excitation radiation from at least one excitation source. the photoluminescence of the measured particles is detected by at least one optical photoluminescence detector. The essence of this method is that before flow cytometric measurement of measured particles and / or during its flow into the capillary, a suspension of reference particles of known size and character is introduced, the cuvette is introduced into a linear step motion with a step in the order of units to tens of micrometers gradually in two mutually perpendicular axes which are simultaneously perpendicular to the longitudinal axis of the cuvette, one of which is perpendicular to the excitation beam, and photoluminescence of the reference particles is detected by at least one optical photoluminescence detector. The position of the highest intensity cell in which the cuvette is moved is then determined from the histogram of the digitized signal of this optical photoluminescence detector / detector, and flow cytometric measurements of the measured particles are initiated or restarted at this position. This position represents the optimum position of the cuvette in which the fluid channel of the measured particle cuvette is exposed to the maximum possible intensity of excitation radiation from the excitation radiation source, while the best ratio of useful signal to noise background is detected by the cytometer optical detectors. Before finding and moving the cuvette to the position with the highest signal intensity of the photoluminescence optical detector, the cuvette is stepped in linear motion with a step of tens to hundreds of micrometers perpendicular to the beam of excitation radiation, and a direct excitation radiation scattering is detected by at least one direct scattering optical detector caused by reference particles in the flow cytometer measuring point, and the position of the cuvette with the narrowest peak of this signal to which the cuvette moves in this axis is determined from the histogram of the digitized signal of this optical detector. Thereafter, the cuvette is stepped in linear motion with a step of tens to hundreds of micrometers in an axis parallel to the excitation beam, with the lateral scattering of the excitation radiation caused by the reference particles at the measurement point of the flow cytometer from at least one side scatter detector, and the histogram of the digitized signal This optical detector determines the position of the cuvette with the highest intensity of this signal, to which the cuvette moves in this axis. In this way, the cuvette moves to a convenient position to find the optimum position. In another variant of the flow cytometric measurement method, the cuvette is moved to a position where some of the previous cytometric measurements have taken place before being found and moved to the highest signal position of the optical photoluminescence detector. In a further variant of the flow cytometric measurement method, the cuvette is moved to a position where the sample stream is visible in the auxiliary objective of the flow cytometer prior to being found and moved to the highest signal position of the optical photoluminescence detector.
Objasnění výkresůClarifying drawings
Na přiloženém výkrese je na obr. 1 znázorněno schéma průtokového cytometru k provádění průtokového cytometrického měření podle vynálezu, a na obr. 2 držák kyvety tohoto cytometru, na obr. 3 příkladný histogram signálu optického detektoru dopředného rozptylu, na obr. 4 příkladný histogram signálu optického detektoru bočního rozptylu, a na obr. 5 příkladný histogram signálu optického detektoru fotoluminiscence. Příklady uskutečnění vynálezuFig. 1 shows a flow cytometer for flow cytometric measurement according to the invention, and Fig. 2 shows a cuvette holder of this cytometer; Fig. 3 shows an exemplary histogram of a forward scattering optical detector; Fig. 5 shows an exemplary histogram of the photoluminescence optical detector signal. Examples of carrying out the invention
Průtokový cytometr 1_ znázorněný na obr. 1 obsahuje kyvetu 2 uloženou v držáku kyvety znázorněném na obr. 2, která je propojená s neznázorněným zdrojem nosné tekutiny, a v jejímž vnitřním prostoru je uložena nebo vyústěna otevřená kapilára 3 neznázorněné zkumavky pro uložení suspenze měřených částic 30. Mimo kapiláru 3 je této kyvetě 2 v měřicím bodu cytometru 1 přiřazen alespoň jeden zdroj 4 (monochromatického) excitačního záření, s výhodou např. laser, proti kterému je na opačné straně kyvety 2 uspořádán alespoň jeden optický detektor 5 přímého rozptylu (FSC - forward scatter) excitačního záření. Dále jí je ve stejné rovině kolmé k podélné ose 20 kyvety 2 a ke směru pohybu měřených částic 30, mimo dráhu excitačního paprsku, přiřazen alespoň jeden optický detektor 6 bočního rozptylu (SSC - side scatter) excitačního záření, a alespoň jeden, obvykle však více, optických detektorů 71, 72, 73 fotoluminiscence měřených částic 30. Každému z těchto optických detektorů 5, 6, 71, 72, 73 je přitom přiřazeni neznázorněná standardní optika, obsahující např. prvky pro kolimaci dané složky excitačního záření, resp. fotoluminiscenčního záření, a/nebo pro její/jeho vychýlení požadovaným směrem, jako např. kolimátory, čočky, zrcadla, apod., a/nebo pro úpravu jeho/jejího spektra, jako např. filtry. V jiné variantě provedení pak může být tato optika úplně nebo částečně nahrazená optickými vlákny. Optické detektory 5, 6, 71, 72, 73 jsou optické detektory libovolného známého typu, jako např. PMT, APD, CCD, CMOS apod., kterým je přiřazena neznázorněná elektronika pro čtení a digitalizaci jejich signálů. Tato elektronika přitom může být samostatná, nebo může být součástí optického detektoru 5, 6, 7Ί, 72, 73 nebo součástí řídicí jednotky 8 cytometru 1 tvořené např. počítačem, či podobným zařízením, ke které jsou optické detektory 5, 6, 71, 72, 73 připojeny.The flow cytometer 1 shown in FIG. 1 comprises a cuvette 2 housed in a cuvette holder shown in FIG. 2, which is connected to a carrier fluid source (not shown), and in which an open capillary tube 3 (not shown) for receiving a measured particle suspension 30 is disposed or opened. Outside the capillary 3, at least one source of 4 (monochromatic) excitation radiation, preferably, for example, a laser against which at least one direct scatter optical detector (FSC) is arranged on the opposite side of the cuvette 2, is assigned to the cuvette 2 at the measurement point of the cytometer 1. scatter) of excitation radiation. Further, at least one optical side scatter detector 6 of the excitation radiation is assigned to it in the same plane perpendicular to the longitudinal axis 20 of the cuvette 2 and to the direction of movement of the measured particles 30, and at least one, but usually more of optical photoluminescence detectors 71, 72, 73 of the measured particles 30. Each of these optical detectors 5, 6, 71, 72, 73 is associated with standard optics (not shown) comprising, for example, elements for collimating a given component of excitation radiation, respectively. and / or to deflect it in the desired direction, such as collimators, lenses, mirrors, and the like, and / or to adjust its spectrum, such as filters. In another embodiment, the optic may then be completely or partially replaced by optical fibers. Optical detectors 5, 6, 71, 72, 73 are optical detectors of any known type, such as PMT, APD, CCD, CMOS and the like, to which an electronics (not shown) is read for reading and digitizing their signals. The electronics may be separate, or may be part of an optical detector 5, 6, 7, 72, 73 or part of a control unit 8 of a cytometer 1, for example, a computer or similar device to which the optical detectors 5, 6, 71, 72 are. , 73 attached.
Oproti standardní konstrukci je u cytometru 1 podle vynálezu držák 9 kyvety 2 uložen pohyblivě ve dvou vzájemně kolmých osách x, y, které jsou současně kolmé k podélné ose 20 kyvety 2 (a tedy ke směru pohybu měřených částic 30), přičemž jedna z nich je současně kolmá na excitační paprsek (viz. obr. 2, na kterém je znázorněná varianta cytometru 1 se svisle orientovanou kyvetou 2, u které jsou obě tyto osy horizontální), a je propojený se dvěma krokovými motory 10 a 11 pro pohyb v těchto osách s krokem v řádu jednotek až stovek mikrometrů. Jako výhodné se během testování projevily zejména krokové motory série LSA (výrobce Zaber Technologies). Tyto krokové motory 10, 11, resp. jejich řídicí části jsou propojeny s řídicí jednotkou 8 cytometru Λ, která je spouští a řídí jejich pohyb. Kromě toho je držák 9 kyvety 2 opatřen neznázorněnými standardními upínacími prostředky, které umožňují opakované vyjímání a vkládání kyvety 2.In contrast to the standard construction, the cytometer 1 according to the invention holds the cuvette holder 9 movably in two mutually perpendicular axes x, y, which are simultaneously perpendicular to the longitudinal axis 20 of the cuvette 2 (and thus to the direction of movement of the measured particles 30), one of which is at the same time perpendicular to the excitation beam (see FIG. 2, wherein a variant of the cytometer 1 is shown with a vertically oriented cuvette 2, both of which are horizontal), and is connected to two stepper motors 10 and 11 for movement in these axes with step up to hundreds of micrometers. In particular, the LSA stepper motors (manufacturer Zaber Technologies) have proven to be advantageous during testing. These stepper motors 10, 11 and 10, respectively. their control parts are coupled to the cytometer control unit 8, which triggers and controls their movement. In addition, the cuvette holder 9 is provided with standard clamping means (not shown) which allow the cuvette 2 to be removed and inserted repeatedly.
Způsob provádění průtokového cytometrického měření podle vynálezu je pak založen na použití cytometru 1 s držákem 9 kyvety 2 uloženým výše popsaným způsobem, u kterého se signály z optických detektorů 5, 6, T\_, 72, 73, kromě standardní analýzy měřených částic 30, použijí k automatickému nalezení optimální polohy kyvety 2, a to buď před měřením daných částic 30, např. po manipulaci s kyvetou 2, nebo během měření těchto částic 30, např. po změně tlakových poměrů v kyvetě 2 a v důsledku toho i změně dráhy těchto částic v ní, a k přesunutí kyvety 2 do této optimální polohy. Optimální polohou kyvety 2 je přitom poloha, ve které je fluidní kanál kyvety 2 s jednotlivými měřenými částicemi 30 vystaven maximální možné intenzitě excitačního záření ze zdroje 4 excitačního záření a zároveň je optickými detektory 5, 6, 71, 72, 73 cytometru 1 detekován nejlepší poměr užitečného signálu vzhledem k šumovému pozadí.The flow cytometric measurement method according to the invention is then based on the use of a cytometer 1 with cuvette holder 9 stored in the above-described manner in which the signals from the optical detectors 5, 6, T1, 72, 73, except the standard analysis of the measured particles 30, they are used to automatically find the optimum position of the cuvette 2, either before measuring the particles 30, eg after handling cuvette 2, or during the measurement of these particles 30, eg after changing the pressure ratios in cuvette 2 and consequently changing the path of these particles in it, and to move cuvette 2 to this optimal position. The optimum position of the cuvette 2 is the position in which the fluid channel of the cuvette 2 with the individual measured particles 30 is exposed to the maximum possible intensity of excitation radiation from the source 4 of excitation radiation and the best ratio is detected by the optical detectors 5, 6, 71, 72, 73 of the cytometer 1 useful signal relative to noise background.
Pro nalezení optimální polohy se nejprve kyveta 2 působením pohonu 10 pohybuje ve směru osy y (dle obr. 2) kolmé na podélnou osu 20 kyvety 2 a na paprsek excitačního záření, přičemž prochází tímto paprskem (s výhodou tímto paprskem a případně jeho nejbližším okolím prochází pouze v ní uložená kapilára 3). Přitom se do řídicí jednotky 8 cytometru 1 přivádí signál z optického detektoru/detektorů 5 přímého rozptylu excitačního záření, který se využívá jako zpětná vazba pro nalezení optimální polohy kyvety 2 na této ose. Takovou optimální polohou je přitom poloha s nejužším pikem, a tedy s nejnižším variačním koeficientem, v histogramu tohoto signálu (viz obr. 3, na kterém je znázorněn příkladný histogram signálu optického detektoru 5 přímého rozptylu, ve kterém je poloha s nejužším pikem označená Y1). Po nalezení této polohy se do ní kyveta 2 působením příslušného krokového motoru 10 přesune. Pro nalezení nejužšího píku signálu optického detektoru/detektorů 5 přímého rozptylu excitačního záření se přitom signál z tohoto detektoru/detektorů 5 s výhodou digitalizuje, a nejužší pík se v histogramu tohoto signálu vyhledá prostřednictvím software obsahujícího funkce pro proložení dat Gaussovskou funkcí, automatické rozpoznání pozadí, apod. Vzhledem ktomu, že takový software a jeho funkce jsou odborníkovi v oboru dobře známé, nebudou tu blíže popisovány.To find the optimum position, the cuvette 2 is first moved by the drive 10 in the y-axis direction (as shown in FIG. 2) perpendicular to the longitudinal axis 20 of the cuvette 2 and to the beam of excitation radiation, passing through it (preferably through the beam and its immediate surroundings, respectively). capillary 3 only). In this case, a signal from the optical excitation radiation detector / detectors 5 is supplied to the control unit 8 of the cytometer 1, which is used as feedback to find the optimum position of the cuvette 2 on that axis. Such an optimum position is the position with the narrowest peak, and thus with the lowest variation coefficient, in the histogram of this signal (see Fig. 3, where an exemplary histogram of the direct scattering optical detector 5 is shown in which the narrowest peak position is designated Y1) . After finding this position, the cuvette 2 is moved into it by the action of the respective stepper motor 10. In order to find the narrowest peak of the signal of the direct excitation radiation scattering detector 5, the signal from this detector / detectors 5 is preferably digitized, and the narrowest peak is found in the histogram of the signal by software containing functions for fitting the data with the Gaussian function, automatic background recognition, and the like. Since such software and its functions are well known to those skilled in the art, they will not be further described herein.
Poté následuje nalezení optimální polohy kyvety 2 na druhé z os - tj. na ose x (dle obr. 2), která je kolmá na podélnou osu 20 kyvety 2 a současně rovnoběžná s paprskem excitačního záření. Přitom se do řídicí jednotky 8 cytometru Λ přivádí signál z optického detektoru/detektorů 6 bočního rozptylu excitačního záření, který se využívá jako zpětná vazba pro nalezení optimální polohy kyvety 2 na této ose. Takovou optimální polohou je přitom poloha s největší intenzitou signálu, a tedy s nejvyšší hodnotou pozice píku v histogramu signálu tohoto optického detektoru 6 (viz obr. 4, na kterém je znázorněn příkladný histogram signálu optického detektoru 6 bočního rozptylu, ve kterém je poloha s nejvyšší hodnotou pozice píku označená XI). Po nalezení této polohy se do ní kyveta 2 působením příslušného krokového motoru 11 přesune. Pro nalezení největší intenzity signálu optického detektoru 6 bočního rozptylu excitačního záření se přitom signál z tohoto detektoru/detektorů 5 s výhodou digitalizuje, a nejvyšší intenzita signálu se v histogramu tohoto signálu vyhledá prostřednictvím software obsahujícího funkce pro proložení dat Gaussovskou funkcí, automatické rozpoznání pozadí, apod. Vzhledem k tomu, že takový software a jeho funkce jsou odborníkovi v oboru dobře známé, nebudou tu blíže popisovány.This is followed by finding the optimum position of the cuvette 2 on the other of the axes - that is, on the x-axis (shown in FIG. 2) which is perpendicular to the longitudinal axis 20 of the cuvette 2 and parallel to the excitation beam. In this case, a signal from the optical excitation radiation detector / detector 6 is supplied to the cytometer control unit 8, which is used as feedback to find the optimum position of the cuvette 2 on that axis. Such an optimum position is the highest signal position, and therefore the highest peak position in the histogram of the signal of the optical detector 6 (see FIG. 4, where an exemplary histogram of a side scatter optical detector 6 in which the position is the highest). value of the peak position indicated by XI). After finding this position, the cuvette 2 is moved into it by the action of the respective stepper motor 11. In order to find the highest signal intensity of the optical excitation radiation side scatter detector 6, the signal from this detector / detectors 5 is preferably digitized, and the highest signal intensity is found in the histogram of the signal through software containing functions for fitting the data with the Gaussian function, automatic background recognition, etc. Since such software and its functions are well known to those skilled in the art, they will not be described in more detail herein.
Vzhledem k charakteru signálu optického detektoru/detektorů 5 přímého rozptylu a optického detektoru/detektorů 6 bočního rozptylu se při výše popsaných krocích kyveta 2 může pohybovat v hrubých krocích o velikosti desítek až stovek mikrometrů, s výhodou např. 50 až 100 mikrometrů.Due to the nature of the signal of the direct scatter optical detector / detectors 5 and the side scatter optical detector / detectors 6, the cuvette 2 can move in coarse steps of tens to hundreds of micrometers, preferably 50 to 100 microns, in the steps described above.
Po tomto hrubém nalezení optimální polohy kyvety 2 následuje doladění polohy kyvety 2 v obou osách Xi γ, ke kterému se jako zpětná vazba využije signál z alespoň jednoho optického detektoru 71 a/nebo 72 a/nebo 73 fotoluminiscence. V tomto kroku se kyveta 2 postupně pohybuje v obou horizontálních osách x, y v okolí polohy nalezené v předcházejících krocích, přičemž se hledá její poloha s nejvyšší intenzitou signálu, a tedy s co nejvyšší hodnotou pozice píku v histogramu signálu optického detektoru 71 a/nebo 72 a/nebo 73 fotoluminiscence (viz obr. 5, na kterém je znázorněn příkladný histogram signálu optického detektoru 71, 72, 73 fotoluminiscence, ve kterém je poloha s nejvyšší hodnotou pozice píku označená P). Vzhledem k tomu, že signál z optického detektoru/detektorů 6 fotoluminiscence je mnohem citlivější než signály z optického detektoru/detektorů 5 přímého rozptylu a z optického detektoru/detektorů 6 bočního rozptylu, pohybuje se kyveta 2 v této fázi prostřednictvím krokových motorů 10, 11 s krokem o velikosti jednotek až desítek mikrometrů, s výhodou např. 10 až 50 mikrometrů. Pro nalezení největší intenzity signálu optického detektoru 71 a/nebo 72 a/nebo 73 fotoluminiscence se přitom signál z tohoto optického detektoru/detektorů 71 a/nebo 72 a/nebo 73 digitalizuje, a nejvyšší intenzita signálu se v histogramu tohoto signálu vyhledá prostřednictvím software obsahujícího funkce pro proložení dat Gaussovskou funkcí, automatické rozpoznání pozadí, apod. Vzhledem k tomu, že takový software a jeho funkce jsou odborníkovi v oboru dobře známé, nebudou tu blíže popisovány. V případě, že se v tomto kroku vyhodnocuje signál z více než jednoho optického detektoru 71, 72, 73 fotoluminiscence, vyhodnotí se optimální poloha kyvety 2 jako kompromisní optimum všech nebo alespoň některých signálů, nebo se jako výchozí zvolí pouze jeden ze signálů. Tímto způsobem nalezená poloha kyvety 2 je optimální polohou kyvety 2 pro dané měření, a krokové motory 10,11 ji v této pozici udržují po dobu měření daných částic 30. Během hledání optimální polohy kyvety 2 před zahájením průtokového cytometrického měření daných částic, případně v jejím průběhu, přitom kyvetou 2 prochází kalibrační částice známé velikosti a struktury, např. normalizované latexové mikrokuličky, apod., případně částice 30 z některého z předcházejících měření.Following this rough finding of the optimum cuvette position 2, the cuvette position 2 in both axes Xi γ is tuned to which the signal from at least one optical detector 71 and / or 72 and / or 73 photoluminescence is used as feedback. In this step, the cuvette 2 moves sequentially in the two horizontal axes x, y in the vicinity of the position found in the previous steps, searching for its position with the highest signal intensity, and thus with the highest peak position value in the histogram signal of the optical detector 71 and / or 72 and / or 73 photoluminescence (see FIG. 5, in which an exemplary histogram of a photoluminescence optical detector 71, 72, 73 is shown in which the position with the highest peak position is indicated by P). Since the signal from the photoluminescence optical detector / detectors 6 is much more sensitive than the signals from the direct scatter optical detector / detectors 5 and the side scatter optical detector 6, the cuvette 2 moves at this stage with step motors 10, 11 with a step of units up to tens of micrometers, preferably, for example, 10 to 50 micrometers. In order to find the highest signal intensity of the photoluminescence optical detector 71 and / or 72 and / or 73, the signal from the optical detector / detectors 71 and / or 72 and / or 73 is digitized, and the highest signal intensity is found in the histogram of the software via software containing functions for fitting the data with a Gaussian function, automatic background recognition, etc. Since such software and its functions are well known to those skilled in the art, they will not be described in detail here. If the signal from more than one optical photoluminescence detector 71, 72, 73 is evaluated in this step, the optimum cuvette position 2 is evaluated as a compromise optimum for all or at least some of the signals, or only one of the signals is selected by default. The cuvette 2 position thus found is the optimum position of the cuvette 2 for a given measurement, and the stepper motors 10, 11 maintain it in this position for the measurement of the particles 30. During the search for the optimum cuvette position 2 before the flow cytometric measurement of the particles, or its During this process, the cuvette 2 passes the calibration particles of known size and structure, e.g., normalized latex microspheres, etc., or particles 30 of any of the preceding measurements.
Pokud by z nějakého důvodu nedošlo v některém z kroků k nalezení optimální polohy kyvety 2 v některé z os x, y, je možné kterýkoliv krok, nebo některou jeho část alespoň jednou zopakovat. V jiné variantě způsobu provádění průtokového cytometrického měření podle vynálezu se vynechají první dva výše popsané kroky hledání optimální polohy kyvety 2, a kyveta 2 se působením krokových motorů 10, 11 přesune do polohy, ve které probíhalo předcházející nebo některé z předcházejících průtokových cytometrických měření, přičemž tato poloha/polohy může být uložená v paměti řídicí jednotky 8 cytometru i. Poté proběhne již jen doladění polohy kyvety 2 s využitím signálu z optického detektoru 71 a/nebo 72 a/nebo 73 fotoluminiscence. V případě, že není daný cytometr Λ osazen optickým detektorem 5 přímého rozptylu a/nebo optickým detektorem 6 bočního rozptylu excitačního záření, je možné provést hrubé nastavení polohy kyvety 2 v příslušné ose prostřednictvím pomocného objektivu, který je standardní součástí cytometru i, nebo kterým lze cytometr Λ na přechodnou dobu osadit, a (např. manuálního) posunu kyvety 2 a poté přejít k těm krokům nalezení optimální polohy kyvety 2, které senzorické vybavení daného cytometru 1 umožňuje, zejména k jemnému doladění polohy kyvety 2 s využitím signálu z optického detektoru 71. a/nebo 72 a/nebo 73 fotoluminiscence. Při tomto postupu obsluha cytometru 1 pohybuje např. manuálně držákem 9 kyvety 2 až do chvíle, kdy je v pomocném objektivu pozorovatelný proud vzorku. V tomto okamžiku se také objeví signál (pík mimo šumové pozadí) na nějakém z optických detektorů, kterými je daný cytometr osazen. Po přesunutí kyvety 2 do této polohy obsluha prostřednictvím řídicí jednotky 8 cytometru i spustí kroky výše popsaného způsobu nalezení optimální polohy kyvety 2, které senzorické vybavení daného cytometru Λ umožňuje. I když se kyveta 2 během provádění způsobu průtokového cytometrického měření podle vynálezu pohybuje s krokem v řádu maximálně stovek mikrometrů, je výhodné, pokud její uložení a její pohony 10,11 umožňují její pohyb i ve větším rozsahu, např. pro její přemístění do polohy, ve které je snaží manipulace s ní, např. při její výměně, apod.If, for any reason, one of the steps to find the optimal cuvette position 2 in any of the x, y axes, any step or one of its parts can be repeated at least once. In another variation of the flow cytometric measurement method of the present invention, the first two cuvette 2 search steps described above are omitted, and the cuvette 2 is moved to the previous or some prior flow cytometric measurements by step motors 10, 11, this position / position can be stored in the memory of the control unit 8 of the cytometer i. Then, only the cuvette position 2 is tuned using the signal from the optical detector 71 and / or 72 and / or 73 of the photoluminescence. If the given cytometer Λ is not equipped with a direct scattering optical detector 5 and / or an optical excitation radiation side scattering optical detector 6, it is possible to perform a coarse adjustment of the cuvette position 2 in the respective axis by means of an auxiliary lens, which is a standard part of the cytometer i, or by which Cytometer adit temporarily fits, and (eg, manually) shifts the cuvette 2 and then proceeds to the steps to find the optimal cuvette position 2, which sensory equipment of the cytometer 1, in particular to fine-tune the cuvette position 2 using the signal from the optical detector 71 and / or 72 and / or 73 photoluminescence. In this procedure, the operator of the cytometer 1, for example, moves the cuvette holder 9 manually, for example, until a sample stream is observable in the auxiliary objective. At this point, a signal (peak outside the noise background) will also appear on any of the optical detectors to which the cytometer is mounted. After the cuvette 2 is moved to this position, the operator, through the cytometer control unit 8, starts the steps of the method described above to find the cuvette 2 position that the sensor equipment of the cytometer allows. Although the cuvette 2 during the flow cytometric measurement method of the present invention moves with a step of a maximum of hundreds of micrometers, it is preferred that its positioning and its drives 10, 11 allow it to move even to a greater extent, e.g. in which it is attempted to manipulate it, eg when it is exchanged, etc.
Průmyslová využitelnostIndustrial usability
Způsob provádění průtokového cytometrického měření podle vynálezu je využitelný pro standardní cytometrická měření, při kterých se měří různé vlastnosti velkého množství pevných částic malých rozměrů, nejčastěji biologického původu - např. různých typů buněk, virů, chromozomů, apod., ale také různých anorganických materiálů - např. částic prachu, apod. Jeho výhodou je, že oproti dosud známým způsobům umožňuje před měřením daných částic, např. po manipulaci s kyvetou cytometru, nebo během měření těchto částic, např. po změně tlakových poměrů v kyvetě cytometru, na základě signálů z optických detektorů cytometru automaticky nalézt optimální polohu této kyvety, ve které je její fluidní kanál s jednotlivými měřenými částicemi vystaven maximální možné intenzitě excitačního záření ze zdroje excitačního záření a zároveň je optickými detektory cytometru detekován nejlepší poměr užitečného signálu vzhledem k šumovému pozadí.The flow cytometric measurement method of the present invention is applicable to standard cytometric measurements, in which various properties of a large number of small particle sizes, most often of biological origin, such as different cell types, viruses, chromosomes, etc., but also various inorganic materials are measured. such as dust particles, etc. Its advantage is that, compared to the prior art methods, it allows the particles to be measured, for example, after the cytometer cuvette has been manipulated, or during the measurement of these particles, e.g. Optical detectors of the cytometer automatically find the optimal position of this cuvette in which its fluid channel with individual measured particles is exposed to the maximum possible intensity of excitation radiation from the source of excitation radiation and at the same time the best detection of the cytometer is detected by the optical detectors of the cytometer. the ratio of useful signal to noise background.
Seznam vztahových značek 1 průtokový cytometr 2 kyveta 20 podélná osa kyvety 3 kapilára 30 měřená částice 4 zdroj excitačního záření 5 optický detektor přímého rozptylu excitačního záření 6 optický detektor bočního rozptylu excitačního záření N 71 optický detektor fotoluminescence 72 optický detektor fotoluminescence 73 optický detektor fotoluminescence 8 řídicí jednotka průtokového cytometru 9 držák kyvety . 10 krokový motor 11 krokový motorReference list 1 flow cytometer 2 cuvette 20 cuvette longitudinal axis 3 capillary 30 measured particle 4 excitation radiation source 5 optical excitation radiation direct dispersion detector 6 optical excitation radiation scattering detector N 71 optical detector fotoluminescence 72 optical photoluminescence detector 73 optical photoluminescence detector 8 control flow cytometer unit 9 cuvette holder. 10 stepper motor 11 stepper motor
Claims (3)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-590A CZ2015590A3 (en) | 2015-08-31 | 2015-08-31 | A method of implementing the flow-cytometric measurement |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2015-590A CZ2015590A3 (en) | 2015-08-31 | 2015-08-31 | A method of implementing the flow-cytometric measurement |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ306640B6 CZ306640B6 (en) | 2017-04-12 |
| CZ2015590A3 true CZ2015590A3 (en) | 2017-04-12 |
Family
ID=58699383
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2015-590A CZ2015590A3 (en) | 2015-08-31 | 2015-08-31 | A method of implementing the flow-cytometric measurement |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2015590A3 (en) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3523737A (en) * | 1964-12-16 | 1970-08-11 | Gilford Instr Labor Inc | Cuvette positioning device for optical density analytical apparatus |
| JP3979304B2 (en) * | 2003-02-24 | 2007-09-19 | 日本光電工業株式会社 | Flow cell positioning method and flow cytometer with adjustable flow cell position |
| JP5167194B2 (en) * | 2009-04-28 | 2013-03-21 | 株式会社日立エンジニアリング・アンド・サービス | Microbiological testing device |
| JPWO2013145836A1 (en) * | 2012-03-30 | 2015-12-10 | ソニー株式会社 | Microchip type optical measuring apparatus and optical position adjusting method in the apparatus |
-
2015
- 2015-08-31 CZ CZ2015-590A patent/CZ2015590A3/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ306640B6 (en) | 2017-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10234392B2 (en) | Optical engine for flow cytometer, flow cytometer system and methods of use | |
| US9372143B2 (en) | Scanning image flow cytometer | |
| KR102182575B1 (en) | Optical construction method for spectral scatter flow cytometry | |
| JP5381741B2 (en) | Optical measuring apparatus and optical measuring method | |
| JP5481035B2 (en) | Optical sensor system and inspection method for liquid processing apparatus | |
| JP6258353B2 (en) | Optical measurement apparatus and method for analyzing samples contained in droplets | |
| US20060177348A1 (en) | Cell sorter chip having gel electrodes | |
| CN107407551A (en) | For the method, system and device for making microscope focus on automatically on substrate | |
| JP2020535421A (en) | Methods and equipment for optically inspecting multiple microsamples | |
| KR20120013297A (en) | Method and system for analysing solid particles in a medium | |
| CN109964111A (en) | Equipment for identifying diamond | |
| CN110865054A (en) | Particle sorting equipment and particle sorting method | |
| US9513206B2 (en) | Particle measuring apparatus | |
| US20140374623A1 (en) | Method and apparatus for measuring optical properties of particles of a dispersion | |
| CZ2015590A3 (en) | A method of implementing the flow-cytometric measurement | |
| WO2019181803A1 (en) | Fine particle measurement device | |
| EP2522981A1 (en) | Compact 2D light detection system for on-chip analysis | |
| WO2019207988A1 (en) | Microparticle fractionating device and microparticle fractionating method | |
| US11858008B2 (en) | Systems and methods for particle sorting with automated adjustment of operational parameters | |
| US20220299420A1 (en) | Systems and methods for image cytometry | |
| US7262843B2 (en) | Method and device for correcting for the size and/or shape of a measuring volume in a chemical and/or biological sample | |
| CN117546006A (en) | Concentration measuring device | |
| WO2024040198A1 (en) | Combined microfluidic resistive pulse sensing and fluorescence device | |
| CA2836376C (en) | A measurement device |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20230831 |