JP3974564B2 - スポット切り出し装置 - Google Patents

Description

本発明は、タンパク質や核酸を分離する１次元または２次元の電気泳動に係わり、電気泳動により分離されたスポットを質量分析等のために切り取るスポット切り出し装置に関する。

タンパク質や核酸試料をアガロースゲルや架橋アクリルアミドゲルを用いた電気泳動により分離する方法は古くから知られている。この分離方法は、分子量により分離するいわゆる電気泳動だけでなく、１次元目で等電位点分離、２次元目で分子量により分離する２次元電気泳動も１９７０年代に完成した技術である。

最近では、２次元電気泳動により得られたゲルのパターンをディファレンシャルディスプレイにより比較し、特異的なスポットを解析する技術が盛んに用いられている。

ディファレンシャルディスプレイとは、同位置でのスポットの有無から疾病等に関与するタンパク質を解析するものである。ディファレンシャルディスプレイによりスポットを選定し、形成したタンパク質を質量分析計で測定できる１００００ダルトン以下（通常は４０００ダルトン以下）となるペプチドが多くなるよう酵素消化し、ペプチドマスフィンガープリンティングやシーケンスタグ法によりタンパク質を同定する。

ゲルのスポット切り出しについて、スポットが少数の場合はマニュアル作業でメス等で切り出しているが、多数のスポットを切り出す機能を備えたスポット切り出し装置も市販されている。たんぱく質スポット切り出しについては、非特許文献１に記載されている。

通常のスポット切り出し装置は２次元電気泳動パターンを画面上に取り込み、ソフトウェアによるスポットの自動認識または目視により、切り出すスポットを決定し、金属またはプラスチック製の筒状の治具によりスポットを打ち抜いている。

打ち抜くべきスポットは複数個存在する場合が多く、これらのスポットのサイズも形状も一定でない。このため、打ち抜き治具では収まりきらないスポットも存在するが、この場合は、打ち抜き治具により複数回切り出して１試料として纏めるスポット切り出し装置が知られている。

「プロテオミクスにおけるバイオインフォマティックスの役割」、ＩＰＡＢセミナー、プロテオミクスの現状と動向、７/２４/２００２

ところで、打ち抜き治具は、新たなスポットを切り出す前には、自動洗浄工程により洗浄されるが、近年、質量分析計の高感度化等により濃度の低いスポットを切り出す作業が増加し、微量の試料混合（コンタミ）でも影響を与えるため、切り出し治具の洗浄不十分のためのコンタミが危惧されている。

また、特にゲノム市場やプロテオーム市場ではグローバル化が進み、ハイスループットな解析が要求される中で切り出し治具洗浄工程も短縮化が必要になっている。

しかしながら、従来技術における打ち抜き治具では、十分な洗浄を行うためには、治具洗浄工程において、洗浄時間の短縮化には限界があり、さらなるハイスループットな解析に対応することは困難であった。

本発明の目的は、試料間のコンタミを防止することができ、かつハイスループット処理が可能なスポット切り出し装置を実現することである。

本発明は、試料を電気泳動し染色して得られたスポットを含むゲルに対し、圧縮気体を照射して所定範囲のゲルを切断する、切り出し装置及び方法に関する。

ゲルは、半乾燥ゲル、未乾燥ゲルをラップ等のプラスチックフィルム上においたもののどちらの状態でも良く、プラスチックと共に容器に入っても、分析時にはゲル中試料とプラスチックフィルムは別に認識できるので問題ない。

ゲルの厚さは通常１ｍｍ以下であり、スポットは圧縮気体により切り出せるので、切り出しにメス等の固体を使用した際に生じる、他スポットとの混合（コンタミ）の可能性がない。

更に、圧縮気体のノズルは直径変化可能、また円形か長円形かの選択も可能であるため、異なるスポット形状に対処可能である。

メス等の切り出し治具を使用しないために従来の切り出し治具洗浄時間が不要であり、切り出したスポットは複数穴がある試料容器に移すことができるのでハイスループット対応でもある。

スポット染色は、可視のクマシーブライアントブルー（CBB）や銀染色のみならず、蛍光染色でも行えるよう本発明には蛍光励起機構や蛍光検出装置を兼ね備えると望ましい。

更に、受託解析のように、試料提供後にゲル電気泳動および本発明の切り出し装置によるゲル切り出しを行う場合、ゲル電気泳動後にゲル写真を受託解析発注者に電子メール等で送付し、受託解析発注者はリファレンスゲルと比較して切り出すスポットを図示して受託解析者に送り返す。

受託解析者は切り出し位置が図示されたゲル電気泳動写真データを本発明の切り出し装置付設のＰＣに入力し、切り出し位置をソフトウェアにより切り出し装置に自動的に伝えてゲルを切り出す。

この方法によれば、伝達の際にゲル切り出し位置を間違えることがなくなり、受託解析の信頼性向上につながる。

試料間のコンタミを防止することができ、異なるスポット形状に合った切り出しを行え、かつハイスループット処理が可能となる。

上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果は、添付図面を参照した次の説明で明白になるであろう。

以下、本発明の実施形態を添付図面を参照して説明する。

（第１の実施形態）
図１は、本発明の第１の実施形態である電気泳動スポット切り出し装置の概念図である。

図１において、電気泳動スポット切り出し装置１のゲル固定治具２に、ゲル乾燥機により半乾燥状態にした半乾燥２次元電気泳動ゲル３を固定する。半乾燥２次元電気泳動ゲル３は、通常１ｍｍ以下の厚さであり、重力でたわまない程度に半乾燥しておく。

２次元電気泳動ゲル３はゲル固定治具２で挟んだ状態で固定され、重力により反らない程度に乾燥させておく。２次元電気泳動ゲル３の上側にはゲルイメージスキャナー４があり、ゲルのスポット位置はＰＣ５のＣＲＴ画面５１で目視できる。スポット３１は電気泳動後のゲルを可視染色または蛍光染色して得られる。

次に、スポット３１を切り出す工程を説明する。
スポットの選択は、ＣＲＴ画面５１上で測定者が手動で行っても良いし、スポット自動選択ソフトウェア５２を用いて自動処理しても良い。スポット自動選択ソフトウェア５２は市販されているソフトウェア同等の機能で差し支えない。

手動で行う場合は、ＣＲＴ画面５１で、スポット３１を囲むように形状設定し、切り出しに用いるための高圧窒素ガス排出ノズル６の形状を決める。つまり、高圧窒素ガス排出ノズル６は、直径２ｍｍタイプノズル６１、直径４ｍｍタイプノズル６２、直径６ｍｍタイプイズル６３から選択できる。

図２は、直径２ｍｍタイプノズル６１の断面図である。この図２に示すように、ノズル６１は、直径２ｍｍの半円ノズル部分６１１、６１２および直線ノズル部分６１３、６１４からなり、各々は厚さ２００μｍのアルミニウム製である。

直線ノズル部分６１３、６１４は、板状となっており、図２の紙面表面から裏面方向に延びた形状となっている。また、半円ノズル部分６１１、６１２も図２の紙面表面から裏面方向に延びた形状となっている。そして、半円ノズル部分６１１、６１２は、直線ノズル部分６１１と６１２との間で、移動可能となっている。

なお、直径４ｍｍタイプノズル６２や直径６ｍｍタイプノズル６３は、図２に示した直径２ｍｍタイプノズル６１の直径を各々４ｍｍ、６ｍｍに変えたものであり、形状は同等となっている。また、種々のスポットの形状に適合させるため、高圧窒素ガス排出ノズル６（気体がその内部を通過可能なノズル）の直径は、２ｍｍ、４ｍｍ、６ｍｍ以外の大きさ以外のものでもよい。

ＣＲＴ画面５１で高圧窒素ガスノズル形状を直径２ｍｍの円形に設定すると、半円ノズル部分６１１、６１２は、半円ノズル移動機構（図示せず）により、互いに接近するように移動され、図３に示すような、短円直径２ｍｍタイプ６１のノズルを形成し、半円ノズル部分６１１、６１２のみを用いて高圧窒素ガスノズルを形成することができる。

また、ＣＲＴ画面５１でノズル形状を長方形＋半円形に設定することもできる。この場合は、ＣＲＴ画面５１で設定した形状に合わせ、図２に示すように半円ノズル部分６１１、６１２および直線ノズル部分６１３、６１４を併用して高圧窒素ガスノズルを形成する。

高圧窒素ガスノズルの形成はＣＲＴ画面５１からの情報に基づいて自動で行えるように半円ノズル移動機構を具備した高圧窒素ガスノズル保持具７が設置してある。

また、スポットが回転した楕円形の場合もあるので、そのスポットに合わせて高圧窒素ガスノズルの形状を保持具７により回転することも可能な、高圧窒素ガスノズル回転機構８も設けてある。

直径２ｍｍタイプノズル６１は、高圧窒素ガスノズル保持具７に設置されており、高圧窒素ガスノズル６に直径４ｍｍタイプノズル６２や直径６ｍｍタイプノズル６３を用いる場合は、高圧窒素ガスノズル保持具７に各々の高圧窒素ガスノズルを設置できる。

高圧窒素ガスノズルの付け替えは手動で行っても良いし、高圧窒素ガスノズル自動切換え機構９を設置して行っても良い。また、円形ノズルの直径も６ｍｍよりも大きくても差し支えない。

更に、図４に示すように、スポット形状に合わせて、高圧窒素ガス排出ノズル６の先端に窒素ガス径絞り治具１４を取り付け、ＣＲＴ画面５１の指示により２次元電気泳動ゲル３上のスポット周辺に点線状に切り込みを付ける機能を付けても良い。

また、図１および図５に示すように２次元電気泳動ゲル３から見て高圧窒素ガス排出ノズル６と反対側にゲル断片受け容器１０が設置してあり、高圧窒素ガス発生装置１１（ノズルに圧縮気体を供給する圧縮気体供給手段）から窒素が高圧窒素ガス排出ノズル６を経由して噴出され、選択されたスポット３１を切り出してゲル断片受けチューブ（容器）１０に入れる。

半乾燥２次元電気泳動ゲル３の厚さは通常１ｍｍ以下であり、３kg/cm²を標準とする窒素圧で切断できるが、窒素気圧は測定者が随時変えられるものとする。

ゲル断片受けチューブ１０は２４穴や９６穴のようにゲル受けを複数兼ね備えると望ましい。

ＣＲＴ画面５１で複数スポットを選択し、ゲル受けを複数有するゲル断片受けチューブ１０内のゲルを入れる位置も同時に設定する。２次元電気泳動ゲル３は固定されているが、スポット切り出し指示に従って高圧窒素ガス排出ノズル６およびゲル断片受け容器１０が２次元電気泳動ゲル３に対して移動する。

高圧窒素ガス排出ノズル６およびゲル断片受け容器１０の移動は、図８に示すような、ＸＹステージ６４およびＸＹステージ１０４により行う。２次元電気泳動ゲル３と高圧窒素ガス排出ノズル６との間隔は、スポットを正確に切り出せるように２ｍｍに固定されている。ただし、設定によりこの間隔は変更可能である。

また、連続切り出し運転の設定も可能である。さらに、切り出したゲルを窒素ガスによってゲル断片受けチューブ１０に入れた際に飛び散らないように、図５で示すように、ゲル断片受けチューブ１０にはセプタム１５を設置しておく。

このセプタム１５は使用前は開口可能な溝がある蓋であり、高圧窒素ガスによって切り出されたスポット片は、高圧窒素ガスによりセプタム１５の溝が開口され、ゲル断片受けチューブ１０に入れられる。その後、セプタム１５の溝はすぐに閉まるため、スポット片がゲル断片受けチューブ１０外に飛散することはない。

ゲル断片受けチューブ１０内での飛散は、分析前に遠心分離機に掛ける等の措置でスポットをゲル断片受けチューブ１０の底部分に集約できる。スポットが多数の場合に備えて、図６に示すように、複数のゲル断片受けチューブ１０を同時に設置する。そして、ゲル断片受けチューブ移動機構１６によりゲル断片受けチューブ１０を移動し、順次スポット切り出しするための高圧窒素ガス排出ノズル６の下に設置する機構を設けると更に望ましい。

また、蛍光染色したスポットにも対応できるよう、図７に示すように、レーザ等の蛍光励起機構１７および蛍光検出機構１８を備え、蛍光検出し易いように本発明のスポット切り出し装置を暗箱１９に覆うように構成することが望ましい。

蛍光励起機構１７は半乾燥２次元電気泳動ゲル３全体をスキャンできる機構を備えている。２次元電気泳動ゲル３のスキャンによる蛍光データは、一時的にＰＣ５３に保存して、その情報から切断位置を選択後、蛍光励起機構１７を使わずに保存された蛍光データを基にスポットを切り出しても良い。また、切り出し時にも蛍光励起機構１７により蛍光を励起しながらスポットを切り出しても良い。

尚、本発明の第１の実施形態におけるスポット切り出しのための圧縮気体は高圧窒素ガスを用いているが、高圧空気等の圧縮気体でも差し支えない。

以上のように、本発明の第１の実施形態によれば、切り出すスポットの形状に適合させて、面形状を変更可能なノズルから、圧縮気体を噴出して、ノズルを切り出すように構成したので、切り出すスポットに接触することなく、スポットを切り出すことができ、ノズルに試料が付着することによる試料混合の発生を大幅に低減することができるの。

したがって、試料間のコンタミを防止することができ、異なるスポット形状に合った切り出しを行え、かつハイスループット処理が可能なスポット切り出し装置を実現することができる。

（第２の実施形態）
図８は本発明の第２の実施形態である電気泳動スポット切り出し装置の概念図である。

図８において、電気泳動スポット切り出し装置１に厚さ２０μｍの保持フィルム２０を張り、この保持フィルム２０上に２次元電気泳動ゲル３を置く。２次元電気泳動ゲル３は電気泳動終了後、特に乾燥させる必要はない。２次元電気泳動ゲル３の上側にはゲルイメージスキャナー４が配置され、ゲル３のスポット位置３１はＰＣ５のＣＲＴ画面５１で目視できる。

保持フィルム２０の材質はポリエチレンテレフタレートやポロ塩化ビニリデン等で良く、厚さは２０μｍに限るものではないが、質量分析計に掛ける際の阻害物質である界面活性剤を含まないものが望ましい。

スポットの切り出し方法等は第１の実施形態と同様である。また、図１および図５に示すように、２次元電気泳動ゲル３を保持する保持フィルム２０から見て高圧窒素ガス排出ノズル６と反対側にゲル断片受け容器１０が設置してある。そして、ＣＲＴ画面５１でスポット切り出し指示を行えば高圧窒素ガス発生装置１１から窒素が高圧窒素ガス排出ノズル６を経由して発射され、選択されたスポット３１およびスポットの真下部分の保持フィルム２０を切り出してゲル断片受けチューブ１０に入れる。

チューブ１０には選択されたスポット３１のみならずスポットの真下部分の保持フィルム２０も入るが、その後の例えばタンパク質同定解析においては保持フィルム２０は目的タンパク質とは明確に区別されるので差し支えない。

２次元電気泳動ゲル３を保持した保持フィルム２０は固定されて動かないが、ＣＲＴ画面５１での設定に合わせて、スポット切り出し指示に従って高圧窒素ガス排出ノズル６およびゲル断片受け容器１０が移動する。稼動はＸＹステージ６４およびＸＹステージ１０４により行う。

この第２の実施形態においても、第１の実施形態と同様に、蛍光励起機構１７を用いて蛍光染色ゲルを切断しても構わない。

本発明の第２の実施形態においては、保持フィルム２０により２次元電気泳動ゲル３を保持し、ゲル３のスポット３１と共に切り出された保持フィルム２０の断片をゲル断片受け容器１０に収容するように構成している。

したがって、第１の実施形態と同様な効果を得ることができる他、 ゲルの固定が容易で切り出し作業性が向上される。

（第３の実施形態）
本発明の第３の実施形態は、上述した第１または第２の実施形態であるスポット切り出し装置を用いた受託解析として、顧客の試料を電気泳動、スポット切り出し、前処理、質量分析からデータベース検索によるタンパク質同定まで行う受託解析システムである。

図９は、本発明の第３の実施形態である受託解析システムの動作フローチャートである。

図９において、顧客（同定依頼側）はタンパク質同定の依頼を受託側（分析側）に発注する（ステップ１００）。次に、ステップ１０１で、顧客は、細胞からタンパク質を抽出し、抽出した試料を受託側に送る。

そして、顧客が抽出したタンパク質を受託側が受け取り、電気泳動分離する。電気泳動分離方式は、顧客の希望により、また受託解析側の設備や方針により、１次元電気泳動（SDS-PAGE）または２次元電気泳動（２D-PAGE）とする。受託者は、電気泳動を行って得られた電気泳動パターンを電子ファイルとして、顧客に電子メール等を用いて送付する（ステップ２００）。

顧客は受託者から伝送された電気泳動パターンをリファレンスゲル等と比較してスポット切り出し位置を選択し、電気泳動パターン上にマークして保存し、受託解析側に電子メール等を用いて送付する（ステップ１０２）。

受託解析側はＰＣ５に顧客から送付されたスポット切り出し位置情報を保存し、そのファイルを加工することなくスポット切り出し位置情報をスポット切り出し装置に情報伝達し、顧客指示に忠実にスポット切り出しを行う（ステップ２０１）。

本方式により、顧客からのスポット切り出し指示と、受託解析側が行うスポット切り出しとの間で誤解を防げるので、電気泳動およびスポット切り出しを含む受託解析の信頼性を向上できる。

次に、受託者は、スポット切り出しした試料を質量分析し（ステップ２０２）、タンパク質を同定し、それを電子データとして顧客に電送する（ステップ２０３）。

顧客は受託者からの結果報告を受け取り（ステップ１０３）、伝票等を受託者に送付する（ステップ１０４）。

なお、顧客はスイスプロット等、ｗｅｂ上で公開されているデータベースで２次元電気泳動図を得ることができるように構成できる。このようにすれば、受託者が実際に電気泳動して作成した２次元電気泳動図と比較して、既知タンパク質、未知タンパク質の情報に基づいて、解析依頼するゲルスポットを選択できる。この選択は、受託者側/顧客側の電子ファイルのやり取りを通してできる。

また、受託者側も、ｗｅｂ上で公開されているデータベースとの比較により、既知タンパク質は解析せず未知タンパク質を解析するように、電子ファイルを顧客に提案できる。

なお、既知タンパク質/未知タンパク質の判断は、ＰＣに自動判断ソフトウエアを搭載することが望ましいが、目視で判断してもよい。

本発明の第１または第２の実施形態であるスポット切り出し装置は、異なるスポット形状に合った切り出しを行え、かつハイスループット処理が可能であるため、多数の顧客に対して、ネットワーク等を介した、タンパク質同定サービスを行うことができる。

本発明の第１の実施形態であるスポット切り出し装置の概略構成図である。 図１の例のノズル形状の説明図である。 図１の例のノズル形状の説明図である。 スポット切り出しの説明図である。 切り出したスポットを受け取りを説明する図である。 切り出したスポットを受け取りを説明する図である。 第１の実施形態の変形例を示す図である。 本発明の第２の実施形態であるスポット切り出し装置の説明図である。 本発明の第３の実施形態である受託解析システムの概略動作フローチャートである。

符号の説明

１ 電気泳動スポット切り出し装置
２ ゲル固定治具
３ 半乾燥２次元電気泳動ゲル
４ ゲルイメージスキャナ
５ ＰＣ
６ 高圧窒素ガス排出ノズル
７ 高圧窒素ガスノズル保持具
８ 高圧窒素ガスノズル回転機構
９ 高圧窒素ガスノズル自動切換え機構
１０ ゲル断片受けチューブ
１１ 高圧窒素ガス発生装置
１２ フィルム固定ＸＹステージ
１３ ＸＹステージ
１４ 窒素ガス径絞り治具
１５ セプタム
１６ ゲル断片受けチューブ移動機構
１７ 蛍光励起機構
１８ 蛍光検出機構
１９ 暗箱
２０ 保持フィルム
３１ ２次元電気泳動ゲル
５１ ＣＲＴ
５２ スポット自動選択ソフトウェア
６１、６２、６３ ノズル
６１１、６１２ 半円ノズル部分
６１３、６１４ 直線ノズル部分、

Claims (5)

1. 試料を電気泳動して得られたゲルを可視染色または蛍光染色して形成されたスポットを上記ゲルから切り出すスポット切り出し装置であって、
   気体がその内部を通過可能なノズルと、
   上記ノズルに圧縮気体を供給する圧縮気体供給手段と、
   を備え、上記ノズルから噴射される気体により、上記スポットを選択的に切り取り分取することを特徴とするスポット切り出し装置。
2. 請求項１記載のスポット切り出し装置において、上記ノズルの断面形状を選択的に変化する機構を備えることを特徴とするスポット切り出し装置。
3. 請求項１または２記載のスポット切り出し装置において、上記ゲルに形成され、切り出すべきスポットを、認識する手段を備えることを特徴とするスポット切り出し装置。
4. 請求項１記載のスポット切り出し装置において、蛍光励起機構または蛍光検出機構を備えることを特徴とするスポット切り出し装置。
5. 電気通信回線を用いたタンパク質の同定方法であって、
   同定依頼側からの試料を分析側が電気泳動し、得られたスポット情報を同定依頼側に電送し、
   電送されたスポット情報のうち、切り出すべきスポットを選択して、選択したスポット情報を分析側に電送し、
   同定依頼側から電送されたスポット情報に基づいて、請求項１記載のスポット切り出し装置により、選択されたスポットを切り出し、
   切り出したスポットを質量分析してタンパク質を同定し、同定した情報を同定依頼側に電送することを特徴とする電気通信回線を用いたタンパク質の同定方法。
   

Images