JP3951273B2 - ヒト遺伝子 - Google Patents
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推測されている。これらの遺伝情報は遺伝子(DNA)からmRNAが転写され、次に蛋白質に翻
訳されるという流れに沿い、調節蛋白質、構造蛋白質あるいは酵素が作られ、生命現象を維持している。上記遺伝子から蛋白質翻訳までの流れの異常は、細胞の増殖・分化などの生命維持システムの異常を惹起し、各種疾患の原因となるとされている。
細胞の増殖・分化に関わるもの、プロテアーゼ、ATPase、スーパーオキシドディスムターゼのような代謝酵素などの医薬品開発にとって有用な素材となると思われる遺伝子が多く見つかっている。
オキシターミネーター法により4種の塩基特異的に停止する伸長反応を行ない、自動DNAシークエンサーにより、遺伝子の5'末端から約400塩基配列を決定した。かくして得られた
塩基配列情報について、公知のバクテリアから酵母、線虫、マウス及びヒトなどの動植物
種に類似性を有する新規なファミリー遺伝子を検索した。
グナル伝達系因子、代謝酵素などがあり、遺伝子解析によって得られた本発明の新規な遺伝子と類似性ある遺伝子との相同性から、およそのその遺伝子産物、即ち蛋白質がどのような機能を有するか類推することが可能である。更に、その候補遺伝子を発現ベクターに組込み、リコンビナントを作製し、酵素活性や結合活性などの機能を調べることができる。
を特徴とする新規なヒト遺伝子、前記各アミノ酸をコードする配列番号:2、:5、:8、
:11、:14、:17、:20、:23、:26、:29、:32、:35、:38及び:41で示される塩基配列を含むことを特徴とするヒト遺伝子、並びに配列番号:3、:6、:9、:12、:15、
:18、:21、:24、:27、:30、:33、:36、:39及び:42で示される塩基配列であることを特徴とする新規なヒト遺伝子が提供される。
るDNA配列から演繹されるものを挙げることができ、それらの各塩基配列は、配列表に示
される通りである。
、本発明はかかる一本鎖DNA配列に相補的なDNA配列やこれらの両者を含むコンポーネントもまた包含する。尚、配列番号:3n-1(n=1〜14の整数)に示す本発明遺伝子の配列は、これによりコードされる各アミノ酸残基を示すコドンの一つの組合わせ例であり、本発明遺伝子はこれに限らず、各アミノ酸残基に対して任意のコドンを組合わせ選択したDNA塩
基配列を有することも勿論可能である。該コドンの選択は常法に従うことができ、例えば利用する宿主のコドン使用頻度を考慮することができる〔Ncl.Acids Res., 9, 43-74 (1981)〕。
ることもあり、また翻訳後の修飾により、或は遺伝子工学的手法により天然の遺伝子(本発明遺伝子)を、例えばサイトスペシフィック・ミュータゲネシス〔Methods in Enzymology, 154, p350, 367-382 (1987);同100, p468 (1983) ;Nucleic Acids Research, 12,
p9441 (1984);続生化学実験講座1「遺伝子研究法II」、日本生化学会編, p105 (1986) 〕などの方法により改変したり、リン酸トリエステル法やリン酸アミダイト法などの化学合成手段〔J. Am. Chem. Soc., 89, p4801 (1967);同91, p3350 (1969);Science, 150,
p178 (1968) ;Tetrahedron Lett., 22, p1859 (1981);同24, p245 (1983)〕により変
異させたDNAを合成したり、それらの組合せにより収得することができる。
、III」、日本生化学会編 (1986) など参照〕。
ばクローンテック社(Clontech Lab. Inc.)より市販の各種cDNAライブラリーなどを用いることもできる。
イゼーション、コロニーハイブリダイゼーションなどやこれらの組合せを例示できる。ここで用いられるプローブとしては、本発明遺伝子のDNA配列に関する情報をもとにして化
学合成されたDNA配列などを用いるのが一般的であり、勿論既に取得された本発明遺伝子
やその断片もかかるプローブとして利用できる。
よるDNA/RNA増幅法が好適に利用できる。殊にライブラリーから全長のcDNAが得られ難い
ような場合に、レース法(RACE:Rapid amplification of cDNA ends;実験医学、12(6),
35-38 (1994))、殊に5′レース(5′RACE)法(Frohman,M.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998-9002(1988))の採用が好適である。かかるPCR法の採用に際して使用されるプライマーは、既に本発明によって明らかにされた本発明遺伝子の配列情報に基づいて適宜設定することができ、これは常法に従い合成することができる。
ル電気泳動法などによればよい。
とができ、例えばジデオキシ法〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)〕やマキサム-ギルバート法〔Method in Enzymology, 65, 499 (1980)〕などにより行なう
ことができる。かかる塩基配列の決定は、市販のシークエンスキットなどを用いても容易に行ない得る。
養することにより行なわれる。
巣細胞及びそのジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216-4220 (1980)〕などがよく用いられているが、これらに限定される訳ではない。
ものを使用でき、これは更に必要により複製起点を有していてもよい。該発現ベクターの例としては、例えば、SV40の初期プロモーターを保有するpSV2dhfr〔Mol. Cell. Biol., 1, 854 (1981)〕などを例示できる。また、真核微生物としては、酵母が一般によく用いられ、中でもサッカロミセス属酵母を有利に利用できる。該酵母などの真核微生物の発現ベクターとしては、例えば酸性ホスフアターゼ遺伝子に対するプロモーターを有するpAM82〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1-5 (1983)〕などを利用できる。
る場合、本発明では、例えば該宿主菌中で複製可能なプラスミドベクターを用い、このベクター中に本発明遺伝子が発現できるように該遺伝子の上流にプロモーター及びSD(シヤイン・アンド・ダルガーノ)塩基配列、更に蛋白合成開始に必要な開始コドン(例えばATG)を付与した発現プラスミドを利用するのが好ましい。上記宿主としての大腸菌として
は、エシエリヒア・コリ(Escherichia coli)K12株などがよく用いられ、ベクターとし
ては一般にpBR322及びその改良ベクターがよく用いられるが、これらに限定されず公知の各種の菌株及びベクターをも利用できる。プロモーターとしては、例えばトリプトファン(trp)プロモーター、lppプロモーター、lacプロモーター、PL/PRプロモーターなどを使用できる。
法としては、一般的な各種方法を採用できる。また得られる形質転換体は、常法に従い培養でき、該培養により本発明遺伝子によりコードされる目的の蛋白が生産、発現される。該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、その培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。
Amplification of RNA. In PCR Protocol, A Guide to methods and applications, Academic Press, Inc., SanDiego, 21-27(1991))によるRNA増幅により、またノーザンブロ
ッティング解析(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory(1989))などにより、いずれも良好に実施し得る。
を特異的に増幅できる本発明遺伝子に特有のものである限りなんら限定はなく、本発明遺伝情報に基いてその配列を適宜設定することができる。通常これは常法に従って20〜30ヌクレオチド程度の部分配列を有するものとすることができる。その好適な例は、後記実施例1-11に示すとおりである。
組織での発現の検出や、その構造及び機能を解析でき、また、該遺伝子でコードされるヒト蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、その発現物の解析などや、これらの関与する疾患、例えば遺伝子病、癌などの病態解明や診断、治療などが可能となる。
(1)GDP解離促進蛋白遺伝子のクローニング及びDNAシークエンシング
ヒト胎児脳、成人血管、胎盤の各組織より抽出したmRNAをクローンテック社より購入し、出発材料とした。
ニーを形成させ、ランダムにそのコロニーをピックアップし、96ウエルマイクロプレートにヒト遺伝子を含む大腸菌クローンを登録した。登録されたクローンは、-80℃にて保存
した。
にDNAのサイズ、量をチェックし、7μlをシークエンス反応用に用い、残りの21μlは、プラスミドDNAとして4℃に保存した。
ることができる。
ルシークエンス法(Carothers, A.M., et al., Bio. Techniques, 7, 494-499 (1989))
を実施した。これらは、少量のプラスミドDNA(およそ0.1-0.5μg)をテンプレート(鋳型)
として4種の塩基特異的に停止する伸長反応させる方法である。
列を決定した。
遺伝子を区別するには適しているので、場合によっては、3'側のシークエンスも行なった。
ロベースの挿入を持つ一つのクローンがヒトRalGDP解離促進蛋白(RalGDS: Ral guanine nucleotide dissociation stimulator)の遺伝子のC末端領域に対して高い相同性を示した。RalGDSは、シグナルの伝達経路になんらかの役割を演ずると考えられるので、更にそのヒト相同物を提供するcDNA挿入部の完全塩基配列を決定した。
ルを送ることにおいて重大な役割を演じている(Bourne, H. R., et al., Nature, 348, 125-132 (1990); Bourne et al., Nature, 349, 117-127 (1991))。
て機能すること、即ち、ras遺伝子ファミリーの機能が生物学的に非活性なGDP結合蛋白或は活性GDP結合蛋白などの結合蛋白の異なる条件下によって調整されること、これら2つの条件がGTPアーゼ活性化蛋白(GAPs)或はGDSによって誘導されることがよく知られている。前者の酵素は結合GTPの加水分解を刺激することによってGDP結合を誘導し、後者の酵素は、結合GDPを遊離することによって定められたGTP結合を誘導する(Bogusuki, M.S. and McCormick, F., Nature, 366, 643-654 (1993))。
A., EMBO J., 5, 2203-2208(1986); Albright, C. F., et al., EMBO J., 12, 339-347 (1993))。
アミノ酸配列を示す。
ィング・フレームを含んでいた。転写開始コドンは28番目の核酸残基に位置していた。
域に対する相同物であることが明らかとなった。この新規な遺伝子でコードされるアミノ酸配列は、rasに結合するために必要であると考えられているRalGDSのC末端領域に対して39.5%の同一性を持っていた。
しれないこと、或はras介在シグナル変換経路に影響を与えるかもしれないと考えられる
。しかしながら、この新規な遺伝子は、GDS活性領域をコードする領域を含んでおらず、GDS蛋白と異なる機能を有しているようである。しかして、本発明者らはこの遺伝子をヒトRalGDSと名付けた。
(2)ノーザンブロット分析
正常ヒト組織におけるRalGDS蛋白のmRNAの発現をランダム・オリゴヌクレオチド・プライミング法によって標識したヒトcDNAクローンをプローブとするノーザンブロットにより評価した。
浄した。フィルターは-70℃下に18時間、X線フィルム(コダック社製)に対して露光した。
かとなった。加えて、3.2キロ転写体が心臓と骨格筋内に特異的に観察された。これらの
異なるサイズを有する転写体の発現は、二者択一的なスプライシングに負うか或は相同遺伝子に対するクロス-ハイブリダイゼーションに負うのかもしれない。
(3)FISHによるコスミド・クローンと染色体の局在
FISHは、コスミド・ベクターpWE15中にクローン化されたヒト染色体のライブラリーをcDNAクローンの0.8キロ塩基挿入部をプローブとしてスクリーニングすることにより実施した(Sambrook, J., et al., Molecular Cloning, 2nd Ed., pp.3.1-3.58, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York(1989))。
イナザワらの方法と同様に実施した(Inazawa, J.. et al., Genomics, 17, 153-162 (1993))。
ク・トランスレーションによってビオチン16dUTPで標識し、プローブとした。
分間変性させ、20%デキストラン硫酸を含む4xSSCの等量を混合した。ついでハイブリダ
イゼーション混合液を、変性したスライド上に播種し、パラフィンで覆った後、37℃で16-18時間、湿箱内にてインキュベートした。50%ホルムアミド/2xSSCで37℃で15分間洗浄
後、2xSSCで15分間、更に1xSSCで15分間それぞれ洗浄を行なった。
製薬社製)を加えた4xSSC中で37℃、40分間インキュベートした。その後、スライドは4xSSC、0.05%トリトンX-100を含む4xSSCで各々10分間洗浄し、1%DABCO(PBS(-):グリセロールを1:9(v:v)に1%DABCO、シグマ社製)を含む抗除色液PPD液(PPD(和光カタログNo.164-015321)100mg及びPBS(-)(pH7.4)10mlを0.5M Na2CO3/0.5M NaHCO3(9:1,v/v)の緩衝液(pH9.0)でpHを8.0に調整した後、グリセリンを追加し、総容量を100mlとしたもの)中に浸して、DAPI(4,6-ジアミノ-2-フェニルインドール:シグマ社製)で対比
染色した。
ブリダイゼーションシグナルを染色体バンド6p21.3上に観察し、RalGDS遺伝子が染色体6p21.3に座位していることを確認した。
る疾患、例えば癌などの病態解明や診断、治療などが可能となると考えられるほか、本発明RalGDS蛋白遺伝子の染色体の転座を同じくする強直性脊椎炎、心房中隔欠損症、色素性網膜症、失読症などの各種疾患の発生と進展との係わりを研究することが可能となる。
(1)細胞骨格関連蛋白2遺伝子のクローニング及びDNAシークエンシング
実施例1-(1)と同様の方法でヒト胎児脳cDNAライブラリーから任意に選択したcDNAクロ
ーンの配列解析により、ヒト細胞骨格関連蛋白遺伝子(cytoskeleton-associated protein : CAP)のCAP-グリシン領域を含有するいくつかのCAPファミリー遺伝子と相同性の高い塩基配列を有するクローンを見いだし、これをGEN-080G01と名付けた。
小官と相互作用を及ぼすことのできることが直接的或は間接的証拠によって提言されている。
Cell Biol., 115, 1309-1318(1991))か或は多分、有糸分裂期間中の染色体の動きに働
くとされる(Pfarr C.M., et al., Nature, 345, 263-265(1990); Steuer E.R., et al.,
Nature, 345, 266-268 (1990); Wordeman L., et al., J. Cell Biol., 114, 285-294(1991))細胞質のダイニン運動を構築している因子のひとつである。
んど全ての細胞の生存にとって重要であり、いくつかの神経細胞の形成にとって重要である(Swaroop A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 6501-6505 (1987); Holzbaur E.L.F., et al., Nature, 351, 579-583 (1991))。
(2)5′レース法(5'RACE:5'rapid amplification of cDNA ends)
本発明遺伝子の5′部分を含むcDNAクローンの単離・解析は、製品使用プロトコールの
一部修飾させ、市販キット(5'-Rapid AmpliFinder RACE Kit, クローンテック社)を用
いた5′レース法により、以下の通り単離した。
Transcriptase, Life Technologies社)を用いたランダムヘキサマーにより逆転写してcDNAを得、これをP1プライマー及びアンカープライマーを用いた第1のPCRによるワタナベ
らの方法(Watanabe T., et al., Cell Genet., )により増幅させた。
・プライマーを用いる第2のPCR反応により増幅させた。第2のPCR産物は、1.5%アガロー
ス・ゲル電気泳動により分析した。
し、このバンドの産物をベクター(pT7Blue(R)T-Vector,ノバゲン(Novagen) 社)に挿入し、適当なサイズの挿入がみられる複数のクローンを選別した。
シングすることによって、蛋白質をコードしている配列と、5'と3'フランキング配列と全長1015塩基の配列を決定し、該遺伝子を細胞骨格関連蛋白2遺伝子(CKAP2遺伝子)と命名した。
配列番号:4に核酸配列によってコードされるアミノ酸配列をそれぞれ示す。
ッチであり、(CAG)4(CGG)4(CTG)(CGG)の不完全なトリプレットが40-69塩基の位置に存在
していた。
は、21,800の計算された分子量を持つ193アミノ酸をコードする579塩基からなっている
。
(2)他のCRPsとCKAP2との類似性
CKAP2の配列は、レスティンとCLIP-170の配列との相同性を明らかにしたが、相同性領
域は、CAP-GLYドメインの短い配列に限定されていた。アミノ酸レベルにおいて、推定さ
れたCKAP2は、他の5つのCAPsとも高い相同性を示した。
、2量体形成や微小管結合能を増加させることに貢献していると思われた(Pierre P., et
al., Cell, 70, 887-900, (1992))。アルファ-ヘリックス領域の欠失は、CKAP2がホモ-或はヘテロ-・ダイマー形成することのできないことを意味するかもしれない。
いて、そして微小官とそれらの相互作用に関係すると考えられた。CKAP2は、上記の如くCAP-GLY領域を含んでいるので、これらのファミリーの中に位置付けされる。
E.M. and Kankel D.R., Dev. Biol., 62, 112-142 (1978))が明らかにされている。こ
れらの微小官関連蛋白は、小胞輸送と有糸分裂に働くと思われている。故に、神経細胞における小胞輸送システムの重要性は、これらのコンポーネントの欠損が異常な神経細胞系に導くかもしれない。
係しているかもしれない。
(3)ノーザンブロット分析
正常ヒト組織におけるヒトCKAP2mRNAの発現を、実施例1-(2)と同様にしてGEN-080G01クローン(553-1015塩基に相当する)をプローブとするノーザンブロットにより評価した。
の組織において、CKAP2のcDNAのサイズに一致する1.0kbの転写体を検出した。該1.0kbの
転写体は、試験した他の組織より、心臓、脳において有意に高いレベルで発現されていた。3.4kbと4.6kbの2つの弱いバントがそれぞれ全ての組織において検出された。
るかもしれない。
(4)ダイレクト・R-バインディングFISHによるコスミド・クローンと染色体上の局在
CKAP2cDNAに対応する2つのコスミドを得た。それらの2つのコスミド・クローンを実施
例1-(3)と同様にしてダイレクト・R-バインディングFISHによってCKAP2の染色体の座位のマッピングを行なった。
剰のヒトCot-I DNA(BRL社製)を加えた。プロビア100フィルム(フジISO100;フジ・フィ
ルム社製)を、顕微鏡写真撮影のために用いた。
つの疾患は、同じ遺伝子の対立遺伝子による疾患であるかもしれない(Tournier-Lasserve E. et al., Nature Genet., 3, 256-259(1993); Joutel A. et al., Nature Genet., 5, 40-45(1993))。
体は、なんらかの神経細胞の疾患に導くかもしれないと考えられる。
種組織での発現の検出や、ヒトCKAP2の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、
前述したように多様で且つ細胞に本質的な活動に深く関与しているヒトCKAP2システム乃
至ヒトCKAP2の機能の解析や、これが関与する各種神経疾患、例えば家族性偏頭痛、など
の診断などを行なうことができ、またこれらの治療及び予防薬のスクリーニングや評価などをも行なうことができる。
(1)OTK27遺伝子のクローニング及びDNAシークエンシング
実施例1-(1)と同様の方法でヒト胎児脳cDNAライブラリーから任意に選択したcDNAク
ローンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、酵母核蛋白(Saccharomyces cerevisiae: Kolodrubetz, D. and Burgum, A., YEAST, 7, 79-90 (1991))、NHP2に対して高い相同性を有する蛋白をコードするcDNAクローン、GEN-025F07を見出し、OTK27と命名した。
力に対して必須の機能を有していると報告されている(Kolodrubetz, D. and Burgum, A., YEAST, 7, 79-90 (1991))。
様な機能を有していると推測される。
なり、配列番号:8で示される384塩基のオープン・リーディング・フレームを含んでおり、これによりコードされるアミノ酸配列は、配列番号:7に示される通り128アミノ酸からなっていた。開始コドンは、配列番号:9の塩基配列番号の95-97番目から始まり、479-481番目が終始コドンを示していた。
シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana: Newman, T., unpublished ; GENEMBL Accession No. T14197)からのcDNAの核酸配列から推定された蛋白に対して83%同一であった。
(2)ノーザンブロット分析
正常ヒト組織におけるヒトOTK27mRNAの発現を、OTK27cDNAクローンのインサート部分をPCRにより増幅し、該PCR産物を精製し、〔32P〕-dCTP(ランダムプライムドDNAラベリン
グキット、ベーリンガーマンハイム社)により標識してプローブとし、実施例1-(2)に準
じてノーザンブロッティングを行なった。
およそ1.6キロ塩基と0.7キロ塩基の位置に2つのバンドを検出した。両サイズの転写体が
試験した全ての正常成人組織に発現されていたが、0.7キロ塩基の転写体の発現は脳にお
いて有意に減少し、試験した他の組織に比べて心臓、骨格筋、睾丸においてより多く発現されていた。
ンを単離し、実施例1-(1)と同様にそれらDNA配列を決定した。
ポリA配列が598番目の塩基、3つのクローンが606番目の塩基、1つのクローンが613番目の塩基で始まっていた。
ルとしておそらく認められた。また、この遺伝子の上流ポリAシグナル“TATAAA”は、脳
においてほとんど影響せず、他の組織より上記した3つの組織においてより効果的である
と認識され、各転写体の安定性は種々の組織間で異なっている可能性も考えられた。
(3)ダイレクト・R-バィンディングFISHによるOKT27染色体の局在
プローブとしてOTK27cDNAのインサートを用いてcDNA OTK27に対応する1つのコスミド・クローンを全ヒト染色体コスミド・ライブラリー(5ゲノムに相当)から単離し、実施例1-(3)に準じてダイレクト・R-バィンディングFISHを実施し、OTK27の染色体の局在を決定
した。
(1)OTK18遺伝子のクローニング及びDNAシークエンシング
亜鉛-フィンガー蛋白は、真核生物の転写調節を行なう蛋白の大きなファミリーと定義
されており、進化的に保存された構造モチーフを含んでいる(Kadonaga, J. T., et al.,
Cell, 51, 1079-1090 (1987); Klung, A. and Rhodes, D., Trends Biol. Sci., 12, 464-469 (1987); Evans, R. M. and Hollenberg, S. M., Cell, 52, 1-3 (1988))。
様モチーフである亜鉛フィンガーは、RNA又はDNAに対する蛋白の特異的結合に関係している。亜鉛フィンガー・モチーフは当初、カエル(Xenopus)の転写因子IIIAのアミノ酸配列
内において確認されていた(Miller, J., et al., EMBO J., 4, 1609-1614 (1986))。
ンガー蛋白をコードする遺伝子が発見されている。
ーンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、亜鉛フィンガー構造を含むいくつかのクローンを確認し、ここにクルッペル・タイプの亜鉛フィンガー構造をもつクローンを見い出した。
ーションして、3つのクローンを単離し、実施例1-(1)と同様にそれらの塩基配列を決定した。
で高い類似性を有するペプチドをコードする新規なヒト遺伝子を含んでいた。この遺伝子をOTK18遺伝子(GEN-076C09クローン由来)と命名した。
含む塩基配列は、配列番号:11で示され、該OTK18遺伝子によりコードされる推定アミノ
酸配列は、配列番号:10で示される通りである。
シ側で13のフィンガー・モチーフを含んでいることが判明した。
(2)他の亜鉛フィンガー・モチーフを有する遺伝子との比較
OTK18、ヒトZNF41、ショウジョウバエのクルッペル遺伝子の比較により、各フィンガー
・モチーフは、共通配列CXECGKAFXQKSXLX2HQRXHに対して大部分保存されていた。
れた蛋白内によく保存されていた。しかしながら、配列の類似性は亜鉛フィンガー領域に限定されており、他の領域では有意なホモロジーは示さなかった。
位を含んでいるこの遺伝子産物の標的DNAは、およそ65塩基長のひとつのDNA断片であることが推測される。
(3)ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例1-(2)に準じて、正常ヒト組織におけるヒトOTK18mRNAの発現を、OTK18cDNAクローンのインサートをPCRにより増幅し、該PCR産物を精製し、〔32P〕-dCTP(ランダムプライムドDNAラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社)により標識してプローブとしてMTNブロットを用いて実施した。
(4)ダイレクト・R-バィンディングFISHによるコスミド・クローンと染色体の局在
OTK18の染色体の局在を実施例1-(3)に準じて行なった。
この領域は亜鉛フィンガー領域のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする多くのDNAセ
グメントを含んでいることが知られている(Hoovers, J. M. N., et al., Genomics, 12,
254-263 (1992))。しかも、亜鉛フィンガー蛋白をコードする少なくとも一つの他の遺
伝子は、この領域で見つけられている(Marine, J.-C., et al., Genomics, 21, 285-286
(1994))。
集まっている部位であると推測される。
での発現の検出や、ヒトOTK18蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより、前
述したように多様で且つ細胞に基本的な活動に深く関与しているヒト転写調節蛋白質遺伝子システム乃至ヒト転写調節蛋白質の機能の解析や、これが関与する各種疾患、例えば発生分化異常の奇形や癌、或は神経系発生異常の精神、神経障害などの診断などを行なうことができ、またこれらの治療及び予防薬のスクリーニングや評価などをも行なうことができる。
(1)ヒト26Sプロテアソーム構成成分P42蛋白質及びP27蛋白質の各遺伝子のクローニング及びDNAシークエンシング
多機能プロテアーゼであるプロテアソームは、酵母からヒトに至る真核生物に広く存在し、細胞内でエネルギー依存的にユビキチン結合蛋白質を分解する酵素である。該プロテアソームは、構造的には分子量21〜31キロダルトンの種々の構成成分からなる20Sプロテ
アソームと、30〜112キロダルトンの種々の構成成分からなる沈降係数22SのPA700制御蛋
白質群とで構成され、全体として沈降係数26S、分子量約200万ダルトンの巨大分子を形成している〔Rechsteiner, M., et al., J.Biol.Chem., 268, 6065-6068 (1993)、Yoshimura, T., et al., J.Struct.Biol., 111, 200-211 (1993)、Tanaka, K., et al., New Biologist, 4, 173-187 (1992)〕。
存的に26Sプロテアソームにより分解されることが明らかにされ〔Ishida, N., et al., FEBS Lett., 324, 345-348 (1993)、Hershko,A., and Ciechanover, A., Annu.Rev.Biochem., 61, 761-807 (1992)〕、細胞周期制御におけるプロテアソームの重要性が認識されつつある。
おいて、プロテアソームが積極的に関与していることも示唆され〔Michalek MT., et al., Nature, 363, 552-554 (1993)〕、さらにアルツハイマー患者の脳内において、ユビキ
チン化蛋白質が異常に蓄積してるという現象〔Kitaguchi, N., et al., Nature, 361, 530-532 (1988)〕から、アルツハイマー病にもプロテアソームが関与していることが示唆されるなど、プロテアソームは多彩な機能を有するという点で、各種病態の診断や治療にその有用性が注目されてきている。
。中でもc-Mycをはじめとする癌遺伝子産物やサイクリンのような細胞周期関連遺伝子産
物の分解が、ユビキチン依存の経路で分解されることが判明している。また肝癌細胞、腎癌細胞、白血病細胞などにおいてプロテアソーム遺伝子は、正常細胞に比較して異常発現しており〔Kanayama, H., et al., Cancer Res., 51, 6677-6685 (1991)〕、腫瘍細胞核
にプロテアソームが異常蓄積していることが観察されている。このことから、ヒトプロテアソームの構成成分はこれらの癌化のメカニズムの解明や癌の診断あるいは治療に有用となることが期待される。
ニズムの解明や免疫制御剤の開発にも期待できる。
なる検索を行い2つの新たなヒト26Sプロテアソーム構成成分蛋白質であるヒト26Sプロテ
アソーム構成成分P42蛋白質及びヒト26Sプロテアソーム構成成分P27蛋白質を得、以下に
示される方法にて該遺伝子のクローニング及びDNAシークエンシングを行なった。
(1)ヒト26Sプロテアソーム構成成分P42蛋白質及びP27蛋白質の精製
新鮮なヒト腎臓約100gを用い、特開平5-292964号公報に記載されているヒトプロテアソームの精製法に従い、バイオゲルA-1.5m(5×90cm、バイオラッド製)、ハイドロキシア
パタイト(1.5×15cm、バイオラッド製)、Q-セファロース(1.5×15cm、ファルマシア製)によるカラムクロマトグラフィー及びグリセロール密度勾配遠心法により、ヒトプロテアソームの精製を行なった。
ステムより、逆相HPLCを行なった。カラムは、Shodex RS Pak D4-613(0.6×15cm、昭和
電工製)を用い、以下の2液によるグラジエント溶出を行なった。
第1液:0.06%トリフルオロ酢酸
第2液:0.05%トリフルオロ酢酸、70%アセトニトリル
各溶出画分につき、その一部をジチオスレイトール還元下、8.5%SDS-ポリアクリルア
ミド電気泳動を行ない検出し、P42蛋白質及びP27蛋白質をそれぞれ単離精製した。
、1μgのトリプシンにより37℃で8時間消化を行ない、得られた部分ペプチド断片を逆相HPLCで分離し、エドマン分解により配列を決定した。その結果は、それぞれ下記表1に示す通りであった。
本発明者らは、実施例1-(1)に示すように、ヒト胎児脳、血管動脈、胎盤cDNAライブ
ラリーの大量DNA配列の決定から、約3万個のcDNAデーターを含むデーターベースを構築している。
を行なった結果、P42については、2つのアミノ酸配列(表2に示す(2)及び(7))が一致す
るクローン(GEN-331G07)を、またP27についても、2つのアミノ酸配列(表2に示す(1)及び(8))が一致するクローン(GEN-163D09)を見出した。
を決定し、合わせて、それぞれの全配列を決定した。
列から構成され、その中に配列番号:14で示される1167塩基の翻訳領域を含み、これによってコードされるアミノ酸配列は、配列番号:13に示す389アミノ酸配列であることが明
らかとなった。
成され、その中に配列番号:17で示される669塩基の翻訳領域を含み、これによってコー
ドされるアミノ酸配列は、配列番号:16に示す223アミノ酸配列であることが明らかとな
った。
バンク内にホモロジーを示す遺伝子は認められず、未知の機能を持つ新規な遺伝子と考えられた。
演じるていると考えられ、これらの点よりヒト26Sプロテアソームの機能解明のみならず
、上記生体機能の低下などに起因する各種病態の診断、治療などに有用であると考えられる。
(1)BNAP遺伝子のクローニング及びDNAシークエンシング
DNAとヒストンで構成されるヌクレオソームは、真核生物の細胞において染色体を構成
する基本構造で、種を越えてよく保存されている。この構造は、DNAの複製過程と転写に
強く関連している。しかしながら、ヌクレオソームの形成については、完全には理解されておらず、ヌクレオソーム構築(nucleosome assembly: NAPs)に係わるいくつかの特異
的な因子が確認されているのみである。即ち、既に2つの酸性蛋白であるヌクレオプラス
ミン(nucleoplasmin)とN1が、ヌクレオソーム構築を容易にすることが確認されている(Kleinschmidt, J.A., et al., J. Biol. Chem., 260, 1166-1176 (1985): Dilworth, S. M., et al., Cell, 51, 1009-1018 (1987))。
ン・ビトロにおいてヌクレオソーム構築活性を保有するかどうかが調べられた。
Eur. J. Neurosci., 2, 704-711 (1990))及びヒトヌクレオソーム構築蛋白(human nucleosome assembly protein: hNRP)がそれぞれクローニングされ(Simon, H. U., et al., Biochem. J., 297, 389-397(1994))、hNRP遺伝子は、多くの組織において発現され、T-リンパ球の増殖に関連することが示された。
択したcDNAクローンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、1125塩基cDNAクローンのGEN-078D05(ポリAを含んでいない)が、ヌクレオソーム構築に関連しているヌクレオソーム構築蛋白(NAPs)の遺伝子であるマウスNAP-Iの遺伝子、マウスの部分cDNAクローンDN38
及びhNRPと有意に高い相同性を有することを解明した。
び46に示す各塩基配列のプライマーP1及びP2を用いた。
定することによって、2つのクローンがまだ全体のコード領域をカバーしていないことを
確認したので、更なる第2の5'レース法を実施した。2回目の5'レース法には、配列番号:47及び48に示す各塩基配列のプライマーP3及びP4を用いた。
なり、この遺伝子を脳特異的ヌクレオソーム構築蛋白(Brain-specific Nucleosome Assembly Protein:BNAP)遺伝子と命名した。
おりである。
目に見られた。これらの3つの配列は、すべて開始コドン周辺でよく保存されている配列
を持っていた(Kozak, M., J. Biol. Chem., 266, 19867-19870 (1991))。
置していた。
塩基からなり、BNAP遺伝子産物の計算された分子量は、57,600ダルトンであった。
メラのクローンを構成しているかもしれないと考えられる可能性を排除するために、センス・プライマーとして配列番号326-356番目の配列と、アンチ・センスプライマーとして
配列番号1758-1786番目の配列とを用い、RT-PCRを実施した。
(2)BNAPとNAPsとの比較
BNAPの推定アミノ酸配列は、hNRPと46%の同一性と65%の類似性を示した。
れていた。
おらず、一方では、哺乳動物種の間で保存されたモチーフが見つけられた。
アミノ酸残基に相当)とIINAEYEPTEEECEW(150-164のアミノ酸残基に相当)は、厳格に保存されていた。
チの位置は保存されていなかった。
基のうち41の酸性アミノ酸残基を含んでいるひとつの長い酸性のクラスターを有していた3つのくり返し配列(194-207番目、208-221番目及び222-235番目のアミノ酸残基に相当)があり、そのコンセンサスは、ExxKExPEVKxEEK(xは保存されておらず、たいていは疎水
性残基である)であった。
。第一のシグナルはBNAPの塩基性ドメインに見つけられ、その配列YRKKR(75-79番目のアミノ酸残基に相当)は、HIV-1のTatのNLS(GRKKR)に類似していた。第二のシグナルは、C末端に位置しており、その配列KKYRK(502-506番目のアミノ酸残基に相当)は、SV40の
ラージT抗原のNLS(KKKRK)に類似していた。これら2つの推定NLSsがあることから、BNAP
は核に局在しているようであったが、他の塩基性クラスターがNLSsとして働くという可能性を排除できなかった。
(3)ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例1-(2)に準じて、正常ヒト組織におけるBNAPmRNAの発
現を、クローンGEN-078D05TA13(BNAP遺伝子の配列番号323から1558番目に相当する)をPCRにより増幅し、該PCR産物を精製し、[32P]-dCTP(ランダムプライムドDNAラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社)により標識し、プローブとしてMTNブロットに用いて
試験した。
臓、骨格筋、腎臓及び膵臓のうち、脳においてBNAPの3.0キロの転写体が検出された(8時
間露光)、そしてより長い露光(24時間露光)で同じサイズのぼんやりしたバンドが心臓に
おいて検出された。
(4)ラディエーション・ハイブリッド・マッピング(Radiation Hybrid Mapping)
ラディエーション・ハイブリッド・マッピングによって、BNAPのクローンの染色体マッピングを行なった(Cox, D.R., et al., Science, 250, 245-250 (1990))。
品の使用説明書に従い、配列番号:49及び50に示す各塩基配列のA1プライマーとA2プライマーを用いて染色体マッピング分析のためのPCR反応を実施した。
れていることが確認された。
てヌクレオソーム構築を促進する能力を持つ因子の一つである。実施された配列に関する研究において、特異抗体4A8のエピトープを含んでいるNAPsがヒト、マウス、カエル、シ
ョウジョウバエ、酵母(サッカロミセス・セレビシェ:S. cerevisiae)において検出された(Ishimi, Y., et al., Eur. J. Biochem., 162, 19-24 (1987))。
、組換えBNAPは、およそ80kDaの位置にゆっくりと電気泳動された。4A8のエピトープは、2番目のよく保存された疎水性モチーフの中に局在されていることが示された。そして、FNFのトリプレットが、エピトープの一部として重要であることが同時に示された(Fujii-Nakata T., et al., J. Biol. Chem., 267, 20980-20986 (1992))。
れる。
H. U., et al., Biochem. J., 297, 389-397 (1994))。一方、NAPsは、いたるところに発現されていて、基本的なヌクレオソーム形成において重要な役割を演じていると考えられる。
上のマーカーに対して強く連鎖していた。このX染色体の中心周囲領域は、α-サラセミアや精神的遅延(ATR-X)のような、精神的な遅延に対して責任ある遺伝子が多かった(Gibbons, R. J., et al., Cell, 80, 837-845 (1995))。ヌクレオソーム構造を調節すると思われるATR-X遺伝子の分析と同様に、本発明者らは、BNAPがX染色体と連鎖した精神遅延のあるタイプに関係しているかもしれないと考える。
ユビキチン・システムは、細胞プロセスに必須の酵素グループのひとつであり、酵母からヒトにいたるまで保存されている。該システムは、ユビキチン活性酵素(ubiquitin-activating enzymes: UBAs)、ユビキチン結合酵素(ubiquitin-conjugating enzymes: UBCs)
、ユビキチン蛋白リガーゼ(ubiquitin protein ligases: UBRs)及び26Sプロテアソーム粒子から構成されている。
されている(Jentsch, S., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1089, 127-139 (1991): H
ershko, A. and Ciechanover, A., Annu. Rev. Biochem., 61, 761-807 (1992) : Jentsch, S., Annu. Rev. Genet., 26, 179-207 (1992): Ciechanover, A., Cell, 79, 13-21 (1994))。
は、カドミウムによって誘導され、カドミウム中毒に対する抵抗性に関与していると思われる(Jungmann, J., et al., Nature, 361, 369-371 (1993))。MAT-α2の分解もまたUBC7とUBC6によって実行される(Chen, P., et al., Cell, 74, 357-369 (1993))。
(1)ヒト骨格筋特異的ユビキチン結合酵素遺伝子(UBE2G遺伝子)のクローニング及びDNAシークエンシング
実施例1-(1)と同様の方法でヒト胎児脳cDNAライブラリーから任意に選択したcDNAクロ
ーンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、GEN-423A12cDNAクローンが様々な種のユビキチン結合酵素(ubiquitin-conjugating enzymes: UBCs)をコードする遺伝子と有意に
高い相同性を有する持つことが分かった。
と同様の方法で5'レース法を行なった。
持っているが異なった長さであった。
特異的ユビキチン結合酵素遺伝子(UBE2G遺伝子)と命名した。
リプレットである塩基配列番号19-21番目に位置していた。このATGに先行したイン・フレ
ーム停止コドンがなかったので、このクローンは、以下の理由から全体のオープン・リーディング・フレームを含んでいると演繹した。
(b)AGGATGAの配列は、開始コドン周辺のコンセンサス配列(A/G)CCATGG(Kozak, M., J. Biol. Chem., 266, 19867-19870 (1991))に類似していた。
(2)UBE2GとUBCsとのアミノ酸配列との比較
UBE2GとUBCsとのアミノ酸配列の比較から、ユビキチンに結合することができる活性部
位システィンは、90番目のシスティン残基であるように思えた。これらの遺伝子でコードされるペプチドは、同じファミリーに属しているようである。
(3)ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例1-(2)に準じて、正常ヒト組織におけるUBE2GmRNAの発現を、UBE2Gの全配列をPCRにより増幅し、該PCR産物を精製し、[32P]-dCTP(ランダム
プライムドDNAラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社)により標識し、プローブ
として用い、メンブレンは、MTNブロットを用いて実施した。
体が検出可能であった、そして骨格筋においてこれらの転写体の強い発現が観察された。(4)ラディエーション・ハイブリッド・マッピング(Radiation Hybrid Mapping)
ラディエーション・ハイブリッド・マッピングによって前記実施例6-(4)と同様の方法
でUBE2Gのクローンの染色体マッピングを行なった。
マーは、配列番号:24の配列の配列番号415-435番目及び配列番号509-528番目にそれぞれ相当しており、その塩基配列は配列番号:53及び54に示す通りである。
れた。全ての他のUBCsは細胞サイクルの調節のような必須の細胞機能に関係しており、それらUBCsは組織のいたるところに発現している。しかしながら、UBE2Gの発現パターンは
、筋肉特異的な役割が提言されるかもしれない。
ものであるかを確認することはできなかった。UBE2G産物の主要な構造は、酵母のUBC7に
対して強い相同性を示した。また、線虫類のUBC7は、一方では酵母UBC7に対して強い相同性を示した。それは、レプレッサーの分解に関連しており、更に酵母におけるカドミウムに対する抵抗を与える。これらの蛋白間の類似性から、それらが同じファミリーに属していることが提言される。
トロフィーのような疾患になると考えられる。近年、別の蛋白質分解酵素、カルパイン3
(Calpain3)が肢体筋ジストロフィー・タイプ2Aの原因であると証明された(Richard, I., et al.,Cell, 81, 27-40 (1995))。該遺伝子がUBE2Gの染色体の位置からいかなる遺
伝性筋疾患とも現在のところ有意な関連はないが、今後のリンケージ解析から、該遺伝子
との関係が見つかる可能性があると思われる。
各種組織での発現の検出や、UBE2G蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これらにより
、前述したように多様で且つ細胞に基本的な活動に深く関与している筋特異的蛋白分解の研究や骨格筋の機能の研究及びこれらが関与する各種筋疾患、例えば筋ジストロフィーの診断などを行なうことができ、これらの治療及び予防薬のスクリーニングや評価などをも行なうことができる。
(1)TMP-2遺伝子のクローニング及びDNAシークエンシング
実施例1-(1)と同様の方法でヒト胎児脳cDNAライブラリーから任意に選択したcDNAクロ
ーンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、膜蛋白遺伝子(transmembrane protein:
アクセッションNo.;U19878)に相同性の高いcDNA配列を有するクローン(GEN-092E10)を見出した。
る(アクセッションNo.;U19878)。
ムを含んでいて、これによってコードされるアミノ酸は、配列番号:25で示されるように374アミノ酸残基を有し、TMP-2の全cDNAクローンの核酸配列は、配列番号:27で示されるとおり、1721塩基からなっていた。
、塩基配列番号1490-1492番目に位置していた。ポリ・アデニレーション・シグナル(AATAAA)は、塩基配列番号1703-1708番目に位置していた。TMP-2遺伝子産物の計算された分子
量は、41,400ダルトンであった。
、本発明の新規なヒト遺伝子においても、これらのモチーフが保存されていた。
EGF-like growth factor; Higashiyama, S., et al., Science, 251, 936-939 (1991))及びシュワノマ誘導成長因子(Schwannoma-derived growth factor; Kimura, H., et al.
, Nature, 348, 257-260 (1990))と、EGF領域を超えてアミノ酸レベルで相同性を有することなどから、細胞の増殖や細胞間のコミュニケーションに重要な役割を果たすと考えられる。
(2)ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例1-(2)に準じて、正常ヒト組織におけるTMP-2mRNAの発現を、クローンGEN-092E10をPCRにより増幅し、該PCR産物を精製し、[32P]-dCTP(ランダムプライムドDNAラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社)により標識し、プロ
ーブとしてMTNブロットを用いて実施した。
の各種組織での発現の検出や、ヒトTMP-2蛋白の遺伝子工学的製造が可能となり、これら
により、前述したように細胞増殖や細胞間コミュニケーションに深く関与している脳腫瘍や前立腺癌の研究及びこれらの疾患の診断等を行なうことができ、これらの治療及び予防薬のスクリーニングや評価等をも行なうことができる。
(1)ヒトNPIK遺伝子のクローニング及びDNAシークエンシング
実施例1及び2と同様の方法で、ヒト胎児脳cDNAライブラリーから任意に選択したcDNAクローンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、フォスファチジルイノシトール(phosphatidylinositol)3及び4キナーゼに保存されているアミノ酸配列をコードする遺伝子(Kunz, J., et al., Cell, 73, 585-596 (1993))に高い相同性を有する2つのcDNAクローン
を得、これらをGEN-428B12c1及びGEN-428B12c2と命名し、これらの全配列を、前記各実施例に準じて決定した。
列番号:33で示されるとおり、3324塩基からなっていた。
列番号の2602-2604番目に位置していた。ポリ・アデニレーション・シグナル(AATAAA)は
塩基配列番号3305-3310番目位置していた。
は、配列番号:30で示されるとおり、3602塩基からなっていた。
列番号の2880-2882番目に位置していた。ポリ・アデニレーション・シグナル(AATAAA)は
塩基配列番号3583-3588番目位置していた。
(2)ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例1-(2)に準じて、正常ヒト組織におけるヒトNPIKmRNA
の発現を、ヒトNPIKの全配列をPCRにより増幅し、該PCR産物を精製し、[32P]-dCTP(ランダムプライムドDNAラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社)により標識し、プ
ローブとして用い、メンブレンは、MTNブロットを用いて実施した。
cDNA(クロンテック社製)をテンプレートとしてPCRを行ない、該PCR産物の塩基配列を
決定した。
番目の領域に、下記表2に示されるポリモルフィズムが存在し(428B12c1.fasta)、これに
よりGEN-428B12c1アミノ酸残基の配列番号:31のアミノ酸配列番号610-618番目のIQDSCEITTがYKILVISAに変異した変異体タンパク質がコードされることが判明した。
実施例1-(3)に準じてFISHによるヒトNPIK遺伝子の染色体のマッピングを行なった。
でいた。また、この遺伝子のmRNAに2つの欠失しうる部位が存在すること並びにGEN-428B12c1アミノ酸残基の配列番号:31のアミノ酸配列番号610-618番目に相当する特定領域にポリモルフィズムが存在し、変異タンパク質がコードされることから、ヒトNPIKには、いくつかの組合わせから成るヒトNPIK、ヒトNPIK欠失体、ヒトNPIK変異体及び/又はヒトNPIK
変異・欠失体の存在することが考えられる。
K. O., et al., Cell, 82, 849-856 (1995))。
遺伝子であることが明らかとなった(Savitsky, K., et al., Science, 268, 1749-1753 (1995))。
びこれらが関与する疾患、例えば癌の研究や診断等を行なうことができ、これらのの治療及び予防薬のスクリーニングや評価等をも行なうことができる。
(1)NRP1遺伝子及びNRP2遺伝子のクローニング及びDNAシークエンシング
EGF様反復配列は、多くの膜蛋白質において確認されており、成長調節と分化に関連す
る蛋白中において確認されている。このモチーフは蛋白間相互作用に関係しているように思われている。
トリ胚のcDNAライブラリーからクローニングされた(Matsuhashi, S., et al., Dev. Dynamics., 203, 212-222(1995))。この産物は、細胞外ドメインにそのEGF様反復配列を持
っている膜分子であると考えられている。nelmRNAの4.5kbの転写体が胚期において様々な組織において発現され、生後は、脳と網膜にもっぱら発現されている。
ーンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、上記nelと有意に相同性の高い2つのcDNAクローンを見出し、それぞれGEN-073E07とGEN-093E05と名付けた。
と同様の方法で5'レース法を行なった。
をカバーしていると思われる配列を明らかにし、この遺伝子をそれぞれnel関連蛋白1(nel-related protein type 1:NRP1)遺伝子とnel関連蛋白2(nel-related protein type 2:NRP2)遺伝子とそれぞれ命名した。
号:36で示されるとおり2977塩基からなっている。
配列番号:39で示されるとおり3198塩基からなっている。
の推定ペプチド配列を比較したところ、アミノ酸レベルでNRP2は80%の相同性を有しており、NRP1のそれの50%よりnelにより近い関連があった。システィン-リッチ・ドメインとEGF様反復配列内のシスティン残基は、完全に保存されていた。
いることであったが、この欠けている領域においてもNRPsとnelの核酸配列は、大変類似
していた。更に2つのNRPは、6つのEGF様反復配列を保有していたが、一方、nelは5つのみであった。
。上記したように2つのNRPの推定されたペプチドは、膜貫通タンパクではないことを示しており、NRPsは分泌された蛋白或は翻訳後修飾によって膜に対して固定された蛋白であるかもしれない。
として機能するかもしれないと考えている。また本発明者らは、nelの膜ドメイン領域を
フレーム-シフトすることによってnelに余分のEGF様反復配列がコードされることを見つ
け出した。
いことを提言している。対照的に、NRP1はヒトのnel対応遺伝子ではなく類似性遺伝子で
あると考えられる。
(2)ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例1-(2)に準じて、正常ヒト組織におけるNRPsmRNAの発
現を、両クローンしたcDNAsの全体の配列をPCRにより増幅し、該PCR産物を精製し、[32P]-dCTP(ランダムプライムドDNAラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社)により標識し、2つのプローブとしてMTNブロットに用いて実施した。
現されていることが分かった。NRP2の3.6kbの転写体が、成人と胎児の脳においてのみ強
く発現されたが、胎児の腎臓においてもわずかであるが発現されていた。
(3)FISHによるNRP1遺伝子及びNRP2遺伝子の染色体のマッピング
実施例1-(3)に準じてFISHによるNRP1遺伝子及びNRP2遺伝子の染色体のマッピングを行
なった。
座位が12q13.11-q13.12の位置にそれぞれあることが判明した。
に働いている可能性が示唆され、各種脳内腫瘍の診断や治療、更に退行性神経疾患における神経の再生に奏効すると考えられる。
(1)GSPT1-TK遺伝子のクローニング及びDNAシークエンシング
ヒトGSPT1遺伝子は、細胞サイクルのG1期からS期転位に重要なGTP結合蛋白をコードす
る酵母のGST1遺伝子のヒト相同遺伝子のひとつである。サッカロミセス・セレビシェ(Saccharomyces cerevisiae)の温度感受性gst1(G1-to-S転位)変異体を補って完全にするこ
とができる蛋白として、最初に特定された酵母のGST1遺伝子は、酵母の染色体ライブラリーから単離された(Kikuchi,Y., Shimatake, H. and Kikuchi, A., EMBO J. 7, 1175-1182 (1988))、該遺伝子は、cAMP依存性蛋白キナーゼの標的部位とGTPaseドメインを持つ蛋白をコードしていた。
によってKB細胞のcDNAライブラリーから単離された(Hoshino, S., Miyazawa, H., Enomoto, T., Hanaoka, F., Kikucho, Y., Kikuchi, a. and Ui, m., EMBO J. 8, 3807-3814 (1989))。該GSPT1遺伝子の推定蛋白もまた酵母GST1のそれと同様に、GTP結合領域とGTPase活性センター部位を有しており、細胞の増殖に重要な役割を演じている。
ーンの配列解析とデータ・ベースの検索の結果、上記GSPT1に相同性の高い0.3kbのcDNA配列を有するクローンを見出し、GEN-077A09と名付けた。GEN-077A09クローンは、5'領域を欠いていると思われたので、全体のコード領域を得るために実施例2-(2)と同様の方法で5'RACE法を行なった。
及び60に示す各塩基配列のP1プライマー及びP2プライマーを用い、また、アンカープライマーとしては市販のキットに付属のものをプライマーとして用いた。PCR反応は、94℃で45秒、58℃で45秒、72℃で2分を35サイクル行ない、、最後に72℃で7分間延長反応させた
。
ンとGEN-077A09クローンの2つの重複しているcDNAクローンの塩基配列を決定することに
よって、全体のコード領域をカバーしていると考えられる配列を明らかにし、これをGSPT1関連蛋白「GSPT1-TK遺伝子」と命名した。
類似する配列によって囲まれていたので、この配列番号144-146番目に位置するATGトリプレットを開始コドンと結論づけた。
流に認められた。
領域に存在する20のグルタミン酸のうち18が、保存されていて、ヒトGSPT1蛋白のそれと
完全に整列している。GSPT1-TK蛋白は、ヒトGSPT1蛋白のそれらの領域と同様にグアニン
核酸結合と水解を担うGTP結合蛋白のいくつかの領域(G1、G2、G3、G4及びG5)が保存され
ていた。
えられるヒトGSPT1とDNA配列において89.4%、推定されたアミノ酸配列において92.4%の同一性を明らかにした。また、酵母のGST1とはアミノ酸配列において50.8%の同一性を示した。
(2)ノーザンブロット分析
ノーザンブロット分析は、実施例1- (2)に準じて、正常ヒト組織におけるGSPT1-TKmRNAの発現を、GEN-077A09cDNAクローンをPCRにより増幅し、該PCR産物を精製し、[32P]-dCTP(ランダムプライムドDNAラベリングキット、ベーリンガーマンハイム社)により標識
し、プローブとしてMTNブロットに用いて実施した。
(3)FISHによるGSPT1-TK遺伝子の染色体のマッピング
実施例1-(3)に準じてFISHによるGSPT1-TK遺伝子の染色体のマッピングを行なった。
この染色体局在部位には急性リンパ性白血病(acute lymphocytic leukemia: ALL)と急
性ミエロイド白血病(acute myeloid leukemia: AML)からの相互の座位が高くしばしば
観察されている。加えて、急性非リンパ性白血病(acute nonlymphocytic leukemia: ANL
L)がヒトGSPT1の領域を含んでいる再配列と関連されることが報告されている(Ozawa, K., Murakami, Y., Eki, T., Yokoyama, K., Soeda, E., Hoshino, S., Ui, M. and Hanaoka, F., Somatic Cell and Molecular Genet., Vol.18, 189-194 (1992))。
Claims (8)
- 以下の(a)または(b)の蛋白質をコードする遺伝子:
(a)配列番号:34で示されるアミノ酸配列からなる蛋白質、
(b)配列番号:34で示されるアミノ酸配列において一部のアミノ酸乃至アミノ酸配列を置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列からなり且つ脳神経成長活性および/または神経再生活性を有する蛋白質。 - 以下の(a)または(b)のDNAからなる遺伝子:
(a)配列番号:35で示される塩基配列からなるDNAまたはこれと相補的な配列のDNA、
(b)配列番号:35で示される塩基配列に相補的な配列を有するDNAとストリンジェントな条件でハイブリダイズし且つ脳神経成長活性および/または神経再生活性を有する蛋白質をコードするDNA。 - 配列番号36:で示される塩基配列である請求項2に記載の遺伝子。
- 以下、(a)または(b)のアミノ酸配列からなる脳神経成長活性および/または神経再生活性を有する組換え体蛋白:
(a)配列番号:34で示されるアミノ酸配列、
(b)配列番号:34で示されるアミノ酸配列において一部のアミノ酸乃至アミノ酸配列を置換、欠失もしくは付加したアミノ酸配列。 - 請求項2に記載の遺伝子を含む発現ベクター。
- 請求項5に記載の発現ベクターを含む形質転換体。
- 請求項6に記載の形質転換体を培養し、脳神経成長活性および/または神経再生活性を有する蛋白質を採取することを特徴とする脳神経成長活性および/または神経再生活性を有する蛋白質の製造方法。
- 請求項4の組換え体蛋白に結合する抗体。
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