KR19980026246A - 인간 단백질 탈인산화효소 유전자, 그의 염기 서열 및 그의 아미노산 서열 - Google Patents

인간 단백질 탈인산화효소 유전자, 그의 염기 서열 및 그의 아미노산 서열 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간 정상의 각질세포(keratinocyte)로부터 분리한 새로운 단백질 탈인산화효소 k (protein phosphatase k) 유전자, 그의 염기서열 및 그의 아미노산 서열에 관한 것으로서, 본 발명의 단백질 탈인산화효소 k 는 생체내 신호전달체계에 관여하는 단백질 인산화효소와 가역적으로 작용하므로 각종 암을 포함한 세포내 신호전달체계의 이상으로 유발되는 각종 질환 등의 예방 및 치료에 널리 사용될 수 있다.

Description

인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자, 그의 염기 서열 및 그의 아미노산 서열
도 1은 본 발명의 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자 및 쥐의 탈인산화효소 k 유 전자에서 유추한 아미노산 서열을 비교분석하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 단백질 탈인산화효소 k 유전자를 유전자은행을 이용하여 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 단백질 탈인산화효소 k 유전자를 이용하여 인간에서 유래된 여려 세포주들에서 본 유전자의 발현을 노던 블럿으로 분석하여 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 단백질 탈인산화효소 k 유전자를 이용하여 인간 조직에서 본 유전자의 발현을 노던 블럿으로 분석하여 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 단백질 탈인산화효소 k 유전자의 염색체 지도를 나타낸 것이다.
[발명의상세한설명]
[발명의목적]
본 발명은 새로운 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자, 그의 염기서열 및 그의 아미노산 서열에 관한 것이다.
보다 상세하게는, 본 발명은 인간 정상의 각질세포(keratinocyte)로부터 분리한 새로운 단백질 탈인산화효소 k (protein phosphatase k) 유전자, 그의 염기서열 및 이로부터 유추한 그의 아미노산 서열에 관한 것으로서, 본 발명의 단백질 탈인산화효소 k 는 생체내 신호전달체계에 관여하는 단백질 인산화효소와 가역적으로 작용하므로 각종 암을 포함한 세포내 신호전달체계의 이상으로 유발되는 각종 질환 등의 예방 및 치료에 널리 사용될 수 있다.
[발명이속하는기술분야및그분야의종래기술]
세포내에서 일어나는 단백질의 인산화는 세포의 성장(growth), 분화(differentiation), 이동(migration) 및 죽음(apoptosis) 등과 밀접히 관련이 있어 정상세포의 발달에 중요한 조절 요인이 되며 (Hanks et al., 1988, Science, 241, 42; Ullrich and Schlessinger, 1990, Cell, 61, 203), 세포의 신호 전달과 관련하여 그 중요성이 더욱 증대되고 있다.
이러한 단백질 인산화 작용은 세포내의 두 가지 종류의 효소 집단군 즉, 단백질 인산화효소(preotein kinase)와 단백질 탈인산화효소(protein phosphatase)에 의해 조절된다. 단백질 인산화효소는 크게 인산화 작용이 일어나는 아미노산 잔기의 특이성에 따라 단백질 타이로신 인산화효소(protein tyrosine kinase)와 단백질 세린/스레오닌 인산화효소(protein serine/threonine kinase)로 구분되고, 단백질 탈인산화효소는 그 작용 부위에 따라 크게 단백질 타이로신 탈인산화효소 (protein tyrosine phosphatase), 세린/스레오닌 탈인산화효소 (serine/threonine phosphatase) 및 양 특이성 탈인산화효소(dual specificity phaphatase)로 구분될 수 있다.
세포내에서 일어나는 단백질 타이로신 인산화는 단백질 타이로신 인산화효소 와 타이로신 탈인산화효소에 의해 가역적(reversible)으로 조절되는데, 실제로 이러한 조절 작용의 이상에 의해 세포가 비정상화되어 세포가 계속하여 증식하게 되고, 세포의 종양화 (neoplastic transformation)가 유발된다고 널리 알려져 있다 (Bishop, 1987, Science, 235, 305; Sefton, 1986, Curr. Top. Microbiol. lmmun., 123, 39; Carpenter, 1987, Annu. Rev. Biochem., 56, 881).
상기의 타이로신 탈인산화효소는 그의 2차 구조 (secondary structure)에 따라 크게 수용체형(receptor-type) 및 비수용체형(non-receptor type) 탈인산화효소로 구분될 수 있다 (Kaplan et al., 1990. Proc. Acad. Sci. USA 87, 7000). 또한, 수용체형 탈인산화효소는 다시 4가지 종류의 형태, 즉 타입 Ⅰ, 타입 Ⅱ, 타입 Ⅲ 및 타입 Ⅳ 으로 세분될 수 있고 이를 상세히 설명하면 다음과 같다.
타입 Ⅰ 수용체형 탈인산화효소는 세포외 부위(external segment)에 상당히 많은 당류가 부착되어 있으며 (glycosylation), 아미노산 서열에 보존성(conservation)이 있는 시스테인이 풍부한 부위(cysteine-rich region)을 가지는 중요한 특징이 있다. 그의 대표적인 예로는 단지 조혈세포(hematopoietic cell)에서만 발견되는 CD45 가 있다 (Goldman et al., 1992, J. Biol. Chem., 267, 6197; Thomas, 1989, Annu. Rev. lmmunol., 7, 339). CD45 는 면역계의 두축이 되는 세포인 B 세포와 T 세포에서 주요한 신호전달 매개체로 작용하고 있는데, CD45 가 없는 세포를 형질전환(transfection)하는 실험을 통해 그 중요성이 잘 확인되었다 (Pingel and Thomas, 1989, Cell, 58, 1055; Koretzky et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 2037).
타입 Ⅱ 수용체형 탈인산화효소는 세포외 부위(extracellular region)에 2-3개의 면역글로불린 G 영역(immunoglobulin G domain) 및 2-9개의 피브로넥틴 타입 Ⅲ 반복부위 (fibronectin type Ⅲ repeats) 등이 존재하는 대표적인 특징이 있다. 타입 Ⅱ 수용체형 탈인산화효소에는 본 발명의 인간 단백질 탈인산화효소 k 가 속한다.
타입 Ⅲ 수용체형 탈인산화효소는 세포외 부위에 다발성 피브로넥틴 Ⅲ 반복부위(multiple fibronectin Ⅲ repeat)를 가지고 있으며, 단백질 타이로신 탈인산화효소 β와 δ(protein tyrosine phosphatase β and δ)를 그의 대표적인 예로 들 수 있다.
타입 IV 수용체형 탈인산화효소는 상기의 타입 Ⅱ 또는 타입 Ⅲ에 비하여 훨씬 작은 세포외 부위를 가지고 있으며, 단백질 타이로신 탈인산화효소 α 와 ε을 그의 대표적인 예로 들 수 있다.
인간 단백질 탈인산화효소 k 는 타입 Ⅱ 수용체형 탈인산화효소 (h-RPTP－k, human receptor-type protein tyrosine phosphatase k)로서, 그의 세포외 부위에 특징이 있어 이의 구조는 피브로넥틴 및 신경세포 부착 분자(neural cell adhesion molecules, NCAM) 등의 세포외 부위와 매우 유사하다. 이러한 세포외 부위는 타입 Ⅱ 탈인산화효소가 세포에 부착(cell adhesion)하도록 영향을 주므로 세포의 성장 및 분화를 조절하는 중요한 요소로 작용할 수 있다.
실제로 타이로신 탈인산화효소 α (PTPα)를 피셔 래트 태아 피브로블라스트(Fischer rat embryo fibroblast) 세포에서 과다하게 발현시킴으로써 세포가 형질전환(transformation)되고 종양형성(tumorigenesis)의 효과가 나타남을 확인하였다 (Zheng et al., 1992, Nature, 359, 336). 이는 단백질 탈인산화효소 α를 포함한 단백질 탈인산화효소의 유전자들이 항종양 유전자(anti-oncogene)로서 강력하게 작용할 수 있음을 제시하는 것으로서, 세포가 종양화되는 과정에 수반되는 세포 주기의 조절에 있어서 단백질 탈인산화효소들이 단백질 인산화효소 (예; p34cdc2) 들과 상호 반응하여 그 역할을 수행함을 보여주고 있다 (Lewin, 1990, Cell, 61, 743; Nurse, 1990, Nature, 344, 503; Hunter and Pines, 1990, New Biol., 2, 389).
이외에도 본 발명의 인간 단백질 탈인산화효소 k 를 포함한 상기에서 제시한 여러 단백질 탈인산화효소들이 항종양 유전자, 즉 종양 억제 유전자(tumor-suppressor gene)로서 작용할 수 있음이 많은 연구를 통해 보고되었다. 구체적으로 지금까지 밝혀진 탈인산화효소 유전자들의 염색체 지도상의 위치 (chromosomal localization) 및 종양화(neoplasiasis)가 일어난 세포의 유전자 손상 부위를 상호 연관시켜 연구한 결과들이 이를 강력하게 뒷받침하고 있다. 그 예로 수용체형 단백질 탈인산화효소 γ(receptor-type PTPγ)의 염색체 지도상의 위치를 고려할 때 신장암 및 폐암(lung carcinoma) 모두에서 염색체 3 에 손상 부위가 서로 일치하게 존재함이 확인되었다.
임상학적으로 상기 암 환자들 중 약 50% 에서 단백질 탈인산화효소 γ(PTPγ) 유전자의 결실(deletion)을 관찰할 수 있었다 (Laforgia et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 5036; Zbar et al., 1987, Nature, 327, 721; Brauch et al., 1987, Genes Chromosomes Cancer, 1, 240). 또한 단백질 탈인산화효소들은 그의 생물학적 기능에 있어서 단백질 인산화효소들과 상호 밀접하게 연관되어 있으므로, 단백질 인산화효소의 활성이 비정상적으로 조절되어 야기되는 여러 가지 인간의 질병들, 예를 들어 관절염(Reumatoid arthritis), 전신성 홍반 루푸스(Systemic lupus erythematosus, SLE), 당뇨병(Diabetes mellitus), 천식 (Asthma), 다발성 경화(Mutiple sclerosis), 치매 (Alzheimer's disease), 악성 신경교종(Malignant glioma) 그리고 여러 신경 계통의 질환들의 치료제로서 단백질 탈인산화효소들은 충분히 간접적인 목표물(target)이 될 수 있다.
따라서, 새로운 항암제 등의 신의약품을 개발하기 위하여 인간 단백질 탈인산화효소를 하나의 대상물로 사용하는 것은 매우 적절하다. 실제로 유전자 치료방법 및 단백질 인산화효소들에 작용하는 촉진제와 억제제의 개발방법이 단백질 탈인산화효소를 이용한 신의약품의 개발에도 널리 응용될 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질 탈인산화효소 및 그의 유전자를 이용하면 세포내 복잡한 신호전달 과정을 더욱 잘 이해하여 각종 질환의 원인을 분석할 수 있다. 따라서 아직까지 밝혀져 있지 않은 새로운 단백질 탈인산화효소 유전자를 발견하고 세포내에서 그의 역할을 이해하는 것은 중요하다.
이에 본 발명자들은 새로운 단백질 탈인산화효소를 이용하여 신호전달체계의 이상에 의해 유발되는 각종 질환의 치료제 등을 개발하기 위하여, 인간 정상의 각질세포로부터 케라티노사이트 cDNA 라이브러리를 제조하고 이로부터 새로운 단백질 탈인산화효소 k 유전자를 분리하여 그의 염기서열 및 아미노산 서열을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
[발명이이루고자하는기술적과제]
본 발명은 새로운 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자를 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명은 인간 정상피부의 케라티노사이트에서 유래한 단백질 탈인산화효소 k 유전자를 제공한다.
본 발명은 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자의 염기서열을 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명의 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지며, 본 서열은 두 개의 효소 활성에 관여하는 촉매 부위를 각각 염기 번호 2755에서 3438 까지에 그리고 번호 3625에서 4329 까지에 포함한다.
또한, 본 발명은 상기의 염기서열에서 유추한 인간 단백질 탈인산화효소 k 의 아미노산 서열을 제공함에 그 목적이 있다. 본 발명의 단백질 탈인산화효소 k 는 1140개의 아미노산으로 구성된다.
본 발명의 단백질 탈인산화효소 k 유전자 및 이로부터 얻을 수 있는 효소 단백질은 본 효소의 활성 저해제, 발현 저해제 및 발현 촉진제 등의 개발에 이용될 수 있다. 이들은 신호전달 과정의 이상에 의해 유발되는 질환인 암, 관절염, 당뇨병, 천식, 전신성 홍반 루푸스, 다발성 경화, 치매 및 악성 신경교종 등의 예방 및 치료에 널리 사용될 수 있다.
[발명의구성및작용]
본 발명은 세포내 신호전달 과정을 깊이 이해하고 이들 과정의 이상에 의해 유발되는 인간의 질환을 치료하는 신의약품 등을 개발하기 위하여, 새로운 단백질 탈인산화효소 k 유전자를 인간 정상의 각질세포(keratinocyte)로부터 분리한다.
우선 본 발명에서는 인간의 정상 각질세포를 이용하여 케라티노사이트 cDNA 라이브러리를 제조한다. 구체적으로 본 발명은 케라티노사이트 cDNA 라이브러리를 주형으로 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)을 수행하여 단백질 탈인산화효소 k 의 활성 부위에 해당하는 약 120bp의 DNA 절편을 얻고, 이를 정제하여 플라스미드 벡터 pGEM3Z(-)에 삽입한다.
이 때 프라이머로는 이미 알려진 탈인산화효소 집단군에서 발견되는 효소활성 부위로서 유전자 서열상의 보존성이 높은 유전자 부위의 염기 서열을 갖는 서열번호 1 및 서열번호 2의 합성 올리고 뉴클레오타이드를 사용한다(서열표 1 및 서열표 2 참조).
또한, 본 발명은 상기 DNA 절편으로 직접 DNA-시퀀싱을 수행하고 유전자은행 (GenBank/EMBL, NIH, USA)의 데이터 베이스를 이용하는 블라스트(blast) 프로그램으로 비교하여 이들 DNA 절편이 효소의 활성부위를 포함하는 새로운 단백질 탈인산화효소 k 유전자의 일부임을 확인한다. 따라서 본 발명자들은 이를 단백질 p55 라고 명명하고 상기에서 얻은 DNA 절편을 이용하여 단백질 탈인산화효소 k 의 전체 유전자를 케라티노사이트 cDNA 라이브러리로부터 스크리닝한다.
또한, 본 발명은 상기에서 스크리닝한 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자 를 이용하여 그의 유전자의 염기서열 및 이로부터 유추한 아미노산 서열을 결정한다. 본 발명의 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자는 서열번호 3 의 염기서열을 갖는다. 또한 이로부터 유추한 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타난 바와 같다(서열표 3 및 서열표 4 참조).
본 발명의 단백질 탈인산화효소 k 의 아미노산 서열을 분석한 결과, 이들이 세포내에서 타이로신에 탈인산화 작용을 갖는 인간 단백질 타이로신 탈인산화효소 k 임을 확인한다. 또한 본 발명의 인간 단백질 탈인산화효소 k 는 아미노산 서열이 쥐의 단백질 탈인산화효소 k 와 비교하여 약 98% 정도의 보존성을 나타냄을 확인한다(도 1 및 도 2 참조).
구체적으로 본 발명의 단백질 탈인산화효소 k 유전자는 아미노산 잔기 1440개를 해독하도록 구성되어 있고, 이들 DNA 염기서열 중 번호 16 부터 4335 까지가 단백질을 해독하는데 사용된다. 또한 본 발명의 인간 탈인산화 효소 k 유전자는 단백질 탈인산화효소 모두에서 공통적으로 나타나는 두 개의 세포내 탈인산화 활성을 위한 촉매 부위를 DNA 염기서열 번호 2755 부터 3438 까지 및 번호 3625 부터 4329 까지에 각각 포함하고 있다.
본 발명의 단백질 탈인산화효소 k 유전자의 특성을 확인하기 위하여, 그의 세포 및 조직에서의 발현을 노던 블럿 등의 방법으로 분석한다(도 3 및 도4 참조). 본 발명의 발현 분석에는 세포주로 정상의 인간 각질세포인 NHK; 각종의 각질세포 HaCaT, KB 및 A431; B 세포주인 Raji, Daudi 및 RPMI1788; T 세포주인 Hut 78; 에리트로류케미아 세포주인 K562 등을 사용하고, 조직으로 지라, 흉선, 정소, 난소, 소장, 전립선 및 말단혈액 백혈구 등을 사용한다.
또한, 본 발명은 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자의 염색체 지도상의 위치를 결정하기 위하여, 모든 종류의 인간 염색체를 함유하고 있는 인간-쥐 하이브리드 패널 등을 이용하여 서던 블럿 등을 수행한다(도 5 참조).
도 5에서 보는 바와 같이 인간 염색체 6번, 남자 게놈(male human genome) 및 여자 게놈(female human genome)의 세 곳에서 양성 신호를 확인한 결과, 본 발명의 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자는 염색체 6번에 위치함을 확인한다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 인간 케라티노사이트의 배양
인간의 상피세포인 케라티노사이트는 정상인 성인남자 성기의 표피 절제수술시 얻어지는 상피조직으로, 이를 사운드스 및 제텐 방법(Saunders ＆ Jetten, 1994, J. Biol. Chem., 269, 2016)에 따라 약 1 × 5 mm 조각으로 얻어 0.1% 디스파제(dispase)용액에 37℃ 조건으로 90분간 배양하였다. 다음 상피층(epidermal layer)을 조직으로부터 핀셋으로 제거하여 용액 A (30 mM HEPES pH 7.4, 0.18% 포도당, 0.77% 소금, 0.014% Na2HPO4, 0.022% KCl, 0.05% 트립신, 0.53mM EDTA)에서 37℃로 10분간 배양하였다. 본 발명의 케라티노사이트를 얻기 위하여 상기에서 배양한 상피층을 트립신으로 처리하여 분리하고 이를 케라티노사이트 성장배지(KGM, clonetics)에서 배양하였다.
실시예 2 인간 케라티노사이트 cDNA 라이브러리의 제조
실시예 1에서 배양한 케라티노사이트를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제조하기 위하여, 스트라티진사(stratagene)가 추천하는 방법에 약간의 변형을 가한 방법으로 다음과 같은 과정을 수행하였다.
상기한 케라티노사이트로부터 전체 세포질 RNA 를 RNAzol B 용액 (Biotecx, Houston, TX)을 사용하여 제조자가 추천하는 방법에 따라 분리하였다. cDNA 라이브러리를 제조하기 위한 폴리 A RNA (poly A RNA)는 퀵프렙 mRNA 분리 키트(QuickPrep mRNA purification kit, Pharmacia)를 사용하여 정제하였다. 인간 케라티노사이트 cDNA 라이브러리는 ZAP 익스피레스 cDNA 합성 키트(ZAP Express cDNA synthesis kit, Stratagene)를 이용하여 제조자가 추천하는 방법에 따라 다음과 같이 제조하였다. 우선 5μg의 폴리 A RNA 를 M-MuLV 역전사효소(M-MuLV reverse transcriptase)를 가하여 37℃에서 40분간의 반응시켜 첫 번째 가닥 cDNA 를 합성고, 다시 DNA 중합효소 Ⅰ(DNA polymerase 1)을 가하여 16℃ 에서 2시간 30분 동안 반응시켜 두 번째 가닥 DNA 를 합성하였다. 여기에 Eco R1 접합체(adaptor)를 연결하여, 다시 T4 폴리뉴클레오타이드 인산화효소(T4 polynucleotide kinase)를 반응시켜 Eco R1 접합체를 인산화하였다.
상기의 반응을 거친 cDNA 로 크기 분획 (size fractionation)을 수행하여 약 1kb 이하의 cDNA 들을 세파크릴 S-400 칼럼을 통해 제거하였다. 정제된 cDNA 들은 Uni-ZAP XR 벡터에 T4 DNA 라이게이즈를 처리하여 연결(ligation)시켰고, 기가팩 Ⅱ 패케징 추출물 (Gigapack Ⅱ packaging extract, 스트라타진)를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제조하였다.
실시예 3 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자의 클로닝
실시예 1 에서 얻은 케라티노사이트 cDNA 라이브러리로부터 새로운 단백질 탈인산화효소 유전자들을 클로닝하기 위하여, 중합효소 연쇄반응(polymcrasc chain reaction, PCR)을 수행하였다.
중합효소 연쇄반응의 주형(template)으로 상기 실시예 1 에서 제조한 케라티노사이트 cDNA 라이브러리 (약 1×109PFU/ml)를 직접 사용하였으며, 이 때 사용한 양은 0.5μl 이고, 최대로는 1μl 이었다. 또한, 프라이머로 서열번호 1의 염기서열을 갖는 센스(sense) 방향의 합성 올리고 뉴클레오타이드 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 안티센스(antisense) 방향의 합성 올리고 뉴클레오타이드를 사용하였다. 다음 파워 블록 Ⅱ 이지사이클러 시스템(Power Block Ⅱ Easycycler system, Ericomp lnc., San Diego)을 사용하여 94℃ 30초, 42℃ 2분, 72℃ 1분의 반응 조건으로 40회 동안 반응을 수행하여 1.5% 아가로스 겔에서 예상되는 단백질 탈인산화효소의 활성 부위인 약 120bp의 DNA 절편을 확인하였다.다음 울트라프리-MC 원심분리 필터(Ultrafree-MC centrifugal filtration, Milipore)를 이용하여 약 1200rpm에서 15분간 마이크로원심분리(micro-centrifuge)함으로써 재분리하고 이를 플라스미드 벡터인 pGEM3Z(-)에 클로닝하였다.
실시예 4 인간 단백질 탈인산화효소 k 의 확인
실시예 3에서 클로닝한 DNA 절편이 단백질 탈인산화효소의 유전자임을 확인하기 위하여, 상기 DNA 절편으로 플라스미드 미니-프렙(mini-prep) 방법의 일종인 TENS 완충용액 (TE용액, 0.1N NaOH, 0.5% SDS) 방법을 이용하여 직접적으로 DNA-시퀀싱을 수행하여 여기에 탈인산화효소의 활성 부위가 포함되는지를 조사하였다. 이 때 DNA-시퀀싱을 위해 사용한 프라이머로는 PSK (Bluescript) 플라스미드에 고유한 SK 프라이머 또는 광범위 프라이머(universal primer)를 사용하였다. 또한, GenBank/EMBL (NIH, USA) 데이터 베이스의 블라스트(blast) 프로그램을 이용하여 새로운 단백질 탈인산화효소의 유무를 확인하였다(도 2 참조).
그 결과, 새로운 단백질 탈인산화효소 유전자를 분리하고 이를 지금까지 알려지지 않은 인간 단백질 탈인산화효소 k 의 유전자로 확인하여 p55 라고 명명하였다.
실시예 5 케라티노사이트 cDNA 라이브러리의 스크리닝
전체 길이의 p55 탈인산화효소의 cDNA 를 얻기 위하여, 상기 실시예 2의 케라티노사이트 cDNA 라이브러리를 실시예 4에서 얻은 약 120bp 의 p55 DNA 절편을 탐침으로 이용하여 스크리닝하였다. 스크리닝은 50% 포름아마이드, 0.1% 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone, PVP), 0.1% 소혈청 알부민(BSA), 0.1% 피로포스페이트(pyrophosphate), 0.1% 피콜(Ficoll), 0.5% SDS, 5× SSC, 10mM EDTA, 0.15mg/ml 디네이쳐 연어 정자 DNA(denatured salmon sperm DNA)가 포함된 완충용액으로 42℃에서 12-18시간 동안 혼성화(hybridization)시킴으로 수행하였다.
필터를 세척하는 과정으로 마지막에 0.25× SSC, 0.2% SDS 용액을 이용하여 65℃ 에서 약 20-30분 동안 필터를 처리하였다. 3회에 걸친 스크리닝을 통하여 최종적으로 15개의 p55 유전자 양성 클론을 확인하였고, 그 중에 전 길이 cDNA 클론으로 Eco RI 및 Xho I 제한효소 반응에서 가장 큰 삽입자(insert)를 나타내는 약 5.8kb DNA 인 p55-7(h-RPTP-k)를 선택하여 이를 DNA 시퀀싱을 통하여 검정하였다(서열표 3 및 도 1 참조).
실시예 6 각종 세포주에서 단백질 탈인산화효소 k 유전자의 발현 분석
실시예 5에서 얻은 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자(h-RPTP-k) p55-7 의 발현을 분석하기 위하여 여러 종류의 인간 세포들을 탐색하였다.
우선, 여러 종류의 인간 세포들은 10% 소태아 혈청(fetal calf serum)이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37℃의 CO2배양기에서 배양하였고, 이렇게 얻은 세포로부터 RNAzolTMB 용액(Biotecx, TX)을 사용하여 제조자가 추천하는 방법에 따라 전체 RNA 를 분리하였다. 분리한 RNA 시료는 1.2% 포름알데히드-아가로스 겔을 이용한 전기영동으로 분리하였고, 혼성화를 수행하기 위하여 이를 상기의 겔로부터 Genescreen PlusTM멤브레인(Dupont-NEN, MA)으로 이동시켰다.
상기에서 얻은 멤브레인은 50% 포름아마이드, 10% 덱스트란 설페이트, 7% SDS, 0.25M NaHPO4, 0.25M NaCl, 1mM EDTA, 100μg/ml 디네이쳐 연어 정자 DNA 가 포함된 용액을 사용하여 42℃에서 하룻동안 반응시켰고, 멤브레인을 세척하는 마지막 과정은 0.25× SSC, 0.2% SDS 가 포함된 용액을 사용하여 60℃에서 15분간 반응시켰다.
본 발명에서 사용한 세포주들로 정상의 인간 각질세포인 NHK; 각종의 각질세포 HaCaT, KB 및 A431; B 세포주인 Raji, Daudi 및 RPMI1788; T 세포주인 Hut 78, 에리트로류케미아 세포주인 K562 등을 들 수 있다(도 3 참조).
실시예 7 인간 조직에서 단백질 탈인산화효소 k 유전자의 발현 분석
실시예 5에서 동정한 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자(h-RPTP-k) p55-7 의 발현을 분석하기 위하여 인간 조직들을 탐색하였다.
각종 인간 조직에서 탈인산화효소 k 유전자(p55-7)의 발현은 인간의 다발성 조직 노던 블럿 Ⅱ(multiple tissue northern blot Ⅱ, Clontech, CA)를 사용하여 분석하였다. 이 때 노던 블럿 실험은 실시예 6 의 조건과 동일하게 수행하였다. 본 발명의 발현 분석에는 조직으로 지라, 흉선, 정소, 난소, 소장, 전립선 및 말단혈액 백혈구 등을 사용하였다(도 4 참조).
실시예 8 단백질 탈인산화효소 k 유전자의 염색체 지도상의 위치 결정
본 발명의 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자의 염색체 지도상의 위치를 결정하기 위하여, 모든 종류의 인간 염색체를 함유하고 있는 인간-쥐 하이브리드 패널(human-rodent hybrid panel, Onco, Gaithersburg)을 이용하고, α-32P-dATP (800 Ci/mmole)로 표지된 인간 탈인산화효소 k 의 cDNA 유전자를 탐침으로 서던 블럿을 수행하였다.
이 때 혼성화는 50% 포름아마이드, 6× SSC, 1% SDS, 150μg/ml 디네이쳐 연어 정자 DNA 가 포함된 용액을 이용하여 45℃에서 16-20시간 동안 수행하였다. 필터는 0.1× SSC, 0.1% SDS 용액을 이용하여 52℃에서 15분 동안 3회에 걸쳐 세척하였다.
그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 인간 염색체 6번, 남자 게놈(male human genome) 및 여자 게놈(female human genome)의 세곳에서 양성 신호를 확인하였다. 이 때 도 5의 숫자들과 X, Y는 각각 염색체의 번호를 나타내며, M 은 쥐의 게놈 DNA, H 는 햄스터의 게놈 DNA, E 는 비어있는 레인, M 은 람다/Hind Ⅲ DNA 마커를 표시한다. 따라서, 본 발명의 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자는 염색체 6번에 위치함을 알 수 있었다.
[발명의효과]
본 발명의 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열을 이용하면 세포내 인산화 작용이 관여하는 신호전달체계를 깊이 이해하여 이의 이상에 의해 유발되는 다양한 질환을 예방하거나 치료하는 신의약품을 용이하게 개발할 수 있다.
구체적으로 본 발명의 유전자 및 이로부터 얻은 효소 단백질을 이용하여 본 효소의 발현 또는 활성에 작용하는 저해제 및 촉진제 등을 개발함으로써, 본 발명의 단백질 탈인산화효소 k 가 단백질 인산화효소와 가역적으로 작용하는데 이상이 생김으로 유발되는 질환인 암, 관절염, 당뇨병, 천식, 전신성 홍반 루푸스, 다발성 경화, 치매 및 악성 신경교종 등의 예방 및 치료에 널리 사용될 수 있다.
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 1
서열의 길이 : 28
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산(올리고 뉴클레오타이드)
[서열표 1]
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 2
서열의 길이 : 29
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)
[서열표 2]
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 3
서열의 길이 : 5775
서열의 형 : 핵산
쇄의 수 : 2본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : cDNA
[서열표 3a]
[서열표3b]
[서열표 3c]
[서열표 3d]
[서열표 3e]
[서열표 3f]
〔서 열 목 록〕
서열번호 : 4
서열의 길이 : 1440
서열의 형 : 아미노산
쇄의 수 : 1본쇄
형태 : 직쇄상
서열의 종류 : 효소 단백질
[서열표 4a]
[서열표 4b]

Claims (5)

  1. 인간 정상의 각질세포(keratinocyte)에서 유래한 새로운 단백질 탈인산화효소 k 유전자.
  2. 제 1항에 있어서, 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 인간 단백질 탈인산화효소 k 유전자.
  3. 제 2항의 염기 서열로부터 유래한 서열번호 4의 인간 단백질 탈인산화효소 k 의 아미노산 서열.
  4. 제 1항의 유전자 및 이로부터 발현된 단백질 탈인산화효소 k 를 이용하여 얻은 세포신호전달 조절제.
  5. 제 4항에 있어서, 암, 관절염, 당뇨병, 천식, 전신성 홍반 루푸스, 다발성 경화, 치매 및 악성 신경교종을 예방하거나 치료하는데 사용하는 세포신호전달 조절제.
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