JP3925937B2 - 生体適合性および生物活性を改善するための蛋白質の化学修飾 - Google Patents

Description

本発明は広範には生物活性蛋白質またはその類似体の化学修飾に関する（本明細書中「蛋白質」という用語は特段の記載が無い限り「ポリペプチド」または「ペプチド」と同義とする）。特に本発明は種々の蛋白質の部位特異的な化学修飾のための新規な方法およびその結果得られる組成物を記載するものである。

遺伝子工学光学および細胞工学の最近の進歩により、種々のインビボ薬理作用を示すことが知られている蛋白質を医薬品用途のために大量に製造できるようになった。このような蛋白質にはエリスロポエチン（ＥＰＯ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン（α、β、γ、コンセンサス）、腫瘍壊死因子結合蛋白質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン−１受容体拮抗剤（ＩＬ−１ｒａ）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、巨核球生育分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、膠細胞系統由来神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）および肥満蛋白質（ＯＢ蛋白質）が包含される。ＯＢ蛋白質は本明細書ではレプチンとも称する。

顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）は造血前駆細胞から好中球への分化を誘発し成熟好中球の活性を亢進させる糖蛋白質である。大腸菌内で発現させた組み換えヒトＧ−ＣＳＦ（ｒｈＧ−ＣＳＦ）は１７５のアミノ酸を含み、１８，７９８Ｄａの分子量を有し、そして、生物学的に活性である。現在Ｆｉｌｇｒａｓｔｉｍという組み換えＧ−ＣＳＦが治療用に使用できる。

種々の条件下のＧ−ＣＳＦの構造がＬｕ等のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．２６７，８７７０−８７７７（１９９２）などで盛んに研究されており、最近ｒｈＧ−ＣＳＦの三次元構造がＸ線結晶分析により測定された。Ｇ−ＣＳＦは４つのα−ヘリックス束と２つの長重複連結部の構造モチーフを共有する増殖因子のクラスのメンバーである（Ｈｉｌｌ等、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０，５１６７−５１７１（１９９３））。このファミリーはＧＭ−ＣＳＦ、生育ホルモン、インターロイキン−２、インターロイキン−４、および、インターフェロンβを包含する。２次構造の範囲は溶媒のｐＨに影響を受けやすく、蛋白質は酸性ｐＨにおいてより高度のαヘリックス含量となる（Ｌｕ等、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，２８６，８１−９２（１９８９））。

レプチンはｏｂ／ｏｂ突然変異マウス（ＯＢ遺伝子産物の生産における欠損による肥満マウス）と正常な野生型マウスの双方においてインビボの活性を示す。生物活性はとりわけ体重減少において顕在化する。一般的文献としてはＢａｒｉｎａｇａの”Ｏｂｅｓｅ” Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｌｉｍｓ Ｍｉｃｅ（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：４７５−４７６（１９９５））およびＦｒｉｅｄｍａｎの”Ｔｈｅ Ａｌｐｈａｂｅｔ ｏｆ Ｗｅｉｇｈｔ Ｃｏｎｔｒｏｌ” （Ｎａｔｕｒｅ３８５：１１９−１２０（１９９７））が参照できる。例えば、ｏｂ／ｏｂ突然変異マウスにおいては、レプチンの投与により血清中インシュリン濃度および血清中グルコース濃度が低下する。また、レプチンの投与により体脂肪が減少することも知られている。このことはｏｂ／ｏｂ突然変異マウスと非肥満正常マウスの双方で観察されている。Ｐｅｌｌｅｙｍｏｕｎｔｅｒ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：５４０−５４３（１９９５）、Ｈａｌａａｓ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９：５４３−５４６（１９９５）が参照できる。またＣａｍｐｆｉｅｌｄ等のＳｃｉｅｎｃｅ ２６９：５４６−５４９（１９９５）も参照できる（マイクログラム用量のレプチンを末梢および中枢に投与した場合、摂餌量の低下と体重減少はｏｂ／ｏｂおよび食餌誘発肥満マウスでは観察されたが、ｄｂ／ｄｂ肥満マウスでは観察されなかった）。前記した報告の何れにおいても、最高用量においてさえ毒性は観察されていない。

動物モデルに置ける予備レプチン誘発体重減少試験はヒトの肥満を効果的に治療するためには高濃度のレプチン製剤を長期投与する必要性があることを予測するするものである。０．５乃至は１．０ｍｇ／ｋｇ／日以下のようなキログラム体重当たりミリグラム水準の蛋白質の用量が、ヒトのようなより大型の哺乳類への治療有効量の注射のためには望ましい。即ち、患者にとって不快であり、あるいは痛みを伴う可能性のある大容量注射を避けるためには、蛋白質濃度の上昇が必要となる。

残念なことに、ヒトにおける注射のための医薬組成物の調製に関しては、レプチンのアミノ酸配列が約２ｍｇ活性蛋白質／ミリリットル液体を超えるような比較的高濃度では生理学的ｐＨで不溶性であることが観察されている。生理学的条件下でレプチンの溶解度が低いことは、低ｐＨ製剤中で高用量を投与する際の濃度依存的な注射部位におけるレプチンの沈殿物の形成に寄与すると考えられる。観察されるレプチンの沈殿に伴い、注射部位に炎症応答が起こり、これには好酸球、マクロファージおよび巨大細胞の存在を特徴とする混合細胞浸潤が含まれる。

今日まで、生理学的ｐＨにおける少なくとも約２ｍｇ／ｍｌの濃度のヒトＯＢ蛋白質の安定な製剤に関する報告は無く、更に、少なくとも約５０ｍｇ／ｍｌ以上の活性ヒトＯＢ蛋白質の安定な濃度の報告も無い。前記した問題を伴うことなく高用量を可能にするレプチン形態の開発は大きな利益をもたらすと考えられる。従って、本発明の１つの目的は蛋白質の部位特異的化学修飾によりレプチンの進歩した形態を与えることである。

有用な治療用蛋白質の化学修飾の方法が幾つか報告されている。その内の１つであるスクシニル化では、１つ以上のスクシニル部分を生物学的に活性な蛋白質に結合させる。スクシニル化の伝統的方法は極めて過剰量の無水コハク酸を用いたアルカリ反応条件を用いている。得られるスクシニル蛋白質コンジュゲートは典型的には複数の部位で修飾されており、異なった３次および４次構造を示す場合が多く、しばしば不活性化される。種々のスクシニル化蛋白質の特性についてはＨｏｌｃｅｎｂｅｒｇ等のＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５０：４１６５−４１７０（１９７５）および１９８８年３月１０日公開のＷＯ８８／０１５１１（およびその引用文献）に記載されている。重要な点は、引用文献の何れも、生物学的に活性な蛋白質が蛋白質のＮ−末端のみにおいてモノスクシニル化され、そして、得られる組成物が進歩した溶解度および進歩した注射部位における毒性を示すような方法を記載していないということである。

ジエチレントリアミン５酢酸無水物（ＤＴＰＡ）およびエチレンジアミン４酢酸２無水物（以後ＥＤＴＡ^２と記載する）は放射標識の目的のために蛋白質に金属キレート形成部位を導入するために伝統的に用いられている。スクシニル化の場合と同様、ＤＴＰＡおよび／またはＥＤＴＡ^２による修飾は典型的には分子全体に渡る複数の部位で起こり、修飾された蛋白質の電荷と等電点を変化させる。今日まで、溶解度および注射部位における毒性の改善を示すＤＴＰＡ−および／またはＥＤＴＡ^２−蛋白質の単量体および二量体の報告は無い。

本発明は化学修飾された蛋白質、例えば、レプチンおよびＧ−ＣＳＦの実質的に均質な製剤およびその製造方法に関する。意外にも、レプチンの部位特異的化学修飾が他のレプチン種で観察されなかった生物学的利用性および生物学的適合性における利点を示した。重要な点は、本明細書に記載する方法が他の蛋白質（またはその類似体）並びにレプチンに広範に適用できる点である。即ち、以下に詳述する通り、本発明は蛋白質（またはその類似体）の化学修飾並びに特定の蛋白質の特異的修飾に関する多くの特徴を有する。

１つの態様において、本発明は、モノスクシニル化レプチン（またはその類似体）の実質的に均質な製剤および関連の方法に関する。重要な点は、記載する方法がＮ−末端においてのみ修飾されているモノスクシニル化蛋白質を高収率で与え、これにより、他の物質種と比較して工程上の利点を与えるという点である。更に、少ないＮ−末端修飾にもかかわらず、モノ置換されたスクシニル−レプチンは意外にも、１）溶解度の実質的な改善、２）二次構造、インビトロの受容体結合活性およびインビボの生体力価の保持、および、３）非修飾レプチンの高濃度投与で観察された重度の注射部位反応の緩解をもたらした。

別の態様において、本発明は、モノスクシニル化されたＧ−ＣＳＦおよびその類似体の実質的に均質な製剤および関連の方法に関する。重要な点は、モノ置換されたスクシニル−Ｇ−ＣＳＦおよびモノ置換されたスクシニル−Ｇ−ＣＳＦ類似体が意外にも溶解度の実質的改善、４℃および３７℃における物理学的安定性、および、インビトロの生物活性の保持を示した点である。

別の態様において、本発明はＤＴＰＡ−レプチン単量体および二量体の実質的に均質な製剤および関連の方法に関する。中性ｐＨでレプチンおよび僅かに化学量論的に過剰なＤＴＰＡ：蛋白質を用いて反応させた場合、前記試薬は意外にも２個のレプチン分子のＮ−末端の間の単一の交差結合を高収率で形成した。モノ置換されたＤＴＰＡ−レプチン単量体および二量体を単離した場合、両方とも、非修飾の蛋白質と比較して実質的に高い溶解度を示す。両方ともインビトロの受容体結合活性およびインビボの生体力価の保持も示す。有意義な点は、モノ置換されたＤＴＰＡ−レプチンの二量体型がＰＢＳ中高濃度で注射しても沈殿せず、非修飾のレプチンで観察されたものと比較して注射部位の反応が極めて改善されていた点である。

更に別の態様において、本発明はＥＤＴＡ２無水物（ＥＤＴＡ^２）−レプチン単量体および二量体の実質的に均質な製剤および関連の方法に関する。構造に関してＤＴＰＡと同様、ＥＤＴＡ^２は化学量論的過剰量未満で中性ｐＨで反応させた場合にＮ−末端を介して効率的にレプチンと交差結合する。単離したＥＤＴＡ^２−レプチン二量体は非修飾のレプチンと比較して劇的に向上した溶解度を示し、インビトロの受容体結合活性およびインビボの生物活性も完全に維持している。更に、ＥＤＴＡ^２−レプチンコンジュゲートはＰＢＳ中高濃度で投与しても注射部位において沈殿せず、非修飾のレプチンで観察された注射部位の副反応の点でも実質的な改善を示した。

（発明の詳細な説明）
本発明は化学修飾蛋白質の実質的に均質な製剤およびそのための方法に関する。本明細書における「実質的に均質な」とは、観察される化学修飾された蛋白質のみが１つの「修飾物質」（例えばＤＴＰＡ、ＥＤＴＡ^２、スクシニル）部分を有するものであることを意味する。製剤は未反応（即ち修飾物質部分を欠く）蛋白質を含有してもよい。ペプチドマッピングおよびＮ−末端配列決定により確認されるとおり、以下に示す１つの例は少なくとも９０％が修飾蛋白質であり最大１０％が非修飾蛋白質である製剤を与えるものである。好ましくは、化学修飾物質は製剤の少なくとも９５％（以下の製造実施例に示すとおり）であり、そして好ましくは化学修飾物質は製剤の９９％以上である。化学修飾物質は生物活性を有する。本明細書において示す本発明の「実質的に均質な」モノスクシニル化蛋白質、ＤＴＰＡ−レプチン、および、ＥＤＴＡ^２−レプチンの製剤は、均質な製剤の利点、例えば、ロット毎の薬物動態が予測可能な臨床的用での容易性を示すために十分均質なものである。

本明細書においては、生物活性剤とは組み換えまたは天然の蛋白質であって、ヒトまたは動物を問わず、予防、治療または診断用とにおいて有用なものを指す。生物活性剤は天然、合成、半合成のものまたはその誘導体であることができる。更に、本発明の生物活性剤は知覚可能である。広範囲の生物活性剤が例示できる。その例としては、ホルモン類、サイトカイン類、造血因子、増殖因子、抗肥満因子、栄養因子、抗炎症因子および酵素が包含されるが、これらに限定されない（有用な生物活性剤のその他の例については米国特許第４，６９５，４６３号を参照できる）。当業者は本発明の組成物に所望の生物活性剤を容易に適合させることができる。

このような蛋白質はインターフェロン類（米国特許第５，３７２，８０８号、第５，５４１，２９３号、第４，８９７，４７１号および第４，６９５，６２３号を参照。図面と供に参考のために本明細書に組み込む）、インターロイキン類（米国特許第５，０７５，２２２号を参照。図面と供に参考のために本明細書に組み込む）、エリスロポエチン類（米国特許第４，７０３，００８号、第５，４４１，８６８号、第５，６１８，６９８号、第５，５４７，９３３号および第５，６２１，０８０号を参照。図面と供に参考のために本明細書に組み込む）、顆粒球コロニー刺激因子（米国特許第４，８１０，６４３号、第４，９９９，２９１号、第５，５８１，４７６号、第５，５８２，８２３号およびＰＣＴ公開９４／１７１８５号を参照。図面と供に参考のために本明細書に組み込む）、幹細胞因子（ＰＣＴ公開９１／０５７９５号、９２／１７５０５号および９５／１７２０６号参照。図面と供に参考のために本明細書に組み込む）、およびレプチン（ＯＢ蛋白質）（ＰＣＴ公開９６／４０９１２号、９６／０５３０９号、９７／００１２８号、９７／０１０１０号および９７／０６８１６号を参照。図面と供に参考のために本明細書に組み込む）を包含するがこれらに限定されない。１９９６年２月２２日に公開された「Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｂｏｄｙ Ｗｅｉｇｈｔ，Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ａｎｄ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅｓ Ｔｈｅｒｅｏｆ」と題されるＰＣＴ公開ＷＯ９６／０５３０９号はＯＢ蛋白質および関連の組成物および方法を完全に記載しており、参考のために本明細書に組み込む。ヒトＯＢ蛋白質のアミノ酸配列はＷＯ９６／０５３０９の配列番号４および６（公開明細書の１７２および１７４ページ）として記載されており、成熟蛋白質の最初のアミノ酸残基は２２位にあり、バリン残基である。成熟蛋白質は１４６残基（あるいは、４９位のグルタミンが非存在の配列番号４の場合は１４５残基）よりなる。

一般的に、本発明の実施において有用なＧ−ＣＳＦは哺乳類生物から単離される形態、または、化学合成法の、または、ゲノムまたはｃＤＮＡクローニングによるかまたはＤＮＡ合成により得られる外因性ＤＮＡ配列の原核または真核生物宿主発現の産物であってよい。適当な原核生物宿主には種々の細菌（例えば大腸菌）が包含され、適当な真核生物宿主には酵母（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および哺乳類細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞、サル細胞）が包含される。使用する宿主に応じて、Ｇ−ＣＳＦ発現産物は哺乳類または他の真核生物の炭水化物でグリコシル化してよく、あるいは、非グリコシル化状態であってもよい。Ｇ−ＣＳＦ発現産物はまた最初のメチオニンアミノ酸残基を（−１位に）含んでいてもよい。組み換えＧ−ＣＳＦ、特に大腸菌由来のものが、とりわけ商業的現実性が高いことから好ましく用いられるものの、本発明は前記した形態のＧ−ＣＳＦの何れかおよび全ての使用を意図している。

特定のＧ−ＣＳＦ類似体が生物学的機能を有するものとして報告されており、これらもまた化学修飾してよい。Ｇ−ＣＳＦ類似体は米国特許第４，８１０，６４３号に記載されている。生物活性を有すると報告されている他のＧ−ＣＳＦ類似体の例としては、報告されている各類似体の活性に関する記述は無いが、ＡＵ−Ａ−７６３８０／９１号、ＥＰ ０ ４５９ ６３０号、ＥＰ ０ ２７２ ７０３号、ＥＰ ０ ４７３ ２６８号およびＥＰ ０ ３３５ ４２３号に記載されているものが挙げられる。更にまたＡＵ−Ａ−１０９４８／９２号、ＰＣＴ ＵＳ９４／００９１３号およびＥＰ ０ ２４３ １５３号も参照できる。一般的に、本発明において有用なＧ−ＣＳＦおよびその類似体は本明細書に記載する化学修飾法を実施し、そして、得られた産物が所望の生物学的特性を有するかどうか試験すること、例えば本明細書に記載する生物活性検定により確認してよい。当然ながら、所望により、非ヒト哺乳類を治療する際には、マウス、ウシ、イヌ由来組み換え体等、組み換え非ヒトＧ−ＣＳＦを使用してよい。例えばＰＣＴ ＷＯ ９１０５７９８号およびＰＣＴ ＷＯ ８９１０９３２号を参照できる。

更に、生物活性剤にはまたインシュリン、ガストリン、プロラクチン、副腎皮質刺激ホルモン類（ＡＣＴＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）、モチリン、インターフェロン類（α、β、γ）、インターロイキン類（ＩＬ−１〜ＩＬ−１２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、腫瘍壊死因子結合蛋白質（ＴＮＦ−ｂｐ）、脳由来神経栄養性因子（ＢＤＮＦ）、膠細胞由来神経栄養性因子（ＧＤＮＦ）、神経栄養性因子３（ＮＴ３）、腺維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経栄養性増殖因子（ＮＧＦ）、骨増殖因子例えばオステオプロテグリン（ＯＰＧ）、インシュリン様増殖因子（ＩＧＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、巨核球由来増殖因子（ＭＧＤＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、トロンボポエチン、血小板由来増殖因子（ＰＧＤＦ）、コロニー刺激増殖因子（ＣＳＦ）、骨形態形成蛋白質（ＢＭＰ）、スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）、組織プラスミノーゲン活性化物質（ＴＰＡ）、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼおよびカリクレインが包含されるが、これらに限定されない。本明細書においては蛋白質という用語はペプチド、ポリペプチド、コンセンサス分子、類似体、誘導体、または、それらの組み合わせを包含するものとする。

一般的に、本発明には、化学修飾蛋白質または誘導産物の有効量を投与に必要な製薬上許容しうる希釈剤、保存料、可溶化剤、乳化剤、補助剤および／または担体と供に含有する医薬組成物が包含される（ＰＣＴ ９７／０１３３１が参照され、参考のために本発明に組み込まれる）。所望の生物活性剤のための最適な医薬製剤は投与経路および所望の用量に応じて当業者が決定する。例示される医薬組成物はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，１８ｔｈ Ｅｄ．， Ｅａｓｔｏｎ， ＰＡ， ｐｇｓ．１４３５−１７１２（１９９０））に開示されている。本発明の医薬組成物は経口用製剤および非経口用製剤（例えば筋肉内、皮下、経皮、内臓、ＩＶ（静脈内）、ＩＰ（腹腔内）、関節内、耳内設置、ＩＣＶ（脳室内）、ＩＰ（腹腔内）、動脈内、包膜内、嚢胞内、眼窩内、注射、肺内、鼻内、肛門内、および、子宮内−経粘膜投与用の製剤）により投与してよい。

本発明の組成物の治療用途は使用される生物活性剤に応じて異なる。当業者は所望の生物活性剤をその意図する治療用途のために本発明に容易に当てはめることができる。そのような治療用途は図面と供に参考のために本発明に組み込まれる以下に示す出版物により詳細に記載されている。治療用途にはインターフェロン類（米国特許第５，３７２，８０８号、第５，５４１，２９３号参照。図面と供に参考のために本明細書に組み込む）、インターロイキン類（米国特許第５，０７５，２２２号を参照。図面と供に参考のために本明細書に組み込む）、エリスロポエチン類（米国特許第４，７０３，００８号、第５，４４１，８６８号、第５，６１８，６９８号、第５，５４７，９３３号および第５，６２１，０８０号を参照。図面と供に参考のために本明細書に組み込む）、顆粒球コロニー刺激因子（米国特許第４，９９９，２９１号、第５，５８１，４７６号、第５，５８２，８２３号、第４，８１０，６４３号およびＰＣＴ公開９４／１７１８５号を参照。図面と供に参考のために本明細書に組み込む）、幹細胞因子（ＰＣＴ公開９１／０５７９５号、９２／１７５０５号および９５／１７２０６号参照。図面と供に参考のために本明細書に組み込む）、およびＯＢ蛋白質（ＰＣＴ公開９６／４０９１２号、９６／０５３０９号、９７／００１２８号、９７／０１０１０号および９７／０６８１６号を参照。図面と供に参考のために本明細書に組み込む）のような蛋白質のための使用が包含されるがこれらに限定されない。更に本発明の組成物は生物活性剤により治療されることを意図する症状の治療または緩解のための複数の医薬の製造のためにも使用してよい。

モノスクシニル化蛋白質の実質的に均質な製剤の製造のための方法の第１の実施態様は、（ａ）無水コハク酸３〜７倍モル過剰量に蛋白質を反応させること；（ｂ）４℃において２〜１６時間前記反応混合物を攪拌すること；（ｃ）２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２に対して前記混合物を透析すること；および（ｄ）前記モノスクシニル化蛋白質を単離することを包含する。場合により、方法は、段階（ｂ）の直後に、ヒドロキシルアミンが完全に溶解するまでｐＨを６．５より高値に維持しながら前記混合物に固体ヒドロキシルアミンを添加する段階、次いで５ＮＮａＯＨを用いてｐＨを８．５まで高める段階、次いで、前記混合物を４℃でさらに１〜２時間攪拌することを包含する段階ができる。一般的な工程を実施例１に模式的に示す。

ＤＴＰＡ−蛋白質の実質的に均質な製剤の製造のための方法の第１の実施態様は、（ａ）ＤＴＰＡ１〜５倍モル過剰量に蛋白質を反応させること；（ｂ）４℃において２〜１６時間前記反応混合物を攪拌すること；（ｃ）２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．２に対して前記混合物を透析すること；および（ｄ）前記ＤＴＰＡ−蛋白質を単離することを包含する。一般的な工程を実施例１に模式的に示す。

ＥＤＴＡ^２−蛋白質の実質的に均質な製剤の製造のための方法の第１の実施態様は、（ａ）ＥＤＴＡ^２の０．５〜５倍モル過剰量に蛋白質を反応させること；（ｂ）４℃において２〜１６時間前記反応混合物を攪拌すること；（ｃ）前記反応混合物を濾過すること；（ｄ）前記反応混合物を濃縮すること；および（ｅ）前記ＥＤＴＡ^２−蛋白質を単離することを包含する。一般的な工程を実施例１に模式的に示す。

以下の実施例は本発明をより詳細に説明するために提示するものであり、本発明の範囲を限定する意図はない。実施例１はモノスクシニル化レプチン、モノ置換ＤＴＰＡ−レプチンの単量体および二量体、および、ＥＤＴＡ^２−レプチンの単量体および二量体の製剤を記載するものである。実施例２は実施例１で調製した修飾レプチン種の物理化学同定を記載するものである。実施例３は実施例１で調製した修飾レプチン種に対して実施した受容体結合試験を記載するものである。実施例４は実施例１で調製した修飾レプチン種に対して実施した溶解度試験を記載するものである。実施例５は実施例１で調製した修飾レプチン種に対して実施したインビボの生物活性試験を記載するものである。実施例６は実施例１で調製した修飾レプチン種に対して実施した注射部位評価を記載するものである。実施例７はモノスクシニル化Ｇ−ＣＳＦおよびモノスクシニル化Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ａ）類似体の製剤について記載するものであり、更に、製剤に関するインビトロの生物活性試験、溶解度検定試験、および、物理的安定性試験を記載するものである。

本実施例はモノスクシニル化レプチン、モノ置換ＤＴＰＡ−レプチンの単量体および二量体、およびＥＤＴＡ^２−レプチンの単量体および二量体の製剤を記載するものである。

１．モノスクシニル化レプチン
本発明の蛋白質スクシニル化方法は一般的に以下の通り説明できる。

組み換えヒトメチオニルレプチン（ｒｈｕ−ｍｅｔ−レプチン）蛋白質（後述する材料および方法に記載の通り調製）を２〜３ｍｇ／ｍＬの濃度で２０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４、ｐＨ７．０中、３〜７倍モル過剰量の固体無水コハク酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、好ましくは５倍モル過剰量と反応させ、反応混合物を４℃で２〜１６時間攪拌した。次ぎに固体ヒドロキシルアミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を反応混合物に添加し、その間ｐＨを６．５より高値に維持した。ヒドロキシルアミンが完全に溶解した後、５ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを８．５まで上昇させ、反応混合物をさらに１〜２時間４℃で攪拌した（収率が僅かに低下するがヒドロキシルアミン工程は省略してもよい）。最後に、反応混合物を２０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．２に対して透析する。

モノスクシニル化ｒｈｕ−ｍｅｔ−レプチンを２０ｍＭトリス、ｐＨ７．２中、０〜０．５ＭのＮａＣｌの勾配溶離によるＨｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより単離する（図１参照）。生成物は５％ポリアクリルアミド、ｐＨ３〜７のゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた等電点電気泳動（ＩＥＦ）ＰＡＧＥにより観察される−０．７ｐＩ単位の等電点シフトにより溶出液中に確認される（図２）。モノスクシニル化ｒｈｕ−ｍｅｔ−レプチンの最終回収率は典型的には４５〜４７％である。

２．モノ置換されたＤＴＰＡ−レプチンの単量体および二量体
本発明のＤＴＰＡ修飾法は一般的に以下の通り説明できる。

組み換えヒトメチオニルレプチン（ｒｈｕ−ｍｅｔ−レプチン）蛋白質（後述する材料および方法に記載の通り調製）を２〜３ｍｇ／ｍＬの濃度で２０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４、ｐＨ７．０中、１〜５倍モル過剰量の固体ＤＴＰＡ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、好ましくは２〜３倍モル過剰量と反応させ、反応混合物を４℃で２〜１６時間攪拌した。最後に、反応混合物を２０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．２に対して透析する。ＤＴＰＡ修飾ｒｈｕ−ｍｅｔ−レプチンを２０ｍＭトリス、ｐＨ７．２中、０〜０．５ＭのＮａＣｌの勾配溶離によるＨｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより単離する。あるいは、モノ置換されたＤＴＰＡ−ｒｈｕ−ｍｅｔ−レプチンまたはｒｈｕ−ｍｅｔ−レプチンの単量体型および二量体型をＰＢＳ中Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ １００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）上のサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーにより分離する（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）（図３参照）。生成物は５％ポリアクリルアミド、ｐＨ３〜７のゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた等電点電気泳動（ＩＥＦ）ＰＡＧＥによる単量体ＤＴＰＡ−レプチンで観察される等電点シフトにより（図２）、または、４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察される交差結合二量体の質量の増大により（図４参照）、溶出液中に確認される。ＤＴＰＡ−ｒｈｕ−ｍｅｔ−レプチンの最終回収率は約３０％である。

３．モノ置換されたＥＤＴＡ^２−レプチンの単量体および二量体
本発明のＥＤＴＡ^２修飾法は一般的に以下の通り説明できる。

組み換えヒトメチオニルレプチン（ｒｈｕ−ｍｅｔ−レプチン）蛋白質（後述する材料および方法に記載の通り調製）を２〜３ｍｇ／ｍＬの濃度で２０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４、ｐＨ７．０中、固体の、または、ＤＭＳＯに溶解した０．５〜５倍モル過剰量のＥＤＴＡ^２（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、好ましくは、ＤＭＳＯ中０．７５倍モル過剰量のＥＤＴＡ^２と反応させ、反応混合物を４℃で２〜１６時間攪拌した。

次ぎに反応混合物を０．４５ミクロンのフィルター（Ｎａｌｇｅｎｅ）で濾過し、〜２０ｍｇ／ｍＬまで１０ｋＤａ分子量カットオフ膜上の攪拌セルにより濃縮し、そして、次ぎにモノ置換ＥＤＴＡ^２−ｒｈｕ−ｍｅｔ−レプチンの単量体型および二量体型をＰＢＳ中平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ １００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）上のサイズエクスクルージョンクロマトグラフィーにより分離する（図５参照）。あるいは、２０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４、ｐＨ７．０中０．８〜０Ｍの硫酸アンモニウムの勾配溶離によるＨｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を用いた疎水性相互作用クロマトグラフィーにより反応混合物を精製してよい。生成物は、５％ポリアクリルアミド、ｐＨ３〜７のゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた等電点電気泳動（ＩＥＦ）ＰＡＧＥによる単量体ＥＤＴＡ^２−ｒｈｕ−ｍｅｔ−レプチンで観察される等電点シフトにより（図２）、または、４〜２０％ポリアクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察される交差結合二量体の質量の増大により（図４参照）、溶出液中に確認される。ＥＤＴＡ^２−ｒｈｕ−ｍｅｔ−レプチン二量体の最終回収率は５０％を超える。

本実施例は実施例１で調製したレプチンコンジュゲートゲートの物理化学的同定について記載するものである。スクシニル−レプチン、ＤＴＰＡ−レプチンの単量体および二量体、および、ＥＤＴＡ^２−レプチンの単量体および二量体の修飾を、逆相ＨＰＬＣ上のＬｙｓ−Ｃ消化のペプチドマッピング、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトル分析およびペプチド配列決定の組み合わせにより評価した。

非修飾レプチンおよび種々の修飾レプチンのＬｙｓ−Ｃ消化は、室温で４時間５０ｍＭトリス−塩酸、ｐＨ８．５（２００μＬ）中エンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）４μｇに蛋白質１００μｇを反応させることにより実施した。種々の試料のペプチドマップは０〜９０％アセトニトリルの勾配溶離による０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）で平衡化した４．６×２５０ｍｍ、５μＣ４カラム（Ｖｙｄａｋ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）上の逆相ＨＰＬＣにより求めた（図６〜８参照）。図６〜８に示したプロットから明らかなとおり、Ｎ−末端ペプチド（Ｍ１−Ｋ６）のみが化学修飾の結果として保持時間の何らかの変化を示している。この結果は６位のリジンは非修飾であり、Ｌｙｓ−Ｃ消化に供され得ることを示しており、化学修飾がＮ−末端のα−アミンで起こることを示唆している。Ｎ−末端修飾は更にＮ−末端配列の寄与も受けており、このことはＮ−末端がブロックされていることを示唆している（データは示さず）。

スクシニル−レプチンおよびＤＴＰＡ−およびＥＤＴＡ^２−レプチンの二量体の質量の測定は、シナピン酸マトリックス中１２ｐｍｏｌの試料を用いてＫｏｍｐａｃｔ Ｍａｌｄｉ ＩＶ（Ｋｒａｔｏｓ，Ｒａｍｓｅｙ，ＮＪ）において実施した。各コンジュゲートは分子当たり単一の化学修飾を示している。

前記した分析に加えて、スクシニル−レプチンの２次構造に対する作用を円偏光二色性スペクトル分析を用いて評価した。リン酸緩衝食塩水中の非修飾およびスクシニル化されたレプチンの遠ＵＶ円偏光二色性スペクトルをＪａｓｃｏ Ｊ−７１０円偏光二色性分光分析器（Ｊａｓｃｏ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）中０．０５ｃｍのセルを用いて取得した。スペクトルは図９に示す通りであり、スクシニル化−レプチンの２次構造が維持されていることを示している。

全体として、実施例２のデータはＮ−末端におけるスクシニル−レプチン、ＤＴＰＡ−レプチンの単量体および二量体、および、ＥＤＴＡ^２−レプチンの単量体および二量体の修飾、並びに、スクシニル−レプチンの２次構造の維持を裏付けるものである。

本実施例は実施例１で調製したレプチンコンジュゲートの各々に対して実施した受容体結合試験を記載するものである。実施例１で調製したレプチンコンジュゲートの各々を、固定化細胞膜内で発現したヒトレプチン受容体における放射標識ヒトレプチンとの置換能力に基づいてレプチンコンジュゲートの相対親和性を測定するインビトロの受容体結合検定を用いて評価した。図１０のデータから明らかなとおり、化学修飾されたイソフォームであるスクシニル−、ＤＴＰＡ−、およびＥＤＴＡ^２−レプチンの各々はリガンド結合の全域（〜１から１００ｎｇ／ｍＬ）に渡り非修飾レプチンと等しいヒトレプチン受容体に対する相対的親和性を示し、そのＥＤ_５０値は約１０ｎｇ／ｍＬであった。

即ち、実施例３のデータはモノ置換スクシニル−レプチン、モノ置換ＤＴＰＡ−レプチンの二量体、および、ＥＤＴＡ^２−レプチンの二量体が、非修飾レプチンと比較して、インビトロの受容体結合活性を保持していることを示している。

本実施例は実施例１で調製したレプチンコンジュゲートの各々に対して実施した溶解度試験を記載するものである。レプチンコンジュゲートをＰＢＳ中に透析し、次ぎにＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ濃縮器、１０ｋＤａ分子量カットオフ（Ａｍｉｃｏｎ）で、沈殿が観察されるようになるまで濃縮した。試料を遠心分離して清澄化し、上澄みのコンジュゲート蛋白質濃度を測定した。次ぎに試料を４８時間室温（約２２℃）に維持し、一定時間間隔で遠心分離し、上澄みのコンジュゲート蛋白質濃度を反復測定した。即ち、ＰＢＳ中のコンジュゲート蛋白質の溶解度は遠心分離後の上澄み中で観察される室温における定常状態の蛋白質の濃度として定義される（表２参照）。

表２は非修飾レプチンと比較して、モノ置換スクシニル−レプチン、モノ置換ＤＴＰＡ−レプチン、および、モノ置換ＥＤＴＡ^２−レプチンが実質的に改善された溶解度を有し、モノ置換ＥＤＴＡ^２−レプチンの溶解度が劇的に上昇していたことを示している。

本実施例は実施例１で調製したレプチンコンジュゲートに対して実施したインビボの生物活性試験を記載するものである。記載したレプチンコンジュゲートをマウスおよびイヌの両方の動物モデルで試験し、非修飾レプチンに対する相対的な生体力価を測定した。モノ置換スクシニル−レプチン、ＤＴＰＡ−レプチン二量体、ＤＴＰＡ−レプチン単量体およびＥＤＴＡ^２−レプチン二量体を１、１０および５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で５〜７日間毎日マウスに注射した。生体力価は、溶媒のみの対照群に対して標準化し、非修飾蛋白質で観察された体重減少と比較した場合の、０日目からの体重の％減少として測定した。１および１０ｍｇ／ｋｇの用量の全試料はそれぞれＰＢＳ中０．２および２．０ｍｇ／ｍｌに調製した。より高用量のものは、化学修飾型については、ＰＢＳ中２０〜５０ｍｇ／ｍｌに調製したが、非修飾レプチンの溶解度の限界のために、高濃度の調製はｐＨ４の酢酸緩衝液中で行うことが必要であった。更にイヌには２８日間に渡り、５ｍｇ／ｍｌの濃度でスクシニル−レプチンを０．０５、０．１５および０．５ｍｇ／ｋｇの１日当たり用量で注射し、その間、体重をモニタリングし、その後、回復期間を設けた。

スクシニルレプチンに関して動物モデルにおける薬物誘導体重減少により判断される生物活性は、イヌおよびマウスの双方で非修飾レプチンと同等であった（図１１）。同様に、ＤＴＰＡ−レプチンの単量体と二量体およびＥＤＴＡ^２−レプチン二量体の何れも、非修飾レプチンと同等の体重減少をマウスにおいてもたらした（図１１および１２）。

図１１および１２のデータはモノ置換スクシニル−レプチン、モノ置換ＤＴＰＡ−レプチンの単量体および二量体、および、ＥＤＴＡ^２−レプチンの二量体が、非修飾レプチンと比較して、インビボの生体力価を維持していたことを示している。

本実施例は実施例１で調製したレプチンコンジュゲートに対して実施した注射部位評価を記載するものである。各投与群３匹のマウスの注射部位から得た組織切片を組織化学的に検査した。確認され評点された注射部位の病理特徴は、壊死、化膿（好酸球および好中球よりなる混合細胞浸潤）、単核細胞（マクロファージ）、レプチン沈殿（微細沈殿または大型の沈着／凝集の何れかを特徴とする）および巨大細胞であった。各反応は以下の等級付け方法を用いて評点した。

０．５〜１ 最小限の変化
１．５〜２ 軽度の変化
２．５〜３ 中等度の変化
３．５〜４ 顕著な変化
４．５〜５ 極度の変化

各動物の評点の合計の平均を用い、以下の評点基準に従って全体の生体適合性評点を定義した。

０〜２ 正常
３〜５ 最小限
６〜１０ 軽度
１１〜２０ 中等度
２１〜３０ 顕著
＞３０ 重度

高濃度のスクシニル−レプチンはｐＨ７．０のＰＢＳ中の溶解度は限られたものであったが、注射部位試験の目的のためには、２０ｍｇ／ｍｌのスクシニル−レプチンの試料はｐＨ７．２のＰＢＳ中、および５０ｍｇ／ｍｌはｐＨ７．５のＰＢＳ中で可溶性を維持していた。表３は、７日後の、ｐＨ４．０の酢酸緩衝液中５０ｍｇ／ｍＬの非修飾レプチンとｐＨ７．５のＰＢＳ中５０ｍｇ／ｍＬのモノ置換スクシニル−レプチンを比較した注射部位の評価を示す。

表３から明らかなとおり、高濃度で投与したモノ置換スクシニル−レプチンは非修飾レプチンと比較して注射部位の病理特徴の何れの項目においても改善性を示しており、最も劇的な改善は、注射部位におけるレプチン沈殿および巨大細胞のほぼ完全な消失として観察された。

表４は、７日後の、ｐＨ４．０の酢酸緩衝液中４３ｍｇ／ｍＬの非修飾レプチンとｐＨ４．０の酢酸緩衝液中４３ｍｇ／ｍＬのモノ置換スクシニル−レプチンを比較した注射部位の評価を示す。

表４のデータは意外にも、高濃度のモノ置換スクシニル−レプチンがｐＨ４の酢酸緩衝液中に処方でき、更になお、モノ置換スクシニル−レプチンをＰＢＳ中に処方した場合に観察された注射部位の反応を劇的に改善したことを示している。

表５は、７日後の、ｐＨ４．０の酢酸緩衝液中２０ｍｇ／ｍＬの非修飾レプチンとＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍＬのモノ置換ＤＴＰＡ−レプチン二量体を比較した注射部位の評価を示す。

表６は、７日後の、ｐＨ４．０の酢酸緩衝液中２０ｍｇ／ｍＬの非修飾レプチンとＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍＬのモノ置換ＥＤＴＡ^２−レプチン二量体を比較した注射部位の評価を示す。

表５および６に示すとおり、ＤＴＰＡ−レプチン二量体（表５）およびＥＤＴＡ^２−レプチン二量体（表６）はＰＢＳ中高濃度でマウスに投与でき、スクシニル−レプチンで観察された注射部位の病理特徴を同様に改善することを示している。しかしながらこれらのコンジュゲートはｐＨ７のＰＢＳには実質的により可溶であり、このため、この緩衝液中ではより極端な調製も可能とする。

全体として、実施例６のデータは、モノ置換スクシニル−レプチン、モノ置換ＤＴＰＡ−レプチンの単量体および二量体、および、ＥＤＴＡ^２−レプチンの単量体および二量体は高濃度で投与された場合に注射部位で沈殿しないことを示しており、そして、重要な点は、非修飾レプチンで観察された注射部位の副反応を実質的に改善していることを示している点である。

本実施例はモノスクシニル化Ｇ−ＣＳＦおよびモノスクシニル化Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ａ）類似体の製剤を記載し、次ぎに、Ｇ−ＣＳＦ製剤に関するインビトロの生物活性試験、溶解度検定試験および物理的安定性試験の結果を記載するものである。

組み換えヒト−メチオニル−Ｇ−ＣＳＦ（ｒｈｕ−ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ）蛋白質およびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ａ）類似体（後述する材料および方法に記載の通り調製）を２〜３ｍｇ／ｍＬの濃度で２０ｍＭ ＮａＨＰＯ_４、ｐＨ７．０中、３〜７倍モル過剰量の固体無水コハク酸（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、好ましくは５倍モル過剰量と反応させ、反応混合物を４℃で２〜１６時間攪拌した。次ぎに固体ヒドロキシルアミン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を反応混合物に添加し、その間ｐＨを６．５より高値に維持した。ヒドロキシルアミンが完全に溶解した後、５ＮのＮａＯＨを用いてｐＨを８．５まで上昇させ、反応混合物をさらに１〜２時間４℃で攪拌した（収率が僅かに低下するがヒドロキシルアミン工程は省略してもよい）。最後に、反応混合物を２０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ７．２に対して透析する。

モノスクシニル化ｒｈｕ−ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（および類似体）を２０ｍＭトリス、ｐＨ７．２中、０〜０．５ＭのＮａＣｌの勾配溶離によるＨｉｇｈ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｑカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ， Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ， ＮＪ）を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより単離する。生成物は５％ポリアクリルアミド、ｐＨ３〜７のゲル（Ｎｏｖｅｘ，Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いた等電点電気泳動（ＩＥＦ）ＰＡＧＥにより観察される−０．７ｐＩ単位の等電点シフトにより溶出液中に確認される。モノスクシニル化ｒｈｕ−ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ（および類似体）の最終回収率は典型的には４５〜４７％である。

非修飾のＧ−ＣＳＦおよびスクシニル化ｒｈｕ−ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦの試料を、Ｇ−ＣＳＦ依存性ネズミ造血前駆細胞の増殖を放射標識チミジン取りこみおよびＧ−ＣＳＦ濃度の関数として測定するインビトロの生物検定において試験した。生物活性の完全な維持が観察される（図１３および１５参照）。

スクシニル化イソフォームの溶解度を非修飾のｒｈｕ−ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦおよびｒｈｕ−ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ類似体と比較した。Ｇ−ＣＳＦ試料をＰＢＳ中に透析し、次にＣｅｎｔｒｉＰｒｅｐ濃縮器、１０ｋＤａ分子量カットオフ（Ａｍｉｃｏｎ）で、沈殿が観察されるようになるまで濃縮した。試料を遠心分離して清澄化し、上澄みのコンジュゲート蛋白質濃度を測定した。次に試料を２２時間３７℃に維持し、一定時間間隔で遠心分離し、上澄みのコンジュゲート蛋白質濃度を反復測定した。即ち、ＰＢＳ中の蛋白質の溶解度は遠心分離後の上澄み中で観察される室温における定常状態の蛋白質の濃度として定義される（表７参照）。

非修飾およびスクシニル化されたＧ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ａ）の物理的安定性は、試料をＰＢＳ中５〜６ｍｇ／ｍＬに濃縮し、試料を４℃および３７℃に維持することにより、比較検討した。溶液中に残存している蛋白質の量は、試料を遠心分離した後に濃度を分光光度計で測定することにより求めた。スクシニル化−Ｇ−ＣＳＦの物理的安定性（４℃および３７℃）は非修飾のＧ−ＣＳＦと比較して実質的に改善されている（図１４参照）。

（材料および方法）
１．組み換えヒトメチオニル−レプチン蛋白質の調製
本発明の組み換えヒトメチオニル−レプチン（ｒｈｕ−ｍｅｔ−ｌｅｐｔｉｎ）は前記参照組込文献であるＰＣＴ公開ＷＯ９６／０５３０９号の１５１〜１５９ページの記載に従って調製してよい。本製造実施例のためには、（１５８ページのアミノ酸配列と比較して）アルギニンの変わりに３５位にリジンを、そして、イソロイシンの代わりに７４位にイソロイシンを有するｒｈｕ−ｍｅｔ−ｌｅｐｔｉｎを使用した。その他の組み換えヒトレプチン蛋白質は組み換えＤＮＡ法を用いて蛋白質発現の分野で一般的に知られている方法に従って調製してよい。

２．組み換えヒトメチオニル−Ｇ−ＣＳＦ蛋白質およびＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ａ）類似体の調製
本発明の組み換えヒトメチオニル−レプチン（ｒｈｕ−ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ）は前記参照組込文献であるＰＣＴ公開ＷＯ９４／１７１８５号の記載に従って調製してよい。本実施例のためには、システインの代わりに３５位にアラニンを有するｒｈｕ−ｍｅｔ−Ｇ−ＣＳＦ類似体であるＧ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ａ）もまた使用した。その他の組み換えヒトＧ−ＣＳＦ蛋白質は組み換えＤＮＡ法を用いて蛋白質発現の分野で一般的に知られている方法に従って調製してよい。

本発明は特定の好ましい実施態様に関して記載したが、当業者は変形や変更を容易に想到できると考えられる。従って、請求する本発明の範囲内に含まれるこのような同等の変形は全て、添付した請求項に包含されるものとする。

図１はスクシニル化レプチンの陰イオン交換クロマトグラフィー分離のクロマトグラムである。２８０ｎｍにおける吸光度をｍＬ単位の溶出量に対してプロットしてある。モノスクシニル化レプチンのピークは（＊）の印を付してある。 図２は非修飾レプチン（第２列）、スクシニル化レプチン（第３列）、ＤＴＰＡ修飾レプチン二量体（第４列）およびＥＤＴＡ^２修飾レプチン二量体（第５列）を示すｐＨ３〜７のＩＥＦ−ＰＡＧＥゲルである。第１列および第６列は等電点マーカーである。 図３はＤＴＰＡ交差結合レプチンの単量体および二量体のサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー分離のクロマトグラムである。２８０ｎｍにおける吸光度をｍＬ単位の溶出量に対してプロットしてある。モノ置換ＤＴＰＡ−レプチンの二量体型は（＊）の印を付してある。 図４は非修飾レプチン（第２列）、スクシニル化レプチン（第３列）、ＤＴＰＡ修飾レプチン二量体（第４列）およびＥＤＴＡ^２修飾レプチン二量体（第５列）を示す４〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。第１列および第６列は分子量マーカーである。 図５はＥＤＴＡ^２交差結合レプチンの単量体および二量体のサイズエクスクルージョンクロマトグラフィー分離のクロマトグラムである。２８０ｎｍにおける吸光度をｍＬ単位の溶出量に対してプロットしてある。モノ置換ＥＤＴＡ^２−レプチンの二量体型は（＊）の印を付してある。 図６は無水コハク酸によるＮ−末端ペプチド（Ｍ１−Ｋ６）の化学修飾により起こる保持時間のシフトを示すＬｙｓ−Ｃ消化物の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。 図７はＤＴＰＡによるＮ−末端ペプチド（Ｍ１−Ｋ６）の化学修飾により起こる保持時間のシフトを示すＬｙｓ−Ｃ消化物の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。 図８はＥＤＴＡ^２によるＮ−末端ペプチド（Ｍ１−Ｋ６）の化学修飾により起こる保持時間のシフトを示すＬｙｓ−Ｃ消化物の逆相ＨＰＬＣクロマトグラムである。 図９は非修飾の天然レプチンおよびモノスクシニル化レプチンのＦａｒ−ＵＶＣＤスペクトルを示す。両試料とも周囲温度においてリン酸緩衝食塩水中０．２５ｍｇ／ｍｌで測定した。 図１０は固定化ヒトレプチン受容体由来の放射標識ヒトレプチンの置換による、非修飾レプチン、スクシニル化レプチン、ＤＴＰＡ修飾レプチン二量体またはＥＤＴＡ^２―レプチン二量体のインビトロ受容体結合を示すグラフである。リガンドの濃度（ｎｇ／ｍＬ）は％リガンド結合に対してプロットしてある。 図１１は非修飾レプチン、スクシニル化レプチン、ＤＴＰＡ−レプチン二量体またはＤＴＰＡ−レプチン単量体の何れかで治療されているマウスにおける体重減少を示すグラフである。マウスにはＰＢＳ中２ｍｇ／ｍＬの濃度で１０ｍｇ／ｋｇを毎日投与した。時間（日）を％体重減少に対してプロットした。 図１２は２０ｍｇ／ｍＬの非修飾レプチン、２ｍｇ／ｍＬの非修飾レプチン、２０ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ^２−レプチン二量体または２ｍｇ／ｍＬのＥＤＴＡ^２−レプチン二量体の何れかで治療されているマウスにおける体重減少を示すグラフである。マウスにはＰＢＳ中２０ｍｇ／ｍＬの濃度で１００ｍｇ／ｋｇまたは２ｍｇ／ｍＬの濃度で１０ｍｇ／ｋｇを毎日投与した（１００ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｍＬで投与した非修飾のレプチンは、ＰＢＳ中の溶解度が低いため酢酸塩緩衝液中ｐＨ４．０に調製した）。時間（日）を％体重減少に対してプロットした。 図１３は非修飾Ｇ−ＣＳＦおよびスクシニル化Ｇ−ＣＳＦのインビトロの生物活性を示すグラフである。ＣＰＭ−ＢＧＮＤをｌｏｇ（ｎｇ／ウエル）に対してプロットしてある。 図１４は４℃における非修飾Ｇ−ＣＳＦ、４℃におけるスクシニル化Ｇ−ＣＳＦ、３７℃における非修飾Ｇ−ＣＳＦおよび３７℃におけるスクシニル化Ｇ−ＣＳＦの物理的安定性試験の結果を示すグラフである。蛋白質濃度（ｍｇ／ｍＬ）を時間（時間）に対してプロットしてある。 図１５は非修飾Ｇ−ＣＳＦ、非修飾Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ａ）およびスクシニル化Ｇ−ＣＳＦ（Ｃ１７Ａ）のインビトロの生物活性を示すグラフである。ＣＰＭ−ＢＧＮＤをｌｏｇ（ｎｇ／ウエル）に対してプロットしてある。

Claims (6)

1. Ｎ−末端においてのみエチレンジアミン四酢酸二無水物（ＥＤＴＡ^２）により修飾されたエチレンジアミン四酢酸二無水物（ＥＤＴＡ^２）−蛋白質単量体であって、ただし該蛋白質がレプチンである前記単量体を少なくとも９０％含む、該蛋白質単量体の製剤。
2. 各々のＮ−末端においてのみエチレンジアミン四酢酸二無水物（ＥＤＴＡ^２）により修飾されたエチレンジアミン四酢酸二無水物（ＥＤＴＡ^２）−蛋白質二量体であって、ただし該蛋白質がレプチンである前記二量体を少なくとも９０％含む、該蛋白質二量体の製剤。
3. （ａ）０．５〜５倍モル過剰量のＥＤＴＡ^２に蛋白質を反応させ反応混合物を形成する段階；（ｂ）４℃において２〜１６時間前記反応混合物を攪拌する段階；（ｃ）前記反応混合物を濾過する段階；（ｄ）前記反応混合物を濃縮する段階；および（ｅ）前記反応混合物からＥＤＴＡ^２−蛋白質を単離する段階を包含する方法により製造されたＥＤＴＡ^２−蛋白質であって、該ＥＤＴＡ^２−蛋白質がＮ−末端においてのみエチレンジアミン四酢酸二無水物（ＥＤＴＡ^２）により修飾されたレプチンであることを特徴とする、前記ＥＤＴＡ^２−蛋白質。
4. （ａ）０．５〜５倍モル過剰量のＥＤＴＡ^２にレプチンを反応させ反応混合物を形成する段階；（ｂ）４℃において２〜１６時間前記反応混合物を攪拌する段階；（ｃ）前記反応混合物を濾過する段階；（ｄ）前記反応混合物を濃縮する段階；および（ｅ）前記反応混合物からＥＤＴＡ^２−レプチンを単離する段階を包含する、請求項１または２に記載のＥＤＴＡ^２−レプチン製剤を製造する方法。
5. Ｎ−末端においてのみエチレンジアミン四酢酸二無水物（ＥＤＴＡ^２）により修飾されたエチレンジアミン四酢酸二無水物（ＥＤＴＡ^２）−蛋白質単量体であって、ただし該蛋白質がレプチンである前記単量体を含有する医薬組成物。
6. 各々のＮ−末端においてのみエチレンジアミン四酢酸二無水物（ＥＤＴＡ^２）により修飾されたエチレンジアミン四酢酸二無水物（ＥＤＴＡ^２）−蛋白質二量体であって、ただし該蛋白質がレプチンである前記二量体を含有する医薬組成物。

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