JP3920929B2

JP3920929B2 - Clostridium butyricum having effects for preventing and treating liver damage, and liver protectant, food and feed comprising the culture

Info

Publication number: JP3920929B2
Application number: JP53553998A
Authority: JP
Inventors: 信洋田口
Original assignee: Nippoh Chemicals Co Ltd
Current assignee: Nippoh Chemicals Co Ltd
Priority date: 1997-02-14
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 2007-05-30
Anticipated expiration: 2017-02-14
Also published as: KR100464847B1; KR20000070820A; WO1998036050A1

Description

技術分野
本発明は、肝障害に対して予防および治療効果を有するクロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、当該クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）を培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を有効成分とする肝庇護剤、および上記培養液等からなる食品及び飼料に関するものである。詳しくは、本発明は、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害に対して予防および治療効果を有するクロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）、当該クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）を培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を有効成分とする、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害の治療及び予防を目的とした肝庇護剤、および上記培養液等からなる食品及び飼料に関するものである。
背景技術
酪酸菌と呼ばれるクロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）は、腸内細菌の一つであり、他の腸内細菌と同様に体内から糞便中に生きたまま出てくる菌である。また、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum）（以下、同様につき、括弧内を省略する）は、酪酸発酵により糖質から多量の酪酸を生成するために工業的酪酸の製造においても利用された有用な菌であり、その培養液中に抗腐敗菌有効因子を産生することが知られているため、従来、整腸効果を有する生菌剤として腹部症状の改善を目的とした医薬品あるいは飼料成分などにおいて広く利用されている。加えて、近年、このクロストリジウム・ブチリカムのある菌株には抗腫瘍作用があることが見出だされており、抗腫瘍免疫賦活剤としての利用も提唱されている（特開平０６−２９２５９７号）。
一方、肝臓は、腹腔上部右寄りで横隔膜の直下にある暗褐色の臓器であり、消化管に付属する人体中で最大の腺で体重の約1/45の重量を占める。また、肝臓は、脂質等の代謝、解毒、胆汁の排泄、各種栄養素の貯蔵、造血や血液凝固および循環血液量の調節など、多くの機能を有するため、肝臓に障害が起こると上記したような様々な機能が低下し、最悪の場合には生命の維持が困難に陥るほどの重要な臓器である。一般的に指摘される肝障害の原因としては、ウィルスによる感染、毒物または薬剤による中毒、飲酒や飽食、栄養障害及び循環障害からストレスのような比較的身近な原因まで種々のものが挙げられる。上記原因に加えて、近年では、家畜動物の生産性を上げるために使用される抗生物質や補栄養もまた肝障害を惹起する。このような障害を受けた肝臓は、肝腫大、辺縁鈍化、脂肪の沈着（脂肪化）、鬱血及び胆汁鬱滞、さらには肝細胞の風船様変化、肝細胞の破壊や壊死等の症状が観察され、倦怠・疲労感あるいは成長期における発育不良、さらには抵抗力の低下による日和見感染の原因となる上、上記したような症状が進むと、脂肪肝、肝炎そして肝硬変、さらには肝癌などの深刻な肝疾患へと移行し、最終的には死に至る可能性も多々ある。しかしながら、このような重大な障害が生じているにもかかわらず、肝臓は大きな予備力を有しているため、肝臓に多少障害が生じても上記したような症状は表に出にくく、痛みなどの症状が現れる時にはすでに病状がかなり進行していることが多く、早期の発見が見過ごされることも多い。
このような肝障害の治療方法は、肝障害を引き起こした原因によって異なり、例えば、アルコール性肝疾患の場合にはアルコール摂取の中止等原因の解消、過栄養に基づく脂肪肝の場合には脂肪摂取量の低減や肥満の解消、ウィルス性肝炎の場合には抗ウィルス剤の投与などが挙げられるが、最適な治療方法はいまだ確立されておらず、特に、原疾患に対する治療薬の投与による肝障害や進行した肝障害の場合には特に治療を施す必要があるが、公知の肝障害に対する治療薬は、急激な作用が生じたり、大量あるいは長期間投与においては副作用があることという欠点がある。このような安全性上の理由により、公知の治療薬を肝臓の庇護を目的として使用する予防薬や日常的な健康維持のための健康食品として利用することは当然のことながら問題がある。
したがって、上記したような背景を踏まえるに、高い肝障害治療及び予防効果さらには安全性を有する肝庇護剤の開発、さらには、このような肝庇護剤による肝障害の治療や予防方法の開発、さらには肝障害に対する治療及び予防効果を有する物質の食品あるいは飼料への利用が達成されれば、それにより得られる利益は計り知れないものである。
本発明は、上記諸事情を鑑みて成されたものであり、重篤な副作用を生じることなく、肝障害を有効に予防および治療する効果を有する安全性の高い肝庇護剤を得ることを目的とする。
本発明の他の目的は、重篤な副作用を生じることなく、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害を有効に予防および治療する効果を有する安全性の高い肝庇護剤を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、重篤な副作用を生じることなく、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害を有効に予防および治療する方法を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害に対する有効な予防及び治療する効果を有しかつ不快感を伴わずに容易に食せる食品または飼料を提供することにある。
発明の開示
上記諸目的は、クロストリジウム・ブチリカム（Clostridium butyricum；以下、単に「クロストリジウム・ブチリカム」と称する）を培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を有効成分として含むことを特徴とする肝庇護剤により達成される。なお、本明細書において、「肝庇護剤」という表現は、「肝障害に対して予防および／または治療効果を有する製剤」という意味で使用される。
本発明は、該クロストリジウム・ブチリカムが受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５７９４のクロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２０株または受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５７９５のクロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２１株である、前記肝庇護剤である。
本発明はまた、該クロストリジウム・ブチリカムが受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５７９４のクロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２０株である、前記肝庇護剤である。
本発明はさらに、脂肪肝、アルコール性肝疾患または中毒性肝障害を予防および／または治療することを目的として使用される、前記肝庇護剤である。なお、本明細書において、「中毒性肝障害」という表現は、「医薬品、毒物及び化学性物質などによって引き起こされる肝障害」という意味で使用される。
上記諸目的はまた、前記したいずれかの肝庇護剤を肝障害を有する患者に投与することからなる、肝障害の治療または予防方法により達成される。
上記諸目的はさらに、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を１０^-6〜１重量％混入した脂肪肝、アルコール性肝疾患または中毒性肝障害を予防または治療することを目的として使用される食品または飼料により達成される。
本発明のクロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物（以下、単に「クロストリジウム・ブチリカムの培養物」または「培養物」とも称する）は、強力な肝障害改善作用および肝保護作用を有し、かつ哺乳動物に対して高い安全性を有するため、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害を治療および／または予防するのに非常に有用である。
また、本発明の肝庇護剤は、上記クロストリジウム・ブチリカムの培養物を有効成分として含んでいるため、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害に対して強力な治療及び予防作用を有し、かつ哺乳動物に対して高い安全性を有する製剤である。
さらに、本発明の食品および飼料は、上記クロストリジウム・ブチリカムの培養物からなり、高い安全性が確保されており、さらに食品または飼料中に混入されているため、安全でかつ有効な肝障害改善作用および肝保護作用を有しかつ容易に食することが可能な食品および飼料である。
発明を実施するための最良の形態
本発明者らは、上記諸問題を解決するために、広く微生物の性質及び生産を鋭意検討した結果、肝疾患に見られる肝腫大、脂肪の沈着、炎症あるいは胆汁鬱滞などの肝障害を動物で引き起こす条件を見いだし、さらに、それらの動物モデルにクロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を摂取せしめることにより肝障害が予防ならびに治療できることを見いだし、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明の肝庇護剤は、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を有効成分として含むことを特徴とするものである。
本発明において使用されるクロストリジウム・ブチリカムとしては、クロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０１９株、ＮＩＰ１０２０株、ＮＩＰ１０２２、およびクロストリジウム・ブチリカムＡＴＣＣ８６０株など、すべてのクロストリジウム・ブチリカムが使用できるが、これらのうち、好ましくは、クロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２０株（以下、単に「ＮＩＰ１０２０株」と称することもある）、クロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２１株（以下、単に「ＮＩＰ１０２１株」と称することもある）及びクロストリジウム・ブチリカムＡＴＣＣ１９３９８株（以下、単に「ＡＴＣＣ株」と称することもある）が使用される。なお、上記クロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２１株は、特公昭３７−８３００号に記載されたクロストリジウム・ブチリカムミヤイリ株と同等であり、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−５７９５号で、平成９年１月２３日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている菌株である。
また、本発明において好ましく使用されるクロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２０株の菌学的性質を示す。
（ａ）形態
１）細胞の形および大きさ：直線状または曲線状で両端が鈍円の桿菌である。大きさは、０．６〜１．２μｍ×５〜１０μｍである。芽胞は、末端が丸い卵円形の亜端在性(subterminal)である。
２）運動性の有無：有り
３）胞子の有無：有り
（ｂ）培養的性質
１）１％スターチ添加肉汁寒天平板培養：コロニーは円形から不規則形で白っぽいクリーム色でかつ凸状に隆起している。コロニーの大きさは、３７℃で２日間培養した際、直径約２〜４ｍｍである。
２）１％スターチ添加肉汁液体培養：酸及びガスを酸性
３）１％スターチ添加肉汁ゼラチン寒天平板培養：ゼラチンの液化なし
４）リトマス・ミルク：酸性、ガス、凝固
（ｃ）生理学的性質
１）グラム染色性：＋
２）硝酸塩の還元： −
３）インドールの生成： −
４）デンプンの加水分解：＋
５）カタラーゼ： −
６）酸素に対する態度：嫌気性
７）生育の範囲：ｐＨ；５．０〜８．０
温度；２０〜４２℃
８）下記糖類からの酸の生成の有無
セロビオース；＋
Ｄ−フラクトース；＋
Ｄ−ガラクトース；＋
ラクトース；＋
マルトース；＋
Ｄ−マンノース；＋
メリビオース；＋
ラフィノース；＋
ラムノース； −
サリシン；＋
Ｄ−ソルビトール； −
シュークロース；＋
トレハロース；＋
Ｄ−キシロース；＋
（ｄ）その他の生理学的性質
１）溶血性： −
２）レシチナーゼ： −
３）発酵産物：酪酸、酢酸
本菌を、バージーズマニュアルオブシステマティックバクテリオロジー第９版(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 9th)を参考に分類したところ、クロストリジウム・ブチリカムに帰属することが分かった。このクロストリジウム・ブチリカムについて、下記実施例において記載されるように、肝障害の予防及び治療効果を調べたところ、公知の菌株（クロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２１株及びクロストリジウム・ブチリカムＡＴＣＣ１９３９８株）に比べて有意に高い肝障害の予防効果を有することが分かった。これにより、上記菌株を新規な微生物であると考え、クロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２０株と命名し、平成９年１月２３日付で日本国茨城県つくば市東１丁目１番３号所在の通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託し、その受託番号はＦＥＲＭＢＰ−５７９４号である。
なお、クロストリジウム・ブチリカムは、生菌剤、飼料添加物、さらには、食品として広く市販されており、人や家畜などの哺乳動物に長期間にわたって投与しても全く副作用を認めず、高い安全性が保証されている。
本発明において、クロストリジウム・ブチリカムの培養物、即ち、「クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液、該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣及び該残渣の乾燥物」は、既知の微生物の培養方法、例えば、特願平０８−２５２０８８号に開示された方法により得られる。その一実施態様を下記に示す：クロストリジウム・ブチリカムを１．０（ｗ／ｖ）％ペプトン、１．０（ｗ／ｖ）％酵母エキス、１．０（ｗ／ｖ）％コーンスターチ及び０．２（ｗ／ｖ）％沈降炭酸カルシウムからなる培地に１０⁵〜１０⁶個／ｍｌになるように接種し、３７℃にて４８時間静置培養することにより、「クロストリジウム・ブチリカムの培養液」を得る。次に、得られた培養液を遠心分離（２，０００〜６，０００ｇ×１０〜３０分）して、「培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣」を分離し、この残渣を、０〜８０℃、好ましくは１０〜２０℃で、１〜２４時間、好ましくは５〜１８時間風乾等による乾燥処理または０〜８０℃、好ましくは１０〜２０℃、０．０５〜５００Ｔｏｒｒ、好ましくは１〜１００Ｔｏｒｒで、１〜２４時間、好ましくは２〜１５時間減圧乾燥処理することなどにより「残渣の乾燥物」を得る。
本発明のクロストリジウム・ブチリカムの培養に使用する培地は、使用する菌株の種類等によっても異なるが、使用するクロストリジウム・ブチリカムが資化しうる炭素源、適量の窒素源、無機塩及びビタミン類などのその他の栄養素を含有する培地であれば、合成培地または天然培地のいずれでもよい。
例えば、本発明による培地中で使用される炭素源の例として、使用する菌株が資化できる炭素源であれば特に制限されない。炭素源としては、必ずしも糖に制限されないが、菌体の増殖を考慮すると、使用する細菌が利用可能な糖または糖を含むものが好ましく使用される。使用できる炭素源の具体例としては、資化性を考慮して、セロビオース、グルコース、フルクトース、ガラクトース、ラクトース、マルトース、マンノース、メリビオース、ラフィノース、サリシン、スターチ、シュクロース、トレハロース、キシロース、デキストリン、および糖蜜等が挙げられる。これらの炭素源のうち、スターチ、グルコース、フルクトース、シュクロース及び糖蜜が好ましく使用される。上記した炭素源を、使用するクロストリジウム・ブチリカムを考慮して、１種または２種以上選択して使用してもよい。この際、炭素源の添加濃度は、使用するクロストリジウム・ブチリカムや炭素源の種類および使用する培地の炭素源以外の培地組成等によっても異なるが、通常、０．５〜５（ｗ／ｖ）％、好ましくは、２〜４（ｗ／ｖ）％である。
また、窒素源およびビタミン類としては、例えば、肉エキス、ペプトン、酵母エキス、味液等の大豆及び小麦の加水分解物、大豆粉末、ミルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンスティープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解物等の有機窒素化合物および硫酸アンモニウムなどのアンモニウム塩が挙げられる。これらの窒素源のうち、ペプトン、酵母エキス、肉エキス、コーンスティープリカー及び味液が好ましく使用される。上記した窒素源及びビタミン類を、使用するクロストリジウム・ブチリカムの生育を向上させるために、１種または２種以上選択して使用してもよい。この際、上記窒素源の添加濃度は、使用する菌株や窒素源の種類および使用する培地の窒素源以外の培地組成等によっても異なるが、窒素源を多く含むペプトンを使用する際には、通常、０．５〜４（ｗ／ｖ）％、好ましくは、１〜３（ｗ／ｖ）％であり、窒素源及びビタミン類を多く含む味液やコーンスティープリカーを使用する際には、通常、０．５〜５（ｗ／ｖ）％、好ましくは、１〜４（ｗ／ｖ）％であり、さらに、ビタミン類を多く含む酵母エキスあるいは肉エキスを使用する際には、通常、０．５〜４（ｗ／ｖ）％、好ましくは、１〜３（ｗ／ｖ）％である。
さらに、無機塩としては、マグネシウム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、モリブデン、ストロンチウム、ホウ素、銅、鉄、スズ及び亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、酪酸塩、プロピオン酸塩及び酢酸塩等から選ばれた１種または２種以上を使用することができる。また、培地中に、必要に応じて、消泡剤、植物油、界面活性剤、血液及び血液成分、ビタミン類、抗生物質などの薬剤、植物または動物ホルモンなどの生理活性物質等を適宜添加してもよい。
本発明において行われる培養の条件は、本発明に使用するクロストリジウム・ブチリカムの生育の範囲（ｐＨや温度等）等の生理学的性質によって異なるが、クロストリジウム・ブチリカムは偏性嫌気性であるため、通気しない、または窒素若しくは炭酸ガスを通気しながら、または培地中に還元剤を加えることにより酸化還元電位を下げるなどによって嫌気的条件下培養されることが必要である。その際の培養条件は、使用される菌株の生育の範囲、培地の組成や培養法によって適宜選択され、本菌株が増殖できる条件であれば特に制限されない。具体的には、培養温度は、２０〜４２℃、好ましくは３５〜４０℃である。
また、本発明において、クロストリジウム・ブチリカムの培養は、培養中に産生される酸をアルカリで中和することにより増殖が促進されるため、予め培地に炭酸カルシウムを添加することが好ましい。この際、炭酸カルシウムの添加量は、０．１〜４（ｗ／ｖ）％、好ましくは０．２〜２．５（ｗ／ｖ）％である。または、上記中和工程を、水酸化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム及び炭酸カリウム等のアルカリ水溶液によって培地のｐＨを設定ｐＨの範囲内に抑えながら行うことも好ましい。なお、アルカリ水溶液を使用する場合には、「設定ｐＨ」とは、培養期間中に予め設定されている培地のｐＨを意味し、「設定ｐＨの範囲」とは、培養期間中に許容されるｐＨの範囲であり、一般的には、設定ｐＨ±許容差で表わす。本発明によると、設定ｐＨは、通常、５．０〜７．５、好ましくは５．５〜６．５の範囲内で設定され、設定ｐＨの範囲は、設定ｐＨ±０．５、望ましくは設定ｐＨ±０．２である。
なお、本発明において、培養を行う間の培地のｐＨは、菌の接種時では中性付近、より好ましくは６．５〜７．５とする。なお、アルカリ水溶液を使用する場合には、酸素が混入しないように緩やかに攪拌しながら設定ｐＨの範囲内に入るよう維持することが好ましい。このように菌の接種時および菌の増殖時のｐＨを制御することによって、菌密度を飛躍的に増大させることができる。
本発明による培養において、クロストリジウム・ブチリカムの初期培養濃度は、クロストリジウム・ブチリカムが生育できる範囲であれば特に制限されず、通常、クロストリジウム・ブチリカムの培養で行われるものと同様である。具体的には、通常、１０⁴〜１０⁷個／ｍｌ、好ましくは１０⁵〜１０⁶個／ｍｌである。
このようにして得られたクロストリジウム・ブチリカムの培養物、特にクロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２０株の培養物は、アルコール摂取、有機溶剤、薬剤、ウィルス、ストレス、栄養不足または栄養過多などのによる肝腫大、辺縁鈍化、脂肪の沈着（脂肪化）、鬱血及び胆汁鬱滞、さらには肝細胞の風船様変化、肝細胞の破壊や壊死等の肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害に対して優れた予防及び治療効果を有する。
本発明の肝庇護剤は、前記クロストリジウム・ブチリカムの培養物そのままの形態でまたは前記クロストリジウム・ブチリカムの培養物に製薬上許容される担体を配合して経口投与用または非経口投与用組成物として患者（家畜、家禽やヒト等の哺乳動物、および魚を含む）に投与できる。本剤を経口投与用とする場合には、上記クロストリジウム・ブチリカムの培養物を適当な添加剤、例えば、乳糖、ショ糖、マンニット、トウモロコシデンプン、合成若しくは天然ガム、及び結晶セルロース等の賦形剤、デンプン、カルボシキメチルセルーロースやメチルセルーロース等のセルロース誘導体、アラビアゴム、ゼラチン、及びポリビニルピロリドン等の結合剤、カルボシキメチルセルーロースカルシウム、カルボシキメチルセルーロースナトリウム、デンプン、コーンスターチ、炭酸水素ナトリウム及びアルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及びステアリン酸ナトリウム等の滑沢剤、および炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、及びリン酸ナトリウム等の充填剤または希釈剤などと適宜混合して、錠剤、散剤（粉末）、丸剤、および顆粒剤などの固型形態にすることができる。または、経口投与用の肝庇護剤は、カプセル剤の形態を有していてもよく、この際、カプセルとしては、硬質あるいは軟質のゼラチンカプセルが用いられる。これらの固型製剤には、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート、セルロースアセテートフタレート、及びメタアクリレートコポリマー等の被覆用基剤を用いて腸溶性被覆を施してもよい。さらに、本発明のクロストリジウム・ブチリカムの培養物を、精製水等の一般的に用いられる不活性希釈剤またはトリカプリン、トリアセチン等のグリセリンエステル類またはエタノール等のアルコール類に懸濁して、必要に応じて、この溶液に浸潤剤、乳化剤、分散助剤若しくは界面活性剤、甘味料、フレーバー若しくは芳香物質などを適宜添加することにより、シロップ剤やエリキシル剤等の液状製剤とすることもできる。
また、本発明の肝庇護剤を非経口投与用とする場合には、上記クロストリジウム・ブチリカムの培養物を精製水、リン酸緩衝液等の適当な緩衝液、生理的食塩水、リンガー溶液やロック溶液等の生理的塩類溶液、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよび慣用される防腐剤、安定剤及び界面活性剤等と適当に組み合わせた滅菌された水溶液若しくは非水溶液、懸濁液、リポソーム、またはエマルジョンとして、液状製剤化できる。この際、液状製剤は、生理学的なｐＨ、好ましくは６〜８の範囲内のｐＨを有することが好ましい。また、本発明の肝庇護剤を、公知の方法を用いて、軟膏、ローションまたはクリーム等の経皮用製剤として形成してもよい。
また、本発明の肝庇護剤は、例えば、炭酸水素ナトリウム、ホウ酸等からなる中性付近、あるいはｐＨ３〜７の緩衝液を用い、必要に応じて防腐剤、安定剤、浸透圧調節剤等を加えて点眼剤の形態にしてもよい。
さらに、本発明の肝庇護剤は、ペレットによる埋め込み、またはゼラチンソフトカプセル等の坐薬用基剤を用いた坐薬として投与されることも可能である。
上述したうち、好ましい投与形態や投与経路などは、担当の医師によって選択される。
本発明の肝庇護剤中に含まれるクロストリジウム・ブチリカムの培養物の濃度は、投与時の形態、病気の種類や重篤度や目的とする投与量などによって様々であるが、一般的には、原料の全重量に対して、菌体の重量が０．１〜５０重量％、好ましくは１〜１０重量％となる範囲である。特に、本発明の製剤が経口投与される場合には、原料の全重量に対して、菌体の重量が０．１〜５０重量％、より好ましくは１〜１０重量％となる範囲であり、非経口投与される場合には、原料の全容量に対して、菌体の重量が０．１〜５０重量％、より好ましくは１〜１０重量％となる範囲であることが好ましい。この際、クロストリジウム・ブチリカムの培養物の濃度が前記上限値を超えると、均質な投与量が得られず好ましくない。これに対して、クロストリジウム・ブチリカムの培養物の濃度が前記下限値未満であると、本発明によって得られるべき病態改善効果が十分に期待できずやはり好ましくない。
本発明の肝庇護剤の投与量は、患者の年齢、体重及び症状、目的とする投与形態や方法、治療効果、および処置期間等によって異なり、正確な量は医師が決定するものである。具体的には、本発明の肝庇護剤を経口投与する場合には、クロストリジウム・ブチリカムの培養液を培養物として使用する際には、通常、０．０１〜１０ｍｌ／ｋｇ体重／回、より好ましくは０．１〜２ｍｌ／ｋｇ体重／回の投与量の範囲で、また、この培養液を遠心分離して得た菌体、抽出物、精製物質またはその乾燥物を培養物として使用する際には、通常、０．０１ｍｇ〜１ｇ／ｋｇ体重／回、より好ましくは１ｍｇ〜０．１ｇ／ｋｇ体重／回の投与量の範囲で、それぞれ、１日に１〜６回、より好ましくは１〜３回に分けて投与されるのが望ましい。この際、１日当たりの投与量が多い場合には、１回に複数個の錠剤等の製剤に分けて投与してもよい。また、本発明の肝庇護剤を非経口投与する場合には、菌体重量の換算して、通常、０．０１ｍｇ〜１ｇ／ｋｇ体重／回、より好ましくは１ｍｇ〜０．１ｇ／ｋｇ体重／回の投与量の範囲で、１日に１〜６回、好ましくは１〜３回に分けて投与されるのが望ましい。
本発明の他の特徴の一つは、クロストリジウム・ブチリカムを培養した培養液または該培養液を遠心分離して得られる菌を含む残渣または該残渣の乾燥物を１０^-6〜１重量％、好ましくは１０^-6〜０．１重量％混入した食品または飼料である。本発明では、上記混入は、予め所定量の培養物を混入した食品、飲水若しくは飼料の形態であっても、または摂取時に所定量の培養物を混入した食品、飲水若しくは飼料の形態であってもよい。
本発明において、培養物の混入量を１０^-6〜１重量％としたのは、１０^-6重量％未満では培養物による十分な肝障害改善または保護作用が期待できず、また、１重量％を超えると食品等としての味覚、風合い及び食感が損なわれる可能性が高いため、好ましくない。
本発明に係る食品としては、ヨーグルト、チーズ等のの乳製品、かまぼこ、ちくわ、はんぺん、さつま揚げ、なると、つみれ等の水産練り製品、でんぶ等の魚介類加工品、ソーセージ、フランクフルト、レバーペースト等の食肉加工品、豆腐、焼き豆腐、生揚げ、油揚げ、がんもどき、おから、凍り豆腐、湯葉等の豆製品、ピューレ等の野菜加工品、マッシュポテト、くず、はるさめ、こんにゃく、しらたき等の芋加工品、もち、白玉、白飯、麩、ビーフン、マカロニ、スパゲッティ、そうめん、そば、うどん、中華めん、食パン、乾パン、アンパン等の穀物の加工品、ジャム等の甘味類、バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング等の油脂類、あめ、らくがん、せんべい、あられ、カステラ、ようかん、もなか、まんじゅう、大福もち、だんご、ういろう、チョコレート、ビスケット、クッキー、ドーナツ、ケーキ、パイ、アイスクリーム、プリン、ババロア、ガム等の菓子類、豆腐、ゼリー、コンニャク、寒天またはトコロテン等のゲル状食品、コンブ、ワカメ、ノリ、テングサ等の海草類など、通常食することのできるすべての食品が挙げられる。
また、本発明に係る飼料としては、ブタ、ウシ、ヒツジやヤギ等の家畜、イヌ、ネコ、ウサギやハムスター等のペット、家禽及び魚など、通常、飼育される動物用のエサはすべて含まれる。
以下に、本発明のクロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２０株、クロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２１株及びクロストリジウム・ブチリカムＡＴＣＣ１９３９８株に関する毒性試験を行い、その安全性を確認した：クロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２０株、クロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２１株及びクロストリジウム・ブチリカムＡＴＣＣ１９３９８株を、１．０（ｗ／ｖ）％ペプトン、１．０（ｗ／ｖ）％酵母エキス、１．０（ｗ／ｖ）％コーンスターチ及び０．２（ｗ／ｖ）％沈降炭酸カルシウムからなる培地に約１０⁶個／ｍｌになるように接種し、３７℃にて４８時間静置培養し、得られた培養液を遠心分離（４，０００ｇ×２０分）して菌体を分離した後、菌体を乾燥処理（１５℃、２０Ｔｏｒｒで１２時間減圧処理）することにより菌体乾燥末を得る。この菌体乾燥末をマウス用エサ（オリエンタル酵母工業株式会社製、製品名：ＭＦ）（以下、単に「マウス用エサ」と称する）に重量比で１：１０⁵で混合して、調製飼料を調製した。４週令のｄｄｙ系マウス（オス、１７〜２０ｇ）５匹を１群として予め同一ケージ内で上記マウス用エサを３日間与えて飼育した後、上記で調製した調製飼料をさらに６カ月間与えて飼育した。この際、調製飼料の代わりにマウス用エサ単独を使用する以外は同様にして飼育した「無投与群」を比較対照とした。なお、すべての試験群において、マウスの餌摂取量は３〜８ｇ／日／匹であった。結果を下記表１に示す。

表１に示されるように、本発明において好ましく使用される３菌株はすべて、マウスの体重及び状態において無投与群と差異は認められず、これより、上記３菌株の安全性が確認された。
次に、本発明を下記実施例をもってさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
クロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２０株、クロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２１株及びクロストリジウム・ブチリカムＡＴＣＣ１９３９８株を、１．０（ｗ／ｖ）％ペプトン、１．０（ｗ／ｖ）％酵母エキス、１．０（ｗ／ｖ）％コーンスターチ及び０．２（ｗ／ｖ）％沈降炭酸カルシウムからなる培地に約１０⁶個／ｍｌになるように接種し、３７℃にて４８時間（静置または振盪）培養した。得られた培養液を遠心分離（４，０００ｇ×２０分）して菌体を分離した後、菌体を乾燥処理（１５℃、２０Ｔｏｒｒで１２時間減圧処理）することにより、それぞれの菌体の乾燥末を調製した。
実施例２
下記実験を行い、本発明の菌株（ＮＩＰ１０２０株、ＮＩＰ１０２１株及びＡＴＣＣ株）のエタノールによる肝障害予防効果を調べた。
水０．６ｍｌをゾンデを用いて日に２回強制的に経口投与すると同時に水を自由摂取させた無処理群（Ｂ群）以外は、すべての群（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ群）に関して、シリアンハムスター（１００〜１６０ｇ：３匹／群）に、下記処理を３カ月間施して、エタノールによる肝障害動物モデルを作製した：２５（ｗ／ｖ）％エタノール水溶液０．６ｍｌを２０ゾンデを用いて日に２回強制的に経口投与すると同時に、５（ｗ／ｖ）％エタノール水溶液を飲水として自由摂取させた。また、本実験期間中、各ハムスター群に、以下に示されるエサをそれぞれ与えて飼育した。
Ａ群：オリエンタル酵母工業株式会社製、製品名：ＭＦのハムスター用エサ（以下、単に「ハムスター用エサ」と称する）（ネガティブコントロール）；
Ｂ群：ハムスター用エサ（無処理群）；
Ｃ群：ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２０株乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料（ＮＩＰ１０２０株投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
Ｄ群：ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２１株乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料（ＮＩＰ１０２１株投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
Ｅ群：ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＡＴＣＣ株乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料（ＡＴＣＣ株投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
Ｆ群：肝機能の改善剤としての既知のウルソデスオキシコール酸のエタノール溶液（０．１ｍｇ／ｃｃ９９．５％エタノール）をハムスター用エサに１ｋｇ当たり１０ｍｇのウルソデスオキシコール酸が含まれるように吸収させた後風乾させた調製飼料（ウルソデスオキシコール酸投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
３カ月間の処理終了後、各々処理されたマウス群に関して、触診による上腹部の腫れを調べたところ、Ａ群では腫れを確認し、Ｂ群及びＣ群では上腹部の腫れは認められなかったが、Ｄ群、Ｅ群及びＦ群において上腹部にやや腫れを認めた。また、それぞれのマウス群について、肝所見として体重１００ｇ当たりの肝臓の容積（ｍｌ／１００ｇ体重）、辺縁鈍化及び脂肪の沈着を調べた。結果を下記表２に示す。

表２から明らかなように、本発明のＮＩＰ１０２０株投与群（Ｃ群）、ＮＩＰ１０２１株投与群（Ｄ群）及びＡＴＣＣ株投与群（Ｅ群）はすべてネガティブコントロールであるＡ群に比べて有意に肝腫大及び脂肪の沈着を抑制し、この抑制効果は肝機能の改善剤としての既知のウルソデスオキシコール酸と同等またはそれ以上であることから、本発明のＮＩＰ１０２０株、ＮＩＰ１０２１株及びＡＴＣＣ株の培養物は、エタノールによる肝障害（アルコール性肝疾患）を有効に予防することが示された。また、本実施例において使用された菌株のうち、特にＮＩＰ１０２０株投与群（Ｃ群）は無処理群（Ｂ群）とほぼ同等の結果にまで肝腫大、辺縁鈍化及び脂肪の沈着を抑制したことから、本発明のＮＩＰ１０２０株の培養物を有効成分として含む配合物はアルコール性肝疾患に有効な予防薬としての可能性を有することが示唆される。
実施例３
下記実験を行い、本発明の菌株（ＮＩＰ１０２０株、ＮＩＰ１０２１株及びＡＴＣＣ株）の四塩化炭素による肝障害予防効果を調べた。
シリアンハムスター（１００〜１６０ｇ：４匹／群）にパラフィン油０．２ｍｌ単独を毎週２回の割合で計６カ月間にわたって皮下注射した比較群（Ｈ群）以外は、すべての群（Ｇ、Ｉ、Ｊ、Ｋ及びＬ群）に関して、シリアンハムスター（１００〜１６０ｇ：４匹／群）に、下記処理を計６カ月間施して、四塩化炭素による肝障害動物モデルを作製した：最初の４カ月間は２．５ｍｇ／０．２ｍｌ、次の１カ月間は３．２ｍｇ／０．２ｍｌ、及び最後の１カ月間は４．０ｍｇ／０．２ｍｌの濃度の四塩化炭素のパラフィン油混合液０．２ｍｌを、毎週２回の割合で計６カ月間にわたって皮下注射した。また、本実験期間中、各ハムスター群に、以下に示されるエサをそれぞれ与えて飼育した。
Ｇ群：ハムスター用エサ（ネガティブコントロール）；
Ｈ群：ハムスター用エサ（比較群）；
Ｉ群：ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２０株乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料（ＮＩＰ１０２０株投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
Ｊ群：ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２１株乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料（ＮＩＰ１０２１株投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
Ｋ群：ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＡＴＣＣ株乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料（ＡＴＣＣ株投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
Ｌ群：肝機能の改善剤としての既知のウルソデスオキシコール酸のエタノール溶液（０．１ｍｇ／ｃｃ９９．５％エタノール）をハムスター用エサに１ｋｇ当たり１０ｍｇのウルソデスオキシコール酸が含まれるように吸収させた後風乾させた調製飼料（ウルソデスオキシコール酸投与群）。なお、試験期間中は、ハムスターの餌摂取量は、１日当たり、５〜３０ｇ程度であった。
６カ月間の処理終了後、各々処理されたマウス群に関して肝所見（上腹部に腫れ、辺縁鈍化、肝臓の白色化、脂肪の沈着、胆汁鬱滞及び炎症）を調べたところ、Ｇ群では６カ月後には触診において上腹部に腫れを確認し、さらに、辺縁鈍化、肝臓の白色化、脂肪の沈着、胆汁鬱滞および炎症を認め、明らかに四塩化炭素による肝障害が起きていることを確認した。また、Ｉ群及びＬ群では、上腹部の腫れ、辺縁鈍化、肝臓の白色化、脂肪の沈着、胆汁鬱滞および炎症はほとんど認められなかったが、Ｊ群及びＫ群では、上腹部にやや腫れを認め、辺縁鈍化がやや多く認められた。詳細な結果を下記表３に示す。

表３から明らかなように、本発明のＮＩＰ１０２０株投与群（Ｉ群）、ＮＩＰ１０２１株投与群（Ｊ群）及びＡＴＣＣ株投与群（Ｋ群）はすべてネガティブコントロールであるＧ群に比べて有意に肝腫大、辺縁鈍化、脂肪の沈着、胆汁鬱滞及び炎症を抑制し、この抑制効果は、肝腫大がＮＩＰ１０２１株（Ｊ群）及びＡＴＣＣ株（Ｋ群）でやや劣るものの、全般的には、肝機能の改善剤としての既知のウルソデスオキシコール酸と同等またはそれ以上であることから、本発明のＮＩＰ１０２０株、ＮＩＰ１０２１株及びＡＴＣＣ株の培養物は、四塩化炭素による肝障害（脂肪肝や中毒性肝障害）を有効に予防することが示された。また、本実施例において使用された菌株のうち、特にＮＩＰ１０２０株投与群（Ｉ群）は、比較群（Ｈ群）やウルソデスオキシコール酸投与群（Ｌ群）とほぼ同等の結果にまで肝腫大、辺縁鈍化、脂肪の沈着、胆汁鬱滞及び炎症を抑制したことから、本発明のＮＩＰ１０２０株の培養物を有効成分として含む配合物は脂肪肝や中毒性肝障害に有効な予防薬としての可能性を有することが示唆される。
実施例４
実施例２及び３において特に優れた予防効果が認められたＮＩＰ１０２０株について下記実験を行い、四塩化炭素による肝障害治療効果を調べた。
シリアンハムスター（１００〜１６０ｇ）に、実施例２と同様の処理を施して、四塩化炭素による肝障害動物モデルを作製した。６カ月間四塩化炭素投与後、腹部に腫れを認めたハムスターを２群（４匹／群）に分け、一方の群はハムスター用エサ単独で１カ月間飼育し（Ｍ群：四塩化炭素投与後の通常飼育群）、他方の群はハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２０株の乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料で１カ月間飼育した（Ｎ群：四塩化炭素投与後のＮＩＰ株投与群）。
また、上記実験において、四塩化炭素投与期間中ハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２０株の乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料で飼育する以外は同様の実験を繰り返して四塩化炭素処理を６カ月間行ったハムスターを２群（４匹／群）に分け、一方の群はハムスター用エサ単独で飼育した群をＯ群（ＮＩＰ処理四塩化炭素投与後の通常飼育群）とし、他方の群はハムスター用エサ１ｋｇに対して実施例１で調製したＮＩＰ１０２０株の乾燥末１０ｍｇを混合した調製飼料で飼育した群をＰ群（ＮＩＰ処理四塩化炭素投与後のＮＩＰ株投与群）とし、それぞれ１カ月間飼育した。
所定期間飼育後、実施例３と同様にして肝臓の様子を観察した。結果を表４に示す。

表４から明らかなように、Ｍ群では、実施例３におけるＧ群の結果と比較することにより、肝障害の原因たる四塩化炭素の投与を中止した後も肝障害による症状は進行するが、Ｎ群の結果から、四塩化炭素による肝障害が生じた後でも本発明のＮＩＰ１０２０株の培養物を投与すると肝腫大、辺縁鈍化及び胆汁鬱滞の症状の軽減が認められ、高度な肝障害に対してもＮＩＰ１０２０株の培養物の投与が有効であることが示される。さらに、表４、Ｏ群及びＰ群の結果から、四塩化炭素の投与と同時にＮＩＰ１０２０株の培養物を含むエサを与えると、四塩化炭素の投与の中止と同時にＮＩＰ１０２０株の培養物の摂取を中止させても、Ｍ群はもとよりＮ群よりも肝障害はほんど受けず、特に本実験期間中を通して毎日ＮＩＰ１０２０株の培養物を投与された群（Ｐ群）は最も肝障害を受けてないことが分かった。したがって、本発明のＮＩＰ１０２０株の培養物は、四塩化炭素による肝障害（脂肪肝や中毒性肝障害）を有効に治療することから、本発明のＮＩＰ１０２０株の培養物を有効成分として含む配合物は脂肪肝や中毒性肝障害に有効な治療薬としての可能性を有することが示唆される。
産業上の利用可能性
上述のように、本発明のクロストリジウム・ブチリカムは、高い肝障害改善作用及び肝保護作用を有する新規な微生物である。したがって、本発明にかかるクロストリジウム・ブチリカム、特にクロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２０株、クロストリジウム・ブチリカムＮＩＰ１０２１株及びクロストリジウム・ブチリカムＡＴＣＣ１９３９８株の培養物は、肝障害を治療および／または予防する製剤において、さらには、健康食品または飼料において非常に有用である。
また、本発明の肝庇護剤は、上記クロストリジウム・ブチリカムの培養物を有効成分として含むので、高い肝障害予防作用及び肝障害治療作用さらには哺乳動物に対する高い安全性を有するため、肝障害、特に脂肪肝、アルコール性肝疾患及び中毒性肝障害を治療および／または予防するのに非常に有効に使用できる。
さらに、本発明の食品および飼料は、上記クロストリジウム・ブチリカムの培養物からなるため、高い安全性や肝障害改善作用及び肝保護作用は確保されたまま、公知の食品に混入されているため、不快感を伴わずに容易に食することができるという利点を有する。Technical field
The present invention includes Clostridium butyricum having a preventive and therapeutic effect on liver damage, a culture solution obtained by culturing the Clostridium butyricum, or a bacterium obtained by centrifuging the culture solution The present invention relates to a liver protectant comprising a residue or a dried product of the residue as an active ingredient, and a food and feed comprising the above culture solution and the like. More specifically, the present invention cultivates Clostridium butyricum having a preventive and therapeutic effect on hepatic disorders, particularly fatty liver, alcoholic liver disease and toxic liver disorder, and the Clostridium butyricum. Treatment and prevention of liver disorders, in particular fatty liver disease, alcoholic liver disease and toxic liver disorder, comprising as an active ingredient a residue containing a microorganism obtained by centrifuging the culture solution or a culture obtained by centrifuging the culture solution or a dried product of the residue The present invention relates to a food and feed comprising a liver protective agent for the purpose of, and the above-mentioned culture solution.
Background art
Clostridium butyricum, called a butyric acid bacterium, is one of the intestinal bacteria, and is a bacterium that emerges from the body alive in the feces like other intestinal bacteria. Clostridium butyricum (hereinafter the same is omitted in parentheses) is a useful bacterium used in the production of industrial butyric acid to produce a large amount of butyric acid from carbohydrates by butyric acid fermentation. And is known to produce anti-septic fungi active factors in its culture medium, and thus has been widely used in pharmaceuticals and feed ingredients for the purpose of improving abdominal symptoms as a live bacterial agent having an intestinal regulating effect. It's being used. In addition, in recent years, it has been found that a strain having Clostridium butyricum has an antitumor action, and its use as an antitumor immunostimulator is also proposed (Japanese Patent Laid-Open No. 06-292597).
On the other hand, the liver is a dark brown organ right to the upper abdominal cavity and directly below the diaphragm, and is the largest gland in the human body that attaches to the digestive tract and occupies about 1/45 of the body weight. In addition, the liver has many functions such as lipid metabolism, detoxification, bile excretion, storage of various nutrients, hematopoiesis, blood coagulation, and regulation of circulating blood volume. It is an important organ that has various functions that decline and in the worst case it is difficult to maintain life. Commonly pointed out causes of liver damage include various infections from viruses, poisoning by poisons or drugs, drinking and satiety, nutritional disorders and circulatory disorders to relatively familiar causes such as stress. In addition to the above causes, in recent years, antibiotics and supplementary nutrition used to increase the productivity of livestock animals also cause liver damage. Liver damaged in this way has symptoms such as hepatomegaly, marginal blunting, fat deposition (fatting), congestion and cholestasis, balloon-like changes in hepatocytes, hepatocyte destruction and necrosis. Observed, caused by fatigue / fatigue or growth failure during growth, and opportunistic infections due to decreased resistance, and when the above symptoms progress, fatty liver, hepatitis and cirrhosis, as well as liver cancer, etc. There are many possibilities for the transition to severe liver disease and eventually death. However, even though such a serious disorder has occurred, the liver has a great reserve, so even if there is some damage to the liver, the above symptoms are difficult to appear on the table, such as pain When the symptoms appear, the condition is often already advanced, and early detection is often overlooked.
Treatment methods for such liver disorders vary depending on the cause of the liver disorder.For example, in the case of alcoholic liver disease, elimination of causes such as withdrawal of alcohol consumption, in the case of fatty liver based on overnutrition, fat intake In cases of viral hepatitis, reduction of the amount, elimination of obesity, and administration of antiviral agents are mentioned, but the optimal treatment method has not yet been established. In particular, it is necessary to perform treatment in the case of advanced liver disorders, but known therapeutic agents for liver disorders have a drawback that they have an abrupt effect or have side effects when administered in large amounts or for long periods. For these safety reasons, there is a problem in using a known therapeutic agent as a preventive drug used for the purpose of protecting the liver and a health food for daily health maintenance.
Therefore, based on the background as described above, development of a liver protection agent having a high liver disorder treatment and prevention effect and safety, and further development of a treatment and prevention method for liver injury using such a liver protection agent, Furthermore, if the use of a substance having a therapeutic and preventive effect on liver damage in foods or feeds is achieved, the profits obtained thereby are immeasurable.
The present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to obtain a highly safe liver protective agent having an effect of effectively preventing and treating liver damage without causing serious side effects. And
Another object of the present invention is a highly safe liver protectant having an effect of effectively preventing and treating liver damage, particularly fatty liver, alcoholic liver disease and toxic liver damage, without causing serious side effects. Is to provide.
A further object of the present invention is to provide a method for effectively preventing and treating liver damage, particularly fatty liver, alcoholic liver disease and toxic liver damage, without causing serious side effects.
A further object of the present invention is to provide a food or feed that has an effective preventive and therapeutic effect on liver disorders, particularly fatty liver, alcoholic liver disease and toxic liver disorders, and can be easily eaten without discomfort. There is to do.
Disclosure of the invention
The above-mentioned objects are obtained by culturing Clostridium butyricum (hereinafter simply referred to as “Clostridium butyricum”), a residue containing bacteria obtained by centrifuging the culture, or a dried product of the residue. It is achieved by a liver protective agent characterized by containing as an active ingredient. In the present specification, the expression “liver protective agent” is used to mean “a preparation having a preventive and / or therapeutic effect against liver damage”.
The present invention is the above liver protecting agent, wherein the Clostridium butyricum is Clostridium butyricum NIP1020 strain having an accession number of FERM BP-5794 or Clostridium butyricum NIP1021 strain having an accession number of FERM BP-5595.
The present invention is also the above liver protecting agent, wherein the Clostridium butyricum is Clostridium butyricum NIP1020 strain having the deposit number FERM BP-5794.
The present invention is further the above-mentioned hepatoprotective agent used for the purpose of preventing and / or treating fatty liver, alcoholic liver disease or toxic liver injury. In the present specification, the expression “addictive liver disorder” is used to mean “liver disorder caused by pharmaceuticals, poisons, chemical substances, and the like”.
The above-mentioned objects are also achieved by a method for treating or preventing liver damage, which comprises administering any of the aforementioned liver protectants to a patient having liver damage.
The above objects are further obtained by adding a culture solution obtained by culturing Clostridium butyricum, a residue containing bacteria obtained by centrifuging the culture solution, or a dried product of the residue. ^-6 It is achieved by a food or feed used for the purpose of preventing or treating fatty liver, alcoholic liver disease or toxic liver injury mixed with ˜1% by weight.
A culture solution obtained by culturing Clostridium butyricum of the present invention, a residue containing bacteria obtained by centrifuging the culture solution, or a dried product of the residue (hereinafter simply referred to as “culture of Clostridium butyricum” or “culture”) Has a strong liver damage-improving action and liver-protecting action, and is highly safe for mammals, and therefore treats liver disorders, particularly fatty liver, alcoholic liver disease and toxic liver disorders, and Very useful for prevention.
Further, since the liver protective agent of the present invention contains the above-mentioned culture of Clostridium butyricum as an active ingredient, it is a powerful treatment and prevention for liver disorders, particularly fatty liver, alcoholic liver disease and toxic liver disorder. It is a preparation having an action and high safety for mammals.
Furthermore, since the food and feed of the present invention are composed of the above-mentioned culture of Clostridium butyricum, high safety is ensured and further mixed in the food or feed, it is safe and effective for improving liver damage. And foods and feeds that have liver-protecting action and can be easily eaten.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In order to solve the above-mentioned problems, the present inventors have extensively studied the properties and production of microorganisms, and as a result, hepatic disorders such as hepatomegaly, fat deposition, inflammation, or cholestasis observed in liver diseases are observed in animals. In addition, the liver damage may be caused by ingesting a culture solution obtained by culturing Clostridium butyricum in these animal models, or a residue containing bacteria obtained by centrifuging the culture solution or a dried product of the residue. It has been found that it can be prevented and treated, and the present invention has been completed.
That is, the liver protectant of the present invention is characterized by containing, as an active ingredient, a culture solution obtained by culturing Clostridium butyricum, a residue containing bacteria obtained by centrifuging the culture solution, or a dried product of the residue. It is.
As Clostridium butyricum used in the present invention, all Clostridium butyricum such as Clostridium butyricum NIP1019, NIP1020, NIP1022, and Clostridium butyricum ATCC 860 can be used. -Butyricum NIP1020 strain (hereinafter sometimes simply referred to as “NIP1020 strain”), Clostridium butyricum NIP1021 strain (hereinafter sometimes simply referred to as “NIP1021 strain”) and Clostridium butyricum ATCC19398 strain (hereinafter simply referred to as “ATCC”) May also be referred to as “strain”). The Clostridium butyricum NIP1021 strain is equivalent to the Clostridium butyricum Miyari strain described in Japanese Patent Publication No. 37-8300, and is under the accession number FERM BP-5795 on January 23, 1997 in Ibaraki, Japan. This strain is deposited with the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, located in 1-3-1 Higashi 1-chome, Tsukuba City.
In addition, the mycological properties of Clostridium butyricum NIP1020 strain preferably used in the present invention are shown.
(A) Form
1) Shape and size of cells: A gonococcus that is linear or curved and has blunted ends. The size is 0.6 to 1.2 μm × 5 to 10 μm. Spores are oval subterminal with rounded ends.
2) Presence or absence of mobility: Yes
3) Presence / absence of spores: Yes
(B) Culture properties
1) Meat agar plate culture with 1% starch: The colonies are round, irregular, whitish, creamy, and convex. The size of the colony is about 2 to 4 mm in diameter when cultured at 37 ° C. for 2 days.
2) 1% starch-added gravy liquid culture: acid and gas acidic
3) Grain gelatin agar plate culture with 1% starch: No gelatin liquefaction
4) Litmus milk: acidity, gas, coagulation
(C) Physiological properties
1) Gram stainability: +
2) Reduction of nitrate: −
3) Formation of indole: −
4) Starch hydrolysis: +
5) Catalase: −
6) Attitude toward oxygen: Anaerobic
7) Growth range: pH; 5.0-8.0
Temperature; 20-42 ° C
8) Presence or absence of acid generation from the following sugars
Cellobiose; +
D-fructose; +
D-galactose; +
Lactose; +
Maltose; +
D-mannose; +
Melibiose; +
Raffinose; +
Rhamnose; −
Salicin; +
D-sorbitol; −
Sucrose; +
Trehalose; +
D-xylose; +
(D) Other physiological properties
1) Hemolytic:-
2) Lecithinase: −
3) Fermentation products: butyric acid, acetic acid
When this bacterium was classified with reference to Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 9th, it was found to belong to Clostridium butyricum. As described in Examples below, the effectiveness of preventing and treating liver damage was examined for this Clostridium butyricum, and it was found to be significantly higher than known strains (Clostridial butyricum NIP1021 and Clostridium butyricum ATCC 19398). It was found to have a high preventive effect on liver damage. As a result, the above strain is considered to be a novel microorganism, and is designated as Clostridium butyricum NIP1020 strain. The industrial technology of the Ministry of International Trade and Industry, located at 1-3 1-3 Higashi, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, Japan on January 23, 1997 Deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, the deposit number is FERM BP-5794.
Clostridium butyricum is widely marketed as a live fungus, feed additive, and food, and has no side effects even when administered to mammals such as humans and livestock over a long period of time. Is guaranteed.
In the present invention, a culture of Clostridium butyricum, that is, “a culture solution in which Clostridium butyricum is cultured, a residue containing bacteria obtained by centrifuging the culture solution and a dried product of the residue” is a known microorganism. It can be obtained by a culture method, for example, the method disclosed in Japanese Patent Application No. 08-252088. One embodiment thereof is shown below: Clostridium butyricum is 1.0 (w / v)% peptone, 1.0 (w / v)% yeast extract, 1.0 (w / v)% corn starch and 0.2 (W / v)% 10 in a medium consisting of precipitated calcium carbonate ^Five -10 ⁶ Inoculated at 37 ° C. for 48 hours, and a culture solution of Clostridium butyricum is obtained. Next, the obtained culture solution is centrifuged (2,000 to 6,000 g × 10 to 30 minutes) to separate “residue containing bacteria obtained by centrifuging the culture solution”. 0 to 80 ° C., preferably 10 to 20 ° C., 1 to 24 hours, preferably 5 to 18 hours by air drying, or 0 to 80 ° C., preferably 10 to 20 ° C., 0.05 to 500 Torr, preferably Is 1 to 100 Torr, and a “residue dried product” is obtained by drying under reduced pressure for 1 to 24 hours, preferably 2 to 15 hours.
The medium used for culturing Clostridium butyricum according to the present invention varies depending on the type of strain used, but other sources such as carbon sources, suitable amounts of nitrogen sources, inorganic salts and vitamins that can be used by Clostridium butyricum. As long as the medium contains the nutrients, either a synthetic medium or a natural medium may be used.
For example, the carbon source used in the medium according to the present invention is not particularly limited as long as it is a carbon source that can be assimilated by the strain used. The carbon source is not necessarily limited to sugar, but considering the growth of bacterial cells, a sugar or sugar containing sugar that can be used by the bacterium to be used is preferably used. Specific examples of carbon sources that can be used include cellobiose, glucose, fructose, galactose, lactose, maltose, mannose, melibiose, raffinose, salicin, starch, sucrose, trehalose, xylose, dextrin, and Examples include molasses. Of these carbon sources, starch, glucose, fructose, sucrose and molasses are preferably used. In consideration of the Clostridium butyricum used, one or more carbon sources may be selected and used. At this time, the concentration of carbon source added varies depending on the type of clostridium butyricum to be used, the type of carbon source, the medium composition other than the carbon source of the medium to be used, etc. Preferably, it is 2 to 4 (w / v)%.
Examples of nitrogen sources and vitamins include meat extract, peptone, yeast extract, hydrolyzate of soybean and wheat such as taste liquid, soybean powder, milk casein, casamino acid, various amino acids, corn steep liquor, and other Examples thereof include organic nitrogen compounds such as hydrolysates of animals, plants, and microorganisms, and ammonium salts such as ammonium sulfate. Of these nitrogen sources, peptone, yeast extract, meat extract, corn steep liquor and taste liquid are preferably used. In order to improve the growth of the Clostridium butyricum to be used, one or more of the nitrogen sources and vitamins described above may be selected and used. At this time, the concentration of the nitrogen source added varies depending on the strain used, the type of nitrogen source, the medium composition other than the nitrogen source of the medium used, and the like, but when using peptone containing a large amount of nitrogen source, 0.5 to 4 (w / v)%, preferably 1 to 3 (w / v)%, and when using a taste liquid or corn steep liquor containing a large amount of nitrogen source and vitamins, 0.5 to 5 (w / v)%, preferably 1 to 4 (w / v)%, and when using a yeast extract or meat extract rich in vitamins, usually 0 0.5 to 4 (w / v)%, preferably 1 to 3 (w / v)%.
In addition, inorganic salts include phosphate, hydrochloride, sulfate, butyrate, propionate and acetic acid such as magnesium, manganese, calcium, sodium, potassium, molybdenum, strontium, boron, copper, iron, tin and zinc. One or more selected from salts and the like can be used. If necessary, add antifoaming agents, vegetable oils, surfactants, blood and blood components, drugs such as vitamins and antibiotics, physiologically active substances such as plant or animal hormones, etc. Also good.
The culture conditions performed in the present invention vary depending on physiological properties such as the growth range (pH, temperature, etc.) of Clostridium butyricum used in the present invention. It is necessary to cultivate under anaerobic conditions, for example, by reducing the oxidation-reduction potential by aeration with nitrogen or carbon dioxide gas or by adding a reducing agent to the medium. The culture conditions at that time are appropriately selected depending on the growth range of the strain to be used, the composition of the medium and the culture method, and are not particularly limited as long as the strain can be grown. Specifically, the culture temperature is 20 to 42 ° C, preferably 35 to 40 ° C.
In the present invention, the cultivation of Clostridium butyricum is preferably promoted by neutralizing the acid produced during the cultivation with an alkali, so that calcium carbonate is preferably added to the medium in advance. At this time, the amount of calcium carbonate added is 0.1 to 4 (w / v)%, preferably 0.2 to 2.5 (w / v)%. Or it is also preferable to perform the said neutralization process, suppressing pH of a culture medium in the range of setting pH with alkaline aqueous solutions, such as sodium hydroxide, sodium hydrogencarbonate, sodium carbonate, potassium hydroxide, and potassium carbonate. When an alkaline aqueous solution is used, the “set pH” means the pH of the medium set in advance during the culture period, and the “set pH range” is allowed during the culture period. This is a pH range, and is generally expressed as a set pH ± tolerance. According to the present invention, the set pH is usually set within the range of 5.0 to 7.5, preferably 5.5 to 6.5, and the set pH range is set to pH ± 0.5, desirably The set pH is ± 0.2.
In the present invention, the pH of the medium during culture is about neutral at the time of bacterial inoculation, more preferably 6.5 to 7.5. In addition, when using alkaline aqueous solution, it is preferable to maintain within the range of setting pH, stirring gently so that oxygen may not mix. Thus, by controlling the pH at the time of bacterial inoculation and bacterial growth, the bacterial density can be dramatically increased.
In the culture according to the present invention, the initial culture concentration of Clostridium butyricum is not particularly limited as long as Clostridium butyricum can grow, and is usually the same as that performed in the culture of Clostridium butyricum. Specifically, usually 10 ^Four -10 ⁷ Pieces / ml, preferably 10 ^Five -10 ⁶ Pieces / ml.
The culture of Clostridium butyricum obtained in this way, especially the culture of Clostridium butyricum NIP1020 strain, is caused by hepatomegaly due to alcohol intake, organic solvent, drug, virus, stress, undernutrition or overnutrition, For blunting, fat deposition (fatting), congestion and cholestasis, balloon-like changes in hepatocytes, liver damage such as hepatocyte destruction and necrosis, especially fatty liver, alcoholic liver disease and toxic liver damage It has excellent preventive and therapeutic effects.
The liver protectant of the present invention is a patient as a composition for oral administration or parenteral administration in the form of the culture of Clostridium butyricum as it is or by blending a pharmaceutically acceptable carrier with the culture of Clostridium butyricum. (Including livestock, poultry and mammals such as humans, and fish). When the agent is used for oral administration, the culture of Clostridium butyricum should be shaped with appropriate additives such as lactose, sucrose, mannitol, corn starch, synthetic or natural gum, and crystalline cellulose. Agents, starch, cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose and methylcellulose, binders such as gum arabic, gelatin and polyvinylpyrrolidone, carboxymethylcellulose calcium, carboxymethylcellulose sodium, starch, corn starch, carbonic acid Disintegrants such as sodium hydrogen and sodium alginate, lubricants such as talc, magnesium stearate, and sodium stearate, and fillers or diluents such as calcium carbonate, sodium carbonate, calcium phosphate, and sodium phosphate Etc. appropriately mixed with, tablets, powders (powders), it can be solid form such as pills, and granules. Or the liver protective agent for oral administration may have the form of a capsule, and a hard or soft gelatin capsule is used as a capsule in this case. These solid preparations may be enteric-coated using a coating base such as hydroxypropylmethylcellulose phthalate, hydroxypropylmethylcellulose acetate succinate, cellulose acetate phthalate, and methacrylate copolymer. Furthermore, the culture of Clostridium butyricum of the present invention is suspended in generally used inert diluents such as purified water or glycerin esters such as tricaprin and triacetin or alcohols such as ethanol as necessary. In addition, liquid preparations such as syrups and elixirs can be obtained by appropriately adding an infiltrant, emulsifier, dispersion aid or surfactant, sweetener, flavor or aromatic substance to this solution.
When the liver protective agent of the present invention is used for parenteral administration, the culture of Clostridium butyricum is prepared by using an appropriate buffer such as purified water, phosphate buffer, physiological saline, Ringer's solution or lock. As a sterilized aqueous or non-aqueous solution, suspension, liposome, or emulsion appropriately combined with physiological salt solutions such as solutions, ethanol, propylene glycol, glycerin and commonly used preservatives, stabilizers and surfactants It can be made into a liquid formulation. In this case, the liquid preparation preferably has a physiological pH, preferably a pH in the range of 6-8. Moreover, you may form the liver protective agent of this invention as transdermal preparations, such as ointment, lotion, or cream, using a well-known method.
Further, the liver protective agent of the present invention uses, for example, a neutral solution consisting of sodium hydrogencarbonate, boric acid or the like, or a buffer solution having a pH of 3 to 7, and if necessary, an antiseptic, a stabilizer, an osmotic pressure regulator, etc. May be added in the form of eye drops.
Furthermore, the liver protectant of the present invention can be administered as a suppository using a suppository base such as embedding with a pellet or gelatin soft capsule.
Among the above-mentioned, a preferable dosage form and administration route are selected by the doctor in charge.
The concentration of the clostridium butyricum culture contained in the liver protective agent of the present invention varies depending on the form at the time of administration, the type and severity of the disease, the intended dose, etc. The weight of the cells is in the range of 0.1 to 50% by weight, preferably 1 to 10% by weight, based on the total weight of the raw material. In particular, when the preparation of the present invention is orally administered, the weight of the microbial cells is 0.1 to 50% by weight, more preferably 1 to 10% by weight, based on the total weight of the raw material, When administered parenterally, the weight of the microbial cells is preferably in the range of 0.1 to 50% by weight, more preferably 1 to 10% by weight with respect to the total volume of the raw material. At this time, if the culture concentration of Clostridium butyricum exceeds the upper limit, a uniform dose cannot be obtained, which is not preferable. On the other hand, if the concentration of the clostridium butyricum culture is less than the lower limit, the disease state improving effect to be obtained by the present invention cannot be sufficiently expected, which is also not preferable.
The dosage of the liver protectant of the present invention varies depending on the age, weight and symptoms of the patient, the intended dosage form and method, therapeutic effect, treatment period, etc., and the exact amount is determined by the doctor. Specifically, when the liver protectant of the present invention is orally administered, when using a culture solution of Clostridium butyricum as a culture, it is usually preferably 0.01 to 10 ml / kg body weight / time. Is in the range of 0.1 to 2 ml / kg body weight / dose, and when the cell, extract, purified substance or dried product obtained by centrifuging this culture solution is used as a culture. Is usually in the range of 0.01 mg to 1 g / kg body weight / dose, more preferably 1 mg to 0.1 g / kg body weight / dose, and 1 to 6 times a day, more preferably 1 to It is desirable to administer in 3 divided doses. At this time, when the dose per day is large, it may be divided into a plurality of preparations such as tablets at a time. In addition, when the liver protectant of the present invention is administered parenterally, it is usually 0.01 mg to 1 g / kg body weight / time, more preferably 1 mg to 0.1 g / kg body weight / time in terms of bacterial cell weight. It is desirable to administer 1 to 6 times a day, preferably 1 to 3 times a day, within a range of doses.
Another feature of the present invention is that a culture solution obtained by culturing Clostridium butyricum, a residue containing bacteria obtained by centrifuging the culture solution, or a dried product of the residue is obtained. ^-6 ˜1% by weight, preferably 10 ^-6 Food or feed mixed with ~ 0.1% by weight. In the present invention, the mixing may be in the form of food, drinking water or feed mixed with a predetermined amount of culture in advance, or in the form of food, drinking water or feed mixed with a predetermined amount of culture when ingested. Also good.
In the present invention, the amount of mixed culture is 10 ^-6 ~ 1% by weight is 10 ^-6 If it is less than% by weight, sufficient improvement of liver damage or protection by the culture cannot be expected, and if it exceeds 1% by weight, the taste, texture and texture of foods and the like are likely to be impaired.
Examples of foods according to the present invention include dairy products such as yogurt and cheese, kamaboko, chikuwa, hanpen, fish paste, fish paste products such as tsumere, processed fishery products such as starch, meat such as sausage, frankfurt and liver paste Processed products, tofu, grilled tofu, freshly fried, fried tofu, ganmodoki, okara, frozen tofu, bean products such as yuba, processed vegetables such as puree, mashed potatoes, scraps, harsame, konnyaku, sardine processed products such as shirataki, mochi, Shiratama, white rice, rice bowl, rice noodles, macaroni, spaghetti, somen noodles, buckwheat noodles, Chinese noodles, processed bread such as bread, dry bread, and anpan, sweets such as jam, fats and oils such as butter, margarine, mayonnaise, dressing, Ame, Raku Cancer, Senbei, Hail, Castella, Yokan, Monaka, Manju, Daifuku , Dango, Uiro, Chocolate, Biscuits, Cookies, Donuts, Cakes, Pies, Ice cream, Pudding, Bavaria, Gum and other sweets, Tofu, Jelly, Konjac, Agar or Tokoroten and other gel foods, Kombu, Wakame, Nori , And all foods that can be eaten normally, such as seaweeds such as tengusa.
In addition, the feed according to the present invention includes all food for animals normally raised such as domestic animals such as pigs, cattle, sheep and goats, pets such as dogs, cats, rabbits and hamsters, poultry and fish. .
Toxicity tests were carried out on the Clostridium butyricum NIP1020, Clostridium butyricum NIP1021 and Clostridium butyricum ATCC 19398 strains of the present invention, and their safety was confirmed: Clostridium butyricum NIP1020, Clostridium butyricum NIP1021 and Clostridium -Butyricum ATCC 19398 strain, 1.0 (w / v)% peptone, 1.0 (w / v)% yeast extract, 1.0 (w / v)% corn starch and 0.2 (w / v)% About 10 in a medium consisting of precipitated calcium carbonate ⁶ After inoculating to inoculate to the number of cells / ml, static culture at 37 ° C. for 48 hours, and centrifuging the obtained culture solution (4,000 g × 20 minutes) to separate the cells, and then drying the cells Treatment (15 ° C., 20 Torr for 12 hours under reduced pressure) gives a dried bacterial cell powder. The dried microbial cell powder is fed into mouse food (Oriental Yeast Co., Ltd., product name: MF) (hereinafter simply referred to as “mouse food”) at a weight ratio of 1:10. ^Five To prepare a prepared feed. A group of 5 4-week-old ddy mice (male, 17-20 g) was fed in advance in the same cage for 3 days, and then the prepared feed prepared above was further given for 6 months. And raised. At this time, a “non-administration group” reared in the same manner except that mouse food alone was used instead of the prepared feed was used as a comparative control. In all the test groups, the food intake of the mice was 3-8 g / day / animal. The results are shown in Table 1 below.

As shown in Table 1, all the 3 strains preferably used in the present invention were not different from the non-administration group in the body weight and state of the mice, and thus the safety of the 3 strains was confirmed.
Next, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
Example 1
Clostridium butyricum NIP1020 strain, Clostridium butyricum NIP1021 strain and Clostridium butyricum ATCC 19398 strain were converted into 1.0 (w / v)% peptone, 1.0 (w / v)% yeast extract, 1.0 (w / v )% Corn starch and 0.2 (w / v)% precipitated calcium carbonate in a medium of about 10 ⁶ The cells were inoculated so that the number of cells / ml was reached, and cultured at 37 ° C. for 48 hours (stationary or shaking). After centrifuging the obtained culture solution (4,000 g × 20 minutes) to separate the cells, the cells are dried (under reduced pressure at 15 ° C. and 20 Torr for 12 hours) to obtain each of the cells. A dry powder was prepared.
Example 2
The following experiment was conducted to examine the liver injury preventing effect of ethanol of the strains of the present invention (NIP1020 strain, NIP1021 strain and ATCC strain).
All groups (groups A, C, D, E, and F) except the non-treated group (group B) in which 0.6 ml of water was forcibly orally administered twice a day using a sonde and at the same time the water was freely ingested ), Syrian hamsters (100 to 160 g: 3 animals / group) were subjected to the following treatment for 3 months to produce an animal model of liver injury caused by ethanol: 20 ml of a 25 (w / v)% aqueous ethanol solution (20 ml). At the same time, it was forcibly orally administered twice a day using a sonde, and at the same time, a 5 (w / v)% ethanol aqueous solution was freely taken as drinking water. During the experiment, each hamster group was fed with the following food.
Group A: manufactured by Oriental Yeast Co., Ltd., product name: MF hamster food (hereinafter simply referred to as “hamster food”) (negative control);
Group B: hamster food (untreated group);
Group C: A prepared feed prepared by mixing 10 mg of NIP1020 strain dry powder prepared in Example 1 with 1 kg of hamster food (NIP1020 strain administration group). During the test period, the hamster food intake was about 5 to 30 g per day.
Group D: prepared feed prepared by mixing 10 mg of NIP1021 strain dry powder prepared in Example 1 with 1 kg of hamster food (NIP1021 strain administration group). During the test period, the hamster food intake was about 5 to 30 g per day.
Group E: A prepared feed prepared by mixing 10 mg of ATCC strain dry powder prepared in Example 1 with 1 kg of hamster food (ATCC strain administration group). During the test period, the hamster food intake was about 5 to 30 g per day.
Group F: A known ursodeoxycholic acid ethanol solution (0.1 mg / cc 99.5% ethanol) as an improving agent for liver function is added so that hamster food contains 10 mg ursodeoxycholic acid per kg. Prepared feed (absodesoxycholic acid administration group) which was air-dried after absorption. During the test period, the hamster food intake was about 5 to 30 g per day.
After treatment for 3 months, each treated group of mice was examined for upper abdominal swelling by palpation. As a result, swelling was confirmed in group A and no swelling in upper abdomen was observed in groups B and C. However, in the D group, the E group, and the F group, the upper abdomen was slightly swollen. For each group of mice, liver findings were examined for liver volume per 100 g body weight (ml / 100 g body weight), marginal blunting and fat deposition. The results are shown in Table 2 below.

As is apparent from Table 2, the NIP1020 strain administration group (Group C), the NIP1021 strain administration group (Group D) and the ATCC strain administration group (Group E) of the present invention are all significantly compared to the negative control A group. Since hepatomegaly and fat deposition are suppressed, and this inhibitory effect is equivalent to or higher than that of known ursodeoxycholic acid as an improving agent for liver function, the NIP1020 strain, NIP1021 strain and ATCC strain of the present invention This culture was effectively prevented from liver damage caused by ethanol (alcoholic liver disease). In addition, among the strains used in this example, the NIP1020 strain administration group (Group C) suppresses hepatomegaly, marginal blunting, and fat deposition to almost the same results as the untreated group (Group B). From these results, it is suggested that the formulation containing the NIP1020 strain culture of the present invention as an active ingredient has the potential as an effective preventive agent for alcoholic liver disease.
Example 3
The following experiment was conducted to examine the effect of carbon tetrachloride on preventing liver damage of the strains of the present invention (NIP1020 strain, NIP1021 strain and ATCC strain).
All groups (G, I) except the comparative group (Group H) in which Syrian hamsters (100 to 160 g: 4 animals / group) were injected subcutaneously with 0.2 ml of paraffin oil twice a week for a total of 6 months. , J, K, and L), Syrian hamsters (100 to 160 g: 4 animals / group) were subjected to the following treatment for a total of 6 months to produce an animal model of liver injury caused by carbon tetrachloride: the first 4 months Carbon tetrachloride paraffin oil mixture at a concentration of 2.5 mg / 0.2 ml for the next month, 3.2 mg / 0.2 ml for the next month, and 4.0 mg / 0.2 ml for the last month .2 ml was injected subcutaneously twice a week for a total of 6 months. During the experiment, each hamster group was fed with the following food.
Group G: hamster food (negative control);
Group H: hamster food (comparison group);
Group I: A prepared feed prepared by mixing 10 mg of NIP1020 strain dry powder prepared in Example 1 with 1 kg of hamster food (NIP1020 strain administration group). During the test period, the hamster food intake was about 5 to 30 g per day.
Group J: prepared feed prepared by mixing 10 mg of NIP1021 strain dry powder prepared in Example 1 with 1 kg of hamster food (NIP1021 strain administration group). During the test period, the hamster food intake was about 5 to 30 g per day.
K group: A prepared feed in which 10 mg of ATCC strain dry powder prepared in Example 1 was mixed with 1 kg of hamster food (ATCC strain administration group). During the test period, the hamster food intake was about 5 to 30 g per day.
Group L: A known ursodeoxycholic acid ethanol solution (0.1 mg / cc 99.5% ethanol) as an improving agent for liver function is added so that hamster food contains 10 mg ursodeoxycholic acid per kg. Prepared feed (absodesoxycholic acid administration group) which was air-dried after absorption. During the test period, the hamster food intake was about 5 to 30 g per day.
After completion of treatment for 6 months, liver findings (swelling in the upper abdomen, blunting of the margin, whitening of the liver, fat deposition, cholestasis and inflammation) were examined for each group of treated mice. After a month, palpation confirmed swelling in the upper abdomen, and blunting of the rim, whitening of the liver, fat deposition, cholestasis, and inflammation were confirmed, and it was confirmed that liver damage due to carbon tetrachloride was clearly occurring did. In the I and L groups, swelling of the upper abdomen, blunting of the margin, whitening of the liver, fat deposition, cholestasis, and inflammation were hardly observed, but in the J and K groups, there was a slight increase in the upper abdomen. Swelling was observed, and marginal blunting was slightly observed. Detailed results are shown in Table 3 below.

As is apparent from Table 3, the NIP1020 strain administration group (Group I), the NIP1021 strain administration group (Group J), and the ATCC strain administration group (Group K) of the present invention are all significantly compared with the negative control G group. It suppresses hepatomegaly, marginal blunting, fat deposition, cholestasis, and inflammation. This suppressive effect is generally inferior to hepatomegaly in NIP1021 strain (Group J) and ATCC strain (Group K). Is equal to or higher than known ursodeoxycholic acid as an improving agent for liver function. Therefore, the cultures of the NIP1020 strain, NIP1021 strain and ATCC strain of the present invention are susceptible to liver damage (fat It was shown to effectively prevent liver and toxic liver damage). In addition, among the strains used in this example, the NIP1020 strain administration group (Group I), in particular, has almost the same results as the comparison group (Group H) and the ursodeoxycholic acid administration group (Group L). Since it has suppressed swelling, marginal blunting, fat deposition, cholestasis and inflammation, the composition containing the NIP1020 strain culture of the present invention as an active ingredient is an effective prophylactic agent for fatty liver and toxic liver damage It is suggested that
Example 4
The following experiment was conducted on the NIP1020 strain, in which a particularly excellent preventive effect was observed in Examples 2 and 3, and the therapeutic effect of liver injury by carbon tetrachloride was examined.
Syrian hamsters (100 to 160 g) were treated in the same manner as in Example 2 to produce an animal model of liver injury caused by carbon tetrachloride. After 6 months of carbon tetrachloride administration, hamsters with swollen abdomen were divided into 2 groups (4 animals / group), and one group was fed with hamster food alone for 1 month (Group M: carbon tetrachloride administration) The other group was reared for 1 month with a prepared feed in which 10 mg of the dried powder of NIP1020 strain prepared in Example 1 was mixed with 1 kg of hamster food (group N: after administration of carbon tetrachloride). NIP strain administration group).
Further, in the above experiment, the same experiment was repeated except that it was reared with a prepared feed in which 10 mg of the dried powder of NIP1020 strain prepared in Example 1 was mixed with 1 kg of hamster food during the carbon tetrachloride administration period. Hamsters that were treated for 6 months were divided into 2 groups (4 animals / group), and one group was grouped with hamster food alone as group O (normal breeding group after administration of NIP-treated carbon tetrachloride), The other group is P group (NIP strain administration group after administration of NIP-treated carbon tetrachloride), which is fed with a prepared feed in which 10 mg of the dry powder of NIP1020 strain prepared in Example 1 is mixed with 1 kg of hamster food. Each was raised for 1 month.
After breeding for a predetermined period, the state of the liver was observed in the same manner as in Example 3. The results are shown in Table 4.

As is clear from Table 4, in the M group, the symptoms due to liver damage progress even after stopping the administration of carbon tetrachloride, which is the cause of liver damage, by comparing with the results of Group G in Example 3. From the results of Group N, even after the liver injury caused by carbon tetrachloride occurred, administration of the NIP1020 strain culture of the present invention reduced the symptoms of hepatomegaly, blunting, and cholestasis. It is also shown that administration of the culture of NIP1020 strain is effective against the above. Further, from the results of Table 4, Group O and Group P, when food containing NIP1020 strain culture was given at the same time as administration of carbon tetrachloride, intake of culture of NIP1020 strain was taken at the same time as administration of carbon tetrachloride was stopped. Even if the treatment is stopped, the liver damage is hardly received from the M group as well as the N group, and the group (P group) to which the culture of the NIP1020 strain is administered every day throughout the experiment period is the least affected by the liver damage. I understood that. Therefore, since the culture of the NIP1020 strain of the present invention effectively treats liver injury (fatty liver or toxic liver injury) caused by carbon tetrachloride, the composition containing the culture of the NIP1020 strain of the present invention as an active ingredient Is suggested to have potential as an effective therapeutic agent for fatty liver and toxic liver injury.
Industrial applicability
As described above, Clostridium butyricum according to the present invention is a novel microorganism having a high liver damage ameliorating action and liver protecting action. Therefore, the culture of Clostridium butyricum according to the present invention, particularly Clostridium butyricum NIP1020 strain, Clostridium butyricum NIP1021 strain and Clostridium butyricum ATCC 19398 strain can be used in preparations for treating and / or preventing liver damage, Very useful in food or feed.
In addition, since the liver protective agent of the present invention contains the above-mentioned culture of Clostridium butyricum as an active ingredient, it has a high liver damage prevention action and liver damage treatment action, as well as high safety for mammals. It can be used very effectively to treat and / or prevent fatty liver, alcoholic liver disease and toxic liver injury.
Furthermore, since the food and feed of the present invention are composed of the above-mentioned culture of Clostridium butyricum, they are mixed with known foods while ensuring high safety, liver damage-improving action and liver protecting action. It has the advantage of being able to eat easily without a pleasant feeling.

Claims

A liver protectant comprising, as an active ingredient, a culture solution obtained by culturing Clostridium butyricum, a residue containing bacteria obtained by centrifuging the culture solution, or a dried product of the residue.

The Clostridium butyricum is the Clostridium butyricum NIP1020 strain under the accession number FERM BP-5794 (Clostridium butyricum NIP1020) or the Clostridium butyricum NIP1021 strain under the accession number FERM BP-5595 (Clostridium butyricum) The liver protective agent according to Item 1.

The liver protective agent according to claim 2, wherein the Clostridium butyricum is Clostridium butyricum NIP1020 strain number FERM BP-5794.

The liver protective agent according to any one of claims 1 to 3, which is used for the purpose of preventing or treating fatty liver, alcoholic liver disease or toxic liver injury.