JP3902167B2 - 表面プラズモン共鳴装置 - Google Patents

Description

本発明は、金属薄層に照射する偏光光束の照度ムラが少ないために、シグナルのばらつきの低減された表面プラズモン共鳴装置に関する。

近年、生理活性物質間の相互作用を評価する試みが数多くなされている。その多くは一方の分子を固相に固定化し、その分子と相互作用するであろう物質を与えることで、相互作用を観察する。相互作用するであろう物質には蛍光やラジオアイソトープなどのラベル物質を結合させ、ラベル物質を検出することで生体分子あるいは分子集合体間の相互作用を評価する。一般的なＤＮＡチップは蛍光などのラベル物質を用いて相互作用をスクリーニングする。しかし、ラベル操作は非常に煩雑であるとともに定量性に欠ける。また、相互作用をリアルタイムで観察するのは非常に困難である。

そこで、ラベルが不要でかつ定量性があり、リアルタイムで評価可能な分析方法として、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーが注目を集めている。ＳＰＲは分析体を固定化した金属薄膜に光を照射して反射光をモニターし、サンプルとの相互作用を、共鳴角もしくは反射光強度の変化で測定する方法である。

一般的なＳＰＲセンサーにおいては単一波長であるレーザー光を光源として用いる（例えば、特許文献１参照）。レーザー光は直進性に優れており、光学研究には非常に使い易い光源である。しかし、光は一点に集中したビームであり、光の当たる部分の面積は非常に小さい。よって、相互作用を評価できる物質は基本的に一つであり、ＤＮＡチップのように複数の物質をスクリーニングすることは非常に難しい。

この問題を解決する手段としてレーザー光をスキャニングデバイスで反射させてスキャンし、スライドの面にレーザー光を逐次照射していく方法（例えば、特許文献２参照）を応用することが考えられるが、装置が煩雑になるとともに、レーザー光がスキャンしている間はリアルタイム評価ができない問題点がある。

そこでＮｅｌｓｏｎらはＳＰＲの光源として、３５Ｗのハロゲンランプを選択した。光を平行光としてから直径３００μｍのピンホールに集め、カメラレンズによって再度、平行光とした。得られた平行光を偏光板に通し、ＳＰＲに適当な角度で入射させて、１８×１８ｍｍの金蒸着スライドの照射し、反射光を波長フィルターに通してからＣＣＤカメラで撮影した（例えば、非特許文献１参照）。

ここで示されているデータは、センサー表面上の６ｍｍ×４ｍｍ＝２４ｍｍ²の領域に２４個のスポットに関してのみである。２４個のデータに関しては、ほとんどばらつきがないことが示されているものの、それ以上の広い範囲にわたってスポットを設けても均一なシグナルを得るのは困難であるのが現状である。

広い範囲にわたって均一なシグナルを得る手段としては、均一な照度を得るのが必要である。照度の均一性を高める手段として、ピンホールの穴を小さくする方法があるものの、十分な照度が得られず、逆にシグナルの均一性が低下することもある上、検出に高価な高感度ＣＣＤカメラが必要となる問題点があった。

欧州特許出願公開第０３４１９２７号明細書 国際公開第９３／１４３９３号パンフレット Nelson ら、Anal.Chem.、71巻、3928-3934頁、1999年

本発明の課題は、照度ムラの低減された光束を得ることで多数のサンプルを再現性良く、また、バラツキが少なく測定できる性能が高いＳＰＲを提供する。

本発明者らは鋭意検討した結果、以下に示す手段により、上記課題を解決できることを見出した。

１．以下の（ａ）〜（ｃ）を少なくとも含んでなり、測定領域を均等に縦１０個×横１０個の各分割測定領域に分け、該各分割測定領域の中心に各分割測定領域の短辺の４０％に相当する直径を持つ円形の各注目領域を設け、水をベースラインとして１％エタノール水溶液をセンサー表面と接触させて測定した場合、該測定領域の面積が７０ｍｍ ² 以上において、該１００個の各注目領域から得られるシグナルのばらつき（ＣＶ）を１５％以下とすることができる表面プラズモン共鳴装置。
（ａ）光源、
（ｂ）該光源からの光を集光し通過させるための、穴の径が５０μｍ以上３００μｍ未満であるピンホール、
及び（ｃ）該ピンホールを通過したした後の光を照射させるための、部分内にアスペクト比０．５以上の長方形もしくは正方形である測定領域を有するセンサー表面。
２．光源として正方形フィラメント型ハロゲンランプを用いることを特徴とする１の表面プラズモン共鳴装置。
３．光源からの光を集光し、ピンホール内で交差させて通過した光を集光レンズで平行光とし、該平行光をセンサー表面に照射することを特徴とする１又は２の表面プラズモン共鳴装置。
４．表面プラズモン共鳴シグナル変化を解析する方法において、光源からの光を集光し、穴の径が５０μｍ以上３００μｍ未満であるピンホール内で交差させて通過した光を集光レンズで平行光とし、該平行光を部分内にアスペクト比０．５以上の長方形もしくは正方形である測定領域を有するセンサー表面に照射することによって、測定領域を均等に縦１０個×横１０個の分割測定領域に分け、該各分割測定領域の中心に各分割測定領域の短辺の４０％に相当する直径を持つ円形の各注目領域を設け、水をベースラインとして１％エタノール水溶液をセンサー表面と接触させて測定した場合、該測定領域の面積が７０ｍｍ ² 以上において、該１００個の各注目領域から得られるシグナルのばらつき（ＣＶ）を１５％以下にする方法。
５．光源が正方形フィラメント型ハロゲンランプであることを特徴とする４の方法。
６．測定領域の面積が７０ｍｍ ² 以上１００ｍｍ ² 以下の範囲であることを特徴とする４または５の方法。

照度の高く、照度のムラがない偏光光束を得ることで、安価でかつ、シグナルのばらつきの少ないＳＰＲ装置を実現した。今後、生体分子の相互作用のスクリーニングに広く用いられていくと期待する。

以下に本発明を詳細に説明する。本発明のＳＰＲ機器では広い範囲のＳＰＲシグナル変化を解析するために、チップの広い範囲に、十分な照度を有し照度ムラのない偏光光束を照射できることが特徴である。

ここで言う広い範囲とはチップ表面上の領域で７０ｍｍ ² 以上、好ましくは７０ｍｍ ² 以上１００ｍｍ ² 以下である。すなわち、レーザー光を狭い領域に照射する手段や、光源を集光してセンサー上の点、もしくは線に照射する手段は含まれない。７０ｍｍ ² 未満であると面積が十分でなく、スクリーニングテストのｎ数の確保、モルホロジー観察が困難となる。

本発明のＳＰＲ装置のシグナルムラを定量的に測定する方法として、テストチップを装置にセットして、屈折率の異なる二種類の液を順番に流し、観察領域を分割した各部位のシグナル変化のばらつきを定量する方法が好ましい。偏光光束の照度ムラを直接的に測定するのはＳＰＲの性能を反映しているとは言えず好ましくない。ただ単に反射像の照度のばらつきを計測する方法は、チップの微小な汚れなどを照度ばらつきと区別できないため好ましくない。

屈折率の異なる二種類の液としては水と１％エタノール水溶液が容易に入手できるため好ましい。測定領域としてはテストチップの表面に換算して７０ｍｍ ² 以上の広い領域であることが好ましく、より好ましくは８０ｍｍ ² である。
測定領域としてはアスペクト比０．５以上の長方形もしくは正方形であることが好ましい。アスペクト比としては、より好ましくは０．６以上、さらに好ましくは０．７以上である。アスペクト比が０．５より低くなると、測定領域が細長くなりすぎ、実質的に使いにくくなる。
７０ｍｍ ² 未満の場合は、多くのサンプルを一度に正確に評価することが困難となる。狭い領域のばらつきが少なくても、広い領域でばらつきがあれば意味がないからである。

測定領域のシグナルの変化のバラツキは以下の通り測定する。
該測定領域を縦１０個、横１０個に均等に分割し、それぞれを分割測定領域とする。さらに分割測定領域の中心に測定を行う円形の測定点（注目領域）を設け、この領域のシグナルをＳＰＲで測定する。注目領域の直径は、分割測定領域の縦、横の辺の短い方の辺の長さの４０％に相当するものとする。それぞれの注目領域でシグナルを検出し、水と１％エタノール水溶液とでそのシグナルの差を求め、さらに、この１００箇所の注目領域でのシグナルの変化の平均値及び標準偏差を求める。

こうして、水と１％エタノール水溶液によって得られるシグナルの変化のばらつきはＣＶで示される。ＣＶとは標準偏差を平均値で割った値であり、ＣＶ値は１５％以下であることが好ましく、１０％以下であるとさらに好ましい。
このようなＣＶ値の測定領域がセンサー表面上に７０ｍｍ²以上存在するＳＰＲ測定機を用いることにより、多くのサンプルを同時に、また、正確に測定することができる。

テストチップとしては透明基板に金がコーティングされたものが好ましい。金の厚みは３０から１００ｎｍが好ましく、特に４０から６０ｎｍが好ましい。金の剥離を防ぐため、金と透明基板の間にクロムまたはチタンが１から１０ｎｍコーティングされていてもよい。金属のコーティング方法としては特に限定されるものではなく、真空蒸着法、スパッタリング法、イオンコーティング法などが挙げられる。実際に用いる場合は、金表面にアルカンチオールを単分子でコーティングすると、チップ表面が汚れないため好ましい。アルカンチオールとしてはＯＨ基をもつ１１−メルカプトウンデカノールや、ＣＯＯＨ基をもつ１１−メルカプトウンデカン酸などを選択すると好ましい。

透明基板としては特に限定されるものではなく、ガラスやプラスチック類などが挙げられる。平面基板もしくは回折格子基板なども含まれる。

一般的な安価な光源はフィラメント部を有しており、光の明暗ムラが存在する。光源の光をそのまま照射すれば、反射して得られる像に明暗ムラが生じ、スクリーニングやモルホロジー変化を評価するのが困難となる。チップに均一に照射する手段として、光をピンホールに通してから平行光にする方法が好ましい。

ピンホールを通す手段は、明るさの均一な光束を得る手段としては好ましいが、そのままピンホールに光を通すと照度が低下する欠点がある。そこで、十分な照度を確保する手段として、ピンホールと光源の間に凸レンズを設置し、集光してピンホールを通す方法を用いることが好ましい。

ピンホールの形状は円、楕円、四角形やそれ以上の多角形、不定形等、形状にこだわるものではないが、円形が好ましい。

ピンホールの穴の大きさは径が５０μｍ以上３００μｍ未満が好ましい。さらには１００μ以上が好ましい。５０μｍ未満であると照度を十分に確保できないため好ましくない。３００μｍ以上のピンホールを用いる、もしくはピンホールを用いない場合は、光束の照度ムラが生じ、ＳＰＲ機器としては正確なイメージング解析ができない場合があり好ましくない。なお、ここで径とはピンホールが円形の場合は直径を表し、楕円の場合は長軸の直径、多角形の場合は対角線で最長の値をとるものである。

ピンホール内で交差し、通過した光は集光レンズ（凸レンズ）を用いて再度平行光とし、偏光板を透過させた後に、センサー表面に照射されることが好ましい。

本発明で用いる光源は安価なハロゲンランプが好ましい。中でも、正方形フィラメントを有するハロゲンランプは照度ムラが低減されており、非常に好ましい。ランプの寿命は１５００時間以上の寿命であることが好ましく、ランプの明るさを表す全光束は３００ルーメン以上であることが好ましい。光を導く方法として、光ファイバーを用いる方法も可能である。

このように、例えば小さな直径のピンホールを用い、フィラメント形状が正方形であるハロゲンランプを用いることで照度のばらつきを低減させた表面プラズモン共鳴装置を実現することができる。

その結果得られる偏光光束の照度は２０ルクス以上が好ましい。２０ルクス以上であると、ＳＰＲの反射像が波長フィルターを透過した後でも、市販の一般的なＣＣＤカメラで撮影可能である。しかし、光源として装置が簡易でかつ安価な白色光源を用いることと、均一に偏光光束を照射するために光をピンホールに通すため、照度を高くすることは高価であり、５００ルクス以下が好ましい。

チップからの反射光は波長フィルターに通した後にＣＣＤカメラで撮影され、特定の波長近辺の光のみが観察される。波長フィルターの中心波長は特に限定されるものではないが、ＳＰＲの感度が高い６５０ｎｍ−１０００ｎｍが選択される。中心波長７５０−９５０ｎｍが選択されると、さらに感度の高いＳＰＲとなる。波長フィルターの透過率が極大時の半分になる波長の波長幅を半値巾と呼ぶが、半値巾は小さいほうが波長の分布がシャープとなり好ましい。具体的には半値巾５０ｎｍ以下が好ましく、半値巾１５ｎｍ以下が特に好ましい。

ＣＣＤカメラで撮影された像はコンピュータに取り込まれ、ある部分の明るさの変化をリアルタイムで評価することや、画像処理により全体像の評価が可能である。こうして複数の物質を固定化したチップをスクリーニングすることや、表面に吸着する物体のモルホロジーを高感度に観察することができる。

本発明における表面プラズモン共鳴機器は、照度ムラの少なく、非常に性能の高いセンサーであり、各種の解析に好適に用いられる。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明は実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
光源には正方形フィラメント型ハロゲンランプ（細渕電球社製）を用いた。このランプは３０Ｗ、全光束は４４０ルーメンと高輝度であるにもかかわらず、平均寿命は２０００時間であり、分析機器にも用いることが可能である。

光源から５０ｍｍの位置に直径３０ｍｍφ、焦点距離５０ｍｍの球面平凸レンズ（シグマ光機社製ＳＬＳＱ３０−５０Ｐ）をレンズの平面側をランプに向けて設置し、光源からの光を平行光とした。前記球面平凸レンズからさらに３５ｍｍ離して、さらにもう一つ直径３０ｍｍφ、焦点距離５０ｍｍの球面平凸レンズ（シグマ光機社製ＳＬＳＱ３０−５０Ｐ）の球面側を光源に向けて設置した。この球面平凸レンズによってレンズから５０ｍｍの位置に集光され、その位置に直径２００μｍのピンホール（シグマ光機社製ＰＡ−２００）を置いて光束をピンホールに通し、球面アロマティックレンズ（シグマ光機製ＤＬＢ−３０−５０ＰＭ）によって平行光とした後、有効径２４ｍｍφの近赤外偏光フィルター（シグマ光機社製ＳＰＦＮ−３０Ｃ−２６）によって２４ｍｍφの偏光平行光束を得た。この偏光平行光束の断面面積は４５２ｍｍ²であり、広範囲の領域を照射可能である。その明るさは感光部１０ｍｍφであるアズワン株式会社デジタル照度計ＬＭ−３３１で測定した場合、６０ルクスと本発明に必要な明るさを示していた。

１８ｍｍ四方で厚さ１ｍｍのＬａｋ１０スライド（ｎ_D＝１．７２０、松浪硝子工業社製）に３ｎｍクロムと４５ｎｍの金が蒸着されている金表面に、１１−メルカプトウンデカノールの自己組織化単分子層（ＳＡＭｓ）を形成したスライドをテスト用チップとして用いた。テスト用チップのガラス面にマッチングオイル（カーギル社製Ｍシリーズ、ｎＤ＝１．７２０）をつけ、一辺２５ｍｍの６０°分散プリズム（Ｏｒｉｅｌ社製４６１０６）と接触させ、本発明のＳＰＲ装置の偏光平行光束を導入した。テスト用チップのＳＡＭｓ面には水を接触させた。

金からの反射光束を８３０ｎｍの光干渉フィルター（シグマ光機社製ＶＰＦ−２５Ｃ−１０−４５−８３０００）によって８３０ｎｍ近傍の波長光を取り出し、ＣＣＴＶレンズ（モリテックス社製ＭＴＥ−５５）により、完全な平行光のみを取り出してから、白黒ＣＣＤカメラ（東京電子工業社製ＣＳ８３３０Ｂ）で撮影した。装置の概要は図１に示す。このＣＣＤカメラは比較的安価であり、最低被写体照度は０．３ルクスである。ＳＰＲ測定にて像を検出することが可能であった。

シグナルのばらつきを評価するために、テストチップのＳＡＭｓ面に水を１００μｌ／ｍｉｎの速度で流し、約５秒おきに画像を撮影した。撮影を継続したまま、１％エタノール水溶液をＳＡＭｓ表面に導入し、再度水を流した場合の屈折率変化によるＳＰＲシグナル変化を観察した。観察はＳＡＭｓ面のほぼ中心付近１０ｍｍ四方（＝１００ｍｍ²）の領域に相当する部分（測定領域）に関して行った。領域を１００等分（１０×１０）し、分割した各分割測定領域の中心に約直径４００μｍに相当する注目領域を１００個作成し、シグナルの変化を計測した。各点における１％エタノールによるシグナル変化を図２に示す。

１００個の注目領域における水と１％エタノールによるシグナルの平均は１６．９、標準偏差は１．２６であり、ＣＶは７．５％であった。シグナルばらつきが低減されたＳＰＲ装置を得ることができた。

［比較例］
光源には汎用ハロゲンランプ（フィリップス社製１３０７８）を用いた。このランプは２０Ｗである。このランプを用い、上記実施例の装置のピンホールを直径３００μｍ（シグマ光機社製ＰＡ−３００）に交換して同様の測定を行った。測定の結果を図３に示す。１００個の注目領域のシグナル平均は１５．８であり、実施例と同等であったが、標準偏差は２．９５であり、ＣＶは１８．７％と非常に悪い結果であった。さらに測定領域を狭めたが、ＣＶ値が１５％以下とできる領域を７０ｍｍ²以上で確保することはできなかった。

照度の高く、照度のムラがない偏光光束を得ることで、安価でかつ、シグナルのばらつきの少ないＳＰＲ装置を実現した。今後、生体分子の相互作用のスクリーニングに広く用いられていくと期待され産業界に寄与すること大である。

ＳＰＲイメージング装置の概観図 実施例における１％エタノールによるＳＰＲシグナルの変化 比較例における１％エタノールによるＳＰＲシグナルの変化

符号の説明

１ 正方形フィラメント型ハロゲンランプ
２ ＣＣＤカメラ
３ ＣＣＴＶレンズ
４ フローセル
５ ピンホール
６ 近赤外偏光フィルター
７ 干渉フィルター（８３０ｎｍ）
８ ６０度プリズム
９ 平凸レンズ
１０ 平凸レンズ

Claims (5)

1. 以下の（ａ）〜（ｃ）を少なくとも含むことを特徴とする表面プラズモン共鳴装置。
   （ａ）正方形フィラメント型ハロゲンランプ
   （ｂ）該正方形フィラメント型ハロゲンランプからの光を集光し通過させるための、穴の径が５０μｍ以上３００μｍ未満であるピンホール
   （ｃ）該ピンホールを通過したした後の光を照射させるための、部分内にアスペクト比０．５以上の長方形もしくは正方形である測定領域を有するセンサー表面
2. 測定領域の面積が７０ｍｍ ² 以上１００ｍｍ ² 以下の範囲であることを特徴とする請求項１に記載の表面プラズモン共鳴装置。
3. 正方形フィラメント型ハロゲンランプからの光を集光し、ピンホール内で交差させて通過した光を集光レンズで平行光とし、該平行光をセンサー表面に照射することを特徴とする請求項１又は２に記載の表面プラズモン共鳴装置。
4. 表面プラズモン共鳴シグナル変化を解析する方法において、正方形フィラメント型ハロゲンランプからの光を集光し、穴の径が５０μｍ以上３００μｍ未満であるピンホール内で交差させて通過した光を集光レンズで平行光とし、該平行光を部分内にアスペクト比０．５以上の長方形もしくは正方形である測定領域を有するセンサー表面に照射することを特徴とする方法。
5. 測定領域の面積が７０ｍｍ²以上１００ｍｍ²以下の範囲であることを特徴とする請求項４に記載の方法。