JP3898046B2 - ハイドロキシアパタイトの製造方法及びその利用 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、医歯薬分野の再建医療、再生医療、組織工学、ＤＤＳ（Drug Delivery System）等における支持体や基材等のみならず、遺伝子工学、生体成分の利用技術、生体とその成分の改造や模倣の技術等々、多種多様な、いわゆるバイオテクノロジー全領域に好適な、結晶の形状や性状等に係る特性が制御された制御ハイドロキシアパタイト及びその合成方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ハイドロキシアパタイト（以下、ＨＡｐと略記する）は生体硬組織（骨組織）の主成分であり、生体親和性が高いことから、骨補填材や代替骨といった生体材料の領域において広く利用されている。
【０００３】
このような生体材料は、強度を付与するために焼結されており、あくまでも生体組織再建用材料として使用され、一度移植された生体材料は半永久的に体内に残存し、体内で代謝されることはほとんどない。
【０００４】
しかし、生体組織再建用の治療としては、再建される組織の機能の復元だけでなく、機能および組織双方の復元が可能な組織再生材料の方が望ましい。
【０００５】
また、生体内局所における特異的な治療を目的としたドラッグデリバリーシステムやベクターを使った遺伝子導入に関する研究が高分子材料を中心に進められている。ＨＡｐもその可能性について検討されているが、現状では薬剤放出やプラスミドＤＮＡの放出制御はほとんどできない。
【０００６】
もし、ＨＡｐの溶解性を制御できれば、上記ＨＡｐからなる成形物を生体材料として生体内に移植した場合、体内に残存する時間を制御でき、骨再生に伴う生体材料の消失を実現できる。その際、溶出するカルシウムイオンや、りん酸イオンは新生骨生成において有効である。
【０００７】
さらに、薬剤やプラスミドＤＮＡの放出がＨＡｐの溶解に依存するように設定することで薬剤放出時間制御や遺伝子導入時間制御が可能となる。
【０００８】
また、結晶サイズの制御は薬剤、プラスミドＤＮＡの吸着量の制御において重要な要因である。もし、ＨＡｐの結晶サイズを制御できれば薬剤、ＤＮＡ吸着量の制御も可能になり、上記の溶解性制御と組み合わせることで真の薬剤や遺伝子の放出制御が可能となる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従来、ＨＡｐの溶解性制御では合成温度の低下やマグネシウム、鉄、炭酸といった各種イオンの置換により行われている。しかし、合成温度低下だけでは顕著な溶解性の向上には結びつかず、また、各種イオンの置換では骨再生の場に溶出するこれらイオンが再生骨の骨質を脆弱化させる可能性が懸念される。
【００１０】
また、ＨＡｐの結晶サイズの制御はその合成温度、圧力、時間の制御により行い、その場合結晶サイズの大きいものを作る点は容易であったが、さらに小さいものを作ることは困難であった。
【００１１】
従って、本発明の目的は、結晶サイズや、溶解性が制御された制御ＨＡｐ及びその合成方法を確立し、ヒトの硬組織再生や組織治癒促進等に有効な生体材料を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、ＨＡｐ合成時にアスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性アミノ酸、さらにグリシン、セリンといった中性アミノ酸を存在（共存）させることにより、ＨＡｐの結晶成長を阻害することを見いだした。
【００１３】
また、これらアミノ酸の存在量を変えることにより、ＨＡｐの結晶サイズ、溶解性が制御された制御ＨＡｐを得ることに成功した。
【００１４】
すなわち、本発明の制御ＨＡｐは、上記課題を解決するために、アミノ酸の共存下において合成されて得られたものであることを特徴としている。
【００１５】
上記制御ＨＡｐでは、アミノ酸により、得られた結晶の形状及び性状の少なくとも一方が制御されていることが好ましい。
【００１６】
上記構成によれば、アミノ酸の共存下において合成されて得られているので、得られた結晶の形状及び性状の少なくとも一方が制御されており、溶解性や、タンパク質の吸着能を調節、制御できる。
【００１７】
これにより、上記構成は、生体材料や、ＤＤＳのキャリアとして有効な機能性を所望する目的に合わせて付与できるから、生体材料や、ＤＤＳのキャリアの素材としてより好適なものとすることが可能となる。
【００１８】
本発明の制御ＨＡｐの合成方法は、前記課題を解決するために、アミノ酸の共存下にて生成させることを特徴としている。
【００１９】
上記合成方法では、アミノ酸の共存下にて生成させるとき、該アミノ酸を結晶中に含有又は包接又は吸着させることにより、得られた制御ＨＡｐの結晶の形状及び性状の少なくとも一方を制御することが好ましい。
【００２０】
上記方法によれば、生体材料や、ＤＤＳのキャリアの素材としてより好適な制御ＨＡｐが、アミノ酸の共存という簡便な方法にて得られるので、優れた機能を有する制御ＨＡｐの製造を簡素化できる。
【００２１】
上記制御ＨＡｐ及びその合成方法においては、アミノ酸が酸性アミノ酸及び中性アミノ酸の少なくとも一方であることが望ましい。
【００２２】
上記制御ＨＡｐ及びその合成方法では、アミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、及びセリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸であることが好ましい。
【００２３】
上記構成及び方法では、上記アミノ酸を用いることで、優れた機能を有する制御ＨＡｐがより確実に得られる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態に係る制御ＨＡｐの合成方法では、ＨＡｐの湿式合成法を用いている。上記湿式合成法は、非常に簡便でＨＡｐを安価かつ大量に合成できる方法である。
【００２５】
上記湿式合成法は、具体的にはカルシウム溶液とりん酸溶液を１０：６の割合のモル濃度比でｐＨを７．４以上の所定値に維持したバッファー液中に長時間にわたり順次滴下することにより、上記バッファー液中にＨＡｐが析出し、析出したＨＡｐを捕集する方法である。上記ＨＡｐとしては、炭酸アパタイト、オクタカルシウムフォスフェートであってもよい。
【００２６】
また、上記合成温度としては、特に限定されるものではないが、好ましくは０℃〜１００℃の範囲内、より好ましくは３０℃〜９０℃の範囲内である。
【００２７】
そして、本発明では、上記合成の際、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン及びセリンからなるアミノ酸群から少なくとも選択された１種をバッファー液中に存在（共存）させている。上記アミノ酸の濃度としては、０．００５ mol/L〜飽和濃度の範囲内であればよいが、より好ましくは０．０１ mol/L〜０．５ mol/Lである。
【００２８】
このようにアミノ酸の存在下にて合成すると、ＨＡｐの結晶成長が抑制され、結晶サイズの小さい、また、溶解性の高い制御ＨＡｐが合成できることが分かった。
【００２９】
この結晶サイズ、溶解性はバッファー液中に存在させるアミノ酸の量に依存し、このとき、最も顕著に影響を及ぼすのはアスパラギン酸であり、グルタミン酸、セリン、グリシンの順に効果が小さくなることが分かった。
【００３０】
次に、上記合成の具体例について説明する。図１に示すように、まず、濃度が１００ mmol/L の酢酸カルシウム一水和物水溶液１００ ml と、濃度が６０ mmol/Lのりん酸一アンモニウム水溶液１００ ml とを、同速度にて攪拌されている、濃度が１．３ mmol/Lの酢酸緩衝液（バッファー液）２００ ml 中に、チューブポンプ１により、順次滴下してＨＡｐを析出（生成）させ、沈殿物を分取して合成した。
【００３１】
合成温度は恒温槽２により６０℃±１℃に維持した。バッファー液は、ｐＨ計３によりモニターされ、ｐＨが７．４±０．１となるようにアンモニウム水溶液を上記モニター結果により制御されるチューブポンプ４によって維持された。
【００３２】
この合成時に、上記バッファー液中に、予め、１２種のアミノ酸をそれぞれ濃度０．５ mol/Lとなるように添加した。１２種のアミノ酸は、グリシン(Gly)、アラニン(Ala)、プロリン(Pro)、ハイドロキシプロリン(Hyp)、セリン(Ser)、バリン(Val)、スレオニン(Thr)、メチオニン(Met)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)である。
【００３３】
このようにして、アミノ酸の存在下（共存下）にて合成されたＨＡｐは、後述するように結晶性や溶解度が制御された本発明の制御ＨＡｐであり、蒸留水にて洗浄され、６０℃の恒温器内にて７２時間乾燥した。また、比較例として、アミノ酸をバッファー液内に添加せずに合成した比較ＨＡｐ（HAp-con)を別に調製した。
【００３４】
このようにして得られた制御ＨＡｐ及び比較ＨＡｐの結晶性を評価するために、それぞれを、Ｘ線回折法（使用機器：Rigaku Ultima+, 40kV and 30mA, CuKα）を用いて、Ｘ線回折図をそれぞれ得た。それらの結果を図２及び図３に示した。また、それらＸ線回折図に基づき、ＨＡｐのａ軸、ｃ軸にそれぞれ対応する、(300)、(002)反射から、半値幅の逆数をそれぞれ算出した。それらの結果を表１に示した。表１において、＊印を付与したものは、平均値がHAp-conに対して５％未満にて有意差を有することを示す。また。測定不能（Immeasurable）とは、ピークがブロード過ぎて算出できなかったことを示す。
【００３５】
【表１】
【００３６】
上記Ｘ線解析から、アミノ酸の存在下にて合成された制御ＨＡｐは、比較ＨＡｐと比べて、図２、図３及び表１に示すように、ピークがブロードとなっているので結晶性が相違することが分かり、それぞれのピークのシフトが観察されないことから、それぞれがＨＡｐであることが分かる。
【００３７】
特に、グリシン、セリン、アスパラギン酸、又はグルタミン酸の存在下にて合成された制御ＨＡｐ（以下、それぞれをHAp-Gly、HAp-Ser、HAp-Asp、HAp-Glu と記す)は、比較ＨＡｐと比べて、５％未満の有意差を有して、結晶性が顕著に低く（結晶歪みが大きく）なっていることが分かる。
【００３８】
これにより、本発明の制御ＨＡｐは、結晶性が顕著に低く（結晶歪みが大きく）なっていることにより、後述するように、イオン性物質、例えばタンパク質の吸着能を制御する（特に向上させる）ことができる。
【００３９】
また、上記Ｘ線回折図のピークから、HAp-con、HAp-Gly、HAp-Ser、HAp-Asp、HAp-Glu の結晶サイズを以下の式（Scherrerの式）によって求めた。
【００４０】
Ｄ＝０．９λ／βcosθ
ここで、λは波長、βは半値幅、θは入射角である。上記各結晶サイズは、以下の表２の通りであった。
【００４１】
【表２】
【００４２】
本発明の制御ＨＡｐ及びその合成方法では、アミノ酸の存在量が多いほど結晶サイズは小さくなり、最小で２００ｎｍのものを確実に、かつ容易に、安定して実現できる。
【００４３】
次に、上記制御ＨＡｐ及び比較ＨＡｐの組成を調べた。まず、１０ mg の試料を１０ ml の０．１Ｎの塩酸水溶液に溶解した。その溶解液から、原子吸光法(使用機器:Shimadzu AA6400F)を用いて試料中のカルシウム（Ｃａ）濃度をそれぞれ測定し、ＵＶ分光光度法(使用機器:Shimadzu UV-150-02)を用いて試料中のりん酸（Ｐ）濃度をそれぞれ測定した。それらの結果を表３に示した。表３において、＊印を付与したものは、平均値がHAp-conに対して５％未満にて有意差を有することを示す。
【００４４】
【表３】
【００４５】
上記結果から、HAp-Asp、HAp-Gluの存在下にて合成された制御ＨＡｐは、比較ＨＡｐに比べて、カルシウムイオンやりん酸イオンの組成成分が顕著に低くなっていることが分かる。
【００４６】
続いて、上記制御ＨＡｐ及び比較ＨＡｐを同定し、分子構造を調べるために、フーリエ変換赤外分光光度法(使用機器:Shimadzu FT-IR 8300M)を用いてＫＢｒペレット（試料濃度１０ mg/400mgKBr)中の試料の赤外吸収を調べた。それらの結果を図４に示した。
【００４７】
上記結果から、HAp-Gly、HAp-Ser、HAp-Asp、及びHAp-Gluでは、１６００〜１７００（１／cm）の範囲にて特異なピークが観察された。このピークは、アミノ酸のカルボキシル基のカルボニル（Ｃ＝Ｏ）に起因するものであり、洗浄後の制御ＨＡｐにおいても、アミノ酸（少なくともグリシン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸）を、ＨＡｐ結晶中への含有、吸着及び包接の少なくとも１つにて有していることが分かる。
【００４８】
さらに、添加濃度を０．０５、０．１５、０．２５、０．５ mol/Lとなるようにそれぞれ添加して各HAp-Aspを調製した。それらの結果を図５に示した。
【００４９】
上記結果から、添加濃度に応じてカルボキシル基のカルボニル（Ｃ＝Ｏ）を示すピークが大きくなっており、制御ＨＡｐ中のアミノ酸の定量が可能なことが分かる。
【００５０】
上記制御ＨＡｐ及び比較ＨＡｐの各沈殿物について、走査型電子顕微鏡（使用機器：Hitachi S-5000) を用いて、それらの結晶サイズや形態を観察した。
【００５１】
その観察結果から、HAp-Aspは、他の制御ＨＡｐのものより、厚さが薄いフレーク状(flake-like)の形態を有し、各結晶の境界は不明瞭なものとなっていた。HAp-Gly、HAp-Ser、及びHAp-Gluは、板状(plate-like) の形態を有し、比較ＨＡｐと比べて結晶サイズが小さいものであった。
【００５２】
最後に、上記制御ＨＡｐ及び比較ＨＡｐの溶解度を調べた。まず、１０ mg の試料を、それぞれ、１０ ml の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、濃度０．１ mol/L）に混合した混合液を調製し、３７℃の恒温器中にて１週間静置した。上記混合液の上清液から、前述の原子吸光法(使用機器:Shimadzu AA6400F)を用いて試料中のカルシウム濃度をそれぞれ測定し、それぞれ溶解度を調べた。それらの結果を図６に示した。
【００５３】
上記結果から、HAp-Ser、HAp-Asp、及びHAp-Gluは、結晶性が顕著に低く（結晶歪みが大きく）なっていることにより、HAp-conと比べて、５％未満の有意差を有して、見かけの溶解度が大きくなっており、用いた各アミノ酸に応じて相違しているのが分かる。それらの溶解度の大きさは、HAp-Asp＞HAp-Ser＞HAp-Glu＞HAp-Glyであった。それらの相違はＨＡｐと各アミノ酸との親和力の違いに起因すると考えられた。
【００５４】
本実施の形態では、定量試験は、４回ずつ繰り返し行った。それらの結果の平均値及び標準偏差値を算出し、平均値を結果値とした。上記試験データは、因子分析（factor analysis of variance:ANOVA)により統計的に分析された。試験結果においては、上記平均値と標準偏差値を用いて、各平均値間の９５％以上の有意差を検定する方法としてシェフ（Scheff）のF-test法を用いた。
【００５５】
次に、HAp-con、及びHAp-Aspを各合成温度（前記の６０℃に加えて８０℃、４０℃）及びアミノ酸濃度（０．２５ mol/L）にて、他は前記と同様にしてそれぞれ調製した。それらを前述のＸ線回折法によりそれぞれ調べた結果について図７及び図８にそれぞれ示した。上記結果から、アミノ酸の存在下でのＨＡｐ 合成が、ＨＡｐ結晶性の制御に対して有効であることが分かる。
【００５６】
また、上述した、各合成温度にて合成された、HAp-con、及びHAp-Aspに関する、酢酸溶液（ｐＨ５）中におけるカルシウム（Ｃａ）の溶出量をそれぞれ調べた結果を図９に示した。上記結果から、HAp-Aspは、HAp-conと比べて、有意に、Ｃａの溶出量（放出量）が大きいことが分かる。
【００５７】
さらに、上述した、各合成温度にて合成された、HAp-con、及びHAp-Aspに関する、比表面積をそれぞれ調べた結果を図１０に示した。上記結果から、HAp-Aspは、HAp-conと比べて、有意に比表面積（吸着能）が大きいことが分かる。
【００５８】
続いて、上述した、各合成温度にて合成された、HAp-con、及びHAp-Aspに関する、塩基性タンパク質の吸着能を調べた結果を説明する。
【００５９】
まず、シトクロームｃ（塩基性タンパク質、ｐＩ＝１０、ＭＷ＝１万）の水溶液中に、上記のHAp-con、及びHAp-Aspをそれぞれ浸漬（３７℃、４時間）、遠心分離後、上澄み液溶液中の残留タンパク質量を定量して、吸着量をそれぞれ調べた。それらの結果を、図１１に示した。上記結果から、HAp-Aspは、HAp-conと比べて、有意に塩基性タンパク質の吸着能が大きいことが分かる。
【００６０】
また、図１０及び図１１の結果から、HAp-con、及びHAp-Aspでは比表面積と上記吸着能との間に正の良好な相関性があることが分かる。
【００６１】
さらに、上記のようにタンパク質を固定化したHAp-Aspを、in vitroにて溶解実験したところ、ＨＡｐの溶解に伴い、溶液中への固定化されていたタンパク質の放出が確認され、その放出はＨＡｐが完全に溶解するまで持続したことを確かめた。
【００６２】
このようにアミノ酸の存在下（共存下）で、ＨＡｐを生成、結晶化、合成して得られた制御ＨＡｐにより、得られた制御ＨＡｐの結晶形態（針状、花弁（flake)状、プレート状、不定形等）、結晶サイズ、溶解度（水溶性）の少なくとも１つを、アミノ酸の種類と濃度とにより所望する目的に合うように制御できる。
【００６３】
よって、上記制御ＨＡｐは、溶解能や、タンパク質吸着能が多様に異なる機能性を合目的に有することができて、医歯薬分野の再建医療、再生医療、組織工学、ＤＤＳ（Drug Delivery System）等における支持体（担体）や基材等のみならず、遺伝子工学、生体成分の利用技術、生体とその成分の改造や模倣の技術等々、多種多様な、いわゆるバイオテクノロジー全領域に好適なものとなっている。
【００６４】
本発明の制御ＨＡｐの応用例として、増殖因子のキャリアとして用いることが挙げられる。上記の増殖因子は、様々な細胞の分化、増殖を制御する働きをもつといわれるタンパク質であり、再生医学ではこれをうまく利用しようとする試みが多くなされている。最近では科研製薬から発売されたｂＦＧＦを利用したスプレーや大阪大学でのＨＧＦ投与などが挙げられる。
【００６５】
タンパク質はその構成アミノ酸の種類により酸性、中性、塩基性タンパク質に分類される。硬組織再生に有効とされるＢＭＰ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−βなど多くのタンパク質が塩基性タンパク質であること、増殖因子は少量で非常に高価（１ｍｇで数十万円）であることから本発明の制御ＨＡｐは、塩基性タンパク質の吸着能が大きいので、上記増殖因子の放出量の調整を容易化できて、上記増殖因子のキャリアとして極めて有効である。
【００６６】
また、他の応用例は、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）や、コントロールリリース（Controlled release）である。薬剤（ドラッグ）は投与後に体内を移動し、作用部位に到達して治療効果を発揮する。ＤＤＳは薬物を必要な部位に必要な量送ることができるように設計したシステムである。
【００６７】
コントロールリリースとは薬剤を必要な時間に必要な量だけ放出できるように制御することである。ＤＤＳ、コントロールリリース、又はそれらを組み合わせることにより、局所における効率の良い薬効の発現や副作用の抑制などが可能になる。
【００６８】
薬剤のキャリアとしての本発明の制御ＨＡｐは、その代謝性（溶解による消失性）を調節することにより、薬剤の放出を制御することが可能となっているので、必要時には保持した薬剤を順次放出し、治療完了後には消失させるように設定できて、ＤＤＳ、コントロールリリースのキャリアとして好適なものとなっている。
【００６９】
ところで、生体硬組織の主成分であるＨＡｐは、エナメル質では９７％以上、象牙質、骨では７０％程度の構成成分となっており、生体親和性、骨接合性が高いことから硬組織用生体材料として多く利用されている。
【００７０】
本発明の制御ＨＡｐは、上記ＨＡｐと同等な生体親和性、骨接合性を有するものと、前述のＸ線回折結果から明らかであるので、骨の欠損（広領域でも狭領域でも）の場合、骨欠損部に埋入することにより骨の機能を持たせることができる人工材料である骨補填剤に好適に用いられる。
【００７１】
さらに、他の応用例としては、生体内に埋め込まれ、生体組織の再生に伴い消失するＧＴＲ(Guided Tissue Regeneration) 膜、細胞培養時の基質及び細胞用担体、プラスミドＤＮＡや、ＲＮＡを組み込んだ遺伝子治療用のベクター、液体クロマトグラフィー用のカラム充填材等が挙げられる。
【００７２】
上記ＧＴＲ膜としては、Ｉ型コラーゲン（豚皮由来）溶液と、本発明の制御ＨＡｐ（炭酸アパタイト、Ｃ／Ｐ比＝１０）のＮａＯＨ溶液（濃度２．５ mg/ml以下）とを互いに混合してゲル化させたものが挙げられる。このようなＧＴＲ膜は、制御ＨＡｐ含有量及びコラーゲン濃度を調整することにより、生体内での吸収性が調節可能なものである。
【００７３】
上記ＧＴＲ膜は、生体の損傷部分など補修に用いた場合、生体吸収性で、２次手術の必要が無く、制御ＨＡｐの溶出により局所のＣａイオン、Ｐイオン濃度が上昇し、局所の石灰化の促進を期待できる。
【００７４】
【発明の効果】
本発明の制御ＨＡｐは、以上のように、アミノ酸の共存下において合成されて得られた構成である。
【００７５】
それゆえ、上記構成は、生体材料や、ＤＤＳのキャリアとして有効な機能性を所望する目的に合わせて付与できるから、生体材料や、ＤＤＳのキャリアの素材としてより好適なものにできるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の制御ＨＡｐにおける製造装置の概略構成図である。
【図２】上記制御ＨＡｐの一部、及び比較ＨＡｐのＸ線回折図である。
【図３】上記制御ＨＡｐの残りのＸ線回折図である。
【図４】上記制御ＨＡｐの一部（HAp-Asp、HAp-Ser、HAp-Glu、HAp-Gly）及び比較ＨＡｐのＩＲ測定結果を示すグラフである。
【図５】上記HAp-Aspにおける、添加濃度の違いに対応した、ＩＲ測定結果の変化を示すグラフである。
【図６】上記制御ＨＡｐの一部（HAp-Asp、HAp-Ser、HAp-Glu、HAp-Gly）及び比較ＨＡｐの溶解度を示すグラフである。
【図７】上記比較ＨＡｐの各合成温度でのＸ線回折図である。
【図８】上記HAp-Aspの各合成温度でのＸ線回折図である。
【図９】上記HAp-Aspと上記比較ＨＡｐとにおけるＣａ放出量を示すグラフである。
【図１０】上記HAp-Aspと上記比較ＨＡｐとにおける、比表面積を示すグラフである。
【図１１】上記HAp-Aspと上記比較ＨＡｐとにおける、タンパク質吸着量を示すグラフである。
【発明の属する技術分野】
本発明は、医歯薬分野の再建医療、再生医療、組織工学、ＤＤＳ（Drug Delivery System）等における支持体や基材等のみならず、遺伝子工学、生体成分の利用技術、生体とその成分の改造や模倣の技術等々、多種多様な、いわゆるバイオテクノロジー全領域に好適な、結晶の形状や性状等に係る特性が制御された制御ハイドロキシアパタイト及びその合成方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
ハイドロキシアパタイト（以下、ＨＡｐと略記する）は生体硬組織（骨組織）の主成分であり、生体親和性が高いことから、骨補填材や代替骨といった生体材料の領域において広く利用されている。
【０００３】
このような生体材料は、強度を付与するために焼結されており、あくまでも生体組織再建用材料として使用され、一度移植された生体材料は半永久的に体内に残存し、体内で代謝されることはほとんどない。
【０００４】
しかし、生体組織再建用の治療としては、再建される組織の機能の復元だけでなく、機能および組織双方の復元が可能な組織再生材料の方が望ましい。
【０００５】
また、生体内局所における特異的な治療を目的としたドラッグデリバリーシステムやベクターを使った遺伝子導入に関する研究が高分子材料を中心に進められている。ＨＡｐもその可能性について検討されているが、現状では薬剤放出やプラスミドＤＮＡの放出制御はほとんどできない。
【０００６】
もし、ＨＡｐの溶解性を制御できれば、上記ＨＡｐからなる成形物を生体材料として生体内に移植した場合、体内に残存する時間を制御でき、骨再生に伴う生体材料の消失を実現できる。その際、溶出するカルシウムイオンや、りん酸イオンは新生骨生成において有効である。
【０００７】
さらに、薬剤やプラスミドＤＮＡの放出がＨＡｐの溶解に依存するように設定することで薬剤放出時間制御や遺伝子導入時間制御が可能となる。
【０００８】
また、結晶サイズの制御は薬剤、プラスミドＤＮＡの吸着量の制御において重要な要因である。もし、ＨＡｐの結晶サイズを制御できれば薬剤、ＤＮＡ吸着量の制御も可能になり、上記の溶解性制御と組み合わせることで真の薬剤や遺伝子の放出制御が可能となる。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
従来、ＨＡｐの溶解性制御では合成温度の低下やマグネシウム、鉄、炭酸といった各種イオンの置換により行われている。しかし、合成温度低下だけでは顕著な溶解性の向上には結びつかず、また、各種イオンの置換では骨再生の場に溶出するこれらイオンが再生骨の骨質を脆弱化させる可能性が懸念される。
【００１０】
また、ＨＡｐの結晶サイズの制御はその合成温度、圧力、時間の制御により行い、その場合結晶サイズの大きいものを作る点は容易であったが、さらに小さいものを作ることは困難であった。
【００１１】
従って、本発明の目的は、結晶サイズや、溶解性が制御された制御ＨＡｐ及びその合成方法を確立し、ヒトの硬組織再生や組織治癒促進等に有効な生体材料を提供することである。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
発明者らは、ＨＡｐ合成時にアスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性アミノ酸、さらにグリシン、セリンといった中性アミノ酸を存在（共存）させることにより、ＨＡｐの結晶成長を阻害することを見いだした。
【００１３】
また、これらアミノ酸の存在量を変えることにより、ＨＡｐの結晶サイズ、溶解性が制御された制御ＨＡｐを得ることに成功した。
【００１４】
すなわち、本発明の制御ＨＡｐは、上記課題を解決するために、アミノ酸の共存下において合成されて得られたものであることを特徴としている。
【００１５】
上記制御ＨＡｐでは、アミノ酸により、得られた結晶の形状及び性状の少なくとも一方が制御されていることが好ましい。
【００１６】
上記構成によれば、アミノ酸の共存下において合成されて得られているので、得られた結晶の形状及び性状の少なくとも一方が制御されており、溶解性や、タンパク質の吸着能を調節、制御できる。
【００１７】
これにより、上記構成は、生体材料や、ＤＤＳのキャリアとして有効な機能性を所望する目的に合わせて付与できるから、生体材料や、ＤＤＳのキャリアの素材としてより好適なものとすることが可能となる。
【００１８】
本発明の制御ＨＡｐの合成方法は、前記課題を解決するために、アミノ酸の共存下にて生成させることを特徴としている。
【００１９】
上記合成方法では、アミノ酸の共存下にて生成させるとき、該アミノ酸を結晶中に含有又は包接又は吸着させることにより、得られた制御ＨＡｐの結晶の形状及び性状の少なくとも一方を制御することが好ましい。
【００２０】
上記方法によれば、生体材料や、ＤＤＳのキャリアの素材としてより好適な制御ＨＡｐが、アミノ酸の共存という簡便な方法にて得られるので、優れた機能を有する制御ＨＡｐの製造を簡素化できる。
【００２１】
上記制御ＨＡｐ及びその合成方法においては、アミノ酸が酸性アミノ酸及び中性アミノ酸の少なくとも一方であることが望ましい。
【００２２】
上記制御ＨＡｐ及びその合成方法では、アミノ酸がアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、及びセリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸であることが好ましい。
【００２３】
上記構成及び方法では、上記アミノ酸を用いることで、優れた機能を有する制御ＨＡｐがより確実に得られる。
【００２４】
【発明の実施の形態】
本発明の実施の形態に係る制御ＨＡｐの合成方法では、ＨＡｐの湿式合成法を用いている。上記湿式合成法は、非常に簡便でＨＡｐを安価かつ大量に合成できる方法である。
【００２５】
上記湿式合成法は、具体的にはカルシウム溶液とりん酸溶液を１０：６の割合のモル濃度比でｐＨを７．４以上の所定値に維持したバッファー液中に長時間にわたり順次滴下することにより、上記バッファー液中にＨＡｐが析出し、析出したＨＡｐを捕集する方法である。上記ＨＡｐとしては、炭酸アパタイト、オクタカルシウムフォスフェートであってもよい。
【００２６】
また、上記合成温度としては、特に限定されるものではないが、好ましくは０℃〜１００℃の範囲内、より好ましくは３０℃〜９０℃の範囲内である。
【００２７】
そして、本発明では、上記合成の際、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン及びセリンからなるアミノ酸群から少なくとも選択された１種をバッファー液中に存在（共存）させている。上記アミノ酸の濃度としては、０．００５ mol/L〜飽和濃度の範囲内であればよいが、より好ましくは０．０１ mol/L〜０．５ mol/Lである。
【００２８】
このようにアミノ酸の存在下にて合成すると、ＨＡｐの結晶成長が抑制され、結晶サイズの小さい、また、溶解性の高い制御ＨＡｐが合成できることが分かった。
【００２９】
この結晶サイズ、溶解性はバッファー液中に存在させるアミノ酸の量に依存し、このとき、最も顕著に影響を及ぼすのはアスパラギン酸であり、グルタミン酸、セリン、グリシンの順に効果が小さくなることが分かった。
【００３０】
次に、上記合成の具体例について説明する。図１に示すように、まず、濃度が１００ mmol/L の酢酸カルシウム一水和物水溶液１００ ml と、濃度が６０ mmol/Lのりん酸一アンモニウム水溶液１００ ml とを、同速度にて攪拌されている、濃度が１．３ mmol/Lの酢酸緩衝液（バッファー液）２００ ml 中に、チューブポンプ１により、順次滴下してＨＡｐを析出（生成）させ、沈殿物を分取して合成した。
【００３１】
合成温度は恒温槽２により６０℃±１℃に維持した。バッファー液は、ｐＨ計３によりモニターされ、ｐＨが７．４±０．１となるようにアンモニウム水溶液を上記モニター結果により制御されるチューブポンプ４によって維持された。
【００３２】
この合成時に、上記バッファー液中に、予め、１２種のアミノ酸をそれぞれ濃度０．５ mol/Lとなるように添加した。１２種のアミノ酸は、グリシン(Gly)、アラニン(Ala)、プロリン(Pro)、ハイドロキシプロリン(Hyp)、セリン(Ser)、バリン(Val)、スレオニン(Thr)、メチオニン(Met)、アスパラギン酸(Asp)、グルタミン酸(Glu)、アルギニン(Arg)、ヒスチジン(His)である。
【００３３】
このようにして、アミノ酸の存在下（共存下）にて合成されたＨＡｐは、後述するように結晶性や溶解度が制御された本発明の制御ＨＡｐであり、蒸留水にて洗浄され、６０℃の恒温器内にて７２時間乾燥した。また、比較例として、アミノ酸をバッファー液内に添加せずに合成した比較ＨＡｐ（HAp-con)を別に調製した。
【００３４】
このようにして得られた制御ＨＡｐ及び比較ＨＡｐの結晶性を評価するために、それぞれを、Ｘ線回折法（使用機器：Rigaku Ultima+, 40kV and 30mA, CuKα）を用いて、Ｘ線回折図をそれぞれ得た。それらの結果を図２及び図３に示した。また、それらＸ線回折図に基づき、ＨＡｐのａ軸、ｃ軸にそれぞれ対応する、(300)、(002)反射から、半値幅の逆数をそれぞれ算出した。それらの結果を表１に示した。表１において、＊印を付与したものは、平均値がHAp-conに対して５％未満にて有意差を有することを示す。また。測定不能（Immeasurable）とは、ピークがブロード過ぎて算出できなかったことを示す。
【００３５】
【表１】
上記Ｘ線解析から、アミノ酸の存在下にて合成された制御ＨＡｐは、比較ＨＡｐと比べて、図２、図３及び表１に示すように、ピークがブロードとなっているので結晶性が相違することが分かり、それぞれのピークのシフトが観察されないことから、それぞれがＨＡｐであることが分かる。
【００３７】
特に、グリシン、セリン、アスパラギン酸、又はグルタミン酸の存在下にて合成された制御ＨＡｐ（以下、それぞれをHAp-Gly、HAp-Ser、HAp-Asp、HAp-Glu と記す)は、比較ＨＡｐと比べて、５％未満の有意差を有して、結晶性が顕著に低く（結晶歪みが大きく）なっていることが分かる。
【００３８】
これにより、本発明の制御ＨＡｐは、結晶性が顕著に低く（結晶歪みが大きく）なっていることにより、後述するように、イオン性物質、例えばタンパク質の吸着能を制御する（特に向上させる）ことができる。
【００３９】
また、上記Ｘ線回折図のピークから、HAp-con、HAp-Gly、HAp-Ser、HAp-Asp、HAp-Glu の結晶サイズを以下の式（Scherrerの式）によって求めた。
【００４０】
Ｄ＝０．９λ／βcosθ
ここで、λは波長、βは半値幅、θは入射角である。上記各結晶サイズは、以下の表２の通りであった。
【００４１】
【表２】
本発明の制御ＨＡｐ及びその合成方法では、アミノ酸の存在量が多いほど結晶サイズは小さくなり、最小で２００ｎｍのものを確実に、かつ容易に、安定して実現できる。
【００４３】
次に、上記制御ＨＡｐ及び比較ＨＡｐの組成を調べた。まず、１０ mg の試料を１０ ml の０．１Ｎの塩酸水溶液に溶解した。その溶解液から、原子吸光法(使用機器:Shimadzu AA6400F)を用いて試料中のカルシウム（Ｃａ）濃度をそれぞれ測定し、ＵＶ分光光度法(使用機器:Shimadzu UV-150-02)を用いて試料中のりん酸（Ｐ）濃度をそれぞれ測定した。それらの結果を表３に示した。表３において、＊印を付与したものは、平均値がHAp-conに対して５％未満にて有意差を有することを示す。
【００４４】
【表３】
上記結果から、HAp-Asp、HAp-Gluの存在下にて合成された制御ＨＡｐは、比較ＨＡｐに比べて、カルシウムイオンやりん酸イオンの組成成分が顕著に低くなっていることが分かる。
【００４６】
続いて、上記制御ＨＡｐ及び比較ＨＡｐを同定し、分子構造を調べるために、フーリエ変換赤外分光光度法(使用機器:Shimadzu FT-IR 8300M)を用いてＫＢｒペレット（試料濃度１０ mg/400mgKBr)中の試料の赤外吸収を調べた。それらの結果を図４に示した。
【００４７】
上記結果から、HAp-Gly、HAp-Ser、HAp-Asp、及びHAp-Gluでは、１６００〜１７００（１／cm）の範囲にて特異なピークが観察された。このピークは、アミノ酸のカルボキシル基のカルボニル（Ｃ＝Ｏ）に起因するものであり、洗浄後の制御ＨＡｐにおいても、アミノ酸（少なくともグリシン、セリン、アスパラギン酸、グルタミン酸）を、ＨＡｐ結晶中への含有、吸着及び包接の少なくとも１つにて有していることが分かる。
【００４８】
さらに、添加濃度を０．０５、０．１５、０．２５、０．５ mol/Lとなるようにそれぞれ添加して各HAp-Aspを調製した。それらの結果を図５に示した。
【００４９】
上記結果から、添加濃度に応じてカルボキシル基のカルボニル（Ｃ＝Ｏ）を示すピークが大きくなっており、制御ＨＡｐ中のアミノ酸の定量が可能なことが分かる。
【００５０】
上記制御ＨＡｐ及び比較ＨＡｐの各沈殿物について、走査型電子顕微鏡（使用機器：Hitachi S-5000) を用いて、それらの結晶サイズや形態を観察した。
【００５１】
その観察結果から、HAp-Aspは、他の制御ＨＡｐのものより、厚さが薄いフレーク状(flake-like)の形態を有し、各結晶の境界は不明瞭なものとなっていた。HAp-Gly、HAp-Ser、及びHAp-Gluは、板状(plate-like) の形態を有し、比較ＨＡｐと比べて結晶サイズが小さいものであった。
【００５２】
最後に、上記制御ＨＡｐ及び比較ＨＡｐの溶解度を調べた。まず、１０ mg の試料を、それぞれ、１０ ml の酢酸緩衝液（ｐＨ５．０、濃度０．１ mol/L）に混合した混合液を調製し、３７℃の恒温器中にて１週間静置した。上記混合液の上清液から、前述の原子吸光法(使用機器:Shimadzu AA6400F)を用いて試料中のカルシウム濃度をそれぞれ測定し、それぞれ溶解度を調べた。それらの結果を図６に示した。
【００５３】
上記結果から、HAp-Ser、HAp-Asp、及びHAp-Gluは、結晶性が顕著に低く（結晶歪みが大きく）なっていることにより、HAp-conと比べて、５％未満の有意差を有して、見かけの溶解度が大きくなっており、用いた各アミノ酸に応じて相違しているのが分かる。それらの溶解度の大きさは、HAp-Asp＞HAp-Ser＞HAp-Glu＞HAp-Glyであった。それらの相違はＨＡｐと各アミノ酸との親和力の違いに起因すると考えられた。
【００５４】
本実施の形態では、定量試験は、４回ずつ繰り返し行った。それらの結果の平均値及び標準偏差値を算出し、平均値を結果値とした。上記試験データは、因子分析（factor analysis of variance:ANOVA)により統計的に分析された。試験結果においては、上記平均値と標準偏差値を用いて、各平均値間の９５％以上の有意差を検定する方法としてシェフ（Scheff）のF-test法を用いた。
【００５５】
次に、HAp-con、及びHAp-Aspを各合成温度（前記の６０℃に加えて８０℃、４０℃）及びアミノ酸濃度（０．２５ mol/L）にて、他は前記と同様にしてそれぞれ調製した。それらを前述のＸ線回折法によりそれぞれ調べた結果について図７及び図８にそれぞれ示した。上記結果から、アミノ酸の存在下でのＨＡｐ 合成が、ＨＡｐ結晶性の制御に対して有効であることが分かる。
【００５６】
また、上述した、各合成温度にて合成された、HAp-con、及びHAp-Aspに関する、酢酸溶液（ｐＨ５）中におけるカルシウム（Ｃａ）の溶出量をそれぞれ調べた結果を図９に示した。上記結果から、HAp-Aspは、HAp-conと比べて、有意に、Ｃａの溶出量（放出量）が大きいことが分かる。
【００５７】
さらに、上述した、各合成温度にて合成された、HAp-con、及びHAp-Aspに関する、比表面積をそれぞれ調べた結果を図１０に示した。上記結果から、HAp-Aspは、HAp-conと比べて、有意に比表面積（吸着能）が大きいことが分かる。
【００５８】
続いて、上述した、各合成温度にて合成された、HAp-con、及びHAp-Aspに関する、塩基性タンパク質の吸着能を調べた結果を説明する。
【００５９】
まず、シトクロームｃ（塩基性タンパク質、ｐＩ＝１０、ＭＷ＝１万）の水溶液中に、上記のHAp-con、及びHAp-Aspをそれぞれ浸漬（３７℃、４時間）、遠心分離後、上澄み液溶液中の残留タンパク質量を定量して、吸着量をそれぞれ調べた。それらの結果を、図１１に示した。上記結果から、HAp-Aspは、HAp-conと比べて、有意に塩基性タンパク質の吸着能が大きいことが分かる。
【００６０】
また、図１０及び図１１の結果から、HAp-con、及びHAp-Aspでは比表面積と上記吸着能との間に正の良好な相関性があることが分かる。
【００６１】
さらに、上記のようにタンパク質を固定化したHAp-Aspを、in vitroにて溶解実験したところ、ＨＡｐの溶解に伴い、溶液中への固定化されていたタンパク質の放出が確認され、その放出はＨＡｐが完全に溶解するまで持続したことを確かめた。
【００６２】
このようにアミノ酸の存在下（共存下）で、ＨＡｐを生成、結晶化、合成して得られた制御ＨＡｐにより、得られた制御ＨＡｐの結晶形態（針状、花弁（flake)状、プレート状、不定形等）、結晶サイズ、溶解度（水溶性）の少なくとも１つを、アミノ酸の種類と濃度とにより所望する目的に合うように制御できる。
【００６３】
よって、上記制御ＨＡｐは、溶解能や、タンパク質吸着能が多様に異なる機能性を合目的に有することができて、医歯薬分野の再建医療、再生医療、組織工学、ＤＤＳ（Drug Delivery System）等における支持体（担体）や基材等のみならず、遺伝子工学、生体成分の利用技術、生体とその成分の改造や模倣の技術等々、多種多様な、いわゆるバイオテクノロジー全領域に好適なものとなっている。
【００６４】
本発明の制御ＨＡｐの応用例として、増殖因子のキャリアとして用いることが挙げられる。上記の増殖因子は、様々な細胞の分化、増殖を制御する働きをもつといわれるタンパク質であり、再生医学ではこれをうまく利用しようとする試みが多くなされている。最近では科研製薬から発売されたｂＦＧＦを利用したスプレーや大阪大学でのＨＧＦ投与などが挙げられる。
【００６５】
タンパク質はその構成アミノ酸の種類により酸性、中性、塩基性タンパク質に分類される。硬組織再生に有効とされるＢＭＰ、ｂＦＧＦ、ＴＧＦ−βなど多くのタンパク質が塩基性タンパク質であること、増殖因子は少量で非常に高価（１ｍｇで数十万円）であることから本発明の制御ＨＡｐは、塩基性タンパク質の吸着能が大きいので、上記増殖因子の放出量の調整を容易化できて、上記増殖因子のキャリアとして極めて有効である。
【００６６】
また、他の応用例は、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）や、コントロールリリース（Controlled release）である。薬剤（ドラッグ）は投与後に体内を移動し、作用部位に到達して治療効果を発揮する。ＤＤＳは薬物を必要な部位に必要な量送ることができるように設計したシステムである。
【００６７】
コントロールリリースとは薬剤を必要な時間に必要な量だけ放出できるように制御することである。ＤＤＳ、コントロールリリース、又はそれらを組み合わせることにより、局所における効率の良い薬効の発現や副作用の抑制などが可能になる。
【００６８】
薬剤のキャリアとしての本発明の制御ＨＡｐは、その代謝性（溶解による消失性）を調節することにより、薬剤の放出を制御することが可能となっているので、必要時には保持した薬剤を順次放出し、治療完了後には消失させるように設定できて、ＤＤＳ、コントロールリリースのキャリアとして好適なものとなっている。
【００６９】
ところで、生体硬組織の主成分であるＨＡｐは、エナメル質では９７％以上、象牙質、骨では７０％程度の構成成分となっており、生体親和性、骨接合性が高いことから硬組織用生体材料として多く利用されている。
【００７０】
本発明の制御ＨＡｐは、上記ＨＡｐと同等な生体親和性、骨接合性を有するものと、前述のＸ線回折結果から明らかであるので、骨の欠損（広領域でも狭領域でも）の場合、骨欠損部に埋入することにより骨の機能を持たせることができる人工材料である骨補填剤に好適に用いられる。
【００７１】
さらに、他の応用例としては、生体内に埋め込まれ、生体組織の再生に伴い消失するＧＴＲ(Guided Tissue Regeneration) 膜、細胞培養時の基質及び細胞用担体、プラスミドＤＮＡや、ＲＮＡを組み込んだ遺伝子治療用のベクター、液体クロマトグラフィー用のカラム充填材等が挙げられる。
【００７２】
上記ＧＴＲ膜としては、Ｉ型コラーゲン（豚皮由来）溶液と、本発明の制御ＨＡｐ（炭酸アパタイト、Ｃ／Ｐ比＝１０）のＮａＯＨ溶液（濃度２．５ mg/ml以下）とを互いに混合してゲル化させたものが挙げられる。このようなＧＴＲ膜は、制御ＨＡｐ含有量及びコラーゲン濃度を調整することにより、生体内での吸収性が調節可能なものである。
【００７３】
上記ＧＴＲ膜は、生体の損傷部分など補修に用いた場合、生体吸収性で、２次手術の必要が無く、制御ＨＡｐの溶出により局所のＣａイオン、Ｐイオン濃度が上昇し、局所の石灰化の促進を期待できる。
【００７４】
【発明の効果】
本発明の制御ＨＡｐは、以上のように、アミノ酸の共存下において合成されて得られた構成である。
【００７５】
それゆえ、上記構成は、生体材料や、ＤＤＳのキャリアとして有効な機能性を所望する目的に合わせて付与できるから、生体材料や、ＤＤＳのキャリアの素材としてより好適なものにできるという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の制御ＨＡｐにおける製造装置の概略構成図である。
【図２】上記制御ＨＡｐの一部、及び比較ＨＡｐのＸ線回折図である。
【図３】上記制御ＨＡｐの残りのＸ線回折図である。
【図４】上記制御ＨＡｐの一部（HAp-Asp、HAp-Ser、HAp-Glu、HAp-Gly）及び比較ＨＡｐのＩＲ測定結果を示すグラフである。
【図５】上記HAp-Aspにおける、添加濃度の違いに対応した、ＩＲ測定結果の変化を示すグラフである。
【図６】上記制御ＨＡｐの一部（HAp-Asp、HAp-Ser、HAp-Glu、HAp-Gly）及び比較ＨＡｐの溶解度を示すグラフである。
【図７】上記比較ＨＡｐの各合成温度でのＸ線回折図である。
【図８】上記HAp-Aspの各合成温度でのＸ線回折図である。
【図９】上記HAp-Aspと上記比較ＨＡｐとにおけるＣａ放出量を示すグラフである。
【図１０】上記HAp-Aspと上記比較ＨＡｐとにおける、比表面積を示すグラフである。
【図１１】上記HAp-Aspと上記比較ＨＡｐとにおける、タンパク質吸着量を示すグラフである。
Claims (7)
- カルシウム溶液とリン酸溶液をバッファー液中に順次投入してハイドロキシアパタイトを製造する湿式合成法を用いており、
上記バッファー液はハイドロキシアパタイト合成の間に所定のｐＨに維持されており、かつ
上記バッファー液は、アミノ酸を含み、
さらに、種結晶を用いることなく、ハイドロキシアパタイトを製造することを特徴とする、溶解性及び／又はタンパク質の吸着能が制御されたハイドロキシアパタイトを製造する方法。 - 上記アミノ酸が、酸性アミノ酸及び中性アミノ酸の少なくとも一方であることを特徴とする請求項１に記載の、溶解性及び／又はタンパク質の吸着能が制御されたハイドロキシアパタイトを製造する方法。
- 上記アミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、及びセリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸である請求項１又は２に記載の、溶解性及び／又はタンパク質の吸着能が制御されたハイドロキシアパタイトを製造する方法。
- カルシウム溶液とリン酸溶液をバッファー液中に順次投入してハイドロキシアパタイトを製造する湿式合成法を用いており、
上記バッファー液はハイドロキシアパタイト合成の間に所定のｐＨに維持されており、かつ
上記バッファー液は、アミノ酸を含み、
さらに、種結晶を用いることなく、ハイドロキシアパタイトを製造することを特徴とする、ハイドロキシアパタイトの溶解性、及び／又は、タンパク質の吸着能を制御する方法。 - 上記アミノ酸が、酸性アミノ酸及び中性アミノ酸の少なくとも一方であることを特徴とする請求項４に記載の、ハイドロキシアパタイトの溶解性、及び／又は、タンパク質の吸着能を制御する方法。
- 上記アミノ酸が、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、及びセリンからなる群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸である請求項４又は５に記載の、ハイドロキシアパタイトの溶解性、及び／又は、タンパク質の吸着能を制御する方法。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の溶解性及び／又はタンパク質の吸着能が制御されたハイドロキシアパタイトを製造する方法によって得られることを特徴とする、溶解性及び／又はタンパク質の吸着能が制御されたハイドロキシアパタイト。
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