JP3894219B2 - キャピラリアレイ電気泳動装置及び電気泳動方法 - Google Patents

Description

本発明は、複数のキャピラリを一括して構成したキャピラリアレイを用いてＤＮＡ，蛋白質などの試料を電気泳動により分離・分析する電気泳動装置に関する。

ＤＮＡの塩基配列および塩基長の決定等を目的して、キャピラリを用いた電気泳動法が用いられている。ガラスキャピラリ中のポリアクリルアミド等のゲルに測定対象である
ＤＮＡを含む試料を注入して、キャピラリの両端部に電圧を印加する。試料中のＤＮＡ合成物はキャピラリ内を移動し、分子量の大きさ等によって分離されキャピラリ内にＤＮＡバンドを生じる。各ＤＮＡバンドには蛍光色素が加えられており、レーザ光の照射によって発色し、これを蛍光計測手段で読み取り、ＤＮＡの配列を決定する。蛋白質の分離・分析も同様に行って、蛋白質の構成を調べることができる。

レーザ光の照射方式のひとつは以下のようなものである。複数のキャピラリからなるキャピラリアレイにおいて、キャピラリの表面のポリイミドなどの被覆を除去し、検出部とする。検出部の両側あるいは一方の端のキャピラリに、それぞれレーザ光を照射し、前記一方あるいは両側に照射したレーザ光のそれぞれが、複数のキャピラリを横断する構成をとる方式がある。

前記従来方式のレーザ光照射方式において、キャピラリアレイの一方の端からレーザ光を照射する場合には、キャピラリアレイ表面からの反射光がレーザ発振器に戻り、レーザの発振を不安定にするという問題がある。また、キャピラリアレイの両側の端からレーザ光を照射する場合には、キャピラリアレイ表面からの反射光だけでなく、キャピラリアレイを通過した光がレーザ発振器に戻ってしまいレーザ発振を不安定にするという問題がある。

本発明において、キャピラリアレイからの戻り光及び反射光の問題を解決する方法として、少なくとも下記の３つの方法がある。本明細書において、キャピラリアレイは平面を持っていないが、複数のキャピラリを平行に整列して、キャピラリの中心軸がほぼ平面上に並んでいるため、「キャピラリアレイの平面（アレイ面）」と表現した。
（１）キャピラリアレイの平面に対して平行方向に入射する照射光軸を、キャピラリの長手方向にたいして垂直な方向に傾斜させる。これによってレーザ光軸とキャピラリによる反射光が重ならないので、ノイズを拾わない。
（２）キャピラリアレイの平面に対して平行方向に入射する照射光軸を、アレイの平面にたいして傾斜させる。この場合、照射光をアレイの両端から照射するので、一方の照射光スポットを見ると、アレイを通過した光と入射光とが隣接している。
（３）キャピラリアレイの平面の両端から該平面に対して平行方向に交叉する２つの照射光軸の入射角度がキャピラリの長手方向にたいして互いに異なる。

本発明は、上記構成（１）−（３）の少なくとも１つを採用するものである。特に上記２つまたは３つの構成を組み合わせることにより、照射光の戻り光による障害を非常によく解消できる。

以上の事から、本発明の一態様においては、上記課題を解決するため、キャピラリアレイ電気泳動装置のうちキャピラリアレイの一方あるいは両側の端のキャピラリにレーザ光を照射し、前記レーザ光が複数のキャピラリを横断する構成をとるキャピラリアレイ電気泳動装置であり、キャピラリとレーザの間の光軸上にあってキャピラリから最も遠い位置にあるレーザ集光手段とレーザの間で、レーザ光が入射するキャピラリ面によるレーザの反射光と入射レーザ光の重なりがないことを特徴とするキャピラリアレイ電気泳動装置を提供する。

キャピラリと入射レーザ光の光軸が垂直ではない場合にこの条件が満足される。キャピラリが一本だけの電気泳動装置において、入射光の光軸とキャピラリがほぼ垂直ではないものがある。但し、この構成の目的は、一本のキャピラリ電気泳動装置であり、光軸を傾けることによって、直接の反射光が検出系に入射することを防ぐ場合がある。本発明においてレーザ光軸を傾ける目的は、この従来技術とは根本的に異なる。本実施例においては、直接の反射光が蛍光の集光レンズから外れる程度に大きく傾ける必要がある。例えば、検出系のＦ値が１.４ の場合には、約２０°以上の入射角を持たせる必要がある。しかしながら、本発明の場合には、集光レンズの焦点距離が５０mmの場合には、１°から２°程度の傾きで十分である。

また、本発明は、キャピラリアレイ電気泳動装置のうちキャピラリアレイの両側の端のキャピラリに、それぞれレーザ光を照射し、前記２つのレーザ光のそれぞれが、複数のキャピラリを横断する構成をとるキャピラリアレイ電気泳動装置において、前記キャピラリアレイが形成する平面と、前記入射レーザ光とが、平行ではないことを特徴とするキャピラリアレイ電気泳動装置を提供する。基本的にレーザ光を分岐し、これらを、同軸に対向するように配置する場合には、レーザの戻り光が問題となる。しかしながら、キャピラリアレイにおいては、キャピラリを通過する光は、前記キャピラリアレイが形成する平面、および、キャピラリ中を進行する光軸と前記の通り傾いて入射する光のなす平面の２つの平面の交わりとして表現される直線を中心とする光軸を持つ。したがって、この点において、本発明による、キャピラリアレイにおいては、キャピラリ中においては同軸であるけれども、キャピラリ外の空間においては対向するレーザ光が同軸ではないという状況を作り出すことが出来る。

また、本発明は、キャピラリアレイ電気泳動装置のうちキャピラリアレイの両側の端のキャピラリに、それぞれレーザ光を照射し、前記２つのレーザ光のそれぞれが、複数のキャピラリを横断する構成をとるキャピラリアレイ電気泳動装置において、前記キャピラリアレイが形成する平面に対する前記２つの入射レーザ光の正射影がほぼ平行ではないことを特徴とするキャピラリアレイ電気泳動装置を提供する。

ここで前記のとおり、キャピラリアレイが形成する平面に対する前記２つの入射レーザ光の正射影がほぼ平行ではない場合には、以下のことが問題となる場合がある。２つのレーザ光が同軸である場合に比べて、２つのレーザ光を加えた場合のレーザビーム径が大きくなってしまうために、蛍光検出における空間分解能が低下する恐れがある。すなわち、電気泳動において、試料中のＤＮＡ合成物はキャピラリ内を移動し、分子量の大きさ等によってキャピラリ内で空間的に分離され、キャピラリ内にＤＮＡバンドを生じるわけであるが、これらのＤＮＡバンドの分解検出能力が低下する可能性がある。このような可能性を回避するために、前記２つのレーザ光の中心どうしがキャピラリアレイの中央付近で重なることが望ましい。このようにすることによって、レーザビーム径の拡大を最小限に食い止めることが出来る。

以上に示したレーザ光軸を実現する方法は以下のようなものである。キャピラリにレーザを集光するための、対向する２つのレーザ光に対するそれぞれの集光レンズをまず除去する。そして、前記対向する２つのレーザ光がほぼ平行になり、キャピラリ軸に対してほぼ垂直になるように調整する。その後で、キャピラリにレーザを集光するための集光レンズを２つのレーザ光のそれぞれに対して挿入する。キャピラリの蛍光検出部にレーザ光が入射するように、集光レンズの位置を調整する。

上記のレーザ光軸実現法においては、レーザ光をキャピラリの適正な場所に導入するために、レンズの位置を調整する。したがって、前記集光レンズに位置の微調整機能がついていることが望ましい。前記レーザ光軸方向については、例えば、集光レンズの焦点距離が５０mmである場合には、この方向について要求されるレンズの位置精度は１mm程度であるため、この方向についての位置調整機能は必ずしも必要ではない。しかしながら、レーザ光軸に直行する２軸については、キャピラリの内径／外径＝５μｍ／３００μｍの場合には１０μｍ程度の位置調整機能が要求される。この場合には、ピッチ０.５mm 程度のネジを集光レンズの位置の調整用のネジとすれば、この要求を満足することができる。

また、上記のレーザ光軸実現法において、対向する２つのレーザ光を適正な位置で互いにほぼ平行にするために、２つの互いにほぼ平行なレーザ光が通過するそれぞれの位置に、レーザ光の直径と同程度の大きさの穴を形成した板状の組をレーザ光軸調整治具として用いることによって、この調整を容易に行うことができる。

本発明においては、レーザ光軸とキャピラリ軸が直交していないため、キャピラリを水平に設置するようにする場合には、レーザ光軸が鉛直方向ではなくなってしまう。マルチキャピラリの検出手段としては、２次元のＣＣＤカメラを用いることが多い。２次元のうちの一方をキャピラリ配列方向に並べ、それぞれのキャピラリからの信号を検出する軸とし、もう一方の軸をそれぞれのキャピラリから発せられる蛍光の波長分散方向におく。すなわち、回折格子，プリズム等を用いて後者の方向に単一キャピラリからの発光を分散する方向とする。本発明においては、キャピラリとレーザ光軸はほぼ垂直ではないが、蛍光検出手段においてＣＣＤ(Charge Coupled Device) カメラを使用する電気泳動装置においては、ＣＣＤの画素格子は、キャピラリにほぼ平行にするのではなく、キャピラリを通過するレーザ光軸とほぼ平行であるほうが、ＣＣＤからのデータの取り込み上好都合である。

さらに、蛍光検出手段において回折格子あるいはプリズム等の波長分散手段を有する電気泳動装置においては、前記波長分散手段による波長分散方向とキャピラリを通過するレーザ光軸とがほぼ垂直であるほうが、ＣＣＤからのデータ取り込み上、好都合である。

本発明によれば、マルチキャピラリアレイに対してレーザ照射する場合の反射あるいは戻り光によりレーザ発振が不安定になるのを防ぐことができる。

［実施例１］
本発明の電気泳動装置の概観を図２に示す。キャピラリアレイ１の一方の端には、負電圧を印加できるように電極（試料導入端）２が形成されている。ＤＮＡを注入する際には、負電極２をＤＮＡサンプルを含む溶液に、また、注入したサンプルの電気泳動を行う際には、負電極をバッファ液３に浸して、電圧を印加する。キャピラリアレイ１のもう一方の端には、泳動媒体であるゲルをキャピラリに注入する手段であるゲルブロック４への接続部５が形成されている。キャピラリ内部の泳動媒体であるゲルをキャピラリ内に充填する際には、バルブ６を閉じ、シリンジ１０を押し込むことによって、シリンジ１０内のゲルをキャピラリ１内に注入する。電気泳動をする際には、バルブ６を開放し、バッファ３に浸った負電極２とバッファ１２に浸ったアース電極７との間に電圧を印加する。気体循環式の恒温槽１１によって、キャピラリ１を一定温度に保つ。

キャピラリアレイの検出部付近とレーザ光の導入経路の模式図を図３に示す。レーザ用のシャッタ，フィルタ等はこの分野で周知事項であり、本発明の直接の対象ではないので、簡略化のため、表示していない。図３（ａ）は本発明の電気泳動装置の主要部の概略正面図、図３（ｂ）はキャピラリアレイの検出部の上面図、図３（ｃ）はレーザ本体出射口に取り付けたピンホール板である。１６本のキャピラリ２１を、アレイ台２０上にならべて固定し、キャピラリアレイを形成している。アレイ台２０上の１６本のキャピラリの中心軸が形成する平面およびその平面を全空間に延長した仮想の平面を、以下、アレイ面
２２と呼ぶ。また、アレイ面内にあって、１６本のキャピラリ軸に垂直であり、検出部の中央を貫く仮想の直線を、以下光軸基本軸２８と呼ぶ（図３（ａ））。キャピラリは石英のガラス管がポリマ薄膜で覆われたものであるが、検出部２３においては、ポリマ被膜が除去され、石英がむき出しの状態になっている。石英管の内径／外径は５０／３２０μｍ、ポリマ薄膜を含めたキャピラリ外径は３６３μｍである。キャピラリのピッチはキャピラリ外径に等しく３６３μｍ、アレイの幅は３６３μｍ×１６＝５.８mmである。

キャピラリアレイにおける蛍光検出部２３に、アレイの片側側面からレーザ光２４を照射し、検出部２３から発せられる蛍光を観測することにより、ＤＮＡを検出する。レーザ光２４はレーザ集光レンズ２５（ｆ＝５０mm）によって集光される。アレイの端に位置し、レーザが導入されるキャピラリを以下、第１キャピラリ２６とする。レーザ集光レンズ２５と第１端キャピラリ２６の距離は５０mmであり、第１キャピラリ２６に導入されたレーザ光は、隣接するキャピラリに次々と伝搬し、１６本のキャピラリを横断する。

入射レーザの反射が、空気／キャピラリ外壁，キャピラリ内壁／ゲルの界面において発生する。特に前者の界面においては、屈折率が大きいために反射光強度が大きくなる。空気／外壁の界面は、一本のキャピラリについて２つあるので、１６本のキャピラリからは３２の空気／外壁界面からの反射がある。

本発明においては、図３（ａ）に示すとおり、１６本のキャピラリ軸の垂線に対し約
２°の角度３０をもって第１キャピラリ２６に入射する。レーザ光はアレイ面２２上にあり、アレイ面２２上で第１キャピラリに対し斜めに入射する。この斜め入射の結果、キャピラリアレイからの反射光２９は、入射レーザ光２４からずれることになる。反射光２９は、集光レンズ２５を通ると、入射レーザ光２４とほぼ平行になる。入射レーザ光２４と反射光２９の距離は、約４mmであった。レーザ本体３１のレーザ光出射口に直径１.４mm のピンホール３４を有するピンホール板３２を取り付け、ピンホールの中心とレーザ光の中心を合せた。ピンホール板３２上の反射光のスポット３５は、図３（ｃ）に示した通りであり、反射光２９がピンホール板３２によって遮られ、レーザ本体３１には戻らないことがわかる。以上の方法により、安定したレーザ発振を得ることができた。
［実施例２］
実施例１における１６本のキャピラリからの信号強度分布を図１８に示す。図１８からわかるように、キャピラリアレイの片側側面からのみレーザ光を導入する場合は、１６本のキャピラリからの信号強度比が大きくなる。本実施例では、キャピラリアレイの両側側面からレーザ光を導入し、１６本のキャピラリからの信号強度のバラツキを小さくする。

本発明の実施例２の模式図を図１に示す。キャピラリアレイの検出部付近とレーザ光の導入経路のみ表示し、レーザ用のシャッタ，フィルタ等は表示していない。キャピラリアレイの構成は実施例１と同様である。また、本実施例で特に定義されない部品名，用語に関する定義は、実施例１と同様である。レーザ光４０をハーフミラー４１によって２等分し、これら２つのレーザ光を、キャピラリアレイ４２に対して両側の側面から照射した。ハーフミラー４１による反射光をレーザ光４３，透過光をレーザ光４４とする。レーザ光４３の集光レンズを集光レンズ４５，レーザ光４４の集光レンズを集光レンズ４６とする。

アレイの端に位置し、レーザ光４３が導入されるキャピラリを以下、第１キャピラリ６５，レーザ光４４が導入されるキャピラリを以下、第１６キャピラリ６６とする。レーザ光４３の光軸構成は実施例１と同様である。また、レーザ光４４の光軸構成はキャピラリアレイについてレーザ光４３と対称である。レーザ光４３と４４は同軸になっており、一方のレーザ光のうちキャピラリを通過した光は、もう一方の入射レーザ光と同軸上を通り、レーザ本体に戻るように光軸を調整した。レーザ光４３，４４のそれぞれのキャピラリからの反射光４７，４８は、図１に示すように、２つのレーザ光のいずれとも同軸とはならない。実施例１と同様に、レーザ本体４９のレーザ光出射口に、直径１.４mm のピンホールを有するピンホール板５１を取り付け、反射光がレーザ発振器に戻ることを防いだ。キャピラリの透過光はレーザ本体の出射口に戻るものの、反射光がレーザ本体に戻ることを防いでいるため、比較的安定したレーザ発振を得ることができた。

本発明における蛍光検出系の模式図を図４（ａ）に示す。キャピラリアレイ４２における発光５３をｆ＝１.４ の発光集光レンズ５４によってほぼ平行光とし、これを透過型回折格子５５に導入する。回折格子５５により分光された光５６，５７は、結像レンズ５８によって、２次元ＣＣＤ５９上に焦点を結ぶ。回折格子５５による波長分散方向は、レーザ光軸に対しほぼ垂直である。これにより、２次元ＣＣＤ５９上の直交する二軸のうち、一方の軸は１６本のキャピラリの配列方向の空間座標を表し、もう一方の軸は、それぞれのキャピラリからの発光スペクトルを表す。

なお、図４（ｂ）の破線６０内に、キャピラリアレイ４２から回折格子５５に向かう方向で見た場合の、キャピラリアレイ４２およびレーザ光軸６１,回折格子５５,ＣＣＤ５９の回転角度を模式的に示す。回折格子の格子、およびＣＣＤの画素の格子が、キャピラリ軸にほぼ垂直ではなくレーザ光軸にほぼ平行になるように、回折格子およびＣＣＤを設置した。これにより、それぞれのキャピラリからの同一波長の信号は、ＣＣＤ画素の同一縦列６２上に並び、単一キャピラリからの発光スペクトルは、ＣＣＤ画素の同一横列６３上に並ぶ。像と画素のこのような関係はＣＣＤ画素のビニング処理、あるいは像の解析を行う上で有利である。

本発明の光軸を以下に示すように、図５（ａ）に示したピンホール板の組によって実現することができる。２つのレーザ集光レンズ４５，４６を電気泳動装置から取り外し、レーザ集光レンズ４５，４６を設置する場所のそれぞれに、図５（ａ）に示すようなピンホールを形成したピンホール板６７，６８を設置する。以下、ピンホール板とアレイ面２２の交わりをアレイ基準線６４，ピンホール板にほぼ垂直であって第一キャピラリの検出部の中心位置を通る直線と、ピンホール板の交点をピンホール基準点６９と呼ぶことにする。

ピンホール板６７，６８におけるピンホールの位置を、設定すべきキャピラリへの入射角度に応じて以下のように決定する。ピンホール板には２つのピンホール（ピンホール板６７にはピンホール７０，７１、ピンホール板６８にはピンホール７２，７３）があり、それらピンホールの中心をアレイ基準線６４上におき、２つのピンホールの中点がピンホール基準点６９になるようにする。ピンホール基準点６９からピンホールの中心までの距離７４をＸ、キャピラリへの入射角度７８をＴ１、［集光レンズ４５と第１キャピラリ
６５までの距離］＋［キャピラリアレイの幅］／２をＬ１とした場合に、
Ｘ＝Ｌ１×tanＴ１
の関係が成り立つようにする。すなわち、本実施例においては、Ｌ１＝５２.９mm（集光レンズ４５と第１キャピラリ６５までの距離が５０mm、キャピラリアレイの幅が５.８mm）、Ｔ１＝２.１°として、Ｘを１.９mmとした。

キャピラリアレイ取り付け場所７５からキャピラリアレイを取り外し、ピンホール板
６７，６８において、レーザ光４３がピンホール７０，７２を、レーザ光４４がピンホール７１，７３を通過し、２つのレーザ光がほぼ平行になるように図６（ａ）に示すようにレーザ光軸を調整する。ピンホール板６８を取り除き、集光レンズ４６、および、泳動媒体を注入したキャピラリアレイ４２を各取り付け場所に設置する（図６（ｂ））。このとき、レンズ４６の位置を以下のようにして定めた。

図６（ｂ）に示すように、Ｘ，Ｙ，Ｚ軸を取る。集光レンズ４６と第１６キャピラリ
６６までの距離が５０mmになるようにＺ軸方向を定める。Ｙ軸方向については、レーザ光４４がキャピラリアレイを透過した透過光強度が最大になるように集光レンズ４６の位置を調整する。集光レンズ４６の位置をＹ軸方向に移動することによって第１６キャピラリ６６上におけるレーザ光４４の照射位置がＹ軸方向に移動する。

本実施例においては、１０μｍ程度のレンズ位置調整機能が要求される。Ｘ軸方向については、レーザ光４４がキャピラリアレイを透過した透過光７７の中心がピンホール板
６７におけるピンホール７０の中心になるようにする。ピンホール板６７をはずし、集光レンズ４５をセットする（図６（ｃ））。Ｙ，Ｚ軸については、集光レンズ４６と同様にして設定する。Ｘ軸方向については、第１キャピラリから数えて８番目の第８キャピラリ上において、２つの照射レーザ光が重なり合うようにして位置を決定する。このとき第８キャピラリにおいてスペクトル幅の狭いラマン散乱をＣＣＤにより観測し、レーザ光４３による前記ラマンバンドと、レーザ光４４による前記ラマンバンドが重なるように調整すればよい。以上の手順により、上記の光軸を実現することができる。

なお、本発明においては、入射レーザ光が、キャピラリ表面によって一度だけ反射する反射光が蛍光検出系のレンズに入射する構成になっている。本発明においては、光学フィルタによって、この直接の反射光を除去している。
［実施例３］
本発明の実施例３の模式図を図９に示す。図９（ａ）は正面図、図９（ｂ）は側面図である。キャピラリアレイの検出部付近とレーザ光の導入経路のみ表示し、レーザ用のシャッタ，フィルタ等は表示していない。アレイ面２２上に入射レーザ光はなく、この平面に対して、約２°の角度９９を持ってレーザが入射する構成になっている。キャピラリアレイの構成は実施例２と同様である。また、本実施例で特に定義されない部品名、用語に関する定義は、実施例１あるいは２と同様である。

このような光軸を実現するために、図７（ａ）に示すピンホールを利用して光軸調整を以下のように行った。２つのレーザ集光レンズ４５，４６を電気泳動装置から取り外し、レーザ集光レンズ４５，４６を設置する場所のそれぞれに、図７（ａ）に示すピンホールを形成したピンホール板９０，９１を設置する。

ピンホール板におけるピンホールの位置を、設定すべきキャピラリへの入射角度に応じて以下のように決定する。ピンホール板には２つのピンホール（ピンホール板９０にはピンホール９２，９３、ピンホール板９１にはピンホール９４，９５）がある。アレイ基準線６４から距離Ｙ９７だけ離れたアレイ基準線にほぼ平行な直線（アレイ基準線６４に対して検出系の回折格子と反対側）を、以下、仰角線９６とする。また、ピンホール基準点６９を通るアレイ基準線６４の垂線と仰角線９６の交点を、以下、仰角線基準点９８とする。ピンホール９２の中心をピンホール基準点６９に、ピンホール９３の中心を仰角線基準点９８になるようにする。

ピンホール９２の中心と第１キャピラリ６５の中心軸から形成される平面とアレイ面のなす角度をＴ２，集光レンズと第１キャピラリアレイまでの距離をＬ２とした場合に、
Ｙ＝Ｌ２×tanＴ２
の関係が成り立つようにする。すなわち、本実施例においては、Ｌ２＝５０mm，Ｔ２＝
２.２°として、Ｙを１.９mmとした。ピンホール板９１上のピンホール９４，９５についても同様に設定する。

２箇所にセットしたピンホール板において、レーザ光４３，４４ともにピンホール９３，９５を通過し、２つのレーザ光が同軸になるように図８に示すようにレーザ光を調整する。図８（ａ）は正面図、図８（ｂ）は側面図である。ピンホール板９１を取り除き、集光レンズ４６をセットする。このとき、レンズの位置を以下のようにして定めた。図７に示すように、Ｘ，Ｙ，Ｚ軸を取る。Ｙ軸，Ｚ軸については実施例２と同様にして最適化する。Ｘ軸方向については、レーザ光４４がキャピラリアレイを透過した透過光１００の中心がピンホール板９０におけるピンホール９２の中心になるようにする（図７（ｂ））。ピンホール板９０をはずし、集光レンズ４５をセットする。Ｘ，Ｙ，Ｚ軸について、実施例２と同様にしてレンズの位置を最適化する。以上の手順により、ピンホールを用いることによって、ＸおよびＹを適当に設定することによって、キャピラリへの入射角度を任意に設定できる。

さらに、実施例１と同様に、レーザ本体のレーザ出射口に直径１.４mm のピンホール
３４を有するピンホール板３２を取り付けた。キャピラリを透過してレーザ本体に戻ってきた光のスポット１０１が、ピンホール板上で図７（ｃ）に示すように観測された。図７（ｄ）に示した、図７（ｃ）の破線１０２上の光強度分布からわかるように、本発明により、キャピラリの透過光の強度の最も強い領域が、レーザ本体に戻ることを避けることができる。このようにして、戻り光強度を低減することができ、レーザが不安定になるのを防ぐことができた。

本発明において、実施例２と実施例３の組み合わせが提供される。２つのレーザ集光レンズを電気泳動装置から取り外し、レーザ集光レンズを設置する場所のそれぞれに、ピンホール板を設置する。

ピンホール板におけるピンホールの位置を、設定すべきキャピラリへの入射角度に応じて以下のように決定する。ピンホール板には４つのピンホールがある。ピンホールの中心をアレイ基準線からある距離だけ離れたアレイ基準線にほぼ平行な直線（アレイ基準線に対して検出系における回折格子と反対側、以下この直線を仰角線とする）上におき、２つのピンホールの中点が、ピンホール基準位置を通るアレイ基準線の垂線と仰角線の交点
（以下、この点を仰角線基準点とする）になるようにする。ピンホールのそれぞれを通る仰角線の垂線とアレイ基準線の交点をきめる。仰角線基準点からピンホールの中心までの距離をＸ、入射レーザ光のアレイ面への正射影とキャピラリのなす角度をＴ１、仰角基準点と第１キャピラリの中心軸から形成される平面とアレイ面のなす角度をＴ２、集光レンズと第１キャピラリアレイまでの距離をＬ２とした場合に、
Ｘ＝Ｌ１×tanＴ１
Ｙ＝Ｌ２×tanＴ２
の関係が成り立つようにする。すなわち、本実施例においては、Ｌ１＝５３mm，Ｌ２＝
５０mm，Ｔ１＝２.１°，Ｔ２＝２.２°として、Ｘを１.９mm、Ｙを１.９mmとした。
［実施例４］
本発明の実施例４の模式図（キャピラリアレイの検出部付近とレーザ光の導入経路のみ表示し、レーザ用のシャッタ，フィルタ等は表示しない）を図１０に示す。図１３（ａ）は２枚のピンホール板によりレーザ光軸を調整する方法を示し、図１３（ｂ）は一方のピンホール板を集光レンズと交換した場合の、図１３（ｃ）は２個の集光レンズを挿入した場合の正面図、図１３（ｄ）はその側面図である。実施例２と同様、２つのレーザ光４３，４４は、ともに、アレイ面２２の平面内にある。しかしながら、実施例２とは異なり、これら２つのレーザ光は、同軸ではなく、０.８６° ずれている。入射レーザ光４３がキャピラリを透過した透過光１２４，レーザ光４４がキャピラリを透過した透過光１２２，キャピラリによるレーザ光４３の反射光１２５，キャピラリによるレーザ光４４の反射光１２６のいずれの中心軸も入射レーザ光４３，４４とは同軸ではない構成になっている。キャピラリアレイ４２に対して集光レンズ４５，４６の外側においては、これらの入射レーザ光，透過光，反射光はほぼ平行光となっている。なお、キャピラリアレイの構成は実施例２と同様である。また、本実施例で特に定義されない部品名、用語に関する定義は、実施例１，２，３と同様である。

このような光軸を実現するために、図１４（ａ）に示すピンホールを利用して光軸調整を以下のように行った。２つのレーザ集光レンズ４５，４６を電気泳動装置から取り外し、レーザ集光レンズ４５，４６を設置する場所のそれぞれに、図１４（ａ）に示すようなピンホールを形成したピンホール板１３０，１３１を設置する。

ピンホール板におけるピンホールの位置を、設定すべき２つのレーザのずれ角度に応じて以下のように決定する。ピンホール板には２つのピンホール（ピンホール板１３０にはピンホール１３２，１３３、ピンホール板１３１にはピンホール１３４，１３５）があり、それらの中心をアレイ基準線６４上におき、２つのピンホールの中点がピンホール基準点６９になるようにする。ピンホール基準点６９からピンホールの中心までの距離１３６をｄＸ、２つのレーザのずれ角度１３７を２×ｄＴ１、［集光レンズ４５と第１キャピラリ６５までの距離］＋［キャピラリアレイの幅］／２をＬ１とした場合に、
ｄＸ＝Ｌ１×tan(ｄＴ１)
の関係が成り立つようにする。すなわち、本実施例においては、Ｌ１＝５２.９mm（集光レンズ４５と第１キャピラリ６５までの距離が５０mm、キャピラリアレイの幅が５.８mm），ｄＴ１＝０.８６°として、ｄＸを０.４mmとした。なお、各ピンホールの直径を0.5
mmとした。

キャピラリアレイ取り付け場所７５からキャピラリアレイを取り外し、２箇所にセットしたピンホール板において、レーザ光４３，４４の両方が、ピンホール１３３，１３５を通過し、２つのレーザ光が同軸になるように図１３（ａ）に示すようにレーザ光を調整する。ピンホール板１３１を取り除き、集光レンズ４６、および、泳動媒体を注入したキャピラリアレイ４２を各取り付け場所に設置する（図１３（ｂ））。このとき、集光レンズ４６の位置を以下のようにして定めた。図１３に示すように、Ｘ，Ｙ，Ｚ軸を取る。Ｙ，Ｚ軸については、実施例２と同様である。

Ｘ軸方向については、レーザ光４４がキャピラリアレイを透過した透過光１２２の中心がピンホール板１３０におけるピンホール１３２の中心になるようにする（図１４(ｂ)）。ピンホール板１３０をはずし、集光レンズ４５をセットする。Ｘ，Ｙ，Ｚ軸について、実施例２と同様にしてレンズの位置を最適化する。以上の手順により、ｄＸを適当に設定したピンホールを用いることによって、２つのレーザのずれ角度を任意に設定できる。

図１３（ｃ）に示すように、レンズに対してキャピラリと反対側の２箇所に、幅３mmのスリット１３８，１３９を取り付けた。スリット１３８上では図１４（ｃ）に示すような透過光１２２と反射光１２５のスポットが観測される。スリットは、入射レーザ光４３を透過するように、かつ、透過光１２２と反射光１２５を遮るように設置する。また、スリット１３９は、入射レーザ光４４を透過するように、かつ、透過光１２４と反射光１２６を遮るように設置する。このようにして、戻り光強度を低減することができ、レーザが不安定になるのを防ぐことができた。

また、キャピラリアレイに対して、レーザ集光レンズの外側においては、入射レーザ光，透過光，反射光はほぼ平行であるので、スリットは、レーザ集光レンズの外側のどこでも挿入可能である。本実施例においては、レーザの出射口に比べて、レーザ集光レンズ付近の方が、スリット位置の調整が容易であった。そのため容易に戻り光強度を小さくすることができるというメリットがある。

なお、本発明においては、２つのレーザ光のずれ角度が０ではないため、つぎのような効果が発現する。回折格子の特性上、回折格子の溝に平行な単色発光光源１４０のＣＣＤ上の結像１４１は、図１２（ａ）に示すように像の中心（実施例２における蛍光集光レンズ５４の中心軸）から離れるにしたがい、長波長側に歪んでしまう。本実施例におけるキャピラリアレイ上の入射光レーザの光強度分布１４３を模式的に表現すると図１２（ｂ）のようになる。

別の表現をすると、すべてのキャピラリに屈折率１.４１ の濃度８Ｍのウレア水溶液を注入し、入射レーザ光４３を励起光源とするある特定のラマンバンドに着目した場合、回折格子によって分光された像においては、第１キャピラリからの前記ラマンバンドの結像位置が、第１６キャピラリからの前記ラマンバンドの結像位置に比べて短波長側になっている、また、入射レーザ光４４を励起光源とするある特定のラマンバンドに着目した場合、回折格子によって分光された像においては、第１６キャピラリからの前記ラマンバンドの結像位置が、第１キャピラリからの前記ラマンバンドの結像位置に比べて短波長側になっている、ということができる。

これは、２つのレーザ光４３，４４のずれ角度が０ではないこと、および、それぞれのレーザ光は１６本のキャピラリを伝搬するにしたがい強度が弱くなることによる。このような発光源のＣＣＤ上の像１４４は、回折格子の歪みとキャンセルして図１５（ｂ）のようになる。（像は反転することに注意。）像の歪みが解消されることによってＣＣＤから取り出したデータの解析が容易になるというメリットを得ることができた。
［実施例５］
本発明の実施例６の模式図（キャピラリアレイの検出部付近とレーザ光の導入経路のみ表示、レーザ用のシャッタ，フィルタ等は非表示）を図１３（ｃ），図１３（ｄ）に示す（図１３（ａ）は正面図、図１３（ｂ）は側面図）。本実施例は、実施例２と実施例４の組み合わせといえる。実施例４と同様、２つのレーザ光４３，４４は、ともに、アレイ面２２の平面内にあり、かつ、これら２つのレーザ光は、同軸ではなく、０.８６° ずれている。但し、実施例４とは異なり、光軸基本軸２８が、２つのレーザ光の二等分線にはなっておらず、蛍光検出系における回折格子およびＣＣＤの回転角度は実施例２と同様である。

入射レーザ光４３がキャピラリを透過した透過光１２４，レーザ光４４がキャピラリを透過した透過光１２２，キャピラリによるレーザ光４３の反射光１２５，キャピラリによるレーザ光４４の反射光１２６のいずれの中心軸も入射レーザ光４３，４４とは同軸ではない構成になっている。キャピラリアレイ４２に対して集光レンズ４５，４６の外側においては、これらの入射レーザ光，透過光，反射光はほぼ平行光となっている。なお、キャピラリアレイの構成、および、本実施例で特に定義されない部品名，用語に関する定義は、実施例１〜４と同様である。

このような光軸を実現するために、図１４（ａ）に示すピンホールを利用して光軸調整を以下のように行った。２つのレーザ集光レンズ４５，４６を電気泳動装置から取り外し、レーザ集光レンズ４５，４６を設置する場所のそれぞれに、図１４（ａ）に示すようなピンホールを形成したピンホール板１６０，１６１を設置する。

ピンホール板におけるピンホールの位置を、設定すべきキャピラリへの入射角度に応じて以下のように決定する。ピンホール板には４つのピンホール（ピンホール板１６０にはピンホール１６２，１６３，１６４，１６５、ピンホール板１６１にはピンホール１６６，１６７，１６８，１６９）と２つのマーク（ピンホール板１６０にはマーク１７０，
１７１、ピンホール板１６１にはマーク１７２，１７３）がある。これら４つのピンホール、および、２つのマークは、すべて、アレイ基準線６４上にある。２つのマークの中点が、ピンホール基準点６９になるようにし、ピンホール基準点から各マークまでの距離
１７４をＸとする。

ピンホール１６２，１６４の中点がマーク１７０，ピンホール１６３，１６５の中点がマーク１７１となるようにし、ピンホール１６２，１６４とマーク１７０の距離、およびピンホール１６３，１６５とマーク１７１の距離１７５をｄＸとする。ピンホール１６２，１６６，１６３，１６７の直径は０.５mm 、ピンホール１６４，１６８,１６５,１６９の直径は０.２mm である。レーザ光４３と光軸基本軸２８のなす角度１７６を（Ｔ１−
ｄＴ１）、レーザ光４４と光軸基本軸２８のなす角度を（Ｔ１＋ｄＴ１）１７７とする。２つのレーザのずれ角度は２ｄＴ１となる。［集光レンズ４５と第１キャピラリ６５までの距離］＋［キャピラリアレイの幅］／２をＬ１とした場合に、
Ｘ＝Ｌ１×tan(Ｔ１）
ｄＸ＝Ｌ１×tan(ｄＴ１）
の関係が成り立つようにする。すなわち、本実施例においては、Ｌ１＝５２.９mm（集光レンズ４５と第１キャピラリ６５までの距離が５０mm、キャピラリアレイの幅が５.８mm）、Ｔ１＝２.１°，ｄＴ１＝０.４３°として、Ｘを１.９mm，ｄＸを０.４mmとした。ピンホール板上のピンホール１６６，１６７，１６８，１６９についても同様に設定する。

キャピラリアレイ取り付け場所７５からキャピラリアレイを取り外し、２箇所にセットしたピンホール板において、レーザ光４３がピンホール１６２，１６６を、レーザ光４４がピンホール１６３，１６７を通過し、かつ、２つのレーザ光が平行になるように図１３（ａ）に示すようにレーザ光を調整する。ピンホール板１６１を取り除き、集光レンズ
４６をセットする。このとき、レンズの位置を以下のようにして定めた。図１３に示すように、Ｘ，Ｙ，Ｚ軸を取る。Ｙ軸，Ｚ軸については実施例４と同様にして最適化する。

Ｘ軸方向については、レーザ光４４がキャピラリアレイを透過した透過光１２２の中心がピンホール板１６０におけるピンホール１６４の中心になるようにする（図１４(ｂ)）。ピンホール板１６０をはずし、集光レンズ４５をセットする。Ｘ，Ｙ，Ｚ軸について、実施例３と同様にしてレンズの位置を最適化する。以上の手順により、ＸおよびｄＸを適当に設定したピンホールを用いることによって、キャピラリへの入射角度を任意に設定できる。

さらに実施例５と同様に、スリット１３８，１３９を取り付けた。スリット１３８上では図１４（ｃ）に示すような透過光１２２と反射光１２５のスポットが観測される。スリットは、入射レーザ光４３を透過するように、かつ、透過光１２２と反射光１２５を遮るように設置する。また、スリット１３９は、入射レーザ光４４を透過するように、かつ、透過光１２４と反射光１２６を遮るように設置する。このようにして、戻り光強度を低減することができ、レーザが不安定になるのを防ぐことができた。

なお、本発明によれば、実施例３と実施例４を組み合わせた構成が提案でき、これも本発明の範囲内である。
［実施例６］
本発明の実施例６の光軸を図１５に示す。本実施例は、実施例２，３，４を組み合わせたものである。入射レーザ光４３がキャピラリを透過した透過光１２４，レーザ光４４がキャピラリを透過した透過光１２２，キャピラリによるレーザ光４３の反射光１２５，キャピラリによるレーザ光４４の反射光１２６のいずれの中心軸も入射レーザ光４３，４４とは同軸ではない構成になっている。キャピラリアレイの構成は実施例２と同様である。また、本実施例で特に定義されない、部品名，用語に関する定義は、実施例１〜５と同様である。

このような光軸を実現するために、図１６（ａ）に示すピンホールを利用して光軸調整を以下のように行った。２つのレーザ集光レンズ４５，４６を電気泳動装置から取り外し、レーザ集光レンズ４５，４６を設置する場所のそれぞれに、図１６(ａ)に示すようなピンホールを形成したピンホール板２１０，２１１を設置する。ピンホール板におけるピンホールの位置を、設定すべきキャピラリへの入射角度に応じて以下のように決定する。ピンホール板には４つのピンホール（一方のピンホール板にはピンホール２１２，２１３，２１４，２１５、他方のピンホール板にはピンホール２１６，２１７，２１８，２１９）と４つのマーク（ピンホール板２１０にはマーク２２０，２２１，２２２，２２３、ピンホール板２１１にはマーク２２４，２２５，２２６，２２７）がある。ピンホール２１２，２１３、およびマーク２２０，２２１の中心は、アレイ基準線６４から距離Ｙだけ離れた仰角線９６上にある。ピンホール２１４，２１５、およびマーク２２２，２２３の中心は、アレイ基準線６４上にある。マーク２２０，２２１の中点が、仰角線基準点９８になるようにし、マーク２２２，２２３の中点が、ピンホール基準点６９となるようにする。仰角線基準点９８からマーク２２０，２２１までの距離２２８と、ピンホール基準点６９からマーク２２２，２２３までの距離は等しく、これをＸとする。ピンホール２１２とマーク２２０、ピンホール２１３とマーク２２１，ピンホール２１４とマーク２２２，ピンホール２１５とマーク２２３の距離２２９は等しくこれをｄＸとする。

入射レーザ光のアレイ面２２への正射影と光軸基準線２８のなす角度を、レーザ光４３について（Ｔ１−ｄＴ１）、レーザ光４４について（Ｔ１＋ｄＴ１）とする。仰角基準点と第１キャピラリの中心軸から形成される平面とアレイ面のなす角度２３０をＴ２、［集光レンズ４５と第１キャピラリ６５までの距離］＋［キャピラリアレイの幅］／２をＬ１、集光レンズ４５と第１キャピラリ６５までの距離をＬ２とした場合に、
Ｘ＝Ｌ１×tan(Ｔ１）
ｄＸ＝Ｌ１×tan(ｄＴ１）
Ｙ＝Ｌ２×tan(Ｔ２）
の関係が成り立つようにする。すなわち、本実施例においては、Ｌ１＝５２.９mm、Ｔ１＝２.１°，ｄＴ１＝０.４３°として、Ｘを１.９mm、ｄＸを０.４mm、Ｙを１.９mmとした。なお、ピンホール２１２，２１３の直径を０.５mm、ピンホール２１４，２１５の直径を０.２mmとした。ピンホール板上のピンホール２１６，２１７，２１８，２１９についても同様に設定する。

２箇所にセットしたピンホール板において、レーザ光４３がピンホール２１２，２１６を、レーザ光４４がピンホール２１３，２１７を通過し、かつ、２つのレーザ光が平行になるように図１７（ａ）に示すようにレーザ光を調整する。ピンホール板２１１を取り除き、集光レンズ４６をセットする。このとき、レンズの位置を以下のようにして定めた。図１７に示すように、Ｘ，Ｙ，Ｚ軸を取る。Ｙ軸，Ｚ軸については実施例５と同様にして最適化する。Ｘ軸方向については、レーザ光４４がキャピラリアレイを透過した透過光
１２２の中心がピンホール板２１０におけるピンホール２１４の中心になるようにする
（図１６（ｂ））。

ピンホール板２１０をはずし、集光レンズ４５をセットする。Ｘ，Ｙ，Ｚ軸について、実施例５と同様にしてレンズの位置を最適化する。以上の手順により、Ｘ、ｄＸ、および、Ｙを適当に設定したピンホールを用いることによって、キャピラリへの入射角度を任意に設定できる。

さらに実施例５と同様に、スリット１３８，１３９を取り付けた。スリット１３８上では図１６（ｃ）に示すような透過光１２２と反射光１２５のスポットが観測される。スリットは、入射レーザ光４３を透過するように、かつ、透過光１２２と反射光１２５を遮るように設置する。また、スリット１３９は、入射レーザ光４４を透過するように、かつ、透過光１２４と反射光１２６を遮るように設置する。

本発明の実施例における照射・検出系及び主要部の構成を示す概略図である。 本発明における電気泳動装置の主要部の概略図である。 （ａ）は本発明の他の実施例における電気泳動装置の主要部であり、（ｂ）はキャピラリアレイの照射・検出部の上面図であり、（ｃ）はレーザ本体出射口に取り付けたピンホール板の平面図である。 （ａ）は本発明における蛍光検出系の模式図であり、（ｂ）は検出系のキャピラリアレイ，レーザ光軸，回折格子及びＣＣＤの回転角度を示す模式図である。 （ａ），（ｂ）は本発明において用いられる１対のピンホール板の平面図である。 （ａ）はピンホール板によるレーザ光軸調整方を示し、（ｂ）はピンホール板と集光レンズの組み合わせによる光軸の変化を示し、（ｃ）は２枚のピンホール板を２個の集光レンズに置き換えたときの光軸の変化を示す。 （ａ）と（ｂ）はピンホール板の形状を示す平面図であり、（ｃ）はピンホール板上での光強度を示し、（ｄ）は（ｃ）の破線上の光強度分布である。 （ａ），（ｂ）は１対のピンホール板を用いてレーザ光軸が同軸になるように調整する方法を示す。 （ａ），（ｂ）は１つの集光レンズを用いたレーザ光軸の調整法を説明する図である。 （ａ）ないし（ｄ）はレーザ光軸を非同軸に調整する方法を説明する図である。 （ａ），（ｂ）はピンホール板の構造を示す平面図であり、（ｃ）はピンホール板上の光強度分布を示す図である。 （ａ）は回折格子の溝に平行な方向におけるＣＣＤ上の結像を示し、(ｂ)はキャピラリアレイ上の入射光レーザの光強度分布を模式的に示す図である。 他の実施例におけるレーザ光軸の調整法を示す。 （ａ），（ｂ）は他の実施例におけるピンホール板の平面構造を示す図であり、（ｃ）はピンホール板の面上における光強度分布である。 （ａ），（ｂ）は他の実施例におけるレーザ光軸の調整法を説明する図である。 （ａ），（ｂ）は他の実施例におけるピンホール板の平面構造を示す図であり、（ｃ）はピンホール板の面上における光強度分布である。 （ａ），（ｂ）は他の実施例におけるレーザ光軸の調整法を説明する図である。 本発明の実施例１における信号強度分布を示す。

符号の説明

４１…ハーフミラー、４２…キャピラリアレイ、４３，４４…レーザ光、４５，４６…集光レンズ、５０…ピンホール板。

Claims (12)

1. 以下の構成を含むキャピラリ電気泳動装置；
   試料を分離する泳動媒体を充填できる複数のキャピラリからなるキャピラリアレイであって、複数のキャピラリの少なくとも一部が略平行に整列された検出部を含むもの；
   キャピラリの両端に電圧を印加する電源；
   キャピラリにレーザ光を集光するレーザ集光手段と、レーザ発振器とを含み、前記検出部における複数のキャピラリを横断し、当該複数のキャピラリを同時照射する１以上のレーザを照射し、試料から放出される光を検出する照射検出系であって、
   レーザ集光手段より集光されたレーザが、前記検出部における複数のキャピラリの中心軸が形成する平面上における端のキャピラリの中心軸の垂線に対して斜めに入射し、検出部により反射されたレーザが、レーザ集光手段に入射し、
   端のキャピラリに入射するレーザの光軸と、検出部により反射されたレーザの光軸が実質的に異なるもの。
2. 以下の構成を含むキャピラリ電気泳動装置；
   試料を分離する泳動媒体を充填できる複数のキャピラリからなるキャピラリアレイであって、複数のキャピラリの少なくとも一部が略平行に整列された検出部を含むもの；
   キャピラリの両端に電圧を印加する電源；
   キャピラリにレーザ光を集光するレーザ集光手段と、レーザ発振器とを含み、前記検出部における複数のキャピラリを横断し、当該複数のキャピラリを同時照射するレーザを検出部の両側から照射し、試料から放出される光を検出する照射検出系であって、
   レーザ集光手段より集光されたレーザが、前記検出部における複数のキャピラリの中心軸が形成する平面上における端のキャピラリの中心軸の垂線に対して斜めに入射し、検出部により反射されたレーザが、レーザ集光手段に入射し、
   端のキャピラリに入射するレーザの光軸と、検出部により反射されたレーザの光軸が実質的に異なるもの。
3. 請求項１又は２のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動装置であって、
   キャピラリが、被膜で覆われたガラス管であり、
   該被膜が、少なくとも検出部において除去されているもの。
4. 請求項１又は２のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動装置であって、
   端のキャピラリに入射するレーザの光軸は、検出部における複数のキャピラリの中心軸が形成する平面上における端のキャピラリの中心軸の垂線に対して約２度傾いているもの。
5. 請求項１又は２のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動装置であって、
   照射検出系が、検出部に照射されるレーザを透過する穴を有し、検出部により反射したレーザを遮るレーザ阻止部材を含むもの。
6. 請求項１又は２のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動装置であって、
   照射検出系が、検出部における複数のキャピラリの中心軸が形成する平面上における端のキャピラリの中心軸の垂線と平行なレーザを集光し、該垂線に対して傾けるレンズを含むもの。
7. 請求項１又は２のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動装置であって、
   照射検出系が、検出部から放射される光の波長を分散する波長分散機構を含み、波長分散方向が、検出部を横断するレーザの光軸と略垂直であるもの。
8. 請求項７記載のキャピラリ電気泳動装置であって、
   波長分散手段が、少なくとも回折格子、又はプリズムを含むもの。
9. 請求項１又は２のいずれかに記載のキャピラリ電気泳動装置であって、
   照射検出系が、検出部から放射される光を検出する２次元ＣＣＤを含み、該２次元CCD
   の画素の格子が、検出部を横断するレーザの光軸と略平行であるもの。
10. 請求項２記載のキャピラリ電気泳動装置であって、
    照射検出系が、検出部の発光点の像の歪みを解消するための波長分散機構を含むもの。
11. 請求項２記載のキャピラリ電気泳動装置であって、
    検出部を横断する複数のレーザが平行ではなく、検出部を横断したレーザがレーザ発振器に届かないもの。
12. 請求項２記載のキャピラリ電気泳動装置であって、
    検出部における複数のキャピラリの中心軸が形成する平面上における端のキャピラリの中心軸の垂線に対する、検出部に入射するレーザの光軸の傾きがそれぞれ異なっており、
    検出部を横断したレーザがレーザ発振器に届かないもの。

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