JP3842931B2 - 液体クロマトグラフ−nmr法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、液体クロマトグラフ−NMR法に関し、特に、UV検出器で検出不能なUV吸収を持たない試料成分のクロマトグラムを容易に作成でき、該クロマトグラムに基づいてNMRのストップ&フロー測定やフラクション・ループ測定を好適に行なうことのできる液体クロマトグラフ−NMR法に関する。
【0002】
【従来の技術】
図1は、液体クロマトグラフ装置(LC)から溶出する試料成分をNMR装置を用いて分析するLC−NMR装置の構成を示したものである。図中1は、高性能液体クロマトグラフ装置(HPLC:high performance liquid chromatography)、2は該HPLCを制御するパーソナル・コンピュータ(PC)である。HPLC1は、内蔵された図示しないポンプで溶媒溜3から溶媒を吸引すると共に、同じく内蔵された図示しない試料溜から試料溶液をも吸引して、試料成分を内蔵の図示しないカラムで成分毎に展開・分離する。
【0003】
展開・分離された試料成分は、UV波長帯に吸収を示すものが多いので、UV検出器4を通過する際にUV検出器4によって順次検出され、UVクロマトグラムを与える。その後、試料はNMRのマグネット5に挿入されたNMRプローブ6に導入され、NMRスペクトルの測定に供される。このNMR測定は、UV検出器4からの検出信号、すなわち、UVクロマトグラムに同期させて(ただし、UV検出器4で検出された試料成分がNMRプローブ6に移動するまでの遅延時間(タイム・ラグ)を設けて)行なわれることにより、HPLC1で分離された試料成分毎のNMRスペクトルを得ることができる。このときのNMR測定は、主にスペクトロメータ7によって行なわれ、該スペクトロメータ7はシステム8によって制御される。また、取得されたNMRデータの処理・解析は、主にシステム8によって行なわれる。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
このような構成において、HPLC1によって分離されてくる試料成分のNMR測定を行なおうとすれば、NMRは検出感度が良くないため、ストップ&フロー法によって試料成分がNMRプローブ6に到達した段階で送液を一時的に止めてNMRの積算測定を行なわせたり、フラクション・ループ法によって試料溶液の流路を切り換えて試料溶液の一部をフラクション・ループに蓄え、HPLC1による分離終了後に各成分をフラクション・ループから順次NMRプローブ6に送液してNMRの積算測定を行なわせたりすることにより、測定時間を稼ぎ、NMRの検出感度を上げることが広く行なわれる。
【0005】
ところが、ストップ&フロー法やフラクション・ループ法を行なうためには、試料成分がHPLC1から溶出する正確な時間(HPLCによる試料成分の保持時間(リテンション・タイム))が判らなければならない。そこで、従来は、UV検出器4からの検出信号(UVクロマトグラム)がこの目的のために用いられてきた。しかしながら、HPLC1から溶出する全ての試料成分がUV波長帯に吸収を持つとは限らず、試料成分の種類によってはUV吸収を持たないものもある。その場合は、UV検出器4による検出はできないため、HPLC1から溶出した試料成分のNMR測定を行なうことは困難であった。
【0006】
本発明の目的は、上述した点に鑑み、UV検出器では捉えることのできないHPLCからの試料成分をNMR装置で測定するための新しい手法を備え、しかもストップ&フロー法やフラクション・ループ法のための時間設定を自動で行なうことのできるLC−NMR法を提供することにある。
【0007】
【課題を解決するための手段】
この目的を達成するため、本発明にかかるLC−NMR法は、混合物試料を注入した液体クロマトグラフ装置から順次溶出する試料分画をNMR装置に送液し、NMR装置において所定の高周波磁界パルスを繰り返し照射してFID信号を観測し、観測されたFID信号をフーリエ変換して各試料分画のNMRスペクトルを取得し、取得されたNMRスペクトル群の時間的な変化からNMRクロマトグラムを作成し、該NMRクロマトグラムから判読される試料成分の保持時間の情報に基づいて、同一混合物試料についてのストップ&フロー測定またはフラクション・ループ測定のための時間制御を行なうようにしたことを特徴としている。
【0008】
また、前記液体クロマトグラフ−NMR法において、取得されたNMRスペクトル群の積分値の時間的な変化からNMRクロマトグラムを作成するようにしたことを特徴としている。
【0009】
また、前記液体クロマトグラフ−NMR法において、取得されたNMRスペクトル群の投影スペクトルの時間的な変化からNMRクロマトグラムを作成するようにしたことを特徴としている。
【0010】
また、前記液体クロマトグラフ−NMR法において、取得されたNMRスペクトル群の所定の周波数におけるNMRスペクトル強度のみを抽出して、その時間的な変化からNMRクロマトグラムを作成するようにしたことを特徴としている。
【0011】
また、混合物試料を注入した液体クロマトグラフ装置から順次溶出する試料分画をNMR装置に送液し、NMR装置において所定の高周波磁界パルスを繰り返し照射してFID信号を観測し、観測されたFID信号の強度変化に基づいてNMRクロマトグラムを作成し、該NMRクロマトグラムから判読される試料成分の保持時間の情報に基づいて、同一混合物試料についてのストップ&フロー測定またはフラクション・ループ測定のための時間制御を行なわせるようにしたことを特徴としている。
【0012】
また、前記FID信号の強度変化は、FID信号を絶対値処理した後、積分して得られるFID信号の積分強度の変化であることを特徴としている。
【0013】
また、前記NMRクロマトグラムから判読される試料成分の保持時間の情報を赤外線分光装置に受け渡すことによって、液体クロマトグラフ装置によって分離された試料成分の赤外線スペクトルの測定を行なうことができるようにしたことを特徴としている。
【0014】
【発明の実施の形態】
以下、図面を参照して、本発明の実施の形態を説明する。図2は、本発明にかかる、LCから溶出する試料成分をNMR装置を用いて分析するLC−NMR装置の構成を示したものである。図中1は、HPLC、2は該HPLCを制御するPCである。HPLC1は、内蔵された図示しないポンプで溶媒溜3から溶媒を吸引すると共に、同じく内蔵された図示しない試料溜から試料溶液をも吸引して、試料成分を内蔵の図示しないカラムで成分毎に展開・分離する。
【0015】
成分毎に展開・分離された試料成分は、UV波長帯に吸収を示すものが多いので、UV検出器4を通過する際にUV検出器4によって順次検出される。その後、試料溶液はNMRのマグネット5に挿入されたNMRプローブ6に導入され、NMRスペクトルの測定に供される。このNMR測定は、UV検出器4からの検出信号、すなわち、UVクロマトグラムに同期させて(ただし、UV検出器4で検出された試料成分がNMRプローブ6に移動するまでの遅延時間(タイム・ラグ)を設けて)行なわれることにより、HPLC1で分離された試料成分毎のNMRスペクトルを得ることができる。
【0016】
しかしながら、分離された試料成分がUV吸収を持たない場合には、UV検出器4によって試料成分を検出することはできないので、UV検出器4の代わりにNMR装置自身を検出器として用いて、オン・フロー法により、予備的にNMRクロマトグラムの測定を行なわせるようにする。そして、本発明では、得られたNMRクロマトグラムのピーク位置に基づいて、各試料成分の正確な保持時間(リテンション・タイム)を求め、そのデータに基づいて、試料溶液の移動の停止や流路の切り換えに関する情報を、システム8からPC2やUV検出器4とNMRプローブ6の間に挿入される図示しないフラクション・ループ・ユニットに対して、ケーブル9を介して自動で設定し、ストップ&フロー法やフラクション・ループ法に基づいた正式なNMR測定を行なわせるようにした。このように、システム8からPC2や図示しないフラクション・ループ・ユニットに対して自動で条件設定する機能を設けたことにより、手動設定ではしばしば起きる入力ミスを、完全になくすことができるようになった。
【0017】
尚、このような構成において、NMRクロマトグラムを得るには、いくつかの方法がある。1つは、図3に示すように、先ず第1段階として、オン・フロー法でHPLC1から溶出する試料溶液をそのままNMRプローブ6内に流通させながら、連続的にNMRを測定し、FID信号をシステム8内に時系列的に並べて2次元データとして取り込み、F2軸をフーリエ変換して一連のNMRスペクトル群を得る(図3の(a))。このとき、所定の高周波磁界パルスを試料溶液に照射することにより、溶媒由来のNMRシグナルを消去して、試料成分由来のNMRスペクトルが選択的に観測されるようにする。次に、第2段階として、2次元で取り込まれた各NMRスペクトルを積分して、NMRスペクトルの積分値を得る(図3の(b))。次に、第3段階として、積分値を時系列的に配列して、スケールをHPLC1からの試料成分の溶出時間を表わす時間軸としてシステム8の画面に表示する(図3の(c))。
【0018】
この方法で得られるNMRクロマトグラムは、強度がNMRスペクトルの積分値となっているので、溶出分画中に含まれているプロトン(1H−NMRの場合)の含有量に比例し、クロマトグラムの強度自体に物理的な意味を有する点が特徴である。
【0019】
尚、NMRスペクトルを積分してNMRクロマトグラムを得る代わりに、NMRスペクトルを時間軸に投影して投影スペクトルを得ることによってNMRクロマトグラムを得るか、または、NMRスペクトル群を所定の周波数でスライスして、所定の周波数におけるNMRスペクトル強度のみを抽出することによってNMRクロマトグラムを得ても良い。
【0020】
また、別の方法としては、次のような方法でNMRクロマトグラムを得ることもできる。すなわち、先ず第1段階として、オン・フロー法でHPLC1から溶出する試料溶液をそのままNMRプローブ6内に流通させながら、連続的にNMRを測定し、FID信号をシステム8内に時系列的に並べて2次元データとして取り込む(図4の(a))。このとき、所定の高周波磁界パルスを試料溶液に照射することにより、溶媒由来のFID信号を消去して、試料成分由来のFID信号が選択的に観測されるようにする。次に、第2段階として、FID信号の強度がそれ自身で相殺されないように、FID信号を一度絶対値処理した後、積分を行なってFID信号の積分値を得る(図4の(b))。次に、第3段階として、積分値を時系列的に配列して、スケールをHPLCからの試料成分の溶出時間を表わす時間軸としてシステム8の画面に表示する(図4の(c))。
【0021】
この方法は、FID信号のフーリエ変換を行なわないので、処理速度が非常に速く、ほとんどリアルタイムでNMRクロマトグラムが得られるという特徴がある。従って、前述のように予備実験を行なってNMRクロマトグラムを得た後に、改めて本実験を行なわなくても、リアルタイムでNMRクロマトグラムを測定しながら、ストップ&フロー法やフラクション・ループ法を用いた本実験を行なうことが可能になり、試料の節約になる。
【0022】
尚、このようにして得られたNMRクロマトグラムにおける各試料成分の保持時間に関する情報をフーリエ変換赤外線分光装置(FT−IR)などの分析機器に受け渡せば、HPLCによって分離された各試料成分毎に赤外線吸収スペクトルを取得することも可能となる(LC−IR)。
【0023】
【発明の効果】
以上述べたごとく、本発明のLC−NMR法によれば、NMR法を応用してNMRクロマトグラムを取得し、該NMRクロマトグラムに基づいて、ストップ&フロー法のための試料溶液送りを停止させるタイミングや、フラクション・ループ法のための試料溶液の流路の切り換えのタイミングを、システム側からHPLC側に対して自動設定できるようにしたので、手動入力の場合のような設定の間違いをする恐れがなくなった。
【図面の簡単な説明】
【図1】従来のLC−NMR装置を示す図である。
【図2】本発明のLC−NMR装置を示す図である。
【図3】本発明のNMRクロマトグラムの作り方の一実施例を示す図である。
【図4】本発明のNMRクロマトグラムの作り方の別の実施例を示す図である。
【符号の説明】
1・・・HPLC、2・・・PC、3・・・溶媒溜、4・・・UV検出器、5・・・マグネット、6・・・NMRプローブ、7・・・スペクトロメータ、8・・・システム、9・・・ケーブル。
Claims (7)
- 混合物試料を注入した液体クロマトグラフ装置から順次溶出する試料分画をNMR装置に送液し、NMR装置において所定の高周波磁界パルスを繰り返し照射してFID信号を観測し、観測されたFID信号をフーリエ変換して各試料分画のNMRスペクトルを取得し、取得されたNMRスペクトル群の時間的な変化からNMRクロマトグラムを作成し、該NMRクロマトグラムから判読される試料成分の保持時間の情報に基づいて、同一混合物試料についてのストップ&フロー測定またはフラクション・ループ測定のための時間制御を行なうようにしたことを特徴とする液体クロマトグラフ−NMR法。
- 前記液体クロマトグラフ−NMR法において、取得されたNMRスペクトル群の積分値の時間的な変化からNMRクロマトグラムを作成するようにしたことを特徴とする請求項1記載の液体クロマトグラフ−NMR法。
- 前記液体クロマトグラフ−NMR法において、取得されたNMRスペクトル群の投影スペクトルの時間的な変化からNMRクロマトグラムを作成するようにしたことを特徴とする請求項1記載の液体クロマトグラフ−NMR法。
- 前記液体クロマトグラフ−NMR法において、取得されたNMRスペクトル群の所定の周波数におけるNMRスペクトル強度の時間的な変化からNMRクロマトグラムを作成するようにしたことを特徴とする請求項1記載の液体クロマトグラフ−NMR法。
- 混合物試料を注入した液体クロマトグラフ装置から順次溶出する試料分画をNMR装置に送液し、NMR装置において所定の高周波磁界パルスを繰り返し照射してFID信号を観測し、観測されたFID信号の強度変化に基づいてNMRクロマトグラムを作成し、該NMRクロマトグラムから判読される試料成分の保持時間の情報に基づいて、同一混合物試料についてのストップ&フロー測定またはフラクション・ループ測定のための時間制御を行なわせるようにしたことを特徴とする液体クロマトグラフ−NMR法。
- 前記FID信号の強度変化は、FID信号を絶対値処理した後、積分して得られるFID信号の積分強度の変化であることを特徴とする請求項5記載の液体クロマトグラフ−NMR法。
- 前記NMRクロマトグラムから判読される試料成分の保持時間の情報を赤外線分光装置に受け渡すことによって、液体クロマトグラフ装置によって分離された試料成分の赤外線スペクトルの測定を行なうことができるようにしたことを特徴とする請求項1、2、3、4、5または6記載の液体クロマトグラフ−NMR法。
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