JP4825052B2 - 循環型フロー核磁気共鳴測定装置および測定方法 - Google Patents

Description

本発明は核磁気共鳴測定において試料の測定条件を変化させながら繰り返し測定を行うための測定装置および測定方法に関する。

タンパク質など生体内で機能を有する分子の分子量は薬などに用いられる化合物に比べて大きく高分子化合物としての特性を有している。

タンパク質に代表される高分子化合物は溶液中で分子機能を有しており、この分子機能は特定の低分子化合物と結合することで阻害されたり促進されたりする。

特定の低分子化合物と高分子化合物の結合あるいは相互作用は、多くの方法で検出されている。特に高分子化合物あるいは低分子化合物の分子構造の情報を直接観測できる核磁気共鳴を用いた測定（以下、ＮＭＲ測定という。）では、化合物濃度に対する測定スペクトルの変化から高分子化合物と低分子化合物の解離定数、反応速度の評価だけでなく化合物の構造に基づいた相互作用の解析が可能である。ＮＭＲ測定によるタンパク質と低分子化合物の相互作用を測定する方法は、例えば、特表２００３−５１０６０８号公報（特許文献１）に記載されている。

ＮＭＲ測定に用いる高分子化合物のうちタンパク質は、自然界に存在する生命体から抽出する方法、タンパク質の生成に関連する遺伝子を組み込んだ大腸菌等を利用した大量発現系から抽出する方法、生きた細胞を用いずにタンパク質を大量発現させる無細胞発現系を利用する方法などによって生成される。また、タンパク質を構成する主な元素である水素、炭素、窒素に対して同位体放射元素による標識（以下、ラベル化という。）を行う場合がある。このラベル化には、タンパク質を構成する水素、炭素、窒素の３元素を組み合わせてラベル化する方法、すべてをラベル化する全標識方法、特定のアミノ酸残基に属する原子のみをラベル化する選択的標識などの方法がある。どの方法においてもラベル化の処理コストは高額である。

核磁気共鳴分光装置（以下、ＮＭＲ装置という。）は、典型的には静磁場Ｂ_０を生じさせる磁石と、この磁石の内側に設置したボア部に配置された核磁気共鳴プローブとを含む。この核磁気共鳴プローブは、目的とする試料にＲＦ磁場Ｂ_１を加え、そして加えられた磁場に対する試料の反応（応答）を検出するための１つ以上のコイルが含まれる。

従来の核磁気共鳴プローブには、静置試料プローブおよびフロースループローブが含まれる。静置試料プローブではガラス管またはアンプル（以下、試料管という）の中に試料を加え、この試料管をＮＭＲ装置の所定の位置にセットしてから測定を開始する方法が行われている。

従来の静置試料プローブでは、開口部を持つ試料管で低分子化合物の滴定を行いながらＮＭＲ測定を行うことで、濃度増加に対するＮＭＲスペクトル変化の観測が可能である。しかしながら、試料溶液は高分子化合物、薬物としての効果を評価する低分子化合物、その他の試薬が混合した溶液であるため、一旦、ある濃度の低分子化合物を含んだ条件に達した試料溶液を用いて、その濃度以下の条件でＮＭＲ測定を行うことは困難である。すなわち、一般的には、所定量の試料溶液中の高分子化合物の量を一定に保持した状態で低分子化合物の濃度をパラメータとして測定する。したがって、低分子化合物の濃度を下げるために、バッファー液を注入すると試料溶液の量が増加することになり、これを所定量まで減らすと、高分子化合物の量も減ってしまうことになり、測定条件が変わってしまうからである。

また、ＮＭＲ測定で用いる試料管での低分子化合物の滴定は、試料溶液全体の体積の増大を生じさせ、高分子化合物試料濃度の変化および試料溶液の液面位置の変化を生じる。これらの変化を抑制するためには、試料溶液の体積に対して滴下する体積を出来るだけ少なくする必要がある。

滴下する体積を小さくするためには、滴下する低分子化合物の濃度を上げる必要があるが、滴下溶液の濃度は低分子化合物の溶解度によってその上限が決まり、一般に物質の溶解度は溶媒の種類や温度などによって大きく異なる。従って、滴下による低分子化合物濃度変化に対するＮＭＲ測定では、溶媒や温度の違いが高分子化合物濃度の安定性に影響を及ぼす。

一方、例えば、特表２００４−５３４９５８号公報（特許文献２）に開示されているフロースループローブでは、試料入口、試料出口、および入口と出口との間に延びる内部の管部を含む。この内部の管部には、試料を保持するためのセルが含まれる。試料は試料入口から入れられ、内部の管部を流れてセルに入る。測定後には管部を流れてプローブ外へと取り除かれる。

従来のフロースループローブとロボット式の試料移送システムの組み合わせが使用されている。様々な試料移送システムとの組み合わせが、例えばＧｉｌｓｏｎ， Ｉｎｃ．から市販されている。そのようなシステムでは、複数の測定条件に調整した試料を、複数の容器にあらかじめ準備する必要がある。試料は容器から試料を取り出せる装置を経由してあらかじめセットされたフロースループローブへ送り込まれる。１つの試料に対してＮＭＲ測定が終了すると、試料はプローブ外に排出される。

従来のフロースループローブと試料移送システムの組み合わせでは、複数の濃度条件に調整した試料をあらかじめ準備することが求められる。したがって、測定条件数だけの一定濃度の高分子化合物溶液が必要となり、試料に要する費用が高価となる。

また、測定条件範囲が未知の高分子化合物や低分子化合物では、好適な測定条件範囲や条件変化の度合いが確定するまで機能評価の計測全体を繰り返し行う問題で悩まされ得る。

特表２００３−５１０６０８号公報 特表２００４−５３４９５８号公報

本発明は、タンパク質などの高分子化合物と低分子化合物を含んだ溶液試料に対して核磁気共鳴測定を行うための装置および方法、ならびに、試料の濃度条件を安定的に制御し、低分子化合物の濃度を変化させながら繰り返し測定を行うための装置および方法を提供する。

本発明では、核磁気共鳴プローブにセットされた試料容器を、これを含めて閉ループを構成する試料移送管で結ぶとともに、この閉ループ中に送液ポンプを設けて、閉ループを循環的に液体が移送できるように構成する。試料移送管の一部に制御部を備え、試料である高分子化合物、この高分子化合物と混合される低分子化合物およびバッファー液を導入する手段を設け、試料成分を制御する。さらに、制御部には閉ループの全容積を超える量の溶液の注入に対して低分子化合物あるいはバッファー液を選択的に排出する手段を設け、試料成分を制御する。高分子化合物の量を所定の値に保持（高分子化合物の濃度を一定に保持）して低分子化合物の濃度を増加あるいは減少させ、試料溶液中の低分子化合物と高分子化合物の濃度比を変化させたＮＭＲ測定を可能とする。

本発明に係る高分子化合物と低分子化合物を含んだ溶液に対するＮＭＲ測定方法によれば、高分子化合物濃度を一定にしたまま低分子化合物濃度を増加あるいは減少させる工程を有するため、一定の高分子化合物の量の下で低分子化合物と高分子化合物の濃度比を自由に制御してＮＭＲスペクトルの変化を測定することができる。

また、本発明に係る高分子化合物と低分子化合物を含んだ溶液に対するＮＭＲ測定方法によれば、滴下によるＮＭＲ測定容器内の溶液体積の変化が発生しないので、試料溶液の温度や低分子化合物の溶解度によらず、ＮＭＲ測定容器内の高分子化合物濃度は一定に保ったままＮＭＲ測定を行うことができる。

本発明のＮＭＲ測定における試料溶液の循環型フロー構成およびその方法の好適な実施の形態について図を参照して、以下に説明する。

（実施例１）
図１は本発明の実施例１の試料溶液の循環型フロー型ＮＭＲ測定装置の概念を示す図である。２０_１，２０_２は試料に磁場を加えるための分割磁石であり、それぞれボア２２_１，２２_２を有する。２４は核磁気共鳴プローブであり、ボア２２_２の内部に保持されている。核磁気共鳴プローブ２４には、試料の一定量を保持する容器１０が設けられ、これは分割磁石２０_１，２０_２の発生する磁場の領域に位置するようになされる。容器１０は、一般に、石英ガラスによって作成することが望ましい。試料の核磁気共鳴信号を検出する検出コイル２８が容器１０と最適な位置関係にセットされている。試料を所定の高周波信号で励起するための送信コイルが設けられるが、図が煩雑となるので、図示は省略した。容器１０の上下端部には、試料管接続部１２,１４が設けられ、これらを介して試料移送管１６_１，１６_２と流体的に接続されている。容器１０と試料移送管１６_１，１６_２および後述する制御部３０の試料移送管１６_３は閉ループとなされて、試料を循環させることができる。実施例１では、容器１０、試料管接続部１２，１４および試料移送管１６_１，１６_２の接続部は同軸上に接続され、容器１０と試料移送管１６_１，１６_２，１６_３の構成する閉ループの容器１０と試料移送管１６_１，１６_２の連結された直線部分は分割磁石２０_１，２０_２の分割部分に設けられている。２６は送受信システムであり、検出コイル２８の信号を取り出し、あるいは、図示しない送信コイルへ信号を送り込む。

３０は制御部であり、試料移送管１６_１，１６_２を連結する試料移送管１６_３が設けられ、これに、排出バルブ４０、フィルタ部４２、ｐＨ値および圧力などの溶液状態をモニタする計測装置５２、低分子化合物の溶液注入装置４４、試料である高分子化合物の溶液注入装置４６、バッファー液あるいは清浄な水を注入する注水バルブ４８、送液ポンプ５０が連結される。これにより、容器１０と試料移送管１６_１，１６_２，１６_３は閉ループとなされるとともに、試料成分が制御できるものとなる。

フィルタ部４２は試料移送管１６_３と連結される接液部６０の外側に、タンパク質などの高分子化合物と他の成分を分離できるものである限り、特に限定はされないが、好ましくは、タンパク質は通過できない程度であって低分子化合物を含む他の成分が通過できる程度の径の細孔を持った膜６２を用いる。例えば、ミリポア社製のディスク状限外濾過フィルタとディスク状フィルタフォルダーを組み合わせた構成で、好適なものができる。これにより、試料溶液内のタンパク質の分子量に合わせてディスク状限外濾過フィルタの細孔サイズを選択して使用できるので、タンパク質以外の成分の限外濾過操作を好適に行うことができる。膜６２で濾過された液体は液溜め６４に排出される。すなわち、このフィルタ部４２は高分子化合物は排出しないので、閉ループ中の高分子化合物の量を一定に保持できる。

溶液注入部４４は、１つあるいは複数の加圧式のシリンジポンプを電子制御する形態が好ましい。例えば、Ｋｄサイエンティフィック社製のシリンジポンプＩＣ３１００，ＩＣ３２００を試料移送管１６_３と流体的に接続し、低分子化合物を含んだ溶液を入れたシリンジを精密制御しながら加圧送液を行うことで、溶液を閉ループ内に注入する作業を好適に行うことができる。なお、閉ループ内にバッファー液を注入したいときは、シリンジ内にバッファー液を入れてシリンジを精密制御しながら加圧送液を行うことで閉ループ内にバッファー液を注入できる。

試料溶液注入装置４６は、溶液注入部４４と同様に、１つあるいは複数の加圧式のシリンジポンプを電子制御する形態が好ましい。例えば、Ｋｄサイエンティフィック社製のシリンジポンプＩＣ３１００，ＩＣ３２００を試料移送管１６_３と流体的に接続し、試料である高分子化合物の溶液を入れたシリンジを精密制御しながら加圧送液を行うことで、高分子化合物の溶液を閉ループ内に注入する作業を好適に行うことができる。

送液ポンプ５０は、一般に高速液体クロマトグラフィー（以下、ＨＰＬＣという。）で用いられるものが好適である。電子制御可能なステッピングモーターなどを用いてプランジャーを駆動し、容器１０と試料移送管１６_１，１６_２，１６_３の構成する閉ループに定圧送液が可能なものが望ましい。

計測装置５２はｐＨ値および圧力などの溶液状態をモニタするメータであり、ＨＰＬＣで用いられるものを使用することができる。

ここで、試料移送管１６_１，１６_２，１６_３の材質について見ると、試料溶液の性質によって選択すべきである。タンパク質などの生体関連高分子化合物に対する測定では、ポリエチレンエチレンケトン（ＰＥＥＫ）、Ｔｅｆｚｅｌ、Ｋｅｌ−Ｆ、フューズドシリカが用いられることが多い。また試料移送管の内径は０．５ｍｍから０．０６５ｍｍの範囲とし、試料移送管の全長は４ｍ程度とし、容器１０と試料移送管の全容積が１０００μＬ程度とすることが望ましい。

以下、図１を参照して、実施例１における計測の手順について説明する。

（バッファー液の注入）
まず、注水バルブ４８を介してバッファー液を供給しながら、送液ポンプ５０を運転して試料移送管１６_１，１６_２，１６_３にバッファー液を満たす。この結果、容器１０もバッファー液で満たされ、閉ループがバッファー液で満たされる。バッファー液はタンパク質などの高分子化合物が安定的に存在しかつ安定的なＮＭＲ測定が行えるように水素イオン濃度（ｐＨ）を調整したバッファー液、燐酸バッファー溶液などを用いる。この段階では、排出バルブ４０は閉じられている。

（試料の注入）
その後、試料溶液注入部４６に高分子化合物を含んだ試料を入れて、これを制御して、試料溶液を注入しながら送液ポンプ５０を運転する。この試料の中にはＮＭＲ測定時のロックに必要なロック溶媒を混入する必要がある。タンパク質のＮＭＲ測定で多く用いられる燐酸バッファーなど、溶媒に軽水が大半を占める場合には、好適には、ロック溶媒として重水を用いる。好適な重水濃度は５％から１０％である。また、測定対象の高分子化合物に合わせて好適なバッファー溶媒、ロック溶媒を選択して測定する。この際、容器１０、試料移送管１６_１，１６_２，１６_３、およびフィルタ部４２の閉ループの全容積に相当する量の高分子化合物を含んだ試料を注入することにより、バッファー液で満たされていた閉ループが分子化合物を含んだ試料で置換される。

試料溶液の注入時の送液ポンプ５０の吐出圧力は、フィルタ部４２での圧力が限外濾過開始圧力よりも大きい値にセットする。試料溶液の注入に応じて試料移送管１６_１，１６_２，１６_３の閉ループに生ずる余剰なバッファー液はフィルタ部４２で液溜め６４に排出される。液溜め６４に排出された溶液の体積が、容器１０、試料移送管１６_１，１６_２，１６_３、およびフィルタ部４２の閉ループの全容積に近づくとメータ５２での圧力が低下する。その後すみやかに、送液ポンプ５０の吐出圧力をフィルタ部４２の限外濾過に必要な圧力以下にまで低下させ、フィルタ部４２での限外濾過を終了する。

フィルタ部４２での圧力が限外濾過開始圧力よりも低い圧力で送液ポンプ５０を運転して、試料移送管１６_１，１６_２，１６_３の閉ループで溶液を循環させ、溶液の状態をさらに均一化させることが可能である。

（ＮＭＲ測定）
次いで、容器１０内のロック溶媒を含んだ試料溶液に対して磁石２０_１，２０_２により磁場Ｂ_０を加え、磁場ロックを行うことができる。この磁場ロックと磁石２０_１，２０_２が発生する磁場Ｂ_０の均一性の調整を用いることでＮＭＲ計測を行える磁場Ｂ_０の均一性を維持できる。

ＮＭＲ測定のための磁場の均一性調整を行った後に、低分子化合物の注入動作や低分子化合物の希釈動作と組み合わせたＮＭＲ測定を繰り返し実施することで、試料溶液中の低分子化合物濃度を変化させたＮＭＲ測定を行うことができる。

（低分子化合物の濃度制御）
送液ポンプ５０による試料溶液の循環を行い、容器１０、試料移送管１６_１，１６_２，１６_３、およびフィルタ部４２の閉ループ内の中に試料溶液の流れを作りながら、溶液注入部４４に低分子化合物を含んだ溶液を入れて、これを制御して、低分子化合物を含んだ溶液を注入する。注入した低分子化合物は送液ポンプ５０で加圧されて試料移送管１６を経由して試料溶液と共にプローブにセットされた容器１０へ送られる。注入と同時に発生する余剰な溶液は、低分子化合物を含んだ溶液の注入作業以前に試料溶液内に含まれる低分子化合物の溶液とバッファー液である。この余剰な溶液はフィルタ部４２で液溜め６４に排出される。液溜め６４に排出された溶液の体積が注入体積に近づくとメータ５２での圧力が低下する。その後すみやかに、送液ポンプ５０を停止してフィルタ部の圧力を限外濾過に必要な圧力以下にまで低下させ、フィルタ部４２の濾過を終了する。

フィルタ部４２での圧力が限外濾過開始圧力よりも低い圧力で送液することで、容器１０、試料移送管１６_１，１６_２および１６_３の閉ループ内で試料を循環させ、溶液の状態をさらに均一化させることが可能である。

低分子化合物の注入の際にも、フィルタ部４２で排出されるのは低分子化合物の溶液あるいはバッファー液であるので、閉ループ内の高分子化合物濃度を一定に保ったまま低分子化合物濃度が増加した状態となる。

前記の低分子化合物の注入動作を複数回繰り返すことで、ＮＭＲ測定に用いる試料溶液内の低分子化合物濃度を増加させることが出来る。

プローブにセットされた容器１０および試料移送管１６_１，１６_２および１６_３の閉ループ全体の容積をＶ、すべての注入動作前に容積Ｖの中に存在する低分子化合物濃度をα、注入する低分子化合物の濃度をβとし、注入動作１回当りの体積をｖとする。そして、ｉ回目の注入動作においてフィルタ部から排出される低分子化合物量をＥ（ｉ）、注入動作後に残った低分子化合物量をＭ（ｉ）、平均濃度をδ（ｉ）とする。

最初の注入動作後、排出される低分子化合物量Ｅ（１）、残った低分子化合物量Ｍ（１）、平均濃度δ（１）はそれぞれ、式（１）、式（２）及び式（３）で示される。

低分子化合物の注入動作をｉ回繰り返した後では、低分子化合物量Ｅ（ｉ）、残った低分子化合物量Ｍ（ｉ）、平均濃度δ（ｉ）はそれぞれ、式（４）、式（５）及び式（６）で示される。

（低分子化合物濃度の希釈）
低分子化合物濃度の希釈は低分子化合物の注入と同様な動作で、注入溶液として低分子化合物を含まない溶媒、例えば、バッファー液を閉ループに注入することで実現される。

まず、送液ポンプ５０により閉ループの試料溶液の循環を行い、試料溶液の流れを試料移送管１６_３の中に作る。溶液注入部４４から、測定者が設定した量の低分子化合物を含まない溶液を注入する。注入した溶液は送液ポンプ５０で加圧されて試料移送管１６_２を経由して試料溶液と共にプローブにセットされた容器１０へ送られる。注入と同時に発生する余剰な溶液は、試料内の低分子化合物やバッファー液のみを外部へ排出するフィルタ部４２によって液溜め６４に排出される。送液ポンプ５０を停止して、閉ループ内の循環の圧力を限外濾過に必要な圧力以下にまで低下させることでフィルタ部４２の濾過が終了する。この結果、閉ループ内の高分子化合物濃度を一定に保ったまま、低分子化合物濃度が減少した状態になる。

前記の低分子化合物の希釈動作を複数回繰り返すことで、ＮＭＲ測定に用いる試料溶液内の低分子化合物濃度を減少させることができる。

プローブにセットされた容器、試料移送管全体、および制御部での閉ループ全体の体積をＶ、希釈前の低分子化合物濃度をδ（０）、注入動作１回当りの低分子化合物を含まない溶液の体積をｖとする。そして、ｉ回目の注入動作においてフィルタ部から排出される低分子化合物量をＥ（ｉ）、注入動作後に残った低分子化合物量をＭ（ｉ）、平均濃度をδ（ｉ）とする。

最初の注入動作後、排出される低分子化合物量Ｅ（１）、残った低分子化合物量Ｍ（１）、平均濃度δ（１）はそれぞれ、式（７）、式（８）及び式（９）で示される。

希釈動作をｉ回繰り返した後では、排出される低分子化合物量Ｅ（ｉ）、残った低分子化合物量Ｍ（ｉ）、平均濃度δ（ｉ）はそれぞれ、式（１０）、式（１１）及び式（１２）で示される。

前記の手順を組み合わせることで、試料溶液中の高分子化合物濃度を一定に保ったまま低分子化合物濃度を増加あるいは減少させ、ＮＭＲ測定を行った後に再び、低分子化合物濃度を変化させることが可能である。また、これを繰り返すことで、一定量かつ一定濃度の高分子化合物に対し、低分子化合物濃度を変化させた一連のＮＭＲ測定を実施することが可能である。

図２に、溶液注入部４４から低分子化合物を含んだ溶液を注入して閉ループ内の低分子化合物濃度を増大させた場合の濃度変化の例を、図３に、溶液注入部４４から低分子化合物を含まない溶液を注入して閉ループ内の低分子化合物濃度を減少させた場合の濃度変化の例を、それぞれ、示す。

図２の例では、容器１０、試料移送管１６_１，１６_２，１６_３、およびフィルタ部４２の閉ループ内の全体の容積を１０００μＬ、初期の低分子化合物濃度は０ｍｏｌ／Ｌ、すべての注入動作に亘って注入する低分子化合物濃度を０．０１ｍｏｌ／Ｌ、１回の注入動作での溶液注入部４４からの注入体積を１０μＬとした場合の容器１０内での低分子化合物濃度を示す。注入回数が増加するに従って容器１０内の低分子化合物濃度が増大する。ここで、低分子化合物の注入に伴う平均濃度の変化は上述した式（１）−式（６）に従って変化することになるが、図２の例では、初期の低分子化合物濃度は０ｍｏｌ／Ｌであるので、すべての注入動作前に容積Ｖの中に存在する低分子化合物濃度αは０である。

このように、注入濃度、１回の注入動作での低分子化合物の注入体積、動作回数を指定することで、設定した低分子化合物濃度を実現させ、その条件下でＮＭＲ測定を実行することができる。

図３の例では、容器１０、試料移送管１６_１，１６_２，１６_３、およびフィルタ部４２の閉ループ内の全体の容積を１０００μＬ、初期の低分子化合物濃度は０．００１９ｍｏｌ／Ｌ、すべての注入動作に亘って注入する低分子化合物濃度を０．００ｍｏｌ／Ｌ（すなわち、バッファー溶液のみの注入）、１回の注入動作での溶液注入部４４からの注入体積を１００μＬとした場合の容器１０内での低分子化合物濃度を示す。注入回数が増加するに従って容器１０内の低分子化合物濃度が減少する。ここで、注入回数に対する容器１０内の低分子化合物濃度は式（１０）、式（１１）、式（１２）にしたがって変化する。

このように、１回の注入動作での低分子化合物を含まない溶液の注入体積、動作回数を指定することで、設定した低分子化合物濃度を実現させ、その条件下でＮＭＲ測定を実行する。

また、前記に示した低分子化合物濃度を増加させる操作と減少させる操作を組み合わせることにより、低分子化合物濃度の増減も自由に制御することが可能であり、一度測定した条件を再現して測定することが可能であることも分かる。

低分子化合物を含むあるいは含まない溶液の注入動作において、注入溶液に一定濃度のロック溶媒を入れておくことで、一連の動作において容器１０内のロック溶媒の濃度も一定にすることが可能である。

（試料の変更）
一つの試料に対する一連の計測が完了すると、新しい試料に変更して次の計測が始められる。この場合、試料間のコンタミを防止するために、次の手順とするのが良い。

まず、試料溶液注入部４６に残っている高分子化合物を含んだ試料、溶液注入部４４に残っている低分子化合物を、それぞれ、廃棄し、次いで、これらを清浄な水で洗浄するとともに、これらに清浄な水を適当に入れる。液溜め６４に排出されている溶液も廃棄する。次いで、注水バルブ４８を介して清浄な水を供給しながら、送液ポンプ５０を運転して試料移送管１６_１，１６_２，１６_３の閉ループに清浄な水を満たす。この際、試料溶液注入部４６および溶液注入部４４に入れられている清浄な水を押し出し、これらと試料移送管１６_３との連結部も洗浄する。送液ポンプ５０の運転による試料移送管１６_１，１６_２，１６_３の閉ループの清浄な水の循環がある程度なされた後に、注水バルブ４８を介して清浄な水を供給しながら、排出バルブ４０を開きとして送液ポンプ５０の運転を短時間継続した後、注水バルブ４８および、排出バルブ４０を閉じるとともに、送液ポンプ５０の運転も停止する。この結果、容器１０も含め、試料移送管１６_１，１６_２，１６_３の閉ループは清浄な水で満たされる。この段階でも、液溜め６４に排出されている溶液は廃棄する。
この後、バッファー液の注入から始まる手順で、新しい試料についての計測を行うことができる。
また、次の計測でも同じバッファー液を使用する場合には、洗浄に用いるのは清浄な水ではなくバッファー液を用いてもよい。この場合には、バッファー液の注入手順を省略することができる。

ここで、容器１０と試料移送管１６_１，１６_２との接続の好ましい形態を説明する。

図４（ａ）、（ｂ）は、容器１０が、試料移送管１６_１，１６_２との接続管６１_１，６１_２を両端部に突出させた構造の場合の接続形態の二つの例を説明する図である。容器１０は、いずれの場合でも、肉厚のガイド部７１_１，７１_２とＮＭＲ測定部７０とを有する。この構造は、例えば、ガラスで容易に一体型で形成することができる。図４（ａ）では肉厚のガイド部７１_１がガイド部７１_２に対して相対的に長いものとされているが図４（ｂ）では肉厚のガイド部７１_１，７１_２はほぼ同じ長さとされている。プローブ２４が容器１０を保持する形で構成されているときは、図４（ａ）に示す構造が好適であり、プローブ２４が容器１０および試料管接続部１２，１４を保持する形で構成されているときは、図４（ｂ）に示す構造が好適である。

接続管６１_１，６１_２は接続する試料移送管１６_１，１６_２と同じ外径が好ましく、好適な値は１．５７ｍｍから０．３６ｍｍの範囲である。また、接続管６１_１，６１_２、接続管６１_１，６１_２およびガイド部７１_１，７１_２の内径の好適な値は０．５ｍｍから０．０６５ｍｍの範囲であることが望ましい。ＮＭＲ測定部７０はＮＭＲ測定に十分な試料を溜める必要があり、高分子化合物としてタンパク質を用いる場合には４００μＬから１００μＬが好ましい。また、ＮＭＲ測定部７０は、分割磁石２０_１，２０_２の発生するＮＭＲ計測に好適な磁場の領域内にこれらの試料が配置されるように、十分な内径を持つものとされる。

試料管接続部１２，１４は接続コネクタ６５とオシネ６６_１，６６_２を有する、ＨＰＬＣで一般的に使用される圧縮タイプの接続具である。オシネ６６_１，６６_２は一体型のものとナット６７_１，６７_２とフェレル６８_１，６８_２が分離した型と２種類あるが、どちらも接続に適している。コネクタ６５とオシネ６６_１，６６_２は好適には、ＰＥＥＫ又はＰＴＥＦ，Ｋｅｌ−Ｆ，ＴｅｆｚｅｌあるいはＨＰＬＣの分野で知られているそのほかの材料で作られる。コネクタ６５内に両側から接続管６１_１，６１_２およびガイド部７１_１，７１_２のそれぞれを挿入して、オシネ６６_１，６６_２によって固定するとともに、ナット６７_１，６７_２によって緩み止めを施す。

図５（ａ）、（ｂ）は、容器１０の肉厚のガイド部７１_１，７１_２の細管内に試料移送管１６_１，１６_２を両端部から挿入する構造の場合の接続形態の二つの例を説明する図である。この例でも、プローブ２４の構造に応じて、ガイド部７１_１，７１_２の長さの適当なものを選択すればよい。また、ＮＭＲ測定部７０は、試料となる高分子化合物としてタンパク質を用いる場合には４００μＬから１００μＬが好ましく、分割磁石２０_１，２０_２の発生するＮＭＲ計測に好適な磁場の領域内にこれらの試料が配置されるように、十分な内径を持つものとされる。ガイド部７１_１，７１_２の細管の内径の好適な値は接続する試料移送管１６_１，１６_２の外径と同じ値が好ましく、好適な値は１．５７ｍｍから０．３６ｍｍの範囲である。６９_１，６９_２は収縮チューブであり、ガイド部７１_１，７１_２に試料移送管１６_１，１６_２を挿入したあと、収縮させて、両者を固定する。収縮チューブ６９_１，６９_２は、好適にはテフロン（登録商標）、ＴｅｆｚｅｌあるいはＨＰＬＣの分野で知られているそのほかの材料を用いた熱収縮性のチューブを用いる。

（実施例２）
図６は本発明の実施例２の構成を示す概念図である。図１に示す実施例１と同じ構成要素には、同じ参照符号を付した。図１と図６とを対比して明らかなように、容器１０に接続部１２，１４を介して接続される試料移送管１６_１，１６_２を、接続部で折り曲げて、ボア２２_２を通して導出する点を除けば、実施例２は実施例１と同じ構成である。測定手順についても同じでよい。

実施例２では、試料に磁場を加えるための分割磁石２０_１，２０_２の外径が大きいときはトータルとしての試料移送管１６_１，１６_２の長さを短くできるメリットがある。この実施例３では、容器１０は、図４（ｂ）、図５（ｂ）に示す構造のものとするのが良い。

（実施例３）
図７は本発明の実施例３の構成を示す概念図である。図６に示す実施例２と同じ構成要素には、同じ参照符号を付した。図６と図７とを対比して明らかなように、プローブ２４が容器１０、接続部１２，１４および接続部１２，１４を介して接続される試料移送管１６_１，１６_２の接続部近辺を含めて構成されている点を除けば、実施例３は実施例２と同じ構成である。測定手順についても同じでよい。

実施例３では、試料に磁場を加えるための分割磁石２０_１，２０_２の外径が大きいときはトータルとしての試料移送管１６_１，１６_２の長さを短くできるメリットがあるとともに、容器１０をプローブ２４に強固に保持できるものとできる。

（実施例４）
図８は本発明の実施例４の構成を示す概念図である。図１に示す実施例１と同じ構成要素には、同じ参照符号を付した。図１と図８とを対比して明らかなように、容器１０を含むプローブ２４が試料に磁場を加えるための分割２０のボア２２内に設けられるとともに、容器１０に加えられる磁場Ｂ_０の向きが容器１０と平行構成されている点を除けば、実施例４は実施例１と同じ構成である。測定手順についても同じでよい。

実施例４では、試料に磁場を加えるための磁石２０を小型とするときは、試料移送管１６_１，１６_２の長さを短くできるメリットがある。

（実施例５）
図９は本発明の実施例５の構成を示す概念図である。図８に示す実施例４と同じ構成要素には、同じ参照符号を付した。図８と図９とを対比して明らかなように、プローブ２４が容器１０、接続部１２，１４および接続部１２，１４を介して接続される試料移送管１６_１，１６_２の接続部近辺を含めて構成されている点を除けば、実施例５は実施例４と同じ構成である。測定手順についても同じでよい。

実施例５では、容器１０をプローブ２４に強固に保持できるものとできる。

（実施例６）
図１０は本発明の実施例６の構成を示す概念図である。図９に示す実施例５と同じ構成要素には、同じ参照符号を付した。図９と図１０とを対比して明らかなように、プローブ２４が容器１０、接続部１２，１４および接続部１２，１４を介して接続される試料移送管１６_１，１６_２の接続部近辺を含めて構成されるとともに、試料移送管１６_１が容器１０、試料移送管１６_２と直線になるように構成される点を除けば、実施例６は実施例５と同じ構成である。測定手順についても同じでよい。

実施例６では、試料に磁場を加えるための磁石２０のボア２２の内径を小さくできるから、装置全体を小型化できる。

（実施例７）
図１１は本発明の実施例７の構成を示す概念図である。図１に示す実施例１と同じ構成要素には、同じ参照符号を付した。図１に示す実施例１の構成と対比して明らかなように、溶液注入部４４が、４４_１，４４_２，---，４４_ｎのｎ個配置された点を除けば、実施例１と同じである。すなわち、実施例７では、一つの試料の計測において、独立した溶液注入部４４のシリンジから異なった低分子化合物を含んだ溶液を注入して、容器１０内での測定対象の高分子化合物の濃度を一定に保ちつつ、さらに、ある低分子化合物の濃度を一定に保って、他の低分子化合物濃度を調整する方法を提供する。

測定の手順の基本的な内容は、実施例１と同じでよいので、ここでは、一つの低分子化合物の濃度を一定に保ちつつ、他の低分子化合物濃度を増加させる好ましい一方法は以下のようである。
（ａ）試料の高分子化合物を含む試料溶液を容器１０、試料移送管１６_１，１６_２および制御部３０の試料移送管１６_３の閉ループ内に注入する。
（ｂ）容器１０内の濃度を一定にしようとする低分子化合物の注入濃度をβとして溶液注入部４４_１のシリンジにセットする。
（ｃ）工程（ｂ）でセットした低分子化合物以外のその他の低分子化合物を溶液注入部４４_２，---，４４_ｎのシリンジにセットする。このとき、その他の低分子化合物の注入体積のトータルをＶｅｘとする。
（ｄ）容器１０での濃度（α）を一定にするように、工程ｂ）でセットした低分子化合物の注入体積ｖを式（１３）を満足するようにセットする。
（ｅ）工程（ａ）の試料溶液へ、工程（ｂ）および工程（ｃ）でセットした低分子化合物の注入を行う。この際、実施例１で説明したように、余剰溶液はフィルタ部４２の排出液溜め６４に排出される。

一つの低分子化合物の濃度を一定に保ちつつ、他の低分子化合物濃度を希釈させる好ましい一方法は以下のようである。
（ｆ）高分子化合物を含む試料溶液を容器１０、試料移送管１６_１，１６_２および制御部３０の試料移送管１６_３の閉ループ内に注入する。
（ｇ）容器１０内の濃度を一定にしようとする低分子化合物の注入濃度をβとして溶液注入部４４_１のシリンジにセットする。
（ｈ）低分子化合物を含まない溶液を溶液注入部４４_２，---，４４_ｎのシリンジにセットする。このとき、低分子化合物を含まない溶液の低分子化合物の注入体積のトータルをＶｅｘとする。
（ｉ）容器１０での濃度（α）を一定にするように、工程（ｆ）でセットした低分子化合物の注入体積ｖを式（１３）を満足するようにセットする。
（ｊ）工程（ｆ）の試料溶液へ、工程（ｇ）および工程（ｈ）でセットした低分子化合物および低分子化合物を含まない溶液の注入を行う。この際、実施例１で説明したように、余剰溶液はフィルタ部４２の排出液溜め６４に排出される。

上述の溶液注入部４４が、４４_１，４４_２，---，４４_ｎのｎ個配置とされる構成は、他の実施例２−６でも、同様に実施できる。

さらに、実施例７の構成では、低分子化合物の注入動作、低分子化合物の希釈動作、低分子化合物の濃度を一定に保ちつつ他の低分子化合物濃度を増加する動作、そして低分子化合物の濃度を一定に保ちつつ他の低分子化合物濃度を希釈する動作を組み合わせることで、複数の低分子化合物が混合した溶液で、各低分子化合物濃度を独立に変化させたＮＭＲ測定を可能とできる。

タンパク質をはじめとする生体内で機能を有する高分子化合物に本発明を適用することにより、一定量の高分子化合物の使用のもとで、滴定条件によらず試料容積一定を維持し、溶液条件を変化させたＮＭＲ計測の反復が可能となるので、ライフサイエンスの分野では生体内で生じている生化学プロセス解析の効率向上となり、医療や創薬分野では疾病関連タンパク質との結合強度計測による疾病メカニズム解析やスクリーニングの高効率化に繋がる。

本発明の実施例１の試料溶液の循環型フロー型ＮＭＲ測定装置の概念を示す図である。 溶液注入部４４から低分子化合物を含んだ溶液を注入して閉ループ内の低分子化合物濃度を増大させた場合の濃度変化の例を示す図である。 溶液注入部４４から低分子化合物を含まない溶液を注入して閉ループ内の低分子化合物濃度を減少させた場合の濃度変化の例を示す図である。 （ａ）、（ｂ）は、容器１０と試料移送管１６_１，１６_２との接続形態の二つの例を説明する図である。 （ａ）、（ｂ）は、容器１０と試料移送管１６_１，１６_２との接続形態の他の二つの例を説明する図である。 本発明の実施例２の構成を示す概念図である。 本発明の実施例３の構成を示す概念図である。 本発明の実施例４の構成を示す概念図である。 本発明の実施例５の構成を示す概念図である。 本発明の実施例６の構成を示す概念図である。 本発明の実施例７の構成を示す概念図である。

符号の説明

１０…保持容器、１２，１４…接続部、１６_１，１６_２，１６_３…試料移送管、２０，２０_１，２０_２…磁石、２２，２２_１，２２_２…ボア、２４…核磁気共鳴プローブ、２６…送受信システム、２８…プローブコイル、３０…制御部、４０…排出バルブ、４２…フィルタ部、４４…溶液注入部、４６…試料溶液注入部、４８…注水バルブ、５０…送液ポンプ、５２…ｐＨ，圧力メータ、６０…接液部、６１_１，６１_２…接続管、６２…フィルタ、６４…排出液溜め部、６５…接続コネクタ、６６_１，６６_２…オシネ、６７_１，６７_２…ナット、６８_１，６８_２…フェレル、７０…ＮＭＲ測定部、７１_１，７１_２…ガイド部、６９_１，６９_２…収縮チューブ。

Claims (10)

1. 試料に磁場を加えるための磁石と、
   前記磁石による磁場の形成されている領域に配置された核磁気共鳴プローブと、
   前記核磁気共鳴プローブに設置された試料を保持する容器と、
   前記容器の試料に対して電磁波を送るあるいは前記核磁気共鳴プローブから電磁波を受け取る送受信システムと、
   前記容器を含めて閉ループを構成する試料移送管と、
   前記試料移送管の一部に設けられた制御部とよりなり、
   前記制御部には
   前記試料移送管に測定対象となる高分子化合物を含む溶液を注入する手段と、
   前記試料移送管に、低分子化合物を含む溶液を注入する手段と、
   前記閉ループを構成している前記容器および試料移送管内の溶液を循環的に移送するための送液ポンプと、
   前記送液ポンプの運転により前記試料移送管内の圧力が所定のレベル以上に高まったときは前記低分子化合物を選択的に排出できるフィルタと、
   前記試料移送管内の圧力を監視する手段と、
   を備えることを特徴とする核磁気共鳴測定を行うための装置。
2. 前記制御部は、さらに、前記試料移送管にバッファー液または清浄な水を注入する手段と、前記閉ループを構成している前記容器および試料移送管内の溶液を排出するための排出バルブを備える請求項１記載の核磁気共鳴測定を行うための装置。
3. 前記フィルタは、前記試料移送管内の圧力増加によって試料内の低分子化合物または液体のみが外部へ排出される膜あるいは中空状の物質を介して前記試料移送管に接続され、前記膜あるいは中空状の物質を通過した低分子化合物または液体が保持される液溜部とで構成される請求項１記載の核磁気共鳴測定を行うための装置。
4. 前記高分子化合物を含む溶液を注入する手段および前記低分子化合物を含む溶液を注入する手段のそれぞれはシリンジポンプで構成され、シリンジポンプからの注入量が電子機器によって制御される請求項１記載の核磁気共鳴測定を行うための装置。
5. 前記送液ポンプは電子制御可能なステッピングモーターによって駆動されるプランジャーによって前記閉ループを構成している前記容器および試料移送管内に定圧送液を行うものである請求項１記載の核磁気共鳴測定を行うための装置。
6. 前記試料移送管に、低分子化合物を含む溶液を注入する手段が、低分子化合物を含む溶液に代えて低分子化合物を含まない溶液を注入するものとされた請求項１記載の核磁気共鳴測定を行うための装置。
7. 前記試料移送管に、低分子化合物を含む溶液を注入する手段が、複数個設けられ、それぞれの低分子化合物を含む溶液を注入する手段の低分子化合物が異なるものとされた請求項１記載の核磁気共鳴測定を行うための装置。
8. 前記試料移送管に、低分子化合物を含む溶液を注入する手段の少なくとも一つは、低分子化合物を含まない溶液を注入するものとされた請求項７記載の核磁気共鳴測定を行うための装置。
9. 試料に磁場を加えるための磁石と、
   前記磁石による磁場の形成されている領域に配置された核磁気共鳴プローブと、
   前記核磁気共鳴プローブに設置された試料を保持する容器と、
   前記容器の試料に対して電磁波を送るあるいは前記核磁気共鳴プローブから電磁波を受け取る送受信システムと、
   前記容器を含めて閉ループを構成する試料移送管と、
   前記試料移送管の一部に設けられた制御部とよりなり、
   前記制御部には
   前記試料移送管に測定対象となる高分子化合物を含む溶液を注入する手段と、
   前記試料移送管に、低分子化合物を含む溶液を注入する手段と、
   前記閉ループを構成している前記容器および試料移送管内の溶液を循環的に移送するための送液ポンプと、
   前記送液ポンプの運転により前記試料移送管内の圧力が所定のレベル以上に高まったときは前記低分子化合物を選択的に排出できるフィルタと、
   前記試料移送管内の圧力を監視する手段と、
   前記試料移送管にバッファー液または清浄な水を注入する手段と、
   前記閉ループを構成している前記容器および試料移送管内の溶液を排出するための排出バルブと、
   を備える核磁気共鳴測定を行うための装置による測定方法が、
   前記試料移送管にバッファー液または清浄な水を注入する手段を介してバッファー液を供給しながら、前記送液ポンプを運転して前記閉ループを構成している前記容器および試料移送管内をバッファー液で満たすこと、
   次いで、測定対象となる高分子化合物を含む溶液を注入する手段により前記送液ポンプを運転しながら前記閉ループを構成している前記容器および試料移送管内に高分子化合物を含んだ試料溶液を注入すること、
   次いで、低分子化合物を含む溶液を注入する手段により前記送液ポンプを運転しながら前記閉ループを構成している前記容器および試料移送管内に低分子化合物を含んだ試料溶液を注入すること、
   により、前記閉ループを構成している前記容器および試料移送管内の前記高分子化合物の量を所定値に維持しながら、前記低分子化合物の相対的な量を変更可能としたことを特徴とする核磁気共鳴測定方法。
10. 前記閉ループを構成している前記容器および試料移送管内に低分子化合物を含んだ試料溶液の注入動作、あるいは、低分子化合物に代えて低分子化合物を含まない試料溶液の注入動作による希釈動作を必要に応じて繰り返し実施する請求項９記載の核磁気共鳴測定方法。

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