JP3836702B2 - リボソームの構造およびタンパク質合成インヒビター - Google Patents

Description

【０００１】
（関連出願）
本出願は、２０００年８月９日に出願された米国出願番号０９／６３５，７０８の一部継続出願、ならびに（ｉ）２０００年８月９日に出願された米国仮出願番号６０／２２３，９７７、（ｉｉ）２００１年７月２０日に出願された「Ｔｈｅ Ｋｉｎｋ−Ｔｕｒｎ：ａ Ｎｅｗ ＲＮＡ Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｍｏｔｉｆ」という表題の、米国仮出願番号［Ａｔｔｙ．Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．ＲＩＢ−００２ＰＲ］、および（ｉｉｉ）２００１年８月１日に出願された「Ｔｈｅ Ｋｉｎｋ−Ｔｕｒｎ：ａ Ｎｅｗ ＲＮＡ」という表題の、米国仮出願番号［Ａｔｔｙ．Ｄｏｃｋｅｔ Ｎｏ．ＲＩＢ−００２ＰＲ２］の利益を主張する。前述の開示の各々は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（政府のライセンス権利）
本明細書中で記載された特定の研究は、米国国立衛生研究所によって授与された連邦政府助成金番号ＮＩＨ−ＧＭ２２７７８およびＮＩＨ−ＧＭ５４２１６によって、一部支援された。政府は、本発明において特定の権利を有し得る。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般的には、タンパク質生合成の分野およびタンパク質生合成のモジュレーター（例えば、インヒビター）に関する。より特に、本発明は、単独またはタンパク質合成インヒビターと組み合わせた大リボソームサブユニットの３次元構造を解明するための方法および組成物；単独またはタンパク質合成インヒビターと組み合わせた大リボソームサブユニットの３次元構造；このような構造の、新規のタンパク質合成インヒビターの設計および試験における使用；ならびに、新規のタンパク質合成インヒビター、に関する。
【０００４】
（背景）
（Ｉ．リボソーム：構造、機能および組成）
リボソームは、原核生物および真核生物の両方において存在するリボ核タンパク質である。リボソームは、約３分の２のＲＮＡ、そして３分の１のタンパク質からなる。リボソームは、タンパク質合成を担う細胞小器官である。遺伝子発現の間、リボソームは、メッセンジャーＲＮＡにコードされた遺伝情報を、タンパク質に翻訳する（Ｇａｒｒｅｔｔら（２０００）「Ｔｈｅ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，」Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。
【０００５】
リボソームは、２つの等価ではないリボ核タンパク質サブユニットを構成する。大きい方のサブユニット（「大リボソームサブユニット」としても公知である）は、小さい方のサブユニット（「小リボソームサブユニット」としても公知である）の大きさの約２倍である。小リボソームサブユニットは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を結合し、そして翻訳の忠実度が依存するｍＲＮＡとトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のアンチコドンとの間の相互作用を媒介する。大リボソームサブユニットは、ペプチド結合形成を触媒し（タンパク質合成のペプチジルトランスフェラーゼ反応）、そして（少なくとも）２つの異なるｔＲＮＡ結合部位を含む：入来するアミノアシルｔＲＮＡ（成長するペプチド鎖にアミノ酸を与える）を適応させるＡ部位、およびペプチジルｔＲＮＡ複合体（すなわち、ペプチド鎖に付加されるまではすべてのアミノ酸に連結されるｔＲＮＡ）を適応させるＰ部位。大リボソームサブユニットはまた、タンパク質合成の開始期、伸長期および終結期において援助するＧタンパク質因子の１つ以上の結合部位を含む。大リボソームサブユニットおよび小リボソームサブユニットは、タンパク質合成の開始期の間に独立してふるまう；しかし、これらのサブユニットは、今にも伸長が開始されようとしているときに、完全なリボソームへと集合する。
【０００６】
原核生物のリボソームの分子量は、約２．６×１０⁶ダルトンである。原核生物において、小リボソームサブユニットは、約５．０×１０⁵ダルトンの分子量を有する１６Ｓ（Ｓｖｅｄｂｅｒｇ単位）リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含む。大リボソームサブユニットは、約１．０×１０⁶ダルトンの分子量を有する２３Ｓ ｒＲＮＡ、および約４．０×１０⁵ダルトンの分子量を有する５Ｓ ｒＲＮＡを含む。原核生物の小サブユニットは、約２０の異なるタンパク質を含み、そしてその大サブユニットは、約３５のタンパク質を含む。大リボソームサブユニットおよび小リボソームサブユニットは、原核生物において、一緒に７０Ｓリボソームを構成する。
【０００７】
真核生物のリボソームは、一般的に、その原核生物の対応物よりも大きい。真核生物において、大リボソームサブユニットおよび小サブユニットは、一緒に８０Ｓリボソームを構成する。真核生物のリボソームの小サブユニットは、単一の１８Ｓ ｒＲＮＡを含むが、一方、大サブユニットは、５Ｓ ｒＲＮＡ、５．８Ｓ ｒＲＮＡおよび２８Ｓ ｒＲＮＡを含む。５．８Ｓ ｒＲＮＡは、構造的に、原核生物の２３Ｓ ｒＲＮＡの５’末端に関連し、そして２８Ｓ ｒＲＮＡは、構造的に、原核生物の２３Ｓ ｒＲＮＡの残りに関連する（Ｍｏｏｒｅ（１９９８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７：３５−５８）。真核生物のリボソームタンパク質は、性質上原核生物のリボソームタンパク質に類似する；しかし、真核生物のタンパク質はより大きく、そしてより多数からなる（Ｍｏｏｒｅ（１９９８）前出）。
【０００８】
（ＩＩ．大リボソームサブユニットの構造保存）
大リボソームサブユニットの化学組成は、種間によって異なるが、この成分の配列は、これらが３次元構造において類似し、類似の様式で機能し、そして進化的に関連するという明白な証拠を提供する。入手可能なｒＲＮＡ配列データの進化的に密接な関係は、Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（ＺｉｍｍｅｒｍａｎｎおよびＤａｈｌｂｅｒｇ、編）、（ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９６）の第ＩＩ章におけるＷｏｅｓｅなどの論文において総説される。同じ巻の第ＩＶ章におけるＧａｒｒｅｔおよびＲｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｆｏｎｓｅｃａによる論文では、大リボソームサブユニットのペプチジルトランスフェラーゼ領域において観察される、著しく高レベルの配列保存が議論される。Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉのような古細菌（ａｒｃｈｅａｌ）種のリボソームは、Ｅ．ｃｏｌｉのような真正細菌種から得られたリボソームに大きさおよび複雑さが似ている。しかし、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉリボソームにおけるタンパク質は、真核生物において見出されたリボソームタンパク質により密接に関連する（Ｗｏｏｌら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７３：９３３−９４７）。
【０００９】
（ＩＩＩ．リボソームの構造の決定）
リボソームの構造について公知の事柄の多くは、比較的低分解能の情報を生成する物理学的方法および化学的方法から導かれる。電子顕微鏡（ＥＭ）は、リボソームが発見されて以来ずっと、リボソーム構造の理解に寄与してきた。１９７０年代に、低分解能のＥＭによって、リボソームの形状および４要素からなる構成が明らかにされた。１９８０年代末までに、Ｅ．ｃｏｌｉの小サブユニットにおけるすべてのタンパク質、ならびに大サブユニットにおける多くのタンパク質の表面エピトープの位置が、免疫電子顕微鏡法技術を使用して、マッピングされた（Ｏａｋｅｓら（１９８６）、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ，（Ｈａｒｄｅｓｔｙ，Ｂ．およびＫｒａｍｅｒ，Ｇ．、編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，４７−６７頁；Ｓｔｏｅｆｆｌｅｒら（１９８６），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ，（Ｈａｒｄｅｓｔｙ，Ｂ．およびＫｒａｍｅｒ，Ｇ．、編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２８−４６頁）。最近数年間に、単一粒子の凍結ＥＭおよび画像再構築における利点が、１５Åと２５Åとの間の分解能までのＥ．ｃｏｌｉの７０ＳリボソームならびにｔＲＮＡおよび伸長因子とのその複合体の３次元再構築を導いた（Ｓｔａｒｋら（１９９５）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ３：８１５−８２１；Ｓｔａｒｋら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ ３８９８：４０３−４０６；Ａｇｒａｗａｌら（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１：１０００−１００２；Ｓｔａｒｋら（１９９７）Ｃｅｌｌ ２８：１９−２８）。さらに、リボソームの３次元ＥＭ画像が、十分に高い分解能で生成され、その結果、タンパク質合成において援助するタンパク質および核酸の多くが、リボソームに結合して可視化され得る。大サブユニットにおけるＲＮＡ構造の近似モデルが、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の５０Ｓサブユニットの７．５Å分解能の電子顕微鏡地図、および入手可能な生化学的データに適合するように構築された（Ｍｕｅｌｌｅｒら（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９８：３５−５９）。
【００１０】
ＥＭによって提供された洞察が有用である一方、リボソーム構造の完全な理解はＸ線結晶学のみから導かれると長い間認識されていた。１９７９年に、ＹｏｎａｔｈおよびＷｉｔｔｍａｎは、リボソームおよびリボソームサブユニットの最初の潜在的に有用な結晶を得た（Ｙｏｎａｔｈら（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｔ．１：４２８−４３５）。１９８０年代中頃までに、科学者らは、Ｘ線結晶学のためのリボソームの結晶を調製していた（Ｍａｓｋｏｗｓｋｉら（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９３：８１８−８２２）。Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５０Ｓリボソームサブユニットの最初の結晶は、１９８７年に得られた。１９９１年には、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの５０Ｓリボソームサブユニットの結晶から得られ得る回折データの分解能における改良が報告された（ｖａｎ Ｂｏｈｌｅｎ，Ｋ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：１１）。
【００１１】
１９９５年には、好塩菌供給源および好熱性細菌供給源由来の大リボソームサブユニットおよび小リボソームサブユニットの低分解能電子密度地図が報告された（Ｓｃｈｌｕｎｚｅｎら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７３：７３９−７４９）。しかし、これらの低分解能電子密度地図は、偽であることが証明された（Ｂａｎら（１９９８）Ｃｅｌｌ ９３：１１０５−１１１５）。
【００１２】
二重鎖ＲＮＡとして認識できる特徴を示したリボソームの最初の電子密度地図は、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の大サブユニットの９Åの分解能のＸ線結晶学的地図であった（Ｂａｎら（１９９８）前出）。５Åの分解能までのこの地図のフェイジング（ｐｈａｓｉｎｇ）の拡大は、いくつかのタンパク質および核酸配列の位置決定を可能にし、これらの構造は独立に決定された（Ｂａｎら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４００：８４１−８４７）。
【００１３】
ほぼ同時に、同様の結晶学的ストラテジーを使用して、ｔＲＮＡ分子のＡ部位、Ｐ部位およびＥ部位（タンパク質の出口部位）に結合したｔＲＮＡ分子の位置を示す完全なＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのリボソームの７．８Åの分解能の地図が生成され（Ｃａｔｅら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：２０９５−２１０４）、そして、解かれたタンパク質の構造およびそのＲＮＡの特徴のいくつかの解釈の適合を可能にするＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来の３０Ｓサブユニットの５．５Åの分解能の地図が得られた（Ｃｌｅｍｏｎｓ，Ｊｒ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ ４００：８３３−８４０）。引き続いて、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓの３０Ｓサブユニットの４．５Åの分解能の地図が公表され、この地図は、６Åの分解能の実験地図を使用して得られたサブユニットの質量の２８％に対応するモデルから計算された位相に、一部基づいた（Ｔｏｃｉｌｊら（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１４２５２−１４２５７）。
【００１４】
（ＩＶ．大リボソームサブユニットにおけるペプチジルトランスフェラーゼ部位の位置）
約３５年間、メッセンジャーＲＮＡ指向性タンパク質合成の間に起こるペプチド結合形成を担うペプチジルトランスフェラーゼ活性が、大リボソームサブユニットに内因性であることが公知であり（Ｔｒａｕｔら（１９６４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：６３；Ｒｙｃｈｌｉｋ（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １１４：４２５；Ｍｏｎｒｏ（１９６７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：１４７−１５１；Ｍａｎｄｅｎら（１９６８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５：３３３−３４５）、そしてリボソームが、タンパク質ならびにＲＮＡを含むことが、いっそう長い間理解されていた。例えば、細菌の特定の種では、大リボソームサブユニットは、約３５の異なるタンパク質および２つのＲＮＡを含む（Ｎｏｌｌｅｒ（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：１１９−１６２；Ｗｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉｅｂｏｌｄら（１９９０）Ｔｈｅ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，（Ｗ．Ｅ．Ｈｉｌｌら、編）Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９０），５９８−６１６頁）。これらの知見は、３つの関連した質問を提起した。どの大リボソームサブユニットの約４０の高分子成分が、そのペプチジルトランスフェラーゼ部位に寄与するのか、どこが、大サブユニットに位置するペプチジルトランスフェラーゼ部位なのか、そしてどのようにして働くのか。
【００１５】
１９８０年までに、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼの一部分であり得る成分のリストが、約６つのタンパク質および２３Ｓ ｒＲＮＡに減少された（Ｃｏｏｐｅｒｍａｎ（１９８０）Ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（Ｇ．Ｃｈａｍｂｌｉｓｓら、編）Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐａｒｋ Ｐｒｅｓｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９８０），５３１−５５４）を参照のこと）。その後、触媒ＲＮＡが発見され（Ｇｕｅｒｒｉｅｒ−Ｔａｋａｄａら（１９８３）Ｃｅｌｌ ３５：８４９−８５７；Ｋｒｕｎｇｅｒら（１９８２）Ｃｅｌｌ ３１：１４７−１５７）、２３Ｓ ｒＲＮＡが、その唯一の成分であると仮定され、これは、支持を得る数年前に提唱された。１９８４年には、Ｎｏｌｌｅｒおよび同僚が、Ｕ２６１９およびＵ２６２０（Ｅ．ｃｏｌｉでは、Ｕ２５８４、Ｕ２５８５）が、Ｐ部位に結合したｔＲＮＡのＣＣＡ末端に隣接することを示したアフィニティー標識の結果を公表した（Ｂａｒｔａら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３６０７−３６１１；Ｖｅｓｔｅｒら（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．７：３５７７−３５８７）。これらのヌクレオチドは、２３Ｓ ｒＲＮＡのＶドメインの中央の高度に保存された内部ループの一部分のようである。このループが、ペプチジルトランスフェラーゼ活性に密接に関与するという仮説は、ループにおける変異が、細胞をペプチジルトランスフェラーゼの多くのインヒビターに対して耐性にするという観察によって支持され、そしてこの活性に関係している証拠が、マウントに寄与した（Ｎｏｌｌｅｒ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：１９１−２２７；Ｇａｒｒｅｔｔら（１９９６）Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｒ．Ａ．ＺｉｍｍｅｒｍａｎおよびＡ．Ｅ．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、編）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ（１９９６），３２７−３５５頁を参照のこと）。
【００１６】
しかし、Ｖドメインの中央のループが、ペプチジルトランスフェラーゼ活性に関与するリボソームの唯一の成分であるという決定的な証拠は、分かりにくいものであった。大リボソームサブユニットのますます強力な脱タンパク質化（ｄｅｐｒｏｔｅｉｎｉｚａｔｉｏｎ）によって、ペプチジルトランスフェラーゼ活性を保持した粒子を調製することが可能であったが、完全にタンパク質を含まない活性な粒子を生成することは可能ではなかったという研究が示された。にもかかわらず、初期の再構成の結果（Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｉら（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：６６７６−６６８２）と相まって、この研究は、関与し得るタンパク質の数を、ただ２つ：Ｌ２およびＬ３に限定した（Ｇｒｅｅｎら（１９９７）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６：６７９−７１６）。より最近には、Ｗａｔａｎａｂｅおよび共同研究者が、インビトロで合成されたタンパク質を含まない２３Ｓ ｒＲＮＡ由来のペプチジルトランスフェラーゼ活性の誘発における成功を報告した（Ｎｉｔｔａら（１９９８）ＲＮＡ ４：２５７−２６７）。しかし、これらの観察は、さらなる精査に耐えられないようである。従って、問題がなお残った：リボソームはリボザイムか、またはリボソームはリボザイムではないのか。
【００１７】
数年にわたり、リボソームにおけるペプチジルトランスフェラーゼ部位の位置は、電子顕微鏡によってほとんど独占的に近づいた。１９８０年代中頃には、大リボソームサブユニットのサブユニット界面側の中央から、その後ろまで、大リボソームサブユニットを通って走るトンネルが存在するという証拠（Ｍｉｌｌｉｇａｎら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ ３１９：６９３−６９５；Ｙｏｎａｔｈら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３６：８１３−８１６）が蓄積され始め、そしてポリペプチドが合成されるときに、ポリペプチドがトンネルを通過すると考えられる強い根拠が存在している（Ｂｅｒｎａｂｅｕら（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：３１１１−３１１５；Ｒｙａｂｏｖａら（１９８８）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２６：２５５−２６０；Ｂｅｃｋｍａｎｎら（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７８：２１２３−２１２６）。より最近には、凍結ＥＭ研究（Ｆｒａｎｋら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７６：４４１−４４４；Ｆｒａｎｋら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．７３：７５７−７６５；Ｓｔａｒｋら（１９９５）前出）が、トンネルの存在を確認し、そしてＡ部位およびＰ部位に結合した、リボソーム結合ｔＲＮＡのＣＣＡ末端が、トンネルのサブユニットの界面の末端で見出されたことが示された。結果として、ペプチジルトランスフェラーゼ部位は、同じ位置に配置されるはずであり、この位置は、大サブユニットのサブユニットの界面の表面の中央の深い裂け目の底、すなわちその中央の隆起の直下である。
【００１８】
大サブユニットのペプチジルトランスフェラーゼ部位で触媒される反応の基質は、アミノアシルｔＲＮＡ（ａａ−ｔＲＮＡ）およびペプチジルｔＲＮＡである。アミノアシルｔＲＮＡは、リボソームのＡ部位で結合し、そしてペプチジルｔＲＮＡは、そのＰ部位で結合する。ａａ−ｔＲＮＡのαアミノ基は、ペプチジルｔＲＮＡの３’ヒドロキシル基をアシル化するカルボニルの炭素を攻撃し、そして四面体の中間体が、カルボニル炭素で形成される。四面体の中間体は、ｔＲＮＡを結合したＡ部位にエステル化された１つのアミノ酸、およびＰ部位の脱アシル化ｔＲＮＡによって伸長されたペプチドを生じることを解明する。
【００１９】
この反応スキームは、ホスホルアミド（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｅ）基を介して、ピューロマイシンに配列ＣＣｄＡを有するオリゴヌクレオチドを結合させることによって、四面体の中間体のアナログを合成したＹａｒｕｓおよび同僚の知見によって支持される（Ｗｅｌｃｈら（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３４：３８５−３９０）。すべてのｔＲＮＡの３’末端配列である配列ＣＣＡは、単独で大サブユニットに結合し、これは、ｔＲＮＡと大サブユニットとの間の相互作用が、それらのＣＣＡ配列に主として依存することを示す生化学的データと矛盾しない（Ｍｏａｚｅｄら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３７２５−３７２８）。ピューロマイシンは、リボソームのＡ部位と相互作用するａａ−ｔＲＮＡアナログであり、そして化合物のホスホルアミド基は、四面体の炭素中間体を模倣する。この遷移状態のアナログ（ＣＣｄＡ−リン酸−ピューロマイシン（ＣＣｄＡ−ｐ−Ｐｕｒｏ）は、リボソームに堅固に結合し、そしてそのペプチジルトランスフェラーゼ活性を阻害する（Ｗｅｌｃｈら（１９９５）前出）。
【００２０】
（Ｖ．Ｘ線結晶学を使用した高分子の構造決定）
リボソームの構造を決定するために行われる試みをより良く記載するために、Ｘ線結晶学の一般的な概要を以下に提供する。
【００２１】
結晶中の各々の原子は、すべての方向にＸ線を散乱するが、結晶性回折は、結晶がＸ線ビームに対して方向付けられ、その結果、原子散乱が構成的に干渉する場合のみに、観察される。回折を導く配向は、使用されるＸ線の波長ならびに結晶の単位格子の対称および寸法が既知である場合に、計算され得る（Ｂｌｕｎｄｅｌｌら（１９７６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｉｅｓ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）。結果は、検出器が、適切な波長の単色Ｘ線で照射される結晶の背面に位置する場合、記録された回折パターンはスポットからなり、各々のスポットは、構成的な干渉を生じる配向のうちの一つを示す。
【００２２】
記録はされているが、このようなパターンの各々のスポットは、（ｉ）強度（しばしば、スポットの黒さともいわれる）；（ｉｉ）回折の配向についての情報をコードする位置；および（ｉｉｉ）位相、によって特徴付けられる。これらの事柄のすべてが、結晶回折パターンの各々のスポットについて既知であれば、結晶の単位格子における電子分布は、フーリエ変換によって計算され得（Ｂｌｕｎｄｅｌｌら（１９７６）前出）、そしてこの分布または電子密度地図から、原子の位置が決定され得る。
【００２３】
残念ながら、電子分布の計算に必須の位相情報は、回折パターンから直接測定できない。高分子（例えば、タンパク質および核酸）の位相を決定するために慣用的に用いられる方法の一つは、多重同形置換法（ＭＩＲ）と呼ばれ、この方法は、結晶の単位格子へのＸ線散乱の導入に関与する。代表的には、これらの添加は重原子であり、これは、回折パターンに有意に寄与する。添加は、これらの位置が位置付けされ得るような十分に少ない数であることが重要であり、そしてこれらの位置は、分子または結晶の構造を、変更されていない格子のままにしておく（すなわち、結晶が同形であるべきである）ことが重要である。同形置換は、通常、異なる重金属複合体を、あらかじめ形成されたタンパク質結晶のチャネルに拡散させることによって行われる。高分子は、重金属を結合し得るこれらの溶媒チャネルにおける側鎖（例えば、ＳＨ基）を露出する。金属タンパク質における内因性の軽金属を、より重い金属で置換すること（例えば、水銀で銅を置換、またはサマリウムでカルシウムを置換）もまた可能である。あるいは、同形の誘導体は、溶液中で重金属を高分子に共有結合的に付着させることによって得られ得、次いで、これを結晶化状態に供する。
【００２４】
慣用的に同形置換のために使用される重金属原子としては、水銀、ウラン、白金、金、鉛およびセレンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の例としては、塩化水銀、リン酸エチル水銀およびペンタミン（ｐｅｎｔａｍｉｎｅ）オスミウム、ペンタミンイリジウムが挙げられる。このような重金属は、タンパク質の軽い原子（Ｈ、Ｎ、Ｃ、ＯおよびＳ）よりも多くの電子を含むので、重金属は、より強力にＸ線を散乱する。従って、すべての回折されたビームは、すべての干渉が正であった場合、重金属置での換後に強度が増加する。しかし、実際に、いくつかの干渉が負である；結果として、重金属での置換後に、いくつかのスポットの強度が増加し、他のスポットの強度は減少し、そして多くは、検出可能な差を示さない。
【００２５】
回折されたスポット間の位相の差は、重金属での置換後の強度の変化から決定され得る。第一に、強度の差は、結晶の単位格子における重原子の位置を推定するために使用される。これらの強度差のフーリエ加法は、重原子間のベクトルの地図（いわゆるパターソン地図）を与える。これらのベクトル地図から、重原子の原子配列が推定される。単位格子における重金属の位置から、重金属を含むタンパク質結晶の回折されたビームへの寄与の振幅および位相が計算される。
【００２６】
次いで、この情報は、重金属原子の存在しないタンパク質からの寄与の位相を見出すために使用される。重金属の位相および振幅、ならびにタンパク質単独の振幅の両方が公知である場合、ならびにタンパク質および重金属（すなわち、タンパク質−重金属複合体）の振幅が公知である場合、一つの位相および三つの振幅が公知である。これより、重金属およびタンパク質によって散乱されるＸ線の干渉は、干渉が構成的または破壊的である場合に、決定するために使用され得る。重金属の位相の情報を有する正の干渉または負の干渉の程度が、タンパク質の位相の評価を与える。２つの異なる位相の角度が決定され、そしてこの２つの異なる位相の角度は、等しく良好な解釈であるので、２つの可能な位相角度もまた与える第二の重金属複合体が用いられ得る。これらのうちの一つのみが、２つの以前の位相角度のうちの一つと同じ値を有する；従って、これは、正確な位相角度を表す。実際には、２つ以上の異なる重金属複合体が、通常、すべての反射についての位相の合理的に良好な評価を与えるために作製される。各々の個々の位相の評価は、測定された振幅における誤差から生じた実験誤差を含む。さらに、多くの反射について、強度差は、小さすぎてある特定の同形置換後に測定できず、そして他の同形置換が試みられ得る。
【００２７】
タンパク質結晶からの回折データの振幅および位相は、結晶の繰り返し単位の電子密度地図を計算するために使用される。次いで、この地図は、目的の分子の残基を適応させるように解釈される。この解釈は、データにおけるいくつかの限定によってより複雑になされる。第一に、地図自体は、主に、位相角度における誤差に起因した誤差を含む。さらに、地図の質は、回折データの分解能に依存し、次には、どのくらい結晶が順序よく配置されているかに依存する。これは、生成され得る地図の質に直接影響する。分解能は、オングストローム単位（Å）で測定される；この数が小さい程、分解能は高くなり、従って、観察され得る細部の量がより多くなる。
【００２８】
初期モデルの形成は、試行錯誤のプロセスである。第一に、どのように、ポリペプチド鎖または核酸が、電子密度地図を通って縫うように進むかを決定しなければならない。得られた鎖のトレースは、ポリペプチドまたは核酸の既知の配列に、側鎖の密度を整合させようとする仮説を構成する。無理のない鎖のトレースが最終的に得られると、分子の原子を電子密度に整合する初期モデルが形成される。コンピュータグラフィックが、鎖のトレースおよびモデル形成の両方のために使用され、データおよび操作されたモデルを示す。
【００２９】
初期モデルは、いくつかの誤差を含む。結晶が、十分に高い分解能まで（例えば、３．５Åより良好に）回折するならば、ほとんどすべての誤差または実質的にすべての誤差は、コンピュータアルゴリズムを使用して、モデルの結晶学的精密化によって取り除かれる。このプロセスにおいて、モデルは、実験的に観察された回折振幅とモデルを含む推測に基づく結晶（実際の分子の代わりに）について計算された回折振幅との間の差を最小にするために変化される。この差は、Ｒ因子（説明がつかない不一致）として表され、Ｒ因子は、正確に一致すると０．０であり、そして合計の不一致は約０．５９である。
【００３０】
一般的に、首尾良く決定された高分子構造のＲ因子は、好ましくは、０．１５と０．３５との間である（例えば、約０．２４〜０．２８未満）。残りの差は、データにおける誤差および不完全の結果である。これらは、種々の源（タンパク質分子の立体配座のわずかな変異、ならびに溶媒の存在および結晶が生成される微結晶の配向における差の両方の不正確な補正を含む）に由来する。これは、最終モデルが、立体配座および配向の両方においてわずかに異なる分子の平均を示す。
【００３１】
高分解能での精密化された構造において、タンパク質または核酸の配列が既知であれば、個々の残基の配向における重大な誤差は通常存在せず、そして原子位置における見積もられた誤差は、通常約０．１〜０．２Åである。目的分子の内部の水素結合および結合したリガンドへの水素結合の両方は、高度の信頼性で同定され得る。
【００３２】
代表的には、分解能が３．５Åよりも良好であれば、Ｘ線構造は決定され得る。電子密度地図は、既知のアミノ酸配列および／または核酸配列を電子密度の領域に整合させることによって解釈される。
【００３３】
（ＶＩ．５０Ｓリボソームサブユニットのより高い分解能のための必要性）
本技術は、５０Ｓリボソームサブユニットの結晶ならびに５０Ｓリボソーム構造の９Åおよび５Åの分解能のＸ線結晶学的地図を提供するが、先行技術の結晶およびＸ線回折データは、５０Ｓリボソームサブユニットの３１個のタンパク質および３，０４３個のヌクレオチドすべての３次元構造を確立するに十分ではない。従って、先行技術の結晶および地図は、活性薬剤（例えば、除草剤、薬物、殺虫剤および動物毒）の、構造に基づいた設計に不十分である。
【００３４】
より詳細には、より高分解能のＸ線結晶学的地図が、リボソームおよびリボソームサブユニット（特に、５０Ｓリボソームサブユニット）におけるタンパク質およびヌクレオチドの、位置および３次元構造を決定するために必要である。５０Ｓリボソームサブユニットの正確な分子構造は、タンパク質合成の機構のさらなる研究および理解を可能にするだけではなく、タンパク質合成を調節する（例えば、誘導するかまたは阻害する）効果的な治療剤および薬物の開発もまた可能にする。
【００３５】
（発明の要旨）
（項１） リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶であって、この結晶が、約１５μｍを超える平均の厚さを有する、結晶。
（項２） 項１に記載の結晶であって、上記平均の厚さが、約１６μｍ〜約６５μｍ、約６６μｍ〜約１０５μｍ、約１０４μｍ〜約１５５μｍおよび約１５６μｍ〜約２０５μｍからなる群より選択される、結晶。
（項３） 上記平均の厚さが、約１００μｍ〜約２００μｍである、項１に記載の結晶。
（項４） リボソームまたはリボソームサブユニットの双晶ではない結晶。
（項５） 上記リボソームサブユニットが、大リボソームサブユニットである、項１または４に記載の結晶。
（項６） 上記リボソームサブユニットが、小リボソームサブユニットである、項１または４に記載の結晶。
（項７） 上記リボソームサブユニットが、５０Ｓリボソームサブユニットである、項１または４に記載の結晶。
（項８） 上記リボソームまたはリボソームサブユニットが、原核生物または真核生物から得られる、項１または４に記載の結晶。
（項９） 上記リボソームまたはリボソームサブユニットが、始原細菌から得られる、項１または４に記載の結晶。
（項１０） 上記リボソームまたはリボソームサブユニットが、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉから得られる、項１または４に記載の結晶。
（項１１） 上記リボソームサブユニットが、６０Ｓリボソームサブユニットである、項１または４に記載の結晶。
（項１２） 上記リボソームまたはリボソームサブユニットが、哺乳動物から得られる、項１または４に記載の結晶。
（項１３） 上記結晶が、原子座標の決定のために、少なくとも約３．０Åの分解能まで効果的にＸ線を回折する、項１または４に記載の結晶。
（項１４） 項１または４に記載の結晶であって、この結晶が、リガンドをさらに含む、結晶。
（項１５） 上記リガンドが、上記リボソームまたはリボソームサブユニットに結合される、項１４に記載の結晶。
（項１６） 上記リガンドが、抗生物質である、項１５に記載の結晶。
（項１７） 上記抗生物質が、マクロライド抗生物質である、項１６に記載の結晶。
（項１８） リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶であって、この結晶が、原子座標の決定のために、少なくとも約３．０Åの分解能まで効果的にＸ線を回折する、結晶。
（項１９） リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶であって、この結晶が、原子座標の決定のために、約２．４Åの分解能まで効果的にＸ線を回折する、結晶。
（項２０） リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶であって、この結晶が、このリボソームまたはリボソームサブユニットの原子座標の決定に十分である、結晶。
（項２１） ５０Ｓリボソームサブユニットの結晶であって、この結晶が、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ＢａｎｋにＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫまたはＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された原子座標によって特徴付けられる原子構造を含む、結晶。
（項２２） 項２１に記載の座標から計算された、位相。
（項２３） 選択されたリボソームサブユニットの電子密度地図を得る方法であって、ここで、この選択されたリボソームサブユニットは、項２２に記載の計算された位相を得るために使用されたリボソームサブユニットとは異なり、この方法が、以下の工程：
（ａ）選択されたリボソームサブユニットの結晶を生成する工程であって、この結晶が、同形である、工程；
（ｂ）工程（ａ）において得られた結晶の回折振幅を得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られた回折振幅と、項２２に記載の計算された位相とを組み合わせて、組み合わせたデータセットを生成する工程；および
（ｄ）工程（ｃ）において得られた組み合わせたデータセットに基づいた、選択されたリボソームサブユニットの電子密度地図を得る工程、
を包含する、方法。
（項２４） 選択されたリボソームサブユニットの電子密度地図を得る方法であって、ここで、この選択されたリボソームサブユニットが、項２２に記載の計算された位相を得るために使用されたリボソームサブユニットに密接に関連し、この方法が、以下の工程：
（ａ）選択されたリボソームサブユニットの結晶を生成する工程であって、この結晶が、項２２に記載の位相を計算するために使用された結晶とは異なる対称を有する異なる単位格子で結晶化する、工程；
（ｂ）工程（ａ）において生成された結晶についてのＸ線回折データを得る工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られたデータを使用することによって、この選択されたリボソームサブユニットの位相を得る工程、および分子置換技術で項２２に記載の計算された位相を得る工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）において得られた位相から、この選択されたリボソームサブユニットの電子密度地図を得る工程、
を包含する、方法。
（項２５） 選択されたリボソームサブユニットのモデルを得る方法であって、ここで、この選択されたリボソームサブユニットが、項２２に記載の計算された位相を得るために使用されたリボソームサブユニットとは異なるが、項２２に記載の計算された位相を得るために使用されたリボソームサブユニットとなお相同であり、この方法が以下の工程：
（ａ）選択されたリボソームサブユニットの結晶を生成する工程；
（ｂ）工程（ａ）において生成された結晶についての原子座標を得る工程；ならびに
（ｃ）工程（ｂ）において得られた原子座標および項２２に記載の計算された位相を使用した相同性モデリングによって、この選択されたリボソームサブユニットについてのモデルを得る工程、
を包含する、方法。
（項２６） リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶を成長させる方法であって、この方法が以下の工程：
（ａ）リボソームまたはリボソームサブユニットを単離する工程；
（ｂ）このリボソームまたはリボソームサブユニットを沈殿させる工程；
（ｃ）この沈殿したリボソームまたはリボソームサブユニットを逆抽出し、溶液を得る工程；
（ｄ）この逆抽出された溶液に結晶種を入れる工程；
（ｅ）室温での蒸気拡散によって、この結晶種を入れた溶液からこのリボソームまたはリボソームサブユニットの結晶を成長させる工程；および
（ｆ）この結晶を収集する工程、
を包含する、方法。
（項２７） 項２６に記載の方法であって、この方法が、以下の工程：
（ｇ）高塩濃度を含む溶液への漸進的移行によって、上記結晶を安定化させる工程；および
（ｈ）高塩濃度下で、この結晶を維持する工程、
をさらに包含する、方法。
（項２８） 上記高塩濃度が、約１．２Ｍ塩〜約１．７Ｍ塩である、項２７に記載の方法。
（項２９） 項２７に記載の方法であって、この方法が以下の工程：
（ｉ）上記結晶を、フラッシュ凍結する工程、
をさらに包含する、方法。
（項３０） 項２６、２７、２８または２９に記載の方法によって生成された結晶。
（項３１） リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶についてのＸ線回折データを得る方法であって、この方法が、以下の工程：
（ａ）リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶を得る工程であって、ここで、この結晶は、１以上の以下の特徴：
（１）１５μｍを超える平均の厚さ；
（２）双晶ではない；
を有する、工程；および
（ｂ）Ｘ線結晶学を使用して、このリボソームまたはリボソームサブユニットの結晶についてのＸ線回折データを得る工程、
を包含する、方法。
（項３２） リボソームまたはリボソームサブユニットの電子密度地図を得る方法であって、この方法が、項３１に記載の方法によって得られたＸ線回折データを使用して、このリボソームまたはリボソームサブユニットの電子密度地図を得る工程、を包含する、方法。
（項３３） リボソームおよびリガンドの複合体、またはリボソームサブユニットおよびリガンドの複合体についてのＸ線回折データを得る方法であって、この方法が、以下の工程：
（ａ）リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶を得る工程であって、ここで、この結晶が、１以上の以下の特徴：
（１）１５μｍを超える平均の厚さ；
（２）双晶ではない；
を有する、結晶である、工程；
（ｂ）結晶を通じてリガンドを拡散させ、その結果、このリガンドが、このリボソームまたはリボソームサブユニットを結合し、複合体を形成する、工程；および
（ｃ）Ｘ線結晶学を使用して、この複合体についてのＸ線回折データを得る、工程、
を包含する、方法。
（項３４） リボソームおよびリガンドの複合体、またはリボソームサブユニットおよびリガンドの複合体についてのＸ線回折データを得る方法であって、この方法が、以下の工程：
（ａ）リボソームおよびリガンドの複合体またはリボソームサブユニットおよびリガンドの複合体の共結晶を得る工程であって、ここで、この共結晶が、１以上の以下の特徴：
（１）１５μｍを超える平均の厚さ；
（２）双晶ではない；
を有する、工程；ならびに
（ｂ）Ｘ線結晶学を使用して、この複合体についてのＸ線回折データを得る、工程、
を包含する、方法。
（項３５） リボソームおよびリガンドの複合体、またはリボソームサブユニットおよびリガンドの複合体についての電子密度地図を得る方法であって、この方法が、項３３または３４に記載の方法によって得られたＸ線回折データを使用して、このリボソームおよびこのリガンドのこの複合体、またはこのリボソームサブユニットおよびこのリガンドのこの複合体の電子密度地図を得る、工程、を包含する、方法。
（項３６） 上記リガンドが、抗生物質である、項３３または３４に記載の方法。
（項３７） リボソームへのリガンドの付着、またはリボソームサブユニットへのリガンドの付着の位置を決定する方法であって、この方法が、以下の工程：
（ａ）項３１に記載のリボソームまたはリボソームサブユニットについてのＸ線回折データを得る、工程；
（ｂ）項３３または３４に記載の方法に従って、リボソームおよびリガンドの複合体、またはリボソームサブユニットおよびリガンドの複合体についてのＸ線回折データを得る、工程；
（ｃ）工程（ｂ）において得られたＸ線回折データから、工程（ａ）において得られたＸ線回折データを減じ、Ｘ線回折データにおける差を得る、工程；
（ｄ）ＭＩＲ、ＭＩＲＡＳおよびＳＡＤからなる群より選択される１つ以上の技術を使用して、工程（ａ）において得られたＸ線回折データに対応する位相を得る、工程；
（ｅ）工程（ｄ）において得られた位相、および工程（ｃ）において得られたＸ線回折データにおける差を利用して、このリガンドの差フーリエ像を計算する、工程；ならびに
（ｆ）工程（ｅ）において得られた計算に基づいた、リボソームへのこのリガンドの付着、またはリボソームサブユニットへのこのリガンドの付着の位置を決定する、工程、
を包含する、方法。
（項３８） リボソームに付着したリガンドの地図、またはリボソームサブユニットに付着したリガンドの地図を得る方法であって、この方法が、以下の工程：（ａ）項３１に記載のリボソームまたはリボソームサブユニットについてのＸ線回折データを得る、工程；
（ｂ）項３３または３４に記載の方法に従って、リボソームおよびリガンドの複合体、またはリボソームサブユニットおよびリガンドの複合体についてのＸ線回折データを得る、工程；
（ｃ）ＭＩＲ、ＭＩＲＡＳおよびＳＡＤからなる群より選択される１つ以上の技術を使用して、工程（ａ）において得られたＸ線回折データに対応する位相を得る、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）において得られた位相、および工程（ｂ）において得られたＸ線回折データを利用して、このリガンドおよびこのリボソームの地図、またはこのリガンドおよびこのリボソームサブユニットの地図を計算する、工程、
を包含する、方法。
（項３９） 上記リガンドが、抗生物質である、項３７に記載の方法。
（項４０） 改変剤を得る方法であって、この方法が、以下の工程：
（ａ）結合した因子を含むリボソームまたはリボソームサブユニットの結晶、あるいは結合した因子を含まないリボソームまたはリボソームサブユニットの結晶を得る、工程；
（ｂ）この結合した因子を含むリボソームまたはリボソームサブユニットの少なくとも一部分の原子座標、あるいはこの結合した因子を含まないリボソームまたはリボソームサブユニットの少なくとも一部分の原子座標を得る、工程；
（ｃ）この原子座標および１つ以上の分子モデリング技術を使用して、どのようにリボソームまたはリボソームサブユニットとのこの因子の相互作用を変更するかを決定する、工程；ならびに
（ｄ）工程（ｃ）において得られた決定に基づいた因子を変更し、改変剤を生成する、工程、
を包含する、方法。
（項４１） 項４０に記載の方法であって、上記１つ以上の分子モデリング技術が、グラフィック分子モデリングおよび計算機化学からなる群より選択される、方法。
（項４２） 項４０に記載の方法であって、この方法が、リボソームまたはリボソームサブユニットと、上記改変剤とを接触させる工程、ならびにこのリボソームまたはリボソームサブユニットと、この改変剤との相互作用を検出する、工程、をさらに包含する、方法。
（項４３） 項４０に記載の方法によって生成された改変剤であって、この改変剤が、この改変剤が誘導される因子とは異なって、リボソームまたはリボソームサブユニットに結合する、改変剤。
（項４４） 上記改変剤が、治療剤である、項４３に記載の改変剤。
（項４５） 項４０に記載の方法であって、上記リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶の原子座標が、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯまたはＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された、方法。
（項４６） 項４０に記載の方法によって生成された改変剤であって、この改変剤が、この改変剤が誘導される因子とは異なって、リボソームまたはリボソームサブユニットに結合する、改変剤。
（項４７） コンピューターシステムであって、このコンピューターシステムが、以下：
（ａ）少なくとも約４．５Åの分解能を有し、そしてリボソームの大サブユニットのリボファンクショナル位置を決定する電子密度地図から誘導される原子座標を示す、メモリー内に保存されたデータを有するメモリー；および
（ｂ）このメモリーを有する電気通信におけるプロセッサであって、このプロセッサが、このリボファンクショナル位置の代表である３次元モデルを生成するためのプログラムを含む、プロセッサ、
を含む、コンピューターシステム。
（項４８） 項４７に記載のコンピューターシステムであって、このコンピューターシステムが、上記モデルの視覚表示を提供するためのデバイスをさらに含む、コンピューターシステム。
（項４９） 項４７に記載のコンピューターシステムであって、上記原子座標が、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯまたはＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された、この原子座標の少なくとも一部分を含む、コンピューターシステム。
（項５０） 項４７に記載のコンピューターシステムであって、上記原子座標が、リボファンクショナル位置と複合体化したタンパク質合成インヒビターの少なくとも一部分をさらに規定する、コンピューターシステム。
（項５１） 上記タンパク質合成インヒビターが、抗生物質である、項５０に記載のコンピューターシステム。
（項５２） 項５１に記載のコンピューターシステムであって、上記原子座標が、ディスク番号３の３の、ファイル番号ａｎｉｓｏｍｙｃｉｎ．ｐｄｂ、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ．ｐｄｂ、ｃａｒｂｏｍｙｃｉｎ．ｐｄｂ、ｓｐａｒｓｏｍｙｃｉｎ．ｐｄｂ、ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ．ｐｄｂ、ｔｙｌｏｓｉｎ．ｐｄｂまたはｖｉｒｇｉｎｉａｍｙｃｉｎ．ｐｄｂの下で記録された原子座標の少なくとも一部分を含む、コンピューターシステム。
（項５３） 上記リボファンクショナル位置が、上記リボソームサブユニットにおける活性部位の少なくとも一部分を含む、項４７に記載のコンピューターシステム。
（項５４） 上記活性部位が、ペプチジルトランスフェラーゼ部位の少なくとも一部分を含む、項５３に記載のコンピューターシステム。
（項５５） 上記ペプチジルトランスフェラーゼ部位が、表５に示される複数の残基によって規定される、項５４に記載のコンピューターシステム。
（項５６） 上記リボファンクショナル位置が、Ａ部位の少なくとも一部分を含む、項４７に記載のコンピューターシステム。
（項５７） 上記Ａ部位が、表６に示される複数の残基によって規定される、項５６に記載のコンピューターシステム。
（項５８） 上記リボファンクショナル位置が、Ｐ部位の少なくとも一部分を含む、項４７または５６に記載のコンピューターシステム。
（項５９） 上記Ｐ部位が、表７に示される複数の残基によって規定される、項５８に記載のコンピューターシステム。
（項６０） 上記リボファンクショナル位置が、ポリペプチド出口トンネルの少なくとも一部分を含む、項４７または５６に記載のコンピューターシステム。
（項６１） 上記出口トンネルが、表８、表９または表１０に示される複数の残基によって規定される、項６０に記載のコンピューターシステム。
（項６２） 上記リボファンクショナル位置が、ポリペプチド出口トンネルの少なくとも一部分を含む、項５８に記載のコンピューターシステム。
（項６３） 上記出口トンネルが、表８、表９または表１０に示される複数の残基によって規定される、項６２に記載のコンピューターシステム。
（項６４） 上記リボファンクショナル位置が、表１１、表１２、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７に示される複数の残基によって規定される、項４７に記載のコンピューターシステム。
（項６５） 上記原子座標が、分子モデリングによって生成される、項４７に記載のコンピューターシステム。
（項６６） 項４７または６５に記載のコンピューターシステムであって、上記原子座標が、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯまたはＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された原子座標の少なくとも一部分を使用して、相同性モデリングによって生成される、コンピューターシステム。
（項６７） 項４７または６５に記載のコンピューターシステムであって、上記原子座標が、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯまたはＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された原子座標の少なくとも一部分を使用して、分子置換によって生成される、コンピューターシステム。
（項６８） 上記リボファンクショナル位置が、リボソームＲＮＡの原子によって規定される、項４７に記載のコンピューターシステム。
（項６９） 上記リボファンクショナル位置が、リボソームタンパク質の原子によって規定される、項４７または６８に記載のコンピューターシステム。
（項７０） 上記原子座標が、病原体のリボソームに存在するが、宿主生物のリボソームには存在しない残基を規定する、項４７に記載のコンピューターシステム。
（項７１） 上記宿主生物が、哺乳動物である、項７０に記載のコンピューターシステム。
（項７２） 上記哺乳動物が、ヒトである、項７１に記載のコンピューターシステム。
（項７３） 上記原子座標が、病原体間で保存された残基を規定する、項４７に記載のコンピューターシステム。
（項７４） 項４７に記載のコンピューターシステムであって、このコンピューターシステムが、薬物設計を行うためのプログラムをさらに含む、コンピューターシステム。
（項７５） 項４７に記載のコンピューターシステムによって生成された、分子モデル。
（項７６） 候補分子を同定する方法であって、この方法が、以下の工程：
（ａ）リボソームの大サブユニットのリボファンクショナル位置の分子モデルを提供する工程であって、ここで、この分子モデルが、少なくとも約４．５Åの分解能を有する電子密度地図から誘導された原子に基づく、工程；および
（ｂ）このモデルを使用して、リボファンクショナル位置に相補的な表面を有する候補分子を同定する、工程、
を包含する、方法。
（項７７） 上記候補化合物が、上記リボソームの大サブユニットのリボファンクショナル位置を結合する、項７６に記載の方法。
（項７８） 項７６に記載の方法であって、この方法が、工程（ｂ）において同定された候補分子を生成するさらなる工程を包含する、方法。
（項７９） 項７６または７８に記載の方法であって、この方法が、上記候補分子が、リボソーム活性を調節するか否かを決定するさらなる工程を包含する、方法。
（項８０） 項７９に記載の方法であって、この方法が、改変された分子を同定するさらなる工程を包含する、方法。
（項８１） 項８０に記載の方法であって、この方法が、上記改変された分子を生成するさらなる工程を包含する、方法。
（項８２） 項８１に記載の方法であって、この方法が、上記改変された分子が、リボソーム活性を調節するか否かを決定するさらなる工程を包含する、方法。
（項８３） 項８２に記載の方法であって、この方法が、上記改変された分子を生成するさらなる工程を包含する、方法。
（項８４） 上記候補分子が、抗生物質または抗生物質のアナログである、項７６に記載の方法。
（項８５） 上記改変された分子が、抗生物質または抗生物質のアナログである、項８０に記載の方法。
（項８６） 上記抗生物質または抗生物質のアナログが、マクロライドである、項８４に記載の方法。
（項８７） 上記リボファンクショナル位置が、活性部位の少なくとも一部分を含む、項７６に記載の方法。
（項８８） 上記活性部位が、ペプチジルトランスフェラーゼ部位の少なくとも一部分を含む、項８７に記載の方法。
（項８９） 上記ペプチジルトランスフェラーゼ部位が、表５に示される複数の残基によって規定される、項８７に記載の方法。
（項９０） 上記リボファンクショナル位置が、Ａ部位の少なくとも一部分を含む、項７６に記載の方法。
（項９１） 上記Ａ部位が、表６に示される複数の残基によって規定される、項９０に記載の方法。
（項９２） 上記リボファンクショナル位置が、Ｐ部位の少なくとも一部分を含む、項７６または９０に記載の方法。
（項９３） 上記Ｐ部位が、表７に示される複数の残基によって規定される、項９２に記載の方法。
（項９４） 上記リボファンクショナル位置が、ポリペプチド出口トンネルの少なくとも一部を含む、項７６または９０に記載の方法。
（項９５） 上記出口トンネルが、表８、表９または表１０に示される複数の残基によって規定される、項９４に記載の方法。
（項９６） 上記リボファンクショナル位置が、ポリペプチド出口トンネルの少なくとも一部を含む、項９２に記載の方法。
（項９７） 上記出口トンネルが、表８、表９または表１０に示される複数の残基によって規定される、項９６に記載の方法。
（項９８） 上記リボファンクショナル位置が、表１１、表１２、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７に示される複数の残基によって規定される、項７６に記載の方法。
（項９９） 上記分子モデルが電子形態である、項７６に記載の方法。
（項１００） 上記分子モデルが、分子モデリングによって生成された原子座標から生成される、項７６に記載の方法。
（項１０１） 項７６または１００に記載の方法であって、上記分子モデルが、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯまたはＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された原子座標の少なくとも一部分を使用して、相同性モデリングによって生成された原子座標から生成される、方法。
（項１０２） 項７６または１００に記載の方法であって、上記分子モデルが、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯまたはＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された原子座標の少なくとも一部分を使用して、分子置換によって生成された原子座標から生成される、方法。
（項１０３） 上記分子モデルが、原核生物間で保存される残基を含む、項７６に記載の方法。
（項１０４） 上記分子モデルが、原核生物のリボソームにおいて存在するが、真核生物のリボソームにおいては存在しない残基を含む、項７６に記載の方法。
（項１０５） 上記真核生物のリボソームが、哺乳動物のリボソームである、項１０４に記載の方法。
（項１０６） タンパク質合成インヒビターであって、このタンパク質合成インヒビターが、以下：
大リボソームサブユニットにおいて第一の接触部位と結合する既知の第一の分子の表面を模倣するか、またはこの表面を複製する表面を有する、第一の結合ドメイン；および
このリボソームサブユニットにおいて第二の接触部位と結合する既知の第二の分子の表面を模倣するか、またはこの表面を複製する表面を有する、第二の結合ドメイン、
を含み、ここで、この第一のドメインが、この第一のドメインおよびこの第二のドメインの両方と、そのそれぞれの接触部位との結合を可能にするように、この第二のドメインに付着し、それによって、リボソームサブユニットにおけるタンパク質合成を中断する、タンパク質合成インヒビター。
（項１０７） 上記第一の分子が、第一の抗生物質である、項１０６に記載のインヒビター。
（項１０８） 上記第一の抗生物質が、リボファンクショナル位置の少なくとも一部分を結合する、項１０６に記載のインヒビター。
（項１０９） 上記第二の分子が、第二の抗生物質である、項１０６または１０７に記載のインヒビター。
（項１１０） 上記第二の抗生物質が、リボファンクショナル位置の少なくとも一部分を結合する、項１０９に記載のインヒビター。
（項１１１） 操作された合成のタンパク質合成インヒビターであって、このインヒビターが、以下：
リボソームサブユニットにおいて接触部位と結合する既知の分子の表面を模倣するか、またはこの表面を複製する表面を有する結合ドメイン；および
この接触部位とのこの結合ドメインの結合に際して、このリボソームサブユニットの内部または隣接する空間を占有し、それによって、このリボソームサブユニットにおけるタンパク質合成を中断する、この結合ドメインに付着するエフェクタードメイン、
を含む、インヒビター。
（項１１２） 上記結合ドメインの表面が、上記接触部位に結合する既知の抗生物質の表面を模倣するか、またはこの表面を複製する、項１１１に記載のインヒビター。
【００３６】
本発明は、部分的に、リボソームサブユニット、より特に、リボソームの大サブユニットの高分解能の原子構造の決定に基づく。生物Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉに存在する大リボソームサブユニットについての高分解能の構造が決定された。しかし、異なる界の生物のリボソーム間における高レベルの配列相同性および高レベルの構造相同性を考慮して、本明細書中で開示される構造情報は、慣用的な技術を使用して、目的の任意の生物についての大リボソームサブユニットの高分解能の構造モデルを生成するために使用され得る。
【００３７】
異なる界のリボソーム間（例えば、ヒトのリボソームと特定のヒト病原体のリボソームとの間）において有意な相同性が存在するが、治療的に利用され得る差異は、依然として存在する。例えば、多くの臨床的および産業的に有意なタンパク質合成インヒビター（例えば、ストレプトマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコールおよびエリトロマイシンのような抗生物質）は、リボソームを選択的に標的化し、そして細菌のタンパク質合成を中断するが、同時に、ヒトのリボソーム機能を標的化しないか、そうでなければ有意にその機能に影響を及ぼさない。結果として、長年にわたって、抗生物質は、ヒトにおける微生物感染の処置において非常に貴重であることが証明されていた。しかし、新規のタンパク質合成インヒビターについての進行中の必要性が依然として存在する。なぜなら、特に、既知の抗生物質に対して耐性の病原体の菌株が発生するからである。本明細書中で提供される情報は、新規のタンパク質合成インヒビターの設計への洞察を提供する。
【００３８】
本明細書中で、本発明は、高分解能の、目的のリボソームサブユニットの３次元構造を解明するための方法および組成物を提供する。さらに、本発明は、リボソーム、より特には大リボソームサブユニットの３次元構造の少なくとも一部分を規定する原子座標を含むコンピュータシステムを提供する。さらに、本発明は、原子座標を使用する方法を提供し、選択的にリボソームに結合し得、そして、好ましくは、タンパク質合成の選択的インヒビターとして作用する新規の分子を同定する。さらに、本発明は、タンパク質合成インヒビターの新規のファミリーを提供する。本発明のこれらの局面の各々を、以下により詳細に議論する。
【００３９】
一つの局面において、本発明は、約１５μｍを超える平均の厚さのリボソームまたはリボソームサブユニットの結晶（好ましくは、双晶ではない結晶）を提供する。より特に、本発明は、約１６μｍ〜約６５μｍ、もしくは約６６μｍ〜約１０５μｍ、または約１０４μｍ〜約１５５μｍ、あるいは約１５６μｍ〜約２０５μｍの平均の厚さを有する結晶を提供する。特に、本発明は、約１００μｍ〜約２００μｍの平均の厚さを有する結晶を提供する。
【００４０】
好ましい実施形態において、本発明は、１５μｍを超える平均の厚さを有する結晶および／または双晶ではない結晶を提供し、ここで、この結晶は、大リボソームサブユニットを含む。より特に、本発明は、このような結晶を提供し、ここで、大リボソームサブユニットは、５０Ｓリボソームサブユニットまたは６０Ｓリボソームサブユニットである。結晶は、原核生物由来のリボソームまたはリボソームサブユニットあるいは真核生物由来のリボソームまたはリボソームサブユニットを使用して得られ得る。好ましい実施形態において、本発明は、細菌または始原細菌、より特に、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ生物から得られる、リボソームまたはリボソームサブユニットを含む結晶を提供する。しかし、結晶は、任意の生物（特に、動物から、より特に、哺乳動物から、そしていっそうより特に、ヒトから）由来のリボソームまたはリボソームサブユニットから得られ得る。
【００４１】
別の好ましい実施形態において、結晶は、リボソームまたはリボソームサブユニットの原子座標の決定のために、少なくとも約４．５Åの分解能まで、好ましくは、少なくとも約３．０Åの分解能まで、そして最も好ましくは、約２．４Åの分解能まで、Ｘ線を回折する。別の好ましい実施形態において、本発明の結晶はまた、リボソームまたはリボソームサブユニットと複合体化したか、あるいはリボソームまたはリボソームサブユニットに結合したリガンド（例えば、タンパク質合成インヒビター（例えば、抗生物質（例えば、マクロライド抗生物質）））を含み得る。
【００４２】
別の局面において、本発明は、５０Ｓリボソームサブユニットの結晶を提供し、この結晶の原子構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ＩＤ：１ＦＦＫまたは１ＪＪ２で登録された原子座標によって特徴付けられる。本発明は、さらに、登録された座標の座標から計算された位相およびこのような位相情報の使用を提供する。好ましい実施形態において、本発明は、５０Ｓリボソームサブユニットの結晶を提供し、この結晶の原子構造は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ＩＤ：１ＦＦＺ（ＣｃｄＡ−ｐ−Ｐｕｒｏと複合体化した大リボソームサブユニット）；またはＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ＩＤ：１ＦＧＯ（アミノアシル−ｔＲＮＡのミニヘリックスアナログと複合体化した大リボソームサブユニット）；ならびにディスク番号３の３に含まれるファイル中に列挙された原子座標によって特徴付けられる原子構造を有するこれらのリボソームサブユニット、特に：アニソマイシンと複合体化した大リボソームサブユニット（ファイル名：ａｎｉｓｏｍｙｃｉｎ．ｐｄｂ）；ブラスチシジンと複合体化した大リボソームサブユニット（ファイル名：ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ．ｐｄｂ）；カルボマイシンと複合体化した大リボソームサブユニット（ファイル名：ｃａｒｂｏｍｙｃｉｎ．ｐｄｂ）；チロシンと複合体化した大リボソームサブユニット（ファイル番号：ｔｙｌｏｓｉｎ．ｐｄｂ）；スパルソマイシンと複合体化した大リボソームサブユニット（ファイル番号：ｓｐａｒｓｏｍｙｃｉｎ．ｐｄｂ）；ヴァージニアマイシンと複合体化した大リボソームサブユニット（ファイル番号：ｖｉｒｇｉｎｉａｍｙｃｉｎ．ｐｄｂ）；またはスピラマイシンと複合体化した大リボソームサブユニット（ファイル番号：ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ．ｐｄｂ）を提供する。
【００４３】
別の実施形態において、本発明は、構造がすでに決定されている（例えば、Ｘ線結晶学によって）リボソームサブユニットとわずかに異なるのみである目的のリボソームサブユニットの電子密度地図を得る方法を提供する。この方法は、（ａ）目的のリボソームサブユニットの結晶を生成する工程であって、ここで、この結晶が同形である、工程；（ｂ）工程（ａ）において生成された結晶の回折振幅を得る工程；（ｃ）すでに既知である構造のリボソームサブユニットの結晶の位相を、工程（ｂ）において得られた回折振幅と組み合わせ、組み合わせたデータセットを生成する、工程；および（ｄ）工程（ｃ）において得られた組み合わせたデータセットに基づいて、選択されたリボソームサブユニットの電子密度地図を得る工程を包含する。
【００４４】
別の実施形態において、本発明は、構造が既知であるリボソームサブユニットに関連する目的のリボソームサブユニットの電子密度地図を得る方法をさらに提供する。この方法は、（ａ）目的のリボソームサブユニットの結晶を生成する工程であって、ここで、この結晶が、構造が既知のリボソームサブユニットの結晶とは異なる対称を有する異なる単位格子で結晶する工程；（ｂ）目的の結晶のＸ線回折データを得る工程；（ｃ）既知のリボソームサブユニットの原子座標を、目的の結晶の単位格子に挿入する工程、および原子座標をモデリングし、その結果、この原子座標が、工程（ｂ）において得られるＸ線回折データに類似する理論的なＸ線回折データを生成し得る工程；（ｄ）工程（ｃ）においてモデル化された原子座標から、目的の結晶の位相を得る工程；ならびに（ｅ）工程（ｂ）において得られたＸ線回折データおよび工程（ｄ）において得られた位相から、目的のリボソームサブユニットの電子密度地図を得る工程を包含する。
【００４５】
さらに、本発明は、目的のリボソームサブユニットのモデルを得る方法であって、ここで、目的のリボソームサブユニットは、計算された位相を生成するために使用されたリボソームサブユニットとは有意に異なるが、この使用されたリボソームサブユニットになお相同である方法を提供する。この方法は、（ａ）構造が既知であるリボソームサブユニットの原子座標を提供する工程；および（ｂ）相同モデリングを使用して、目的のリボソームサブユニットの原子座標を生成する工程を包含する。
【００４６】
別の局面において、本発明は、リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶を成長させる方法、ならびにこのような方法から得られた結晶を提供する。この方法は、（ａ）リボソームまたはリボソームサブユニットを単離する工程；（ｂ）リボソームまたはリボソームサブユニットを沈殿させる工程；（ｃ）沈殿したリボソームまたはリボソームサブユニットを逆抽出し、溶液を得る工程；（ｄ）逆抽出された溶液に結晶種を入れる工程；（ｅ） 室温で、蒸気拡散によって、結晶種をいれた溶液からリボソームまたはリボソームサブユニットの結晶を成長させる工程；ならびに（ｆ）結晶を収集する工程を包含する。必要に応じて、この方法は、１つ以上の以下の工程：（ｇ）高塩濃度（例えば、約１．２Ｍ塩〜約１．７Ｍ塩）を含む溶液への漸進的移行によって、結晶を安定化させる工程；（ｈ）このような高塩濃度下で、結晶を維持する工程、および（ｉ）結晶を、フラッシュ凍結する工程、をさらに包含する。
【００４７】
別の局面において、本発明は、リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶についてのＸ線回折データを得る方法を提供する。この方法は、（ａ）リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶を得る工程であって、ここで、この結晶が、１つ以上の以下の特徴（１）１５μｍを超える平均の厚さ、および（２）双晶ではない、を有する工程；ならびに（ｂ）Ｘ線結晶学を使用して、リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶についてのＸ線回折データを得る工程を包含する。本発明はまた、リボソームまたはリボソームサブユニットの電子密度地図得る方法であって、本明細書中で開示されるＸ線回折データを使用して、リボソームまたはリボソームサブユニットの電子密度地図を得る工程を包含する方法を開示する。
【００４８】
別の局面において、本発明は、リボソームおよびリガンド（例えば、タンパク質合成インヒビター）の複合体またはリボソームサブユニットおよびリガンドの複合体についてのＸ線回折データを得る方法を提供する。この方法は、（ａ）リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶を得る工程であって、ここで、この結晶が、１つ以上の以下の特徴：（１）１５μｍを超える平均の厚さ、および（２）双晶ではないを有する工程；（ｂ）リガンドを結晶に拡散する工程、および複合体を形成するために、リガンドの結晶への結合を可能にする工程；ならびに（ｃ）Ｘ線結晶学を使用して、この複合体についてのＸ線回折データを得る工程を包含する。代替の局面において、本発明は、リボソームおよびリガンド（例えば、タンパク質合成インヒビター）の複合体またはリボソームサブユニットおよびリガンドの複合体についてのＸ線回折データを得る方法を提供する。この方法は、（ａ）リボソームおよびリガンドの複合体またはリボソームサブユニットおよびリガンドの複合体の共結晶を得る工程であって、ここで、この共結晶が、１つ以上の以下の特徴：（１）１５μｍを超える平均の厚さ、および（２）双晶ではないを有する工程；ならびに（ｂ）Ｘ線結晶学を使用して、この複合体についてのＸ線回折データを得る工程を包含する。いずれかの方法において、Ｘ線回折データは、リボソームおよびリガンドの複合体またはリボソームサブユニットおよびリガンドの複合体についての電子密度地図を生成するために使用され得る。
【００４９】
好ましい実施形態において、本発明は、リボソームへのこのようなリガンドの結合、またはリボソームサブユニットへのリガンドの結合の位置を位置付けする方法を提供する。この方法は、（ａ）リボソームまたはリボソームサブユニットについてのＸ線回折データを得る工程；（ｂ）リボソームおよびリガンドの複合体、またはリボソームサブユニットおよびリガンドの複合体についてのＸ線回折データを得る工程；（ｃ）工程（ｂ）において得られたＸ線回折データから、工程（ａ）において得られたＸ線回折データを減じ、Ｘ線回折データにおける差を得る工程；（ｄ）ＭＩＲ、ＭＩＲＡＳ、ＳＡＤおよび既存の原子構造からの計算からなる群より選択される１つ以上の技術を使用して、工程（ａ）において得られたＸ線回折データに対応する位相を得る工程；（ｅ）工程（ｄ）において得られた位相および工程（ｃ）において得られたＸ線回折データにおける差を使用して、リガンドの差フーリエ像を計算する工程；ならびに（ｆ）工程（ｅ）において得られた計算に基づいて、リボソームへのリガンドの結合、またはリボソームサブユニットへのリガンドの結合の位置を決定する工程を包含する。
【００５０】
別の実施形態において、本発明は、リボソームに結合したこのようなリガンドまたはリボソームサブユニットに結合したリガンドの地図を得る代替の方法を提供する。この方法は、（ａ）リボソームまたはリボソームサブユニットについてのＸ線回折データを得る工程；（ｂ）リボソームおよびリガンドの複合体、またはリボソームサブユニットおよびリガンドの複合体についてのＸ線回折データを得る工程；（ｃ）ＭＩＲ、ＭＩＲＡＳ、ＳＡＤおよび既存の原子構造からの計算からなる群より選択される１つ以上の技術を使用して、工程（ａ）において得られたＸ線回折データに対応する位相を得る工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）において得られた位相および工程（ｂ）において得られたＸ線回折データを使用して、リガンドおよびリボソームの地図またはリガンドおよびリボソームサブユニットの地図を計算する工程を包含する。
【００５１】
別の局面において、本発明は、（ａ）少なくとも約４．５Å、より好ましくは、少なくとも約３．０Å、そして最も好ましくは、約２．４Åまでの分解能を有し、そしてリボソームの大サブユニットのリボファンクショナル位置を決定する電子密度地図から誘導される原子座標を示す、メモリ内に保存されたデータを有するメモリー；および（ｂ）メモリーを有する電気通信におけるプロセッサであって、このプロセッサが、このリボファンクショナル位置の代表である３次元モデルを生成するためのプログラムを含むプロセッサ、を含むコンピュータシステムを提供する。好ましい実施形態においては、このコンピュータシステムは、デバイス（例えば、分子モデルの視覚表示を提供するためのコンピュータモニターまたはターミナル）をさらに含む。別の好ましい実施形態において、このプロセッサは、合理的な薬物設計を容易にするための１つ以上のプログラムをさらに含む。
【００５２】
好ましい実施形態において、このコンピュータシステムは、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯまたはＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された原子座標の少なくとも一部分をさらに含む。別の好ましい実施形態において、この原子座標は、タンパク質合成インヒビター（例えば、抗生物質、より特に、リボファンクショナル位置（例えば、本明細書中に含まれるディスク番号３の３コンパクトディスクに記録された原子座標の少なくとも一部分）と複合体化した、アニソマイシン、ブラスチシジン、カルボマイシン、スパルソマイシン、スピラマイシン、チロシンおよびヴァージニアマイシンからなる群より選択される抗生物質）の少なくとも一部分をさらに規定する。
【００５３】
好ましい実施形態において、このリボファンクショナル位置は、リボソームサブユニットにおける活性部位の少なくとも一部分（例えば、１つ以上の以下：ペプチジルトランスフェラーゼ部位（表５に示される複数の残基によって規定され得る部分）；Ａ部位（表６に示される複数の残基によって規定され得る部分）；Ｐ部位（表７に示される複数の残基によって規定され得る部分）；ポリペプチド出口トンネル（表８、表９または表１０に示される複数の残基によって規定され得る部分）；あるいは抗生物質結合ドメイン（表１１、表１２、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７に示される複数の残基によって規定され得る部分）の少なくとも一部分）を含む。複数の残基は、少なくとも３残基、好ましくは、少なくとも５残基、そしてより好ましくは、少なくとも１０残基を含むように考慮されるべきである。リボファンクショナル位置は、リボソームＲＮＡの原子、１つ以上のリボソームタンパク質の原子、またはリボソームＲＮＡおよび１つ以上のリボソームタンパク質との組み合わせの原子によって規定され得る。
【００５４】
別の好ましい実施形態において、原子座標は、分子モデリングによって生成される。本明細書中で提供される原子座標を使用して、当業者は、従来技術（例えば、従来の相同性モデリング、および分子置換技術）を使用して、目的の任意のリボソームのモデルを生成し得る。別の実施形態において、原子座標は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯまたはＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された原子座標、あるいはディスク番号３の３のコンパクトディスクに含まれる原子座標の少なくとも一部分を使用した相同性モデリングによって生成される。別の実施形態において、原子座標は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯまたはＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された原子座標、あるいはディスク番号３の３のコンパクトディスクに含まれる原子座標の少なくとも一部分を使用した分子置換によって生成される。
【００５５】
好ましい実施形態において、原子座標は、病原体（例えば、原核生物）のリボソームまたはリボソームサブユニット間で保存される残基、そして必要に応じて、しかしより好ましくは、宿主生物（例えば、ヒト）のリボソームまたはリボソームサブユニットにはまた存在しない残基を規定する。別の好ましい実施形態において、原子座標は、原核生物（例えば、細菌）のリボソームまたはリボソームサブユニット間で保存される残基、そして必要に応じて、しかしより好ましくは、真核生物（例えば、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）のリボソームサブユニットにはまた存在しない残基を規定する。この情報は、例えば、１つ以上の分子モデルの使用を介して使用され、新規の分子（例えば、病原体（例えば、細菌）におけるタンパク質合成を中断するが、宿主細胞（例えば、ヒト）におけるタンパク質合成を中断しないか、またはそうでなければ、この合成に実質的に影響を及ぼさないタンパク質合成インヒビター）を開発するために利用され得る合理的な薬物設計の標的を同定し得る。
【００５６】
別の局面において、本発明は、合理的な薬物設計を介した、新規の分子の設計、試験および精密化のための種々の方法を提供する。例えば、本発明は、（ａ）リボソームの大リボソームサブユニットのリボファンクショナル位置を有するモデル（例えば、分子モデル）を提供する工程であって、ここで、このモデルが、少なくとも約４．５Å、より好ましくは、少なくとも約３．０Å、そしてより好ましくは、約２．４Åまでの分解能を有する電子密度地図から誘導される原子の空間配置によって規定される工程；および（ｂ）このモデルを使用して、リボファンクショナル位置に相補的な表面を有する候補分子を同定する工程を包含する方法を提供する。好ましくは、この候補分子は、リボソームの大サブユニットのリボファンクショナル位置を立体化学的に内部適合させ（ｉｎｔｅｒｆｉｔ）、そしてより好ましくは、この位置に結合する。
【００５７】
好ましい実施形態において、この方法は、１つ以上のさらなる以下の工程：このような方法において同定された候補分子を生成する工程；生成された場合、この候補分子が、リボソーム活性を調節（例えば、誘導または減少）するか否かを決定する工程；改変された分子を同定する工程；この改変された分子を生成する工程；生成された場合、この改変された分子が、リボソーム活性を調節するか否かを決定する工程；および、単独または薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせてのいずれかの使用のために、改変された分子を生成する工程を包含する。この候補分子および／または改変された分子は、抗生物質または抗生物質のアナログ（例えば、マクロライド抗生物質またはマクロライドアナログ）であり得る。
【００５８】
好ましい実施形態において、このような方法において使用されるリボファンクショナル位置は、リボソームサブユニットにおいて、活性部位の少なくとも一部分を含む。別の好ましい実施形態において、このリボファンクショナル位置は、１つ以上の以下：ペプチジルトランスフェラーゼ部位（表５において示される複数の残基によって規定され得る部分）；Ａ部位（表６において示される複数の残基によって規定され得る部分）；Ｐ部位（表７において示される複数の残基によって規定され得る部分）；ポリペプチド出口トンネル（表８、表９または表１０において示される複数の残基によって規定され得る部分）；あるいは抗生物質結合ドメイン（表１１、表１２、表１３、表１４、表１５、表１６または表１７において示される複数の残基によって規定され得る部分）の少なくとも一部分によって規定される。このリボファンクショナル位置は、リボソームＲＮＡの原子、１つ以上のリボソームタンパク質の原子、またはリボソームＲＮＡおよび１つ以上のリボソームタンパク質との組み合わせの原子によって規定され得る。
【００５９】
別の好ましい実施形態において、原子座標は、電子形態における分子モデルを生成するために使用される。原子座標は、好ましくは、分子モデリングによって生成される。別の実施形態において、原子座標は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯまたはＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された原子座標、あるいはディスク番号３の３のコンパクトディスクに含まれる原子座標の少なくとも一部分を使用した相同性モデリングによって生成される。別の実施形態において、原子座標は、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯまたはＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された原子座標、あるいはディスク番号３の３のコンパクトディスクに含まれる原子座標の少なくとも一部分を使用した分子置換によって生成される。
【００６０】
好ましい実施形態において、原子座標は、病原体（例えば、原核生物）のリボソームまたはリボソームサブユニットの間で保存される残基、あるいは宿主生物（例えば、ヒト）のリボソームまたはリボソームサブユニットにはまた存在しない残基を規定し得る。別の好ましい実施形態において、原子座標は、原核生物（例えば、細菌）のリボソームまたはリボソームサブユニットの間で保存される残基、あるいは、必要に応じて、真核生物（例えば、哺乳動物、より好ましくは、ヒト）のリボソームまたはリボソームサブユニットにはまた存在しない残基を規定し得る。この情報は、例えば、１つ以上の分子モデルの使用を介して使用され、新規の分子（例えば、病原体（例えば、細菌）においてはタンパク質合成を中断するが、宿主生物（例えば、ヒト）においてはタンパク質合成を中断しないか、またはそうでなければ、実質的にタンパク質合成に影響を及ぼさないタンパク質合成インヒビター）を開発するために利用され得る合理的な薬物設計のための標的を同定し得る。
【００６１】
好ましい実施形態において、本発明は、改変剤を得る方法を提供する。この方法は、（ａ）リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶を得る工程；（ｂ）結晶の原子座標を得る工程；（ｃ）原子座標および１つ以上の分子モデリング技術（例えば、グラフィック分子モデリングおよび計算機化学）を使用して、どのようにリボソームまたはリボソームサブユニットとの因子の相互作用を改変するかを決定する工程；ならびに（ｄ）工程（ｃ）において得られた決定に基づいて、この因子を改変し、改変剤を生成する工程を包含する。あるいは、この方法は、改変剤を、リボソームまたはリボソームサブユニットと接触させる工程、およびリボソームまたはリボソームサブユニットとのこの因子の相互作用を検出する工程をさらに包含する。本発明はまた、この改変剤が誘導される因子とは異なって、リボソームまたはリボソームサブユニットに結合するような改変剤（好ましくは、治療剤）を提供する。
【００６２】
別の局面において、本発明は、標的リボソームの機能を断つ新規のタンパク質合成インヒビターを提供する。これらのインヒビターは、本明細書中で開示されるように、容易に設計され、そして試験され得る。
【００６３】
本発明のタンパク質合成インヒビターの１つの型は、以下：表面（例えば、既知の第一の分子（例えば、大リボソームサブユニット内または大リボソームサブユニット上の第一の接触部位（例えば、第一のリボファンクショナル位置）に結合する第一の抗生物質）の表面を模倣するか複製する、溶媒に近づきやすい表面）を有する第一の結合ドメイン；および表面（例えば、既知の第二の分子（例えば、リボソームサブユニット内またはリボソームサブユニット上の第二の接触部位（例えば、第二のリボファンクショナル位置）に結合する第二の抗生物質）の表面を模倣するか複製する、溶媒に近づきやすい表面）を有する第二の結合ドメインを含む。第一のドメインが第二のドメインに結合し、その結果、第一のドメインおよび第二のドメインの両方が、リボソームサブユニットの内部またはリボソームサブユニット上のそれぞれの接触部位に同時に結合することを可能にし、その結果、リボソームサブユニットにおけるタンパク質合成を中断する。
【００６４】
タンパク質合成インヒビターの別の型は、以下：表面（例えば、既知の分子（例えば、リボソームサブユニット内またはリボソームサブユニット上の接触部位（例えば、リボファンクショナル位置）に結合する第一の既知の抗生物質）の表面を模倣するか複製する、溶媒に近づきやすい表面）を有する第一の結合ドメイン；および接触部位との結合ドメインの結合に際して、リボソームサブユニットの内部またはリボソームサブユニットに隣接した空間を占有し、それによって、リボソームサブユニットにおけるタンパク質合成を中断する、結合ドメインに結合したエフェクタードメイン、を含む、合成され、操作された分子である。
【００６５】
本発明の前述の局面および実施形態は、以下の図、詳細な説明および特許請求の範囲を参照して、より完全に理解され得る。さらなる利点は、図面（グレースケールおよびカラーの両方で提供される）から明白である。
【００６６】
（発明の詳細な説明）
（Ｉ．定義）
本明細書中で使用されるように、用語「活性部位」は、タンパク質合成に直接関与するリボソームまたはリボソームサブユニット上の領域（例えば、ペプチジルトランスフェラーゼ部位、伸長因子結合部位および他の類似の部位）をいう。
【００６７】
本明細書中で使用されるように、用語「因子」および「リガンド」は、同義で使用され、そしてリボソーム、リボソームサブユニットまたはリボソームフラグメントと結合する任意の原子、分子または化学基をいう。従って、リガンドとしては、一つの重原子、抗生物質、ｔＲＮＡ、ペプチジルｔＲＮＡ、アミノアシルｔＲＮＡまたはシグナル認識粒子（「ＳＲＰ」）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６８】
本明細書中で使用されるように、「始原細菌」は、メタンプロデューサー、硫黄依存種、および非常に塩基性の環境または高温の環境に耐性のある多くの種を含むモネラ界をいう。
【００６９】
本明細書中で使用されるように、用語「Ａ部位」は、ペプチド結合形成反応への関与の直前に、アミノアシルｔＲＮＡ分子によって占有される位置をいう。
【００７０】
本明細書中で使用されるように、用語「非対称単位」は、結晶の対称操作によって操作される場合に、完全な結晶を再生する原子座標の最小のセットをいう。
【００７１】
本明細書中で使用されるように、「少なくとも〜の一部分」または「少なくとも〜の３次元構造の一部分」は、リボソームまたはリボソームサブユニットの３次元構造の一部分を意味し、このリボソームまたはリボソームサブユニットは、少なくとも３、より好ましくは少なくとも３〜１０、そして最も好ましくは、少なくとも１０の、リボソームまたはリボソームサブユニットの隣接するアミノ酸および／またはヌクレオチド残基によって形成される荷電分布および親水性／疎水性特徴を含む。このような部分を形成する隣接する残基は、リボソームＲＮＡまたはリボソームタンパク質の一次配列の隣接する部分を形成する残基、すなわちリボソームまたはリボソームサブユニットあるいはその組み合わせの３次元構造の隣接する部分を形成する残基であり得る。従って、３次元構造の一部分を形成する残基は、一次配列においては隣接する必要はないが、むしろ、空間において隣接しなければならない。本明細書中で使用されるように、リボソームまたはリボソームサブユニット「の３次元構造の一部分」を形成する残基は、隣接する３次元形状を形成し、この形状の一部分を形成する各々の原子または官能基は、４０Å未満、好ましくは、２０Å未満、より好ましくは、５〜１０Å未満、そして最も好ましくは、１〜５Å未満まで、この形状の一部分を形成する最も近接した原子または官能基から分離される。
【００７２】
本明細書中で使用されるように、用語「原子座標」または「構造座標」は、リボソームまたはリボソームサブユニットの結晶における原子の位置を記載する数学的座標（「Ｘ」値、「Ｙ」値および「Ｚ」値として表される）をいう。結晶から得られた回折データは、結晶の繰り返し単位の電子密度地図を計算するために使用される。電子密度地図は、一つのリボソームサブユニット内の個々の原子の位置を確立するために使用される。当業者は、Ｘ線結晶学によって決定された一組の構造座標が、標準誤差を有することを理解する。本発明の目的にとって、任意の供給源由来のリボソームまたはリボソームサブユニットについての任意の一組の構造座標は、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）（Ｂｅｒｍａｎら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８，２３５−２４２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）に、登録番号ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ；ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺ；ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯ；またはＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２で登録された原子座標の非水素原子位置上に重ね合わせた場合、０．７５Å未満の非水素原子の二乗平均偏差を有する。前述の各々の開示は、本明細書中でその全体において参考として援用される。
【００７３】
ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに登録された原子座標またはコンパクトディスクに記録されたファイルのように本明細書中に含まれる原子座標のリストにおいて、用語「原子座標」または構造座標は、各々Ｘ、Ｙ、ＺおよびＢを含むＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）フォーマットにおける構造中の原子の測定された位置をいう。用語「原子型」は、座標が測定されたエレメントをいう。縦列の最初の文字は、エレメントを規定する。用語「Ｘ」、「Ｙ」、「Ｚ」は、選択された結晶学的原点に関して測定されたエレメントの結晶学的に規定された原子位置をいう。用語「Ｂ」は、平均位置に関して、原子の位置の平均変化を測定する温度因子をいう。
【００７４】
本明細書とともに含まれ、そしてコンパクトディスク（３つのオリジナルのコンパクトディスクおよびオリジナルのコンパクトディスクの各々の複製コピーを含む合計６つのコンパクトディスク）で提出される原子座標および関連する表に対する参照がなされる。前述のすべてが、本明細書中に参考として援用される。ディスク番号１の３（Ｄｉｓｋ Ｎｏ．１ ｏｆ ３）は、８つのファイルを含む；ディスク番号２の３（Ｄｉｓｋ Ｎｏ．２ ｏｆ ３）は、４つのファイルを含む；そしてディスク番号３の３（Ｄｉｓｋ Ｎｏ．３ ｏｆ ３）は、９つのファイルを含む。ディスク番号１の３は、大リボソームサブユニットを規定する原子座標のファイルを示すＰＤＢ１ＦＦＫ．ＤＯＣおよびＰＤＢ１ＦＦＫ．ＥＮＴとして同定されるファイルを含み；大リボソームサブユニット−ＣＣｄＡ−ｐ−Ｐｕｒｏ複合体を規定する原子座標のファイルを示すＰＤＢ１ＦＦＺ．ＤＯＣおよびＰＤＢ１ＦＦＺ．ＥＮＴとして同定されるファイルを含み；そして大リボソームサブユニット−ａａ−ｔＲＮＡ−アナログ複合体を規定する原子座標のファイルを示すＰＤＢ１ＦＧＯ．ＤＯＣおよびＰＤＢ１ＦＧＯ．ＥＮＴとして同定されるファイルを含む。ディスク番号２の３は、完全に精密化された大リボソームサブユニットを規定する原子座標のファイルを示す１ＪＪ２．ＲＴＦおよび１ＪＪ２．ＴＸＴとして同定されるファイルを含む。ディスク番号３の３は、それぞれアニソマイシン、ブラスチシジン、カルボマイシン、スパルソマイシン、スピラマイシン、チロシンおよびヴァージニアマイシンに結合した大リボソームサブユニットを規定する原子座標のファイルを示すａｎｉｓｏｍｙｃｉｎ．ｐｄｂ、ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ．ｐｄｂ、ｃａｒｂｏｍｙｃｉｎ．ｐｄｂ、ｓｐａｒｓｏｍｙｃｉｎ．ｐｄｂ、ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ．ｐｄｂ、ｔｙｌｏｓｉｎ．ｐｄｂおよびｖｉｒｇｉｎｉａｍｙｃｉｎ．ｐｄｂとして同定されるファイルを含む。
【００７５】
当業者に明らかなように、本明細書中で示される原子構造は、その配向に関係なく、そして本明細書中で同定された原子座標が、単に特定の大リボソームサブユニットの１つの可能な配向を表す。従って、本明細書中で同定された原子座標は、それぞれの構造の相対的な原子の位置または特徴を変化せずに、数学的に回転され得るか、並進され得るか、率に応じて定められ得るか、またはそれを組み合わせられ得ることが明らかである。このような数学的操作は、本明細書中で採用されることが意図される。
【００７６】
本明細書中で使用されるように、用語「〜誘導された原子座標」および「〜誘導された原子」は、電子密度地図から直接的または間接的のいずれかで誘導された原子座標または原子をいう。電子密度地図から「直接的に」誘導された原子座標または原子は、従来の結晶学的技術および／または分子モデル技術を使用することによって、電子密度地図から同定されるか、および／または電子密度地図に適合される原子座標または原子をいい、従って、一次的な原子座標または原子であるとみなされ得ることが理解される。電子密度地図から「間接的に」誘導された原子座標または原子は、一次的な原子座標または原子から誘導される原子座標あるいは一次的な原子座標または原子から誘導される原子をいい、従って、一次的な原子座標または原子の誘導体あるいは一次的な原子座標または原子の変形体であり、従って、二次的な原子座標または原子であるとみなされ得ることが理解される。二次的な原子座標または原子は、従来の分子モデリング技術を使用することによって、一次的な原子座標または原子から生成され得る。非限定的な例示の目的で、以下に記載される通り、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの大リボソームサブユニットについての原子座標は、一次的な座標であるとみなされ、一方、分子モデリング（例えば、相同性モデリングおよび／または分子置換を含む）によって、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの原子座標から誘導され得る哺乳動物の大リボソームサブユニットの原子座標は、二次的な座標であるとみなされ得る。原子座標および原子の両方の型は、本発明によって採用されるとみなされる。
【００７７】
本明細書中で使用されるように、用語「結合する（ｂｉｎｄ）」、「結合（している）（ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「結合した（ｂｏｕｎｄ）」、「結合（ｂｏｎｄ）」または「結合した（される、された）（ｂｏｎｄｅｄ）」は、原子、分子または化学基の会合に関して使用される場合、２つ以上の原子、分子または化学基の任意の物理的な接触または会合をいう（例えば、リボソームサブユニットとのリガンドの結合は、リガンドとリボソームサブユニットとの間の物理的な接触をいう）。このような接触および会合としては、相互作用の共有結合型および非共有結合型が挙げられる。
【００７８】
本明細書中で使用されるように、用語「複合体」または「複合体化した」は、より高い次数（ｏｒｄｅｒ）の構造（例えば、リガンドに結合した５０Ｓリボソームサブユニット）を得るための２つ以上の分子の集合をいう。
【００７９】
本明細書中で使用されるように、用語「計算機化学」は、分子の物理的性質おおよび化学的性質の計算をいう。
【００８０】
本明細書中で使用されるように、用語「結合した系」は、電子が、系の全体に完全に非局在化するように、空間的に配置された２を超える二重結合をいう。芳香族残基は、結合した二重結合系を含む。
【００８１】
本明細書中で使用されるように、用語「共有結合」または「原子価結合」は、結合した原子によって、通常２つ一組での電子の共有によって生成された分子における２つの原子間の化学結合をいう。
【００８２】
本明細書中で使用されるように、用語「結晶」は、Ｘ線を回折する分子の任意の３次元に整列したアレイをいう。
【００８３】
本明細書中で使用されるように、「結晶学的起点」は、結晶学的な対称操作に関して、単位格子における基準点をいう。
【００８４】
本明細書中で使用されるように、用語「伸長因子結合ドメイン」は、伸長因子（例えば、伸長因子、ＥＦ−ＴｕおよびＥＦ−Ｇを含む）と直接相互作用するリボソームの領域をいう。
【００８５】
本明細書中で使用されるように、用語「Ｅ部位」は、ペプチド結合形成に関与した後にリボソームを離れる脱アシル化ｔＲＮＡによって占有される位置をいう。
【００８６】
本明細書中で使用されるように、用語「重原子誘導体化」は、リボソームおよびリボソームサブユニットならびにその複合体の結晶の「重原子誘導体」としても公知である、化学的に改変された形態を生成する方法をいう。実際には、結晶を、結晶を通って拡散し得、そしてリボソームまたはリボソームサブユニットに結合し得る重金属原子塩または有機金属化合物（例えば、塩化水銀、リン酸エチル水銀、ペンタミン（ｐｅｎｔａｍｉｎｅ）オスミウムまたはペンタミンイリジウム）を含む溶液に浸漬する。結合した重金属原子の位置は、浸漬された結晶のＸ線回折分析によって決定され得る。この情報は、順に、複合体の３次元構造を構築するために使用される位相情報を生成するために使用される（Ｂｌｕｎｄｅｌｌら（１９７６）前出）。
【００８７】
本明細書中で使用されるように、用語「ホモログ」は、以下の任意の１つまたは組み合わせ：（ｉ）リボソームまたはリボソームサブユニットから単離されたかまたは単離され得る任意のタンパク質（すなわち、リボソームタンパク質）、（ｉｉ）リボソームまたはリボソームサブユニットから単離されたかまたは単離され得る任意の核酸（すなわち、リボソームＲＮＡ）、（ｉｉｉ）すべてのデフォルトパラメータを実行するコンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ」２．１．１版を使用して決定される通り、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓから単離されたリボソームタンパク質に、少なくとも２５％の配列同一性を有する任意のタンパク質、あるいは（ｉｖ） すべてのデフォルトパラメータを実行するコンピュータプログラム「ＢＬＡＳＴ」２．１．１版を使用して決定される通り、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＲａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓから単離されたリボソームタンパク質に、少なくとも３０％の配列同一性を有する任意のタンパク質、を意味することが理解される。「ＢＬＡＳＴ」２．１．１版は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／のワールドワイドウェブを介して入手可能であり、そして利用可能であるか、または独立型のコンピュータ上で、完全に実行できるプログラムとして局部的に作動され得る。
【００８８】
本明細書中で使用されるように、用語「相同性モデリング」は、ホモログについて既存の３次元構造から、高分子の３次元構造についてのモデルを誘導する実行をいう。相同性モデルは、目的の分子の配列が、公知の構造の分子の配列と同一ではない位置で、残基の同一性の変更を可能にするコンピュータシステムを使用して得られる。
【００８９】
本明細書中で使用されるように、用語「水素結合」は、２つの負に帯電した原子（ＯまたはＮのいずれか）をいい、これらの原子は、一方と相互作用しながら、ただ１つの原子に共有結合する水素を共有する。
【００９０】
本明細書中で使用されるように、用語「疎水性相互作用」は、２つの疎水性残基によって形成される相互作用をいう。
【００９１】
本明細書中で使用されるように、リボソームタンパク質は、「ＬＸ」または「ＳＸ」と示され、ここで、Ｌは、「大サブユニット」を表し；Ｓは、「小サブユニット」を表し；そしてどちらの場合にもＸは整数である。
【００９２】
本明細書中で使用されるように、用語「ＭＩＲ」は、多重同形置換をいい、これは、重原子化合物で処理した結晶から、位相情報を誘導するために使用される技術である。
【００９３】
本明細書中で使用されるように、用語「分子グラフィック（ス）」は、原子の３次元表示（好ましくは、コンピュータスクリーン上での）をいう。
【００９４】
本明細書中で使用されるように、用語「分子モデル」または「分子構造」は、特定の物体内部の原子の３次元配置（例えば、リボソームまたはリボソームサブユニットを含む原子の３次元構造、およびリボソームまたはリボソームサブユニットと相互作用するリガンド、特に、大リボソームサブユニットと相互作用するリガンド、より特に、５０Ｓリボソームサブユニットと相互作用するリガンドを含む原子の３次元構造）をいう。
【００９５】
本明細書中で使用されるように、用語「分子モデリング」は、１つ以上のモデルを作成するために、そして必要に応じて、リガンドの構造活性関係についての予測を立てるために、コンピュータを用いるかまたは用いずに実行され得る方法または手順をいう。分子モデリングにおいて使用される方法は、分子グラフィックから計算機化学に及ぶ。
【００９６】
本明細書中で使用されるように、用語「分子置換」は、未知の結晶の観察された回折パターンを最良に説明するために、未知のリボソームの結晶の単位格子において、本発明に記載された原子座標を修正し、そして配置することによって、原子座標が既知ではないリボソームまたはリボソームサブユニットのモデルの作成に関わる方法をいう。次いで、このモデルから位相が計算され得、そして観察された振幅と組み合わされ得、未知のリボソームまたはリボソームサブユニットの原子座標を与える。この型の方法は、例えば、Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄ（Ｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｇ．、編）、Ｇｏｒｄｏｎ＆Ｂｒｅａｃｈ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７２）に記載される。
【００９７】
本明細書中で使用されるように、「非共有結合」は、原子および／または分子間の共有結合の形成に関与しない原子および／または分子間の相互作用をいう。
【００９８】
本明細書中で使用されるように、用語「ペプチジルトランスフェラーゼ部位」は、ペプチド結合が合成される大サブユニットの位置をいう。
【００９９】
本明細書中で使用されるように、用語「ポリペプチド出口トンネル」は、ペプチジルトランスフェラーゼ部位からリボソームの外部へ、大リボソームサブユニットを通過するチャネルをいい、新規に合成されたペプチドが通過する。
【０１００】
本明細書中で使用されるように、用語「タンパク質合成インヒビター」は、リボソームにおいて、タンパク質合成またはポリペプチド合成を減じ得るか、阻害し得るか、またはそうでなければ中断し得る任意の分子をいう。
【０１０１】
本明細書中で使用されるように、用語「Ｐ部位」は、ペプチド結合形成反応に関与するときに、ペプチジルｔＲＮＡによって占有される位置をいう。
【０１０２】
本明細書中で使用されるように、用語「リボファンクショナル位置」は、リボソームもしくはリボソームサブユニットの内部でのタンパク質合成もしくはポリペプチド合成、および／あるいはリボソーム外のタンパク質もしくはポリペプチドの輸送またはリボソーム外のタンパク質もしくはポリペプチドの移動に、能動的または受動的のいずれかで関与するリボソームまたはリボソームサブユニットの領域をいう。リボファンクショナル位置としては、例えば、ペプチジルトランスフェラーゼ部位、Ａ部位、Ｐ部位、Ｅ部位、伸長因子結合ドメイン、ポリペプチド出口トンネルおよびシグナル認識粒子（ＳＲＰ）結合ドメインが挙げられる。リボファンクショナル位置が、特定のトポロジーのみならず、原子（例えば、水素結合に関与し（例えば、プロトンドナーおよび／またはアクセプター）、特定の静電的特性および／または親水性特徴もしくは疎水性特徴を有する原子）によって規定された粒子の表面化学もまた有することが理解される。
【０１０３】
本明細書中で使用されるように、用語「リボソームサブユニット」は、タンパク質合成の初期段階の間に、独立して機能し得るリボソームの２つのサブユニットのうちの１つをいうが、両方が一緒にリボソームを構築する。例えば、原核生物リボソームは、５０Ｓサブユニット（大サブユニット）および３０Ｓサブユニット（小サブユニット）を含む。
【０１０４】
本明細書中で使用されるように、用語「リボソーム」は、大リボソームサブユニットおよび小リボソームサブユニットを含む複合体をいう。
【０１０５】
本明細書中で使用されるように、用語「シグナル認識粒子結合ドメイン」は、シグナル認識粒子と直接相互作用するリボソームの位置をいう。
【０１０６】
本明細書中で使用されるように、用語「空間群」は、結晶の対称エレメントの配置をいう。
【０１０７】
本明細書中で使用されるように、用語「対称操作」は、別の非対称単位の対応する原子上に、非対称単位の原子を配置する所定の空間群における操作をいう。
【０１０８】
本明細書中で使用されるように、用語「双晶である」は、すべての回折パターンを重ね合わせるといった方法で、有意に配向が異なる同じ対称の微小なドメインを含む、単一の巨視的な結晶をいう。双晶の結晶において、モザイク塊またはドメインは、いくつかはある方向に向いており、そして他のものは、第二の明確に区別される方向に向いているように配向され、そしてこれらの方向は、塊の１つの群によって生成される回折パターンが、他の群の回折パターンのちょうど上に来るような方向である。
【０１０９】
本明細書中で使用されるように、用語「双晶ではない」は、ドメインが整列した結晶格子をいう。このドメインはまた、「モザイク塊」としても公知である。大半の結晶は、モザイク塊の集合であるかのように回折する。これは、より大きな結晶（これは、全体的には、あまり良好には整列していない）の内部の小さい、完全に整列された領域であると考えられ得る。各々の塊は、他のすべてと同じ対称および単位格子充填を有する。
【０１１０】
本明細書中で使用されるように、用語「単位格子」は、基本的な平行六面体形状の塊をいう。結晶の全体の大きな塊は、このような塊の規則正しい集合によって構築され得る。各々の単位格子は、パターンの単位の完全な表示、すなわち、結晶を築き上げる反復を含む。
【０１１１】
（ＩＩ．大リボソームサブユニットの構造および使用）
（Ａ．２．４Åの分解能、初期精密化での大リボソームサブユニットの原子構造）
本発明は、リボソームの結晶を調製するための新規の方法の開発に一部基づく。新規の方法は、以前に入手された結晶よりもさらに厚く、そして約２．４Åの分解能までＸ先を回折し得る５０Ｓリボソームサブユニットの結晶を提供する。この方法は、長年Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５０Ｓリボソームサブユニットの結晶構造の決定の進歩を妨げた双晶の結晶を排除する。５０Ｓリボソームサブユニットの結晶を調製する方法を、以下に議論する。
【０１１２】
本発明はまた、重原子誘導体を使用して実験的に位相を等しくした２．４Åの分解能の電子密度地図から誘導された、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５０Ｓリボソームサブユニットの結晶の原子構造に一部基づく。大リボソームサブユニットを規定する原子座標は、２０００年７月１０日に、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）（Ｂｅｒｍａｎら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８，２３５−２４２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）に、登録番号ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫで登録された。
【０１１３】
さらに、本発明は、この節で簡単に要約され、そして本明細書の以下の節で詳細に議論される以下のモデルの原子座標からの派生物に一部基づく。このモデルは、２３Ｓ ｒＲＮＡの２，９２３個のヌクレオチドのうちの２，８１１個、その５Ｓ ｒＲＮＡのすべての１２２個のヌクレオチド、およびサブユニット中で良好に整列した２７個のタンパク質についての構造を含む。
【０１１４】
５Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡの両方の二次構造は、系統発生的比較によって、その二次構造について推論された二次構造に著しく近い。２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造は、６つの大きなドメインに分けられ、その各々は、非常に非対称な３次構造を有する。これらの形状の変則にもかかわらず、ドメインは、連動の様式でともに適合し、ほぼ等軸であるＲＮＡの密集した塊を得る。タンパク質は、構造の至るところに分散し、その表面上に主として密集するが、タンパク質合成に対して本来機能的に重要であるサブユニットの領域（３０Ｓサブユニット表面、ｔＲＮＡの結合領域およびペプチジルトランスフェラーゼ活性部位）になおさら豊富ではない。これらのタンパク質の多くの最も驚くべき特徴は、これらのループおよび末端の伸長した不規則な構造であり、これは、ＲＮＡヘリックスの間を貫く。サブユニットにおける大半のタンパク質の主な役割は、そのｒＲＮＡの３次元構造の安定化のようである。
【０１１５】
（１．５０Ｓリボソームサブユニットの結晶の調製および構造決定）
いくつかの実験的アプローチは、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの５０Ｓリボソームサブユニットの電子密度地図の分解能を、５Åから２．４Åに広げるために使用された（結晶の改良を含む）。逆抽出手順は、以前に入手可能であった結晶よりも厚く、そして２．２Åの分解能まで回折し得る再現可能に成長する結晶のために開発された（実施例１を参照のこと）。手短に言えば、結晶を、沈殿したサブユニットから逆抽出された結晶種を入れた溶液から、蒸気拡散によるハンギングドロップで、室温で成長させた。得られた結晶は、０．５×０．５×０．２ｍｍの最大の大きさを有し、そして３週間後に収集した。長年進歩を妨げた双晶の結晶（Ｂａｎら（１９９９）前出）を、結晶の安定化条件を調整することによって排除した（実施例１を参照のこと）。結晶は、１２％ ＰＥＧ６０００、２２％ エチレングリコール、１．７Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ、１００ｍＭ 酢酸カリウム、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および１ｍＭ ＣｄＣｌ₂、ｐＨ６．２を含む溶液への漸進的移行によって安定化され、そして液体プロパンでフラッシュ凍結した。塩濃度を１．７Ｍ ＮａＣｌ未満に減少することによって、双晶になる結晶の傾向が増加した。１．２Ｍと同程度まで低い塩濃度では、ほぼすべての結晶が双晶となった。
【０１１６】
高分解能のフェージング（ｐｈａｓｉｎｇ）のために使用されたすべてのＸ線データを、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ ａｔ Ａｒｇｏｎｎｅで収集した２つのネイティブデータセットを使用した以外は、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅで収集した（実施例２を参照のこと）（表１）。ペンタミンオスミウム（１３２部位）誘導体およびヘキサミン（ｈｅｘａｍｉｎｅ）イリジウム（８４部位）誘導体が、３．２Åの分解能までの同形置換の位相情報および異常分散の位相情報の両方を生成する点において最も有効であることが証明された（実施例２を参照のこと）。より低い分解能で有意に寄与した結晶内部の密度の平均化は、約５Åを超えて有用ではなかった。電子密度地図は、ＣＮＳの溶媒フリッピング（ｆｌｉｐｐｉｎｇ）手順を使用して、劇的に改良され、そしてその分解能はついに２．４Åまで広がった（Ａｂｒａｈａｍｓら（１９９６）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔｏｌｌｏｇｒ．Ｄ ５２：３０；Ｂｒｕｅｎｇｅｒら（１９９８）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５４：９０５−９２１）。
【０１１７】
【表１】

【０１１８】

【０１１９】
ディスオーダーによる不明確な領域を除いて、実験的にフェイジングされた２．４Åの分解能の電子密度地図は十分な質であり、その結果、タンパク質および核酸の配列誤差の両方が、同定されそして補正され得た。各々のヌクレオチドは、個々に適合され得、そしてＡとＧとの間の差は、プリンとピリミジンとの間の距離であるように、化学的配列を参照せずに、通常明らかであった（図１）。
【０１２０】
実験的電子密度地図からの原子モデルの減算は、水およびイオンを除いて、有意な密度を残さず、これは、このモデルが、すべての高分子の密度の説明となることを示す。モデルの初期精密化は、プログラムＣＮＳにおいて、混合された標的を使用して達成された（Ｂｒｕｅｎｇｅｒら（１９９８）前出）。このモデルを、プログラムＴＮＴを使用して、２．４Åの電子密度地図に対する実空間においてさらに精密化した（Ｔｒｏｎｒｕｄ（１９９７）、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｐａｒｔ Ｂ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）。そして、この得られたモデルは、０．３３のフリーＲ因子を有した。ＣＮＳを使用して、原子位置およびＢ因子の両方の混合された標的の精密化の１つのさらなる繰り返しが、以下に記載される構造を導いた。このフリーＲ因子は、０．２７である（表１）。
【０１２１】
（２．配列整合（ｆｉｔｔｉｎｇ）およびタンパク質の同定）
２３Ｓ ｒＲＮＡの配列を、サルシン／リシン（ｓａｒｃｉｎ／ｒｉｃｉｎ）ループ配列（Ａ２６９１〜Ａ２７０２）から開始するヌクレオチドによって、電子密度地図のヌクレオチドに整合させた（Ｅ．ｃｏｌｉ番号Ａ２６５４〜Ａ２６６５）。この位置は、５Åの分解能で決定された（Ｂａｎら（１９９９）前出）。２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造についての入手可能な情報によって導かれるように（Ｇｕｔｅｌｌ，Ｒ．Ｒ．（１９９６），「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ １６Ｓ ａｎｄ ２３Ｓ ｒＲＮＡ，」Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｄａｈｌｂｅｒｇ Ａ．およびＺｉｍｍｅｒｍａｎ Ｂ．編）、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ．ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ＦＬ．１１１−１２８頁）、残りのＲＮＡの電子密度は、５Ｓ ｒＲＮＡの配列を適切に適応させた。タンパク質に対応するタンパク質の電子密度の解釈は、より複雑である。なぜなら、各々のタンパク質領域が、適切な配列がこの電子密度に整合され得る前に化学的に同定されたが、約４，０００個のアミノ酸残基が、電子密度に整合されたからである。
【０１２２】
Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの５０Ｓサブユニットは、３１個のタンパク質を含むようであり、そしてＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータバンクには、最初は小リボソームサブユニットと割り当てられた１つ（ＨＭＳ６またはＬ７ａｅ）を含むこの３１個のタンパク質のうちの２８個のタンパク質の配列が存在する（Ｗｈｉｔｔｍａｎｎ−Ｌｉｅｂｏｌｄら（１９９０）前出）。３つの残りのタンパク質を、規準として、真核生物および他の始原種（ａｒｃｈｅａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ）由来のリボソームタンパク質の配列を使用して同定した。配列データベースＬＸにおいて、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの大リボソームサブユニットタンパク質のうちの１つの電子密度は、見出されなかった。大サブユニットに対するＬＸの割当てが誤っているか、またはＬＸが、サブユニットののディスオーダーした領域に関連するか、あるいはＬＸが、全体で試験されたサブユニットに存在しないかのいずれかである。
【０１２３】
２．４Åの分解能の電子密度地図は、タンパク質Ｌ１、Ｌ１０、Ｌ１１およびＬ１２の明確な電子密度を欠失する。これらのタンパク質の位置は、初期の低分解能のＸ線研究および／または電子顕微鏡研究から公知である。これらのタンパク質は、サブユニットの２つの側面の隆起の成分であり、このタンパク質は両方とも、結晶中で不完全に整列する。Ｌ１は、これらのうちの１つの唯一のタンパク質成分であり（Ｏａｋｅｓ，Ｍ．ら（１９８６），Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ，（Ｈａｒｄｅｓｔｙ，Ｂ．およびＫｒａｍｅｒ，Ｇ．編）Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，４７−６７）、そしてサブユニットの９Åの分解能の密度地図において明らかである（Ｂａｎら（１９９８）前出）が、より高い分解能の密度地図においては明らかではない。Ｌ１０、Ｌ１１およびＬ１２は、他の隆起の成分であり、これは、しばしばＬ７／Ｌ１２「茎上部（ｓｔａｌｋ）」といわれる（Ｏａｋｅｓら（１９８６）前出）。結合するＬ１１およびＲＮＡは、この複合体の独立に決定された結晶構造を使用して（Ｃｏｎｎ ＧＬら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８４：１１７１−１１７４；Ｗｉｍｂｅｒｌｙら（１９９９）Ｃｅｌｌ ９７：４９１−５０２）、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの大サブユニットの５Åの分解能の電子密度地図に配置された（Ｂａｎら（１９９９）前出）。Ｌ１１複合体を支持するＲＮＡ軸と会合するタンパク質フラグメント（約１００残基）は、２．４Åの分解能地図において見られ得る。位置に基づいて、これは、Ｌ１０の一部分のはずである。任意の分解能で観察されるＬ１２に対応する電子密度は存在しないが、Ｌ１２テトラマーは、Ｌ１０を通してリボソームに結合することが公知であり、そしてＬ１０／Ｌ１２の会合は、いくつかの環境下で可撓性であることが公知であり（Ｍｏｌｌｅｒら（１９８６）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒｉｂｏｓｏｍｅｓ、前出、３０９−３２５頁）、これは、ここでのその不可視性を説明し得る。
【０１２４】
タンパク質Ｌ２、Ｌ４、Ｌ６、Ｌ１４およびＬ２２のユーバクテリアのホモログの構造は、以前に、全部または一部が決定された（表２を参照のこと）。Ｌ２、Ｌ６およびＬ１４は、５Åの分解能の地図に最初は位置していた（Ｂａｎら（１９９９）前出）。Ｌ４およびＬ２２が、同様に現在同定され、そして位置決定された。残りのタンパク質の大半に対応する電子密度は、電子密度地図から推定された鎖長および配列モチーフを、既知の配列長と比較することによって割り当てられ、これは、相対的なタンパク質の位置についての入手可能な情報（Ｗａｌｌｅｃｚｅｋら（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．７：３５７１−３５７６）および２３Ｓ ｒＲＮＡと５Ｓ ｒＲＮＡとのタンパク質相互作用についての入手可能な情報（Ｏｓｔｅｒｇａａｒｄら（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：２２７−２４０）によって導かれた。このように同定されたタンパク質の電子密度領域の各々は、そのアミノ酸配列によってよく説明される。
【０１２５】
配列類似性によって同定されるタンパク質の一番の興味は、Ｌ７ａｅであり、これは、最初はＬ３０ｅであるように見えた。Ｌ３０ｅの同定は、もっともであるように見えた。なぜなら、酵母のＬ３０の構造は、Ｌ７ａｅの電子密度に整然と重ね合わされ、そしてＬ７ａｅが結合するＲＮＡの構造が、酵母のＬ３０に結合するＲＮＡの構造に類似するからである（Ｍａｏ，Ｈ．ら（１９９９）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６：１１３９−１１４７）。それにもかかわらず、配列類似性からＬ７ａｅタンパク質ファミリーのメンバーであるＨＭＳ６の配列は、電子密度に良好に整合する。配列類似性によって同定された他のタンパク質のうちの４つ（Ｌ２４ｅ、Ｌ３７ｅ、Ｌ３７ａｅおよびＬ４４ｅ）は、ジンクフィンガーモチーフを含む。Ｌ３７ｅおよびＬ３７ａｅのラットのホモログは、配列に基づいて、ジンクフィンガータンパク質であると予測され（Ｗｏｏｌら（１９９５）前出）、そしてこの予測は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるそのホモログであるという同定を助けた。
【０１２６】
【表２】

【０１２７】

【０１２８】
（３．サブユニットの総体的外観）
頂部図（ｃｒｏｗｎ ｖｉｅｗ）において（図２を参照のこと）、直径約２５０Åである大リボソームサブユニットには、読み手に対して、強調された表面から四方に広がる３つの突起を有する小サブユニットと相互作用する表面が存在する。Ｌ１を含む隆起は、２．４Åの分解能の電子密度地図では認識できないが、独立して決定された（Ｎｉｋｏｎｏｖら（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ．１５：１３５０−１３５９）Ｌ１の構造は、より低い分解能の地図においてほぼ位置決定され、そして読み手に向くようにここに含まれる。この２つの側面の隆起を除いて、大リボソームサブユニットが、モノリシックであることが明らかである。トポロジー的に（ｔｏｐｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ）独立したドメインへの構造の分割の疑いはない。さらに、幾分、明らかなドメインのサブ構造を欠失するが、また非常に大きいため、全体として見ることを理解するのは不可能である。読み手に、どのようにして組み合わせられたかの観念を伝えるために、サブユニットを、その化学的成分に解体しなければならない。
【０１２９】
（４．ＲＮＡの二次構造）
少なくとも２つの水素結合によって安定化されたＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの２３Ｓ ｒＲＮＡにおけるすべての塩基対は、３．２Å未満で分離された水素結合のドナーおよびアクセプターについての構造を検索するコンピュータプログラムを使用して同定された。少なくとも２つのこのような結合によって結合した塩基を、標準間の角度が４５°未満であり、そして結合と塩基標準間角度がまた、４５°未満である場合に、結合したとみなす。この分析の結果に基づいて、二次構造の図を、２３Ｓ／２８Ｓ ｒＲＮＡについてのフォーマット標準で調製した（図３を参照のこと）。系統発生的比較によってこの分子について予測された二次構造は、非常に正確であるが、３次元対形成のすべてを見出さず、そして保存塩基を含む相互作用を同定できなかった。ほぼすべての型の塩基対に加えて、ＲＮＡは、周知の二次構造モチーフ（例えば、塩基トリプレット、テトラループおよび交差鎖のプリンスタック（ｃｒｏｓｓ−ｓｔｒａｎｄ ｐｕｒｉｎｅ ｓｔａｃｋ））の多数の例を含むが、劇的な新規の二次構造のモチーフは、これまで同定されなかった。
【０１３０】
この２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造は、末端のステムによって閉ざされる中央のループからなり、１１以上の入り組んだステム−ループが四方に広がる。６つのドメインからなるような分子を記載すること、および５’末端から連続して開始されるヘリックスの軸に番号を付すことは慣例である（図４を参照のこと）（Ｌｅｆｆｅｒｓら（１９８７）前出）。図４に示されるドメインへの分子の分割は、ヘリックス２５に関して、標準的な実行から逸脱し、通常、ドメインＩの一部としてみなされる。ドメインＩＩに配置される。なぜなら、ドメインＩの他のエレメントとよりも、ドメインＩＩとより強力に相互作用するからである。
【０１３１】
２３Ｓ ｒＲＮＡ中に、１０個のヌクレオチドよりも長い５つの配列が存在し、この２３Ｓ ｒＲＮＡの構造は、ディスオーダーに起因して、２．４Åの分解能地図から決定できない。要するに、最終モデルからはずされる２３２個のヌクレオチドのうち２０７の説明となる。ディスオーダーの領域は：（１）ヘリックス１のすべて、（２）ヘリックス３８の遠位端、（３）リボソームタンパク質Ｌ１１が結合するヘリックス４３／４４、（４）ステム−ループ６９のループ末端、および（５）Ｌ１が結合するＲＮＡ構造であるヘリックス７６／７７／７８である。完全性のために、これらの領域は、系統発生的に決定された二次構造を用いて、図３（灰色で）に含まれる。
【０１３２】
（５．ｒＲＮＡの全体構造）
２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡの６つのドメインは、それにもかかわらず一緒に整合する、複雑で入り組んだ形状をすべて有し、密集したモノリシックなＲＮＡの塊を生成する（図４（Ａ）および４（Ｂ）を参照のこと）。従って、二次構造レベルでのそのＲＮＡの構成にもかかわらず、３次元においては、大サブユニットは単一の巨大なドメインである。この点で、小サブユニットとはまったく異なり、この小サブユニットは、モノリシックでない平坦な物体である。低い分解能の電子顕微鏡写真においてさえも、小サブユニットは、３つのドメインからなり、これらの各々は、そのＲＮＡの３つの二次構造ドメインのうちの一つを含むことが判明する（Ｎｏｌｌｅｒら（１９９０）Ｔｈｅ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ、前出、７３−９２頁）。２つのサブユニット間の性質の相違は、小サブユニットのより大きな構造可撓性の必要性を反映し得る。
【０１３３】
マッシュルームのように見えるドメインＩ（図４（Ｅ）を参照のこと）は、粒子の裏、すなわちＬ１領域の後ろおよび下に位置する。ドメインの細い部分は、ドメインＶＩの付近に始まり、これは、第一の残基および最後の残基が位置する場所である。ヘリックス１および２５は、裏側で粒子にわたり、次いで、ドメインは、Ｌ１領域の下および後ろで、より大きくより球状の構造に伸長する。
【０１３４】
粒子の裏面の大半を占める、６つの２３Ｓ ｒＲＮＡのドメインの最も大きなドメインであるドメインＩＩは、粒子のサブユニットの界面に達する３つの隆起を有する（図４（Ｆ）を参照のこと）。これらのうちの一つ（ヘリックス４２〜４４）は、Ｌ７／Ｌ１２茎上部のＲＮＡ部分であり、これは、伸長因子と相互作用することが公知であり、これらの結晶中でよく整列していない。第二のドメインＩＩの隆起は、ヘリックス３８であり、これは、粒子において最も長く、分枝していない軸である。これは、粒子の裏側で始まり、約９０°曲がり、そしてドメインＶと５Ｓ ｒＲＮＡとの間の小サブユニットに突出する。第三の領域でああるヘリックス３２〜３５．１は、小サブユニットおよびその末端に向かって直接向き、ステム−ループ３４のループは、小リボソームサブユニットと直接相互作用する（Ｃｕｌｖｅｒら（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８５：２１３３−２１３５）。このループは、ドメインＩＩＩとＩＶとの間のサブユニットの界面で現れる。
【０１３５】
ドメインＩＩＩは、頂部図において、サブユニットの左下の領域を占有する密集した球状ドメインである（図４（Ｇ）を参照のこと）。ドメイン（ステム−ループ４８）の起点、ならびに点を形成するステム−ループ５２、５７および５８を有する４つの先の尖った星のように見える。ドメインＩＩＩの最も広範な接触は、ドメインＩＩとの接触であるが、ドメインＩ、ＩＶおよびＶＩともまた相互作用する。すべての他のドメインと異なり、ドメインＩＩＩは、ドメインＶとほとんどまったく相互作用しない；唯一の接触は、各々のドメイン由来の単一の塩基を含む単一のファンデルワールス接触である。
【０１３６】
ドメインＩＶは、３０Ｓサブユニットと接触する５０Ｓサブユニットの界面表面の大半を占める（図４（Ｈ）を参照のこと）。サブユニット側に、平坦な表面の大きな斜方向の断片を形成し、そして粒子の裏面で、ドメインＩＩＩおよびＶと接触する。ヘリックス６７〜７１は、ドメインＩＶの最も顕著な特徴であり、そして活性部位のクレフトの前端を形成する。これは、低分解能で明らかに認識できる（図２を参照のこと）。これは、リボソームタンパク質によって広範に安定化されない２３Ｓ ｒＲＮＡのいくつかの領域のうちの一つである。この隆起の中央のヘリックス６９は、小リボソームサブユニットにおける１６Ｓ ｒＲＮＡの、長い終わりから２番目の軸と相互作用し、そしてｔＲＮＡを結合したＰ部位からｔＲＮＡを結合したＡ部位を分離する仕切りとして見られ得る。
【０１３７】
サブユニットの中央で、ドメインＩＶとＩＩとの間に挟まれるドメインＶは、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ活性に深く関与することが公知である。構造的に、ドメインは、３つの領域に分けられ得る（図４（Ｉ）および４（Ｊ）を参照のこと）。第一の領域は、ヘリックス７５から始まり、そして最後にタンパク質Ｌ１の結合部位を形成する。ヘリックス８０〜８８からなる第二の領域は、中央の隆起領域の大半を形成し、そして５Ｓ ｒＲＮＡおよびドメインＩＩによって裏面で支持される。ヘリックス８９〜９３を含む第三の領域は、ドメインＶＩに伸長し、そしてリボソームの伸長因子結合領域の安定化を助ける。
【０１３８】
２３Ｓ ｒＲＮＡにおける最も小さなドメイン（Ｌ７／Ｌ１２軸の直下のサブユニットの表面の大きな部分を形成する）は、底に鉄棒を有する文字Ｘのように見える（図４（Ｋ）を参照のこと）。このドメインの興味深い領域は、サルシン−リシンループ（ＳＲＬ）であり（ステム−ループ９５）、この構造は、単離して広範に研究された（Ｓｚｅｗｃｚａｋら（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４７：８１−９８）。ＳＲＬは、因子の結合に不可欠であり、そしてリボソームは、このループにおける一つの共有結合の切断によって不活化され得る（Ｗｏｏｌら（１９９２）ＴＩＢＳ １７：２６６−２６９）。ヌクレオチド保護データによって示唆されるように、このループの大きい方の溝は、溶媒に曝露され（Ｍｏａｚｅｄら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ ３３４：３６２−３６４）、そしてこの立体配座は、タンパク質によって安定化され、そして小さい方の溝側で２つの塩基を含むドメインＶとの相互作用を介して安定化される。含まれるヌクレオチドは、ドメインＶＩのＡ２６９９およびＧ２７００、ならびにドメインＶのＡ２５６６およびＧ２５６７である。
【０１３９】
サブユニットにおける実際上第七のＲＮＡドメインである５ＳリボソームＲＮＡは、ループＡと呼ばれる共通の接合点から四方に広がる３つの軸からなる（図４（Ｄ）を参照のこと）。Ｅ．ｃｏｌｉの５Ｓ ｒＲＮＡ由来のフラグメント１の結晶構造において見られるものと対照的に（Ｃｏｒｒｅｌｌら（１９９７）Ｃｅｌｌ ９１：７０５−７１２）、この分子のヘリックス２／３腕は、そのヘリックス４／５腕上に積み重なるが、ヘリックス１には積み重ならない（図４（Ｌ）を参照のこと）。この配置は、２つの積み重なった塩基トリプレットを含むループＡ残基のゆがんだ立体配座に起因する。実際に、二次構造の観点から、５ＳｒＲＮＡのループＡ−ヘリックス２，３腕は、非常に注目すべきである。サブユニットのどこにも、異常な対形成および入り組んだＲＮＡの二次構造のより高い集中が存在しない。
【０１４０】
（６．２３Ｓ ｒＲＮＡにおける配列保存および相互作用）
２３Ｓ／２８Ｓ ｒＲＮＡは、多くの保存配列を含むが、この配列はまた、実質的に鎖長が異なる。より短い２３Ｓ／２８Ｓ ｒＲＮＡは、全体のステム−ループの切断によって、または全体のステム−ループの除去までもによってそのより長いホモログと識別され、そして配列の比較によって、すべてによって共有される最小限の構造を同定し得る（Ｇｅｒｂｉ（１９９５）Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、前出、７７−８８頁）。Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの２３Ｓ ｒＲＮＡにおける伸長配列（すなわち、最小のものよりも大きい配列を含む）を、図５に緑色で示す。これらは、粒子のサブユニット界面の表面に豊富に存在しないが、活性部位から遠いその裏面の表面に豊富に存在する。これは、低分解能の電子顕微鏡での知見と矛盾しない。この知見は、構造が最も保存される大サブユニットの領域が、小サブユニットと相互作用する表面であることを示唆する（Ｄｕｂｅら（１９９８）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ６：３８９−３９９）。
【０１４１】
２３Ｓ ｒＲＮＡには、２つのクラスの保存配列が存在する。一方は、大サブユニットの活性部位領域に集中する残基を含む。第二のクラスは、粒子の全体に渡って散乱するより短い配列からなる（図５：赤色の配列）。ドメインＶＩのＳＲＬ配列およびペプチジルトランスフェラーゼのクレフトの底に位置するドメインＶに属する保存残基のクラスターは、第一のクラスのメンバーである。これらは保存されている。なぜなら、これらは、基質結合、因子結合および触媒活性に不可欠であるからである。保存残基の第二のクラスにおける残基の大半は、２３Ｓ ｒＲＮＡの３次構造を安定化するドメイン間（ｉｎｔｅｒ−ｄｏｍａｉｎ）相互作用およびドメイン内（ｉｎｔｒａ−ｄｏｍａｉｎ）相互作用に関与する。アデノシンは、このクラスにおいて不釣り合いに表示される。ｒＲＮＡにおける保存残基間のＡの優占は、過去に指摘されていた（Ｗａｒｅら（１９８３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２２：７７９５−７８１７）。
【０１４２】
Ａ依存性モチーフに対する信頼性に加えて、２３Ｓ ｒＲＮＡのドメインの３次元構造およびそれらの相対的位置は、ＲＮＡジッパーおよびテトラループ／テトラループレセプターモチーフのような類似する３次元構造エレメントによって安定化され（Ｍｏｏｒｅ，Ｐ．Ｂ．（１９９９）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６８：２８７−３００）、そして多くの位置で、塩基対形成および塩基三重形成（ｔｒｉｐｌｅ）が、２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造の異なる成分に属する配列の相互作用を安定化する。
【０１４３】
興味深いことに、５Ｓ ｒＲＮＡおよび２３Ｓ ｒＲＮＡは、互いに広範に相互作用しない。存在するいくつかのＲＮＡ／ＲＮＡ相互作用は、５Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス４／５腕の骨格および２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス３８の骨格を含む。大リボソームサブユニットに結合する５Ｓ ｒＲＮＡの大半の自由エネルギーおよびこの５Ｓ ｒＲＮＡのすべての特異性は、リボソームの残りに張り付けるモデリング粘土として作用するタンパク質との広範な相互作用に依存するようである。
【０１４４】
（７．５０Ｓリボソームサブユニットにおけるタンパク質）
Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの大リボソームサブユニットにおいてみいだされた２７個のタンパク質の構造（表２）が決定された。これらのタンパク質構造のうちの２１個が、任意のホモログについて以前に確立され、そして既知の構造のホモログを有する５つの構造が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ配列を使用して、電子密度地図に再構築された。さらに、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉＬ１、Ｌ１１およびＬ１２のホモログに使用可能な構造が存在し、これは、２．４Åの分解能の電子密度地図では見ることができなかった。Ｌ１０の構造のみが、存在することが公知である３１個のタンパク質の間で、いまだ未知である。
【０１４５】
これらの構造のすべてが完全ではない。例えば、Ｌ５の全体のドメインは、電子密度から落とされており、これは、おそらくディスオーダーのためである。Ｌ３２ｅはまた、この点で注目すべきである。Ｎ末端から約２０残基が、電子密度地図において観察されず、そしてこの電子密度地図は、Ｃ末端残基が、認識できる残基の最もＮ末端側に共有結合することを示唆する。
【０１４６】
構造が既知である３０個の大サブユニットのリボソームタンパク質のうちの１７個が、球状タンパク質であり、構造がＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに存在する多数の構造と特徴が類似する（表２）。残りの１３個のタンパク質は、このタンパク質から突出する伸長を有する球状体を有するか（「ｇｌｂ＋ｅｘｔ」）、または完全に伸長しているか（「ｅｘｔ」）のいずれかである。これらの伸長は、しばしば、明らかな３次元構造を欠失し、そして多くの領域において、同様に二次構造を欠失する（図６を参照のこと）。これらの伸長は、多くのリボソームタンパク質が、単離されて結晶化に耐える理由を説明し得る。通則を証明する例外は、Ｌ２およびＬ４であり、これらの両方は、「ｇｌｂ＋ｅｘｔ」クラスに属するタンパク質である。タンパク質Ｌ２は、結晶化され、そしてリボソームに伸長するＬ４の２つの領域のうちの１つは、インタクトなＬ４の結晶構造中でディスオーダーする（Ｗａｈｌら（２０００）前出）。
【０１４７】
２つの側面の隆起の先端を形成するタンパク質Ｌ１、Ｌ７、Ｌ１０およびＬ１１を除いて、５０Ｓサブユニットのタンパク質は、ＲＮＡによって規定されたエンベロープを超えて有意に伸長しない（図７を参照のこと）。これらの球状ドメインは、粒子の外部上に主として見出され、しばしばＲＮＡのフォールディングによって形成されたギャップおよび裂け目に横たわる。従って、球状ウイルスにおけるタンパク質と異なって、大リボソームサブユニットのタンパク質は、会合する核酸の周囲のシェルを形成せず、そしてヌクレオソームにおけるタンパク質と異なって、このタンパク質はまた、核酸によって囲まれない。代わりに、タンパク質は、「ＲＮＡブリック」間のギャップおよび裂け目を充填するモルタルのように作用する。
【０１４８】
サブユニット表面上のタンパク質の分布は、活性部位のクレフトおよび３０Ｓサブユニットと相互作用する平坦な表面を除いて、ほぼ均一である。頂部図において、タンパク質は、サブユニットの末梢周辺に横たわる（図７（Ａ）を参照のこと）が、３０Ｓサブユニットの結合部位と反対側から見ると（「裏側」）、タンパク質は、その全体の表面にわたってほぼ均一な格子を形成するようである（図７（Ｂ）を参照のこと）。同様に、ポリペプチドトンネルの出口を含むサブユニットの底の表面は、タンパク質をちりばめてある（図７（Ｃ）を参照のこと）。実際に、トンネル出口を囲む５つのタンパク質は、タンパク質分泌の役割を果たしている。なぜなら、膜タンパク質および分泌タンパク質が合成される場合に、膜およびトランスロコン（ｔｒａｎｓｌｏｃｏｎ）に面する表面の一部であるからである。
【０１４９】
図７は、リボソーム内部に姿を消すタンパク質鎖を示すが、タンパク質が粒子の本体を貫通する程度は、ＲＮＡが剥ぎ取られる場合にのみ、完全に認識される。粒子の内部は、タンパク質を含まないものではないが、粒子の表面に比較して、タンパク質が乏しい。ポリペプチドの伸長した触手（この触手の多くは、表面上の球状ドメインから放射する）は、ＲＮＡの二次構造の近隣のエレメント間のギャップを充填する内部へ放射する（図８（Ｅ）を参照のこと）。これらの伸長の奇異な構造は、ＲＮＡとの相互作用によって説明される。
【０１５０】
伸長した非球状の構造が、タンパク質データベースで珍しいが、この構造は、未知なわけではない。伸長したタンパク質の末端は、しばしばタンパク質間接触（例えば、ウイルスキャプシドにおいて）を形成し、これはおそらく、キャプシド形成に際してのみ、固定された構造を採用する。ヒストンの塩基性の「テイル」は、ヌクレオソームが形成される場合に、同様にふるまい得る。キャプシドタンパク質のＮ末端配列は、しばしば正に荷電し、そしてウイルスの結晶構造においては、これらの配列の電子密度は、しばしば、これらの配列が、非対称的に整列した核酸とおそらく相互作用するウイルスの内部に姿を消す。リボソームにおいて観察された相互作用は、これらのウイルス相互作用のモデルに有用であり得る。
【０１５１】
大サブユニットにおける伸長したポリペプチドおよびＲＮＡの相互作用（塊状の核酸構造を安定化する）は、サブユニットの中央において、ＲＮＡおよびタンパク質のもつれを生じる（図８（Ａ）および８（Ｂ）を参照のこと）。高度に整列した様式以外に有効な成分から会合するような物体を想像するのは難しい。シャペロンは、これらのタンパク質の伸長した領域の集合を妨げるためにおそらく必要であり得、これは、ｒＲＮＡによって提供された状況の外部でディスオーダーするようであり、そしてｒＲＮＡのフォールディングを統御するようである。
【０１５２】
（８．タンパク質およびＲＮＡの相互作用）
タンパク質は、驚くべき程度で大サブユニットに浸透するので、タンパク質とまったく相互作用しない２３Ｓ ｒＲＮＡのいくつかのセグメントのみしか存在しない。２３Ｓ ｒＲＮＡにおいて２９２３個のヌクレオチドのうちの１１５７個のヌクレオチドが、タンパク質と少なくともファンデルワールス接触を形成する（図８（Ｄ）を参照のこと）。そして、２０個のヌクレオチドよりも長い１０個の配列しか存在せず、ヌクレオチドはタンパク質と接触しない。このような最も長い配列は、４７個のヌクレオチドを含み、そして活性部位のクレフトの隆起を形成するドメインＩＶの一部である。
【０１５３】
大サブユニットが会合する場合に生じる、ＲＮＡとタンパク質との間の相互作用の程度は、定量的に評価され得る。接近可能な表面領域を計算するために、Ｒｉｃｈａｒｄｓアルゴリズム（Ｌｅｅ，Ｂ．ら（１９７１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５５：３７９−４００）、および１．７Åの半径のプローブを使用して、サブユニットが、単離されたが完全に構築された成分から形成される場合に、１８０，０００Ųの表面が埋められるようになることが示され得る。これは、総表面領域の約半分である。平均は、タンパク質当たり役６，０００Ųである。大半のタンパク質オリゴマーを形成する場合、埋められた表面と比較して、これは莫大な量であるが、リボソームアセンブリが、大半のタンパク質がオリゴマー形成する場合に生じない構造エントロピーの大きな損失によって付随されるはずであることが認識されるべきである。リボソームタンパク質の伸長したタンパク質末端およびループは、単離されてほぼ間違いなく可撓性であり、そしてタンパク質が存在しない場合、ＲＮＡは、同様におそらくかなり可撓性である。従って、表面領域の大量の埋没は、これらの分子の構造の固定に必要なエネルギーを提供するために必要とされ得る。
【０１５４】
Ｌ１２を除いて、粒子におけるすべてのタンパク質は、ＲＮＡと直接相互作用し、そして残りの３０個のタンパク質のうちの７個を除くすべては、２つ以上のｒＲＮＡと相互作用する（表２）。この点において、「シャペロン」はＬ２２であり、これは、２３Ｓ ｒＲＮＡのすべての６つのドメインに属するＲＮＡ配列と相互作用するタンパク質のみである（図８（Ｃ）を参照のこと）。５Ｓ ｒＲＮＡと２３Ｓ ｒＲＮＡとの間のタンパク質媒介性相互作用は、特に広範である。タンパク質Ｌ１８は、５Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス１およびヘリックス２／３を、２３Ｓ ｒＲＮＡのヘリックス８７に結合する。タンパク質Ｌ３１ｅは、５Ｓ ｒＲＮＡの同一部分とドメインＩＩおよびＶとの間の相互作用を媒介する。ループＣは、タンパク質Ｌ５によってドメインＶに結合し、そしてループＤは、タンパク質Ｌ１０ｅによってドメインＩＩおよびＶに結合する。どんなことが起こり得ようとも、これらのタンパク質の重要な機能は、隣接するＲＮＡドメインの相対的配向の安定化であることが明らかである。いくつかはまた、相互作用するドメインの３次元構造の固定を助ける。
【０１５５】
大半のリボソームタンパク質が、多くのＲＮＡ配列と相互作用し、そしてタンパク質の数が、ＲＮＡドメインの数を大いに超えるので、あらゆるｒＲＮＡドメインが複数のタンパク質と相互作用することは、意外な結果ではあり得ない（表２）。例えば、ドメインＶは、１３個のタンパク質と、いくつかは密接に、そしていくつかはついでに相互作用する。長い間、リボソームタンパク質のＲＮＡ結合性質についての情報に依存したオリゴヌクレオチド結合実験は、ＲＮＡとの相互作用についての可能性を過小評価した。このような実験によってタンパク質について同定された高親和性のＲＮＡ結合部位は、実際に、リボソームアセンブリに重要であり得るが、他の配列とのその多くのより弱い相互作用は、避けられるようであり、そしてこの相互作用はまた、リボソーム構造にきわめて重大であり得る。大半のリボソームタンパク質は、ＲＮＡと架橋し、そして架橋は、複数の相互作用なしでは不可能である。類似の考察は、スライセオソーム（ｓｌｉｃｅｏｓｏｍｅ）のような他のリボ核タンパク質の成分であるタンパク質に適用し得る。
【０１５６】
ただ１つのドメインと相互作用する７個のタンパク質のうちの３つ（Ｌ１、Ｌ１０，Ｌ１１）は、タンパク質合成プロセスに直接関係する。ＲＮＡが適切な構造を採用することを保証するために、リボソームに含まれるというよりは、正確な配置を確実にするために構築されたように、ＲＮＡを眺めるにより適切であるように見える。別の３つ（Ｌ２４、Ｌ２９、Ｌ１８ｅ）は、結合し、そしておそらくこのドメインの三次構造を安定化するように機能するドメインの内部で、いくつかの二次構造エレメントと相互作用する。一つのＲＮＡドメインタンパク質の最後であるＬ７ａｅは、難解である。一方、ＲＮＡ安定化タンパク質として機能することはできない。なぜなら、これは、ドメインＩの一つの短い配列とのみ相互作用し、そして一方、サブユニット、ペプチジルトランスフェラーゼ部位および因子結合部位における重要な機能的部位にはほど遠いからである。しかし、Ｅ部位機能に重要であるようであり（Ａｇｒａｗａｌら（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：８７２３−８７２９）、そしておそらくこの活性に関与するＬ１にかなり近い。
【０１５７】
多くのリボソームタンパク質が、主としてＲＮＡと相互作用するが、いくつかは、他のタンパク質と有意に相互作用する。タンパク質−タンパク質相互作用によって生成された最も著しい構造は、因子結合部位に近接することが見出されたＬ３、Ｌ６、Ｌ１４、Ｌ１９およびＬ２４ｅから構成されるタンパク質クラスターである。これらが提供するタンパク質表面は、因子相互作用に重要であり得る。
【０１５８】
上記で示された構造は、単離された成分の構造決定に依存する複合体の集合への接近の強度および弱さの両方を解明する。Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の大リボソームサブユニットのタンパク質のホモログの球状ドメインの構造は、インタクトのサブユニットにおける対応するドメインの構造と主として同一であるが、ドメインの位置の補正が、時折必要である。結果として、これらの構造は、タンパク質の位置決定および低分解能の電子密度地図の解釈に非常に有用であった。しかし、明らかな理由のために、リボソームタンパク質の伸長したテイルおよびループは、構造を与えるＲＮＡがない場合は決定されることができず、そしてこのようなタンパク質の構造を固定するために必要なすべてのＲＮＡ接触を有する低分子量のＲＮＡ−タンパク質複合体の生成に依存するストラテジーの可能性は、ありそうもないように見える。ＲＮＡはまた問題である。サルシン／リシンループは、リボソームと同様に、単離されてほぼ同じ構造を有するが、単離された５Ｓ ｒＲＮＡの構造は、リボソームにおいて見られたものとどこか異なり、そして単離されたＰループの構造は（Ｐｕｇｌｉｓｉら（１９９７）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．４：７７５−７７８）、リボソームのＰループの構造にまったく類似しない。明らかに、すべてのタンパク質およびすべての可能なｒＲＮＡフラグメントの構造決定を必要とするリボソームへの「構造ゲノム」アプローチは、うまくいっていない。他の高分子アセンブリもまた、成功しないかもしれない。
【０１５９】
（Ｂ．ペプチド結合合成におけるリボソーム活性の構造基礎）
同様に精密化された種々のアナログと複合体化したリボソームサブユニットのさらなる原子座標とともに、上記の第ＩＩＡ章で議論された原子座標の分析は、リボソーム機能の分析を可能にする。従って、本発明はまた、Ｙａｒｕｓ遷移状態アナログであるＣＣｄＡ−ｐ−ＰｕｒｏまたはアミノアシルｔＲＮＡのミニヘリックスアナログのいずれかと複合体化したＨａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの５０Ｓリボソームサブユニットの結晶に基づく。本発明は、両方の複合体の構造を提供する。両方の複合体の構造の原子座標は、２０００年７月２６日に、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（ＲＣＳＢ）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に、登録番号ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺ（５０Ｓリボソーム／ＣＣｄＡ−ｐ−Ｐｕｒｏ複合体）およびＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯ（５０Ｓリボソーム／ａａ−ｔＲＮＡアナログ）の下で登録された（Ｂｅｒｍａｎら（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２８：２３５−２４２；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）。
【０１６０】
以下で議論するように、２つの基質アナログを有する大リボソームサブユニットおよびその複合体の完全な原子構造は、リボソームはリボザイムであることを示す。完全な原子構造はまた、そのすべてのＲＮＡの活性部位の触媒性質に関して情報を提供する。基質アナログの両方は、２３Ｓ ｒＲＮＡのドメインＶ由来の保存されたｒＲＮＡ残基によって独占的に接触する；合成されたペプチド結合に、約１８Åよりも近いタンパク質側鎖は存在しない。ペプチド結合合成の機構は、セリンプロテアーゼにおける脱アシル化工程の逆に類似するようであり、Ｅ．ｃｏｌｉのＡ２４８６（Ａ２４５１）の塩基は、キモトリプシンにおけるＨｉｓ５７と同じ一般的な塩基の役割を果たす。Ａ２４８６が所有し、この機能を遂行するはずである異常なｐＫａは、触媒に必要とされる２つの塩基の異常な互変体を安定化し得る埋没したリン酸基（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）と相互作用するＧ２４８２（Ｇ２４４７）に結合するその水素に由来する。ポリペプチド出口トンネルは、主にＲＮＡによって形成されるが、タンパク質Ｌ２２、Ｌ３９およびＬ４からの有意な寄与を有し、そしてその出口は、タンパク質Ｌ１９、Ｌ２２、Ｌ２３ａ、Ｌ２４およびＬ２９によって豊富になる。
【０１６１】
Ｙａｒｕｓアナログ由来のＣＣｄＡは、いわゆるＰループに結合し、そしてそれ故、Ｐ部位にあるはずである。ａａ−ｔＲＮＡアナログの末端のＣＣＡのみが認識されるが、それは適切にＡループと相互作用するため（Ｋｉｍら（１９９９）Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ ４：８５９−８６４）、Ａ部位にあるはずである。ピューロマイシンの群は、両方の構造において同じ位置を占有し、そしてこの部位に近接するタンパク質は存在しない。それ故、活性部位の触媒活性は、完全にＲＮＡに依存するはずである。Ａ２４８６のＮ３（Ｅ．ｃｏｌｉのＡ２４５１）は、合成されたペプチド結合に最も近い滴定可能な群であり、そして一般的な塩基として機能し、Ａ部位基質のαアミノ基による求核攻撃を容易にするようである。この能力で機能するために、この塩基のｐＫａは、通常よりも約５ユニット高いはずである。
【０１６２】
（１．基質アナログ複合体の構造）
基質が、大サブユニットのＡ部位およびＰ部位でどのように相互作用するかを確立するために、２つの基質アナログを使用した。アナログのうちの一つ（ａａ−ｔＲＮＡのアクセプター軸を模倣し、そしてＡ部位に結合するように設計された）は、３’末端に、アミノアシル化された４つのヌクレオチド伸長を有する１２個の塩基対のＲＮＡヘアピンであった（図９を参照のこと）。使用された配列は、ｔＲＮＡ ｔｙｒアクセプター軸の配列であり、そしてピューロマイシンで終了し、これ自身は、チロシル（ｔｙｒｏｓｙｌ）−Ａ７６のアナログである。使用された第二のアナログは、Ｙａｒｕｓ遷移状態アナログであるＣＣｄＡ−ｐ−ピューロマイシンであった。Ａ部位基質アナログの場合のように、Ｙａｒｕｓインヒビターのピューロマイシンは、Ａ部位で結合することが予期されるが、このＣＣｄＡ部分は、Ｐ部位で結合するはずである。
【０１６３】
ＹａｒｕｓインヒビターおよびｔＲＮＡアクセプター軸アナログの位置は、これらの分子を、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットの結晶に浸漬することによって決定され、３．２Åの分解能まで回折データを測定し、そして差電子密度地図を計算した（Ｗｅｌｃｈら（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：６６１４−６６２３）。複合体の地図はまた、係数として２Ｆ０（複合体化）−Ｆ０（非複合体化）を使用して計算し、これらのアナログが結合した場合に（図１０（Ｂ）および表３を参照のこと）生じるリボソーム残基の位置における変化を試験した。
【０１６４】
【表３】

【０１６５】
全体のＹａｒｕｓインヒビターのモデルは、差密度に適合され得（図１０（Ａ）を参照のこと）、そして複合体の電子密度地図は、ホスホルアミドの非架橋酸素の水素結合距離内に、Ａ２４８６（２４５１）のＮ３を示す（図１０（Ｂ）を参照のこと）。ペプチジルｔＲＮＡのＣ７４およびＣ７５に対応する、インヒビターの２つのＣは、それぞれ、ＰループにおけるＧ２２８５（２２５２）およびＧ２２８４（２２５１）とのワトソン−クリック塩基対形成をする（図１１（Ａ）を参照のこと）。Ｃ７４−Ｇ２２８５（２２５２）相互作用は、Ｎｏｌｌｅｒらの結果によって推測された（Ｎｏｌｌｅｒら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４１６−１４１９）。Ｐ部位のｔＲＮＡのＡ７６に対応するｄＡは、塩基対形成していないが、Ａ２４８６のリボースに、むしろ積み重なり、そしてヌクレオチドＡ２４８５の２’ＯＨに水素結合する（図１２（Ｂ）を参照のこと）。
【０１６６】
ミニヘリックスのアクセプター軸アナログのＣＣ−ピューロマイシン部分のみが、差電子密度地図において整列した電子密度を示した（図１０（Ｃ）を参照のこと）。アクセプター軸ＣＣＡのＣ７５は、ＡループのＧ２５８８（２５５３）とワトソン−クリック塩基対形成し、一方、Ｃ７４は、よりディスオーダーしており、そして塩基対形成していないが、リボソーム塩基に積み重なっているようである。Ａ部位のインヒビターであるピューロマイシンのジメチルＡは、ＹａｒｕｓインヒビターのジメチルＡに等しく位置する。さらに、ピューロマイシンのジメチルＡ（Ａ部位のｔＲＮＡのＡ７６等価物である）は、Ｐ部位のＣＣＡ由来のＡ７６が、Ｐループと相互作用する様式とほぼ同じ様式で、Ａループと相互作用する（図１１（Ｂ）を参照のこと）。
【０１６７】
遷移状態アナログの結合によって誘導される、リボソームにおけるいくつかの構造変化の最も顕著なものは、塩基Ａ２６３７（２６０２）の整列であり、これは、リガンドを含まない酵素ではディスオーダーする（図１１（Ｂ）を参照のこと）。この塩基は、Ａ部位で結合したＣＣＡとＰ部位で結合したＣＣＡとの間に位置するようになる。Ｕ２６２０（２５８５）の塩基はまた移動し、その結果、Ａ部位のＡ７６のリボースの２’ヒドロキシルと水素結合を形成し得、そしてＵ２６１９およびＧ２６１８の位置が変化し、Ａ７６の位置決定を可能にする。位置におけるより小さい位置変化は、Ａ２４８６の位置において観察され、Ａ２４８６のＮ３は、リン酸基の非架橋酸素および相互作用するＧ残基のうちの一つであるＧ２１０２（２４８２）に近接する。
【０１６８】
（２．ペプチジルトランスフェラーゼ部位の位置および化学組成）
インヒビターは、近くにタンパク質を有さない２３Ｓ ｒＲＮＡから完全に形成された部位に結合し、リボソームはリボザイムであることを証明する。Ｙａｒｕｓインヒビターおよびａａ−ｔＲＮＡのＡ部位アナログは、サブユニットの裏を走る１００Å長のポリペプチド出口トンネルの入り口の大きくそして深いクレフトの底で、大サブユニットと結合する（図１２を参照のこと）。この部位は、２３Ｓ ｒＲＮＡのドメインＶの中央のループ（「ペプチジルトランスフェラーゼループ」）に属するヌクレオチドによって囲まれる。このループの一つの鎖の位置由来のヌクレオチドは、四面体炭素中間体を模倣するリン酸基への最も近接した接近を形成する。一般的に、２３Ｓ ｒＲＮＡの２次構造図において、ペプチジルトランスフェラーゼループから伸長するヘリックスはまた、３次構造において、活性部位から離れて伸長する（図１３を参照のこと）。ドメインＶと相互作用する１３個のタンパク質が存在するが（図１４（Ａ）を参照のこと）、インヒビターの付近には球状タンパク質は存在しない。最も近接したポリペプチドは、ドメインＶに深く貫通し、そしてそして活性部位に接近するいくつかのタンパク質（Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ１０ｅ）の非球状伸長である（図１４（Ｂ）を参照のこと）。これらの伸長は、ドメインＶのＲＮＡヘリックス間の多くの空隙を充填し、リン酸基の骨格の電荷を中和し、そしておそらく、ドメインの構造および他のＲＮＡとの会合を安定化する。しかし、これらの側鎖の原子のいずれも、ペプチド結合を形成する部位を特徴付けるインヒビターのリン酸基のリンに約１８Åよりも近接していない。さらに、基質アナログは、ｒＲＮＡキャビティに完全に囲まれる。このキャビティは、非常にきつくパッキングされるので、同定されていないペプチドが、近くに潜み得る可能性は存在しない（図１５を参照のこと）。従って、リボソームの触媒の本質はＲＮＡのはずである。
【０１６９】
ドメインＶのｒＲＮＡ骨格を貫通する長い末端またはループを有するタンパク質のうちの２つは、ペプチジルトランスフェラーゼ反応Ｌ２およびＬ３の関与から以前に除外されなかったタンパク質である（Ｎｏｌｌｅｒ（１９９１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６０：１９１−２２７）。Ｎｏｌｌｅｒら（Ｎｏｌｌｅｒら（１９９２）前出）は、ＲＮＡ変性を防ぐ条件下で、プロテアーゼでのＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ５０Ｓサブユニットの広範な消化、その後のフェノールおよびタンパク質−ＲＮＡ相互作用を分裂する他の薬剤での抽出が、分子量１０，０００未満であるサブユニットから、いくつかのペプチドを取り除かないことを見出した。この構造は、これらのタンパク質フラグメントは、特に、プロテアーゼ処理に耐性である理由を明らかにする。プロテアーゼ処理は、大サブユニットの表面上の球状タンパク質ドメインを消化し得るが、２３Ｓ ｒＲＮＡに深く貫通する長い末端およびループを取り除くことはできなかった。なぜなら、これらは、ｒＲＮＡの内部に封鎖され、従って、球状ドメインに関係なく切断から保護されるからである。
【０１７０】
（３．ペプチジルトランスフェラーゼ活性部位）
基質アナログを囲むＲＮＡは、きつくパッキングされ、タンパク質酵素の活性部位領域のようであり、そしてインヒビターと接触するヌクレオチドは、すべての３つの生物界において９５％を超えて保存される（図１５を参照のこと）。従って、リボソームがリボザイムであることは明らかであるが、ＲＮＡに触媒力を与えるものは何であろうか。
【０１７１】
理論に束縛されることを望まずに、おそらく一般的な塩基として、最も触媒に関与するらしい残基は、Ａ２４８６である。Ａ２４８６のＮ３は、発生期のペプチド結合のカルボニル酸素のアナログであるＹａｒｕｓインヒビターのホスホルアミド酸素から約３Åであり、そして合成されたペプチド結合のアミド窒素に対応するアミドから約４Åである。通常、アデノシン一リン酸のＮ１のｐＫａは、約３．５であり、そしてそのＮ３のｐＫａは、おそらく２ｐＨユニット低く（Ｓａｅｎｇｅｒ（１９８４）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，（Ｃ．Ｒ．Ｃａｎｔｏｒ、編）、ＳｐｒｉｎｇｅｒＡｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｘｔｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、そして一般的な塩基としてＡ２４８６が機能するために、このｐＫａは、７以上に上昇されるはずである。それ自身の結晶構造は、実際に、そのｐＫａがかなり異常であることを示唆する。Ａ２４８６のＮ３は、観察されるように、Ｎ３（または、そのリン酸基の酸素（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｘｙｇｅｎ））がプロトン化される場合に、リン酸基の酸素にのみ水素結合し得る。これらの２つの原子間の距離は約３Åであり、水素結合が、実際にこれらの間に存在することを示す。結晶は、ｐＨ５．８であるので、これは、Ｎ３のｐＫａが６を超えることを意味する。ＭｕｔｈおよびＳｔｒｏｂｅｌは、ｐＨの機能として硫酸ジメチル反応性を試験することによって、Ｅ．ｃｏｌｉ ２３Ｓ ＲＮＡにおいて対応するＡのｐＫａを測定し、そしてこのｐＫａが７．６であると結論付けた。しかし、測定したｐＫａが、Ｎ３のものかＮ１のものであるかは、この実験から確かではなかった（Ｍｕｔｈら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：９４７−９５０）。発生期のペプチド結合に約７Åより近接する滴定可能なＲＮＡ官能基の他に利用できるものはなかったので、一般的な塩基として機能するような利用可能な他の基は存在しない。
【０１７２】
ｐＫａに影響を及ぼし得るＡ２４８６（２４５１）の環境のいくつかの特徴が存在する。Ａ２４８６（２４５１）のＮ３のｐＫａは、セリンプロテアーゼの活性部位で生じる機構に類似する電荷リレー機構によって一部有意に増加し得、Ａ２４８５（２４５０）の埋没したリン酸基は、キモトリプシンのＡｓｐ１０２の埋没したカルボキシル基と類似の機能を果たす。実験的な２．４Åの電子密度地図は、明白に、活性部位のこの最も重大な領域での水素結合相互作用を確立する（図１６（Ａ）を参照のこと）。Ａ２４８６のＮ６は、Ｇ２４８２（２４４７）およびＧ２１０２（２０６１）のＯ６原子と相互作用する（図１６（Ｂ）を参照のこと）。Ｇ２４８２のＮ２はまた、２．４Åの分解能の地図において任意の中和対イオンが見られない大リボソームサブユニットにおける３つの最も溶媒に接近不可能なリン酸基（８２６、１４９７および２４８５）の間にあるＡ２４８５（２４５０）のリン酸基の非架橋水素と相互作用する。水分子に対応し得る弱い密度は、他の非架橋酸素に結合した水素である。中和対イオンは、この構造においては明白ではない。Ａ２４８５の埋没したリン酸基は、エネルギー的に不利な埋没した負の電荷を中和するために、Ｇ２４８２の環外Ｎ２からプロトンを引き抜き得る。これは、順に、この塩基の他の点では珍しいイミノ四面体を安定化する。同様に、Ａ２４８６とのＧ２４８２のイミノの相互作用は、プロトン化されていなければ、そのＮ３上で負の電荷を生じるＡ２４８６のイミノ四面体を安定化し得る（図１６（Ｃ）を参照のこと）。このようにして、Ａ２４８５の埋没したリン酸基上に生ずる負の静電電荷のいくつかは、Ａ２４８６のＮ３に中継され得、それによって、そのｐＫａを増加する。
【０１７３】
安定性、四面体状態および静電電荷分布に影響を及ぼし得る触媒部位の環境の第二の特徴は、結合した一価の陽イオンである。カリウムイオンまたはナトリウムイオンは、Ｇ２４８２およびＧ２１０２のＯ６ならびに３つの他の塩基と相互作用する。カリウムイオンとしてのその同一性は、観察された継続によって確立され、そしてルビジウムイオンがこの状態に結合し得ることを示す独立した実験によって確立される。一価のイオンはまた、非標準的四面体を安定化し得るが、Ａ２４８６のｐＫａへの予期された影響は、あまり明らかではない。初期の生化学的実験は、ペプチジルトランスフェラーゼ活性に対するカリウムの重要性を示し（Ｍｏｎｒｏ（１９６７）前出；Ｍａｄｅｎら（１９６８）前出）、そしてこの結合部位は、この影響の原因であり得る。
【０１７４】
埋没されたリン酸基によるイミノ四面体の安定化は、デルタ肝炎ウイルスリボザイムの活性部位の触媒シトシンの予期されたより高いｐＫａを説明する（Ｆｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ ３９５：５６７−５７４；Ｎａｈａｒｏら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：１４９３−１４９７）。この場合、溶媒への接近可能性がリボソームのＡ２４８５と類似するリン酸基骨格は、ＣのＮ４およびＣがリン酸基を中和するイミノ四面体のプロトン化形態と水素結合することが観察され、一般的な酸としてのＮ３の機能を促進する（Ｎａｈａｒｏら（２０００）前出）。
【０１７５】
（４．ペプチド結合形成の触媒機構）
合成されたペプチド結合へのＡ２４８６（２４５１）の近接および触媒された反応の性質は、ペプチド加水分解の間のセリンプロテアーゼにおいて見られる脱アシル化工程の逆に類似するペプチド合成の化学的機構を示唆する（Ｂｌｏｗら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ２２１：３３７−３４０；Ｓｔｅｉｔｚら（１９８２）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．１１：４１９−４４４）。この機構において、Ｈｉｓ５７の塩基形態は、アシル−Ｓｅｒ１９５を攻撃するように、ペプチド産物のαアミノ基からプロトンを引き抜く。四面体カルボニル炭素中間体の形成は、アミド骨格で形成されるオキシアニオンの相互作用によって安定化される（「オキシアニオン孔」）；Ｈｉｓ５７は、四面体中間体が破壊される場合、α−ＮＨ₂からＳｅｒ１９５へ必要とされるプロトンを往復輸送する。
【０１７６】
残基Ａ２４８６（２４５１）は、キモトリプシンにおいてＨｉｓ５７に類似するようであり、そしてペプチジルｔＲＮＡは、アシル−Ｓｅｒ−１９５に類似する。従って、非常に上昇したｐＫａを有するＡ２４８６のＮ３は、アミノアシル−ｔＲＮＡを結合したＡ部位のαアミノ基からプロトンを引き抜き、Ｐ部位においてｔＲＮＡの３’ＯＨをアシル化するカルボニル炭素上のアミノ基の求核攻撃を容易にする（図１７（Ａ）を参照のこと）。しかし、セリンプロテアーゼと対照的に、四面体中間体のオキシアニオンは、分離したオキシアニオン結合部位に近位ではなく、Ａ２４８６（Ａ２４５１）のプロトン化されたＮ３に近接する。従って、Ａ２４８６のプロトン化されたＮ３は、Ｙａｒｕｓインヒビター複合体において観察されるように、このＮ３への水素結合によるオキシアニオンの形成を安定化し得る（図１７（Ｂ）を参照のこと）。次いで引き続いて、Ａ２４８６のＮ３は、ｔＲＮＡを結合したＰ部位の３’ヒドロキシルにプロトンを移動し得、ペプチドは、ｔＲＮＡを結合したＡ部位に位置を変える場合に遊離される（図１７（Ｃ）を参照のこと）。
【０１７７】
さらなる問題は、Ｐ部位におけるペプチジルｔＲＮＡの触媒された加水分解が、次の適切なａａ−ｔＲＮＡをＡ部位へ送達する前に、どのように妨げられるかである。この複合体から、Ａ部位が空いている場合、水が、Ｐ部位のｔＲＮＡへのペプチジル結合の接近から除外されるようである。類似の問題は、１９６０年代に、Ｋｏｓｈｌａｎｄによって議論された（Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｊｒ．（１９６３）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．２８：４７３−４８９）。Ｋｏｓｈｌａｎｄは、水がグルコースの６ヒドロキシルによって使用される結合部位に完全に良好に結合するはずであるので、ヘキソキナーゼが、グルコースの非存在下でＡＴＰを加水分解しない理由を理論づけた。提唱された回答は、整合を誘導された。すなわち、ヘキソキナーゼは、グルコースが結合し、そして最適に基質および触媒基を配向する構造変化を生成するまで、触媒反応能を有さない。これは、実際にこの場合であるようである（Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊｒ．ら（１９７８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７５：４８４８−４８５２）。同様に、触媒Ａ２４８６および／またはペプチジル基質が、適切に配向しないか、またはα−ＮＨ₂基の結合部位が、Ａ部位におけるａａ−ｔＲＨＡの非存在下において、再配向したリボソーム塩基によってブロックされる可能性がある。Ｕ２６２０の塩基が、リガンドを含まない構造においてＡ２４８６に近接ことが観察され、そしてペプチジルｔＲＮＡの自発的な加水分解を妨げる適切なプラグとして役立ち得る。
【０１７８】
従って、このＲＮＡ酵素は、タンパク質酵素と同じ触媒原理を使用するようである。第一に、大きな触媒の増強が、２つの反応物（Ａ部位のアミノアシルｔＲＮＡ由来のαＮＨ₂およびＰ部位のペプチジルｔＲＮＡ由来のカルボニル炭素）を正確に配向することによって達成される。これは部分的に、それぞれ、ＡループおよびＰループとのＡ部位およびＰ部位のｔＲＮＡのＣＣＡ末端の相互作用によって果たされ得る。第二に、酸塩基触媒および遷移状態の安定化が、化学的性質が、活性部位の環境によって適切に変更される酵素の官能基（この場合、Ａ２４８６（２４５１））によって達成される。第三に、類似の化学的原理が、ＲＮＡおよびタンパク質酵素によって使用され、官能基のｐＫａを変更し得る。Ｈｉｓ５７を介して作用するＡｓｐ１０２の埋没したカルボキシレート（ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ）は、キモトリプシンのＳｅｒ１９５の求核性を変更する（Ｂｌｏｗら（１９６９）前出）。リボソームにおいて、溶媒に接近不可能なリン酸基は、Ｇ２４８２（２４４７）を介して作用し得、Ａ２４８６（２４５１）のＮ３の求核性を変更する。ＲＮＡ分子が、タンパク質分子が触媒の化学的原理を使用する前に、有意に触媒の化学的原理を使用する方法を「学習した」可能性がある。
【０１７９】
（５．ｔＲＮＡ結合）
立体配置に関する理由のために、これらの結晶中で、Ａ部位またはＰ部位のいずれかへのｔＲＮＡ分子の結合は不可能であるが、Ｃａｔｅらが、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ７０Ｓリボソームの結晶学的研究において観察した同じ相対的配向で、大リボソームサブユニット上のＰ部位のｔＲＮＡ分子およびＥ部位のｔＲＮＡ分子を配置することは可能である。７０Ｓリボソームにおいて見られる相対的配置における３つのｔＲＮＡ分子の原子座標は、立体衝突を避け、そして本発明者らがＡループおよびＰループに結合したことを観察したＣＣＡの位置の近くのＡ部位のｔＲＮＡおよびＰ部位のｔＲＮＡのアクセプター軸を配置する様式で、Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの大リボソームサブユニット上にドッキングされ得る（図１８を参照のこと）。ヌクレオチドＣ７４およびＣ７５が７．８Åのリボソーム地図においてことなる立体配座でモデル化されたが、Ａ部位およびＰ部位の両方におけるＣＣＡ由来のＣ７４残基が、モデル化された残基７３を通してドッキングされたＡ部位のｔＲＮＡおよびＰ部位のｔＲＮＡの残基７２に接続され得、そしてｔＲＮＡ分子は、サブユニットの表面上に良好に整合するようである。予想外に、このモデリングは、３つのリボソームタンパク質に極めて近接して、ｔＲＮＡ分子を結合したＥ部位、Ｐ部位およびＡ部位を配置する。タンパク質Ｌ５およびＬ１０ｅは、Ｐ部位およびＡ部位においてｔＲＮＡに近接する。これらのタンパク質の両方はまた、５Ｓ ｒＲＮＡと相互作用するので、この知見は、５Ｓ ｒＲＮＡおよびこの会合したタンパク質のいくつかが、ｔＲＮＡを結合したリボソームの位置決定の安定化を助け得る可能性を引き上げ、そして５Ｓ ｒＲＮＡが、リボソーム活性を増強する事実に矛盾しないが、この活性に完全に不可欠なわけではない（Ｍｏｏｒｅ，Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ＆Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９６）、前出、１９９−２３６頁）。タンパク質Ｌ４４ｅは、Ｅ部位のｔＲＮＡと相互作用するようであり、そしてＥ部位活性に寄与し得る。このドッキング実験に従って、Ａ部位のｔＲＮＡは、高度に保存されたステム−ループ２５０２−２５１８（２４６７−２４８３）と相互作用し、このステム−ループは、Ｌ１０ｅとともに、Ｔ軸上でｔＲＮＡと接触する大きな凹状表面を形成し、ＥＦ−Ｔｕによって利用される全く同じ結合部位を利用する（Ｇｕｔｅｌｌら（２０００）前出）。
【０１８０】
Ａ部位およびＰ部位に結合したＣＣＡと、結合したｔＲＮＡとの間の関係ならびにその相互作用についての試験はまた、移動へのいくつかの洞察を導く。新規のペプチド結合の形成およびＰ部位のｔＲＮＡの脱アシル化の直後に、Ｐ部位のｔＲＮＡのアクセプター末端がＥ部位へ移動し、そしてＡ部位のｔＲＮＡのアクセプター末端がＰ部位へ移動することが公知である（Ｂｌｏｂｅｌら（１９７０）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４５：１３０−１４５）。大サブユニット上の３つのｔＲＮＡ分子の近似モデリングは、このプロセスへのいくつかの可能な寄与を示唆する。第一に、Ｐ部位のｔＲＮＡとＰループとの間に２つの塩基対が存在し、そしてＡ部位とＡループとの間に１つの塩基対のみが存在する。Ａ部位からＰ部位への移動が、塩基対形成を増加するが、脱アシル化されたＰ部位のｔＲＮＡのＥ部位への同時に生ずる誘引であるはずである。さらに、ＣＣＡは、１８０°回転によって関連づけられ、一方、結合するｔＲＮＡは、関連づけられない。従って、アクセプター軸へのＣＣＡの関係は、両方の部位において同一であり得ず、そして等しく安定ではないかもしれない。Ａ部位のｔＲＮＡの立体配座が、より安定でない場合、次いで、Ａ部位からＰ部位へのｔＲＮＡの移動は、エネルギー的に有利であり得る。
【０１８１】
（６．ポリペプチド出口トンネル）
構造から、すべての発生期のポリペプチドが、リボソームから出る前に、ポリペプチド出口トンネルを通過するようである。なぜなら、他に出口がないようであるからである。本発明者らは、現在、ポリペプチド出口トンネルの機能についての２つの重要な問題を扱い得る：（１）なぜ、発生期のタンパク質は、その壁に付着しないのか。テフロンは、変性した卵タンパク質に付着しない驚くべき性質を有する。では、リボソームは、トンネルを通過しなければならない変性したタンパク質の類似の付着しない表面をどのように獲得したのか。（２）タンパク質は、トンネル内で任意の程度に折り畳まれ、リボソームにシャペロン様機能を与えるのか。
【０１８２】
ペプチド合成部位からその出口までのトンネルの長さは、約１００Åであり、リボソームによるタンパク質分解性切断から保護される発生期のポリペプチドの長さ（Ｍｏａｚｅｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：１４２）および出口での抗体認識に必要な最小限の長さ（Ｐｉｃｋｉｎｇら（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：２３６８−２３７５）に大まかには矛盾しない。トンネルは、ペプチジルトランスフェラーゼの中央部からの２０〜３５Åの屈曲を除いて、主として一直線である（図１９を参照のこと）。この直径は、最初期および約１５Åの平均直径を有する出口トンネルから２８Åの位置でで、最も広い点での約２０Åから狭い点での約１０Åに変化する。ポリペプチド産物が通過しなければならない最も小さな穴は、αヘリックスの直径にかろうじて適応するので、αヘリックスの構造を超えた有意なタンパク質の折り畳みが、リボソームにおいて生じることは不可能であるようである。
【０１８３】
トンネル表面の大半は、２３Ｓ ｒＲＮＡのドメインＩ〜Ｖによって形成されるが、有意な寄与はまた、ＲＮＡ骨格においていくつかの空隙を充填するだけでなく、トンネル壁の有意な部分を形成する、タンパク質Ｌ２２、Ｌ４およびＬ３９の非球状領域によってなされる（図１９を参照のこと）。トンネルの表面への最も大きなタンパク質の誘因は、Ｌ２２であり、Ｌ２２の長いαヘアピンループは、ドメインＩからドメインＩＶのＲＮＡセグメントの間に横たわり、そしてトンネルの軸にほぼ平行である。他のトンネルタンパク質と異なり、タンパク質Ｌ３９は、粒子の表面で球状ドメインを有さず、そしてタンパク質Ｌ２３の下のドメインＩおよびＩＩＩにほぼ完全に埋没される。興味深いことに、トンネル壁を形成する２３Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチドは、主に２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造におけるループ由来である（図１９を参照のこと）。活性部位からトンネルへ進行するように、発生期のポリペプチドは、ドメインＩＩおよびドメインＩＶならびにタンパク質Ｌ４およびタンパク質Ｌ２２に沿って２０Å続くドメインＶに最初に出会う。トンネルの最後の半分は、ドメインＩおよびＩＩＩならびにタンパク質Ｌ３９ｅによって形成される。
【０１８４】
トンネルの最も狭い部分は、トンネルの反対側からトンネルに接近するタンパク質Ｌ２２およびＬ４によって形成され、門を備えられた開口部のようなものを形成する（図１９Ｃを参照のこと）。この緊縮の機能は、たとえあったにしても、明らかではない。発生期の鎖の性質が検知され、そして情報が、おそらくＬ２２またはＬ４を介して粒子の表面に伝達される場所であり得る。この穴の部位のＬ２２のαヘアピンおよびこれと相互作用する２３Ｓ ｒＲＮＡは、高度に保存されている；この球状部分は、タンパク質分泌の間にトランスロコンに面するはずである表面上の出口トンネルに近接して位置する（図１９を参照のこと）。
【０１８５】
トンネル壁の「付着しない」特徴は、遭遇する任意のタンパク質配列または構造への構造相補性および極性相補性の欠失を反映するはずである。トンネル表面は、主として親水性であり、そして塩基、リン酸基骨格および極性タンパク質側鎖由来の露出した水素結合基を含む（図１９を参照のこと）。同様に、トンネルに面する多くの疎水性基（糖、塩基、タンパク質側鎖）が存在するが、発生期のポリペプチドにおける疎水性配列のための有意な結合部位を形成するに十分大きな疎水性表面の断片は存在しない。トンネルは、直径約２０Åであり、そして水で満たされ、そして新たに合成されたポリペプチドが、おそらく自由に可動するため、トンネル壁へのペプチドの結合は、７００Åを超える大きな相補的相互作用表面によって補われるべきエントロピーの大損失を生じる（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ ２５６：７０５−７０８）。同様に、発生期のペプチド由来のＡｒｇおよびＬｙｓ側鎖が、実際に、トンネルに露出されたリン酸基と相互作用し得るが、結合した対イオンを置換した後に得られる構造相補性および正味の結合エネルギーの程度は、ペプチド結合に起因する固定の不利なエントロピーを克服するには小さすぎるはずである。従って、リボソームトンネルは主としてＲＮＡから形成されるが、その表面の性質は、非結合立体配座でのシャペロニン（ＧｒｏＥＬ）の内部表面を連想させる（Ｘｕら（１９９８）Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２４：１２９−１４１）。大きな疎水性表面を露出する立体配座においてのみ、ＧｒｏＥＬは変性したタンパク質を結合する。
【０１８６】
トンネルからの出口に位置する６つのタンパク質（Ｌ１９、Ｌ２２、Ｌ２３、Ｌ２４、Ｌ２９およびＬ３１ｅ）が存在し、タンパク質分泌の間に、リボソームとドッキングするトランスロコンに面する。プロテアーゼによるタンパク質の広範な消化の後でさえ、リボソームがトランスロコンを結合する証拠が存在し、これは、トランスロコンとリボソームとの間の相互作用が、ＲＮＡによって媒介されることを意味する。しかし、トランスロコンへのこれらのタンパク質の近接は、たとえあるにしても、タンパク質分泌プロセスにおける役割を果たし得るという役割について疑問を抱かせる。Ｄｏｂｂｅｒｓｔｅｉｎ研究室からの最近のデータは、ＳＲＰ５４のＮ末端ドメイン（シグナルペプチド結合に関与するシグナル認識粒子由来のＧタンパク質）が、リボソームタンパク質Ｌ２３およびＬ２９と架橋し得ることを示す。これらの２つのタンパク質は、互いに近接し、そしてトンネル出口に位置する（図１９を参照のこと）。
【０１８７】
（７．進化）
ＲＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ進化は、Ｙａｒｕｓインヒビターのような分子を効果的に結合し得るか、またはペプチド転移反応を触媒し得る小ＲＮＡ分子を生成した（Ｚｈａｕｇら（１９９８）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５：５３９−５５３；Ｗｅｌｃｈら（１９９７）前出）。これらの分泌ＲＮＡの配列および二次構造は、２３Ｓ ｒＲＮＡのドメインＶにおけるペプチジルトランスフェラーゼループを連想させる（Ｚｈａｕｇら（１９９８）前出）。最も著しい類似性は、触媒Ａ２４８６、Ｇ２４８２およびＡ２４８５の埋没したリン酸基を含むドメインＶの配列に同一の５つのヌクレオチド配列である。著しく、リボソームにおけるＡ２４８６の活性化についての提唱された電荷リレー系に関与するすべての基は、インビトロで選択されたリボザイムに存在する。従って、周囲の構造状況は異なるようであるが、この人工的に進化したリボザイムが、アデニンのｐＫａを変換するためのリボソームおよびペプチド合成のための塩基と同じ機構を使用することは、もっともであるようである。第二のＲＮＡ（Ｗｅｌｃｈら（１９９７）前出）は、ペプチジルトランスフェラーゼループの同一の領域に見出された９つの塩基配列を含む１２のヌクレオチドループを含む。
【０１８８】
リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ活性部位に見出された重要な触媒エレメントを含む配列と、ペプチジルトランスフェラーゼを触媒し得る小ＲＮＡドメインの出現を明らかにする関連した活性を有するインビトロで選択されたＲＮＡの配列との間の類似性は、リボソームでのタンパク質合成の進化のもっともらしい第一の工程であった。この始源的なペプチド合成酵素によって構成される第一のペプチドは、ランダムポリマーまたはコポリマーであり得、そしてアミノアシル化ＣＣＡと同じくらい単純な基質とともに機能し得る。２３Ｓ ｒＲＮＡとともに折り畳まれる非球状伸長を形成することが観察された型の基本的なペプチドは、機能的に有用である合成された第一のペプチドの中にある。このようなペプチドは、今日のリボソームのより複雑化されたペプチドが、プロトリボソームおよび他の初期のリボソームの安定性を増大し得るように、プロトリボソーム（ｐｒｏｔｏｒｉｂｏｓｏｍｅ）および他の初期のリボソームの安定性を増大し得る。
【０１８９】
（Ｃ．２．４Åの分解能、完全な精密化での大リボソームサブユニットの原子構造）
Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の大リボソームサブユニットの３次元構造が、現在、２．４Åの分解能で完全に精密化された。モデルは、２８７６個のＲＮＡヌクレオチド、２８個のリボソームタンパク質由来の３７０１個のアミノ酸、１１７個のマグネシウムイオン、８８個の一価の陽イオンおよび７８９８個の水分子を含む。このタンパク質の多くは、表面に露出した球状ドメインおよびｒＲＮＡに埋没された１つ以上の塩基性の非球状伸長からなる。これらのうちの半分は、非リボソームタンパク質に共通のモチーフ（例えば、ＲＲＭドメイン、ＳＨ３様バレルおよびジンクフィンガーを含む）を含む。有意な配列類似性および構造類似性を有するタンパク質（例えば、Ｌ１５およびＬ１８ｅ）は、ｒＲＮＡとの本質的に同一の相互作用を形成する。
【０１９０】
より特に、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの５０Ｓサブユニットが、ＣＮＳを使用してグラジエントエネルギー最小化およびＢ因子の継続によって完全に再形成され、そして精密化された（Ｂｒｕｅｎｇｅｒら（１９９８）前出）。リボソームタンパク質およびｒＲＮＡは、溶媒および金属イオンのモデリングの前に、２Ｆ_o−Ｆ_c電子密度地図を用いて、ソフトウェアプログラム「Ｏ」を使用して、完全に再形成された（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．ら（１９９１）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ａ４６：１１０−１１９）。タンパク質におけるモデリング誤差は、ＰＲＯＣＨＥＣＫを使用して同定され（Ｌａｓｋｏｗｓｋｉら（１９９３）Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．２６：２８３−２９１）、そしてＦｏ−Ｆｃ地図の点検によって同定された。差地図はまた、ｒＲＮＡにおける誤差の同定を助け、最も頻繁に、糖の縮み（ｐｕｃｋｅｒ）に関連する。このプロセスにおいて、アミノ酸の立体配座、配列登録（ｒｅｇｉｓｔｅｒ）および配列それ自体のいくつかの補正が行われた。行われた配列変化は、直接配列決定されないＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の唯一の３つのタンパク質であるＬ１０ｅ、Ｌ１５ｅおよびＬ３７Ａｅに主として限定された。さらに、５１個のアミノ酸が、ＩＩＡ節に記載されたモデルに追加され、これらのうちの４４個は、Ｌ７／Ｌ１２茎状部およびＬ３９ｅの塩基のＬ１０に由来し、ポリペプチド出口トンネルの壁の一部分に並べられる。ｒＲＮＡ構造に対する補正はほとんど行わなかった。４９個の新規のヌクレオチドが、主に２３Ｓ ｒＲＮＡのドメインＩＩのヘリックス４３および４４においてモデル化され、そして精密化された。さらに、糖の縮みまたはグリコシド結合の立体配座は、いくつかのヌクレオチドに近接した。精密化プロセスは、モデルならびにＲ／Ｒ_free値に由来する位相を使用して計算された電子密度地図の質によってモニターされた。完全に精密化されたモデルは、現在、２８７６個のＲＮＡヌクレオチド、３７０１個のアミノ酸、２１０個の金属イオンおよび７８９８個の水分子を含む。このモデルは、Ｒ／Ｒ_free値を１８．９％／２２．３％まで精密化し、そして優れたジオメトリを有する（表４）。
【０１９１】
溶媒のモデリングは、ＣＮＳを使用した自動ピーク選択によって得られる可能なマグネシウムイオンのリストの生成から始めた。Ｎ原子またはＯ原子からのマグネシウムの球内（ｉｎｎｎｅｒ−ｓｐｈｅｒｅ）座標距離が１．９〜２．１Å内で配置されるＦ_o−Ｆ_c地図において、３．５σを超えるピークが選択された。得られたリストを手動で調べ、そして明らかに八面体の座標ジオメトリを示すピークのみを、マグネシウムとして選択した。
【０１９２】
一価の陽イオンを、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ５０Ｓサブユニットのルビジウム浸漬結晶とＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ５０Ｓサブユニットのネイティブ結晶との間の同形性の差異に基づいて同定した。ネイティブ結晶は、１．６Ｍ ＮａＣｌの存在下で安定なので、これらの部位は、Ｎａ⁺¹として最初にモデル化され、そして精密化された。Ｋ⁺¹としてのこれらの部位の精密化は、ほぼ常に、異常に高い温度因子を生じ、本発明者らがＫ⁺¹をモデル化した場合に２つの例外を伴った。５０Ｓサブユニットの大半の一価の部位は、本発明者らの結晶中で、Ｎａ⁺¹によって占有されるようであるが、これらの部位は、インビボではＫ⁺¹によって占有されるようである。
【０１９３】
水は、Ｆ_o−Ｆ_c電子密度地図において、３．５σを超え、そしてＯ原子またはＮ原子の２．５Åと３．３Åとの間のピークとして選択された。個々のＢ因子値は、水分子の割当てを評価するために使用された。多くの水が、周囲のＲＮＡおよびタンパク質原子よりも有意に低いＢ因子まで精密化された。多くの場合、これらのピークは、金属イオンまたは塩化イオンであることが見出された。少数の低いＢ因子の水分子が、最終モデルにおいて保持された。なぜなら、これらの水分子は、他の種のように明白に割当てられないからである。添加した金属イオンおよび水分子の結果として、最終モデルは、現在９８，５４７個の非水素原子を含む。大リボソームサブユニットの精密化およびモデル統計を、表４に要約する。
【０１９４】
【表４】

【０１９５】
精密化はまた、２３Ｓ ｒＲＮＡのＬ１０、Ｌ３９ｅおよびＬ１１結合部位のさらなるモデリングを可能にした。さらに、特定のモチーフ（例えば、ＲＲＭトポロジー、ＳＨ３様バレルおよびジンクフィンガー）が、５０Ｓタンパク質に共通であり、そして各々は、多くの異なる様式で、ｒＲＮＡを認識することが発見された。しかし、有意な３次元相同性（例えば、Ｌ１５およびＬ１８ｅ、ならびにＬ１８およびＳ１１）を有するタンパク質は、ｒＲＮＡとの本質的に同一の相互作用を形成する。５０Ｓタンパク質と非リボソームタンパク質との間のさらなる構造相同性もまた、明らかである。これらの球状タンパク質ドメインの溶媒に露出した表面は、アスパラギン酸残基およびグルタミン酸残基に富むが、不規則なタンパク質伸長は、リボソームのＲＮＡのコアを貫通する。これらの伸長は、頻繁に高度に保存され、そしてアルギニン、リシンおよびグリシン残基がこれらの伸長に豊富であることは、この伸長の機能に重要である。集合的に、結果は、多くのリボソームタンパク質間の進化的関連を示し、そして高度に特異的であるが、リボソームにおけるタンパク質−ＲＮＡ相互作用がいくつかの共通の原理を共有することを説明する。
【０１９６】
（Ｄ．抗生物質結合部位）
前述の構造研究に加えて、７つの異なる抗生物質の各々と複合体化したＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの大リボソームサブユニットの構造が決定された。より特に、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの大リボソームサブユニットの結晶を、以下の抗生物質のうちの一つに浸漬した：アニソマイシン、ブラスチシジン、カルボマイシン、チロシン、スパルソマイシン、ヴァージニアマイシンまたはスピラマイシン。次いで、各々の抗生物質と複合体化した大リボソームサブユニットの構造は、各々の結晶について生成されたＸ線回折データに基づいて解明された。
【０１９７】
手短に言えば、少量の濃縮された抗生物質溶液を、安定化溶液中で懸濁された大サブユニットの結晶に添加し、そして数時間インキュベートした。通常、実験使用のためのこのような結晶を調製するために使用される凍結手順およびその他の手順の後に、Ｘ線回折データは、結晶を含む抗生物質から収集された。結晶は、上記の構造に由来する結晶に同形なので、ネイティブ結晶について得られた位相は、抗生物質に浸漬された結晶から得られた回折強度と組み合わされ、抗生物質に浸漬された結晶構造を得る。結晶中の結合した抗生物質の位置は、差電子密度地図において最も明瞭に示され、この差電子密度地図は、抗生物質を含む結晶の振幅（適切にスケーリングされた）から、抗生物質を含む結晶の振幅を減ずることによって得られる振幅とまさにいわれる位相を使用して計算された電子密度地図である。上述の方法を使用することによって、大リボソームサブユニット内の特定の抗生物質と結合部位との間の空間的関係を示す原子座標を決定することが可能であった。類似の方法が、大リボソームサブユニットと複合体化した他の抗生物質の構造を解明するために使用され得ることが意図される。
【０１９８】
アニソマイシンと複合体化した大リボソームサブユニットの原子座標を、ファイル名ａｎｉｓｏｍｙｃｉｎ．ｐｄｂの下でコンパクトディスクのディスク番号３の３に表で列挙される。さらに、図２０は、抗生物質アニソマイシンと大リボソームサブユニットとの間の空間的関係を示す。
【０１９９】
ブラスチシジンと複合体化した大リボソームサブユニットの原子座標を、ファイル名ｂｌａｓｔｃｉｄｉｎ．ｐｄｂの下でコンパクトディスクのディスク番号３の３に表で列挙される。図２１は、抗生物質ブラスチシジンと大リボソームサブユニットとの間の空間的関係を示す。配向については、図２１はまた、Ｐ部位の基質を含む。
【０２００】
カルボマイシンと複合体化した大リボソームサブユニットの原子座標を、ファイル名ｃａｒｂｏｍｙｃｉｎ．ｐｄｂの下でコンパクトディスクのディスク番号３の３に表で列挙される。図２２は、抗生物質カルボマイシンと大リボソームサブユニットとの間の空間的関係を示す。図２２はまた、ポリペプチド出口トンネルの一部分を示す。
【０２０１】
チロシンと複合体化した大リボソームサブユニットの原子座標を、ファイル名ｔｙｌｏｓｉｎ．ｐｄｂの下でコンパクトディスクのディスク番号３の３に表で列挙される。図２２は、抗生物質チロシンと大リボソームサブユニットとの間の空間的関係を示す。図２２はまた、ポリペプチド出口トンネルの一部分を示す。
【０２０２】
スパルソマイシンと複合体化した大リボソームサブユニットの原子座標を、ファイル名ｓｐａｒｓｏｍｙｃｉｎ．ｐｄｂの下でコンパクトディスクのディスク番号３の３に表で列挙される。図２３は、抗生物質スパルソマイシンと大リボソームサブユニットとの間の空間的関係を示す。配向については、図２３はまた、Ｐ部位の基質を示す。
【０２０３】
ヴァージニアマイシンと複合体化した大リボソームサブユニットの原子座標を、ファイル名ｖｉｒｇｉｎｉａｍｙｃｉｎ．ｐｄｂの下でコンパクトディスクのディスク番号３の３に表で列挙される。図２４は、抗生物質ヴァージニアマイシンならびにカルボマイシンと大リボソームサブユニットとの間の空間的関係を示す。
【０２０４】
スピラマイシンと複合体化した大リボソームサブユニットの原子座標を、ファイル名ｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ．ｐｄｂの下でコンパクトディスクのディスク番号３の３に表で列挙される。
【０２０５】
図２５は、いくつかの抗生物質（すなわち、ブラスチシジン、アニソマイシン、ヴァージニアマイシンおよびカルボマイシン）が、大リボソームサブユニットの内部のそれぞれの抗生物質結合部位に結合する通り、いくつかの抗生物質（すなわち、ブラスチシジン、アニソマイシン、ヴァージニアマイシンおよびカルボマイシン）の空間的配向を示す。読み手を向かせる目的のために、これらの抗生物質は、大リボソームサブユニットの内部で、特異的な位置に結合するかまたは接触し、タンパク質生合成を中断する。例えば、ブラスチシジンは、Ｐ部位の付近に大リボソームサブユニットを結合するようであり：アニソマイシンおよびヴァージニアマイシンは、Ａ部位の付近に大リボソームサブユニットを結合し：そしてカルボマイシン（マクロライド）は、ペプチジルトランスフェラーゼ部位に近接したポリペプチド出口トンネルの付近に大リボソームサブユニットを結合する。
【０２０６】
図２５から、当業者が、大リボソームサブユニットにおける領域と接触する各々の抗生物質の特定の部分を同定し得ることが明らかである。これらの空間的関係について、丁寧に互いに知ることによって、当業者は、第一の鋳型抗生物質の一部分および第二の異なる鋳型抗生物質の一部分を含むハイブリッド抗生物質分子を生成し得る。２つの部分は、他の部分に関して一つの部分の空間的配向を維持するために、化学的リンカーによって連結され得る。結果として、このハイブリッド抗生物質は、各々の鋳型抗生物質によって代表的に結合されるリボソームサブユニットの各々の領域を同時に結合し得る。このような分子の設計および試験を、以下により詳細に議論する。
【０２０７】
（Ｅ．Ｘ線回折データを活用する実験技術）
結晶性固体における分子または原子の集合から得られるＸ線回折パターンに基づいて、この固体の電子密度は、結晶学およびＸ線回折技術の分野の当業者に周知の手段を使用して再構成され得る。次いで、回折データおよび入手可能な公開された文献から引き出されるか、ならびに／または追加の実験から引き出されるかのいずれかのさらなる位相情報を使用して、再構築を完成する。
【０２０８】
電子密度の構築のためのＸ線回折データの収集、分析および利用の基本的な概念および手順については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９８４）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｔｈｅ Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ， ＣＡ）；Ｃａｎｔｏｒら（１９８０）Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐａｒｔ ＩＩ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ａ．Ｔ．Ｂｒｕｅｎｇｅｒ（１９９３）Ｘ−ＰＬＯＲ ３．１版：Ａ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｘ−ｒａｙ ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ａｎｄＮＭＲ，Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖ．Ｐｒ．，（Ｎｅｗ Ｈａｖｅｎ，ＣＴ）；Ｍ．Ｍ．Ｗｏｏｌｆｓｏｎ（１９９７）Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｘ−ｒａｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖ．Ｐｒ．，（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）；Ｊ．Ｄｒｅｎｔｈ（１９９９）Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｘ−ｒａｙ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｘｔｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；Ｂｅｒｌｉｎ；Ｔｓｉｒｅｌｓｏｎら（１９９６）Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｎｓｉｔｙ ａｎｄ Ｂｏｎｄｉｎｇ ｉｎ Ｃｒｙｓｔａｌｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄＸ−ｒａｙ Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｓｔａｔｅ Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｎｓｔ．ｏｆ Ｐｈｙｓｉｃｓ Ｐｕｂ．；米国特許第５，９４２，４２８号；米国特許第６，０３７，１１７号；米国特許第５，２００，９１０号、および米国特許第５，３６５，４５６号（「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｔｈｅＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｄｅｎｓｉｔｙ ｏｆ ａ Ｃｒｙｓｔａｌ」）を参照のこと。
【０２０９】
次いで、分子モデルは、実験的電子密度情報を使用して、前進的に形成され得、そしてＸ線回折データに対してさらに精密化され得、固体の正確な分子構造に帰着する。
【０２１０】
（Ｆ．他の大リボソームサブユニットの構造決定）
当業者が、第一の高分子の原子座標とともに提供された場合、この情報を使用して、異なるけれども構造的に関連する高分子の３次元構造を迅速かつ容易に決定し得ることが理解される。例えば、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の大リボソームサブユニットを規定する原子座標が使用され、小サブユニットと複合体化した単離されたサブユニットとしてか、または機能的に重要な以下のリガンドと複合体化したサブユニットのいずれかの他の種由来の大リボソームサブユニットの構造を決定し得る：例えば、アミノアシルｔＲＮＡ；種々のタンパク質合成因子（例えば、伸長因子Ｇ、伸長因子Ｔｕ、終結因子または再生（ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ）因子）（これらの両方とも、ＧＴＰおよびＧＤＰ立体配座状態である）；およびタンパク質合成インヒビター（例えば、抗生物質）。さらに、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉサブユニットの座標がまた使用され、タンパク質分泌機構（例えば、シグナル認識粒子およびトランスロコン）の成分とのリボソーム複合体の構造を解き得る。
【０２１１】
調べられた結晶が、未知の構造の高分子を含み、そしてさらなる情報が入手不可能である場合、さらなる実験が、高分子の適切な位相の決定のために時折必要とされ得る。これらの研究はしばしば、時間の浪費であり得、そして成功するかも不確かであり得る（Ｂｌｕｎｄｅｌｌら（１９７６）前出）。しかし、さらなる情報（例えば、構造および／または結晶学的情報）が目的の高分子にある点で関連する分子に利用できる場合、目的の分子の構造を解明するプロセスは、興味深くなく、そして時間浪費の仕事である。
【０２１２】
従って、当業者は、以前に解明された構造から収集された情報を使用して、目的の新規の分子の３次元モデルを開発し得る。さらに、当業者は、種々のアプローチを使用して、新規の分子の３次元構造を解明し得る。このアプローチは、目的の分子の結晶が入手可能であるか否か、および／または目的の分子が、構造がすでに決定されたホモログを有するか否かに依存し得る。
【０２１３】
一つのアプローチでは、目的の分子が、同形（すなわち、構造が決定されている関連分子と同じ単位格子寸法および空間群を有する）の結晶を形成する場合、関連分子の位相および／または原子座標が、新規に観察された振幅と直接組み合わされ、電子密度地図を獲得し得、従って、目的の分子の原子座標を獲得し得る。次いで、得られた地図および／または原子座標は、当該分野で公知の標準的な精密化手順を使用して精密化され得る。別のアプローチでは、目的の分子が、既知の３次元構造の別の分子に関連するが、異なる対称を有する異なる単位格子で結晶化する場合、当業者は、分子置換として公知の技術を使用して、構造が既知の分子の座標から有用な位相を獲得し得る（Ｂｌｕｎｄｅｌｌら １９７６前出）。次いで、これらの位相が使用され、目的の分子の電子密度地図および／または原子座標が生成され得る。別のアプローチでは、結晶が、目的の分子について入手不可能であるが、３次元構造が既知の別の分子と相同である場合、当業者は、相同性モデリングとして公知のプロセスを使用して、目的の分子の３次元構造を生成し得る。他のアプローチは、目的の分子の３次元モデルの誘導に有用であり得ることが意図される。従って、一つの分子の結晶および／または座標に関する情報は、関連分子の構造の決定を非常に容易にし得る。
【０２１４】
１９６０年代にＲｏｓｓｍａｎｎおよびＢｌｏｗによって最初に開発された分子置換法は、現在慣用的に使用され、相同分子、または異なる連結状態の相同分子の構造を使用して、未知の構造の高分子の結晶構造を確立する（Ｍ．Ｇ．Ｒｏｓｓｍａｎｎ編、「Ｔｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，」Ｉｎｔ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｊ．Ｎｏ．１３，Ｇｏｒｄｏｎ ＆Ｂｒｅａｃｈ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９７２）；Ｅａｔｏｎ Ｌａｔｔｍａｎ，「Ｕｓｅ ｏｆ Ｒｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎＦｕｎｃｔｉｏｎｓ，」Ｈ．Ｗ．Ｗｙｃｋｏｆｆ，Ｃ．Ｈ．Ｗ．Ｈｉｓｔ．（Ｓ．Ｎ．Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ編）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１１５：５５−７７（１９８５））。分子置換の適用の例としては、例えば、Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ａ．＆ Ｓｔｅｉｔｚ，Ｔ．Ａ．（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．１３：１５１４−２４を参照のこと。
【０２１５】
分子置換において、既知の分子の３次元構造は、観察された回折振幅と位置決定されたサブユニットの座標から計算された振幅との間の最良な一致を提供する配向および位置を見出すことによって、新規の結晶の単位格子内で位置決定される。このモデリングから、未知の結晶についての近似の位相が誘導され得る。未知であるが、関連する構造の単位格子において、既知の構造を位置決定するために、単位格子の原点と相対的な３つの回転角および３つの並進が決定された。回転検索は、検索する構造と相対的な配向の関数としての標的構造のパターソン関数との間の一致を探すことによって行われる（回転関数）。Ｘ−ＰＬＯＲ（Ｂｒｕｅｎｇｅｒら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：４５８−４６０；ＣＮＳ（Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ＆ ＮＭＲ Ｓｙｓｔｅｍ，Ｂｒｕｅｎｇｅｒら（１９９８）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｓｅｃｔ．Ｄ ５４：９０５−９２１）およびＡＭＯＲＥ：ａｎ Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｐａｃｋａｇｅ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｎａｖａｚａ，Ｊ．（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｓｅｃｔ．Ａ，５０：１５７−１６３）は、回転関数検索および並進関数検索を実行し得るコンピュータプログラムである。一旦、試験分子の配向が公知になると、分子の位置は、並進検索を使用して見出されるはずである。一旦、既知の構造が、未知の分子の単位格子に位置決定されると、観察された回折データの位相が、既知の分子の構造的に関連する原子の原子座標から計算され得る。未知の分子についての計算された位相およびＸ線回折データを使用することによって、当業者は、目的の分子の電子密度地図および／または原子座標を生成し得る。
【０２１６】
例えば、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来以外のリボソームサブユニットの３次元モデルは、分子置換を介して生成され得ることが意図される。この方法において、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉのサブユニット構造は、観察された回折振幅と、位置決定されたサブユニットの座標から計算された振幅との間の最良の一致を提供する配向および位置を見出すことによって、新規の結晶の単位格子内に位置決定される。出発（ｓｔａｒｔｉｎｇ）電子密度地図は、２Ｆ_hkl（観測値）−Ｆ_hkl（計算値）（ここで、Ｆ（観測値）は、未知の構造の結晶から測定された回折振幅であり、そしてＦ（計算値）は、位置決定されたＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉのサブユニット構造から計算された回折振幅である）を使用して計算された。初期モデルの精密化は、高分子の結晶学の分野で標準的なように行われ得る。
【０２１７】
Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの５０Ｓ構造はまた、さもなければ低すぎて解釈できない分解能で計算された電子密度地図の７０Ｓリボソームまたは５０Ｓリボソームの構造を確立するために使用され得る。一方、５Åの分解能の地図は、新規の原子限界点（ｔｅｒｍ）で解釈され得ず、もっともらしい原子モデルが、より低い分解能地図（例えば、４．５Å〜８Å）まで、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの５０Ｓ構造を精密化することによって構築され得る。この再適合は、相同性モデリングと組み合わされ、異なる種由来のリボソームまたはリボソームサブユニットの３次元モデルを獲得し得る。類似の手順が使用され、真核生物の６０Ｓサブユニットおよび／または真核生物のリボソームの構造を決定し得ることが意図される。
【０２１８】
一般に、構造を解くための分子置換の成功は、関連構造の断片およびその同一性の程度に依存する。例えば、約５０％以上の構造が、約２Å以下の範囲で対応する原子間のｒ．ｍ．ｓ．差を示す場合、既知の構造が首尾良く使用され、未知の構造を解明し得る。
【０２１９】
比較モデリング（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）または経験に基づくモデリング（ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ−ｂａｓｅｄ ｍｏｄｅｌｉｎｇ）としてもまた公知の相同性モデリングを使用し、ホモログの既知の構造に基づく分子の３次元モデルを生成し得る。一般に、手順は、１つ以上の以下の工程を包含し得る：構造が以前に決定された分子のアミノ酸または核酸配列に対して、未知の分子のアミノ酸または核酸配列を整列させる工程；構造的に保存された領域および構造的に変化しやすい領域を同定する工程；公知の構造のコア残基から未知の構造のコア（構造的に保存された）残基についての原子座標を生成する工程；未知の構造における他の（構造的に変化しやすい）残基についての立体配座を生成する工程；側鎖の立体配座を形成する工程；ならびに未知の構造の精密化および／または評価する工程。
【０２２０】
例えば、すべての既知の５０ＳサブユニットのｒＲＮＡのヌクレオチド配列が、互いに、ならびにＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５ＳｒＲＮＡに関して整列され得るので、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの構造を使用して、他の５０Ｓ リボソームｒＲＮＡ（特に、トンネルおよび活性部位の領域において）の構造モデルを構築することが可能である。同様に、相同なタンパク質はまた、類似の方法論を使用してモデル化され得る。比較ＲＮＡ配列分析に有用な方法は当該分野で公知であり、そして視覚方法および数のパターン（ｎｕｍｂｅｒ ｐａｔｔｅｒｎ）方法、ならびにχ²統計、系統発生アルゴリズムまたは経験的アルゴリズムを利用する方法を含む。上述の方法のいくつかの記載については、例えば、；Ｇｕｔｅｌｌ（１９９６），「Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ １６Ｓ ａｎｄ ２３Ｓ ｒＲＮＡ，」Ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＲＮＡ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，ａｎｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，（Ｄａｈｌｂｅｒｇ Ａ．およびＺｉｍｍｅｒｍａｎ Ｂ．編）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ．Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１１１−１２８頁；Ｇｕｔｔｅｌｌら（１９９３）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２１：３０５５−３０７４；Ｓｃｈｎａｒｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６：７０１−７１９で入手可能である。特に有用な視覚点検方法としては、Ｅ．ｃｏｌｉの二次構造図に対する類似の位置に位置する残基とのＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの二次構造図における特定の位置の比較が挙げられる。相同性モデリングに特に有用なソフトウェアプログラムとしては、ＸＡＬＩＧＮ（Ｗｉｓｈａｒｔ，Ｄ．ら（１９９４）Ｃａｂｉｏｓ １０：６８７−８８）が挙げられる。米国特許第５，８８４，２３０号もまた、参照のこと。
【０２２１】
新規の種のｒＲＮＡをモデリングするために、コンピュータグラフィックプログラム（例えば、「Ｏ」（Ｊｏｎｅｓら（１９９１）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．Ｓｅｃｔ．Ａ，４７：１１０−１１９））を使用して、相同のｒＲＮＡの塩基（これらの塩基は異なる）でＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉのｒＲＮＡの塩基を置換し得る。そうでなければ多くのたいていの場合、塩基の同じ配向が適切である。挿入および欠失は、より難しくそして不確かであり得るが、ペプチジルトランスフェラーゼ部位を形成するｒＲＮＡおよびこの部位に最も近接するトンネルの一部分は、本質的に挿入および欠失と非常に高度に保存されない。自動化のウェブに基づく相同性モデリングは、例えば、Ｇｌａｘｏ Ｗｅｌｌｃｏｍｅ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，から入手可能なＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬコンピュータプログラムおよびＥＭＢＬサーバから入手可能なＷＨＡＴＩＦプログラムを使用して行われ得る。
【０２２２】
相同性モデリングの他の記載については、例えば、Ｇｕｔｅｌｌ Ｒ．Ｒ．（１９９６），前出；Ｇｕｔｅｌｌ Ｒ．Ｒ．ら（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：３０５５−３０７４；Ｓｃｈｎａｒｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６：７０１−７１９；Ｂｌｕｎｄｅｌｌら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ ３２６：３４７−３５２；ＦｅｔｒｏｗおよびＢｒｙａｎｔ（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：４７９−４８４；Ｇｒｅｅｒ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ２０２：２３９−２５２；ならびにＪｏｈｎｓｏｎら（１９９４）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９：１−６８を参照のこと。相同性モデリングの例は、例えば、Ｓｚｋｌａｒｚ Ｇ．Ｄ（１９９７）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．６１：２５０７−２５２０に見出され得る。
【０２２３】
以前に議論したように、原核生物および真核生物由来の大リボソームサブユニットは、構造的に保存される。原核生物および真核生物由来の大リボソームサブユニットのアミノ酸配列は、基質および触媒部位の結合部位の３次元構造、性質および形状に重要なアミノ酸残基の同一性の進化的保存に起因して整列され得る。相同な大リボソームサブユニットのアミノ酸配列における類似性により、相同性モデリングを介して、結晶構造が解かれていない分子のモデルの構築が可能になる。
【０２２４】
次いで、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの結晶および／または原子座標を使用して決定された新規のリボソームまたは大リボソームサブユニットの構造は、本明細書の以下に記載の１つ以上のアプローチを使用して、構造に基づく薬物設計に使用され得る。次いで、この情報が使用され、比較的感化されていない宿主のリボソームを残しながら、選択的に結合し、そして病原体のリボソームにおけるタンパク質合成を中断する分子を設計する。
【０２２５】
（Ｇ．合理的な薬物設計）
（１．序論）
１つ以上のＸ線結晶学、分子モデリング、相同性モデリングまたは分子置換から誘導された目的の大リボソームサブユニットを規定する原子座標が、合理的な薬物設計（ＲＤＤ）に使用され、目的の新規の分子（例えば、リボソーム機能の新規のモジュレーター（例えば、インデューサー、ミメティックまたはインヒビター）を設計し得ることが意図される。さらに、本明細書中で開示される原理を使用して、当業者は、目的の生物または種におけるリボソーム機能を減少、中断、またはそうでなければ阻害するように特に操作された新規のタンパク質合成インヒビターを設計、作製、試験、精密化および使用し得ることが意図される。例えば、本明細書中で議論された原理を使用して、当業者は、宿主（例えば、真核生物（特に、哺乳動物、そしてより特に、ヒト））におけるリボソーム機能を保護しながら、病原体（例えば、特定の原核生物）におけるリボソーム機能を特に標的化しかつ阻害する新規の分子を操作し得る。結果として、本明細書中で提供されかつ議論された原子座標により、当業者が、意図されたレシピエント（例えば、ヒト）においてはほとんど毒性を有さないか、またはまったく有さないまま、特定の病原体を殺傷し得る新規の抗生物質を設計することを可能にする。
【０２２６】
大リボソームサブユニットの原子座標を使用したＲＤＤが、当該分野で公知でありかつ使用される従来のコンピュータハードウェアおよびソフトウェアを使用したコンピュータ支援薬物設計（ＣＡＤＤ）を通じて、最も直ちに容易にされ得ることが意図される。候補分子は、従来の方法論を使用して、新規に設計され得るか、またはすでに既存の分子（例えば、現存の抗生物質）の改変版として設計され得る。一旦設計されると、候補分子は、当該分野で公知でありかつ使用される標準的な方法論を使用して合成され得る。合成後、候補分子は、例えば、リボソーム機能を減少させるかまたは阻害する能力、リボソームまたはリボソームサブユニットと相互作用するか、あるいはリボソームまたはリボソームサブユニットを結合する能力によって、生物活性についてスクリーニングされ得る。一部これらの結果に基づいて、候補分子は、１つ以上の前述の工程を繰り返し使用して精密化され、所望の生物学的活性を有するより望ましい分子を生成し得る。得られた分子は、標的生物の生物学的活性の処置、阻害または予防に有用であり得、それによって生物を殺傷するか、またはその増殖を妨げる。あるいは、得られた分子は、任意の生物（特に、動物、より特に、ヒト）における微生物感染の処置、阻害または予防に有用であり得る。
【０２２７】
要約すれば、本発明によって提供される手段および方法論が使用され、望ましい様式で、リボソームおよびリボソームサブユニットを結合および／またはリボソームおよびリボソームサブユニットと相互作用する目的の分子を同定および／または設計し得る。本質的に、手順は、繰り返しのプロセスを利用し、それによって、分子を合成し、試験し、そして特徴付ける。新規の分子は、最初の分子の試験および特徴付けにおいて得られた情報に基づいて設計され得、次いで、このような新規に同定された分子は、それ自身試験され得、そして特徴づけられ得る。この一連のプロセスは、望ましい結合性質および／または生物学的活性を有する分子を得るに必要とされる回数反復され得る。候補分子の同定のための方法を、以下により詳細に議論する。
【０２２８】
（２．候補分子の同定）
目的の候補分子の設計が、従来のボール＆スティック型モデリング手順によって容易にされ得ることが意図される。しかし、大リボソームサブユニットの大きさおよび複雑さを考慮して、候補分子を設計する能力が、コンピュータに基づくモデリングおよび設計プロトコルを使用して、有意に増大され得ることが意図される。
【０２２９】
（ａ．分子モデリング）
本明細書中の以下で詳細に議論される通り、候補分子の設計が、例えば、ＩＢＭ ＯＳ／２オペレーティングシステム上のＵＮＩＸベースのＷｉｎｄｏｗｓ ＮＴを作動し、そして分子モデリングおよび合理的な薬物設計のための従来のコンピュータプログラムを作動し得る、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ Ｉｎｃ．およびＳｕｎ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓから市販されている従来のコンピュータまたはワークステーションを使用して容易にされ得ることが意図される。
【０２３０】
図２７に示される包括的な特徴を有する任意のコンピュータシステムが、本発明の実施に有用であり得ることが理解される。より具体的には、図２７は、例えば、内部バスまたは外部ネットワーク、セントラルプロセシングユニット（１０１）、ランダムアクセス記憶装置（ＲＡＭ）（１０２）、読出し専用メモリ（ＲＯＭ）、モニタまたはターミナル（１０４）および必要に応じて外部保存デバイス（例えば、ディスケット、ＣＤ ＲＯＭまたは磁気テープ（１０５））を介して、互いに電気通信（１００）される代表的なコンピュータワークステーションの略図である。
【０２３１】
本発明のコンピュータに基づくシステムは、好ましくは、本発明のリボソームまたはリボソームサブユニットあるいはフラグメント配列および／または原子座標／Ｘ線回折データが保存されたデータ保存手段、ならびに分析手段を支持し、そして実行する必要なハードウェアおよびソフトウェア手段を含む。本明細書中で使用されるように、「コンピュータシステム」または「コンピュータに基づくシステム」は、本発明の配列、Ｘ線回折データおよび／または原子座標を分析するために使用される、ハードウェア手段、ソフトウェア手段およびデータ保存手段をいう。本明細書中で使用されるように、用語「データ保存手段」は、配列データ、原子座標および／またはＸ線回折データあるいは本発明の原子座標を記録された製品にアクセスし得るメモリアクセス手段を保存し得る任意のメモリをいう。
【０２３２】
一つの実施形態において、本発明のリボソームまたはリボソームサブユニット、あるいはその少なくとも一つのサブドメイン、アミノ酸および核酸配列、Ｘ線回折データおよび／または原子座標が、コンピュータ読取り可能媒体に記録される。本明細書中で使用されるように、用語「コンピュータ読取り可能媒体」は、コンピュータによって直接読まれ、そしてアクセスされ得る任意の媒体を意味することが理解される。このような媒体としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：磁気記録媒体（例えば、フロッピーディスク、ハードディスク記録媒体および磁気テープ）；光学記録媒体（例えば、光学ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭ）；電気記録媒体（例えば、ＲＡＭおよびＲＯＭ）；ならびにこれらのカテゴリの混成物（例えば、磁気／光学記録媒体）。当業者は、現在公知のコンピュータ読取り可能媒体のいずれかを使用し、どのように本発明のアミノ酸および／またはヌクレオチド配列、Ｘ線回折データおよび／または原子座標を記録されたコンピュータ読取り可能媒体を含む製品を創造し得るかを容易に認識する。
【０２３３】
本明細書中で使用されるように、用語「記録された」は、コンピュータ読取り可能媒体上に情報を保存する任意のプロセスを意味することが理解される。当業者は、コンピュータ読取り可能媒体上に情報を記録するための現在公知の方法のいずれかを容易に採用し、本発明のアミノ酸またはヌクレオチド配列、原子座標および／またはＸ線回折データを含む製品を生成し得る。
【０２３４】
本発明のアミノ酸および／またはヌクレオチド配列、原子座標および／またはＸ線回折データを記録されたコンピュータ読取り可能媒体を創造するための種々のデータ保存構造は、当業者に入手可能である。データ保存構造の選択は、一般に、保存された情報にアクセスするように選択された手段に基づく。さらに、種々のデータプロセッサおよびフォーマットが使用され、コンピュータ読取り可能媒体上に、本発明の配列情報、Ｘ線データおよび／または原子座標が保存され得る。上述の情報、データおよび座標は、市販のソフトウェア（例えば、ＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔおよびＭＩＣＲＯＳＯＦＴ Ｗｏｒｄ）でフォーマット（例えば、テキストファイルまたはデータベース）されたワードプロセッサテキストファイル、またはデータベースアプリケーション（例えば、ＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅなど）に保存されたＡＳＣＩＩファイルの形態で表され得る。当業者は、本発明の情報を記録したコンピュータ読取り可能媒体を得るために、任意の数のデータプロセッサ構造化（ｓｔｒｕｃｔｕｒｉｎｇ）フォーマットを容易に適用し得る。
【０２３５】
リボソームまたはリボソームサブユニットの配列および／または原子座標を保存されたコンピュータ読取り可能媒体を提供することによって、当業者は、配列および／または原子座標に慣用的にアクセスし得、リボソームもしくはリボソームサブユニット、そのサブドメイン、そのミメティックまたはリガンドをモデリングし得る。当業者が、コンピュータ読取り可能媒体において提供されるこのデータにアクセスし、そして分子モデリングおよび／またはＲＤＤについて分析することを可能にするコンピュータアルゴリズムは、公的に入手可能であり、そして市販されている。例えば、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ，ＭａｒｙＡｎｎ Ｌｉｅｂｅｒｔ Ｐｕｂｌ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９５）を参照のこと。
【０２３６】
コンピュータは必要とされないが、分子モデリングは、リボソーム、リボソームサブユニットまたはその一部分の現実的なモデルを作成するためにコンピュータを使用することによって、最も直ちに容易にされ得る。分子モデリングはまた、リボソーム、リボソームサブユニットまたはその中の一部分に結合し得る新規のより小さい分子（例えば、リガンド、薬剤および他の分子）のモデリングを可能にする。分子モデリングに利用される方法は、分子グラフィック（すなわち、３次元表示から計算機化学（すなわち、物理学的性質および化学的性質の計算）に及び、より小さい分子の結合またはその活性についての予測を行い；そして化学合成のためのリガンド（例えば、薬物）を含む新規の分子を予測する。
【０２３７】
分子モデリングについての基本的な情報については、例えば、Ｍ．Ｓｃｈｌｅｃｈｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ＰＣ（１９９８）Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；Ｇａｎｓら，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ（１９９６）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．；Ｎ．Ｃ．Ｃｏｈｅｎ編，Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ ｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ（１９９６）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；およびＷ．Ｂ．Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ（１９９６）を参照のこと。分子モデリングについての詳細な情報を提供する米国特許としては、例えば、米国特許第６，０９３，５７３号；同第６，０８０，５７６号；同第６，０７５，０１４号；同第６，０７５，１２３号；同第６，０７１，７００号；同第５，９９４，５０３号；同第５，８８４，２３０号；同第５，６１２，８９４号；同第５，５８３，９７３号；同第５，０３０，１０３号；同第４，９０６，１２２号；および同第４，８１２，１２号が挙げられる。
【０２３８】
３次元モデリングは、以下を含み得るがこれらに限定されない：構造の３次元表示を作製する工程、構造の図を描く工程、構造の物理的モデルを形成する工程、ならびに、既知の座標を使用して、関連するリボソーム、リボソームサブユニット、ならびにリボソーム／リガンド複合体およびリボソームサブユニット／リガンド複合体を決定する工程。適切な座標は、当該分野で公知の通り、分子モデリングの１つ以上のコンピュータプログラムに入れられる。例えば、３次元構造を見るか、または操作するために有用なコンピュータプログラムのリストとしては、以下が挙げられる：Ｍｉｄａｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；ＭｉｄａｓＰｌｕｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；ＭＯＩＬ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）；Ｙｕｍｍｉｅ（Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｓｙｂｙｌ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）；Ｉｎｓｉｇｈｔ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｂｉｏｓｙｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＭａｃｒｏＭｏｄｅｌ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｑｕａｎｔａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；Ｃｅｒｉｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；Ａｌｃｈｅｍｙ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）；ＬａｂＶｉｓｉｏｎ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒａｓｍｏｌ（Ｇｌａｘｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）；Ｒｉｂｂｏｎ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｌａｂａｍａ）；ＮＡＯＭＩ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｅｘｐｌｏｒｅｒ Ｅｙｅｃｈｅｍ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ，Ｉｎｃ．）；Ｕｎｉｖｉｓｉｏｎ（Ｃｒａｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）；Ｍｏｌｓｃｒｉｐｔ（Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｃｈｅｍ−３Ｄ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；Ｃｈａｉｎ（Ｂａｙｌｏｒ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）；Ｏ（Ｕｐｐｓａｌａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＧＲＡＳＰ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｘ−Ｐｌｏｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．；Ｙａｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｓｐａｒｔａｎ（Ｗａｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．）；Ｃａｔａｌｙｓｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；Ｍｏｌｃａｄｄ（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）；ＶＭＤ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｌｌｉｎｏｉｓ／Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）；Ｓｃｕｌｐｔ（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．）；Ｐｒｏｃｈｅｃｋ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ）；ＤＧＥＯＭ（ＱＣＰＥ）；ＲＥ＿ＶＩＥＷ（Ｂｒｕｎｅｌｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；Ｍｏｄｅｌｌｅｒ（Ｂｉｒｂｅｃｋ Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｌｏｎｄｏｎ）；Ｘｍｏｌ（Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｓｕｐｅｒｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｅｒｔ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＨｙｐｅｒＣｈｅｍ（Ｈｙｐｅｒｃｕｂｅ）；ＭＤ Ｄｉｓｐｌａｙ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）；ＰＫＢ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＮＩＨ）；ＣｈｅｍＸ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｌｔｄ．）；Ｃａｍｅｌｅｏｎ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）；およびＩｄｉｔｉｓ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｉｎｃ．）。
【０２３９】
ＲＤＤへの一つのアプローチは、目的の部位に結合し得る既知の分子構造を検索することである。分子モデリングを使用して、ＲＤＤプログラムは、目的の部位に適合し得る異なる分子構造の範囲で眺め得、そしてそしてコンピュータスクリーン上に移動するか、または計算を介することによって、どの構造が、実際に良好に部位に適合するかを決定し得る（Ｗｉｌｌｉａｍ Ｂａｉｎｓ（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｒｏｍ Ａ ｔｏ Ｚ，第２版，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２５９頁）。
【０２４０】
代替ではあるが関連するアプローチは、小さい分子リガンドとの複合体の既知の構造、およびリボソームまたはリボソームサブユニットとのさらなる有利な相互作用を形成するためのこの小さい分子のモデル改変から開始される。
【０２４１】
本発明は、分子モデリング技術およびコンピュータモデリング技術を使用することによって、リボソームおよびリボソームサブユニットと相互作用する新規の分子（例えば、抗生物質または他の治療剤）の設計および選択を可能にする。このような抗生物質および治療剤の他の型としては、抗真菌薬、抗ウイルス物質、抗菌薬、殺虫薬、除草薬、ダニ駆除剤、齧歯類駆除剤（ｒｏｄｅｎｔｃｉｄｅｓ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２４２】
分子モデリングおよび／またはＲＤＤを容易にするために、当業者は、ＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに登録番号ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ、ＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２、ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＺまたはＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯで登録された原子座標のいくつかまたはすべて、および／あるいはディスク番号３の１、２または３に含まれる原子座標のいくつかまたはすべてを使用し得る。さらに、当業者は、上述の原子座標を使用して、目的の別の種由来のリボソームのモデルの少なくとも一部分をともに規定する、例えば、分子モデリングを介して、例えば、相同性モデリングおよび／または分子置換技術を使用して、さらなる原子座標を生成し得る。上述の原子座標を使用することによって、当業者は、１つ以上の種由来のリボソームに対して有効であるようにぴったり合うことが可能であるが、他の種のリボソームに対する効果がほとんどないか、またはまったくないタンパク質合成インヒビターを設計し得る。このようなインヒビターは、拮抗的インヒビターであり得る。本明細書中で使用されるように、用語「拮抗的インヒビター」は、リボソームまたはリボソームサブユニットの活性化形態に、その基質またはｔＲＮＡと同じ部位で結合するインヒビターをいい、従って、直接基質またはｔＲＮＡと競争する。用語リボソームまたはリボソームの「活性化形態」は、タンパク質合成を可能にし得る状態におけるリボソームまたはリボソームサブユニットをいう。拮抗阻害は、基質濃度またはｔＲＮＡ濃度を増加することによって、完全に逆転され得る。
【０２４３】
本発明はまた、タンパク質合成の非拮抗的インヒビターとして作用する分子の設計を可能にする。本明細書中で使用されるように、用語「非拮抗的インヒビター」は、基質またはｔＲＮＡに結合するよりも、リボソームまたはリボソームサブユニットの異なる部位に結合することによって、リボソームまたはリボソームサブユニットの機能的活性を阻害する分子をいう。このようなインヒビターは、しばしば、基質またはｔＲＮＡを伴うリボソームまたはリボソームサブユニットに結合し得、そしてリボソームまたはリボソームサブユニットそれ自身には結合しない。非拮抗阻害は、基質濃度を増加させることによって完全に逆転することができない。これらのインヒビターは、基質にすでに結合した大リボソームサブユニットの活性部位または他の領域のすべて、またはその大リボソームサブユニットの活性部位または他の領域の一部分に結合し得、そして大リボソームサブユニットの活性部位に競合するか、または大リボソームサブユニットへの結合に競合する既知の拮抗的インヒビターよりも強力かつ非特異的であり得る。
【０２４４】
同様に、別の化学的実体への結合の有無を問わず、タンパク質合成に結合し、そして阻害する非拮抗的インヒビターは、大リボソームサブユニットまたは本発明の大リボソームサブユニットを含む複合体の原子座標を使用して設計され得る。本明細書中で使用されるように、用語「非拮抗的インヒビター」は、リボソームまたはリボソームサブユニットの遊離形態、またはリボソームまたはリボソームサブユニットの基質結合形態、あるいはリボソームまたはリボソームサブユニットのｔＲＮＡ結合形態のいずれかに結合し得るインヒビターをいう。
【０２４５】
当業者は、Ｓｅｇｅｌ，Ｉ．Ｈ．，（１９７５）Ｅｎｚｙｍｅ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ：Ｂｅｈａｖｉｏｕｒ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｒａｐｉｄ Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ａｎｄ Ｓｔｅａｄｙ−Ｓｔａｔｅ Ｅｎｚｙｍｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，（Ｗｉｌｅｙ Ｃｌａｓｓｉｃｓ Ｌｉｂｒａｒｙ）に従った標準的な式を使用したコンピュータフィッティング酵素動力学データによって、インヒビターを拮抗的、非拮抗的（ｕｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）または非拮抗的（ｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）と同定し得る。本発明に従った非拮抗的（ｕｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）インヒビターまたは非拮抗的（ｎｏｎｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ）インヒビターが、同じ結合部位または異なる結合部位に結合し得ることがまた、理解されるべきである。
【０２４６】
あるいは、本発明によって提供される原子座標は、既知のタンパク質合成インヒビターの改良されたアナログを設計するのに有用であるか、または５０Ｓリボソームサブユニット／ＣＣｄＡ−ｐ−Ｐｕｒｏ複合体および５０Ｓリボソームサブユニット／ａａ−ｔＲＮＡアナログ複合体の結晶の原子構造および座標に基づくインヒビターの新規のクラスの設計に有用である。これは、高い特異性、安定性および他の薬物様品質の両方で、タンパク質合成インヒビターの設計のための新規の経路を提供する（Ｌｉｐｉｎｓｋｉら（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２３：３）。
【０２４７】
本発明の原子座標はまた、リボソームまたはリボソームサブユニットあるいは種々の異なる化学的特徴からなる分子を有するその一部分の３次元構造を突き止めることを可能にし、候補インヒビターおよび／またはアクチベーターとリボソームまたはリボソームサブユニットとの間の相互作用のための最適な部位を決定する。例えば、溶媒に浸された結晶から収集されたＸ腺回折データに基づく高分解能の原子座標により、各々の型の溶媒分子の付着の位置の決定が可能になる。次いで、これらの部位に結合する小分子が設計され得、合成され得、そして阻害活性について試験され得る（Ｔｒａｖｉｓ，Ｊ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１３７４）。さらに、任意の公知の抗生物質、インヒビターまたはＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ大サブユニットに結合する他の小分子が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ大サブユニットの結晶に浸漬され得、そして結合の正確な様式が、差電子密度地図から決定され得る。これらの分子は、より良い薬物様化合物が合成され得る先導する化合物を表し得る。
【０２４８】
（ｂ．標的部位の同定）
本発明の原子座標により、当業者が、合理的な薬物設計における開始地点として役立ち得るリボソームまたは大リボソームサブユニットにおける標的位置を同定することを可能にする。閾値問題として、本発明の原子座標により、当業者が、リボソームを離れてタンパク質合成および／またはタンパク質分泌に関与するリボソームまたはリボソームサブユニット内の特異的な領域を同定することを可能にする。さらに、本発明の原子座標により、当業者が、異なる生物間で保存されるかまたは保存されないこれらの領域の一部分をさらに同定することを可能にする。例えば、特定の病原体（例えば、特定の原核生物）の間で保存されるが、宿主生物（例えば、真核生物、より好ましくは、哺乳動物）においては保存されないこれらの領域の一部分を同定することによって、当業者は、病原体のリボソームのタンパク質合成活性を選択的に阻害または中断するが、宿主のリボソームのタンパク質合成活性を選択的に阻害または中断しない分子を設計し得る。さらに、特定の病原体の間で保存されるかまたは保存されないのいずれかである領域を分析することによって、特定の必要性が生じる場合に、広い範囲または狭い範囲のタンパク質合成インヒビター（例えば、抗生物質）を設計することが可能になり得る。
【０２４９】
図２８は、リボソーム内でのタンパク質合成および／またはリボソーム外で新たに合成されたタンパク質の輸送または移動に関与するらしい種々の典型的な標的部位を同定する大リボソームサブユニットの概略図である。標的部位としては、例えば、Ｐ部位（２００）、Ａ部位（２０１）、ペプチジルトランスフェラーゼ中央部（２０２）、ペプチジルトランスフェラーゼ部位（２０３）（少なくともＰ部位およびＡ部位の一部分、因子結合ドメイン（２０４）（例えば、ＥＦ−Ｔｕ結合ドメインおよびＥＦ−Ｇ結合ドメインを含む）、ポリペプチド出口トンネル（２０５）（出口トンネルの壁によって規定されるキャビティを含む）、シグナル認識粒子結合ドメイン（２０６）を含む）が挙げられる。
【０２５０】
例えば、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットの原子座標の点検は、新規のタンパク質合成インヒビターまたは改変されたタンパク質合成インヒビターの合理的な薬物設計のための基本の役割を果たし得る種々の標的領域を同定する。標的領域としては、ペプチジルトランスフェラーゼ部位、Ａ部位、Ｐ部位、ポリペプチド出口トンネル、ポリペプチド出口トンネルの壁に配置された特定のキャビティ（例えば、キャビティ１およびキャビティ２）、および特定の抗生物質結合ポケットが挙げられる。上述の領域の各々の少なくとも一部分をともに規定する残基を、以下の表に同定する。しかし、同一または類似の標的部位が、本明細書中で記載される原理を使用して、目的のリボソームまたはリボソームユニットにおいて同定され得ることが意図される。さらに、これらの原理は、本明細書中で提供される原子座標の初期のセットのいずれか、または任意のさらなる原子座標のセット（例えば、目的の任意のリボソームまたはリボソームサブユニットの分子モデリングによって生成され得る二次的な原子座標のセット）を使用して、利用され得る。
【０２５１】
表５は、リボソームのペプチジルトランスフェラーゼ部位の少なくとも一部分をともに規定する、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットにおける残基を同定する。さらに、表５は、ペプチジルトランスフェラーゼ部位の少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとＥ．ｃｏｌｉとの間で保存されないこと、ペプチジルトランスフェラーゼ部位の少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとラットとの間で保存されないこと、ペプチジルトランスフェラーゼ部位の少なくとも一部分を規定する残基が、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間で保存されないこと、およびペプチジルトランスフェラーゼ部位の少なくとも一部分を規定する残基が、ユーバクテリアと真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔａ）との間で保存されないことを同定する。保存されない残基は、他の生物由来の整列されたｒＲＮＡの対応する配列と、上記の部位を形成するＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ２３Ｓ ｒＲＮＡの配列とを比較することによって同定された。
【０２５２】
【表５】

【０２５３】

【０２５４】
表６は、リボソームのＡ部位の少なくとも一部分をともに規定するＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットにおける残基を同定する。さらに、表６は、Ａ部位の少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとＥ．ｃｏｌｉとの間で保存されないこと、Ａ部位の少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとラットとの間で保存されないこと、Ａ部位の少なくとも一部分を規定する残基が、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間で保存されないこと、およびＡ部位の少なくとも一部分を規定する残基が、ユーバクテリアと真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔａ）との間で保存されないことを同定する。保存されない残基は、表５に関して以前に記載されたように同定した。
【０２５５】
【表６】

【０２５６】
表７は、リボソームのＰ部位の少なくとも一部分をともに規定するＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットにおける残基を同定する。表７に示されるように、表５に関して以前に記載された比較方法を使用して決定されたように、リボソームのＰ部位部分のすべての残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとＥ．ｃｏｌｉとの間、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとラットとの間、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間、およびユーバクテリアと真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔａ）との間で保存される。
【０２５７】
【表７】

【０２５８】
表８は、リボソームのポリペプチド出口トンネルの少なくとも一部分をともに規定するＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットにおける残基を同定する。さらに、表８は、ポリペプチド出口トンネルの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとＥ．ｃｏｌｉとの間で保存されないこと、ポリペプチド出口トンネルの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとラットとの間で保存されないこと、ポリペプチド出口トンネルの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間で保存されないこと、およびポリペプチド出口トンネルの少なくとも一部分を規定する残基が、ユーバクテリアと真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔａ）との間で保存されないことを同定する。保存されない残基は、表５に関して以前に記載されたように同定した。
【０２５９】
【表８】

【０２６０】

【０２６１】

【０２６２】

【０２６３】

【０２６４】
図２６は、抗生物質が結合する大リボソームサブユニットの領域を示す。図２６（Ａ）は、ペプチジルトランスフェラーゼ部位に隣接したポリペプチド出口トンネルの頂部に結合した抗生物質チロシンを有する大リボソームサブユニットの拡大部分を示す。図２６（Ｂ）および２６（Ｃ）は、ポリペプチド出口トンネルに沿って切断された大リボソームサブユニットの各々の半分を示す図であり、そして全体として大リボソームユニットに関連してチロシン結合部位を示すために、読み手に向くように提供される。図２６（Ａ）はまた、ポリペプチド出口トンネルの壁によって規定された２つのキャビティを示し、そして「キャビティ１」および「キャビティ２」と表される。さらに、図２６（Ａ）はまた、二糖結合ポケットを示す。新規に合成されたポリペプチド鎖が、ポリペプチド出口トンネルを通ってリボソームを出ていく方向を、矢印で示す。
【０２６５】
表９は、ポリペプチド出口トンネルの壁の内部の第一のキャビティをともに規定するＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットにおける残基を同定する。さらに、表９は、キャビティ１を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとＥ．ｃｏｌｉとの間で保存されないこと、キャビティ１を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとラットとの間で保存されないこと、キャビティ１を規定する残基が、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間で保存されないこと、およびキャビティ１を規定する残基が、ユーバクテリアと真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔａ）との間で保存されないことを同定する。保存されない残基は、表５に関して以前に記載されたように同定した。
【０２６６】
【表９】

【０２６７】

【０２６８】
表１０は、ポリペプチド出口トンネルの壁の内部の第二のキャビティをともに規定するＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットにおける残基を同定する。さらに、表１０は、キャビティ２を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとＥ．ｃｏｌｉとの間で保存されないこと、キャビティ２を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとラットとの間で保存されないこと、キャビティ２を規定する残基が、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間で保存されないこと、およびキャビティ２を規定する残基が、ユーバクテリアと真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔａ）との間で保存されないことを同定する。保存されない残基は、表５に関して以前に記載されたように同定した。
【０２６９】
【表１０】

【０２７０】

【０２７１】
しかし、表９および１０は、ポリペプチド出口トンネルの壁の内部に配置された２つ以上のキャビティを規定する。しかし、本明細書中に記載される原子座標および分子モデリング方法論を使用することによって、当業者は、ポリペプチド出口トンネルの壁の内部の他のキャビティをともに規定する残基（アミノ酸、ヌクレオチドまたは両方の組み合わせによって寄与される）を同定し得る。
【０２７２】
さらに、本明細書中に記載される原子座標を使用することによって、当業者は、目的の任意の抗生物質の抗生物質結合部位を同定し得る。この情報はまた、抗生物質と、リボソームまたはリボソームサブユニットにおける残基との間の接触部位を提供し、これは、新規のタンパク質合成インヒビターまたは改変されたタンパク質合成インヒビターの設計に利益を与えるために使用され得る。種々の抗生物質のための結合部位または接触部位は、以下でより詳細に議論される。
【０２７３】
表１１は、アニソマイシン結合ポケットの少なくとも一部分をともに規定するＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットにおける残基を同定する。さらに、表１１は、アニソマイシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとＥ．ｃｏｌｉとの間で保存されないこと、アニソマイシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとラットとの間で保存されないこと、アニソマイシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間で保存されないこと、およびアニソマイシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、ユーバクテリアと真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔａ）との間で保存されないことを同定する。保存されない残基は、表５に関して以前に記載されたように同定した。
【０２７４】
【表１１】

【０２７５】
表１２は、ブラスチシジン結合ポケットの少なくとも一部分をともに規定するＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットにおける残基を同定する。表１２に示されるように、表５に関して以前に記載された比較方法を使用して決定されたように、ブラスチシジン結合ポケット部分のすべての残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとＥ．ｃｏｌｉとの間、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとラットとの間、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間、およびユーバクテリアと真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔａ）との間で保存される。
【０２７６】
【表１２】

【０２７７】
表１３は、カルボマイシン結合ポケットの少なくとも一部分をともに規定するＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットにおける残基を同定する。さらに、表１３は、カルボマイシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとＥ．ｃｏｌｉとの間で保存されないこと、カルボマイシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとラットとの間で保存されないこと、カルボマイシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間で保存されないこと、およびカルボマイシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、ユーバクテリアと真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔａ）との間で保存されないことを同定する。保存されない残基は、表５に関して以前に記載されたように同定した。
【０２７８】
【表１３】

【０２７９】
表１４は、チロシン結合ポケットの少なくとも一部分をともに規定するＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットにおける残基を同定する。さらに、表１４は、チロシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとＥ．ｃｏｌｉとの間で保存されないこと、チロシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとラットとの間で保存されないこと、チロシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間で保存されないこと、およびチロシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、ユーバクテリアと真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔａ）との間で保存されないことを同定する。保存されない残基は、表５に関して以前に記載されたように同定した。
【０２８０】
【表１４】

【０２８１】
表１５は、スパルソマイシン結合ポケットの少なくとも一部分をともに規定するＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットにおける残基を同定する。表１５に示されるように、表５に関して以前に記載された比較方法を使用して決定されたように、スパルソマイシン結合ポケット部分のすべての残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとＥ．ｃｏｌｉとの間、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとラットとの間、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間、およびユーバクテリアと真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔａ）との間で保存される。
【０２８２】
【表１５】

【０２８３】
表１６は、ヴァージニアマイシン結合ポケットの少なくとも一部分をともに規定するＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットにおける残基を同定する。表１６に示されるように、表５に関して以前に記載された比較方法を使用して決定されたように、ヴァージニアマイシン結合ポケット部分のすべての残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとＥ．ｃｏｌｉとの間、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとラットとの間、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間、およびユーバクテリアと真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔａ）との間で保存される。
【０２８４】
【表１６】

【０２８５】
表１７は、スピラマイシン結合ポケットの少なくとも一部分をともに規定するＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ ５０Ｓリボソームサブユニットにおける残基を同定する。さらに、表１７は、スピラマイシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとＥ．ｃｏｌｉとの間で保存されないこと、スピラマイシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉとラットとの間で保存されないこと、スピラマイシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間で保存されないこと、およびスピラマイシン結合ポケットの少なくとも一部分を規定する残基が、ユーバクテリアと真核生物（ｅｕｋａｒｙｏｔａ）との間で保存されないことを同定する。保存されない残基は、表５に関して以前に記載されたように同定した。
【０２８６】
【表１７】

【０２８７】
当業者は、上述の例示的な標的部位または他の例示的な標的部位を所有する場合、合理的な薬物設計のプロセスを使用して、１つ以上の標的部位に潜在的に結合する分子および／またはリボソーム活性を阻害する分子を同定し得る。さらに、標的部位を規定する残基が、病原体の間で保存されるが、宿主種の間で保存されないことを考慮することによって、当業者は、新規の種特異的タンパク質合成インヒビターを設計し得る。当業者が、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間で保存されない領域を利用して、合理的な薬物設計のための標的領域を提供し得ることが明らかである。例えば、図２９は、Ｅ．ｃｏｌｉとラットとの間で保存されるポリペプチド出口トンネルの特定の領域（赤色で示される）およびＥ．ｃｏｌｉとラットとの間で保存されないポリペプチド出口トンネルの領域（青色で示される）を示す。図２９（Ａ）および２９（Ｂ）は、ポリペプチド出口トンネルにそって半分に切断する場合の、大リボソームサブユニットの拡大図を提供する。図２９（Ｃ）は、大リボソームサブユニットに関連して、図２９（Ａ）における図に読み手を向かせるように提供される。図２９（Ｄ）は、大リボソームサブユニットに関連して、図２９（Ｂ）における図に読み手を向かせるように提供される。さらに、当業者は、抗生物質活性を予防または減少する（すなわち、抗生物質耐性に関与する）変異を有する場合、この情報を使用して、次いで基本として合理的な薬物設計を使用して、薬物耐性を克服する小分子を同定し得る、関連する抗生物質結合産物をモデリングし得る。種々のコンピュータモデリング手順（例えば、相同性モデリングプロトコル）が使用され、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸の部位特異的変異誘発を実行し、次いで適切なエネルギー最小化および精密化プロトコルを使用することによって、薬物耐性の標的部位のモデルを提供し得ることが意図される。
【０２８８】
（ｃ．候補分子の同定）
タンパク質生合成を阻害する候補分子は、デノボで全体的に設計され得るか、または予め存在するタンパク質生合成インヒビターに基づき得ることが、意図される。これらのアプローチのいずれかは、リボソームまたはリボソームサブユニット、より好ましくは大リボソームサブユニット、さらにより好ましくは５０Ｓリボソームサブユニットに、全体的にかまたは部分的に結合し得る、化学実体、薬剤、リガンド、または化合物についてのデータベースおよび低分子のライブラリーを計算によりスクリーニングすることにより容易になり得る。このスクリーニングにおいて、このような実体または化合物の、結合部位（単数または複数）にフィットする品質は、形状相補性または推定された相互作用エネルギーのいずれかにより判定され得る（Ｍｅｎｇら（１９９２）Ｊ．Ｃｏｍａ．Ｃｈｅｍ．１３：５０５−５２４）。
【０２８９】
本発明による、リボソームまたはリボソームサブユニットに結合するか、またはこれらの機能的活性を阻害する分子の設計は、一般に、２つの因子の考慮を包含する。第一に、この分子は、大リボソームサブユニットと物理的かつ構造的に会合し得なければならない。リボソームおよびリボソームサブユニットと分子との会合において重要な、非共有結合的な分子相互作用としては、水素結合相互作用、ファンデルワールス相互作用、および疎水性相互作用が挙げられる。第二に、この分子は、この分子がリボソームまたはリボソームサブユニット、より好ましくは大リボソームサブユニット、さらにより好ましくは５０Ｓリボソームサブユニットと会合することを可能にする立体配座を呈し得なければならない。この分子の特定の部分は、リボソームまたはリボソームサブユニットとのこの会合に直接関与しないかもしれないが、これらの部分は依然として、この分子の全体的な立体配座に影響を与え得る。このことは、次に、結合親和性、治療効力、薬物様品質、および能力に対して、有意な影響を有し得る。このような立体配座要件としては、リボソームもしくはリボソームサブユニットの活性部位または他の領域の全体もしくは一部に対する、化学的実体または分子の全体的な三次元構造および配向、あるいはリボソームもしくはリボソームサブユニット（より好ましくは、大リボソームサブユニット、およびなおより好ましくは、５０Ｓリボソームサブユニット）と直接相互作用するいくつかの化学的実体を含む分子の、官能基間の間隔が挙げられる。
【０２９０】
リボソームおよびリボソームサブユニットに対する、分子の潜在的な、予測された阻害効果または結合効果は、その分子の実際の合成、およびコンピュータモデル化技術の使用による試験の前に、分析され得る。所定の分子の理論的な構造が、この分子とリボソームまたはリボソームサブユニットとの間の不十分な相互作用および会合を示唆する場合には、この分子の合成および試験が取り除かれる。しかし、コンピュータモデル化が強い相互作用を示す場合には、この分子は、合成され得、そしてリボソームまたはリボソームサブユニットと相互作用し、そしてタンパク質合成を阻害する能力について、試験され得る。この様式で、非作動的な分子の合成が回避され得る。いくつかの場合において、モデル化において予測された不活性分子が合成され、次いで試験されて、リボソームまたはリボソームサブユニット（より好ましくは、大リボソームサブユニット、そしてなおより好ましくは、５０Ｓリボソームサブユニット）の特異的領域と相互作用する分子について、ＳＡＲ（構造−活性関係）を開発する。本明細書中において使用される場合に、用語「ＳＡＲ」は、化合物の活性／特定とその化学的構造との間の関係に直接関係する、構造−活性／構造特性関係を集合的に言及するべきである。
【０２９１】
（ｄ．デノボ設計）
当業者は、いくつかの方法のうちの１つを使用して、化学部分もしくは実体、化合物、または他の薬剤を、それらがリボソームまたはリボソームサブユニット内の予め選択された標的部位と会合する能力について、同定し得る。このプロセスは、例えば、５０Ｓリボソームサブユニットならびに／または他のアナログおよび抗生物質（登録番号ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ、１ＪＪ２、１ＦＦＺ、または１ＦＧ０でＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに登録され、そして／またはＤｉｓｋ Ｎｏ．３の１、３の２または３の３に含まれる表に列挙される）とのその複合体の原子座標に基づく、コンピュータスクリーン上の標的部位の目視検査またはコンピュータ補助モデル化により、開始し得る。１つの実施形態において、化合物設計は、異なる分子がリボソーム、リボソームサブユニット、またはそのフラグメントの種々の部位とどのように相互作用するかを計算するコンピュータモデル化プログラムを使用する。次いで、選択された化学的部分もしくは実体、化合物、または薬剤は、リボソームまたはリボソームサブユニット、より好ましくは大リボソームサブユニット、およびなおより好ましくは５０Ｓリボソームサブユニットの標的部位の少なくとも一部で、種々の配向に位置決定またはドッキングされ得る。化学構造のデータベースは、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ Ｄａｔａ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｕ．Ｋ．）およびＣｈｅｍｉｃａｌ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）から入手可能である。ドッキングは、ＱｕａｎｔａおよびＳｙｂｙｌのようなソフトウェアを使用し、引き続くエネルギー最小化および分子力学（ＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲのような標準的な分子力学力場を用いる）により、達成され得る。
【０２９２】
専門化されたコンピュータプログラムはまた、化学実体を選択するプロセスにおいて補助し得る。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（１）ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｐ．Ｊ．、「Ａ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃａｌｌｙ Ｆａｖｏｒａｂｌｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」（１９８５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８、８４９−８５７）。ＧＲＩＤ（種々の官能基の特徴を有するプローブと、高分子表面との間の可能な相互作用部位を決定するプログラム）のようなソフトウェアを使用して、類似の阻害タンパク質または分子の構造を決定するための表面部位を分析し得る。分子上の適切な阻害基（例えば、プロトン化された一級アミン）をプローブとして用いるＧＲＩＤ計算を使用して、適切なエネルギー輪郭レベルにおけるアクセス可能な位置の周囲の潜在的な熱点を同定する。ＧＲＩＤは、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫから入手可能である。
【０２９３】
（２）ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ、Ａ．およびＭ．Ｋａｒｐｌｕｓ（１９９１）「Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ Ｍａｐｓ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅｓ：Ａ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｐｙ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ Ｓｅａｒｃｈ Ｍｅｔｈｏｄ」、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１：２９−３４）。ＭＣＳＳは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから入手可能である。
【０２９４】
（３）ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．およびＡ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ（１９９０）「Ａｕｔｏｍａｔｅｄ Ｄｏｃｋｉｎｇ ｏｆ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ Ａｎｎｅａｌｉｎｇ」Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：１９５−２０２）。ＡＵＴＯＤＯＣＫは、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡから入手可能である。
【０２９５】
（４）ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｓ，Ｉ．Ｄ．ら（１９８２）「Ａ Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９−２８８）。プログラムＤＯＣＫを使用して、活性部位またはリガンド結合部位を分析し得、そして相補的な立体特性を有するリガンドを示唆し得る。ＤＯＣＫは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡから入手可能である。
【０２９６】
（５）ＡＬＡＤＤＩＮ（Ｖａｎ Ｄｒｉｅら（１９８９）「ＡＬＡＤＤＩＮ：Ａｎ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｔｏｏｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ Ｆｒｏｍ Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ，Ｓｔｅｒｉｃａｎｄ Ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ」Ｊ．Ｃｏｍｐ−ＡｉｄｅｄＭｏｌ．Ｄｅｓ．３：２２５）。
【０２９７】
（６）ＣＬＩＸ（ＤａｖｉｅおよびＬａｗｒｅｎｃｅ（１９９２）「ＣＬＩＸ：Ａ Ｓｅａｒｃｈ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ Ｆｕｎｄｉｎｇ Ｎｏｖｅｌ Ｌｉｇａｎｄｓ Ｃａｐａｂｌｅ ｏｆ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｋｎｏｗｎ Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ」Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １２：３１−４１）。
【０２９８】
（７）ＧＲＯＵＰＢＵＩＬＤ（ＲｏｔｓｔｅｉｎおよびＭｕｒｃｋｏ（１９９３）「ＧｒｏｕｐＢｕｉｌｄ：Ａ Ｆｒａｇｍｅｎｔ−Ｂａｓｅｄ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ３６：１７００）。
【０２９９】
（８）ＧＲＯＷ（ＭｏｏｎおよびＨｏｗｅ（１９９１）「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂｉｏａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：Ａ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｂａｓｅｄ Ｄｅ Ｎｏｖｏ ＬｉｇａｎｄＤｅｓｉｇｎ」Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １１：３１４）。
【０３００】
一旦、適切な化学的部分もしくは実体、化合物、または薬剤が選択されると、これらは単一の分子に構築され得る。構築の前に、この化学的部分もしくは実体、化合物、または薬剤の、三次元空間での互いに対する空間的関係の目視検査および／またはコンピュータモデル化およびコンピュータ分析を行い得る。次いで、これに続いて、ＱｕａｎｔａまたはＳｙｂｙｌのようなソフトウェアを用いるモデル構築がなされ得る。
【０３０１】
当業者が個々の化学的実体、化合物、または薬剤を接続する際に補助するために有用なプログラムとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（１）ＣＡＶＥＡＴ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｐ．Ａ．ら（１９８９）「ＣＡＶＥＡＴ：Ａ Ｐｒｏｇｒａｍ ｔｏ Ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ、Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｕｂ．、Ｒｏｙａｌ Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７８：８２−１９６）および（Ｂａｃｏｎら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５：８４９−８５８）。ＣＡＶＥＡＴは、既に活性部位に位置する任意数の化学フラグメントを接続するための「スペーサー」として作用し得る、環式化合物のデータベースを使用する。これは、当業者が迅速に、きつい結合のために必要であることが既知であるか、またはその疑いのあるフラグメントを接続するための、何百もの可能な方法を生成することを可能にする。ＣＡＶＥＡＴは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡから入手可能である。
【０３０２】
（２）ＭＡＣＣＳ−３Ｄのような３Ｄ Ｄａｔａｂａｓｅシステム（ＭＤＬ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ（ＣＡ））。この領域は、Ｍａｒｔｉｎ，Ｙ．Ｃ．、（１９９２）「３Ｄ Ｄａｔａｂａｓｅ Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：２１４５−２１５４に概説される。
【０３０３】
（３）ＨＯＯＫ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから入手可能）。
【０３０４】
上記のように一度の１つの化学的実体で段階ごとの様式で、目的の分子を構築することに先行する代わりに、目的の分子は、空の活性部位かまたは既知のインヒビター（単数または複数）のいくらかの部分（単数または複数）を必要に応じて含む部位のいずれかを使用して、全体として設計され得る。これらの方法を実行するソフトウェアとしては、以下が挙げられる：
（１）ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｈ．−Ｊ．（１９９２）「Ｔｈｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍ ＬＵＤＩ：Ａ Ｎｅｗ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅＤｅ Ｎｏｖｏ Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｎｈｉｈｉｔｏｒｓ」、Ｊ．ＣｏｍＲ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ ６：６１−７８）。プログラムＬＵＤＩは、水素結合および疎水性フラグメントの両方を配置するための相互作用部位の列挙を決定し得る。次いで、ＬＵＤＩは、約６００のリンカーのライブラリーを使用して、４つまでの異なる相互作用部位をフラグメントに接続する。次いで、小さい方の「架橋」基（例えば、−ＣＨ₂−および−ＣＯＯ−）を使用して、これらのフラグメントを接続する。例えば、酵素ＤＨＦＲについては、周知のインヒビターであるメトトレキサートでの主要な官能基の配置が、ＬＵＤＩにより再生された。ＲｏｔｓｔｅｉｎおよびＭｕｒｃｋｏ、（１９９２）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１７００−１７１０もまた参照のこと。ＬＵＤＩは、Ｂｉｏｓｙｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから入手可能である。
【０３０５】
（２）ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ，Ｙ．およびＡ．Ｉｔａｉ（１９９１）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ４７、８９８５）。ＬＥＧＥＮＤは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＭＡから入手可能である。
【０３０６】
（３）ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから入手可能）。
【０３０７】
（４）Ａｌａｄｄｉｎ（Ｄａｙｌｉｇｈｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡから入手可能）。
【０３０８】
他の分子モデル化技術もまた、本発明に従って使用され得る。例えば、Ｃｏｈｅｎ，Ｎ．Ｃ．ら（１９９０）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３：８８３−８９４を参照のこと。Ｎａｖｉａ，Ｍ．Ａ．およびＭ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ（１９９２）「Ｔｈｅ Ｕｓｅ ｏｆ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２：２０２−２１０；およびＪｏｒｇｅｎｓｅｎ（１９９８）「ＢＯＳＳ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｐ．Ｖ．Ｒ．Ｓｃｈｌｅｙｅｒ編）Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓｔｒａ．、Ａｔｈｅｎｓ、Ｕ．Ｓ．Ａ．５：３２８１−３２８５もまた参照のこと。
【０３０９】
モデル化の間に、目的の分子に、医薬品として投与されるべき分子のために有用であり得る化学的部分を導入することが可能であり得ることが、意図される。例えば、分子の標的領域に対する結合に直接影響を与えないかもしれないが、例えば、薬学的に受容可能なキャリアにおける分子の全体的な安定性、分子のバイオアベイラビリティおよび／または分子の毒性に寄与し得る、化学的部分を、目的の分子に導入するか、または目的の分子から省略することが、可能であり得る。目的の分子の薬理学を最適化するための考慮および方法は、例えば、「Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」第８版（Ｇｏｏｄｍａｎ Ｇｉｌｍａｎ、Ｒａｌｌ、Ｎｉｅｓ、およびＴａｙｌｏｒ（編））、Ｐｅｒｇａｍａｎ Ｐｒｅｓｓ（１９８５）；ＪｏｒｇｅｎｓｅｎおよびＤｕｆｆｙ（２０００）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０：１１５５−１１５８に見出され得る。
【０３１０】
さらに、コンピュータプログラム「Ｑｉｋ Ｐｒｏｐ」を使用して、目的の有機分子の物理的に有意な説明および薬学的に関連する特性の迅速な予測を提供し得る。「５の法則」確率スキームを使用して、新たに合成された化合物の経口的吸収を推定し得る（Ｌｉｐｉｎｓｋｉら（１９９７）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２３：３）。
【０３１１】
薬物団（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）の選択および設計のために適したプログラムとしては、以下が挙げられる：
（１）ＤＩＳＣＯ（Ａｂｂｏｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔ Ｐａｒｋ、Ｉｌｌ．）
（２）Ｃａｔａｌｙｓｔ（Ｂｉｏ−ＣＡＤ Ｃｏｒｐ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）
（３）Ｃｈｅｍ ＤＢＳ−３Ｄ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ Ｌｔｄ．Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）。
【０３１２】
さらに、当業者は、適切な治療的に活性な化合物および薬学的に有用な化合物をどのように設計するかに関する利用可能な情報を使用し得、そして本発明の新たなタンパク質合成インヒビターの設計において、この情報を使用し得る。例えば、Ｌｉｐｉｎｓｋｉら（１９９７）Ａｄ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖｉｅｗｓ ２３：３−２５；Ｖａｎ ｄｅ Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄら（１９９６）Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ １５：４８０−４９０：およびＣｒｕｃｉａｎｉら（２０００）、Ｔｈｅｏｃｈｅｍ−Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．５０３：１７−３０を参照のこと。
【０３１３】
リボソームのタンパク質およびＲＮＡ、またはリボソームサブユニットのタンパク質およびＲＮＡの座標を、上記コンピュータプログラムに入力することにより、その高分子の最も見込みのある構造（リボソーム、リボソームサブユニットまたはそのフラグメントの全体的な原子座標を含む）が計算される。これらの構造を組み合わせ、そしてこのようなプログラムを使用するさらなる計算により洗練して、リボソーム、リボソームサブユニットまたはそのフラグメントの、見込みのある三次元構造または実際の三次元構造（リガンドの潜在的または実際の活性部位または結合部位を含む）を決定し得る。
【０３１４】
（ｅ．既存の分子の改変）
目的の分子を完全にデノボで設計する代わりに、予め存在する分子またはそのタンパク質を、新たな候補の設計のための出発点として使用し得ることが、意図される。デノボで分子を設計するために有用なアプローチの多くがまた、既存の分子を改変するために有用であり得ることが、意図される。
【０３１５】
タンパク質生合成インヒビター（例えば、抗生物質）と、リボソーム内のそのそれぞれの結合部位との間の空間的関係の知識は、インヒビターが由来する分子に対してより良好な結合特性（例えば、より高い結合親和性および／または特異性）を有し得る改変されたインヒビターの設計を可能にすることが、意図される。あるいは、リボソーム内のインヒビター接触部位の知識は、例えば、その接触部位に結合する第一の分子の部分、およびさらなる官能性に寄与する別の部分を含む新たな分子の合成を可能にする。
【０３１６】
種々の改変された分子（例えば、改変された抗生物質）が、本明細書中に提供される原子座標を使用して設計され得ることが、意図される。例えば、１つ以上の抗生物質の、大リボソームサブユニットに対する空間的関係を知ることにより、新たな抗生物質に基づく分子を生成することが可能であることが意図される。各抗生物質の、大リボソームサブユニットに対する原子座標は、リボソームまたはリボソームサブユニットおよびその抗生物質のどの部分が互いに接触するかに関する情報を提供する。従って、この情報から、当業者は、上記のようなデノボ薬物設計のために使用され得るリボソーム内の接触位置を同定し得るのみでなく、リボソーム結合ドメインとして作用し得る抗生物質の部分をまた同定し得る。
【０３１７】
本明細書中に提供される情報に基づいて、当業者は、第一の抗生物質のリボソーム結合ドメインおよび第二の異なる抗生物質のリボソーム結合ドメインを含むハイブリッド抗生物質を、容易に同定および生成し得る。得られるハイブリッド抗生物質は、好ましくは、リボソームサブユニット内のそれぞれの接触位置の各々に、同時に結合する。本明細書中に提供される原子座標は、当業者がハイブリッドの合成においてテンプレートとして使用し得る候補抗生物質を同定することを可能にし、そしてまた、結合化学を生成するために必要な立体情報を提供し、その結果、各リボソーム結合ドメインが、それぞれの接触部位に対して適切に配向される。その結果として、当業者が、ハイブリッドを生成するために使用される個々のテンプレート抗生物質のいずれよりも高い親和性でリボソームまたはリボソームサブユニットと結合し、そして／またはより高いタンパク質合成阻害活性を有するハイブリッド抗生物質を生成し得ることが、意図される。あるいは、ハイブリッド抗生物質は、テンプレート抗生物質のいずれかに対して発達したかもしれない抵抗表現型を克服し得る。例えば、カルボマイシンの二糖類部分により占有される部位が、アニソマイシン（ａｎｉｓｏｍｙｃｉｎ）により満たされる部位に近いことは、カルボマイシンとアニソマイシンの両方の部分を含むハイブリッド化合物が、タンパク質合成の効果的なインヒビターであり得ることを示唆する。
【０３１８】
さらに、本明細書中に提供される原子座標は、当業者がリボソーム結合ドメインを同定すること、および他の型のタンパク質合成インヒビターを設計することに関する情報を使用することを可能にする。例えば、リボソーム接触領域および周囲の環境を理解して、当業者は、一部が抗生物質結合領域（結合ドメイン）に基づき、そして別の部分（エフェクタードメイン）がリボソームにおけるタンパク質生合成またはポリペプチド出口トンネルを通る分泌を立体的に阻害または破壊する新規な空間充填ドメインとして設計され得る、新規な分子を提供し得る。例えば、当業者は、抗生物質であるタイロシン（これは、ペプチジルトランスフェラーゼ部位に近いポリペプチド出口トンネルの片側に結合する）のリボソーム結合領域を、このポリペプチド出口トンネルをブロックするに十分に嵩高い新規化学的部分と結合させ得る。しかし、当業者が、本明細書中に開示される多数の抗生物質接触領域の１つ以上を利用して、新たな結合ドメインおよびエフェクタードメインを完全に設計し得ることが、意図される。
【０３１９】
さらに、本発明は、当業者が、分子（例えば、標的生物のリボソーム（例えば、微生物のような病原体）に対してより強力であり、そして非標的生物のリボソーム（例えば、ヒトのような宿主生物）に対しては強力ではない（すなわち、毒性が低い）よう作製される選択的タンパク質合成インヒビター）を設計することを可能にする。また、本発明は、当業者が、大リボソームサブユニットおよびそのタンパク質合成インヒビターとの複合体の原子座標および構造を使用して、標的リボソーム（例えば、細菌の５０Ｓリボソームサブユニット）にはよりきつく結合し、そして非標的リボソーム（例えば、ヒト６０Ｓリボソームサブユニット）にはあまりきつく結合しない、抗生物質のような出発化合物の改変を設計することを可能にする。
【０３２０】
大リボソームサブユニットと出発化合物（例えば、タイロシンまたは別のタンパク質合成インヒビター）との間の複合体の構造を使用して、また、その化合物の改変を、適用可能な工業的および他の用途（例えば、医薬品、除草剤または殺虫剤として）のための、他の所望の特性（例えば、化学的安定性、溶解度または膜透過性）を有する新たな化合物を生成するためにガイドし得る。
【０３２１】
種々の抗生物質は、大リボソームサブユニットを結合し、そしてタンパク質合成を破壊し、そして例えば以下が挙げられる抗生物質ファミリーのメンバーを含む：クロラムフェニコール、マクロライド、リンコサミド（ｌｉｎｃｏｓａｍｉｄｅ）、ストレプトグラミン（ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ）、アルシノマイシン（ａｌｔｈｉｎｏｍｙｃｉｎ）、オキサゾリノン、ヌクレオチドアナログ、チオストレプトン（ｔｈｉｏｓｔｒｅｐｔｏｎ）、ペプチド、グルタルイミド、およびトリコテセン（ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｅｎｅ）。
【０３２２】
クロラムフェニコールファミリーのメンバーとしては、例えば、クロラムフェニコールおよびヨードアムフェニコール（Ｉｏｄｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ）が挙げられる。マクロライドファミリーのメンバーとしては、例えば、ビアキシン（Ｂｉａｘｉｎ）（クラリスロマイシン）、ジスロマックス（Ｚｉｔｈｒｏｍａｘ）（アジスロマイシン）、ケテック（Ｋｅｔｅｋ）（テリスロマイシン（Ｔｅｌｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）；ケトリド（ｋｅｔｏｌｉｄｅ））、ＡＢＴ−７７３、タイロシン、スピラマイシンＩ、スピラマイシンＩＩ、スピラマイシンＩＩＩ、エリスロマイシンＡ、カルボマイシンＡ、テリスロマイシン（Ｔｅｌｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、メチマイシン（Ｍｅｔｈｙｍｙｃｉｎ）、ナルボマイシン（Ｎａｒｂｏｍｙｃｉｎ）、ランカマイシン、オレアンドマイシン、メガロマイシン（Ｍｅｇａｌｏｍｙｃｉｎ）、カルコマイシン（Ｃｈａｌｃｏｍｙｃｉｎ）、ニッダマイシン（Ｎｉｄｄａｍｙｃｉｎ）、ロイコマイシン（Ｌｅｕｃｏｍｙｃｉｎ）、アンゴラマイシン（Ａｎｇｏｌａｍｙｃｉｎ）、およびレロマイシンが挙げられる。リンコサミドファミリーのメンバーとしては、例えば、クリンダマイシンおよびリンコマイシンが挙げられる。ストレプトグラミンファミリーのメンバーとしては、例えば、ストレプトグラミンＡ、ストレプトグラミンＢ、オステオグリシン（Ｏｓｔｅｏｇｒｙｃｉｎ）Ｇ、シネルシド（Ｓｙｎｅｒｃｉｄ）、バージニアマイシン（Ｖｉｒｇｉｎａｍｙｃｉｎ）Ｓ１、バージニアマイシンＳ２、バージニアマイシンＳ３、バージニアマイシンＳ４、バージニアマイシンＢ、ベルナマイシンＣ（Ｖｅｒｎａｍｙｃｉｎ Ｃ）、パトリシンＡ、およびパトリシンＢが挙げられる。アルシノマイシンファミリーのメンバーとしては、例えば、アルシノマイシンが挙げられる。オキサゾリジンファミリーのメンバーとしては、例えば、リネゾリド（Ｌｉｎｅｚｏｌｉｄ）が挙げられる。ヌクレオチドアナログのファミリーのメンバーとしては、例えば、スパルソマイシン、プロマイシン、アニソマイシン、およびブラスチシジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）Ｓが挙げられる。チオストレプトンファミリーのメンバーとしては、例えば、チオストレプトン、シオマイシン（Ｓｉｏｍｙｃｉｎ）、スポランジオマイシン（Ｓｐｏｒａｎｇｉｏｍｙｃｉｎ）、およびチオペプチン（Ｔｈｉｏｐｅｐｔｉｎ）が挙げられる。ペプチドファミリーのメンバーとしては、例えば、バイオマイシン、カプレオマイシンＩＡ、カプレオマイシンＩＢ、カプレオマイシンＩＩＡ、およびカプレオマイシンＩＩＢが挙げられる。グルタルイミドファミリーのメンバーとしては、例えば、シクロヘキサイミド、ストレプトビタシン（Ｓｔｒｅｐｔｏｖｉｔａｃｉｎ）、ストレプトイミドン、イナクトン（Ｉｎａｃｔｏｎｅ）、アクチフェノール（Ａｃｔｉｐｈｅｎｏｌ）が挙げられる。トリコテセンファミリーのメンバーとしては、例えば、トリコデルミン（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｉｎ）、トリコデルモル（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｏｌ）、トリコデルモン（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍｏｎｅ）、ボミトキシン（Ｖｏｍｉｔｏｘｉｎ）、Ｔ−２毒素、トリコテシン（Ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｎ）、ニバレノール（Ｎｉｖａｌｅｎｏｌ）、およびベルカリン（Ｖｅｒｒｕｃａｒｉｎ）Ａが挙げられる。
【０３２３】
インヒビターは、実施例３に記載のように、大リボソームサブユニットの安定化された結晶に拡散または浸漬され、Ｘ線回折データを収集するための大リボソームサブユニットとの複合体を形成し得る。あるいは、インヒビターは、このインヒビターを大リボソームサブユニットと混合し、その後、高塩により沈殿させることによって、大リボソームサブユニットと共結晶化され得る。
【０３２４】
Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来のリボソームの構造で出発して、非標的生物由来のリボソーム（例えば、ヒト６０Ｓリボソームサブユニット）の構造を、相同性モデル化により（すなわち、目的の標的部位の残基の構造を非標的リボソームの同じ位置の残基と交換することにより）構築し得る。このことは、既知の構造のリボソームから側鎖を除去し、そしてこれらを、立体的にもっともらしい位置に挿入される未知の構造の側鎖と置換することにより、計算的になされる。この様式で、標的リボソームおよび非標的リボソームにおける標的部位の形状がどのように異なるかを理解し得る。従って、このプロセスは、標的リボソームにきつく特異的に結合するが同時に非標的リボソームに結合することは防止される分子を生成するために、標的部位を結合する分子がどのように化学的に変更され得るかに関する情報を提供する。同様に、溶媒に面する結合分子の部分の知識は、他の官能基をさらなる薬学的目的で導入することを可能にする。相同性構造モデル化のプロセスを使用して、また、変異リボソームが医薬品または農薬（例えば、除草剤もしくは殺虫剤）の効果に抵抗性となる機構を理解し得る。さらに、薬物抵抗性に参加するリボソームサブユニットの部分の知識を用いて、当業者は、薬物抵抗性の問題を克服する新たな分子を設計し得る。
【０３２５】
非標的リボソームより標的リボソームによりきつく結合する分子を設計するために、相同性構造モデル化を使用することは、広範にわたる適用可能性を有する。本明細書中に概説される方法を使用して、標的生物の大リボソームサブユニットを阻害し、一方で非標的生物（例えば、宿主）の５０Ｓまたは６０Ｓリボソームサブユニットを同程度には阻害しないかまたは全く阻害しない分子を設計することにより、任意の標的生物（例えば、病原体）を制御し得る。本発明の方法により同定または調製される分子を使用して、標的生物を制御し得、一方で非標的生物には有害な効果をほとんどまたは全く引き起こさない。従って、本発明の方法を使用して同定または開発される分子は、これらの投与が標的生物を殺傷するかまたは標的生物の生物学的機能のいくらかの局面を阻害し、一方で非標的生物に対しては類似の効果を有さないように、設計され得る。標的生物に対する薬剤の有害な効果としては、以下が挙げられ得るが、これらに限定されない：標的生物の死；成長速度の低下；１つの成長期から別の成長期への継代の遅延または排除（例えば、幼虫成長段階の延長）；再生の遅延または排除、交配の減少または防止、子の産生の減少または排除、標的生物の重量増加の制限または排除、供給能力および挙動の減少または排除；ならびに細胞機能、組織機能および／または器官機能の破壊。
【０３２６】
本発明により意図される新規な薬剤は、特定の生物を標的にする、除草剤、農薬（例えば、殺虫剤、殺線形動物剤、殺鼠薬など）、殺ダニ剤、または抗菌剤（例えば、抗真菌薬、抗細菌剤（ａｎｔｉｂａｃｔｅｒｉａｌ）、抗原生動物剤（ａｎｔｉｐｒｏｔｏｚｏａｌ）など）として有用であり得る。例えば、これらの新規な薬剤は、動物および植物に寄生する線虫、原核生物（疾患を引き起こす微生物）、ならびに真核多細胞有害生物を標的にし得る。多細胞有害生物の特定の例としては、昆虫、真菌、細菌、線形動物、ダニおよびマダニ、原生動物病原体、動物に寄生する肝臓吸虫などが挙げられるが、これらに限定されない。
リボソームとの相互作用によりタンパク質合成を阻害する、除草剤、農薬、殺ダニ剤、および抗菌剤は、当業者に公知である。いくつかの例が、以下で考察される。これらの公知の薬剤は、コンピューターモデリング技術、ならびにリボソームおよびリボソームサブユニットの構造の知識ならびにリボソーム／薬剤複合体およびリボソームサブユニット／薬剤複合体の構造の知識を使用することにより、新規な薬剤を得るために改変され得る。
【０３２７】
ケトライドＡＢＴ−７７３は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅにおいてエリスロマイシンよりも強くリボソームに結合し、そして細菌におけるマクロライド耐性を無効にし得る（Ｃａｐｏｂｉａｎｃｏら（２０００）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４４（６），１５６２−１５６７）。本発明のツールおよび方法論を使用して、非標的動物のリボソームおよびリボソームサブユニットに結合するよりも強く、標的細菌のリボソームまたはリボソームサブユニットに結合するエリスロマイシン誘導体を得ることができる。この標的細菌は、任意の感染性細菌、詳細にはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、そしてなおより詳細にはエリスロマイシン耐性Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅであり得る。非標的動物は、任意の動物、詳細には哺乳動物、そしてなおより詳細にはヒトであり得る。
【０３２８】
タンパク質合成のインヒビターである抗生物質の例としては、ピューロマイシン、シクロヘキシンイミド、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、およびストレプトマイシン（Ｈｅｌｄｔ（１９９６）Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２１ ２：４５８−４６４）が挙げられるが、これらに限定されない。ピューロマイシンは、（上記で議論したように）アミノアシル−ｔＲＮＡのアナログとしてＡ部位に結合し、そして発生期のペプチド鎖に付加され、リボソームとのその弱い会合が、原核生物および真核生物におけるさらなる伸長段階を妨げる。シクロヘキシイミドは、真核生物リボソームにおいてペプチジルトランスフェラーゼを阻害する。クロランフェニコールは、原核生物リボソームにおいてペプチジルトランスフェラーゼを阻害する。テトラサイクリンは、３０Ｓサブユニットに結合し、そしてアミノアシル−ｔＲＮＡの、真核生物リボソームへの結合よりもずっと多く原核生物リボソームへの結合を阻害する。ストレプトマイシンは、３０Ｓリボソームと相互作用し、その相互作用がｍＲＮＡ配列の不正確な認識を生じ、そしてそれにより原核生物リボソームにおける開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）を阻害する。米国特許第５，８０１，１５３号は、病原体に対する抗生物質を開示する。アミノグリコシドは、タンパク質合成を阻害すると思われる抗菌性抗生物質の例である。しかし、これらの抗生物質の内耳神経毒性特性および腎毒性（ｎｅｐｈｒｏｔｏｘｉｃ）特性のために、これらの使用には限界がある。硫酸アミカマイシン、硫酸フラマイセチン、硫酸ゲンタマイシン、硫酸カナマイシン、硫酸ネオマイシン、硫酸ネチルミシン、硫酸パロモマイシン、硫酸シソマイシン、トブラマイシン、塩酸バンコマイシン、および硫酸バイオマイシンは、アミノグリコシドファミリーのメンバーである。本発明のツールおよび方法論を使用して、非標的生物（例えば、ヒト）のタンパク質合成を阻害するよりも多くの程度まで標的生物のタンパク質合成を阻害するように選択された任意の抗生物質の誘導体を得ることができる。
【０３２９】
標的化生物および非標的化生物の例としては、表１８に提供される生物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３０】
【表１８】

【０３３１】
本発明のツールおよび方法論を使用して、Ｃｏｃｃｉｎｅｌｌｉｄａｅ科（例えば、テントウムシ）およびＡｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ科（ミツバチ）の甲虫のような非標的昆虫のタンパク質合成を阻害するよりも、オオタバコガの幼虫およびカのような標的昆虫のタンパク質合成のインヒビターを得ることができるということが意図される。他の可能な標的昆虫としては、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ目（甲虫）、Ｄｉｐｔｅｒａ目（ハエ、カ）、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ目（スズメバチ、アリ、ハバチ）、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ目（チョウおよびガ）、Ｍａｌｌｏｐｈａｇａ目（シラミ）、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ目（コナジラミ、アリマキ）、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ目（ナンキンムシ（ｂｕｇ））、Ｏｒｔｈｒｏｐｔｅｒａ目（バッタ、ゴキブリ）、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ目（アザミウマ）、Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ目（ハサミムシ）、Ｉｓｏｐｔｅｒａ目、Ａｎｏｐｌｕｒａ目、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ目およびＴｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ目（トビケラ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３２】
さらに、本発明のツールおよび方法論を使用して、標的植物のタンパク質合成のインヒビターが得られ得、これらのインヒビターは、非標的植物および動物のタンパク質合成を阻害するよりも、標的植物のタンパク質合成を阻害する。標的植物は、任意の所望されない植物種、詳細には雑草、およびなおより詳細には有害な雑草であり得る。特定の植物が、雑草とみなされるか否かは、その植物が生長する状況に依存する。例えば、Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ（ダイズ）畑で生長する所望されないＺｅａ ｍａｙｓ（トウモロコシ）植物は、所望されない雑草とみなされる。標的植物であるような雑草の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ａｌｌｉｕｍ ｖｉｎｅｄｅ（野生ニンニク）、Ｂｒｏｍｕｓ ｔｅｃｔｏｒｕｍ（スズメノチャヒキ属（ｄｏｗｎｙ ｂｒｏｍｅ））、Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ｃｙｌｉｎｄｒｉｃｕｍ（キシュウスズメノヒエ（ｊｏｉｎｔｅｄ ｇｏａｔｇｒａｓｓ）、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓ種（ヒユ・アカザ類の雑草）、Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ ａｌｂｕｍ（シロアカザ）、Ａｖｅｎａ ｆａｔｕａ（カラスムギ）、Ｂ．ｓｅａｌｉｎｕｓ（カラスノチャヒキ）、Ｅｃｈｉｎｏｃｈｌｏａ ｃｒｕｓ−ｇａｌｌｉ（イヌビエ）、Ａｌｏｐｅｃｕｒｕｓ ｍｙｏｓｕｒｏｉｄｅｓ（ｂｌａｃｋｇｒａｓｓ）、Ｓｔａｒｉａ ｆａｂｅｒｉｉ（オオムギ（ｇｉａｎｔ ｆｏｘｔａｉｌ））、Ｘａｎｔｈｉｕｍ ｓｔｒｕｍａｒｉｕｍ（一般的なオナモミ）、Ａｍｂｒｏｓｉａ ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ（一般的なブタクサ）、およびＩｐｏｍｏｅａ種（アサガオ）。非標的生物は、任意の植物、特に任意の所望の植物、そしてなおさらに特に任意の農作物植物であり得る。非標的生物体はまた、任意の動物、特に哺乳動物、そしてなおさらに特にヒトであり得る。１つの好ましい実施形態において、本発明のツールおよび方法論は、１つ以上の有害な雑草種を殺傷するかまたは傷つけるが、非標的植物および動物を害しない、タンパク質合成インヒビターを産生するために使用され得る。
【０３３３】
目的の標的細菌としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉｄｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｂｏｖｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉｄｅ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｃｏｌｉ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｍａｌｌｅｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｓｅｕｄｏｍａｌｌｅｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｆｅｔｕｓ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｎｕｃｌｅａｔｕｍ、Ｃａｌｙｍｍａｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｍａｔｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｅｐｒａｅ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐｅｒｔｅｎｕｅ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｒｅｃｕｒｒｅｎｔｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｉｓｒｅａｌｌｉ、Ｎｏｃａｒｄｉａ ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｓｉｔｔａｃｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｍｏｎｉａｅ、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ ｃａｒｉｎｉｉ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ ｓｃｈｅｎｃｋｉｉ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ。
【０３３４】
一旦候補分子が、上記の方法により設計されるかまたは選択されると、分子がリボソームまたはリボソームサブユニットに結合し得る親和性が、コンピューターを用いる評価および／または化合物を合成した後の生物学的活性の試験により、試験および最適化され得る。候補化合物は、各々が類似した全体の結合エネルギーを有する１つより多くの立体配座で、リボソームまたはリボソームサブユニットと相互作用し得る。これらの場合、結合の変形エネルギーは、遊離の分子のエネルギーと、この分子がリボソームまたはリボソームサブユニット（より好ましくは大リボソームサブユニット、そしてなおより好ましくは５０Ｓリボソームサブユニット）に結合した場合に観察される立体配座の平均エネルギーとの間の差異とみなされ得る。
【０３３５】
リボソームまたはリボソームサブユニットに結合するように設計されるかまたは選択された分子は、その結合状態においてこの分子が、標的領域との反発静電相互作用がないように、さらにコンピューターを用いて最適化され得る。このよな非相補的（例えば、静電的）相互作用は、反発的電荷−電荷相互作用、双極子−双極子相互作用および電荷−双極子相互作用を含む。詳細には、インヒビターがリボソームまたはリボソームサブユニットに結合した場合の、インヒビターと酵素の間の全ての静電相互作用の合計は、好ましくは、結合エンタルピーに対して中性または有利に寄与する。弱く結合する化合物はまた、ＳＡＲを決定するように、これらの方法により設計され得る。
【０３３６】
化合物の変形エネルギーおよび静電相互作用を評価し得る特定のコンピュータープログラムは、当該分野で入手可能である。適切なプログラムとしては、以下が挙げられる：Ｇａｕｓｓｉａｎ ９２，改訂版Ｃ（Ｍ．Ｊ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｇａｕｓｓｉａｎ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ．）；ＡＭＢＥＲ，バージョン４．０（Ｐ．Ａ．Ｋｏｌｌｍａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ ａｔ ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）；およびＩｎｓｉｇｈｔ ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｂｉｏｓｙｓｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）。これらのプログラムは、例えば、Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｇｒａｐｈｉｃｓ ワークステーション，ＩＲＩＳ ４Ｄ／３５またはＩＢＭ ＲＩＳＣ／６０００ワークステーションモデル５５０を使用して、実行され得る。他のハードウェアシステムおよびソフトウェアパッケージが、当業者に公知である。
【０３３７】
一旦目的の分子が、上記のように選択または設計されると、その分子の結合特性を改善または改変するために、その分子の原子または側基のいくつかにおいて、置換がなされ得る。一般的に、最初の置換は保存的である。すなわち、置換される基は、元々の基と、ほぼ同じサイズ、形状、疎水性および電荷である。当然のことながら、公知の構成要素の立体配座を変更することは、避けられるべきであるということが、理解される。次いで、このような置換された化学化合物は、上記で詳細に記載された同じコンピューターの方法により、リボソームまたはリボソームサブユニットへの適合性について分析され得る。
【０３３８】
さらに、実際のリボソーム関連リガンド、複合体または模倣体（ｍｉｍｅｔｉｃ）が、結晶化され得、そしてＸ線回折を用いて分析され得る。回折パターン相関は、リガンドと、リボソーム、リボソームサブユニット、または模倣体との三次元相互作用を計算するために同様に使用される。この計算は、リボソームまたはリボソームサブユニット上の特定の部位、または模倣体が、リボソーム、リボソームサブユニットまたはそのフラグメントと同じ三次元構造を有する部位に、このリガンドが結合するということ、あるいはこれらの部位の立体配座を変化するということを確認するために、行われる。
【０３３９】
（３．リード化合物の合成）
本発明のリード化合物は、脂質、核酸、ペプチド、低有機分子もしくは低無機分子、化学物質、元素、糖質、同位体、炭水化物、画像化剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、分析プローブ、および抗体もしくはそのフラグメント、上記のいずれかの任意の組み合わせ、ならびに上記のいずれかの任意の化学的変形または改変体から選択される少なくとも１つであり得るが、これに限定されない。さらに、リード化合物は、必要に応じて検出可能な標識を含み得る。このような標識としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：酵素的標識、放射性同位体または放射性化合物もしくは放射性元素、蛍光性化合物もしくは蛍光性金属、化学発光化合物および生物発光化合物。周知の方法が、このような検出可能な標識をリード化合物に結合するために使用され得る。
【０３４０】
リード化合物（例えば、脂質、脂質、核酸、ペプチド、低有機分子もしくは低無機分子、化学物質、元素、糖質、同位体、炭水化物、画像化剤、リポタンパク質、糖タンパク質、酵素、分析プローブ、および抗体もしくは抗体フラグメント）を合成するために有用な方法は、当該分野で周知である。このような方法は、このようなリード化合物の１つの合成の伝統的なアプローチ（例えば、１度に単一の明確なペプチド、ならびに１つ以上の容器で複数のリード化合物の組み合わせた合成）を含む。このような複数のリード化合物は、前もって同定されたリード分子の１つ以上の改変体を含み得る。複数のリード分子の組合せた合成のための方法は、コンビナトリアルライブラリーを調製する際に特に有用である。このコンビナトリアルライブラリーは、当該分野で公知のスクリーニング技術において使用され得る。
【０３４１】
例として、複数のペプチドおよびオリゴヌクレオチドが、同時に合成され得るということが周知である。５０アミノ酸長までの小さいペプチドであるリード分子は、標準的な固相ペプチド合成手順（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９に記載される手順と同様の手順）を使用して合成され得る。例えば、合成の間、保護された側鎖を有するＮ−α−保護アミノ酸を、不溶性ポリマー支持体（例えば、ポリスチレンビーズ）に、Ｃ末端により連結された伸長するポリぺプチド鎖に段階的に付加する。Ｎ−α−脱保護アミノ酸のアミノ基を、Ｎ−α−保護アミノ酸のα−カルボキシ基に連結することにより、ペプチドを合成し、このカルボキシ末端は、ジシクロヘキシルカルボジイミドのような試薬と反応させることにより活性化されている。遊離アミノ基の、活性化カルボキシルへの連結によりペプチド結合が形成される。最も一般的に使用されるＮ−α−保護基としては、酸に不安定であるＢｏｃおよび塩基に不安定であるＦｍｏｃが挙げられる。
【０３４２】
簡単には、Ｃ末端Ｎ−α−保護アミノ酸を、最初にポリスチレンビーズに連結する。次いで、Ｎ−α−保護基を、除去する。この脱保護されたα−アミノ基を、次のＮ−α−保護アミノ酸の活性化α−カルボキシレート基にカップリングする。このプロセスを、所望のペプチドが合成されるまで繰り返す。生じたペプチドを、不溶性ポリマー支持体から切断し、そしてアミノ酸側鎖を脱保護する。より長いペプチドは、例えば約５０アミノ酸長より大きく、代表的には保護されたペプチドフラグメントの縮合により誘導される。適切な化学、樹脂、保護基、保護されたアミノ酸および試薬の詳細は、当該分野で周知であるので、本明細書中において詳細に考察されない。例えば、Ａｔｈｅｒｔｏｎら、（１９６３）Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、およびＢｏｄａｎｓｚｋｙ（１９９３）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ，第２版、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ならびにＦｉｅｌｄｓら、（１９９０）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５：１６１−２１４を参照のこと。
【０３４３】
生じたペプチドの精製を、分取ＨＰＬＣ（例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィーおよび／またはイオン交換クロマトグラフィー）のような従来の手順を使用して、達成した。適切なマトリックスおよび緩衝液の選択は、当該分野で周知であるので、本明細書中において詳細には記載しない。
【０３４４】
本発明に従った合成ペプチドが、天然に存在するアミノ酸、非天然のアミノ酸、および／または特定の特徴を有するアミノ酸（例えば、正に荷電したか、負に荷電したか、疎水性か、親水性か、または芳香族のアミノ酸）を含み得る。本明細書中で使用される場合、用語「天然に存在するアミノ酸」とは、通常タンパク質中に見出されるアミノ酸のＬ−異性体をいう。主な天然に存在するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、アルギニン、およびリシンである。特に示されない限り、全てのアミノ酸は、本出願においてＬ−形態である。さらに、本明細書中で使用される場合、用語「非天然のアミノ酸」とは、タンパク質中に天然に見出されないアミノ酸をいう。例えば、セレノメチオニン。
【０３４５】
「正に荷電した」アミノ酸は、通常の生理学的条件下で正に荷電した側鎖を有する任意のアミノ酸を含む。正に荷電した天然に存在するアミノ酸の例としては、例えば、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられる。逆に、「負に荷電した」アミノ酸は、通常の生理学的条件下で負に荷電した側鎖を有する任意のアミノ酸を含む。負に荷電した天然に存在するアミノ酸の例としては、例えば、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【０３４６】
本明細書中で使用される場合、用語「疎水性アミノ酸」は、荷電していない、非極性側鎖を有する、水に比較的不溶の任意のアミノ酸を含む。天然に存在する疎水性のアミノ酸としては、例えば、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。さらに、本明細書中で使用される場合、用語「親水性アミノ酸」とは、荷電していない極性の側鎖を有する、水に比較的可溶な任意のアミノ酸をいう。天然に存在する親水性アミノ酸としては、例えば、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミンおよびシステインが挙げられる。
【０３４７】
最後に、本明細書中で使用される場合、用語「芳香族」とは、側鎖が非局在化共役系を有するアミノ酸残基をいう。芳香族残基の例としては、例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。
【０３４８】
本発明においてリガンドとして作用する非ペプチド低有機分子の生成に関して、これらの分子は、周知でありかつ特許および他の文献において完全に示される標準的な有機化学を使用して合成され得る。
【０３４９】
本発明のリードを合成する際に有用な多くの公知の方法は、自動化され得るか、またはそうでなければ商業的規模で実施され得る。このように、一旦リード化合物が、商業的将来性を有すると同定されれば、大量のこの化合物が、容易に生産され得る。
【０３５０】
（４．分子の特徴付け）
上記の方法により設計され、選択され、そして／または最適化された分子は、一旦生成されると、当業者に公知の種々のアッセイを使用して、この化合物が生物学的活性を有するか否かを決定するために特徴付けされ得る。例えば、これらの分子は、従来のアッセイ（以下の記載されるアッセイを含むがこれらに限定されない）により、これらが推定される活性、結合活性、および／または結合特異性を有するか否かを決定するために特徴付けされ得る。
【０３５１】
さらに、ハイスループットスクリーニングを使用して、このようなアッセイを使用する分析をスピードアップし得る。結果として、本発明のツールおよび方法を使用して、新しい分子のリボソームまたはリボソームサブユニットと相互作用する能力について、新しい分子を迅速にスクリーニングすることが可能であり得る。ハイスループットスクリーニングを実行するための一般的な方法論は、例えば、Ｄｅｌｖｉｎ，（１９９８），Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ；および米国特許第５，７６３，２６３号に記載される。ハイスループットアッセイは、１つ以上の異なるアッセイ技術（以下に記載されるアッセイ技術を含むがこれらに限定されない）を使用し得る。
【０３５２】
（１）表面結合研究。種々の結合アッセイは、結合活性について新しい分子をスクリーニングする際に有用であり得る。１つのアプローチとしては、表面プラズモン共鳴（ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）（ＳＰＲ）が挙げられ、これは、リボソーム、リボソームサブユニットまたはそれらのフラグメントに対する目的の分子の結合特性を評価するために使用され得る。
【０３５３】
ＳＰＲ方法論は、量子力学的表面プラズモンの生成により、実時間で２つ以上の高分子の間の相互作用を測定する。１つのデバイス（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗｙ，Ｎ．ＪからのＢ１Ａｃｏｒｅ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ ＲＴＭ）は、多色光の集束ビームを、金フィルム（使い捨てバイオセンサー「チップ」として提供される）とバッファー区画（使用者により調整され得る）との間のインターフェースに提供する。カルボキシル化デキストランからなる１００ｎｍの厚さの「ヒドロゲル」は、目的の被分析物の共結合性固定化のためのマトリックスを提供し、これが、金フィルムに装着される。集束光が金フィルムの自由電子雲と相互作用する場合、プラズモン共鳴が増強される。生じた反射光は、最適に共鳴した波長においてスペクトル的に減少される。反射多色光を（プリズムの手段により）その成分に分離し、減少した周波数を決定することにより、ＢＩＡｃｏｒｅは、発生した表面プラズモン共鳴の挙動を正確に提示する光学インターフェースを確立する。上記のように設計される場合、プラズモン共鳴（および減少スペクトル）は、エバネッセント場における質量（ｍａｓｓ）（これは、ヒドロゲルの厚さにおおよそ対応する）に敏感である。相互作用対の一方の構成要素が、ヒドロゲルに固定化される場合、および相互作用パートナーがバッファー区画を介して提供される場合、２つの構成要素の間の相互作用は、エバネッセント場における質量の蓄積、および減少スペクトルにより測定されるようなプラズモン共鳴の対応する効果に基づいて、実時間で測定され得る。この系により、いずれの構成要素も標識する必要なく、分子相互作用の迅速で感度の高い実時間測定が可能である。
【０３５４】
（（２）免疫診断およびイムノアッセイ） 複合混合物（例えば、生物学的流体）中で通常は低濃度である特定の生化学的物質の測定に使用され得る一群の技術が存在し、これは、その補完的抗原に対して適切に調製および選択された抗体によって示される特異性および高親和性に依存する。測定される物質は、必然的に、抗原性（免疫原性高分子またはハプテン性低分子のいずれか）でなければならない。各サンプルに対して、既知の制限された量の特異的抗体が添加され、そしてその抗体と結合する抗原の画分（しばしば、結合：遊離比として表される）を、放射性同位体（ラジオイムノアッセイ）、蛍光分子（蛍光イムノアッセイ）、安定なフリーラジカル（スピンイムノアッセイ（ｓｐｉｎ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、酵素（酵素免疫法）、または他の容易に識別可能な標識で標識された抗原の形態を指示薬として使用して推定する。
【０３５５】
抗体を、以下を含む種々の様式で標識し得る：酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）；ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）；蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）；化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）；および金コロイド粒子での抗体の標識（免疫金）。
【０３５６】
一般的なアッセイ様式としては、以下が挙げられる：サンドイッチアッセイ、競合アッセイまたは非競合アッセイ、ラテックス凝集アッセイ、均一系アッセイ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｎｏｕｓ ａｓｓａｙ）、マイクロタイタープレート様式および微小粒子に基づくアッセイ。
【０３５７】
（（３）酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）） ＥＬＩＳＡは、放射化学薬品の危険および蛍光検出システムの費用を回避する免疫化学技術である。代わりに、このアッセイは、指示薬として酵素を使用する。ＥＬＩＳＡは、不溶性キャリア表面に結合した抗体（または、抗原）の使用に基づいた定量的イムノアッセイの形態であり、この表面が、次いで、試験溶液中の関連の抗原（または、抗体）を「捕捉」するために使用される。次いで、抗原−抗体複合体を、抗原（または、抗体）に予め共有結合されていた適切な酵素の活性を測定することによって検出する。
【０３５８】
ＥＬＩＳＡを実施するための一般的な方法および組成物は、例えば、Ｃｒｏｗｔｈｅｒ（１９９５）ＥＬＩＳＡ−Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ；ＣｈａｌｌａｃｏｍｂｅおよびＫｅｍｅｎｙ（１９９８）ＥＬＩＳＡ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ−Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｓｐｅｃｔｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ；Ｋｅｍｅｎｙ（１９９１）Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ＥＬＩＳＡ、Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ；Ｉｓｈｉｋａｗａ（１９９１）Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｅｌｓｅｖｉｅｒに記載される。
【０３５９】
（（４）比色定量アッセイ） 比色定量は、任意の定量的化学分析の方法であり、ここでは、化合物の濃度または量を、その化合物の標準および試験量の両方との試薬の反応によって生成される呈色を比較すること（しばしば、比色計を使用する）によって、決定する。比色計は、視覚的または光電的のいずれかで、呈色強度または呈色強度における差異を測定するためのデバイスである。
【０３６０】
β−ガラクトシダーゼ酵素活性の標準的な比色定量アッセイは、当業者に周知である（例えば、Ｎｏｒｔｏｎら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．５：２８１−２９０を参照のこと）。比色定量アッセイは、標準的比色定量β−ガラクトシダーゼアッセイでは、基質としてＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ、Ｓｉｇｍａ）を使用して、細胞全体の溶解産物において実施され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。自動化された比色定量アッセイもまた、米国特許第５，７３３，７２０号に記載のように、β−ガラクトシダーゼ活性の検出のために利用可能である。
【０３６１】
（（５）免疫蛍光アッセイ） 免疫蛍光検査または免疫蛍光顕微鏡検査は、抗原または抗体を、蛍光色素への結合体化によって蛍光性にし、次いで、組織切片または塗抹標本中の補完的抗体または抗原と反応させる技術である。次いで、その抗原または抗体の位置を、紫外光の下で顕微鏡法によって蛍光を観察することによって決定し得る。
【０３６２】
免疫蛍光技術の一般的説明は、例えば、以下において見られる：Ｋｎａｐｐら（１９７８）Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ＲｅｌａｔｅｄＳｔａｉｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ａｌｌａｎ（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ−Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｈｅ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ Ｓｅｒｉｅｓ）Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｃａｕｌ（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ。本発明に適用可能な免疫蛍光技術の詳細な説明については、例えば、米国特許第５，９１２，１７６号；同第５，８６９，２６４号；同第５，８６６，３１９号；および同第５，８６１，２５９号を参照のこと。
【０３６３】
（（６）蛍光偏光） 蛍光偏光（ＦＰ）は、２つの分子間の会合反応のＩＣ₅₀およびＫｄを導き出すために、タンパク質−タンパク質相互作用およびタンパク質−リガンド相互作用に容易に適用され得る測定技術である。この技術において、目的の分子の１つは、発蛍光団に結合体化される。これは、一般的に、この系においてより小さい方の分子である（この場合、目的の分子）。リガンド−プローブ結合体およびリボソーム、そのリボソームサブユニットまたはフラグメントの両方を含むサンプル混合物を、垂直方向の偏光で励起する。光は、プローブ発蛍光団によって吸収され、そして短時間の後に再放射される。この放射された光の偏光の程度を測定する。この放射された光の偏光は、いくつかの因子に依存するが、最も重要には、溶液の粘度および発蛍光団の見かけの分子量に依存する。適切なコントロールでは、放射された光の偏光の程度における変化は、発蛍光団の見かけの分子量における変化にのみ依存し、これは次に、プローブ−リガンド結合体が、溶液中で遊離であるのか、またはレセプターに結合されているのかに依存する。ＦＰに基づいた結合アッセイは、多くの重要な利点を有し、これには、真の均一な平衡条件下でのＩＣ₅₀およびＫｄの測定、分析の速度および自動化へのアメニティー（ａｍｅｎｉｔｙ）、ならびに濁った懸濁液および着色溶液においてスクリーニングする能力が挙げられる。
【０３６４】
（（７）タンパク質合成） 前述の生化学的アッセイによる特徴付けに加えて、目的の分子をまた、リボソームまたはリボソームサブユニットの機能的活性の調節因子（例えば、タンパク質合成の誘発物質、またはタンパク質合成のインヒビター）として特徴付け得ることが意図される。
【０３６５】
タンパク質合成のインヒビターは、細胞レベルでアッセイされ得る。例えば、目的の分子を、生物体（例えば、微生物）に対する阻害性作用について、その目的の分子を含むかまたは欠いているかのいずれかの培地において、目的の微生物を増殖させることによってアッセイし得る。増殖阻害は、その分子が、タンパク質合成のインヒビターとして作用し得ることを示し得る。
【０３６６】
さらに、より特異的なタンパク質合成インヒビターアッセイは、化合物を、生物体全体、組織、器官、オルガネラ、細胞、細胞抽出物もしくは亜細胞抽出物、または精製されたリボソーム調製物に投与すること、そして例えば、タンパク質合成の阻害についてのその阻害定数（ＩＣ₅₀）を決定することにより、その薬理学的特性および阻害特性を観察することによって、実施され得る。³Ｈロイシンもしくは³⁵Ｓメチオニンの取り込み、または類似の実験を実施して、タンパク質合成活性を調査し得る。
【０３６７】
目的の分子の存在下での細胞におけるタンパク質合成の量または速度における変化は、その分子が、タンパク質合成の誘発物質であることを示す。タンパク質合成の速度または量における減少は、その分子が、タンパク質合成のインヒビターであることを示す。
【０３６８】
（Ｈ．薬物処方および投与）
一旦同定されると、本発明の活性分子は、使用前に、任意の適切なキャリアに組み込まれ得ることが意図される。より詳細には、活性分子の用量、投与の様式、および適切なキャリアの使用は、目的の標的および非標的生物体に依存する。
【０３６９】
哺乳動物レシピエントに関しては、目的の化合物を、当該分野において公知であり、そして／または使用されている、任意の従来的なアプローチによって投与し得ることが意図される。従って、適切なように、投与は、経口的または非経口的（静脈内投与経路および腹腔内投与経路を含む）であり得る。さらに、投与は、周期的なボーラス注射によってであり得るか、または外部のリザーバー（例えば、静脈内バッグ）からの静脈内投与または腹腔内投与によって、より連続的になされ得る。特定の実施形態では、本発明の化合物は、治療的グレードであり得る。すなわち、特定の実施形態は、ヒトへの投与のために必要とされる純度および品質の規制の基準を満たす。獣医学的適用もまた、本明細書中で使用されるような意図される目的の範囲内である。
【０３７０】
獣医学的な医学的用途およびヒトでの医学的用途の両方について、本発明に従う薬物の処方物は、代表的に、従って薬学的に受容可能なキャリア、および必要に応じて、他の治療的成分（１つまたは複数）と合わせて、このような薬物を含む。キャリア（１つまたは複数）は、処方物の他の成分と適合性であり、そしてそのレシピエントに対して有害でないという意味で、「受容可能」であるべきである。これに関して、薬学的に受容可能なキャリアは、薬学的投与に適合性である、任意そしてすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な物質に対するこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において公知である。いかなる従来の媒体または薬剤も、活性化合物と不適合性である範囲を除いて、組成物におけるその使用が意図される。補充的な活性化合物（本発明に従って同定もしくは設計されるか、および／または当該分野において公知である）もまた、組成物に組み込まれ得る。処方物は、都合よく、投薬単位形態で提示され得、そして薬学／微生物学の分野において周知の任意の方法によって調製され得る。一般的には、薬物を、液状キャリアもしくは微細に分割した固体キャリア、または両方と合わせ、次いで、必要に応じて、その生成物を所望の処方物に成形することによって、いくつかの処方物を調製する。
【０３７１】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように処方されるべきである。投与経路の例としては、経口投与または非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、吸入投与、経皮投与（局所的）、経粘膜投与および直腸投与）が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注射水、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒）；抗菌剤（例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝液（例えば、アセテート、シトレート、またはホスフェート）、および張度の調整のための薬剤（例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロース）。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基で調整され得る。
【０３７２】
経口投与または非経口投与のために有用な溶液は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．編）、Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．（１９９０）に記載される、薬学分野で周知の任意の方法によって調製され得る。非経口投与のための処方物はまた、口腔内投与のためにグリココール酸、直腸投与のためにメトキシサリチル酸、または膣内投与のためにクエン酸（ｃｕｔｒｉｃ ａｃｉｄ）を含み得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルのシリンジ、または複数回用量のバイアルに封入され得る。直腸投与のための坐剤はまた、ココアバター、他のグリセリド、または室温で固体であり、そして体温で液体である他の組成物のような非刺激性賦形剤と薬物とを混合することによって、調製され得る。処方物はまた、例えば、ポリアルキレングリコール（例えば、ポリエチレングリコール）、植物起源の油、水素化ナフタレンなどを含み得る。直接の投与のための処方物は、グリセロールおよび高粘度の他の組成物を含み得る。これらの薬物のための他の潜在的に有用な非経口キャリアとしては、エチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透圧ポンプ、移植可能な注入系、およびリポソームが挙げられる。吸入投与のための処方物は、賦形剤として、例えば、ラクトースを含み得るか、あるいは例えば、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、グリココール酸およびデオキシコール酸を含む水溶液であり得るか、もしくは点鼻薬の形態での投与のための油性溶液であり得るか、または鼻腔内適用されるゲルとしてであり得る。保持浣腸（ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｅｎｅｍａ）もまた、直腸送達のために使用され得る。
【０３７３】
経口投与のために適切な本発明の処方物は、個別単位の形態（例えば、カプセル、ゼラチンカプセル、小袋（ｓａｃｈｅｔ）、錠剤、トローチ、またはロゼンジ）であり得、各々が、粉末もしくは顆粒の形態；水溶液もしくは非水性液体における溶液もしくは懸濁液の形態；または、水中油エマルジョンもしくは油中水エマルジョンの形態で、予め決められた量の薬物を含む。薬物はまた、ボーラス、舐剤、またはペーストの形態で投与され得る。錠剤は、必要に応じて１以上の付属成分を有する薬物を圧縮または成形することによって作製され得る。圧縮剤は、必要に応じて、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤または分散剤により混合された、自由流動形態（例えば、粉末または顆粒）の薬物を、適切な機械において圧縮することによって調製され得る。成形剤は、粉末化薬物および不活性液状希釈剤で湿らせた適切なキャリアの混合物を、適切な機械において成形することによって作製され得る。
【０３７４】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または可食性キャリアを含む。経口治療的投与のために、活性化合物は、賦形剤に組み込まれ得る。うがい薬としての使用のために液状キャリアを使用して調製された経口組成物は、液状キャリア中の化合物を含み、そして経口的に適用され、そして水音をたてられ、そして喀出または嚥下される。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント物質を、組成物の部分として含み得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、任意の以下の成分、または類似の性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、トラガカントガム、またはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）；崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンスターチ）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、ショ糖またはサッカリン）；または、香料剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料）。
【０３７５】
注射可能な用途に適切な薬学的組成物としては、滅菌水溶液（ここでは、水溶性）または分散剤、および滅菌注射可能溶液もしくは分散剤の即時調製物のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与のために、適切なキャリアとしては、生理学的食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は無菌性であるべきであり、そして容易な注入可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流体であるべきである。それは、製造および貯蔵の条件下で安定であるべきであり、そして微生物（例えば、細菌および真菌）の汚染作用に対して保護されるべきである。キャリアは、溶媒または分散媒であり得、これは、例えば、水、エタノール、ポリオル（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物を含む。適切な流動度は、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散剤の場合には、必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持され得る。微生物の作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど）によって、達成され得る。多くの場合において、組成物中に等張剤（例えば、糖、多価アルコール（例えば、マンニトール（ｍａｎｉｔｏｌ））、ソルビトール、塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を、組成物中に含ませることによってもたらされ得る。
【０３７６】
滅菌注射可能溶液は、上記に列挙された成分の１つまたは組合せを有する適切な溶媒中に、必要とされる量の活性化合物を組み込むこと、必要に応じて、次いで濾過滅菌すること、によって調製され得る。一般的に、分散剤は、塩基性（ｂａｓｉｃ）分散媒および上記に列挙された成分から必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に、活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌注射可能溶液の調製物のための滅菌粉末の場合、調製方法は、予め濾過滅菌されたその溶液から、活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を生じる、真空乾燥および凍結乾燥を含む。
【０３７７】
関節内投与のために適切な処方物は、薬物の滅菌水性調製物の形態であり得、これは、微晶質形態（例えば、水性微晶質懸濁液の形態）であり得る。リポソーム処方物または生分解性ポリマー系もまた、関節内投与または眼内投与の両方のための薬物を提示するために使用され得る。
【０３７８】
局所投与（眼の処置を含む）のために適切な処方物としては、液体調製物もしくは半液体調製物（例えば、リニメント、ローション剤、ゲル、貼用剤（ａｐｐｌｉｃａｎｔ）、水中油エマルジョンまたは油中水エマルジョン（例えば、クリーム）、軟膏またはペースト（ｐａｓｔ））；または、溶液もしくは懸濁液（例えば、滴剤）が挙げられる。皮膚表面への局所投与のための処方物は、薬物と、皮膚科学的に受容可能なキャリア（例えば、ローション剤、クリーム、軟膏または石けん）とを分散させることによって調製され得る。特に有用なのは、適用を局在化させ、そして除去を阻害するために、皮膚にわたって被膜または層を形成し得るキャリアである。内部組織表面への局所投与のために、薬剤は、組織表面への吸収を増強することが公知の液状組織接着剤または他の物質中に分散され得る。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースまたはフィブリノゲン／トロンビン溶液が、有利に使用され得る。あるいは、組織コーティング溶液（例えば、ペクチン含有処方物）が、使用され得る。
【０３７９】
吸入処置のために、スプレー缶、ネブライザまたはアトマイザで投薬された粉末（自己推進型（ｓｅｌｆ−ｐｒｏｐｅｌｌｉｎｇ）または噴霧処方物）の吸入が使用され得る。このような処方物は、粉末吸入デバイスまたは自己推進型粉末投薬処方物からの肺投与のための微細粉末の形態であり得る。自己推進型溶液および噴霧処方物の場合、効果は、所望される噴霧特徴（すなわち、所望される粒子サイズを有する噴霧を生成し得る）を有するバルブの選択によってか、または制御された粒子サイズ中に懸濁された粉末として活性成分を組み込むことによってのいずれかにより達成され得る。吸入による投与のために、化合物はまた、適切な高圧ガス（例えば、二酸化炭素のようなガス）またはネブライザを含む、加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾル噴霧の形態で送達され得る。
【０３８０】
全身投与はまた、経粘膜手段または経皮手段により得る。経粘膜投与または経皮投与のために、透過されるべき障壁に適切な浸透剤が処方物中に使用される。このような浸透剤は、一般に当該分野において公知であり、そして例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁酸塩、およびフィルシジン酸誘導体（ｆｉｌｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）を含む。経粘膜投与は、鼻噴霧または坐剤の使用を通して達成され得る。経皮投与のために、活性化合物は、代表的に、当該分野において一般的に公知であるような、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリーム中に処方される。
【０３８１】
活性化合物は、身体からの急速な排除に対して化合物を保護するキャリアを用いて調製され得る（例えば、制御放出処方物（インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む））。生分解性の生体適合性ポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸）が使用され得る。このような処方物を調製する方法は、当業者に明らかである。材料はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手され得る。リポソーム懸濁物もまた、薬学的に受容可能なキャリアとして使用され得る。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載のような、当業者に公知の方法に従って調製され得る。ミクロソームおよび微小粒子もまた、使用され得る。
【０３８２】
経口または非経口組成物は、投与の容易さおよび投薬の均一性のために、投薬単位形態で処方され得る。投薬単位形態は、処置される被験体に対する単位投薬量として適切な、物理的に別個の単位をいい；各単位が、必要とされる薬学的キャリアと組合せて所望の治療的効果を生じるように計算された、予め決定された量の活性化合物を含む。本発明の投薬単位形態についての特定化は、活性化合物の独特の特徴および達成されるべき特定の治療的効果、ならびにこのような化合物を個体の処置のために調合する分野において固有の制限によって指示され、そしてそれらに直接的に依存する。
【０３８３】
上述したように、本発明に従って同定または設計される薬物は、薬学的に受容可能な非毒性の賦形剤およびキャリアと混合することによって、薬学的組成物中に処方され得る。このような組成物は、非経口投与のためには、特に溶液もしくは懸濁液の形態で；経口投与のためには、特に錠剤もしくはカプセルの形態で；または鼻腔的には、特に粉末、点鼻薬もしくはエアロゾルの形態で、調製され得る。組織表面への接着が所望される場合、組成物は、フィブリノゲン−トロンビン組成物または他の生体接着剤中に分散された薬物を含み得る。次いで、薬物は、所望の組織表面に塗布され得るか、噴霧され得るか、さもなくば適用され得る。あるいは、薬物は、例えば、治療的有効量（例えば、所望の効果を誘導するために十分な時間にわたり、適切な濃度の薬物を標的組織に提供する量）で、ヒトまたは他の哺乳動物に非経口投与または経口投与するために処方され得る。
【０３８４】
活性化合物が、移植手順の部分として使用される場合、これは、ドナーからの組織または器官の取り出し前に、移植される生組織または器官に提供され得る。薬物は、ドナー宿主に提供され得る。あるいは、またはさらに、一旦ドナーから取り出されると、器官または生組織は、活性化合物を含有する保存溶液中に配置され得る。すべての場合において、活性化合物は、組織への注射による場合には、所望される組織に直接的に投与され得るか、または活性化合物は、本明細書中に記載されるか、および／または当該分野において公知である任意の方法および処方物を使用して、経口投与または非経口投与のいずれかによって、全身的に提供され得る。
【０３８５】
薬物が組織または器官保存溶液の部分を含む場合、任意の市販の保存溶液が有利に使用され得る。例えば、当該分野において公知の有用な溶液としては、Ｃｏｌｌｉｎｓ溶液、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ溶液、Ｂｅｌｚｅｒ溶液、Ｅｕｒｏｃｏｌｌｉｎｓ溶液、および乳酸加リンガー溶液が挙げられる。
【０３８６】
治療的組成物において送達される化合物の有効濃度は、多くの因子（投与される化合物の最終的に所望される投薬量および投与経路を含む）に依存して変動する。投与される好ましい投薬量はまた、処置されるべき疾患または指標の型および程度、特定の患者の全体的な健康状態、送達される化合物の関連する生物学的効力、薬物の処方、処方物中における賦形剤の存在および型、ならびに投与経路のような変数に依存する可能性がある。概して、本発明の薬物は、以前に記載された、非ヒト霊長類およびげっ歯類を使用した哺乳動物研究から導き出される代表的な用量単位を使用して、個体に提供され得る。
【０３８７】
活性化合物が核酸分子である場合、核酸はベクターに挿入され得、そして遺伝子治療ベクターとして使用され得る。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照のこと）によってか、または定位注射（例えば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３０５４−３０５７を参照のこと）によって、被験体に送達され得る。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、受容可能な希釈剤中の遺伝子治療ベクターを含み得るか、または遺伝子送達ビヒクルが包埋された緩徐放出マトリクスを含み得る。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞からインタクトに産生され得る場合（例えば、レトロウイルスベクター）、薬学的調製物は、遺伝子送達系を生成する１以上の細胞を含み得る。
【０３８８】
本発明の活性化合物が、植物宿主への投与のために意図される場合、本発明は、植物環境に（例えば、葉、芽、根、または花の部分の表面に）直接的に、適用され得る。あるいは、本発明は、種子コーティングとして使用され得る。特定の植物に必要とされるような本発明の有効量の決定は、当該分野の技術の範囲内であり、そして植物種、栽植方法、および土壌型のような因子に依存する。本発明の薬物を含む組成物は、充填／分割された粒子状固体、顆粒、ペレット、湿化可能な（ｗｅｔａｂｌｅ）粉末、ダスト、水性懸濁液、または分散剤およびエマルジョンの形態の組成物を提供するために、アジュバント、希釈剤、キャリアなどを有するこのような薬物を処方することによって調製され得ることが意図される。カプセル化形態のこのような薬物を使用することがさらに意図され、例えば、薬物は、ポリマー内にカプセル化され得、ゼラチン、液体または他の処方補助剤（例えば、乳化剤、界面活性剤、湿潤剤、消泡剤、および不凍剤）は、このような組成物が使用前に任意の期間保存される場合に特に、このような組成物中に組み込まれ得る。活性剤として本発明の薬物を含む組成物の適用は、従来技術によって実施され得る。活性化合物が、昆虫宿主への投与のために意図される場合、標準的方法（例えば、空中散布が挙げられるが、これに限定されない）が意図される。
【０３８９】
本発明の方法によって同定または設計された活性化合物はまた、活性化合物の前駆体を含む。用語前駆体は、活性化合物を放出するための生物体において、自然的または酵素的のいずれかでの生体内変化を必要とする、親分子の薬理学的に不活性（または、部分的に不活性）な誘導体をいう。前駆体は、代謝条件下で切断可能な基を有する、本発明の化合物のバリエーションまたは誘導体である。前駆体は、それらが生理的条件下で加溶媒分解を受けるか、または酵素的分解を受ける場合に、インビボで薬学的に活性な本発明の活性化合物になる。前駆体形態は、しばしば、哺乳動物生物体において可溶性、組織適合性、または遅延型放出の利点を提供する（Ｂｕｎｄｇａｒｄ、Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ Ｐｒｏｄｒｕｇｓ、７−９頁、２１−２４頁、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ（１９８５）；および、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｔｈｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｃｔｉｏｎ、３５２−４０１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ（１９９２）を参照のこと）。
【０３９０】
本明細書中で記載される方法によって同定または設計されるような活性化合物は、障害を処置するために（予防的または治療的に）、個体に投与され得る。このような処置と合わせて、薬理ゲノミクス学（すなわち、個体の遺伝子型と、外来化合物または薬物に対するその個体の応答との間の関係の研究）が考慮され得る。治療剤の代謝における差異は、用量と薬理学的に活性な薬物の血中濃度との間の関係を変更することによって、重篤な毒性または治療の失敗へと導き得る。従って、医師または臨床家は、薬物を投与するか否かを決定する際、ならびにその薬物での処置の投薬量および／または治療レジメンを仕立てる際に、関連の薬理ゲノミクス学研究において得られた見識を適用することを考慮し得る。
【０３９１】
哺乳動物に関して、タンパク質合成の誘発物質またはインヒビターの有効用量は、単回用量または複数回用量で投与される場合に、約０．０１〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であることが意図される。代表的には、誘発物質またはインヒビターは、１患者あたり約１〜約２０００ｍｇの１日量の範囲で、処置の必要なヒトレシピエントに投与され得る。
【０３９２】
前述の一般的考察に照らして、以下に提示される特定の実施例は、単に例示であり、そして本発明の範囲を制限することを意図しない。他の一般的および特異的な構成が、当業者に明らかである。
【０３９３】
（ＩＩＩ．実施例）
（Ａ．実施例１：５０Ｓリボソームサブユニット結晶の調製）
Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ（ＡＴＣＣ ４３０４９）を、ＡＴＣＣ培養培地１２３０のわずかな改変版で、以前に記載された通りに（Ｂａｎら（１９９８）前出）増殖し、この改変版に、１リットル当たり、４．３ｇの酵母エキス（ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ）、５．１ｇのＴｒｉｓおよび３．４ｇのグルコースを補充した。細菌を、３７℃で、ＯＤ₅₅₀ｎｍが１．０と２．２との間になるまで増殖した。細菌を、遠心分離によって収集し、そして−８０℃で保存した。細胞を、Ｆｒｅｎｃｈプレスを使用して破裂させた。リボソームを、遠心分離によって溶解物から調製し、そしてサブユニットを、ショ糖勾配上で単離した（Ｓｈｅｖａｃｋら（１９８５）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．１８４：６８−７１）。
【０３９４】
（１．逆抽出（ｒｅｖｅｒｓｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ））
（１）濃縮された５０Ｓリボソームサブユニットストック（１．２Ｍ ＫＣｌ、０．５Ｍ ＮＨ４Ｃｌ、２０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、Ｔｒｉｓ １０ｍＭ、ＣｄＣｌ₂ １ｍＭ、Ｔｒｉｓ ５ｍＭ、ｐＨ ７．５中の３０ｍｇ／ｍｌ）から、１ｍｇのサブユニットを取り出し、そして１／２容の３０％ ＰＥＧ６０００（１リットルの３０％ ＰＥＧを作製するために、３００ｇ ＰＥＧ、７００ｍｌ Ｈ₂０；０．２μｍフィルターを通して濾過）と混合する。１〜２時間、氷上に放置する。
【０３９５】
（２）卓上用遠心分離機を使用して、約３０秒間沈殿物をスピンダウンする。
【０３９６】
（３）上清を取り除き、そして１００μｌのＲＥ緩衝液：７％ ＰＥＧ６０００、１．２Ｍ ＫＣｌ、０．５Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ、１００ｍＭ ＫＡｃ、３０ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ ７．５）および１ｍＭ ＣｄＣｌ₂を添加する。
【０３９７】
（４）ペレットを、室温で、５０μｌに設定したＰ２００ピペットを用いて混合することによって、再懸濁する。
【０３９８】
（５）エッペンドルフチューブをアルミ箔で包み、そして平衡のために室温で３０〜６０分間放置する。溶液は、５０Ｓで飽和する。
【０３９９】
（６）２分間、卓上用遠心分離機で、室温でスピンダウンし、上清を新しいエッペンドルフチューブに移す。少量のペレットが、遠心分離に用いたチューブ内に見出されるはずである。上清を、室温で維持する。
【０４００】
（７）シッティングドロップトレイ（Ｃｈａｒｌｅｓ−Ｓｕｐｐｅｒ）のサンプルウェルに、８〜１０μｌの上清を置く。１時間後、結晶種ストックから結晶種を筋状に塗りつける（ｓｔｒｅａｋ）。結晶種ストックを、安定化溶液緩衝液Ａ（以下を参照のこと）中で以前に成長した結晶を置くことによって調製し、次いで激しくボルテックスする。結晶種を筋状に塗りつけるために、水およびエタノールで洗浄し、次いで乾燥させたヒトの毛髪を、ボルテックスした溶液に通過し、次いで新たな結晶化ドロップに触れる。ドロップは、曇るように見えるはずである。シッティングドロップトレイにおけるリザーバーは、８％ ＰＥＧ６０００、１．２Ｍ ＫＣｌ、０．５Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ、１００ｍＭ ＫＡｃ、６．５ｍＭ ＨＡｃ（収率ｐＨ ５．８）、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂および１ｍＭ ＣｄＣｌ₂を含む１０００μｌの溶液を含む。
【０４０１】
（８）１日後、結晶種入れ（ｓｅｅｄｉｎｇ）が成功したか否かを調べる。成功したならば、結晶を３週間成長させる。
【０４０２】
（２．安定化プロトコル）
結晶が成長を停止した時点で（約３週間後）、各々のシッティングドロップチャンバを、ウェルの中央から縁へわずかなシングルカット（切り込み）を作成することによって開放する。この狭い切り込みを通して、室温で、１０μｌの緩衝液Ａ（１．２Ｍ ＫＣｌ、０．５Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１０％ＰＥＧ６０００、１ｍＭ ＣｄＣｌ₂、１００ｍＭ ＫＡｃ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（最終ｐＨ ６．１まで滴定した）、３０ｍＭ ＭＥＳ）を、各々のドロップに添加し、そして４５μｌの緩衝液（０．６６７Ｍ ＭＥＳ、０．３３３ＭＴｒｉｓ）を、各々のリザーバーに添加する。
【０４０３】
トレイを、ふたのあるプラスチック箱に入れ、そして約１日、１６℃のインキュベーターに入れる。次いで、さらに１日、１２℃に移動する。次いで、このプラスチック箱を、ふたのあるポリスチレン容器に入れ、そしてさらにもう１日、低温室に置く。結晶は、このように長時間維持し得るが、任意の使用の前に、緩衝液のさらなる変化を受ける必要がある。
【０４０４】
緩衝液Ａおよび緩衝液Ｂ（１．７Ｍ ＮａＣｌ、０．５Ｍ ＮＨ₄Ｃｌ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、１ｍＭ ＣｄＣｌ₂、１２％ ＰＥＧ６０００、２０％ ＥＧ、１００ＭＭ ＫＡＣ（ＨＡＣを用いて、最終ｐＨ ５．８まで滴定した）を使用して、以下の遷移系列を作成し、緩衝液Ｂ対緩衝液Ａの最終比：１／１６、１／８、１／４、１／２、３／４を与える。すべての溶液を、低温室温度にするべきである。ドロップのすべての操作は、狭い切り込みを通して行う。
【０４０５】
（１）４０μｌの「１／１６」をドロップに添加し、１５分間放置する。
【０４０６】
（２）４０μｌの「１／８」をドロップに添加し、３０〜６０分間放置する。
【０４０７】
（３）ドロップから４０μｌを取り出し（そして、リザーバーに廃棄する）、４０μｌの「１／４」を添加し、３０〜６０分間放置する。
【０４０８】
（４）ドロップから４０μｌを取り出し（そして、リザーバーに廃棄する）、４０μｌの「１／２」を添加し、１５分間放置する。
【０４０９】
（５）ドロップから４０μｌを取り出し（そして、リザーバーに廃棄する）、４０μｌの「３／４」を添加し、１５分間放置する。
【０４１０】
（６）ドロップから４０μｌを取り出し（そして、リザーバーに廃棄する）、４０μｌの緩衝液Ｂを添加し、１５分間放置する。
【０４１１】
（７）ドロップから６０〜８０μｌを取り出し（そして、リザーバーに廃棄する）、６０〜８０μｌの緩衝液Ｂを添加し、リザーバーを、５００μｌの緩衝液Ｂで置換する。
【０４１２】
（Ｂ．実施例２：初期精密化での５０Ｓリボソームサブユニットの結晶構造の決定）
２つのネイティブデータセットを除くすべてのデータを、ビームラインＸ１２ｂおよびＸ２５を使用して、１００Ｋで凍結させた結晶から、ＮａｔｉｏｎａｌＳｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎで収集し、そして３４５ｍｍのＭＡＲイメージングプレートを使用して記録した。各々の重原子誘導体について、異常回折データを、異常散乱するピークに対応する波長で収集した。ビームの大きさは、Ｘ２５で、大半のデータ収集について１００×１００μｍであり、そしてビームラインＸ１２ｂで、２００×２００μｍであった。結晶を、単位格子の長軸（５７０Å）に沿って向きを調整し、その結果、１．０⁰の振動を使用して、ＭＡＲ検出器の端で、最大２．７Åの分解能の外で反射を収集し得る。ビームラインＸ１２ｂでは、結晶から検出器の距離は、波長、結晶の質およびビーム発散に依存して４５０．０ｍｍと５５０．０ｍｍとの間で変化し、そして最大分解能データを、スポットの重複を避けながら収集し得るように選択した。ビームラインＸ２５では、検出器は、４８０ｍｍで、堅い台上に配置され、これは、異常端で設定された波長を有するイリジウム誘導体およびオスミウム誘導体についての３．２Åまでのデータ収集を可能にする。２．４Åの分解能までのネイティブデータは、ＣＣＤ検出器（等）を使用して、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（Ａｒｇｏｎｎｅ）の構造生物学ビームライン１９番で収集した。データセットを、ＤＥＮＺＯおよびＳＣＡＬＥＰＡＣＫ（Ｏｔｗｉｎｏｗｓｋｉ，（１９９３）Ｄａｔａ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）を使用することによって処理した。
【０４１３】
重原子に基づくフェイジングを、一つの誘導体異常分散（ＳＡＤ）位相と、２つの異なる同形群のデータ（ＭＩＲ１およびＭＩＲ２、表１）について計算したＭＩＲ位相とを組み合わせることによって、３．２Åの分解能まで拡張した。最良の２つの誘導体は、ペンタミンオスミウム（ｏｓｍｉｕｍ ｐｅｎｔａｍｉｎｅ）およびヘキサミンイリジウム（ｉｒｉｄｉｕｍ ｈｅｘａｍｉｎｅ）であり、これらの各々は、多数の結合部位を含んだ（表１）。少数の部位を有するいくつかの他の誘導体は、地図の品質をさらに改良した。すべてのフェイジングを、Ｔａ₆Ｂｒ₁₂誘導体以外は、ＣＮＳで実行した最尤法によって行った（Ｂｒｕｅｎｇｅｒら（１９９８）前出）。Ｔａ₆Ｂｒ₁₂誘導体は、球状に平均化された電子密度として表されるＳＨＡＲＰ（ｄｅ Ｌａ Ｆｏｒｔｅｌｌｅ，（１９９７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７６：４７２−４９４）で精密化した。位相を改良し、そして溶媒フリッピング（Ａｂｒａｈａｍｓら（１９９６）前出）によって、３．３Åから２．４Åに拡張し、そしてモデルを形成した。
【０４１４】
（Ｃ．実施例３：５０Ｓリボソームサブユニット／ピューロマイシン複合体の結晶調製およびＸ線回折データの収集）
５０Ｓリボソームサブユニットの結晶を、上記の通りに成長させ、そして安定化した。ＣＣｄＡ−ｐ−ピューロマイシン（図９Ａを参照のこと）を、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｙａｒｕｓ（Ｗｅｌｃｈら（１９９５）前出）から、好意により頂いた。アミノ−Ｎ−アシル化ミニヘリックス由来のオリゴヌクレオチド（図９Ｂを参照のこと）を、Ｄｈａｒｍａｃｏｎによって合成した。脱保護後、オリゴヌクレオチドを１００℃まで手短に加熱し、そして氷上で急冷し、再アニールした。リボソームの５０Ｓサブユニット結晶を安定化し、次いで液体プロパンでの冷凍ガラス化状態（ｃｒｙｏｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）およびＸ線回折データ収集の前に、１００μＭ ＣＣｄＡ−ｐ−ピューロマイシンまたはアミノ−Ｎ−アシル化ミニヘリックスを含む安定化緩衝液中に２４時間浸漬した。位相を、６０．０〜３．２Åの振幅のために、２Ｆ₀（アナログ）−Ｆ₀（ネイティブ）を使用して、最良の実験的位相から開始する密度改変（ＣＮＳ）によって計算した。（ネイティブの振幅は、より完全なネイティブの２つのデータセットのみに存在する振幅を除いて、大半の同形のネイティブの１つのデータセット由来であった。対応する計算された振幅の２倍未満であり、そしてＦ₀（アナログ）で置換された計算された２Ｆ₀−Ｆ₀振幅。）次いで、地図を、密度改変された振幅、および２Ｆ₀（アナログ）−Ｆ₀（ネイティブ）の振幅、またはＦ₀（アナログ）−Ｆ₀（ネイティブ）の振幅からの位相を使用して計算した。
【０４１５】
（Ｄ．実施例４：ペプチジルトランスフェラーゼ中央部付近のポリペプチド出口トンネルに位置する抗生物質結合部位）
３つの抗生物質と複合体化したＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ大サブユニットの結晶性複合体を、約３．０Åの分解能で確立した。この分解能での電子密度地図により、本発明者らは、リボソーム上の抗生物質チロシン、カルボマイシンおよびアニソマイシンのおよその位置決定を可能にした。本発明者らは、これらの抗生物質すべてが、Ｙａｒｕｓインヒビター、ＣＣｄＡ−ｐ−ピューロマイシン、およびポリペプチド出口トンネルにおいて小さな穴を形成する点のタンパク質Ｌ２２およびＬ４の先端によって規定されるような、ペプチジルトランスフェラーゼ中央部の間に横たわる領域において、リボソームに結合することを観察した。この主要な抗生物質結合部位の一般的な位置を、図１９に示す。チロシンおよびカルボマイシンは、新たに合成されたポリペプチドの出口をブロックすることによって機能するようである。アニソマイシンは、Ａ部位をブロックする。
【０４１６】
抗生物質エリトロマイシンは、チロシンとほぼ同じ位置に結合することが意図される。なぜなら、これは２つの分子の類似性のためであり、そしてエリトロマイシン耐性変異が、タンパク質Ｌ４の先端およびチロシン結合部位に近接するＲＮＡの一部の両方に存在することが公知であるからである。
【０４１７】
抗生物質とリボソームとの間の非常に大部分の相互作用は、Ａ部位、およびペプチジルトランスフェラーゼ中央部とタンパク質Ｌ２２との間のトンネル表面を形成するｒＲＮＡを介する。これらの抗生物質は、全く同じに結合しないので、小分子化合物が、本発明の手段および方法論を使用して、この領域に結合するように設計され得る多くのさらなる方法が存在する。例えば、重複しない部位に結合する異なる抗生物質の各々の成分を互いに結合することによって、新規の抗生物質を作成することが可能である（実施例６を参照のこと）。さらに、これらの抗生物質複合体によって示される小分子ＲＮＡ相互作用の新規の原理に基づいて、本発明者らは、リボソームならびに他の可能性のあるＲＮＡ標的上の部位に結合する全く新しい小分子を設計することが可能である。
【０４１８】
（Ｅ．実施例５：ハイブリッド抗生物質の設計および試験）
リボソーム、より特に、大リボソームサブユニットを標的化し、そしてタンパク質合成を中断する多くの抗生物質は、より単純なサブ構造の効果的な連鎖である複雑な分子であり、このうちの少なくとも１つは、リボソームの別々の部分と相互作用する。問題の化合物が、いくつかの相互作用的サブ構造を含む場合、その結合部位は、事実上、各々のこのようなサブ構造と接触し、そして引き込むサブサイト（ｓｕｂｓｉｔｅ）の合計である。大リボソームサブユニットを標的化する多くの抗生物質が、互いに近接する部位で、リボソームサブユニットを結合することが見出された。従って、第一の既知の抗生物質の一つのリボソーム結合部分が、隣接するサブサイトと相互作用する第二の既知の抗生物質のリボソーム結合部分に化学的に結合された、新規の抗生物質を合成する可能性が存在する。従って、生じた新規の化合物は、由来する２つの抗生物質のキメラである。
【０４１９】
キメラ抗生物質は、本明細書中の上記で議論された抗生物質／リボソーム複合体の構造についての情報を使用して、設計され得る。これらの構造により、リボソームにおける抗生物質結合サブサイトの同定、およびこのサブサイトと相互作用する化学的実体の特定が可能になる。このような知識を装備して、有機合成の当業者は、同時に、目的のサブ構造が、それぞれのサブサイトと相互作用し得るべき方法で、目的のサブ構造を互いに結合する化合物を合成し得る。意図された様式で機能する方法で発明された任意の化合物は、おそらく細胞増殖を阻害し、そして実際に阻害する場合、インビトロでタンパク質合成をおそらく阻害する。少なくとも、これは、インビトロアッセイ系においてタンパク質合成をブロックするはずである。このような化合物のリボソーム相互作用についてのさらなる情報は、本明細書中の上記のＤ節に記載される方法を使用して、リボソームと形成する複合体の構造を決定することによって得られ得る。
【０４２０】
例えば、本明細書中で記載される研究の結果として、カルボマイシンの二糖部分が、アニソマイシンの一部についての結合部位に近接する部位で、大リボソームサブユニットに結合することが発見された。この情報および本明細書中の上記に記載されたソフトウェアパッケージを使用して、当業者は、適切な化学リンカーによって結合した、カルボマイシンおよびアニソマイシンの関連するリボソーム結合部分を含むハイブリッド抗生物質を設計し得る。このハイブリッド分子は、一旦設計されると、従来の合成有機化学および従来の精製スキームを使用して、合成されそして精製され得る。一旦合成され、そして精製されると、このハイブリッド分子は、生物活性についてスクリーニングされ得る。これらのスクリーニングとしては、例えば、ハイブリッド分子を補充したかまたはハイブリッド分子を欠失したかのいずれかの、培地上または培地内での微生物の増殖が挙げられ得る。ハイブリッド分子の存在下での、微生物の数またはコロニーの大きさの任意の減少は、生物活性の指標である。さらに、ハイブリッド分子は、１つ以上の標識化アミノ酸の存在下での無細胞翻訳系において試験され得る。ハイブリッド分子を閉じこめる無細胞系に関連して、ハイブリッド分子を含む無細胞系におけるタンパク質へ取り込まれた標識化アミノ酸レベルの任意の減少は、ハイブリッド分子が、機能的タンパク質合成インヒビターとして作用する指標である。次いで、ハイブリッド分子を、本明細書中の上記で議論されたように、繰り返し精製して、その生理活性ペプチドおよびバイオアベイラビリティーを増強し得ることが意図される。
【０４２１】
本発明は、リボソームおよびリボソームサブユニットの高分解能の結晶を生成するための方法、ならびにこのような方法によって生成された結晶を提供する。本発明はまた、単独またはタンパク質合成インヒビターと組み合わせてのいずれかのリボソームサブユニットの高分解能の構造を提供する。本発明は、リボソーム関連リガンドを同定するための方法、および特定のリボソーム結合性質を有するリガンド、ならびにタンパク質合成インヒビターとして作用し得るリガンドを設計するための方法を提供する。従って、本発明の方法および組成物は、任意の標的生物の増殖を特異的に殺傷するかまたは阻害するように設計されるリガンドを生成するために使用され得る。
【０４２２】
（参考としての援用）
本明細書中で言及される特許文書、科学論文、原子座標（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）に、登録番号ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫ；ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦ２；ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＧＯ；およびＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の下で登録されたセット、および／またはディスク番号１、２または３に含まれるセットを含むが、これらに限定されない）の各々の開示は、本明細書中で参考として援用される。
【０４２３】
（等価物）
本発明は、その趣旨または不可欠な特徴から逸脱することなく、他の特異的な形態において体現され得る。従って、上述の実施形態は、あらゆる点で、本明細書中に記載される発明を限定するのではなく、例示として見なされるべきである。従って、本発明の範囲は、上述の記載によって示されるのではなく、添付の特許請求の範囲によって示される。そして、特許請求の範囲と同等の意義および範囲内で生じるあらゆる変化が意図され、特許請求の範囲に包含される。
【０４２４】
【表１９】
【図面の簡単な説明】
本特許書類または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有する本特許公開または特許出願公開は、請求および必要な料金の支払いの下で、特許局によって提供される。
多くの以下の図に類似したカラー表現は、例えば、Ｂａｎら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：９０５−９２０；またはＮｉｓｓｅｎら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：９２０−９２９に見出され得る。
本発明の目的および特徴は、以下に記載の図面を参照して、より完全に理解され得る。
【図１】図１（Ａ）〜（Ｅ）は、２．４Åの分解能の電子密度地図からの電子密度を示す。特に、図１（Ａ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡドメインＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶ間の接合部の立体図を示す。図１（Ｂ）は、周囲のＲＮＡと相互作用するタンパク質Ｌ２の伸長したドメインを示す。図１（Ｃ）は、結合したＭｇ²⁺イオンを有するＬ２領域を詳細に示す。図１（Ｄ）は、アミノ酸側鎖を有するＬ２を詳細に示す。図１（Ｅ）は、ドメイン６由来のヘリックス９４〜９７を示す。
【図２】図２は、頂部図（ｃｒｏｗｎ ｖｉｅｗ）でＨ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの大リボソームサブユニットを示す。右へのＬ７／Ｌ１２軸（ｓｔａｌｋ）、左へのＬ１軸、および上方への隆起（ＣＰ）を有するサブユニットを頂部図で示す。この図において、小リボソームサブユニットと相互作用するサブユニットの表面は、読み手に面する。ＲＮＡは、灰色の空間充填表現で示される。認識できるタンパク質の骨格を、金色で表現する。サブユニットのペプチジルトランスフェラーゼ部位に結合した遷移状態のアナログを、緑色で表現する。粒子は、直径約２５０Åである。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。この２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を、標準化したで示す。図３（Ａ）は、大サブユニットのｒＲＮＡの５’の半分を示す。この図は、少なくとも２つの水素結合によって安定化された大サブユニットの結晶構造において見られるすべての塩基対を示す。赤色で示される対形成は、予測されており、そして観察される対形成である。緑色で示される対形成は、予測されていたが、観察されない対形成である。青色で示される相互作用は、観察されるが、予測されなかった相互作用である。黒色で示される塩基は、対形成相互作用に関与しないようである。２．４Åの分解能の電子密度地図では視覚化できない配列は、それらの配列の予測された二次構造をとともに、灰色で示される。
【図３Ｂ】図３（Ｂ）は、大サブユニットのｒＲＮＡの３’の半分を示す。この図は、少なくとも２つの水素結合によって安定化された大サブユニットの結晶構造において見られるすべての塩基対を示す。赤色で示される対形成は、予測されており、そして観察される対形成である。緑色で示される対形成は、予測されていたが、観察されない対形成である。青色で示される相互作用は、観察されるが、予測されなかった相互作用である。黒色で示される塩基は、対形成相互作用に関与しないようである。２．４Åの分解能の電子密度地図では視覚化できない配列は、それらの配列の予測された二次構造をとともに、灰色で示される。
【図４Ａ】図４（Ａ）〜（Ｌ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるＲＮＡの三次構造、全体としてのそのＲＮＡ、およびそのＲＮＡの概略図を示す。特に、図４（Ａ）および４（Ｂ）は、全体のサブユニットのＲＮＡ構造を示す。ドメインを、図５（Ｃ）の概略図に示されるように色分けする。図４（Ａ）は、頂部図で粒子を示す。図４（Ｂ）は、像の平面に垂直に走る軸の周りを１８０°回転した図４（Ａ）の像を示す。図４（Ｃ）および４（Ｄ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡの概略図および５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。図４（Ｃ）は、Ｌｅｆｆｅｒｓら（（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：４３−６１）に従って番号を付されたヘリックスを有する図３の２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造の概略図を示し、そして分子のドメインを、色の変化によって示す。図４（Ｄ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。塩基を結合する太線は、ワトソン−クリック対形成を示す。小文字の「ｏ」によって結合される塩基は、非ワトソン−クリック対形成を示す。細線によって結合される塩基は、一つの水素結合を介して相互作用する。黒色で示される塩基は、対形成していない。赤色で示される塩基は、現在確認されている（Ｓｙｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１５６−１５９）系統発生的に予測された対形成である。青色で示される対形成は、観察されるが、予測されなかった対形成であり、そして緑色で示される対形成は、予測されたが、観察されない対形成である。図４（Ｅ）〜図４（Ｌ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡにおけるＲＮＡドメインの立体図を示す。各々のドメインは、その５’末端から３’末端に色分けされ、見る者の、３次元におけるその軌道の追跡が容易になる。最も重要な内部ドメインの相互作用が発生する表面を、立体図の右にモノラルで示す。図４（Ｅ）は、ドメインＩを示す；図４（Ｆ）は、ドメインＩＩを示す；図４（Ｇ）は、ドメインＩＩＩを示す；図４（Ｈ）は、ドメインＩＶを示す；図４（Ｉ）は、ドメインＶを示す；図４（Ｊ）は、ドメインＶの背面図を示す；図４（Ｋ）は、ドメインＶＩを示す；そして図４（Ｌ）は、５Ｓ ｒＲＮＡを示す。
【図４Ｂ】図４（Ａ）〜（Ｌ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるＲＮＡの三次構造、全体としてのそのＲＮＡ、およびそのＲＮＡの概略図を示す。特に、図４（Ａ）および４（Ｂ）は、全体のサブユニットのＲＮＡ構造を示す。ドメインを、図５（Ｃ）の概略図に示されるように色分けする。図４（Ａ）は、頂部図で粒子を示す。図４（Ｂ）は、像の平面に垂直に走る軸の周りを１８０°回転した図４（Ａ）の像を示す。図４（Ｃ）および４（Ｄ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡの概略図および５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。図４（Ｃ）は、Ｌｅｆｆｅｒｓら（（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：４３−６１）に従って番号を付されたヘリックスを有する図３の２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造の概略図を示し、そして分子のドメインを、色の変化によって示す。図４（Ｄ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。塩基を結合する太線は、ワトソン−クリック対形成を示す。小文字の「ｏ」によって結合される塩基は、非ワトソン−クリック対形成を示す。細線によって結合される塩基は、一つの水素結合を介して相互作用する。黒色で示される塩基は、対形成していない。赤色で示される塩基は、現在確認されている（Ｓｙｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１５６−１５９）系統発生的に予測された対形成である。青色で示される対形成は、観察されるが、予測されなかった対形成であり、そして緑色で示される対形成は、予測されたが、観察されない対形成である。図４（Ｅ）〜図４（Ｌ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡにおけるＲＮＡドメインの立体図を示す。各々のドメインは、その５’末端から３’末端に色分けされ、見る者の、３次元におけるその軌道の追跡が容易になる。最も重要な内部ドメインの相互作用が発生する表面を、立体図の右にモノラルで示す。図４（Ｅ）は、ドメインＩを示す；図４（Ｆ）は、ドメインＩＩを示す；図４（Ｇ）は、ドメインＩＩＩを示す；図４（Ｈ）は、ドメインＩＶを示す；図４（Ｉ）は、ドメインＶを示す；図４（Ｊ）は、ドメインＶの背面図を示す；図４（Ｋ）は、ドメインＶＩを示す；そして図４（Ｌ）は、５Ｓ ｒＲＮＡを示す。
【図４Ｃ】図４（Ａ）〜（Ｌ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるＲＮＡの三次構造、全体としてのそのＲＮＡ、およびそのＲＮＡの概略図を示す。特に、図４（Ａ）および４（Ｂ）は、全体のサブユニットのＲＮＡ構造を示す。ドメインを、図５（Ｃ）の概略図に示されるように色分けする。図４（Ａ）は、頂部図で粒子を示す。図４（Ｂ）は、像の平面に垂直に走る軸の周りを１８０°回転した図４（Ａ）の像を示す。図４（Ｃ）および４（Ｄ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡの概略図および５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。図４（Ｃ）は、Ｌｅｆｆｅｒｓら（（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：４３−６１）に従って番号を付されたヘリックスを有する図３の２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造の概略図を示し、そして分子のドメインを、色の変化によって示す。図４（Ｄ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。塩基を結合する太線は、ワトソン−クリック対形成を示す。小文字の「ｏ」によって結合される塩基は、非ワトソン−クリック対形成を示す。細線によって結合される塩基は、一つの水素結合を介して相互作用する。黒色で示される塩基は、対形成していない。赤色で示される塩基は、現在確認されている（Ｓｙｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１５６−１５９）系統発生的に予測された対形成である。青色で示される対形成は、観察されるが、予測されなかった対形成であり、そして緑色で示される対形成は、予測されたが、観察されない対形成である。図４（Ｅ）〜図４（Ｌ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡにおけるＲＮＡドメインの立体図を示す。各々のドメインは、その５’末端から３’末端に色分けされ、見る者の、３次元におけるその軌道の追跡が容易になる。最も重要な内部ドメインの相互作用が発生する表面を、立体図の右にモノラルで示す。図４（Ｅ）は、ドメインＩを示す；図４（Ｆ）は、ドメインＩＩを示す；図４（Ｇ）は、ドメインＩＩＩを示す；図４（Ｈ）は、ドメインＩＶを示す；図４（Ｉ）は、ドメインＶを示す；図４（Ｊ）は、ドメインＶの背面図を示す；図４（Ｋ）は、ドメインＶＩを示す；そして図４（Ｌ）は、５Ｓ ｒＲＮＡを示す。
【図４Ｄ】図４（Ａ）〜（Ｌ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるＲＮＡの三次構造、全体としてのそのＲＮＡ、およびそのＲＮＡの概略図を示す。特に、図４（Ａ）および４（Ｂ）は、全体のサブユニットのＲＮＡ構造を示す。ドメインを、図５（Ｃ）の概略図に示されるように色分けする。図４（Ａ）は、頂部図で粒子を示す。図４（Ｂ）は、像の平面に垂直に走る軸の周りを１８０°回転した図４（Ａ）の像を示す。図４（Ｃ）および４（Ｄ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡの概略図および５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。図４（Ｃ）は、Ｌｅｆｆｅｒｓら（（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：４３−６１）に従って番号を付されたヘリックスを有する図３の２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造の概略図を示し、そして分子のドメインを、色の変化によって示す。図４（Ｄ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。塩基を結合する太線は、ワトソン−クリック対形成を示す。小文字の「ｏ」によって結合される塩基は、非ワトソン−クリック対形成を示す。細線によって結合される塩基は、一つの水素結合を介して相互作用する。黒色で示される塩基は、対形成していない。赤色で示される塩基は、現在確認されている（Ｓｙｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１５６−１５９）系統発生的に予測された対形成である。青色で示される対形成は、観察されるが、予測されなかった対形成であり、そして緑色で示される対形成は、予測されたが、観察されない対形成である。図４（Ｅ）〜図４（Ｌ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡにおけるＲＮＡドメインの立体図を示す。各々のドメインは、その５’末端から３’末端に色分けされ、見る者の、３次元におけるその軌道の追跡が容易になる。最も重要な内部ドメインの相互作用が発生する表面を、立体図の右にモノラルで示す。図４（Ｅ）は、ドメインＩを示す；図４（Ｆ）は、ドメインＩＩを示す；図４（Ｇ）は、ドメインＩＩＩを示す；図４（Ｈ）は、ドメインＩＶを示す；図４（Ｉ）は、ドメインＶを示す；図４（Ｊ）は、ドメインＶの背面図を示す；図４（Ｋ）は、ドメインＶＩを示す；そして図４（Ｌ）は、５Ｓ ｒＲＮＡを示す。
【図４Ｅ】図４（Ａ）〜（Ｌ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるＲＮＡの三次構造、全体としてのそのＲＮＡ、およびそのＲＮＡの概略図を示す。特に、図４（Ａ）および４（Ｂ）は、全体のサブユニットのＲＮＡ構造を示す。ドメインを、図５（Ｃ）の概略図に示されるように色分けする。図４（Ａ）は、頂部図で粒子を示す。図４（Ｂ）は、像の平面に垂直に走る軸の周りを１８０°回転した図４（Ａ）の像を示す。図４（Ｃ）および４（Ｄ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡの概略図および５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。図４（Ｃ）は、Ｌｅｆｆｅｒｓら（（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：４３−６１）に従って番号を付されたヘリックスを有する図３の２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造の概略図を示し、そして分子のドメインを、色の変化によって示す。図４（Ｄ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。塩基を結合する太線は、ワトソン−クリック対形成を示す。小文字の「ｏ」によって結合される塩基は、非ワトソン−クリック対形成を示す。細線によって結合される塩基は、一つの水素結合を介して相互作用する。黒色で示される塩基は、対形成していない。赤色で示される塩基は、現在確認されている（Ｓｙｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１５６−１５９）系統発生的に予測された対形成である。青色で示される対形成は、観察されるが、予測されなかった対形成であり、そして緑色で示される対形成は、予測されたが、観察されない対形成である。図４（Ｅ）〜図４（Ｌ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡにおけるＲＮＡドメインの立体図を示す。各々のドメインは、その５’末端から３’末端に色分けされ、見る者の、３次元におけるその軌道の追跡が容易になる。最も重要な内部ドメインの相互作用が発生する表面を、立体図の右にモノラルで示す。図４（Ｅ）は、ドメインＩを示す；図４（Ｆ）は、ドメインＩＩを示す；図４（Ｇ）は、ドメインＩＩＩを示す；図４（Ｈ）は、ドメインＩＶを示す；図４（Ｉ）は、ドメインＶを示す；図４（Ｊ）は、ドメインＶの背面図を示す；図４（Ｋ）は、ドメインＶＩを示す；そして図４（Ｌ）は、５Ｓ ｒＲＮＡを示す。
【図４Ｆ】図４（Ａ）〜（Ｌ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるＲＮＡの三次構造、全体としてのそのＲＮＡ、およびそのＲＮＡの概略図を示す。特に、図４（Ａ）および４（Ｂ）は、全体のサブユニットのＲＮＡ構造を示す。ドメインを、図５（Ｃ）の概略図に示されるように色分けする。図４（Ａ）は、頂部図で粒子を示す。図４（Ｂ）は、像の平面に垂直に走る軸の周りを１８０°回転した図４（Ａ）の像を示す。図４（Ｃ）および４（Ｄ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡの概略図および５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。図４（Ｃ）は、Ｌｅｆｆｅｒｓら（（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：４３−６１）に従って番号を付されたヘリックスを有する図３の２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造の概略図を示し、そして分子のドメインを、色の変化によって示す。図４（Ｄ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。塩基を結合する太線は、ワトソン−クリック対形成を示す。小文字の「ｏ」によって結合される塩基は、非ワトソン−クリック対形成を示す。細線によって結合される塩基は、一つの水素結合を介して相互作用する。黒色で示される塩基は、対形成していない。赤色で示される塩基は、現在確認されている（Ｓｙｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１５６−１５９）系統発生的に予測された対形成である。青色で示される対形成は、観察されるが、予測されなかった対形成であり、そして緑色で示される対形成は、予測されたが、観察されない対形成である。図４（Ｅ）〜図４（Ｌ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡにおけるＲＮＡドメインの立体図を示す。各々のドメインは、その５’末端から３’末端に色分けされ、見る者の、３次元におけるその軌道の追跡が容易になる。最も重要な内部ドメインの相互作用が発生する表面を、立体図の右にモノラルで示す。図４（Ｅ）は、ドメインＩを示す；図４（Ｆ）は、ドメインＩＩを示す；図４（Ｇ）は、ドメインＩＩＩを示す；図４（Ｈ）は、ドメインＩＶを示す；図４（Ｉ）は、ドメインＶを示す；図４（Ｊ）は、ドメインＶの背面図を示す；図４（Ｋ）は、ドメインＶＩを示す；そして図４（Ｌ）は、５Ｓ ｒＲＮＡを示す。
【図４Ｇ】図４（Ａ）〜（Ｌ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるＲＮＡの三次構造、全体としてのそのＲＮＡ、およびそのＲＮＡの概略図を示す。特に、図４（Ａ）および４（Ｂ）は、全体のサブユニットのＲＮＡ構造を示す。ドメインを、図５（Ｃ）の概略図に示されるように色分けする。図４（Ａ）は、頂部図で粒子を示す。図４（Ｂ）は、像の平面に垂直に走る軸の周りを１８０°回転した図４（Ａ）の像を示す。図４（Ｃ）および４（Ｄ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡの概略図および５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。図４（Ｃ）は、Ｌｅｆｆｅｒｓら（（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：４３−６１）に従って番号を付されたヘリックスを有する図３の２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造の概略図を示し、そして分子のドメインを、色の変化によって示す。図４（Ｄ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。塩基を結合する太線は、ワトソン−クリック対形成を示す。小文字の「ｏ」によって結合される塩基は、非ワトソン−クリック対形成を示す。細線によって結合される塩基は、一つの水素結合を介して相互作用する。黒色で示される塩基は、対形成していない。赤色で示される塩基は、現在確認されている（Ｓｙｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１５６−１５９）系統発生的に予測された対形成である。青色で示される対形成は、観察されるが、予測されなかった対形成であり、そして緑色で示される対形成は、予測されたが、観察されない対形成である。図４（Ｅ）〜図４（Ｌ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡにおけるＲＮＡドメインの立体図を示す。各々のドメインは、その５’末端から３’末端に色分けされ、見る者の、３次元におけるその軌道の追跡が容易になる。最も重要な内部ドメインの相互作用が発生する表面を、立体図の右にモノラルで示す。図４（Ｅ）は、ドメインＩを示す；図４（Ｆ）は、ドメインＩＩを示す；図４（Ｇ）は、ドメインＩＩＩを示す；図４（Ｈ）は、ドメインＩＶを示す；図４（Ｉ）は、ドメインＶを示す；図４（Ｊ）は、ドメインＶの背面図を示す；図４（Ｋ）は、ドメインＶＩを示す；そして図４（Ｌ）は、５Ｓ ｒＲＮＡを示す。
【図４Ｈ】図４（Ａ）〜（Ｌ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるＲＮＡの三次構造、全体としてのそのＲＮＡ、およびそのＲＮＡの概略図を示す。特に、図４（Ａ）および４（Ｂ）は、全体のサブユニットのＲＮＡ構造を示す。ドメインを、図５（Ｃ）の概略図に示されるように色分けする。図４（Ａ）は、頂部図で粒子を示す。図４（Ｂ）は、像の平面に垂直に走る軸の周りを１８０°回転した図４（Ａ）の像を示す。図４（Ｃ）および４（Ｄ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡの概略図および５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。図４（Ｃ）は、Ｌｅｆｆｅｒｓら（（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：４３−６１）に従って番号を付されたヘリックスを有する図３の２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造の概略図を示し、そして分子のドメインを、色の変化によって示す。図４（Ｄ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。塩基を結合する太線は、ワトソン−クリック対形成を示す。小文字の「ｏ」によって結合される塩基は、非ワトソン−クリック対形成を示す。細線によって結合される塩基は、一つの水素結合を介して相互作用する。黒色で示される塩基は、対形成していない。赤色で示される塩基は、現在確認されている（Ｓｙｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１５６−１５９）系統発生的に予測された対形成である。青色で示される対形成は、観察されるが、予測されなかった対形成であり、そして緑色で示される対形成は、予測されたが、観察されない対形成である。図４（Ｅ）〜図４（Ｌ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡにおけるＲＮＡドメインの立体図を示す。各々のドメインは、その５’末端から３’末端に色分けされ、見る者の、３次元におけるその軌道の追跡が容易になる。最も重要な内部ドメインの相互作用が発生する表面を、立体図の右にモノラルで示す。図４（Ｅ）は、ドメインＩを示す；図４（Ｆ）は、ドメインＩＩを示す；図４（Ｇ）は、ドメインＩＩＩを示す；図４（Ｈ）は、ドメインＩＶを示す；図４（Ｉ）は、ドメインＶを示す；図４（Ｊ）は、ドメインＶの背面図を示す；図４（Ｋ）は、ドメインＶＩを示す；そして図４（Ｌ）は、５Ｓ ｒＲＮＡを示す。
【図４Ｉ】図４（Ａ）〜（Ｌ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるＲＮＡの三次構造、全体としてのそのＲＮＡ、およびそのＲＮＡの概略図を示す。特に、図４（Ａ）および４（Ｂ）は、全体のサブユニットのＲＮＡ構造を示す。ドメインを、図５（Ｃ）の概略図に示されるように色分けする。図４（Ａ）は、頂部図で粒子を示す。図４（Ｂ）は、像の平面に垂直に走る軸の周りを１８０°回転した図４（Ａ）の像を示す。図４（Ｃ）および４（Ｄ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡの概略図および５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。図４（Ｃ）は、Ｌｅｆｆｅｒｓら（（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：４３−６１）に従って番号を付されたヘリックスを有する図３の２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造の概略図を示し、そして分子のドメインを、色の変化によって示す。図４（Ｄ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。塩基を結合する太線は、ワトソン−クリック対形成を示す。小文字の「ｏ」によって結合される塩基は、非ワトソン−クリック対形成を示す。細線によって結合される塩基は、一つの水素結合を介して相互作用する。黒色で示される塩基は、対形成していない。赤色で示される塩基は、現在確認されている（Ｓｙｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１５６−１５９）系統発生的に予測された対形成である。青色で示される対形成は、観察されるが、予測されなかった対形成であり、そして緑色で示される対形成は、予測されたが、観察されない対形成である。図４（Ｅ）〜図４（Ｌ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡにおけるＲＮＡドメインの立体図を示す。各々のドメインは、その５’末端から３’末端に色分けされ、見る者の、３次元におけるその軌道の追跡が容易になる。最も重要な内部ドメインの相互作用が発生する表面を、立体図の右にモノラルで示す。図４（Ｅ）は、ドメインＩを示す；図４（Ｆ）は、ドメインＩＩを示す；図４（Ｇ）は、ドメインＩＩＩを示す；図４（Ｈ）は、ドメインＩＶを示す；図４（Ｉ）は、ドメインＶを示す；図４（Ｊ）は、ドメインＶの背面図を示す；図４（Ｋ）は、ドメインＶＩを示す；そして図４（Ｌ）は、５Ｓ ｒＲＮＡを示す。
【図４Ｊ】図４（Ａ）〜（Ｌ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるＲＮＡの三次構造、全体としてのそのＲＮＡ、およびそのＲＮＡの概略図を示す。特に、図４（Ａ）および４（Ｂ）は、全体のサブユニットのＲＮＡ構造を示す。ドメインを、図５（Ｃ）の概略図に示されるように色分けする。図４（Ａ）は、頂部図で粒子を示す。図４（Ｂ）は、像の平面に垂直に走る軸の周りを１８０°回転した図４（Ａ）の像を示す。図４（Ｃ）および４（Ｄ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡの概略図および５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。図４（Ｃ）は、Ｌｅｆｆｅｒｓら（（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：４３−６１）に従って番号を付されたヘリックスを有する図３の２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造の概略図を示し、そして分子のドメインを、色の変化によって示す。図４（Ｄ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。塩基を結合する太線は、ワトソン−クリック対形成を示す。小文字の「ｏ」によって結合される塩基は、非ワトソン−クリック対形成を示す。細線によって結合される塩基は、一つの水素結合を介して相互作用する。黒色で示される塩基は、対形成していない。赤色で示される塩基は、現在確認されている（Ｓｙｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１５６−１５９）系統発生的に予測された対形成である。青色で示される対形成は、観察されるが、予測されなかった対形成であり、そして緑色で示される対形成は、予測されたが、観察されない対形成である。図４（Ｅ）〜図４（Ｌ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡにおけるＲＮＡドメインの立体図を示す。各々のドメインは、その５’末端から３’末端に色分けされ、見る者の、３次元におけるその軌道の追跡が容易になる。最も重要な内部ドメインの相互作用が発生する表面を、立体図の右にモノラルで示す。図４（Ｅ）は、ドメインＩを示す；図４（Ｆ）は、ドメインＩＩを示す；図４（Ｇ）は、ドメインＩＩＩを示す；図４（Ｈ）は、ドメインＩＶを示す；図４（Ｉ）は、ドメインＶを示す；図４（Ｊ）は、ドメインＶの背面図を示す；図４（Ｋ）は、ドメインＶＩを示す；そして図４（Ｌ）は、５Ｓ ｒＲＮＡを示す。
【図４Ｋ】図４（Ａ）〜（Ｌ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるＲＮＡの三次構造、全体としてのそのＲＮＡ、およびそのＲＮＡの概略図を示す。特に、図４（Ａ）および４（Ｂ）は、全体のサブユニットのＲＮＡ構造を示す。ドメインを、図５（Ｃ）の概略図に示されるように色分けする。図４（Ａ）は、頂部図で粒子を示す。図４（Ｂ）は、像の平面に垂直に走る軸の周りを１８０°回転した図４（Ａ）の像を示す。図４（Ｃ）および４（Ｄ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡの概略図および５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。図４（Ｃ）は、Ｌｅｆｆｅｒｓら（（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：４３−６１）に従って番号を付されたヘリックスを有する図３の２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造の概略図を示し、そして分子のドメインを、色の変化によって示す。図４（Ｄ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。塩基を結合する太線は、ワトソン−クリック対形成を示す。小文字の「ｏ」によって結合される塩基は、非ワトソン−クリック対形成を示す。細線によって結合される塩基は、一つの水素結合を介して相互作用する。黒色で示される塩基は、対形成していない。赤色で示される塩基は、現在確認されている（Ｓｙｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１５６−１５９）系統発生的に予測された対形成である。青色で示される対形成は、観察されるが、予測されなかった対形成であり、そして緑色で示される対形成は、予測されたが、観察されない対形成である。図４（Ｅ）〜図４（Ｌ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡにおけるＲＮＡドメインの立体図を示す。各々のドメインは、その５’末端から３’末端に色分けされ、見る者の、３次元におけるその軌道の追跡が容易になる。最も重要な内部ドメインの相互作用が発生する表面を、立体図の右にモノラルで示す。図４（Ｅ）は、ドメインＩを示す；図４（Ｆ）は、ドメインＩＩを示す；図４（Ｇ）は、ドメインＩＩＩを示す；図４（Ｈ）は、ドメインＩＶを示す；図４（Ｉ）は、ドメインＶを示す；図４（Ｊ）は、ドメインＶの背面図を示す；図４（Ｋ）は、ドメインＶＩを示す；そして図４（Ｌ）は、５Ｓ ｒＲＮＡを示す。
【図４Ｌ】図４（Ａ）〜（Ｌ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉにおけるＲＮＡの三次構造、全体としてのそのＲＮＡ、およびそのＲＮＡの概略図を示す。特に、図４（Ａ）および４（Ｂ）は、全体のサブユニットのＲＮＡ構造を示す。ドメインを、図５（Ｃ）の概略図に示されるように色分けする。図４（Ａ）は、頂部図で粒子を示す。図４（Ｂ）は、像の平面に垂直に走る軸の周りを１８０°回転した図４（Ａ）の像を示す。図４（Ｃ）および４（Ｄ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡの概略図および５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。図４（Ｃ）は、Ｌｅｆｆｅｒｓら（（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９５：４３−６１）に従って番号を付されたヘリックスを有する図３の２３Ｓ ｒＲＮＡの二次構造の概略図を示し、そして分子のドメインを、色の変化によって示す。図４（Ｄ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉ由来の５Ｓ ｒＲＮＡの二次構造を示す。塩基を結合する太線は、ワトソン−クリック対形成を示す。小文字の「ｏ」によって結合される塩基は、非ワトソン−クリック対形成を示す。細線によって結合される塩基は、一つの水素結合を介して相互作用する。黒色で示される塩基は、対形成していない。赤色で示される塩基は、現在確認されている（Ｓｙｍａｎｓｋｉら（１９９８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２６：１５６−１５９）系統発生的に予測された対形成である。青色で示される対形成は、観察されるが、予測されなかった対形成であり、そして緑色で示される対形成は、予測されたが、観察されない対形成である。図４（Ｅ）〜図４（Ｌ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡにおけるＲＮＡドメインの立体図を示す。各々のドメインは、その５’末端から３’末端に色分けされ、見る者の、３次元におけるその軌道の追跡が容易になる。最も重要な内部ドメインの相互作用が発生する表面を、立体図の右にモノラルで示す。図４（Ｅ）は、ドメインＩを示す；図４（Ｆ）は、ドメインＩＩを示す；図４（Ｇ）は、ドメインＩＩＩを示す；図４（Ｈ）は、ドメインＩＶを示す；図４（Ｉ）は、ドメインＶを示す；図４（Ｊ）は、ドメインＶの背面図を示す；図４（Ｋ）は、ドメインＶＩを示す；そして図４（Ｌ）は、５Ｓ ｒＲＮＡを示す。
【図５】図５（Ａ）〜（Ｃ）は、Ｈ．ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉの２３Ｓ ｒＲＮＡにおける保存および伸長を示す。これらの像におけるＲＮＡの大部分を灰色で示す。３つの系統発生界にわたって、９５％を超えて保存されることが見出された配列を、赤色で示す。基本的な２３Ｓ構造における伸長が可能である配列を、緑色で示す（Ｇｕｔｅｌｌら（２０００）前出）。特に、図５（Ａ）は、頂部図に関して回転した粒子を示し、その結果、活性部位のクレフトが見られ得る。図５（Ｂ）は、頂部図を示す。図５（Ｃ）は、粒子の背面図、すなわち垂直軸の周りを１８０°回転した頂部図を示す。
【図６】図６（Ａ）〜（Ｉ）は、非球状伸長を有するいくつかの大サブユニットのリボソームタンパク質の構造を示す。これらのタンパク質の球状ドメインを緑色で示し、そしてその非球状伸長を赤色で示す。Ｌ４４ｅおよびＬ３７ｅにおける亜鉛イオンの位置もまた示す。図６（Ａ）は、Ｌ２を示す；図６（Ｂ）は、Ｌ３を示す；図６（Ｃ）は、Ｌ３９を示す；図６（Ｄ）は、Ｌ４を示す；図６（Ｅ）は、Ｌ１５を示す；図６（Ｆ）は、Ｌ２１ｅを示す；図６（Ｇ）は、Ｌ４４ｅを示す；図６（Ｈ）は、Ｌ３７ｅを示す；図６（Ｉ）は、Ｌ１９を示す。
【図７】図７（Ａ）〜（Ｃ）は、大リボソームサブユニットの表面上に現れるタンパク質を示す。サブユニットのＲＮＡは、図２に示されるように、灰色で示し、そしてタンパク質の骨格を、金色で示す。特に、図７（Ａ）は、サブユニットの頂部図におけるサブユニットを示す。図７（Ｂ）は、頂部図の配向でのサブユニットの背面図を示す。図７（Ｃ）は、底面図を示す；ペプチドトンネルの末端は、この像の中央に現れる。各々の像において認識できるタンパク質を、図の左隅に、小さい像で同定する。
【図８】図８（Ａ）〜（Ｆ）は、大リボソームサブユニットにおけるタンパク質の分布およびタンパク質−ＲＮＡ相互作用を示す。特に、図８（Ａ）は、ペプチドトンネルの末端の近傍におけるタンパク質の構造、およびタンパク質が、相互作用するＲＮＡ配列にどのように関わるかを示す。タンパク質Ｌ２２は、２３Ｓ ｒＲＮＡの内部に、長いβヘアピン伸長を伸ばす。Ｌ２４は、類似する伸長を有するが、タンパク質全体は、粒子の表面上にある。Ｌ３９は、サブユニットにおいて、３次元構造を欠失する唯一のタンパク質であり、一方、Ｌ３７ｅは、ＮＨ₂末端伸長およびＣＯＯＨ末端伸長の両方を有する。Ｌ１９は、ＲＮＡを通って縫うように進む伸長配列によって結合したサブユニットの表面上に、２つの球状ドメインを有する点で独特である。Ｌ３９（緑色）の末端は、実際にはトンネルに入っており、一方、Ｌ３７ｅ（赤色）は、完全にＲＮＡに取り囲まれている。図８（Ｂ）は、ペプチジルトランスフェラーゼ部位（ＣＣｄＡ−ｐ−ピューロマイシン分子によって特徴付けられる）に向かって、２３Ｓ ｒＲＮＡの塊を通って到達するＬ２およびＬ３の非球状伸長を示す。図８（Ｃ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡのすべての６つのドメインの一部分と相互作用するＬ２２を示す。図８（Ｄ）は、タンパク質（赤色）と少なくともファンデルワールス接触を形成する配列の位置を示す２３Ｓ ｒＲＮＡの概略図を示す。図８（Ｅ）は、大リボソームサブユニットのタンパク質の立体図を示し、すべてのＲＮＡははぎ取られている。タンパク質は、視覚化のみの目的のために赤色で示す。図８（Ｆ）は、トンネルの出口の領域におけるサブユニットの断面図を示す。タンパク質Ｌ２２は、赤色でリボンとして示し、そしてエリトロマイシン耐性を与える変異の存在するβヘアピンループを橙色で示す。表面上の原子を灰色で示し、タンパク質原子を緑色で示し、そしてスライスの界面を青色で示す。
【図９】図９（Ａ）〜（Ｃ）は、リボソームペプチジルトランスフェラーゼの基質およびアナログの化学的構造を示す。特に、図９（Ａ）は、ペプチド結合形成の間に生成された四面体炭素中間体を示す；この四面体炭素を、矢印で示す。図９（Ｂ）は、リン酸基（ＣＣｄＡ−ｐ−Ｐｕｒｏ）を介して、ピューロマイシンのＯ−メチルチロシン残基のアミノ基へのＣＣｄＡの３’ＯＨの結合によって形成される遷移状態のアナログを示す（Ｗｅｌｃｈら（１９９５）前出）。図９（Ｃ）は、Ａ部位を標的化するために構築されたアミノ−Ｎ−アシル化ミニヘリックスを示す。オリゴヌクレオチド配列の５’リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）
ＣＣＧＧＣＧＧＧＣＵＧＧＵＵＣＡＡＡＣＣＧＧＣＣＣＧＣＣＧＧＡＣＣ ３’（配列番号１）
ピューロマイシンは、１２塩基対を形成するはずである。この構築物は、Ｔｙｒ−ｔＲＮＡシンセターゼによるアミノアシル化に適した基質であるミニヘリックスに基づいた。Ｃ末端の３’ＯＨは、ホスホジエステル結合によって、ピューロマイシンのＮ６−ジメチルＡ部分の５’ＯＨに結合する。
【図１０】図１０（Ａ）〜（Ｃ）は、３．２Åの分解能での、実験的に位相を等しくした（ｐｈａｓｅｄ）基質アナログ複合体の電子密度地図を示し、モデルを重ね合わせる（酸素は赤；リンは紫；窒素は青；ならびにｒＲＮＡの炭素は緑および基質の炭素は黄色）。特に、図１０（Ａ）は、Ｆ₀（複合体）−Ｆ₀（親）の差電子密度地図を示し、ＣＣｄＡ−ｐ−Ｐｕｒｏの骨格モデルを重ね合わせる。図１０（Ｂ）は、活性部位領域のＣＣｄＡ−ｐ−Ｐｕｒｏの２Ｆ₀（複合体）−Ｆ₀（親）の電子密度地図を示し、リボソームおよびインヒビターの構造を重ね合わせ、これは、Ａ２４８６（２４５１）のＮ３の、リン酸エステル（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）に対する近似を示し、この複合体において、酸素は架橋されない。図１０（Ｃ）は、ｔＲＮＡアクセプターのステム（ｓｔｅｍ）アナログのＦ₀（複合体）−Ｆ₀（親）の差電子密度地図を示し、ＣＣｐｕｒｏの骨格モデルを重ね合わせる。Ｃ７４のリボースおよびリン酸エステルの密度のみ存在し、そして残りのＲＮＡヘアピンの密度は存在しない。
【図１１】図１１（Ａ）および（Ｂ）は、Ａ部位に結合したミニヘリックスのＣＣＡ部分と、Ａ部位およびＰ部位に結合したＣＣｄＡ−ｐ−Ｐｕｒｏとを組み合わせたモデルを示し、図２にのように色分けする。特に、図１１（Ａ）は、Ｐ部位のＣ７４およびＣ７５と、２３Ｓ ｒＲＮＡのＰループとの間の塩基対形成相互作用を左に示し、そして２３Ｓ ｒＲＮＡのＡループを有するＡ部位のＣ７５を右に示す。触媒Ａ２４８６は、四面体中間体のオキシアニオン（ｏｘｙａｎｉｏｎ）のアナログであるリン酸エステル酸素（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｏｘｙｇｅｎ）（Ｐ）の近傍である。図１１（Ｂ）は、Ｎ３が非架橋リン酸エステル酸素に接近する２つのＣＣＡとＡ２４８６（緑）との間に横たわるＡ２６３７（すべて青）を示す。Ａ部位およびＰ部位のｔＲＮＡ由来のＡ７６塩基のＮ１原子は、それぞれＡループおよびＰループの両方で、リボースの２’ＯＨとほぼ等しい相互作用を形成し、そして約２回軸が、これらの残基に関連する。
【図１２】図１２は、回転した「頂部図」において活性部位のクレフトを見下ろす２３ＳｒＲＮＡおよび５Ｓ ｒＲＮＡ、タンパク質、ならびにＣＣｄＡ−ｐ−Ｐｕｒｏインヒビターの空間充填モデルを示す。塩基は白色で、糖リン酸（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）骨格は黄色である。インヒビターを赤色で示し、そして番号付けされたタンパク質を青色で示す。より低い分解能で位置確認されたＬ１およびＬ１１タンパク質は、青色の骨格である。中央の隆起を、ＣＰと標識する。
【図１３】図１３（Ａ）は、ループＡおよびＰ、ならびにペプチジルトランスフェラーゼループを含む残基の３次元分布の立体図を示す。図１３（Ｂ）は、トンネルの方向からのドメインＶの中央のループの立体図を示す。残基を、抗生物質耐性を与える変異に基づいて色分けする。図１３（Ｃ）は、ドメインＶ活性部位を示し、その中央のループを、二次構造として示す。
【図１４】図１４（Ａ）および（Ｂ）は、Ｙａｒｕｓインヒビター（ＣＣｄＡ−ｐ−Ｐｕｒｏ）のボール＆スティック（ｂａｌｌ ａｎｄ ｓｔｉｃｋ）モデルによって特徴付けられたペプチジルトランスフェラーゼ活性部位へのポリペプチドの最も近接した接近を示す。特に、図１４（Ａ）は、ドメインＶのＲＮＡ骨格を赤色で、そして塩基を灰色で示したコイル表示、および相互作用するすべての１３のタンパク質のリボン骨格表示を示す。図１４（Ｂ）は、活性部位のクローズアップ図を示し、ＲＮＡは取り除く。すべての原子表示において最も近接した側鎖を有するＹａｒｕｓアナログのリン酸エステルおよびインヒビターに伸長が最も近接するタンパク質をリボンで示す。最も近接したタンパク質原子と四面体炭素のリンアナログ（桃色）との間の距離（Å）を、モデル化されたペプチド（桃色）のままで示す。
【図１５】図１５は、ＣＣｄＡ−ｐ−Ｐｕｒｏを結合するペプチジルトランスフェラーゼ領域における保存ヌクレオチドおよび活性部位領域の空間充填表示を示し、Ｙａｒｕｓインヒビターが、活性部位のクレフトを見下ろす。すべての３つの界において９５％保存される（Ｇｕｔｅｌｌら（２０００）前出）２３Ｓ ｒＲＮＡヌクレオチドに属するすべての原子は赤色である。そしてすべての他のヌクレオチドは白色である；インヒビターは青色である。
【図１６】図１６（Ａ）〜（Ｃ）は、ペプチジルトランスフェラーゼ活性部位の触媒装置を示す。特に、図１６（Ａ）は、立体での触媒部位の領域における大サブユニットの実験的に２．４Åの分解能の電子密度地図（Ｂａｎら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：９０５−９２０）の立体図を示す。Ａ２４８６との相互作用に関与するＴＲＮＡの構造を重ね合わせる。残基Ｇ２１０２（２０６１）およびＧ２４８２（２４４７）は、近接するリン酸基と相互作用するＡ２４８６（２４５１）およびＧ２４８２のＮ６に水素結合される。図１６（Ｂ）は、骨格表示とともに破線の水素結合を示し、Ｇ２４８２、Ｇ２１０２、Ａ２４８６、およびＧ２４８２からＡ２４８６のＮ３への電荷リレーを生じると提唱される埋められたリン酸を示す。図１６（Ｃ）は、残基２４８５の埋められたリン酸によって安定化されると提唱されるＧ２４８２およびＡ２４８６の標準的なイミン互変体形態およびまれなイミン互変体形態を示す。
【図１７】図１７（Ａ）〜（Ｃ）は、リボソームによって触媒されるペプチド合成の提唱されたメカニズムを示す。特に、図１７（Ａ）は、ＮＨ₂が、ペプチジルｔＲＮＡのカルボニル炭素を攻撃する場合の、ＮＨ₂基からプロトンを抜き取るＡ２４８６のＮ３を示す。図１７（Ｂ）は、オキシアニオンへの水素結合によって、四面体炭素中間体を安定化するプロトン化されたＮ３を示す。図１７（Ｃ）は、新規に形成されたペプチドが脱アシル化された場合のＮ３からペプチジルｔＲＮＡの３’ＯＨへ転移されたプロトンを示す。
【図１８】図１８（Ａ）および（Ｂ）は、Ａ部位およびＰ部位に結合されたＣＣＡ上にドッキングされた（ｄｏｃｋｅｄ）Ｎｏｌｌｅｒらによる７０Ｓリボソームの構造において見出される配向と同じ相関的な配向での、５０Ｓリボソームサブユニットの空間充填表示と、３つのｔＲＮＡ分子を示す。特に、左手側に示された図１８（Ａ）は、回転された頂部図での全体のサブユニットを示し、ｒＲＮＡを黄色、タンパク質を桃色そしてｔＲＮＡを橙色で示す。右手側に示された図１８（Ｂ）は、クローズアップ図を示し、番号を付されたタンパク質を桃色、そしてｒＲＮＡを青色で示す。Ａ部位、Ｐ部位およびＥ部位の骨格のリボン表示を、それぞれ黄色、赤色および白色で示す。
【図１９】図１９（Ａ）〜（Ｆ）は、ポリペプチドの出口トンネルを示す。特に、図１９（Ａ）は、半分に切断したサブユニット、ほぼ二等分するその中央の隆起、および全体の長さに沿ったそのペプチドトンネルを示す。２つの半分は、本の頁のように開いている。すべてのリボソーム原子を、ＣＰＫ表示で示し、溶媒と接触しないすべてのＲＮＡ原子を白色で示し、そして溶媒と接触しないすべてのタンパク質原子を緑色で示す。タンパク質およびＲＮＡの両方の表面の原子を、炭素を黄色、酸素を赤色、そして窒素を青色で色分けする。トンネルを通過するポリペプチドの可能な軌道を、白色のリボンで示す。ペプチジルトランスフェラーゼ部位（ＰＴ）もまた示す。図１９（Ｂ）は、極性基および非極性基の分布（原子を図１９（Ａ）のように色付けする）、タンパク質Ｌ２２およびＬ４（ＰＴに近接する緑色の断片）によって形成されるトンネル内の狭搾、ならびにトンネルの比較的広い出口とともに、ポリペプチド出口トンネルの詳細を示す。図１９（Ｃ）は、ドメインによって色分けされたＲＮＡの骨格原子を有するトンネル表面を示す：ドメインＩ（白色）、ＩＩ（水色）、ＩＩＩ（金色）、ＩＶ（緑色）、Ｖ（橙色）、５Ｓ（桃色）およびタンパク質（青色）で示す。ペプチジルトランスフェラーゼの中央部（ＰＴＣ）を示す。図１９（Ｄ）は、トンネルの出口での大サブユニット表面の空間充填表示であり、タンパク質の配置を示し、このうちのいくつかは、タンパク質の分泌における役割を果たし得る。ＲＮＡは白色（塩基）および黄色（骨格）であり、そして数を付されたタンパク質は、青色である。モデル化されたポリペプチドは、赤色でトンネルを出ていく。図１９（Ｅ）は、出口トンネルの半分のクローズアップ図を示し、タンパク質Ｌ４（黄色）およびＬ２２（青色）とのペプチジルトランスフェラーゼの中央部（ＰＴＣ）の関係を示す。Ｙａｒｕｓインヒビターおよびモデル化されたペプチドは紫色であり、そして２３Ｓ ｒＲＮＡは赤色および白色である。図１９（Ｆ）は、２３Ｓ ｒＲＮＡの概要の二次構造を示し、トンネルと接触する配列を赤色で同定する。
【図２０】図２０は、大リボソームサブユニットに結合した抗生物質アニソマイシン間の空間的関係を示す図である。
【図２１】図２１は、大リボソームサブユニットに結合した抗生物質ブラスチシジン間の空間的関係を示す図である。
【図２２】図２２は、大リボソームサブユニットに結合した抗生物質カルボマイシンおよびチロシン間の空間的関係を示す図である。
【図２３】図２３は、大リボソームサブユニットに結合した抗生物質スパルソマイシン間の空間的関係を示す図である。
【図２４】図２４は、大リボソームサブユニットに結合した抗生物質ヴァージニアマイシン（ストレプトグラミン（ｓｔｒｅｐｔｏｇｒａｍｉｎ）Ａ）およびカルボマイシン間の空間的関係を示す図である。
【図２５】図２５は、大リボソームサブユニットに結合した特定の抗生物質、すなわち、アニソマイシン、ブラスチシジン、カルボマイシンおよびヴァージニアマイシンの空間的関係を示す図である。結合した抗生物質の位置を、リボソームのＡ部位、Ｐ部位およびポリペプチド出口トンネルに関して示す。
【図２６】図２６（Ａ）〜（Ｃ）は、大リボソームサブユニット内に配置されたペプチジルトランスフェラーゼ部位を示す図である。図２６（Ａ）は、結合したチロシン分子を示し、そして二糖結合ポケットならびに「キャビティ１」および「キャビティ２」と示された２つのキャビティを同定する。図２６（Ｂ）および（Ｃ）は、読み手が、大リボソームサブユニットにおけるペプチジルトランスフェラーゼ部位（ＰＴ）およびポリペプチド出口トンネルの位置に向くように、左手側に提供する。
【図２７】図２７は、リボソームサブユニットの分子モデリングに有用なコンピュータシステムおよび／または合理的な薬物設計を行うためのコンピュータシステムの概略図である。
【図２８】図２８は、大リボソームサブユニットにおける特定の可能性のある薬物標的部位の概略図である。
【図２９】図２９（Ａ）〜（Ｄ）は、Ｅ．ｃｏｌｉとラットの間で保存された（赤色）か、または保存されていない（青色）ポリペプチド出口トンネルの壁の内部の残基を示す図である。リボソームサブユニットは、ポリペプチド出口トンネルを切り取られ、ポリペプチド出口トンネルの半分を図２９（Ａ）に示し、そしてポリペプチド出口トンネルの他の半分を図２９（Ｂ）に示す。図２９（Ｃ）は、全体としてのリボソームサブユニットに関して、図２９（Ａ）において示されるリボソームサブユニットの一部分の位置を示すように読み手を向かせるために提供する。図２９（Ｄ）は、全体としてのリボソームサブユニットに関して、図２９（Ｂ）において示されるリボソームサブユニットの一部分の位置を示すように読み手を向かせるために提供する。

Claims (7)

1. Ｈａｌｏａｒｃｕｌａ ｍａｒｉｓｍｏｒｔｕｉから得られる５０Ｓリボソームサブユニットの結晶の実質的に純粋な調製物であって、該結晶が（ｉ）双晶でなく、（ii）１５μｍを超える平均の厚さを有し、かつ（iii）４．５Åの分解能を有する電子密度地図を作製できるものである調製物。
2. 前記調製物中の結晶が少なくとも３．０Åの分解能を有する電子密度地図を作製できるものである、請求項１に記載の調製物。
3. 前記調製物中の結晶が少なくとも２．４Åの分解能を有する電子密度地図を作製できるものである、請求項２に記載の調製物。
4. 請求項１または２に記載の調製物から収集される結晶であって、少なくとも２．４Åの分解能までＸ線を回折し、該結晶がＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ＢａｎｋにＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された複数の原子座標によって特徴付けられる原子構造を含む、結晶。
5. 請求項１または２に記載の調製物から収集される結晶であって、少なくとも２．４Åの分解能までＸ線を回折し、該結晶が表５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１７に記載された複数の残基によって特徴付けられる原子構造を含む、結晶。
6. ５０Ｓリボソームサブユニットの結晶であって、該結晶がＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ＢａｎｋにＰＤＢ ＩＤ：１ＦＦＫの登録番号の下で登録された複数の原子座標によって特徴付けられる原子構造を含む、結晶。
7. ５０Ｓリボソームサブユニットの結晶であって、該結晶がＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ ＢａｎｋにＰＤＢ ＩＤ：１ＪＪ２の登録番号の下で登録された原子座標によって特徴付けられる原子構造を含む、結晶。

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