DE60119853T2

DE60119853T2 - Kristallstruktur von Ribosomen und Proteinsynthese-Inhibitoren

Info

Publication number: DE60119853T2
Application number: DE60119853T
Authority: DE
Inventors: Thomas A Branford Steitz; Peter B. New Haven Moore; Nenad Ban; Poul Nissen; Jeffrey New Haven Hansen
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 2000-08-09
Filing date: 2001-08-09
Publication date: 2007-05-10
Anticipated expiration: 2021-08-10
Also published as: EP1188769A8; US20020086308A1; DE01306825T1; US20050234227A1; US20100131258A1; IL144830A0; JP3836702B2; AU768033B2; DE60119853D1; EP1188769B1; US6947844B2; AU5784601A; ATE327250T1; JP2003212896A; CA2354051A1; EP1188769A2; EP1188769A3

Description

Verwandte Anmeldungen
Diese Anmeldung ist eine Fortführung in Teilen der U.S. Anmeldung Nr. 09/635,708, eingereicht am 9. August 2000, und beansprucht die Ableitung aus (i) vorläufiger U.S. Anmeldung Nr. 60/223,977, eingereicht am 9. August 2000, (ii) vorläufiger U.S. Anmeldung Nr. [Anwaltliche Referenznr. RIB-002PR], mit dem Titel „Der Kink-Turn: ein neues RNA Sekundärstruktur Motiv", eingereicht am 20. Juli 2001, und (iii) vorläufiger U.S. Anmelde Nr. [Anwaltliche Referenznr RIB-002PR2], mit dem Titel „Der Kink-Turn eine neue RNA", eingereicht am 1. August 2001, die Offenbarungen jedes der vorstehenden Dokumente wird hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
Regierungslizenzrechte
Bestimmte hier beschriebene Arbeiten wurden zum Teil gefördert durch Bundesfördermittel Nr. NIH-GM22778 und NIH-GM54216, vergeben durch die „National Institutes of Health". Die Regierung kann bestimmte Rechte an der Erfindung besitzen.
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf das Gebiet der Proteinbiosynthese und auf Modulatoren, zum Beispiel, Inhibitoren der Proteinbiosynthese. Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf Verfahren und Zusammensetzungen zum Aufklären von der dreidimensionalen Struktur der großen Ribosomenuntereinheit, entweder alleine oder in Kombination mit einem Pxoteinsyntheseinhibitor; die dreidimensionale Struktur der großen ribosomalen Untereinheit, entweder alleine oder in Kombination mit einem Proteinsyntheseinhibitor; die Verwendung solcher Strukturen für die Konstruktion und Testung neuer Proteinsyntheseinhibitoren; und neue Proteinsyntheseinhibitoren.
Hintergrund
I. Ribosomen: Struktur, Funktion und Zusammensetzung
Ribosomen sind Ribonukleoproteine, die sowohl in Prokaryoten als auch in Eukaryoten vorhanden sind. Sie umfassen ungefähr zwei Drittel RNA und ein Drittel Protein. Ribosomen sind die zellulären Organellen, die verantwortlich für die Proteinsynthese sind. Während der Genexpression translatieren die Ribosomen die genetische Information, die die in einer Boten RNA kodiert ist, in Protein (Garret et al. (2000) „The Ribosome: Structure, Function, Antibiotics and Cellular Interactions" American Society for Microbiology, Washington D.C.).
Ribosomen umfassen zwei nichtäquivalente Ribonukleoprotein Untereinheiten. Die größere Untereinheit (auch bekannt als die „große ribosomale Untereinheit") hat ungefähr die zweifache Größe der kleineren Untereinheit (auch bekannt als die „kleine ribosomale Untereinheit"). Die kleine ribosomale Untereinheit bindet Boten RNA (mRNA) und vermittelt die Wechselwirkungen zwischen mRNA und Transfer RNA (tRNA) Antikodons, von der die Zuverlässigkeit der Translation abhängt. Die große ribosomale Untereinheit katalysiert die Bildung der Peptidbindung – die Peptidyl Transferase Reaktion der Proteinsynthese – und schließt (wenigstens) zwei verschiedene tRNA Bindungsstellen ein: die A-Stelle, die die hinein kommende Aminoacyl-tRNA aufnimmt, die ihre Aminosäure zu der wachsenden Peptidkette beiträgt, und die P-Stelle, die den Peptidyl-tRNA Komplex aufnimmt, d.h. die tRNA, die mit all den Aminosäuren verbunden ist, die bis dahin zu der Peptidkette hinzugefügt wurden. Die große ribosomale Untereinheit schließt auch ein oder mehrere Bindungsstellen für G-Protein Faktoren ein, die bei der Initiierungs-, Elongations- und Terminationsphasen der Proteinsynthese assistieren. Die großen und kleinen ribosomalen Untereinheiten verhalten sich während der Initiationsphase der Proteinsynthese unabhängig; jedoch setzen sie sich zu vollständigen Ribosomen zusammen, unmittelbar bevor die Elongation beginnt.
Das Molekulargewicht des prokaryotischen Ribosoms beträgt ungefähr 2.6 × 10⁶ Dalton. In Prokaryoten enthält die kleine ribosomale Untereinheit eine 16S (Svedberg Einheiten) ribosomale RNA (rRNA) mit einem Molekulargewicht von ungefähr 5.0 × 10⁵ Dalton. Die große ribosomale Untereinheit enthält eine 23S rRNA mit einem Molekulargewicht von ungefähr 1.0 × 10⁶ Dalton und eine 5S rRNA mit einem Molekulargewicht von ungefähr 4.0 × 10⁵ Dalton. Die prokaryotische kleine Untereinheit enthält ungefähr 20 verschiedene Proteine und ihre große Untereinheit enthält ungefähr 35 Proteine. Die großen und kleinen ribosomalen Untereinheiten bilden zusammen ein 70S Ribosom in Prokaryroten.
Eukaryotische Ribosomen sind im Allgemeinen größer als ihre prokaryotischen Gegenstücke. In Eurkaryoten bilden die großen und kleinen Untereinheiten zusammen ein 80S Ribosom. Die kleine Untereinheit eines eurkaryotischen Ribosoms schließt eine einzelne 18S rRNA ein, während die große Untereinheit eine 5S rRNA, eine 5.8S rRNA und eine 28S rRNA einschließt. Die 5.8S rRNA ist strukturell verwandt mit dem 5' Ende der prokaryotischen 23S rRNA und die 28S rRNA ist strukturell verwandt mit dem Rest der prokaryotischen 23S rRNA (Moore (1998) Annu. Rev. Biophys. 27: 35-58). Eukaryotische ribosomale Proteine sind den prokaryotischen ribosomalen Proteinen qualitativ ähnlich; jedoch sind die eukaryotischen Protein größer und zahlreicher (Moore (1998) supra).
II. Strukturelle Konservierung der großen ribosomalen Untereinheit
Während die chemische Zusammensetzung der großen ribosomalen Untereinheiten von Spezies zu Spezies variiert, beweisen die Sequenzen ihrer Komponenten eindeutig, dass sie in Bezug auf die dreidimensionale Struktur ähnlich sind, in einer ähnlichen Weise funktionieren und evolutionär verwandt sind. Die evolutionären Implikationen der verfügbaren rRNA Sequenzdaten werden in den Artikeln von Woese und anderen in Teil II von Ribosomal RNA. Structure, Evolution, Processsing and Function in Protein Biosynthesis (Zimmermann und Dahlberg, Hrg.) (CRS Press, Boca Raton, FL, 1996) zusammengefasst. Der Artikel von Garret und Rodriguez-Fonseca in Teil IV des gleichen Bandes diskutiert das ungewöhnlich hohe Niveau der Sequenzkonservierung, die in der Perptidyl-Transferaseregion der großen ribosomalen Untereinheit beobachtet wird. Die Ribosomen von Archaeen Spezien wie Haloarcula marismortui ähneln denen, die von eubakteriellen Spezies wie E. coli erhalten wurden, in Hinsicht auf Größe und Komplexität. Die Proteine in H. marismortui Ribosomen sind jedoch mit den in Eukaryoten gefundenen Ribosomenproteinen enger verwandt (Wool et al. (1995) Biochem. Cell Biol. 73: 933-947).
III. Bestimmung der Struktur von Ribosomen
Viel von dem, was über Ribosomenstruktur bekannt ist, ist abgeleitet aus physikalischen und chemischen Verfahren, die Information mit relativ niedriger Auflösung produzieren. Elektronenmikoskopie (EM) hat zu einem Verständnis der Ribosomenstruktur beigetragen, schon seit dem das Ribosom entdeckt wurde. In den 1970ern enthüllte die EM mit niedriger Auflösung die Form und quaternäre Organisation des Ribosoms. Bis zum Ende der 1980er waren die Positionen der Oberflächenepitope all der Proteine in der E. coli kleinen Untereinheit, wie auch vieler der großen Untereinheit mit Immunelektron-Mikroskopietechniken kartiert worden (Oakes et al. (1986), Structure, Function and Genetics of Ribosomes, (Hardesty, B. und Kramer, G. Hrg.) Springer Verlag, New York, NY, S. 47-67; Stoeffler et al. (1986), Structure, Function and Genetics of Ribosomes, (Hardesty, B. und Kramer, G. Hrg.) Springer Verlag, New York, NY, S. 28-46). In den letzten paar Jahren haben Fortschritte in der Einzel-Partikel Kryo-EM und Bildrekonstruktion zu dreidimensionalen Rekonstruktionen des E. coli 70S Ribosoms und seiner Komplexe mit tRNAs und Elongationsfaktoren mit Auflösungen von 15 Å bis 25 Å geführt (Stark et al. (1995) Structure 3: 815-821; Stark et al. (1997) Nature 3898: 403-406; Agrawal et al. (1996) Science 271: 1000-1002; Stark et al. (1997) Cell 28: 19-28). Zusätzlich wurden drei-dimensionale EM-Bilder des Ribosoms bei so ausreichend hohen Auflösungen produziert, dass viele der Proteine und Nukleinsäuren, die bei der Proteinsynthese assistieren, an das Ribosom gebunden visualisiert werden können. Ein ungefähres Modell der RNA Struktur in der großen Untereinheit wurde konstruiert, um in eine elektronenmikroskopische Karte mit 7.5 Å Auflösung der 50S Untereinheit von E. coli und zu verfügbaren biochemischen Daten zu passen (Mueller et al. (2000) J. Mol. Biol. 298: 35-59).
Während die durch das EM gewährten Einblicke nützlich gewesen sind, ist schon lange erkannt worden, dass ein volles Verständnis der Ribosomenstruktux nur aus Röntgenstrahl Kristallographie abgeleitet würde. 1979 gewannen Yonath und Wittman die ersten potentiell nützlichen Kristalle von Ribosomen und ribosomalen Untereinheiten (Yonath et al. (1980) Biochem. Internat. 1: 428-435). In der Mitte der 1980er stellten Wissenschaftler Ribosomenkristalle für die Röntgenstrahl Kristallographie her (Maskowski et al. (1987) J. Mol. Biol. 193: 818-822). Die ersten Kristalle der 50S ribosomalen Untereinheit von H. marismortui wurden 1987 erhalten. 1991 wurden Verbesserungen der Auflösung der aus den Kristallen der 50S ribosomalen Untereinheit von H. marismortui erhältlichen Beugungsdaten berichtet (van Bohlen, K. (1991) J. Mol. Biol. 222: 11).
1995 wurden Elektronendichtekarten mit niedriger Auflösung für die großen und kleinen ribosomalen Untereinheiten aus halophilen und thermophilen Quellen berichtet (Schlunzen et al. (1995) Biochem. Cell Biol. 73: 739-749). Diese Elektronendichtekarten mit niedriger Auflösung erwiesen sich jedoch als falsch (Ban et al. (1998) Cell 93: 1105-1115).
Die erste Elektronendichtekarte des Ribosoms, die Merkmale zeigte, die als Duplex RNA erkennbar waren, war eine Röntgenstrahl Kristallographie Karte mit 9 Å Auflösung der großen Untereinheit aus Haloarcula marismortui (Ban et al. (1998) supra). Phasenextension dieser Karte zu einer 5 Å Auflösung machte es möglich zahlreiche Protein und Nukleinsäuresequenzen zu lokalisieren, deren Strukturen unabhängig bestimmt worden waren (Ban et al. (1999) Nature 400: 841-847).
Ungefähr zur gleichen Zeit wurde mit ähnlichen Kristallographie Strategien eine Karte mit einer 7.8 Å Auflösung des gesamten Thermus thermophilus Ribosoms erzeugt, die die Positionen von rRNA Molekülen gebunden an ihre A-, P- und E- (Proteinaustrittsstelle) Stellen zeigte (Cate et al. (1999) Science 285: 2095-2104), und eine Karte mit einer 5.5 Å Auflösung der 30S Untereinheit von T. thermophilus wurde gewonnen, die die Anpassung der gelösten Proteinstrukturen und die Interpretation einiger ihrer RNA Elemente ermöglichte (Clemons, Jr. et al. (1999) Nature 400: 833-840). Nachher wurde ein Karte mit einer 4.5 Å Auflösung der T. thermophilus 30S Untereinheit veröffentlicht, die zum Teil auf Phasen basierte, die aus einem Modell berechnet wurden, das zu 28% der Untereinheitenmasse entsprach, das mit einer experimentellen Karte mit einer 6 Å Auflösung erhalten wurde (Tocilj et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 14252-14257).
IV. Lokalisierung der Peptidyltransferase Stelle in der großen ribosomalen Untereinheit
Es war für ungefähr 35 Jahre bekannt, dass die für die Peptidbindungsbildung verantwortliche Peptidyltransferase Aktivität, die während Boten RNA getriebener Proteinsynthese vorkommt, der großen Ribosomenuntereinheit intrinsisch ist (Traut et al. (1964) J. Mol. Biol. 10: 63; Rychlik (1966) Biochem. Biophys. Acta 114: 425; Monro (1967) J. Mol. Biol. 26: 147-151; Maden et al. (1986) J. Mol. Biol. 35: 333-345) und es wurde sogar schon länger verstanden, dass das Ribosom sowohl Proteine als auch RNA enthält. In bestimmten Bakterienspezies enthält zum Beispiel die große ribosomale Untereinheit ungefähr 35 verschiedene Proteine und zwei RNAs (Noller (1984) Ann. Rev. Biochem. 53: 119-162; Wittmann-Liebold et al. (1990) The Ribosome: Structure, Function, and Evolution, (W.E. et al., Hrg.) American Society for Microbiology, Washingtion D.C (1990), S. 598-616). Diese Befunde führten zu drei verwandten Fragen. Welche der fast 40 makromolekularen Komponenten der großen ribosomalen Untereinheit ist Teil seiner Peptidyltransferase Stelle, wo ist diese Stelle in der großen Untereinheit lokalisiert, und wie funktioniert sie?
Bis 1980 wurde die Liste der Komponenten, die vielleicht Teil der Peptidyltransferase des Ribosoms ist, auf ungefähr ein halbes Dutzend Proteine und die 23S rRNA reduziert (siehe Cooperman (1980) Ribosomes: Structure, Function and Genetics, (G. Chambilss et al., Hrg.) University Park Press, Baltimore, MD (1980), 531-554), und nach der Entdeckung von katalytischen RNAs (Guerrier-Takada et al. (1983) Cell 35: 849-857; Kruger et al. (1982) Cell 31: 147-157), begann die These Zuspruch zu gewinnen, dass die 23S rRNA ihr einziger Bestandteil sein könnte, die Jahre zuvor aufgestellt wurde. 1984 veröffentlichten Noller und Kollegen Affinitätmarkierungsergebnisse, die zeigten, dass U2619 und U2620 (in E. coli: U2584, U2585) unmittelbar neben dem CCA Ende der P-Stellen gebundenen tRNA liegen (Barta et al. (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81: 3607-3611; Vester et al. (1988) EMBO J. 7: 3577-3587). Diese Nukleotide scheinen Teil eines hoch-konservierten internen Loops in dem Zentrum der Domäne V der 23S rRNA zu sein. Die Hypothese, dass dieser Loop eng in die Peptidyltransferase Aktivität involviert ist, wurde durch die Beobachtung gestützt, dass Mutationen in diesem Loop Zellen resistent gegenüber vielen Inhibitoren der Peptidyltransferase Aktivität machen, und Belege, die diesen in dieser Aktivität implizieren, haben sich weiter angehäuft (siehe Noller (1991) Ann. Rev. Biochem. 60: 191-227; Garret et al. (1996) Ribosomal RNA: Structure, Evolution, Processing and Function of Protein Biosynthesis, (R.A.. Zimmermann und A.E. Dahlberg, Hrg.) CRC Press, Boca Raton, FL (1996), S. 327-355).
Ein definitiver Beweis, dass der zentrale Loop in Domäne V die alleinige Komponente des Ribosoms ist, die bei der Peptidyltransferase Aktivität involviert ist, blieb jedoch aus. Studien haben gezeigt, dass es möglich war, Partikel herzustellen, die die Peptidyltransferase Aktivität beibehielten durch ansteigend stärkere Deproteinierungen der großen ribosomalen Untereinheiten, es war jedoch nicht möglich aktive Partikel herzustellen, die vollkommen Protein frei sind. Nichtsdestotrotz reduzierte diese Arbeit kombiniert mit früheren Rekonstitutionsergebnissen (Franceschi et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 6676-6682) die Zahl der Proteine, die vielleicht involviert sind, auf nur zwei: L2 und L3 (siehe Green et al. (1997) Annu. Rev. Biochem. 66: 679-716). Erst kürzlich berichteten Watanabe und Mitarbeiter Erfolg beim Hervorrufen von Peptidyltransferase Aktivität aus in vitro synthetisiertem Protein freier 23S rRNA (Nitta et al. (1998) RNA 4: 257-267), jedoch erscheinen ihre Beobachtungen weiterer Überprüfung nicht Stand gehalten zu haben. Somit blieb immer noch die Frage: ist das Ribosom ein Ribozym oder nicht?
Über die Jahre wurde die Lokalisierung der Peptidyltransferase Stelle in dem Ribosom fast ausschließlich über Elektronenmikroskopie angegangen. Mitte der 1980er begann sich Belege anzuhäufen, dass es einen Tunnel gibt, der durch die großen ribosomale Untereinheit aus der Mitte ihrer Untereinheiten Schnittstelle zu ihrer Rückseite verläuft (Milligan et al. (1986) Nature 319: 693-695; Yonath et al. (1987) Science 236: 813-816), und es gab sehr bedeutende Gründe anzunehmen, dass Polypeptide durch ihn gehen, wenn sie synthetisiert werden (Bernabeu et al. (1982) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 79: 3111-3115; Ryabo et al. (1988) FEBS Letters 226: 255-260; Beckmann et al. (1997) Science 278: 2123-2126). Kürzlich gemachte Kryo-EM Untersuchungen (Frank et al. (1995) Nature 376: 441-444; Frank et al. (1995) Biochem. Cell Biol. 73: 757-765; Stark et al. (1995) supra) bestätigten die Existenz des Tunnels und belegten, dass die CCA-Enden von Ribosomen gebundenen tRNAs gebunden an A- und P-Stellen in dem Untereinheiten-Schnittstellen-Ende des Tunnels gefunden werden. Konsequenterweise muss die Peptidyltransferase an der gleichen Position lokalisiert sein, die am Boden einer tiefen Furche in dem Zentrum der Untereinheiten Schnittstellenoberfläche der großen Untereinheit ist, unmittelbar unter ihrer zentralen Vorwölbung.
Die Substrate der Reaktion, die an der Peptidyltransferase Stelle der großen Untereinheit katalysiert werden, sind eine Aminoacyl-tRNA (aa-tRNA) und eine Peptidyl-tRNA. Die Erstere bindet in der A-Stelle des Ribosoms und die Letztere in seiner P-Stelle. Die Aminogruppe der aa-tRNA greift den Kohlenstoff des Carbonyls acylierend die 3' Hydroxylgruppe der Peptidyl-tRNA an und ein tetrahedrisches Intermediat wird an dem Carbonyl Kohlenstoff gebildet. Das tetrahedrische Intermediat löst sich auf, um ein Peptid zu ergeben, das um eine Aminosäure verlängert wurde, verestert mit der A-Stellen gebundenen t-RNA und eine deacylierte tRNA in der P-Stelle.
Dieses Reaktionsschema wird durch die Beobachtungen von Yarus und Kollegen gestützt, die ein Analog des tetrahedrischen Intermediats synthetisierten durch Verbinden eines Oligonnukleotids mit der Sequenz CCdA mit Puromycin über eine Phosphoramid Gruppe (Welch et al. (1995) Biochemistry 34: 385-390). Die Sequenz CCA, die die 3' terminale Sequenz aller tRNAs ist, bindet an die große Untereinheit durch sich selbst, konsistent mit den biochemischen Daten, die zeigen, dass die Wechselwirkungen zwischen tRNAs und der großen Untereinheit größtenteils von ihren CCA Sequenzen abhängen (Moazed et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3725-3728). Puromycin ist ein aa-tRNA Analog, die mit der ribosomalen A-Stelle wechselwirkt, und die Phosphoramid Gruppe der Verbindung imitiert das tetrahedrische Kohlenstoff Intermediat. Dieses Übergangsstadium Analog, CCdA-Phosphat-Puromycin (CCdA-p-Puro), bindet stark an das Ribosom, und hemmt seine Peptidyltransferase Aktivität (Welch et al. (1995) supra).
V. Strukturbestimmung von Makromolekülen mit Röntgenstrahl Kristallographie
Um besser Arbeiten zu beschreiben, die unternommen wurden, um die Struktur von Ribosomen zu bestimmen, wird im Folgenden ein Überblick über Röntgenstrahl Kristallographie gegeben.
Jedes Atom in einem Kristall streut Röntgenstrahlen in alle Richtungen, aber kristalline Beugung wird nur beobachtet, wenn ein Kristall so relativ gegenüber dem Röntgenstrahl ausgerichtet ist, dass die atomare Streuung konstruktiv interferiert. Die Orientierungen, die zur Brechung führen, können berechnet werden, wenn die Wellenlänge der verwendeten Röntgenstrahlen und die Symmetrie und die Dimensionen der Einheitszelle des Kristalls bekannt sind (Blundell et al. (1976) Protein Crystallography (Molecular Biology Series), Academic Press, London). Das Ergebnis ist, dass, wenn ein Detektor hinter einem Kristall platziert wird, der mit monochromatischem Röntgenstrahlen einer geeigneten Wellenlänge bestrahlt wird, das aufgezeichnete Brechungsmuster aus Punkten bestehen wird, wobei jeder Punkt eine der Orientierungen darstellt, die die konstruktive Interferenz verursachen.
Jeder Punkt in solch einem Muster, wie auch immer er aufgezeichnet wird, ist charakterisiert durch (i) eine Intensität (oft als seine Schwärze bezeichnet); (ii) eine Koordinate, die die Information über die Beugungsorientierung kodiert; und (iii) eine Phase. Wenn all diese Dinge über jeden einzigen Punkt eines Kristall Beugungsmusters bekannt sind, kann die Verteilung der Elektronen in der Einheitszelle des Kristalls über Fourier Transformation berechnet werden (Blundell et al. (1976) supra), und aus dieser Verteilung oder Elektronendichtekarte können Atom Positionen bestimmt werden.
Leider kann die Phaseninformation, die essentiell für das Berechnen der Elektronenverteilungen ist, nicht direkt aus den Brechungsmustern gemessen werden. Eines der routinemäßig verwendeten Verfahren um die Phasen von Makromolekülen, wie Proteinen oder Nukleinsäuren, zu bestimmen, wird mutiple isomorphe Ersetzung (MIR) genannt, das die Einführung neuer Röntgenstrahl Streuer in die Einheitszelle des Kristalls involviert. Typischerweise sind diese Hinzufügungen Schweratome, die ein beträchtlichen Beitrag zu dem Beugungsmuster beisteuern. Es ist wichtig, dass die Hinzufügungen in ausreichend niedriger Zahl vorhanden sind, so dass ihre Positionen lokalisiert werden können und sie die Struktur des Moleküls oder der Kristallzelle unverändert lassen, d.h., die Kristalle sollten isomorph seien. Isomorphe Ersetzung wird gewöhnlich durchgeführt, indem man verschiedene Schwermetall Komplexe in die Kanäle der vorgefertigten Proteinkristalle diffundieren lässt. Makromoleküle exponieren Seitenketten (wie SH Gruppen) in diese Lösungsmittelkanäle, die in der Lage sind Schwermetalle zu binden. Es ist auch möglich endogene Leichtmetalle in Metalloproteinen mit schwereren zu ersetzen, z.B., Zink mit Quecksilber, oder Kalzium mit Samarium. Alternativ kann das isomorphe Derivat erhalten werden, indem ein Schwermetall kovalent an das Makromolekül in Lösung angebracht wird, und es dann Kristallisierungsbedingungen ausgesetzt wird.
Schwermetallatome, die routinemäßig für die die isomorphe Ersetzung verwendet werden, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Quecksilber, Uran, Platin, Gold, Blei und Selen. Spezifische Beispiele schließen ein Quecksilberchlorid, Ethyl-Quecksilberphosphat, und Osmium-pentamin, Iridium-pentamin. Da solche Schwermetalle viel mehr Elektronen enthalten als die leichten Atome (H, N, C, O und S) des Proteins, streuen die Schwermetalle stärker Röntgenstrahlen. Alle gebeugten Strahlen würden daher an Intensität zunehmen nach Schwermetall Substitution, wenn alle Interferenzen positiv wären. Tatsächlich sind aber einige Interferenzen negativ; konsequenterweise nehmen nach Schwermetall Substitution einige Punkte an Intensität zu, andere ab, und viele zeigen keinen nachweisbaren Unterschied.
Phasendifferenzen zwischen Beugungspunkten können bestimmt werden aus Intensitätsänderungen nach Schwermetall Substitution. Zuerst werden die Intenstitätsdifferenzen verwendet, um die Positionen der Schweratome in der Kristall Einheitszelle abzuleiten. Fourier Summierungen dieser Intenstitätsdifferenzen ergibt Karten der Vektoren zwischen den Schweratomen, die so genannten Patterson Karten. Aus diesen Vektor Karten wird die atomare Anordnung der Schweratome abgeleitet. Aus den Positionen der Schwermetalle in der Einheitszelle werden die Amplituden und Phasen ihres Beitrages zu den gebeugten Strahlen der Proteinkristalle enthaltend die Schweratome berechnet.
Diese Wissen wird dann verwendet, um die Phase des Beitrags des Proteins in der Abwesenheit der Schwermetallatome zu finden. Da sowohl die Phase und die Amplitude der Schwermetalle und die Amplitude des Proteins alleine bekannt sind, wie auch die Amplitude des Proteins plus Schwermetalle (d.h. Protein Schwermetall Komplex), sind eine Phase und drei Amplituden bekannt. Daraus kann die Interferenz der Röntgenstrahlen, die durch die Schweratome und das Protein gestreut werden berechnet werden, um zu bestimmen, ob die Interferenz konstruktiv oder destruktiv ist. Das Ausmaß von positiver und negativer Interferenz zusammen mit dem Wissen um die Phase des Schwermetalls erlaubt eine Abschätzung der Phase des Proteins. Da zwei verschiedene Phasenwinkel bestimmt werden und gleich gute Lösungen sind, kann ein zweiter Schwermetallkomplex verwendet, der auch zwei mögliche Phasenwinkel ergibt. Nur einer von diesen wird den gleichen Wert haben, wie einer der zwei vorherigen Phasenwinkel; er stellt daher den korrekten Phasenwinkel dar. In der Praxis werden mehr als zwei verschiedene Schwermetallkomplexe für gewöhnlich gemacht, um eine vernünftig gute Abschätzung der Phase für alle Reflektionen zu machen. Jede individuelle Phasenabschätzung enthält experimentelle Fehler, die aus Fehlern in den gemessenen Amplituden herrühren. Weiterhin sind für viele Reflektionen die Intensitätsdifferenzen zu klein, um nach einer speziellen isomorphen Ersetzung gemessen zu werden, und andere können versucht werden.
Die Amplituden und die Phasen der Beugungsdaten des Proteinkristalls werden verwendet, um eine Elektronendichtekarte der sich wiederholenden Einheit des Kristall zu berechnen. Diese Karte wird dann interpretiert, die Reste des interessierenden Moleküls aufzunehmen. Diese Interpretation wird durch zahlreiche Beschränkungen der Daten komplexer gemacht. Zuerst enthält die Karte selbst Fehler, hauptsächlich wegen der Fehler in den Phasenwinkeln. Zusätzlich hängt die Qualität der Karte von der Auflösung der Beugungsdaten ab, die ihrerseits davon abhängt, wie wohl geordnet die Kristalle sind. Dies beeinflusst direkt die Qualität der Karte, die produziert werden kann. Die Auflösung wird in Angstrom Einheiten (Å) gemessen; je kleiner diese Zahl ist, desto höher ist die Auflösung und desto größer ist die Detailfülle, die gesehen werden kann.
Das Erstellen des anfänglichen Modells ist ein Versuchs-und-Irrtums Prozess. Zuerst muss man sich entscheiden, wie eine Polypeptidkette oder Nukleinsäure sich ihren Weg durch die Elektronendichtekarte nimmt. Die resultierende Kettenspur stellt eine Hypothese dar, durch die man versucht die Dichte von Seitenketten mit der bekannten Sequenz des Polypeptids und der Nukleinsäure in Einklang zu bringen. Wenn eine vernünftige Kettenspur schließlich erhalten wurde, wird ein erstes Modell gebaut, das die Atome des Moleküls in die Elektronendichte einpasst. Computergraphiken werden sowohl für das Spurenziehen der Kette als auch für das Erstellen des Modells verwendet, um die Daten darzustellen und die Modelle zu manipulieren.
Das erste Modell wird einige Fehler enthalten. Falls die Kristalle zu ausreichend hoher Auflösung beugen (z.B. besser als 3.5 Å), können die meisten oder im Wesentlichen alle Fehler durch kristallographische Verfeinerung des Modells mittels Computer Algorithmen entfernt werden. In diesem Prozess wird das Modell verändert, um den Unterschied zwischen den experimentell beobachteten Beugungsamplituden und denen, die für einen hypothetischen Kristall berechnet wurden, der dieses Modell (statt des realen Moleküls) enthält, zu minimieren. Der Unterschied wird als ein R Faktor (restliche Abweichung) ausgedrückt, der 0.0 für exakte Übereinstimmung und ungefähr 0.59 für vollkommene Abweichung ist.
Im Allgemeinen liegt der R Faktor für eine gut bestimmte makromolekulare Struktur vorzugsweise zwischen 0.15 und 0.35 (so wie weniger als ungefähr 0.24-0.28). Der restliche Unterschied ist eine Folge von Fehlern und Nichtvollkommenheiten der Daten. Diese leiten sich aus zahlreichen Quellen ab einschließlich kleiner Variationen der Konformation der Proteinmoleküle, wie auch nicht korrekter Korrekturen sowohl in Hinblick auf das Vorhandensein von Lösungsmittel als auch in Hinblick auf Unterschiede der Orientierung der Mikrokristalle, aus denen der Kristall gebaut ist. Das bedeutet, dass das finale Modell ein Durchschnitt von Molekülen darstellt, die sowohl in Hinblick auf Konformation als auch Orientierung leicht unterschiedlich sind.
In verfeinerten Strukturen bei hoher Auflösung gibt es für gewöhnlich keinen großen Fehler in der Orientierung der individuellen Reste, und die geschätzten Fehler der Atom Positionen beträgt für gewöhnlich 0.1-0.2 Å, unter der Vorraussetzung, dass die Sequenz des Proteins oder der Nukleinsäure bekannt ist. Wasserstoff Brückenbindungen können, sowohl innerhalb des interessierenden Moleküls als auch gebunden an Liganden, mit einem hohem Grad der Zuverlässigkeit identifiziert werden.
Typischerweise können Röntgenstrahlen Strukturen bestimmt werden, falls die Auflösung besser als 3.5 Å ist. Elektronendichtekarten werden interpretiert durch Einpassen der bekannten Aminosäuren und/oder Nukleinsäure Sequenzen in die Elektronendichteregionen.
VI. Der Bedarf für eine höhere Auflösung der 50S ribosomalen Untereinheit
Obwohl die Technik Kristalle der 50S ribosomalen Untereinheit, und Röntgenstrahlen kristallographische Karten mit 9 Å und 5 Å Auflösung der Struktur des 50S Ribosoms bereitstellt, sind die Kristalle des Standes der Technik und die Röntgenstrahlen Beugungsdaten nicht ausreichend, um die drei-dimensionalen Strukturen aller 31 Proteine und 3043 Nukleotide der 50S ribosomalen Untereinheit zu etablieren. Somit sind die Kristalle und Kartierungen aus dem Stand der Technik inadäquat für die Struktur basierte Konstruktion der aktiven Agenzien, wie Herbiziden, Wirkstoffen, Insektiziden und tierischen Giften.
Insbesondere, sind Röntgenstrahlen kristallographische Kartierungen mit höherer Auflösung notwendig, um die Lokalisierung und dreidimensionale Struktur von Proteinen und Nukleotiden in Ribosomen und ribosomalen Untereinheiten zu bestimmien, insbesondere der 50S ribosomalen Untereinheit. Eine zutreffende molekulare Struktur der 50S ribosomalen Untereinheit wird nicht nur die weitere Untersuchung und das weitere Verständnis des Mechanismus der Proteinsynthese ermöglichen, sondern auch die Entwicklung wirksamer therapeutischer Agenzien und Wirkstoffe, die die Proteinsynthese modulieren (z.B. induzieren oder hemmen).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert, zum Teil, auf der Bestimmung einer atomaren Struktur mit hoher Auflösung einer ribosomalen Untereinheit, genauer, einer großen Untereinheit eines Ribosoms. Die Struktur mit hoher Auflösung wurde bestimmt für eine große ribosomale Untereinheit vorhanden in dem Organismus Haloarcula marismortui. jedoch kann angesichts des hohen Niveaus der Sequenz und strukturellen Homologie zwischen den Ribosomen von Organismen in verschiedenen Reichen die hier offenbarte strukturelle Information verwendet werden, um mittels von Routinetechniken strukturelle Modelle mit hoher Auflösung der großen ribosomalen Untereinheiten für jeden interessierenden Organismus herzustellen.
Obgleich es eine signifikante Homologie zwischen Ribosomen verschiedener Organismen gibt, zum Beispiel, zwischen Ribosomen von Menschen und bestimmten humanen Pathogenen, gibt es noch Unterschiede, die therapeutisch ausgenutzt werden können. Zum Beispiel zielen viele klinische und kommerziell signifikante Proteinsyntheseinhibitoren, zum Beispiel, Antibiotika wie Streptomycin, Tetracyclin, Chloramphenicol und Erythromycin selektiv auf bakterielle Ribosomen und unterbrechen die bakterielle Proteinsynthese, zielen aber gleichzeitig nicht auf oder beeinflussen nicht auf andere Weise signifikant die humane Ribosomenfunktion. Folglich erwiesen sich über die Jahre Antibiotika als unschätzbar für die Behandlung von mikrobiellen Infektionen beim Menschen. Jedoch gibt es immer noch einen anhaltenden Bedarf für neue Proteinsyntheseinhibitoren, besonders wegen der Entwicklung von pathogenen Stämmen, die resistent sind gegenüber bekannten Antibiotika. Die hier bereitgestellte Information erlaubt Einblicke in die Konstruktion neuer Proteinsyntheseinhibitoren.
Die Erfindung stellt Verfahren und Zusammensetzungen zur Verfügung zum Aufklären in hoher Auflösung der drei-dimensionale Struktur einer interessierenden ribosomalen Untereinheit. Computer Systeme enthaltend atomare Koordinaten werden auch beschrieben, die wenigstens einen Teil der drei-dimensionalen Struktur eines Ribosoms definieren, genauer, einer großen ribosomalen Untereinheit. Zusätzlich werden Verfahren zur Verwendung der atomaren Koordinaten beschrieben, um neue Moleküle zu identifizieren, die selektiv Ribosomen binden können, und die vorzugsweise als selektive Inhibitoren der Proteinsynthese funktionieren. Zusätzlich werden neue Familien von Proteinsyntheseinhibitoren beschrieben.
In einem ersten Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein im Wesentlichen reines Präparat von Kristallen einer großen ribosomalen Untereinheit aus Haloarcula marismortui, in welcher die Kristalle (i) unverzwillingt sind, (ii) ein mittlere Dicke größer etwa 15 μm aufweisen und (iii) Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von mindestens 5 Å beugen und wahlweise ferner ein darin angeordneten Liganden umfassen. Bevorzugte Merkmale des Präparats sind in den Ansprüchen 2 bis 16 zitiert.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zum Züchten des Präparats, das Verfahren umfassend die Schritte:

(a) Isolierung einer großen ribosomalen Untereinheit;
(b) Fällung der großen ribosomalen Untereinheit;
(c) Rückextraktion der gefällten großen ribosomalen Untereinheiten, um eine Lösung zu erhalten;
(d) Ansetzen der rückextrahierten Lösung;
(e) Züchten der Kristalle in der angesetzten Lösung mittels Dampfdiffusion bei Zimmertemperatur; und
(f) Einsammeln der Kristalle. Bevorzugte Merkmale des Verfahrens sind in den Ansprüchen 18 bis 20 zitiert.

In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Gewinnung von Röntgenbeugungsdaten für eine große ribosomale Untereinheit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

(a) Gewinnung eines Kristalls aus dem Präparat; und
(b) Einsatz der Röntgenstrahlen Kristallographie zur Gewinnung von Röntgenstrahlen Beugungsdaten für den Kristall. Bevorzugte Merkmale des Verfahrens sind in den Ansprüchen 22 bis 26 zitiert.

In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Identifikation eines ausgewählten Moleküls umfassend die Schritte:

(a) Beschaffen eines Molekülmodells von einem ribofunktionellen Lokus einer großen Untereinheit eines Ribosoms, wobei das Molekülmodell des ribofunktionellen Lokus (i) aus den bei der Protein Data Bank unter der Accession Number PDB ID: 1JJ2 hinterlegten Atomkoordinaten erstellt wird; oder (ii) aus einem molecularen Modelieren mit den bei der Protein Data Bank unter der Accession Number PDB ID: 1JJ2 hinterlegten Atomkoordinaten stammt; und
(b) Verwendung des Modells zur Identifizierung eines ausgewählten Moleküls, das eine komplementär zu dem ribofunktionellen Lokus ausgebildete Oberfläche aufweist. Bevorzugte Merkmale des Verfahrens sind in den Ansprüchen 28 bis 51 zitiert.

Kristalle, vorzugsweise unverzwillingte Kristalle, von Ribosomen und ribosomalen Untereinheiten, die eine mittlere Dicke größer als 15 μm aufweisen, werden beschrieben. Insbesondere besitzen die Kristalle eine mittlere Dicke von ungefähr 16 μm bis ungefähr 65 μm, oder von ungefähr 66 μm bis ungefähr 105 μm, oder von ungefähr 104 μm bis ungefähr 155 μm, oder von ungefähr 156 μm bis ungefähr 205 μm. Insbesondere habe die Kristalle eine mittlere Dicke von ungefähr 100 μm bis ungefähr 200 μm.
Die Kristalle haben vorzugsweise eine mittlere Dicke größer als ungefähr 15 μm und/oder sind unverzwillingt, wobei die Kristalle die große ribosomale Untereinheit umfassen. Insbesondere ist die große ribosomale Untereinheit eine 50S oder 60S ribosomale Untereinheit. Die Kristalle können gewonnen werden mittels der Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten aus Prokaryoten oder Eukaryoten. Die Kristalle enthaltend Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten werden gewonnen aus Bakterien oder Arachaebakterien, genauer aus dem Organismus Haloarcula marismortui. Jedoch können die Kristalle aus Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten aus jedem Organismus gewonnen werden, vorzugsweise aus Tieren, besonders aus Säugern, und insbesondere aus Menschen.
Vorzugsweise beugen die Kristalle Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von wenigstens ungefähr 4.5 Å, noch bevorzugter bis zu einer Auflösung von wenigstens ungefähr 3.0 Å, und am bevorzugtesten bis zu einer Auflösung von wenigstens ungefähr 2.4 Å zur Bestimmung von Atom Koordinaten der Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten. Die Kristalle können auch einschließen einen Liganden, zum Beispiel, einen Proteinsytheseinhibitor, zum Beispiel, ein Antibiotikum (wie ein Macrolid Antibiotikum) komplexiert mit oder gebunden an ein Ribosom oder eine ribosomale Untereinheit.
Die Kristalle von 50S ribosomalen Untereinheiten werden beschrieben, deren atomare Struktur gekennzeichnet ist durch die Atom Koordinaten hinterlegt bei der Protein Data Bank ID: 1FFK oder 1JJ2. Phasen berechnet aus den Koordinaten der hinterlegten Koordinaten und die Verwendung solcher Phaseninformation ist auch beschrieben. Die Kristalle der 50S ribosomalen Untereinheiten werden auch beschrieben, deren atomare Struktur gekennzeichnet ist durch die Atom Koordinaten hinterlegt bei der Protein Data Bank ID: 1FFZ (große ribosomale Untereinheit komplexiert mit CCdA-p-Puro); oder 1FG0 (große ribosomale Untereinheit komplexiert mit einem Mini-Helix Analog von Aminoacyl-tRNA); wie auch diejenigen ribosomalen Untereinheiten, deren atomare Struktur gekennzeichnet ist durch die atomaren Koordinaten gelistet in einer Datei enthalten auf Diskette Nr. 3 von 3, genauer: große ribosomale Untereinheit komplexiert mit Anisomycin (Dateiname: blasticidin.pdb); große ribosomale Untereinheit komplexiert mit Carbomycin (Dateiname: carbomycin.pdb); große ribosomale Untereinheit komplexiert mit Tylosin (Dateiname: tylosin.pdb); große ribosomale Untereinheit komplexiert mit Sparsomycin (Dateiname: sparsomycin.pdb); große ribosomale Untereinheit komplexiert mit Virginiamycin (Dateiname: virginiamycin.pdb); oder große ribosomale Untereinheit komplexiert mit Spiramycin (Dateiname: spiramycin.pdb).
Ein Verfahren zum Erhalt einer Elektronendichtekarte einer interessierenden ribosomalen Einheit, die nur wenig verschieden ist von der ribosomalen Untereinheit, deren Struktur bereits bestimmt wurde, zum Beispiel durch Röntgenstrahlen Kristallographie wird auch beschrieben. Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Erstellen eines Kristalls der interessierenden ribosomalen Untereinheit, wobei der Kristall isomorph ist; (b) Erhalt von Beugungsamplituden der in Schritt (a) erstellten Kristalle; (c) Kombinieren der Phasen des Kristalls der ribsomalen Untereinheit, dessen Struktur bereits mit den Beugungsamplituden, die in Schritt (b) erhalten wurden, um ein kombinierten Datensatz zu erstellen; und (d) Gewinnen einer Elektronendichtekarte der gewählten ribosomalen Untereinheit basierend auf dem kombinierten Datensatz, der in Schritt (c) erhalten wurde.
Ein Verfahren zum Erhalt einer Elektronendichtekarte einer interessierenden ribosomalen Untereinheit, die mit einer ribosomalen Untereinheit verwandt ist, deren Struktur bekannt ist, ist auch beschrieben. Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Erstellen eines Kristalls einer interessierenden ribosomalen Untereinheit, wobei der Kristall in einer unterschiedlichen Einheitszelle mit unterschiedlicher Symmetrie als dem Kristall der ribosomalen Untereinheit, deren Struktur bekannt ist, kristallisiert; (b) Erhalt von Röntgenstrahlen Beugungsdaten des interessierenden Kristalls; (c) Einfügen der atomaren Koordinaten der bekannten ribosomalen Untereinheit in die Einheitszelle des interessierenden Kristalls und Modellieren der Koordinaten, so dass sie in der Lage wären theoretische Röntgenstrahlen Beugungsdaten zu erstellen, die den in Schritt (b) erhaltenen Röntgenstrahlen Beugungsdaten ähnelt; (d) Erhalt von Phasen des interessierenden Kristalls aus den in Schritt (c) modellierten Koordinaten; und (e) Erhalt einer Elektronendichtekarte der interessierenden ribosomalen Untereinheit aus den in Schritt (b) erhaltenen Röntgenstrahlen Beugungsdaten und den in Schritt (d) erhaltenen Phasen.
Zusätzlich wird ein Verfahren beschrieben zum Erhalt eines Modells einer interessierenden ribosomalen Untereinheit, wobei die interessierende ribosomale Untereinheit signifikant abweicht von aber immer noch homolog ist zu der ribosomalen Untereinheit, die verwendet wurde, um die berechneten Phasen zu erzeugen. Das Verfahren umfasst die Schritte (a) Erstellen von atomaren Koordinaten der ribosomalen Untereinheit, deren Struktur bekannt ist; und (b) Verwenden von Homologiemodellierung zum Erstellen von Atom Koordinaten der interessierenden ribosomalen Untereinheit.
Ein Verfahren zum Züchten eines Kristalls eines Ribosoms oder einer ribosomalen Untereinheit, wie auch Kristalle, die aus solch einem Verfahren resultieren, sind auch beschrieben. Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Isolieren eines Ribosoms oder einer ribosomalen Untereinheit; (b) Fällen des Ribosoms oder der ribosomalen Untereinheit; (c) Rückextraktion der gefällten großen ribosomalen Untereinheiten, um eine Lösung zu erhalten; (d) Ansetzen der rückextrahierten Lösung; (e) Züchten der Kristalle in der angesetzten Lösung mittels Dampfdiffusion bei Zimmertemperatur; und (f) Einsammeln der Kristalle. Optional kann das Verfahren weiter einen oder mehrere der folgenden Schritte enthalten: (g) Stabilisieren des Kristalls durch allmählichen Transfer in eine Lösung enthaltend eine Hochsalz Konzentration, zum Beispiel, ungefähr 1.2 M Salz bis ungefähr 1.7 M Salz; (h) Halten des Kristalls unter solch einer hohen Salzkonzentration; und (i) Schockgefrieren des Kristalls. Ein Verfahren zum Erhalt von Röntgenstrahlen Beugungsdaten für einen Kristall eines Ribosoms oder einer ribosomalen Untereinheit ist auch beschrieben. Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Gewinnen eines Kristalls eines Ribosoms oder einer ribosomalen Untereinheit, wobei der Kristall eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften aufweist (1) ein mittlere Dicke von mehr als 15 μm, und (2) unverzwillingt; und (b) Verwenden von Röntgenkristallographie, um Röntgenbeugungsdaten für den Kristall des Ribosoms oder der ribosomalen Untereinheit zu erhalten. Ein Verfahren zum Gewinnen einer Elektronendichtekarte eines Ribosoms oder einer ribosomalen Untereinheit umfassend die hier beschriebenen Röntgenstrahlen Beugungsdaten, um ein Elektronendichtekarte des Ribosoms oder der ribosomalen Untereineinheiten zu gewinnen, ist auch beschrieben.
Ein Verfahren zum Erhalt von Röntgenstrahlen Beugungsdaten für einen Komplex aus einem Ribosom und einem Liganden oder für einen Komplex aus einer ribosomalen Untereinheit und einem Liganden wird auch beschrieben. Das Verfahren umfasst die Schritten: (a) Erhalten eines Kristalls eines Ribosoms oder einer ribosomalen Untereinheit, wobei der Kristall eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften hat: (1) eine durchschnittliche Dicke von mehr als 15 μm; (2) nicht verzwillingt; (b) Diffundieren eines Liganden durch den Kristall, so dass der Ligand das Ribosom oder die ribosomale Untereinheit bindet, um einen Komplex zu bilden; und (c) Verwenden von Röntgenstrahlen Kristallographie zum Erhalt von Röntgenstrahlen Beugungsdaten für den Komplex. Ein Verfahren zum Erhalt von Röntgenstrahlen Beugungsdaten für einen Komplex aus einem Ribosom und einem Liganden oder für einen Komplex aus einer ribosomalen Untereinheiten und einem Liganden ist auch beschrieben. Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Erhalten eines Ko-Kristalls für einen Komplex aus einem Ribosom und einem Liganden oder für einen Komplex aus einer ribosomalen Untereinheit und einem Liganden, wobei der Ko-Kristall eine oder mehere der folgenden Eigenschaften aufweist: (1) eine durchschnittliche Dicke von mehr als 15 μm; (2) nicht verzwillingt; und (b) Verwenden von Röntgenstrahlen Kristallographie zum Erhalt von Röntgenstrahlen Beugungsdaten für den Komplex. In jedem dieser Verfahren können die Röntgenstrahlen Beugungsdaten verwendet werden, um eine Elektronendichtekarte für einen Komplex eines Ribosoms und eines Liganden oder für einen Komplex einer ribosomalen Untereinheit und eines Liganden zu erzeugen.
Ein Verfahren zur Lokalisierung der Anheftung eines Liganden an ein Ribosom oder der Anheftung des Liganden an eine ribosomale Untereinheit ist auch beschrieben. Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Erhalt von Röntgenstrahlen Beugungsdaten für ein Ribosom oder für eine ribosomale Untereinheit; (b) Erhalten von Röntgenstrahlen Beugungsdaten für einen Komplex aus einem Ribosom und einem Liganden oder für einen Komplex aus einer ribosomalen Untereinheit und einem Liganden; (c) Subtrahieren der Röntgenstrahlen Beugungsdaten, die in Schritt (a) erhalten wurden, von den Röntgenstrahlen Beugungsdaten, die in Schritt (b) erhalten wurden zum Erhalt der Differenz in den Röntgenstrahlen-Beugungsdaten; (d) Erhalten von Phasen, die den in Schritt (a) erhaltenen Röntgenstrahlen Beugungsdaten entsprechen, unter Verwendung einer oder mehrer Techniken ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MIR, MIRAS, SAD und Berechnung aus eine existierenden atomaren Struktur; (e) Verwendung der in Schritt (d) erhaltenen Phasen und der Differenz der in Schritt (c) erhaltenen Röntgenstrahlen Beugungsdaten zur Berechnung eines Differenz-Fourier-Bildes des Liganden; und (f) Lokalisierung der Anheftung des Liganden an ein Ribosom oder Anheftung des Liganden an eine ribosomale Untereinheit, basierend auf den Berechnungen, die in Schritt (e) erhalten wurden.
Ein alternatives Verfahren zum Erhalt einer Karte eines Liganden, der an ein Ribosom angeheftet ist oder eines Liganden, der an eine ribosomale Untereinheit angeheftet ist, wird auch beschrieben. Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Erhalten von Röntgenstrahlen Beugungsdaten für ein Ribosom oder für eine ribosomale Untereinheit; (b) Erhalten von Röntgenstrahlen Beugungsdaten für einen Komplex aus einem Ribosom und einem Liganden oder für einen Komplex aus einer ribosomalen Untereinheit und einem Liganden; (c) Erhalten von Phasen, die den in Schritt (a) erhaltenen Röntgenstrahlen Beugungsdaten entsprechen, unter Verwendung einer oder mehrer Techniken ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus MIR, MIRAS, SAD und Berechnung aus eine existierenden atomaren Struktur; und (d) Verwendung der in Schritt (c) erhaltenen Phasen und der in Schritt (b) erhaltenen Beugungsdaten zur Berechnung einer Karte des Liganden und des Ribosoms oder des Liganden und der ribosomalen Untereinheit.
Ein Computersystem ist beschrieben umfassend: (a) einen Speicher mit gespeicherten Daten, die Atom Koordinaten anzeigen, die von einer Elektronendichtekarte abgeleitet sind, die eine Auflösung von wenigstens 4.5 Å, bevorzugt von wenigstens 3.0 Å, und am bevorzugtesten von 2.4 Å aufweist und die den ribofunktionellen Lokus einer großen Untereinheit eines Ribosoms definiert; und (b) ein Prozessor in elektrischer Kommunikation mit dem Speicher, wobei der Prozessor ein Programm umfasst zur Erzeugung eines dreidimensionalen Modells, das den ribofunktionellen Lokus zeigt. Ein bevorzugtes Computersystem ist beschrieben, das ferner eine Vorrichtung umfasst, zum Beispiel, einen Computermonitor, oder Terminal zum Bereitstellen einer visuellen Darstellung des molekularen Modells. In einem anderen bevorzugten Computersystem umfasst der Prozessor ferner ein oder mehrere Programme, um rationales Wirkstoff Design zur ermöglichen.
Das Computersystem umfasst ferner wenigstens einen Teil der Atom Koordinaten, die in der Protein Data Bank und der Accession Number PDB ID: 1FFK, 1FFZ, 1FG0 oder 1JJ2 hinterlegt sind. Die Atom Koordinaten definieren weiter wenigstens einen Teil eines Proteinsyntheseinhibitors, zum Beispiel, eines Antibiotikums, genauer eines Antibiotikums ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Anisomycin, Blasticidin, Carbomycin, Sparsomycin, Spiramycin, Tylosin und Virginiamycin, das mit einem ribofunktionellen Lokus komplexiert ist, zum Beispiel, wenigstens einen Teil der Atom Koordinaten, die auf Compact Disk Nr. 3 von 3, die hier enthalten ist, aufgezeichnet sind.
Der ribofunktionelle Lokus umfasst wenigstens einen Teil einer aktiven Stelle in der ribosomalen Untereinheit, zum Beispiel, wenigstens einen Teil einer oder mehrerer: einer Peptidyltransferase Stelle (ein Teil davon kann definiert werden als eine Vielzahl der Reste, die in Tabelle 5 angegeben sind); einer P Stelle (ein Teil davon kann definiert werden als eine Vielzahl der Reste, die in Tabelle 7 angegeben sind); eines Polypeptidaustrittstunnels (ein Teil davon kann definiert werden als eine Vielzahl der Reste, die in Tabelle 8, Tabelle 9 oder Tabelle 10 angegeben sind); oder einer Antibiotika Bindungsdomäne (ein Teil davon kann definiert werden als eine Vielzahl der Reste, die in Tabelle 11, Tabelle 12, Tabelle 13, Tabelle 14, Tabelle 15, Tabelle 16 oder Tabelle 17 angegeben sind). Ein Vielzahl von Resten soll verstanden werden, wenigstens 3 Reste, vorzugsweise wenigstens 5 Reste, und noch bevorzugter wenigstens 10 Reste einzuschließen. Der ribofunktionelle Lokuskann kann durch Atome von ribosomaler RNA, einem oder mehreren ribosomalen Proteine oder einer Kombination von ribosomaler RNA und einem oder mehreren ribosomalen Proteinen definiert werden.
Die Atom Koordinaten werden vorzugsweise durch molekulares Modellieren erzeugt. Mit den hier bereitgestellten Atom Koordinaten kann der Fachmann Modelle jedes interessierenden Ribosoms mit konventionellen Techniken erzeugen, zum Beispiel, konventionellem Homologiemodellierung, und oder molekularen Ersetzungstechniken. Die Atom Koordinaten können auch durch Homologiemodellierung mit wenigstem einem Teil der Atom Koordinaten hergestellt werden, die bei der Protein Data Bank unter der Accession Number PDB ID: 1FFK, 1FFZ, 1FG0 oder 1JJ2 hinterlegt sind, oder den Atom Koordinaten, die auf Compact Disk Nr. 3 von 3 enthalten sind, erzeugt werden. Die Atom Koordinaten können auch durch molekulare Ersetzung mit wenigstens einem Teil der Koordinaten, die bei der Protein Data Bank unter der Accession Number PDB ID: 1FFK, 1FFZ, 1FG0 oder 1JJ2 hinterlegt sind, oder den Atom Koordinaten, die auf Compact Disk Nr. 3 von 3 enthalten sind, erzeugt werden.
Vorzugsweise definieren die Atom Koordinaten die Reste, die zwischen Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten von Pathogenen, zum Beispiel, prokaryotischen Organismen konserviert sind, und, optional aber bevorzugter auch in den Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten eines Wirtsorganismus, zum Beispiel eines Menschen, nicht vorhanden sind. Die atomaren Koordinaten können Reste definieren, die zwischen Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten von prokaryotischen Organismen, zum Beispiel Bakterien, konserviert sind, und, optional aber bevorzugter auch in den Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten von Eukaryoten, zum Beispiel eines Säugers, bevorzugter eines Menschen, nicht vorhanden sind. Diese Information kann verwendet werden, zum Beispiel über die Verwendung von einem oder mehreren molekularen Modellen, um Ziele für rationales Wirkstoff Design zu identifizieren, die benützt werden können, um neue Moleküle zu entwickeln, zum Beispiel Proteinsyntheseinhibitoren, die die Proteinsynthese in einem Pathogen, zum Beispiel einem Bakterium, unterbrechen, aber nicht die Proteinsynthes in einem Wirtsorganismus, zum Beispiel einem Menschen, im Wesentlichen unterbrechen oder auf andere Weise wesentlich beeinflussen.
Eine Vielzahl von Verfahren zum Konstruieren, Testen und Verfeinern neuer Moleküle über rationales Wirkstoff Design sind beschrieben. Zum Beispiel ein Verfahren, das die Schritte umfasst:

(a) Bereitstellen eines Modells, zum Beispiel eines molekularen Modells mit einem ribofunktionellen Lokus einer großen Untereinheit eines Ribosoms, wobei das Modell durch die räumliche Anordnung der Atome definiert ist, die aus einer Elektronendichtekarte mit einer Auflösung von wenigstens ungefähr 4.5 Å, bevorzugter wenigstens 3.0 Å, und am bevorzugtesten ungefähr 2.4 Å, abgeleitet ist; und (b) Verwenden des Modells, um ein Kandidatenmolekül zu identifizieren mit einer Oberfläche komplementär zu dem ribofunktionalen Lokus. Vorzugsweise, passt das Kandidatenmolekül stererochemisch in und bevorzugter bindet es an den ribofunktionalen Lokus der großen Untereinheit des Ribosoms.

Vorzugsweise umfasst das Verfahren einen oder mehrere zusätzliche folgende Schritte: Erstellen des in solch einem Verfahren identifizierten Kandidatenmoleküls; Bestimmen, ob das Kandidatenmolekül, wenn es erstellt wurde, die ribosomale Aktivität moduliert (zum Beispiel induziert oder reduziert); Identifizieren eines modifizierten Moleküls, Erstellen des modifizierten Moleküls; Bestimmen, ob das das modifizierte Molekül, wenn es erstellt wurde, ribosomale Aktivität moduliert; und Erstellen des modifizierten Moleküls zu Verwendung entweder alleine oder in Kombination mit einem pharmazeutisch verträglichem Träger. Das Kandidatenmolekül und/oder das modifizierte Molikül kann ein Antibiotikum oder Antibiotikum Analog sein, zum Beispiel ein Macrolid Antibiotikum oder ein Macrolid Analog.
Vorzugsweise umfasst der ribofunktionale in solch einem Verfahren verwendete Lokus wenigstens einen Teil einer aktiven Stelle in der ribosomalen Untereinheit. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist der ribofunktionale Lokus definiert durch wenigstens einen Teil von einem oder mehreren einer: Peptidytransferase Stelle (ein Teil davon kann definiert werden als eine Vielzahl der Reste, die in Tabelle 5 angegeben sind); einer A Stelle (ein Teil davon kann definiert werden als eine Vielzahl des Reste, die in Tabelle 7 angegeben sind); einer P Stelle (ein Teil davon kann definiert werden als eine Vielzahl der Reste, die in Tabelle 6 angegeben sind); eines Polypeptidaustrittstunnels (ein Teil davon kann definiert werden als eine Vielzahl der Reste, die in Tabelle 8, Tabelle 9 oder Tabelle 10 angegeben sind); oder einer Antibiotika Bindungsdomäne (ein Teil davon kann definiert werden als eine Vielzahl der Reste, die in Tabelle 11, Tabelle 12, Tabelle 13, Tabelle 14, Tabelle 15, Tabelle 16 oder Tabelle 17 angegeben sind). Der ribofunktionale Lokus kann durch Atome von ribosomaler RNA, ein oder mehrere ribosomale Proteine oder eine Kombination von ribosomaler RNA und einem oder mehreren ribosomalen Proteinen definiert werden.
Die Atom Koordinaten werden verwendet um ein molekulares Modell in elektronischer Form zu erzeugen. Die Atom Koordinaten werden vorzugsweise durch molekulares Modellieren erstellt. Die Atom Koordinaten können durch Homologie Modellieren mit wenigstens einem Teil der Atom Koordinaten hergestellt werden, die bei der Protein Data Bank unter der Accession Number PDB ID: 1FFK, 1FFZ, 1FG0 oder 1JJ2 hinterlegt sind, oder den Atom Koordinaten, die auf Compact Disk Nr. 3 von 3 enthalten sind, erzeugt werden. Die Atom Koordinaten können auch durch molekulare Ersetzung mit wenigstens einem Teil der Koordinaten, die bei der Protein Data Bank unter der Accession Number PDB ID: 1FFK, 1FFZ, 1FG0 oder 1JJ2 hinterlegt sind, oder den Atom Koordinaten, die auf Compact Disk Nr. 3 von 3 enthalten sind, erzeugt werden.
Die Atom Koordinaten können die Reste definieren, die zwischen Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten von Pathogenen, zum Beispiel, prokaryotischen Organismen konserviert sind, und, optional aber bevorzugter auch in den Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten eines Wirtsorganismus, zum Beispiel eines Menschen, nicht vorhanden sind. Die Atom Koordinaten können Reste definieren, die zwischen Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten von prokaryotischen Organismen, zum Beispiel Bakterien, konserviert sind, und, optional aber bevorzugter auch in den Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten von Eukaryoten, zum Beispiel eines Säugers, bevorzugter eines Menschen, nicht vorhanden sind. Diese Information kann verwendet werden, zum Beispiel über die Verwendung von einem oder mehreren molekularen Modellen, um Ziele für rationales Wirkstoff Design zu identifizieren, die benützt werden können, um neue Moleküle zu entwickeln, zum Beispiel Proteinsyntheseinhibitoren, die die Proteinsynthese in einem Pathogen, zum Beispiel einem Bakterium, unterbrechen, aber nicht die Proteinsynthese in einem Wirtsorganismus, zum Beispiel einem Menschen, unterbrechen oder auf andere Weise wesentlich beeinflussen.
Ein Verfahren zum Gewinnen eines modifizierten Agens ist auch beschrieben. Das Verfahren umfasst die Schritte: (a) Gewinnen eines Kristalls eines Ribosoms oder einer ribosomalen Untereinheit; (b) Gewinnen der Atom Koordinaten des Kristalls; (c) Verwenden der Atom Koordinaten und einer oder mehrer molekularen Modellierungstechniken, zum Beispiel graphischem molekularem Modellieren und berechneter Chemie, um zu bestimmen, wie die Wechselwirkung eines Agens mit einem Ribosom oder ribosomalen Untereinheit zu modifizieren ist; und (d) Modifizieren des Agens basierend auf den in Schritt (c) erhaltenen Bestimmungen, um ein modifiziertes Agens zu produzieren. Alternativ umfasst das Verfahren das in Kontakt bringen des modifizierten Agens mit einem Ribosom oder einer ribosomalen Untereinheit und Detektieren der Wechselwirkung des Agens mit dem Ribosom oder ribosomalen Untereinheit. Solch ein modifiziertes Agens (vorzugsweise ein therapeutisches Agens), bei dem das modifizierte Agens verschieden an ein Ribosom oder ribosomale Untereinheit bindet als das Agens, von dem das modifizierte Agens abgeleitet wurde, wird auch beschrieben.
Neue Proteinsyntheseinhibitoren, die die Funktion eines Zielribosoms unterbrechen, sind auch beschrieben. Die Inhibitoren können leicht konstruiert und getestet werden, wie hier offenbart wird.
Ein Typ eines Proteinsyntheseinhibitors umfasst: eine erste Bindungsdomäne mit einer Oberfläche, zum Beispiel, eine Lösungsmittel zugängliche Oberfläche, die eine Oberfläche eines bekannten ersten Moleküls nachmacht oder dupliziert, zum Beispiel eines ersten Antibiotikums, das an eine erste Kontaktstelle bindet, zum Beispiel einen ersten ribofunktionalen Lokus, in oder an einer großen ribosomalen Untereinheit; und ein zweite Bindungsdomäne mit einer Oberfläche, zum Beispiel eine Lösungsmittel zugängliche Oberfläche, die eine Oberfläche eines bekannten zweiten Moleküls nachmacht oder dupliziert, zum Beispiel eines zweites Antibiotikums, das an eine zweite Kontaktstelle bindet, zum Beispiel einen zweiten ribofunktionalen Lokus, in oder an der ribosomalen Untereinheit. Die erste Domäne ist an der zweiten Domäne angebracht, um so zu ermöglichen, dass die erste Domäne und die zweite Domäne gleichzeitig mit ihren jeweiligen Kontaktstellen innerhalb oder auf der ribosomalen Untereinheit gleichzeitig binden, um so die Proteinsynthese in einer ribosomalen Untereinheit zu unterbrechen.
Ein anderer Typ von Proteinsyntheseinhibitor ist ein synthetisches konstruiertes Molekül, das umfasst: eine Bindungsdomäne mit einer Oberfläche, zum Beispiel eine Lösungsmittel zugängliche Oberfläche, die eine Oberfläche eines bekannten Moleküls nachmacht oder dupliziert, zum Beispiel eines ersten bekannten Antibiotikums, das an eine Kontaktstelle bindet, zum Beispiel einen ribofunktionalen Lokus, in oder an einer ribosomalen Untereinheit; und eine Effektordomäne, die an der Bindungsdomäne angebracht ist, die nach Bindung der Bindungsdomäne mit der Kontaktstelle eine Raum innerhalb oder direkt an der ribosomalen Untereinheit besetzt, wodurch die Proteinsynthese in der ribosomalen Untereinheit unterbrochen werden soll.
Die vorstehenden Aspekte und Ausführungsformen der Erfindung könne umfassender verstanden werden unter Bezug auf die folgenden Abbildungen, eingehende Beschreibung und Ansprüche. Weitere Vorteile ergeben sich aus den Zeichnungen (bereitgestellt sowohl in Grauabstufung als auch in Farbe).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Das Patent oder die Anmeldung enthält wenigstens eine in Farbe ausgeführte Zeichnung. Kopien dieses Patent- oder dieser Patentanmeldungsveröffentlichung mit Farbzeichnung(en) werden von dem Amt auf Anfrage und Bezahlung der notwendigen Gebühr hin bereitgestellt.
Farbdarstellungen ähnlich zu vielen von denen in den folgenden Abbildungen können zum Beispiel in Ban et al. (2000) Science 289: 905-920; oder Nissan et al. (2000) Science 289: 920-929 gefunden werden.
Die Ziele und Merkmale der Erfindung können umfassender verstanden werden unter Bezug auf die unten beschriebenen Abbildungen:
1(A)-(E) zeigen die Elektronendichte einer Elektronendichtekarte mit einer 2.4 Å Auflösung. Insbesondere zeigt 1(A) eine Stereo Ansicht einer Kontaktstelle zwischen 23S rRNA Domänen II, III und IV. 1(B) zeigt die ausgedehnte Region von Protein L2, das mit der umgebenden RNA wechselwirkt. 1(C) zeigt im Detail die L2 Region mit einem gebundenen Mg²⁺ Ion. 1(D) zeigt im Detail L2 mit Aminosäureseitenketten. 1(E) zeigt Helices 94-97 aus Domäne 6.
2 zeigt die H. marismortui große ribosomale Untereinheit in der Kronen Ansicht. Die Untereinheit ist in der Kronen Ansicht gezeigt, mit ihrem L7/L12 Stamm zur Rechten, ihrem L1 Stamm zur Linken und ihrer zentralen Vorwölbung (CP) oben. In diese Ansicht ist die Oberfläche der Untereinheit, die mit der kleinen ribosomalen Unterheit wechselwirkt, zum Leser ausgerichtet. RNA wird in Grau in einer Raum füllenden Darstellung gezeigt. Die Rückrate der sichtbaren Protein sind in Gold dargestellt. Ein Übergangszustandsanalog gebunden an die Peptidyltransferase Stelle der Untereinheit wird in Grün angezeigt. Der Partikel ist ungefähr 250 Å lang.
3(A)-(B) zeigen die Sekundärstruktur der 23S rRNA von H. marismortui. Die Sekundärstruktur dieser 23S rRNA wird in einem standardisierten Format gezeigt. 3(A) zeigt die 5' Hälfte der rRNA der großen Untereinheit. 3(B) zeigt die 3' Hälfte der rRNA der großen Untereinheit. Dieses Diagramm zeigt all die Basenpaarungen, die in der Kristallstruktur der großen Untereinheit gesehen werden, die durch wenigstens zwei Wasserstoff Brückenbindungen stabilisiert werden. In Rot gezeigt Paarungen waren vorausgesagt und sind beobachtet worden. Diejenigen in Grün gezeigten, wurden vorrausgesagt, aber nicht beobachtet. In Blau gezeigte Wechselwirkungen werde beobachtet, wurden aber nicht vorausgesagt. In Schwarz gezeigte Basen erscheinen in Paarungswechselwirkungen involviert zu sein. Sequenzen, die nicht in der Elektronendichtekarte mit 2.4 Å Auflösung visualisiert werden können, sind in Grau dargestellt mit den für sie vorausgesagten Sekundärstrukturen.
4(A)-(L) zeigen die Tertiärstrukturen der RNA Domänen in der H. marismortui großen ribosomalen Untereinheit, ihre RNA als Ganzes, und schematische Darstellungen ihrer RNAs. Insbesondere zeigen 4(A) und 4(B) die RNA Struktur der gesamten Untereinheit. Die Domänen sind farbkodiert, wie in den schematischen Darstellungen von 5(C) gezeigt. 4(A) zeigt die Partikel in der Kronenansicht. 4(B) zeigt das Bild aus 4(A), das 180° um eine Achse, die vertikal durch die Bildebene läuft, gedreht ist. 4(C) und 4(D) zeigen ein schematisches Diagramm der 23S rRNA Sekundärstruktur und der Sekundärstruktur der 5S rRNA. 4(C) ein schematisches Diagramm der 23S rRNA Sekundärstruktur aus 3 mit gemäß Leffers et al. ((1987) J. Mol. Biol. 195: 43-61) Helices nummerierten Helices, und die Domänen des Moleküls sind durch Farbtönung markiert. 4(D) zeigt die Sekundärstruktur der 5S rRNA aus H. marismortui. Dicke Basen verbindende Linien stellen Watson-Crick Paarungen dar. Durch ein klein geschriebenes „o" verbundene Basen zeigen nicht Watson-Crick Paarung an. Durch dünne Linien verbundene Basen wechselwirken über eine einzelne Wasserstoff-Brückenbindung. In Schwarz gezeigte Basen sind nicht gepaart. In Rot gezeigte Basen sind phylogenetisch vorausgesagte Paarungen, die nun bestätigt worden sind (Symanski et al. (1988) Nucl. Acids. Res. 26: 156-159). In Blau gezeigte Paarungen werden beobachtet, wurden aber nicht vorausgesagt, und in Grün gezeigte Paarungen wurden vorausgesagt, aber nicht beobachtet. 4(E) bis 4(L) zeigen Stereo Ansichten der RNA Domänen in der 23S rRNA und der 5S rRNA. Jede Domäne ist farkkodiert von ihrem 5' Ende zu ihrem 3' Ende, um den Betrachter zu ermöglichen ihrem Verlauf dreidimensional zu folgen. Die Oberflächen, an denen die wichtigsten Zwischendomänen Wechselwirkungen auftreten, werden unräumlich zur Rechten der Stereoansichten gezeigt. 4(E) zeigt Domäne I; 4(F) zeigt Domäne II; 4(G) zeigt Domäne III; 4(H) zeigt Domäne IV; 4(I) zeigt Domäne V, Kronenansicht; 4(J) zeigt Domäne V, Rückansicht; 4(K) zeigt Domäne VI; und 4(L) zeigt 5S rRNA.
5(A)-(C) zeigt Konservierungen und Ausdehnungen in der 23S rRNA von H. marismortui. Grundsätzlich ist die RNA in diesen Bildern grau. Sequenzen, die sich als zu > 95% über die drei phylogenetischen Reiche erwiesen, sind in Rot gezeigt. Sequenzen, bei denen Ausdehnung in der 23S Grundstruktur erlaubt ist, sind in Grün gezeigt (Gutell et al. (2000) supra). Insbesondere zeigt 5(A) die Partikel als in Bezug auf die Kronenansicht rotiert, so dass ihre Spalte mit der aktiven Stelle gesehen werden kann. 5(B) zeigt die Kronenansicht. 5(C) zeigt die Rückansicht des Partikels, d.h., die Kronenansicht 180° rotiert um ihre vertikale Achse.
6(A)-(I) zeigt Strukturen einiger großer ribosomalen Untereinheiten Proteine, die nicht globuläre Ausdehnungen haben. Nur die Rückrate der Protein sind gezeigt. Die globulären Domänen dieser Proteine sind in Grün gezeigt, und ihre nicht globulären Ausdehnungen sind in Rot dargestellt. Die Positionen der Zinkionen in L44e und L37e sind auch angezeigt. 6(A) zeigt L2; 6(B) zeigt L3; 6(C) zeigt L39; 6(D) zeigt L4; 6(E) zeigt L15; 6(F) zeigt L21e; 6(G) zeigt L44e; 6(H) zeigt L37e; 6(I) zeigt L19;
7(A)-(C) zeigt Proteine, die auf der der großen ribosomalen Untereinheit auftreten. Die RNA der Untereinheit ist in Grau gezeigt, wie in 2, und die Protein Rückrate sind in Gold gezeigt. Insbesondere zeigt 7(A) die Untereinheit in der Kronenansicht der Untereinheit. 7(B) zeigt die Rückseite der Untereinheit in der Kronenansicht Orientierung. 7(C) zeigt die Ansicht von unten; das Ende des Peptidtunnels erscheint im Zentrum dieses Bildes. Die in jedem Bild sichtbaren Proteine werden in der unteren linken Ecke der Abbildung identifiziert.
8(A)-(F) zeigt die Proteinverteilung und die Protein-RNA-Wechselwirkungen in der großen ribosomalen Untereinheit. Insbesondere zeigt 8(A) die Strukturen von Proteinen in der Nachbarschaft des Endes des Peptidtunnels und wie sie sich auf die RNA Sequenzen beziehen, mit denen sie wechselwirken. Protein L22 hat einen langen Haarnadel Fortsatz innerhalb der 23S rRNA. L24 hat ein ähnlichen Fortsatz, aber das gesamte Protein ist auf der Oberfläche des Partikels. L39 ist das einzige Protein in der Untereinheit, dem Tertiärstruktur fehlt, während L37e sowohl NH₂ als auch COOH terminale Fortsätze besitzt. L19 ist einzigartig, das es zwei globuläre Domänen auf der Oberfläche der Untereinheit besitzt, die über einen Sequenzfortsatz verbunden sind, der sich durch die RNA windet. Das Ende von L39 (grün) tritt wirklich in den Tunnel ein, während L37e (rot) in seiner Gesamtheit von RNA umgeben ist. 8(B) zeigt die nicht globulären Fortsätze von L2 und L3, die durch die Masse der 23S rRNA zu der Peptidyltransferase Stelle reichen, die durch ein CCdA-p-Puromycin Molekül markiert ist. 8(C) zeigt L22 wechselwirkend mit den Teilen aller sechs Domänen von 23S rRNA. 8(D) zeigt ein Schema der 23S rRNA, das die Lokalisierung der Sequenzen zeigt, die wenigstens van der Waals Kontakt mit Protein machen (rot). 8(E) zeigt eine Stereo Ansicht der Proteine der großen ribosomalen Untereinheit unter Entfernung aller RNA. Proteine sind in roter Farbe nur als Hilfe bei der Visualisierung eingefärbt. 8(f) zeigt einen Querschnitt der Untereinheit in dem Gebiet des Tunnelaustritts. Protein L22 wird als rote Bänder gezeigt, und der Haarnadel Loop, bei dem Mutationen Erythromycin-Resistenz verleihen, wird in Orange gezeigt. Atome auf der Oberfläche sind in Grau gezeigt, Proteinatome sind in Grün gezeigt, und Atome an Schnittfläche sind in Blau gezeigt.
9(A)-(C) zeigen chemische Strukturen von Ribosom Peptidyltransferase Substraten und Analogen. Insbesondere 9(A) zeigt das tetrahedrische Kohlenstoffintermediat, das während der Peptidbindungsbildung hergestellt wird; der tetrahedrische Kohlenstoff wird durch einen Pfeil angezeigt. 9(B) zeigt das Übergangszustand Analog, das durch Koppelung des 3' OH des CCdA an die Aminogruppe des O-Methyl Tyrosin Restes von Puromycin über eine Phosphatgruppe, CCdA-p-Puro (Welch et al. (1995) supra), gebildet wird. 9(C) zeigt eine Amino-N-acylierte Mini-Helix, die konstruiert wurde, auf die A-Stelle abzuzielen. Die Oligonukleotid Sequenz 5' Phosphat CCG GCG GGC UGG UUC AAA CCG GCC CGC CGG ACC 3' (SEQ ID NO: 1) Puromycin sollte 12 Basenpaare bilden. Das Konstrukt fusst auf einer Mini-Helix, die ein geeignetes Substrat für die Amino-Acylierung durch Tyr-tRNA Synthetase ist. Das 3' OH seines terminalen C ist gekoppelt mit dem 5' OH der N6-Dimethyl A Einheit des Puromycins durch eine Phosphodiesterbindung.
10(A)-(C) zeigen experimentell in Phasen gebrachte Elektronendichtekarten der Substrat Analog Komplexe bei 3.2 Å Auflösung, wobei die Modelle übereinander projiziert sind (Sauerstoff, rot; Phosphor, violett; Stickstoff blau; und Kohlenstoff, grün für rRNA und gelb für Substrat). Insbesondere zeigt 10(A) eine F₀(Komplex)-F₀(Stamm) Differenz-Elektronendichtekarte mit einem überlagerten Skelettmodell des CCdA-p-Puro. 10(B) zeigte eine eine F₀(Komplex)-F₀(Stamm) Differenz-Elektronendichtekarte des CCdA-p-Puro in dem Bereich der aktiven Stelle, wobei die Strukturen des Ribosoms und des Inhibitors überlagert wurden, was die Nähe des N3 von A2486 (2451) zu dem Phosphat, nicht verbrückten Sauerstoff in diesem Komplex zeigt. 10(C) zeigt eine F₀(Komplex)-F₀(Stamm) Differenz-Elektronendichtekarte des tRNA Akzeptorstamm Analogs überlagert mit einem Skelettmodell des CCpuro.
Es gibt nur Dichte für die Ribose und das Phosphat des C74 und keine für den Rest der RNA Haarnadel.
11(A) und (B) zeigen ein kombiniertes Modell des CCA Teils der Mini Helix gebunden an die A-Stelle und das CCdA-p-Puro gebunden an die A- und P-Stellen, farbkodiert wie in 2. Insbesondere zeigt 11(A) die Basenpaarungs-Wechselwirkungen zwischen der P-Stelle C74 und C75 und dem P Loop der 23S rRNA auf der Linken und der A-Stelle C75 mit dem A Loop der 23S rRNA auf der Rechten. Das katalytische A2486 ist nahe dem Phosphat-Sauerstoff (P), der das Analog des tetrahedrischen Intermediat Oxyanions ist. 11(B) zeigt A2637 (in komplett Blau), das zwischen den zwei CCAs und A2486 (grün) liegt, dessen N3 sich einem nicht verbrückten Phosphat Sauerstoff annähert. Die N1 Atome der A76 Basen aus den A- und P-Stellen tRNAs machen fast identische Wechselwirkungen mit einem Ribose 2' OH im A- bzw. im P-Loop, und eine ungefähr 2-fache Achse setzt diese Reste in Beziehung.
12 zeigt ein raumfüllendes Modell der 23S und 5S rRNA, der Proteine und des CCdA-p-Puro Inhibitors, wobei die Sicht in die Spalte mit der aktiven Stelle hinunter geht bei einer rotierten „Kronenansicht". Die Basen sind weiß und die Zuckerphosphat Rückrate sind gelb. Der Inhibitor ist in Rot gezeigt und die nummerierten Proteine sind in Blau gezeigt. Die L1 und L11 Proteins, die bei einer geringer Auflösung positioniert sind, sind im blauen Rückrat. Die zentrale Vorwölbung ist als CP markiert.
13(A) zeigt ein Stereoansichtsdiagramm der dreidimensionalen Verteilung der Reste umfassend die Loops A und P und den Peptidyltransferase Loop. 13(B) zeigt eine Stereoansicht des zentralen Loops in der Domäne V aus der Richtung des Tunnels. Die Reste sind farbkodiert basierend auf Mutationen, die Antibiotika Resistenz vermitteln. 13(C) zeigt die aktive Stelle von Domäne V mit ihrem zentralen Loop gezeigt als die Sekundärstruktur.
14(A) und (B) zeigen die engste Annäherung von Polypeptiden an die aktive Stelle der Peptidyltransferase markiert durch ein Kugel und Stab Darstellung des Yarus Inhibitors, CCdA-p-Puro. Insbesondere zeigt 14(A) eine Spiralendarstellung des Domänen V RNA Rückrats in Rot und der Domänen V RNA Basen in Grau und Schleifenrückrat Darstellung aller dreizehn Proteine, die mit ihm wechselwirken. 14(B) zeigt eine Nahansicht der aktiven Stelle, wobei die RNA entfernt wurde. Das Phosphat des Yarus Analogs und der Proteine, deren Fortsätze dem Inhibitor am nächsten sind, sind als Schleife gezeigt, wobei ihre nahesten Seitenketten in vollständiger Atom Darstellung sind. Die Abstände in Å zwischen den nahesten Proteinatomen und dem Phosphor Analog des tetrahedrischen Kohlenstoffs (rosa) werden gezeigt, wie auch ein modelliertes Peptid (rosa).
15 zeigt konservierte Nukleotide in dem Peptidyltransferase Bereich, der CCdA-p-Puro A mit raumfüllender Darstellung des aktiven Stellen Bereichs mit dem Yarus Inhibitor bindet, wobei die Sicht in die Spalte mit der aktiven Stelle hinunter geht. Alle zu den 23S rRNA Nukleotiden gehörenden Atome, die zu 95% in allen drei Reichen konserviert sind (Gutell et al. (2000) supra) sind rot gefärbt und alle anderen Nukleotide sind weiß; der Inhibitor ist blau gefärbt.
16(A)-(C) zeigt die katalytische Vorrichtung der aktiven Stelle mit der Peptidyl Transferase. Insbesondere zeigt 16(A) eine Stereoansicht eines Teils der experimentellen Elektronendichtekarte mit 2.4 Å Auflösung (BAN et al. (2000) Science 289: 905-920) der großen Untereinheit in dem Bereich der katalytischen Stelle als Stereobild. Die Struktur der RNA, die in Wechselwirkungen mit A2486 involviert sind, ist überlagert. Reste G2102 (2061) und G2482 (2447) sind mit Wasserstoff Brückenbindungen verbrückt mit dem N6 von A2486 (2451) und G2482, das mit einer benachbarten Phosphatgruppe wechelwirkt. 16(B) zeigt eine Skelettdarstellung mit gestrichelten Wasserstoff Brückenbindungen, die G2483, G2102, A2486 und das verborgene Phosphat zeigen, bei dem vorgeschlagen wird, dass sie als ein Folge einer Ladungsverschiebung über G2482 auf N3 von A2486 resultieren. 16(C) zeigt die normale und die selteneren Imin tautomeren Formen von G2482 und A2486, bei denen vorgeschlagen wird, dass sie durch das verborgene Phosphat des Restes 2485 stabilisiert werden.
17(A)-(C) zeigen den vorgeschlagenen Mechanismus der Peptidsynthese, die durch das Ribosom katalysiert wird. Insbesondere zeigt 17(A) das N3 des A2486, das ein Protein aus der NH₂ Gruppe abzieht, da das Letztere den Carbonyl Kohlenstoff der Peptidyl tRNA angreift. 17(B) zeigt ein protoniertes N3, das das tetrahedrische Kohlenstoff Intermediat durch Wasserstoffbrückenbindung an das Oxyaninon stabilisiert. 17(C) zeigt das Proton, das von dem N3 auf das Peptidyl tRNA 3' OH transferiert wurde, wenn das neu gebildete Peptid deacyliert.
18(A) und (B) zeigen raumfüllende Darstellungen der 50S ribosomalen Untereinheit mit den 3 tRNA Molekülen in der gleichen relativen Orientierung, die in der 70S Ribosom Struktur durch Noller und Kollegen vorgefunden wurde, die an die CCAs gedockt sind, die in der A-Stelle und P-Stelle gebunden sind. Insbesondere zeigt 18(A), gezeigt auf der linken Seite, die gesamte Untereinheit in rotierter Kronenansicht mit der rRNA in Gelb, Proteinen in Rosa und tRNAs in Orange. 18(B), gezeigt auf der rechten Seite, zeigt eine Nahansicht, die die nummerierten Proteine in Rosa und die rRNA in Blau zeigt. Eine Rückrat Bänder Darstellung der A-, P-, und E-Stellen wird in Gelb, Rot bzw. Weiß gezeigt.
19(A)-(F) zeigen den Polypeptidaustrittstunnel. Insbesondere zeigt 19(A) die in Hälften geschnittene Untereinheit, wobei ihre zentrale Vorwölbung und ihr Peptidtunnel entlang der gesamten Länge grob in zwei Teile geteilt werden. Die zwei Hälften wurden wie die Seiten eines Buches geöffnet. Alle Ribosomen Atome sind als CPK Darstellung gezeigt, wobei alle RNA Atome, die nicht in Kontakt zu Lösungsmittel stehen, in Weiß gezeigt werden und alle Protein Atome, die nicht in Kontakt zu Lösungsmittel stehen, in Grün gezeigt werden. Oberflächenatome von sowohl Protein als auch RNA sind farbkodiert mit Kohlenstoff in Gelb, Sauerstoff in Rot, und Stickstoff in Blau. Ein möglicher Weg für ein Polypeptid, das durch den Tunnel läuft, wird als ein weißes Band gezeigt. Die Peptidyltransferase Stelle (PT) ist auch gezeigt. 19(B) zeigt Details des Polypeptid Austrittstunnels mit der Verteilung von polaren und nicht polaren Gruppen, wobei die Atome gefärbt sind wie in 19(A), die Verengung in dem Tunnel, die durch Proteine L22 und L4 (grüne Flächen nahe bei PT), und den relativ weiten Ausgang des Tunnels. Ein modelliertes Polypeptid ist in Weiß. 19(C) zeigt die Tunneloberfläche mit Rückratatomen der RNA farbkodiert nach Domäne: Domäne I (weiß), II (hellblau), III (gold), IV (grün), V (orange), 5S (rosa) und die Proteine sind blau. Das Peptidyltransferase Zentrum (PTC) ist gezeigt. 19(D) ist eine Raumfüllungs-Darstellung der Oberfläche der großen Untereinheit am Tunnelausgang, die die Anordnung der Proteine zeigt, von welchen einige eine Rolle bei der Proteinsezernierung spielen können. Die RNA ist in Weiß (Basen) und Gelb (Rücktat) und die nummerierten Proteine sind blau. Ein modelliertes Polypeptid verlässt den Tunnel in Rot. 19(E) zeigt eine Nahansicht der Hälfte des Austrittstunnels, der die Beziehung des Peptidyltransferase Zentrums (PTC) zu den Proteinen L4 (gelb) und L22 (blau) zeigt. Der Yarus Inhibitor und ein modelliertes Peptid sind violett und 23S rRNA ist in Rot und Weiß. 19(F) zeigt ein Sekundärstrukturschema einer 23S rRNA, das die Sequenzen identifiziert, die zu dem Tunnel in Rot in Kontakt stehen.
20 ist ein Bild, das die räumliche Beziehung zwischen dem Antibiotikum Anisomycin gebunden an eine große ribosomale Untereinheit zeigt.
21 ist ein Bild, das die räumliche Beziehung zwischen dem Antibiotikum Blasticidin gebunden an eine große ribosomale Untereinheit zeigt.
22 ist ein Bild, das die räumliche Beziehung zwischen den Antibiotika Carbomycin und Tylosin gebunden an eine große ribosomale Untereinheit zeigt.
23 ist ein Bild, das die räumliche Beziehung zwischen dem Antibiotikum Sparsomycin gebunden an eine große ribosomale Untereinheit zeigt.
24 ist ein Bild, das die räumliche Beziehung zwischen den Antibiotika Virginamycin (Streptogramin A) und Carbomycin gebunden an eine große ribosomale Untereinheit zeigt.
25 ist ein Bild, das die räumliche Beziehung bestimmter Antibiotika, nämlich Anisomycin, Blasticidin, Carbomycin und Virginamycin gebunden an eine große ribosomale Untereinheit zeigt. Die Lokalisierung der gebundenen Antibiotika sind gezeigt relativ zu der A-Stelle, P-Stelle und dem Polypeptidaustrittstunnel.
26(A)-(C) sind Bilder, die eine Peptidyltransferase Stelle zeigen, angeordnet innerhalb einer großen ribosomalen Untereinheit. 26A zeigt ein gebundenes Tylosin Molekül, und identifiziert ein Disaccharid Bindungstasche und zwei Höhlungen bezeichnet als „Höhlung 1" und „Höhlung 2". 26(B) und (C) werden auf der linken Seite bereitgestellt, um dem Leser in Hinsicht auf die Lokalisierungen der Peptidyltransferase Stelle (PT) und des Polypeptidaustrittstunnels in der großen ribosomalen Untereinheit zu orientieren.
27 ist eine schematische Darstellung eines Computersystems nützlich für das molekulare Modellieren einer ribosomalen Untereinheit und/oder für das Durchführen von rationalem Wirkstoff Design.
28 ist eine schematische Darstellung bestimmter potentieller Wirkstoff Zielstellen in einer großen ribosomalen Untereinheit.
29(A)-(D) sind Bilder, die die Reste innerhalb der Wand des Polypeptidsaustrittstunnels zeigten, die konserviert (rot) oder nicht konserviert (blau) zwischen E. coli und Ratte sind. Die ribosomale Untereinheit wurde den Polypeptidaustrittstunnel hinunter aufgeschnitten, wobei die eine Hälfte des Polypeptidaustrittstunnels in 29(A) gezeigt ist und die andere Hälfte des Polypeptidaustrittstunnels in 29(B) gezeigt ist. 29(C) wird bereitgestellt, um den Leser zu orientieren, um die Lokalisation des Teils der ribosomalen Untereinheit, gezeigt in 29(A), relativ zu der ribosomalen Untereinheit als ein Ganzes zu zeigen. 29(D) wird bereitgestellt, um den Leser zu orientieren, um die Lokalisation des Teils der ribosomalen Untereinheit, gezeigt in 29(B), relativ zu der ribosomalen Untereinheit als ein Ganzes zu zeigen.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
I. Definitionen
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „aktive Stelle" auf Regionen auf einem Ribosom oder einer ribosomalen Untereinheit, die direkt in der Proteinsynthese involviert sind, z.B. die Peptidyltransferase Stelle, die Elongationsfaktor Bindungsstelle, und andere ähnliche Stellen.
Wie hier verwendet, werden die Begriffe „Agens" und „Ligand" synonym verwendet und beziehen sich auf jedes Atom, Molekül, oder chemische Gruppe, die an ein Ribosom_; ribosomale Untereinheit oder ribosomales Fragment bindet. Somit schließen Liganden ein, sind aber nicht eingegrenzt auf, ein einzelnes Schweratom, ein Antibiotikum, eine tRNA, eine Peptidyl tRNA, eine Aminoacyl tRNA, oder ein Signalerkennungspartikel („SRP").
Wie hier verwendet, bezieht sich „Archaebakterien" auf ein Reich von Moneranen, die Methanerzeuger, Schwefel abhängige Spezies, und viele andere Spezies einschließen, die sehr salzige oder heiße Umgebungen tolerieren.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „A-Stelle" auf den Lokus, den eine Aminoacyl-tRNA Molekül unmittelbar vor seiner Beteiligung an der Peptidbindungs-bildenden Reaktion innehat Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „asymmetrische Einheit" auf einen minimalen Satz von Atom Koordinaten, der nach Bearbeitung mit den Symmetrieoperationen eines Kristalls den gesamten Kristall wieder erzeugt.
Wie hier verwendet, wird unter „wenigstem einen Teil von" oder „wenigstem einen Teil der dreidimensionalen Struktur von" verstanden, dass ein Teil der dreidimensionalen Struktur eines Ribosoms oder ribosomalen Untereinheit, einschließlich der Ladungsverteilung und der Hydrophilzitäts-/Hydrophobizitätseigenschaften, bevorzugt gebildet aus wenigstens drei, bevorzugter aus wenigstens drei bis zehn, und am bevorzugtesten wenigstens zehn auf einander folgende Aminosäuren – und/oder Nukleotidresten des Ribosoms oder der ribosomalen Untereinheiten. Die auf einander folgenden Reste, die solche einen Teil bilden, können Reste sein, die einen auf einander folgenden Teil der primären Sequenz einer ribosomalen RNA oder eines ribosomalen Proteins bilden, Reste sein, die einen zusammen hängenden Teil der dreidimensionalen Struktur des Ribosoms oder ribosomalen Untereinheit, oder eine Kombination davon, bilden. Somit müssen die Reste, die einen Teil der dreidimensionalen Struktur bilden, nicht in der Primärsequenz aneinander grenzen, sondern müssen eher im Raum zusammenhängend sein. Wie hier verwendet, bilden die Reste, die „einen Teil der dreidimensionalen Struktur von" einem Ribosom oder einer ribosomalen Einheit bilden, ein zusammenhängende dreidimensionale Form, in der jedes Atom oder funktionale Gruppe, die den Teil der Form bildet, von dem nächsten Atom oder der nächsten funktionalen Gruppe, die den Teil der Form bildet, durch nicht mehr als 40 Å, vorzugsweise nicht mehr als 20 Å, noch bevorzugter durch nicht mehr als 5-10 Å und am bevorzugtesten durch nicht mehr als 1-5 Å getrennt ist.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Atom Koordinaten" oder „Struktur Koordinaten" auf mathematische Koordinaten (dargestellt als „X", „Y" und „Z" Werte), die die Positionen von Atomen in einem Kristall eines Ribosoms oder ribosomalen Untereinheit beschreiben. Die Beugungsdaten, gewonnen aus diesen Kristallen, werden verwendet, um eine Elektronendichtekarte der Wiederholungseinheit des Kristalls zu berechnen. Die Elektronendichtekarten werden verwendet, um die Positionen der individuellen Atome innerhalb einer einzelnen ribosomalen Untereinheit zu etablieren. Für den Fachmann versteht sich, dass ein Satz von Struktur Koordinaten, der durch Röntgenstrahlen Kristallographie bestimmt wurde, nicht ohne Standartfehler ist. Für die Zwecke dieser Erfindung besitzt jeder Satz von Struktur Koordinaten für ein Ribosom und eine ribosomale Untereinheit aus jeder Quelle eine mittlere quadratische Abweichung von Nicht-Wasserstoff Atomen von weniger als 0.75 Å, wenn sie mit den Nicht-Wasserstoff Atompositionen der besagten Atom Koordinaten übereinander gelegt werden, die bei der Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank (PDB) (Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research 28, 235-242; http:www.rcsb.org/pdb) unter den Accession Numbers PDB ID: 1FFK; PDB ID: 1FFZ; PDB ID: 1FG0; oder PDB ID: 1JJ2 hinterlegt wurden, wobei jede der vorstehenden Offenbarung hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist.
In der Liste von Atom Koordinaten, die bei der RSCB Protein Data Bank hinterlegt sind, oder hier als Dateien eingeschossen sind, die auf den Compact Disks aufgezeichnet sind, bezieht sich der Begriff „Atom Koordinaten" oder Struktur Koordinaten auf die gemessene Position eines Atoms in der Struktur in dem Protein Data Bank (PDB) Format, einschließlich für jedes X, Y, Z und B. Der Begriff „Atom Typ" bezieht sich auf das Element, dessen Koordinaten gemessen werden. Der erste Buchstabe in der Spalte definiert das Element. Der Begriff „X", „Y", „Z" bezieht sich auf die kristallographisch definierte Atom Position des Elements, das unter Bezug auf den gewählten kristallographischen Ursprung gemessen wurde. Der Begriff „B" bezieht sich auf einen thermalen Faktor, der die mittlere Abweichung einer Atom Position gegenüber seiner Durchschnittsposition misst.
Es wird Bezug genommen auf die Sätze von Atom Koordinaten und in Beziehung stehender Tabellen, die mit dieser Beschreibung eingeschlossen sind und auf Compact Disk eingereicht sind (sechs Compact Disks insgesamt einschließlich dreier Original Compact Disks und einem Duplikat jeder der Original Compact Disks), wobei alles Vorstehende hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Disk Nr. 1 von 3 enthält acht Dateien; Disk Nr. 2 von 3 enthält vier Dateien; und Disk Nr. 3 von 3 enthält neun Dateien. Disk Nr. 1 von 3 enthält die als PDB1FFK.DOC und PDB1FFK.ENT identifizierten Dateien, die Dateien von Koordinaten darstellen, die die große ribosomale Untereinheit definieren; PDB1FFZ.DOC und PDB1FFZ.ENT, die die Dateien der Koordinaten darstellen, die die große ribosomale Untereinheit-CCdA-p-Puro Komplex definieren; und PDB1FG0.DOC und PDB1FG0.ENT, die die Dateien der Koordinaten darstellen, die die große ribosomale Untereinheit-aa-tRNA Analog Komplex definieren. Disk Nr. 2 von 3 enthält die als 1JJ2.RTF und 1JJ2.TXT identifizierten Dateien, die Dateien von Koordinaten darstellen, die die vollständig verfeinerte große ribosomale Untereinheit definieren. Disk Nr. 3 von 3 enthält die als anisomycin.pdb, blasticidin.pdb, carbomycin.pdb, sparsomycin.pdg, spiramycin.pdb, tylosin.pdb und virgianiamycin.pdb identifizierten Dateien, die die Dateien der Koordinaten darstellen, die die große ribosomale Untereinheit gebunden an Anisomycin, Blasticidin, Carbomycin, Sparsomycin, Spiramycin, Tylosin bzw. Virgianiamycin definieren.
Wie für den Fachmann offensichtlich ist, sind die hier dargestellten Atom Strukturen unabhängig von ihrer Orientierung, und die hier identifizierten Atom Koordinaten stellen nur eine mögliche Orientierung einer bestimmten großen ribosomalen Untereinheit dar. Es ist daher offensichtlich, dass die hier identifizierten Atom Koordinaten mathematisch rotiert, verschoben, skaliert werden können, oder eine Kombination davon, ohne die relativen Positionen der Atome oder Eigenschaften der jeweiligen Struktur zu ändern. Solche mathematischen Manipulationen sollen hier umfasst sein.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Atom Koordinaten abgeleitet aus" und „Atome abgeleitet aus" auf Atom Koordinaten oder Atome abgeleitet, entweder direkt oder indirekt, aus Elektronendichtekarte. Es versteht sich, dass Atom Koordinaten oder Atome, die „direkt" aus einer Elektronendichtekarte abgeleitet sind, sich auf Atom Koordinaten oder Atome beziehen, die aus und/oder eingepasst sind in eine Elektronendichtekarte mittels konventioneller kristallographischer und/oder molekulare Modellierungstechniken und somit als primäre Atom Koordinaten oder Atome betrachtet werden können. Es versteht sich, dass Atom Koordinaten oder Atome, die „indirekt" aus einer Elektronendichtekarte abgeleitet sind, sich auf Atom Koordinaten oder Atome beziehen, die abgeleitet sind aus und somit Derivate von oder Transformation von den Atom Koordinaten und Atome sind und somit als sekundäre Atom Koordinaten oder Atome betrachtet werden können. Die sekundären Atom Koordinaten oder Atome können erzeugt werden aus den primären Atom Koordinaten oder Atomen durch Verwendung konventioneller molekularer Modellierungstechniken. Als ein nicht einschränkendes Beispiel hierfür werden die Atom Koordinaten für die große H. marismortui ribosomale Untereinheit, wie hier unten beschrieben, als primäre Koordinaten betrachtet, während die Atom Koordinaten einer großen Säuger ribosomalen Untereinheit, die von H. marismortui Atom Koordinaten durch molekulares Modellieren abgeleitet werden kann, einschließend, zum Beispiel Homologie Modellieren und/oder molekulare Ersetzung als sekundäre Koordinaten betrachtet werden. Beide Typen von Atom Koordinaten und Atomen werden als durch die Erfindung umfasst betrachtet.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „binden", „Binden", „gebunden", „Bindung" oder „in Bindung", wenn sie unter Bezug auf die Assoziierung von Atomen, Molekülen oder chemischen Gruppen verwendet werden, auf jeden physikalischen Kontakt oder Assoziierung von zwei oder mehreren Atomen, Molekülen oder chemischen Gruppen (z.B. der Bindung eines Liganden mit einer ribosomalen Untereinheit bezieht sich auf den physikalischen Kontakt zwischen dem Liganden und der ribosomalen Untereinheit). Solche Kontakte und Assoziierungen schließen ein kovalente und nicht kovalente Typen von Wechselwirkungen.
Wie hier verwendet, beziehen sich die Begriffe „Komplex" und „komplexiert" auf den Zusammenbau von zwei oder mehreren Molekülen, um eine Struktur höherer Ordnung zu ergeben, wie einer 50S ribosomalen Untereinheit gebunden an einen Liganden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „berechnete Chemie" auf Berechnungen der physikalischen und chemischen Eigenschaften der Moleküle.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „konjugiertes System" auf mehr als zwei Doppelbindungen, die räumlich so positioniert sind, dass ihre Elektronen vollständig im ganzen System delokalisiert sind. Aromatische Reste enthalten konjugierte Doppelbindungssysteme.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „kovalente Bindung" oder „Valenz Bindung" auf eine chemische Bindung zwischen zwei Atomen in einem Molekül, die durch das Teilen von Elektronen geschaffen werden, gewöhnlich in Paaren, durch die Atome in Bindung.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Kristall" auf jede dreidimensional geordnete Anordnung von Molekülen, die Röntgenstrahlen beugen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „kristallographischer Ursprung" auf einen Bezugspunkt in der Einheitszelle für eine kristallographische Symmetrieoperation.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Elongationsfaktor Bindungsdomäne" auf die Region des Ribosoms, die direkt mit Elongationsfaktoren wechselwirkt, einschließlich zum Beispiel der Elongationsfaktoren EF-Tu und EF-G.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „E-Stelle" auf den Lokus, der durch ein deacyliertes tRNA Molekül belegt ist, es verlässt das Ribosom nach seiner Teilnahme an der Peptidbindungsbildung.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Schweratom Derivatisierung" auf das Verfahren zum Herstellen einer chemisch modifizierten Form, auch bekannt als ein „Schweratom Derivat", eines Kristalls des Ribosoms und der ribosomalen Untereinheit und ihre Komplexe. In der Praxis wird ein Kristall mit einer Lösung durchtränkt enthaltend Schweratome Salze, oder organometallische Verbindungen, z.B. Quecksilber-chlorid, Etyhl-Quecksilber Phosphat, Osmium-pentamin oder Iridium-pentamin, die durch den Kristall diffundieren können und an das Ribosom oder die ribosomale Untereinheit binden. Die Lokalisierungen) des gebundenen Schwermetall Atoms(e) kann durch Röntgenstrahlen Beugungsanalyse des durchtränkten Kristalls bestimmt werden. Diese Information wiederum kann verwendet werden, um Phaseninformation zu erzeugen, die verwendet wird, um die dreidimensionale Struktur des Komplexes zu konstruieren (Blundell et al. (1976) supra).
Wie hier verwendet, wird der Begriff „Homolog" verstanden jedes oder eine Kombination von (i) jedem Protein zu meinen, das aus einem Ribosom oder einer ribosomalen Untereinheit (d.h. ein ribosomales Protein) isoliert oder isolierbar ist (d.h. eine ribosomale RNA), (ii) jede Nukleinsäuresequenz, die aus einem Ribosom oder einer ribosomalen Untereinheit (d.h. ein ribosomales Protein) isoliert oder isolierbar ist, (iii) jedem Protein mit wenigstens 25% Sequenzidentität zu einem ribosomalen Protein, das aus E. coli oder Rattus norwegicus isoliert wurde, aufweist, wie mit dem Computer Programm „BLAST" Versionsnummer 2.1.1 unter Verwendung der Standartparameter bestimmt wurde, oder (iv) jeder Nukleinsäure mit wenigstens 30% Sequenzidentität zu einer ribosomalen RNA, die aus E. coli oder Rattus norwegicus isoliert wurde, aufweist, wie mit dem Computer Programm „BLAST" Versionsnummer 2.1.1 unter Verwendung der Standartparameter bestimmt wurde. „BLAST" Versionsnummer 2.1.1 ist verfügbar oder zugänglich über das Word Wide Web unter http://ncibi.nlm.nih.gov/BLAST/ oder kann lokal ausgeführt werden als ein voll ausführbares Programm auf einem allein stehenden Rechner.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Homologie Modellierung" auf die Tätigkeit dreidimensionalen Strukturen von Makromolekülen aus existierenden dreidimensionalen Strukturen für ihre Homologe abzuleiten. Homologie Modelle werden mit Computer Programmen erhalten, die es möglich machen, die Identität von Resten an Positionen zu ändern, bei denen die Sequenz des interessierenden Moleküls nicht die gleiche ist wie bei dem Molekül der bekannten Struktur.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Wasserstoff Brückenbindung" auf zwei elektronegative Atome (entweder O oder N), die sich ein Wasserstoff teilen, das kovalent nur an ein Atom gebunden ist, während es mit dem anderen wechselwirkt.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „hydrophobe Wechselwirkung" auf Wechselwirkungen, die durch zwei hydrophobe Reste gemacht werden.
Wie hier verwendet, werden ribosomale Protein als „LX" oder „SX" bezeichnet, wobei L für „große Untereinheit" steht; S für „kleine Untereinheit" steht; und X in jeder der Fälle eine natürliche Zahl ist.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „MIR" auf multiple isomorphe Ersetzung, eine Technik, die verwendet wird, um Phaseninformation aus Kristallen abzuleiten, die mit Schweratom Verbindungen behandelt wurden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „molekulare Graphiken" auf dreidimensionale Darstellungen von Atomen, vorzugsweise auf einem Computer Schirm.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „molekulares Modell" oder „molekulare Struktur" auf die dreidimensionale Anordnung von Atomen innerhalb eines bestimmten Objekts (z.B. die dreidimensionale Struktur der Atome, die ein Ribosom oder ribosomale Untereinheit umfassen, und die Atome, die einen Liganden umfassen, der mit einem Ribosom oder einer ribosomalen Untereinheit wechselwirken, insbesondere mit einer großen ribosomalen Untereinheit, vor allem mit einer 50S ribosomalen Untereinheit).
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „molekulares Modellieren" auf ein Verfahren oder eine Prozedur, die mit oder ohne einen Computer ausgeführt werden kann, um ein oder mehrere Modelle zu erstellen, und wahlweise Vorhersagen über die Strukturaktivitäts-Beziehungen der Liganden zu produzieren. Die Verfahren, die beim molekularen Modellieren verwendet werden, reichen von molekularen Graphiken bis zu berechneter Chemie.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „molekulare Ersetzung" auf ein Verfahren, das involviert, ein Modell eines Ribosoms oder ribosomalen Einheit zu erzeugen, deren Atom Koordinaten unbekannt sind, indem die Atom Koordinaten, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden, in der Einheitszelle des Kristalls des unbekannten Ribosoms ausgerichtet und zu positioniert werden, um so am besten dem beobachteten Beugungsmuster des unbekannten Kristalls Rechnung zu tragen. Phasen können dann aus diesem Modell kalkuliert werden und kombiniert werden mit den beobachteten Amplituden, um die Atom Koordinaten des unbekannten Ribosoms oder der unbekannten ribosomalen Untereinheit zu ergeben. Dieser Verfahrenstyp ist beschrieben zum Beispiel in The Molecular Replacement Method (Rossmann, M.G. Hrg.), Gordon & Breach, New York, (1972).
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „nicht kovalente Bindung" auf eine Wechselwirkung zwischen Atomen und/oder Molekülen, die nicht die Bildung eine kovalenten Bindung zwischen diesen involviert.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Peptidyltransferase Stelle" auf den Lokus in der großen ribosomalen Untereinheit, an dem Peptidbindungen synthetisiert werden.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Polypeptidaustrittstunnel" auf den Kanal, der durch die große ribosomale Untereinheit von der Peptidyltransferase Stelle zu dem Äußeren des Ribosoms verläuft, durch den neu synthetisierte Polypeptide hindurch treten.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Proteinsyntheseinhibitor" auf jedes Molekül, das Protein- oder Polypeptidsynthese in einem Ribosom vermindern, hemmen oder auf andere Weise unterbrechen kann.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „P-Stelle" auf den Lokus, der durch eine Peptidyl-tRNA zu dem Zeitpunkt besetzt wird, zu dem sie an der Peptidbindungsbildungsreaktion teilnimmt.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „ribofunktionaler Lokus" auf einen Bereich des Ribosoms oder ribosomalen Untereinheit, der entweder aktiv oder passiv an der Protein- oder Polypeptidsynthese innerhalb des Ribosoms oder ribosomalen Untereinheit und/oder am Export oder der Translokation eines Proteins oder Polypeptids aus einem Ribosom teilnimmt. Der ribofunktionale Lokus kann einschließen, zum Beispiel eines Teils einer Peptidyltransferase Stelle, eine A-Stelle, eine P-Stelle, eine E-Stelle, eine Elongationsfaktor Bindungsdomäne, einen Polypeptidaustrittstunnel und einen Signalerkennungspartikel (SRP) Bindungsdomäne. Es versteht sich, dass der ribofunktionale Lokus nicht eine bestimmte Topologie besitzt, sondern auch eine bestimmte Oberflächenchemie, die durch Atome definiert wird, die zum Beispiel an Wasserstoffbrückenbindung teilnehmen (zum Beispiel, Proton Donoren und/oder Akzeptoren), bestimmte elektrostatische Eigenschaften und/oder hydrophilen oder hydrophoben Charakter besitzen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „ribosomale Untereinheit" auf eine der zwei Untereinheiten des Ribosoms, der während der Initiierungsphase der Proteinsynthese unabhängig funktionieren können, aber die zusammen ein Ribosom bilden. Zum Beispiel umfasst ein prokaryotisches Ribosom eine 50S Untereinheit (große Untereinheit) und eine 30S Untereinheit (eine kleine Untereinheit).
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Ribosom" auf einen Komplex umfassend eine große ribosomale Untereinheit und eine kleine ribosomale Untereinheit.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Signalerkennungspartikel Bindungsdomäne" auf den Teil des Ribosoms, der direkt mit dem Signalerkennungspartikel wechselwirkt.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Raumgruppe" auf die Anordnung von Symmetrieelementen eines Kristalls.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Symmetrieoperation" auf eine Operation in der vorgegebenen Raumgruppe, die die Atome in einer asymmetrischen Einheit auf den korrespondierenden Atomen in einer anderen asymmetrischen Einheit ableiten.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „verzwillingt" auf einen einzelnen makroskopischen Kristall, der mikroskopische Domänen der gleichen Symmetrie enthält, die sich signifikant in der Orientierung unterscheiden, so dass die Beugungsmuster aller übereinander gelagert sind. In einem verzwillingten Kristall sind die Mosaik Blöcke oder Domänen so orientiert, dass einige in eine Richtung und andere in eine zweite, distinkt verschiedene Richtung, zeigen, und die Richtungen so sind, dass das Beugungsmuster, das durch eine Gruppe von Blöcken erzeugt wird, genau auf das Beugungsmuster der anderen Gruppe fällt.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „nicht verzwillnigt" auf eine Kristallzelle, deren Domänen ausgerichtet sind. Die Domänen sich auch als die „Mosaik Blöcke" bekannt. Die meisten Kristalle beugen als ob sie aus Mosaik Blöcken aufgebaut wären. Man kann sie sich als kleine perfekt geordnete Bereiche innerhalb des größeren Kristalls vorstellen, der insgesamt nicht so gut geordnet ist. Jeder Block hat die gleiche Symmetrie und Einheitszellpackung wie all die anderen.
Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „Einheitszelle" auf einen einfachen paralleleptischen Block. Das gesamte Volumen des Kristalls kann durch regelmäßigen Aufbau aus solchen Blöcken konstruiert sein. Jede Einheitszelle umfasst eine komplette Darstellung der Einheit des Musters, dessen Wiederholung den Kristall aufbaut.
II. Struktur und Verwendung der großen ribosomalen Untereinheit
A. Atomare Struktur der großen ribosomalen Untereinheit bei 2.4 Å Auflösung, erste Verfeinerung
Die vorliegende Erfindung basiert zum Teil auf der Entwicklung eines neuen Verfahrens, um Kristalle von Ribosomen herzustellen. Das neue Verfahren stellt Kristalle der 50S ribosomalen Untereinheit zur Verfügung, die viel dicker sind als die früher verfügbaren, und die Röntgenstrahlen bei einer Auflösung von ungefähr 2.4 Å beugen können. Das Verfahren eliminiert das Verzwillingen der Kristalle, die die Bestimmung der Kristallstruktur der 50S ribosomalen Untereinheit von H. marismortui für viele Jahre behinderte. Das Verfahren zum Herstellen der Kristalle der 50S ribosomalen Untereinheit wird unten diskutiert.
Die vorliegende Erfindung basiert auch zum Teil auf der Atom Struktur des Kristalls der 50S ribosomalen Untereinheit von H. marismortui, die aus einer Elektronendichtekarte mit einer 2.4 Å Auflösung abgeleitet wurde, die mit Schweratom Derivaten experimentell in Phase gebracht wurde. Die Atom Koordinaten, die die große ribosomale Untereinheit definieren, wurden am 10. Juli 2000 bei Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank (PDB) (Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research 28, 235-242; http:www.rcsb.org/pdb) unter der Accession Number PDB ID: 1FFK hinterlegt.
Darüber hinaus basiert die vorliegende Erfindung zum Teil auf der Ableitung aus den Atom Koordinaten des folgenden Modells, das hier kurz zusammengefasst wird und im Detail in den folgenden Abschnitten der Beschreibung diskutiert wird. Das Modell schließt 2811 der 2923 Nukleotide der 23S rRNA, alle 122 Nukleotide seiner 5S rRNA und Strukturen der 27 Proteine, die in der Untereinheit gut geordnet sind, ein.
Die Sekundärstrukturen sowohl von der 5S als auch der 23S rRNA sind bewerkenswert ähnlich zu denjenigen, die für sie durch phylogenetischen Vergleich abgeleitet wurden. Die Sekundärstruktur der 23S rRNA teilt sich in 6 große Domänen, von denen jede eine hoch asymmetrische Tertiärstruktur besitzt. Trotz der Irregularitäten ihrer Formen, passen die Domänen in einer Schlüssel Schloss Manier zusammen, um eine kompakte Masse an RNA zu ergeben, die fast isometrisch ist. Die Proteine sind über die Struktur verteilt, hauptsächlich auf der Oberfläche konzentriert, sind aber weniger häufig in den Bereichen der Untereinheit, die von primärer funktionaler Signifikanz für die Proteinsynthesen – die 30S Untereinheit Schnittstelle, die Bindungsbereiche für tRNA und die Peptidyltransferasen Stelle – sind. Die überraschenste Eigenschaft vieler dieser Proteine sind die ausgedehnten, irregulären Strukturen ihrer Loops und Termini, die zwischen den RNA Helices hindurch treten. Die primäre Rolle der meisten der Proteine in der Untereinheit scheint die Stabilisierung der dreidimensionalen Struktur ihrer rRNA zu sein.
1. Herstellung des Kristalls für die 50S ribosomale Untereinheit und Strukturbestimmung
Zahlreiche experimentelle Ansätze wurden verwendet um die Auflösung der Elektronendichtekarten der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit von 5 Å auf 2.4 Å zu erhöhen einschließlich Verbesserungen in dem Kristall. Eine Rückextraktionsprozedur wurde entwickelt, um reproduzierbar Kristalle zu züchten, die viel dicker sind, als die früher verfügbaren und bis zu 2.2 Å Auflösung beugen können (siehe Beispiel 1). Kurz gesagt wurden die Kristalle bei Raumtemperatur in hängenden Tropfen durch Dampfdiffusion aus angesetzten Lösungen, die aus gefällten Untereinheiten rückextrahiert wurden, gezüchtet. Die Kristalle, die resultierten, hatten die maximalen Maße 0.5 × 0.5 × 0.2 mm und wurden nach drei Wochen eingesammelt. Das Verzwillingen der Kristalle, das den Fortschritt für viele Jahre behinderte (Ban et. (1999) supra) wurde eliminiert durch Anpassen der Kristallstabilisierungsbedingungen (siehe Beispiel 1). Kristalle wurden stabilisiert durch allmähliche Überführung in eine Lösung enthaltend 12% PEG 6000, 22% Ethylen-glykol, 1,7 M NaCl, 0.5 M NH₄Cl, 100 mM Kalium-acetat, 30 mM MgCl₂ und 1 mM CdCl₂, pH 6.2 und Schockgefrieren in flüssigem Propan. Erniedrigen der Salzkonzentration unter 1.7 M NaCl (KCl) erhöhte die Tendenz der Kristalle verzwillingt zu werden. Bei niedrigen Salzkonzentrationen von 1.2 M waren fast alle Kristalle verzwillingt.
All die Röntgenstrahlen Daten, die für Hoch-Auflösungs-Phasenbestimmung verwendet wurden, wurden an dem Brookhaven National Synchroton Light Source gesammelt mit der Ausnahme von zwei verwendeten nativen Datensätzen, die am Advanced Photon Source at Argonne gesammelt wurden (siehe Beispiel 2) (Tabelle 1). Osmium-pentamin (132 Stellen) und Iridium-hexamin (84 Stellen) Derivate erwiesen sich am effektivsten bei der Herstellung sowohl der isomorphen Ersetzungs- als auch anomaler Streungs-Phaseninformation bis 3.2 Å Auflösung (siehe Beispiel 2). Zwischenkristall Dichtemittelung, die bei niedriger Auflösung einen signifikanten Beitrag leistete, war jenseits von ungefähr 5 Å nicht hilfreich. Elektronendichtekarten wurden erheblich verbessert und ihre Auflösungen erhöht, letztlich bis 2.4 Å, mittels der Lösungsmittel Flippingprozedur in CNS (Abrahams et al. (1996) Acta Crystollogr. D 52: 30; Brünger et al. (1998) Acta Crystollogr. D Biol. Crystollogr. 54 : 905-921). Tabelle 1 Statistiken zur Datensammlung, Phasenbestimmung und Modellkonstruktion

Wellenlänge; Redun., Redundanz; (*) Letzt-Auflösungs-Schale.
R_iso: Σ|F_PH – F_p|/Σ F_PH, wobei F_PH und F_p die Derivat bzw. die Nativ Struktur Faktor Amplituden sind. R_sym: ΣΣ_i|I_(h) – I_(h)i|/ΣΣ: I_(h)i, wobei I(h) die mittlere Dichte nach den Reflektionen ist. Phasenenergie: r.m.s. isomorphe Differenz geteilt durch den r.m.s Restschließungsmangel. R_cullis: Σ(||F_PH – F_p| – |F_H(calc)||)/Σ|F_PH – F_p|, wobei F_PH der Strukturfaktor des Derivats und F_p der der nativen Daten ist. Die Summierung ist nur gültig für zentrische Reflektion. FOM („Figure of merit"): mittlerer Wert des Kosinus der Fehler in den Phasenwinkeln. Abkürzungen: MIRAS: multiple isomorphe Ersetzung, anomale Streuung; SAD: Einzel-Wellenlängen anomale Beugung; FOM: „figure of merit"

Abgesehen von den Bereichen, die durch Unordnung nicht erkennbar waren, war die experimentell in Phase gebrachte Elektronendichtekarte mit 2.4 Å Auflösung von ausreichender Qualität, so dass sowohl Protein- als auch Nukleinsäuresequenzierungsfehler identifiziert und korrigiert werden konnten. Jedes Nukleotid konnte individuell eingepasst werden und die Differenz zwischen A und G war für gewöhnlich ohne Bezugnahme auf die Sequenz klar, wie auch die Unterscheidung zwischen Purinen und Pyrimidinen (1).
Subtraktion des Atom Modells von der experimentellen Elektronendichtekarte lässt keine signifikante Dichte außer für Wasser und Ionen zurück, was zeigt, dass das Modell der gesamten makromolekularen Dichte Rechnung trägt. Vorläufige Verfeinerung des Modells wurde erreicht mit einem gemischten Ziel in dem Programm CNS (Brünger et al. (1998) supra). Das Modell wurde weiter verfeinert im realen Raum gegen die 2.4 Å Elektronendichtekarte mit dem Programm TNT (Tronrud (1997), Makromolecular Crystallography, Part B, Methods in Enzymology), das ein Model ergab mit einem freien R-Faktor von 0.33. Eine zusätzliche Runde der gemischten Ziel Verfeinerung beider atomarer Positionen und B-Faktoren mit CNS führte zu der unten beschriebenen Struktur. Ihr freier R-Faktor ist 0.27 (Tabelle 1).
2. Sequenz Einpassung und Protein Identifikation
Die Sequenz der 23S rRNA wurde in die Elektronendichtekarte Nukleotid für Nukleotid eingepasst, beginnend mit ihrer Sarcin/Ricin Loop Sequenz (A2691-A2702) (E. coli Nummern A2654 bis A2665), deren Position bei 5 Å Auflösung bestimmt worden war (Ban et al. (1999) supra). Geleitet durch die über die Sekundärstruktur der 23S rRNAs verfügbare Information (Gutell, R.R. (1996), „Comparative Sequence Analysis and the Structure of 16S and 23S rRNA", Ribosomal RNA. Structure, Evolution, Processing, and Function in Protein Biosynthesis, (Dahlberg A. und Zimmermann B., Hrg.), CRC Press. Boca Raton, Fl. S. 111-128), entsprach die verbleibende RNA Elektronendichte sehr gut der Sequenz von 5S rRNA. Die Interpretation der Protein Elektronendichte, die dem Protein entsprach, war komplizierter, da jede Proteinregion chemisch identifiziert werden musst bevor die korrekte Sequenz in sie eingepasst werden konnte, aber ungefähr 4000 Aminosäurereste wurden in die Elektronendichte eingepasst.
Die H. marismortui 50S Untereinheit erscheint 31 Proteine zu enthalten und es gibt in der Swiss-Prott Datenbank für 28 dieser 31 Proteine Sequenzen einschließlich einem, HMS6 oder L7ac, das ursprünglich der kleinen ribosomalen Untereinheit zugeschrieben wurde (Whittmann-Liebold et al. (1990) supra). Die drei verbleibenden Proteine wurden mit den Sequenzen der ribosomalen Proteine von Eukaryoten und anderen Archäen Sequenzen als Führer identifiziert. Für eines der H. marismortui großen ribosomales Untereinheitsproteine wurde keine Elektronendichte in der Sequenzdatenbank gefunden, LX. Entweder ist die Zuordnung von LX zu der großen Untereinheit fehlerhaft, oder LX ist mit einem ungeordneten Bereich der Untereinheit assoziiert, oder LX ist in den untersuchten Untereinheiten überhaupt nicht vorhanden.
Die Elektronendichtekarte mit 2.4 Å besitzt keine klaren Elektronendichten für Proteine L1, L10, L11 und L12, deren Positionen von früheren Nichtauflöungs-Röntgenstrahlen und/oder elektronenmikroskopischen Studien bekannt sind. Diese Proteine sich Komponenten der zwei lateralen Vorwölbungen der Untereinheit, die beide in diesen Kristallen schwach geordnet sind. L1 ist die alleinige Proteinkomponente eine dieser beiden (Oakes, M. et al. (1986), Structure, Function and Genetics of Ribosomes, (Hardesty, B. und Kramer, G., Hrg.) Springer Verlag, New York, NY, 47-67) und ist in Dichtekarten mit 9 Å Auflösung der Untereinheit vorhanden (Ban et al. (1998) supra), aber nicht bei höheren Auflösungen. L10, L11 und L12 sind Komponenten der anderen Vorwölbung, die oft als der L7/L12 „Stamm" bezeichnet wird (Oakes et al. (1986) supra). L11 und die RNA, an die es bindet wurden in der Elektronendichtekarte mit 5 Å Auflösung der H. marismortui großen Untereinheit lokalisiert (Ban et al. (1999) supra) mit den unabhängig bestimmten Kristallstrukturen dieses Komplexes (Conn GL et al. (1999) Science 284: 1171-1174; Wimberly et al. (1999) Cell 97: 491-502). Ein Proteinfragment (ungefähr 100 Reste), die mit dem RNA Stamm assoziiert ist, den den L11 Komplex stützt kann in der Karte mit 2.4 Å gesehen werden. Aufgrund seiner Lokalisierung muss es Teil von L10 sein. Bei keiner Auflösung wird eine Elektronendichte, die mit L12 korrespondiert, gesehen, aber vom L12 Tetramer ist bekannt, dass er an das Ribosom über L10 angebracht ist, und von der L10/L12 Anordnung ist bekannt, das es unter solchen Umständen flexibel ist (Moller et al. (1986) Structure, Function, and Genetics of Ribosomes), supra, S. 309-325, was seine Unsichtbarkeit hier erklären könnte.
Die Strukturen der eubakteriellen Homologe der Proteine L2, L4, L6, L14 und L22 wurden zuvor als Ganzes oder in Teilen bestimmt (siehe Tabelle 2). L2, L6 und L14 wurden anfangs in der Karte mit 5 Å Auflösung lokalisiert (Ban et al. (1999) supra). L4 und L22 wurden nun auf gleiche Weise identifiziert und positionierst. Elektronendichte, die den meisten der verbliebenen Proteine entsprach, wurde zugeordnet durch Vergleichen der Kettenlängen und Sequenzmotive, die aus der Elektronendichtekarte mit bekannte Sequenzlängen abgeleitet wurden geleitet durch die über relative Proteinpositionen verfügbaren Information (Walleczek et al. (1988) EMBO J. 7: 3571-3576) und Proteinwechselwirkungen mit 23S rRNA und 5S rRNA (Ostergaard et al. (1988) J. Mol. Biol. 284: 227-240). Jede der so identifizierten Protein-Elektronendichtekarten wird gut durch ihre Aminosäuresequenz gedeckt.
Das interessanteste der durch Sequenzähnlichkeit identifizierten Proteine war L7ae, das zuerst L30e zu sein schien. Die L30e Identifikation erschien plausibel, da die Struktur von Hefe L30 mit der Elektronendichte von L7ae sehr gut überlagert, und die Struktur der RNA, an die L7ae bindet, eng der RNA ähnelt, an die Hefe L30 bindet (Mao, H. et al. (1999) Nat. Struct. Biol. 6: 1139-1147). Nichtsdestotrotz passt die Sequenz von HMS6, die durch Sequenzähnlichkeit ein Mitglied der L7ae Proteinfamilie ist, besser in die Elektronendichte. Vier der anderen Proteine, die durch Sequenzähnlichkeit identifiziert wurden, L24e, L37e, L37ae und L44e enthalten Zinkfingermotive. Von den Ratten Homologen von L37e und L37ae wurden vorausgesagt, das sie aufgrund ihrer Sequenzen Zinkfingerproteine seien (Wool et al. (1995) supra), und diese Vorrausage half ihre Homologe in H. marismortui zu identizieren. Tabelle 2 Große Untereinheitsproteine aus Haloarcula Marismortui
Der obere Block von Proteinen schließt all diese ein, von denen man weiß, dass sie eubakterielle Homologe des gleichen Namens besitzen. Der zweite Block führt Proteine auf, die in der dex H. marismortui großen ribosomalen Untereinheit gefunden werden, die nur eukaryotische Homologe besitzen (Wittmann-Liebold et al. (1990) supra). All ihren Namen folgt der Buchstabe „c", um sie von eubakteriellen Proteinen zu unterscheiden, die sonst den gleichen Namen besäßen. Der dritte Block sind große Untereinheit Proteine, für die noch keine H. marismortui Sequenz existiext. Sie werden durch Sequenzhomologie mit Standart L Namen identifiziert.

¹Die Strukturen aller oder eines Teils der Homologe der folgenden Proteine wurden früher bestimmt: L1 (Nevskaya et al. (2000) Struct. Fold. Des. 8: 363), L2 (Nakagawa, A. et al. (1999 EMBO J. 18: 1459-1467), L4 (Wahl et al. (2000) EMBOJ. 19: 807-818), L6 (Golden et al (1993) EMBO J. 12: 4901-4908), L11 (Conn et al. (1999) supra; Wimberly et al. (1999) supra; Markus et al. (1997) Nature Struct. Biol. 4: 70-77), L12 (Leijonmarck, M. et al. (1980) Nature 286: 824-827), L14 (Davies et al. (1996) Structure 4: 55-66), L22 (Unge et al. (1998) Structure 6: 1577-1586), L30 (Wilson et al. (1986) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 83: 7251-7255). Alle anderen Strukturen, außer 10, wurden in dieser Studie neu besimmt.
²Rattenhomolog. Ratten Äguivalente zu H. marismortui Proteinen sind aus (Mao et al. (1999) supra)
³Sequenzkettenlänge
⁴Konformation: glb = globulär; ext. = Fortsatz
⁵Die Protein Wechselwirkungen mir den 6 Domänen der 23S rRNA, 5S rRNA und anderen Proteinen werden spezifiziert. (+) impliziert, dass die Wechselwirkung wesentlich ist. (Å) impliziert eine schwache, tangentiale Wechselwirkung. Proteinnamen, die in Klammern gezeigt werden, implizieren, dass die Wechselwirkungen schwach sind; sonst ist die Wechselwirkung wesentlich.
*Alle so bezeichneten Einträge beschreiben Proteine, die nicht vollständig in den hier beschriebenen Elektronendichtekarten dargestellt sind. Die hier zusammen gefasste Information wird aus Literaturquellen abgeleitet und wird hier nur der Vollständigkeit halber eingeschlossen.
†Die für dieses Protein in Isolierung erhältliche Struktur schließt nicht den hier berichteten Fortsatz(Fortsätze) ein.

3. Generelles Erscheinungsbild der Untereinheit
In seiner Kronenansicht (siehe 2) präsentiert die große ribosomale Untereinheit, die ungefähr 250 Å Durchmesser hat, ihre Oberfläche dem Betrachter, die mit der kleinen Untereinheit wechselwirkt, wobei die drei Fortsätze, die aus der Oberfläche ragen, nach oben gerichtet sind. Obwohl die Vorwölbung, die L1 einschließt, nicht in der Elektronendichtekarte mit 2.41 Auflösung sichtbar ist, wurde die Struktur von L1, die unabhängig bestimmt wurde (Nikonov et al. (1996) EMBO J. 15: 1350-1359), in Niedrigauflösungskarten ungefähr eingepasst (Ban et al. (1998) supra) und wird hier eingeschlossen, um dem Leser Orientierung zu geben. Es versteht sich, dass, außer für ihre zwei lateralen Vorwölbungen, die großer ribosomale Untereinheit monolithisch ist. Es gibt keinen Hinweis auf eine Teilung ihrer Struktur in topologisch getrennte Domänen. Zusätzlich ist sie, zum Teil da ihr eine offensichtliche Domänenstruktur fehlt, aber auch da sie so groß ist, unmöglich beim Betrachten als ein Ganzes zu erfassen. Um dem Leser eine Idee davon zu vermitteln, wie sie zusammengesetzt ist, muss die Untereinheit in ihre chemischen Komponenten zerlegt werden.
4. RNA Sekundärstruktur
All die Basen, die H. marismortui 23S rRNA durch wenigstens zwei Wasserstoff Brückenbindungen stabilisiert sind, wurden mit einem Computerprogramm identifiziert das die Struktur nach Wasserstoff Brückbindungs-Donoxen und Akzeptoren, die durch weniger als 3.2 Å getrennt sind, durchsucht. Basen, die durch wenigstens zwei solcher Bindungen verbunden sind, wurden als gepaart betrachtet, wenn der Winkel zwischen ihren Normalen weniger als 45° war, und der Winkel zwischen ihren Bindungen und Basen-Normalen auch weniger als 45° war. Basierend auf den Ergebnissen dieser Analyse, wurde ein Sekundärstruktur Diagramm in dem Format-Standart für 23S/28S rRNAs (siehe 3) erstellt. Die Sekundärstruktur, die für dieses Molekül durch phylogenetischen Vergleich vorausgesagt wurde, war bemerkenswert zutreffend, fand aber nicht alle tertiären Paarungen und identifizierte nicht Wechselwirkungen, die konservierte Basen involvierten. Zusätzlich zu Basenpaarungen nahezu jeden Typs enthält die RNA zahlreiche Beispiele von gut bekannten Sekundärstrukturmotiven, wie Basen triplets, Tetraloops und Querstrang-Purinstapeln, aber keine dramatisch neuen Sekundärstrukturmotive wurden bisher identifiziert.
Die Sekundärstruktur dieser 23S rRNA besteht aus einem zentralen Loop, die durch einen terminalen Stamm geschlossen wird, aus dem 11 mehr oder weniger komplizierte Stämme/Loops abstehen. Es ist üblich das Molekül als aus 6 Domänen bestehend zu beschreiben, und seine helikalen Stämme sequentiell beginnend von dem 5' Ende her zu nummerieren (siehe 4) (Leffers et al. (1987) supra). Die Teilung des Moleküls in Domänen, gezeigt in 4, weicht von dem Standart in Bezug auf Helix 25 ab, die für gewöhnlich als Teil von Domäne I betrachtet wird. Sie wird in Domäne II platziert, da sie stärker mit Domäne II interagiert als mit den anderen Elementen von Domäne I.
Es gibt fünf Sequenzen in der 23S rRNA länger als 10 Nukleotide, deren Strukturen nicht aus der Karte mit 2.4 Å Auflösung aufgrund von Unordnung bestimmt werden können. Alle zusammen genommen sind sie für 207 der 232 Nukleotide, die im Endmodell fehlen, verantwortlich. Die ungeordneten Bereiche sind: (1) Helix 1 insgesamt, (2) das distale Ende von Helix 38, (3) Helix 43/44, an die das ribosomale Protein L11 bindet, (4) das Loop Ende von Stamm/Loop 69, und (5) Helix 76/77/78, die die RNA Struktur ist, an die L1 bindet. Zur Vollständigkeit werden diese Bereiche in 3 (in Grau) eingeschlossen, wobei ihre Sekundärstrukturen phylogenetisch bestimmt wurden.
5. Gesamtarchitektur von rRNA
Die sechs Domänen von 23S rRNA und 5S rRNA haben alle komplizierte, zusammengefaltete Formen, die trotzdem zusammen passen, um eine kompakte monolithische RNA Masse zu erzeugen (siehe 4(A) und 4(B)). Somit ist trotz der Organisation ihrer RNAs auf der Sekundärstruktur Ebene die große Untereinheit auf dreidimensionaler Ebene eine große gigantische Domäne. In dieser Hinsicht ist sie sehr verschieden von der kleinen Untereinheit, die ein Flatter-Objekt ist, das überhaupt nicht monolithisch ist. Selbst bei elektronenmikroskopischen Aufnahmen mit niedriger Auflösung besteht die kleine Untereinheit aus drei strukturellen Domänen, jede davon enthält, wie sich herausstellt, eine der drei Sekundärstruktur Domänen ihrer RNA (Noller et al. (1990) The Ribosome: Structure, Function, and Evolution, supra, S. 73-92). Der qualitative Unterschied zwischen den zwei Untereinheiten spiegelt eine Anforderung für konformationale Flexibilität wieder, die größer ist als bei der kleinen Untereinheit.
Domäne I, die die aussieht wie ein Pilz (siehe 4(E)), liegt im rückwärtigen Teil des Partikels, hinter und unter der L1 Region. Der dünne Teil der Domäne beginnt in der Nachbarschaft der Domäne VI, die dort ist, wo ihre ersten und zweiten Reste lokalisiert sind. Helices 1 und 25 umspannen den Partikel rückwärtig und dann setzt sich die Domäne in eine größere, globulärere Struktur unter und hinter die L1 Region fort.
Die größte der 23S rRNA Domänen, Domäne II, die den größten Teil der Rückseite des Partikels stellt, besitzt drei Ausbuchtungen, die zu der Schnittstellenfläche der Untereinheit des Partikels reichen (siehe 4(F)). Eine von diesen (Helix 42-44) ist der RNA Teil des L7/L12 Stamms, von dem bekannt ist, dass er mit den Elongationsfaktoren wechselwirkt, der in diesen Kristallen nicht gut geordnet ist. Die zweite Domäne II Ausbuchtung ist Helix 38, die der längste unverzweigte Stamm in dem Partikel ist. Sie beginnt in dem Rücken des Partikels, biegt sich um ungefähr 90 Grad und erstreckt sich in Richtung der kleinen Untereinheit zwischen den Domänen V und 5S rRNA. Die dritte Region, Helix 32-35.1 zeigt direkt in Richtung auf die kleine Untereinheit und ihren Terminus, der Loop von Stamm/Loop 34 wechselwirkt direkt mit der kleinen ribosomalen Untereinheit (Culver et al. (1999) Science 285: 2133-2135). Dieser Loop taucht an der Untereinheits-Schnittfläche zwischen den Domänen III und IV auf.
Domäne III ist eine kompakte globuläre Domäne, die die untere linke Region der Untereinheit in der Kronenansicht einnimmt (siehe 4(G)). Sie sieht aus wie ein vier-zackiger Stern, wobei der Ursprung der Domäne (Stamm/Loop 48) und dem Stamm/die Loops 52, 57 und 58 die Zacken bilden. Anders als die anderen Domänen, wechselwirkt Domäne III kaum mit Domäne V; der alleinige Kontakt ist ein einzelner van der Waals Kontakt, der eine einzelne Base aus jeder Domäne involviert.
Domäne IV ist zuständig für den Großteil der Schnittflächen-Oberfläche der 50S Untereinheit, die die 30S Untereinheit kontaktiert (siehe 4(H)). Sie bildet einen großen diagonalen Bereich der flachen Oberflache auf dieser Seite der Untereinheit, und verbindet sich mit Domänen III und V auf der Rückseite des Partikels. Helices 67-71 sind die prominentesten Merkmale von Domäne IV, und bilden den vorderen Rand der Spalte mit dem aktiven Zentrum, die bei niedriger Auflösung klar sichtbar ist (siehe 2). Diese ist eine der wenigen Regionen der 23S rRNA, die nicht durch ribosomale Proteine intensiv stabilisiert ist. Helix 69 in der Mitte dieser Erhöhung wechselwirkt mit dem langen vorletzten Stamm der 16S rRNA in der kleinen ribosomalen Untereinheit und kann betrachtet werden als eine Trennvorrichtung, die A-Stellen gebundene tRNAs von P-Stellen gebundenen tRNAs trennt.
Von Domäne V, die zwischen Domänen IV und II in der Mitte der Untereinheit eingeklemmt liegt, ist bekannt, dass sie sehr eng an der Peptidyltransferase Aktivität des Ribosoms beteiligt ist. Strukturell kann die Domäne in drei Bereiche geteilt werden (siehe 4(I) und 4(J)). Der erste beginnt mit Helix 75 und bildet schließlich die Bindungsstelle für Protein L1. Der zweite, der aus Helices 80-88 besteht, bildet den Großteil der zentralen Vorwölbungsregion, und wird rückseitig durch die 5S rRNA und Domäne II gestützt. Der dritte Bereich, der Helices 89-93 einschließt, dehnt sich aus in Richtung Domäne VI und hilft die Elongationsfaktor bindende Region des Ribosoms zu stabilisieren.
Die kleinste Domäne in der 23S rRNA, Domäne VI, die einen großen Teil der Oberfläche der Untereinheit unmittelbar unter den L7/L12 Stamm bildet, ähnelt dem Buchstaben X mit einem horizontalen Stab an seiner Basis (siehe 4(K)). Eine interessante Region dieser Domäne ist der Sarcin-Ricin Loop (SRL) (Stamm/Loop 95), dessen Struktur intensiv in Isolation untersucht wurde (Szewcak et al. (1995) J. Mol. Biol. 247: 81-98). Der SRL ist essentiell für das Faktorbinden, und Ribosomen können inaktiviert werden durch die Spaltung einer einzelnen kovalenten Bindung in diesem Loop (Wool et al. (1992) TIBS 17: 266-269). Wie durch Nukleotidprotektions-Daten nahe gelegt wird, ist die große Grube dieses Loops dem Lösungsmittel gegenüber exponiert (Moazed et al. (1988) Nature 334: 362-364), und ihre Konformation wird durch Proteine und durch Wechselwirkung mit Domäne V stabilisiert, die zwei Basen an der Seite der kleinen Grube involviert. Die involvierten Nukleotide sind A 2699 und G 2700 in Domäne VI, und A 2566 und G 2567 in Domäne V.
5S ribosomale RNA, die effektiv die siebte RNA Domäne in der Untereinheit ist, besteht aus drei Stämmen, die von einer gemeinsamen Kontaktstelle Loop A genannt abstehen (siehe 4(D)). Im Gegensatz zu dem, was in der Kristallstruktur von Fragment I aus E. coli 5S rRNA gesehen wird (Correll et al. (1997) Cell 91: 705-712), stapelt sich der Helix 2/3 Arm des Moleküls auf seinem Helix 4/5 Arm, nicht Helix I (siehe 4(L)). Die Anordnung resultierte aus einer deformierten Konformation der Loop A Reste, die zwei gestapelte Basentripletts involviert. In der Tat ist vom Standpunkt der Sekundärstruktur aus der Loop A Helix 2,3 Arm der 5S rRNA ziemlich bemerkenswert. Nirgendswo in der Untereinheit gibt es eine höhere Konzentration an ungewöhnlichen Paarungen und an gefalteter RNA Sekundärstruktur.
6. Sequenzkonservierung und Wechselwirkungen in 23S rRNA.
Während 23S/28S rRNAs viele konservierte Sequenzen enthalten, variieren sie beträchtlich in Hinblick auf die Kettenlänge. Kürzere 23S/28S rRNAs werden unterschieden von ihren längeren Homologen durch die Beschneidung oder sogar Eliminierung von ganzen Stämmen/Loops, und durch Sequenzvergleich kann man eine Minimal-Struktur identifizieren, die von allen geteilt wird (Gerbi (1995) Ribosomal RNA. Structure, Evolution, Processing and Function in Protein Biosynthesis, supra, S. 77-88). Die Expansionssequenzen in der 23S rRNA von H. marismortui, d.h. die Sequenzen, die sie enthält die größer als das Minimum sind, sind in 5 in Grün gezeigt. Die sind auf der Untereinheits-Oberfläche der Partikels weitestgehend nicht vorhanden, sind aber auf ihrer rückwärtigen Oberfläche reichlich vorhanden, weit weg von ihren aktiven Stellen. Dies ist konsistent mit den elektronenmikroskopischen Beobachtungen bei niedriger Auflösung, was nahe legt, dass der Bereich der großen Untereinheit, dessen Struktur am meisten konserviert ist, die Oberfläche ist, die mit der kleinen Untereinheit wechselwirkt (Dube et al. (1998) Structure 6: 389-399).
Es gibt zwei Klassen von konservierten Sequenzen in 23S rRNA. Eine enthält Reste, die in den Bereichen mit der aktiven Stelle der großen Untereinheit konzentriert sind. Die zweite Klasse besteht aus viel kürzeren Sequenzen, die über den ganzen Partikel verteilt sind (5: Rote Sequenzen). Die SRL Sequenz in Domäne VI und die Gruppe von konservierten Resten, die zu Domäne V gehören, die an der Basis der Spalte mit der Peptidyltransferase lokalisiert sind, sind Mitglieder der ersten Klasse. Sie sind konserviert, da sie essentiell für Substratbindung, Faktorbindung und katalytische Aktivität sind. Die Meisten der Reste in der zweiten Klasse der konservierten Reste sind in den inter- und intradomänen Wechselwirkungen involviert, die die tertiäre Struktur von 23S rRNA stabilisieren. Adenosine sind in dieser Klasse unproportional vertreten. Die Prädominanz von As unter den konservierten Resten in den rRNAs wurde auch in der Vergangenheit angedeutet (Ware et al. (1983) Nucl. Acids. Res. 22: 7795-7817).
Zusätzlich zu ihrer Stützung auf A-abhängige Motive ist die tertiäre Struktur der Domänen der 23S rRNA und ihre relativen Positionen durch familiäre tertiäre Strukturelemente wie RNA Reißverschluss und Tetraloop/Tetraloop-Rezeptor Motive stabilisiert (Moore, P.B. (1999) Annu. Rev. Biochem. 68: 287-300), und an vielen Stellen stabilisieren Basenpaare und -trippel die Wechselwirkungen der Sequenzen, die zu verschiedenen Komponenten der Sekundärstruktur der 23S rRNA gehören.
Interessanterweise wechselwirken die 5S rRNA und die 23S rRNA nicht intensiv miteinander. Die wenigen RNA/RNA Wechselwirkungen, die es gibt, involvieren die Rückrate des Helix 4/5 Arms der 5S rRNA und das Rückrat der Helix 38 der 23S rRNA. Das meiste der freien Energie und all die Spezifizität der 5S rRNA Bindung an die große ribosomale Untereinheit, scheint von ihren intensiven Wechselwirkungen mit Proteinen abzuhängen, die als Knetmasse agieren, die sie an den Rest des Ribosoms kleben.
7. Proteine in der 50S ribosomalen Untereinheit
Die Strukturen von 27 Proteinen, die in der großen ribosomalen Untereinheit von H. marismortui gefunden werden (Tabelle 2) wurden bestimmt. 21 dieser Proteinstrukturen waren zuvor für keines der Homologe etabliert worden, und die Strukturen der sechs, die Homologe bekannter Struktur besitzen, wurden in de Elektronendichtekarte wieder eingebaut mit ihren H. marismortui Sequenzen. Zusätzlich sind Strukturen verfügbar für Homologe von H. marismortui L1, L11 und L12, die nicht in der Elektronendichtekarte mit der 2.4 Å Auflösung visualisiert werden können. Nur die Struktur von L10 ist immer noch unbekannt unter den 31 bis heute bekannten Proteinen.
Nicht jede dieser Strukturen ist vollständig, zum Beispiel, fehlt eine gesamte Domäne von L5 in der Elektronendichte, vermutlich wegen Unordnung. L32e ist in dieser Hinsicht auch bemerkenswert. Ungefähr zwanzig Reste aus seinem N-Terminus sind in der Elektronendichtekarte nicht sichtbar, und die Elektronendichtekarte legt nahe, dass sein C-terminaler Rest kovalent mit den am meistern N-terminalen seiner sichtbaren Reste gebunden ist.
Von den dreißig großen Untereinheits-ribosomalen Proteinen, deren Strukturen bekannt sind, sind 17 globuläre Proteine, mit Eigenschaften, die ähnlich tausenden von Proteinen sind, deren Strukturen in der Protein Data Bank sind (Tabelle 2). Die verbleibenden dreizehn Proteine besitzen entweder globuläre Körper mit Fortsätzen, die von ihnen abstehen („glb + ext") oder liegen vollständig als Fortsatz vor („ext"). Ihren Fortsätzen fehlt oft ihre offensichtliche tertiäre Struktur und in vielen Regionen fehlt ihnen auch Sekundärstruktur (siehe 6). Diese Fortsätze erklären vielleicht, warum viele ribosomale Proteine sich der Kristallisierung in Isolierung widersetzt haben. Die Ausnahmen, die die Regel belegen, sind L2 und L4, beide sind Proteine die zu der „glb + ext" Klasse gehören. Protein L2 wurde kristallisiert und seine Struktur nur gelöst, nachdem seine Fortsätze entfernt worden waren (Nakagawa et al. (1999) supra), und eine der zwei Regionen von L4, die in dem Ribosom als Fortsatz vorliegt, ist in der Kristallstruktur des intakten L4 ungeordnet (Wahl et al. (2000) supra).
Mit Ausnahme der Proteine L1, L7, L10 und L11, die die Spitzen der zwei lateralen Vorwölbungen bilden, setzen sich die Proteine der 50S Einheit nicht signifikant über die Hülle fort, die durch die RNA definiert wird (siehe 7). Ihre globulären Domänen werden weitestgehend auf dem Äußeren des Partikels gefunden, oft eingeschmiegt in die Lücken und Spalten, die durch die Faltung der RNA gebildet werden. Somit bilden, anders als die Proteine in sphärischen Viren, die Proteine der großen ribosomalen Untereinheit keine Schale um die Nukleinsäure, mit der sie assoziieren, und anders als die Proteine in Nukleosomen, werden sie auch nicht durch Nukleinsäure eingehüllt. Stattdessen agieren die Proteine wie Mörtel, der die Lücken und Risse zwischen den „RNA Ziegeln" füllt.
Die Verteilung der Proteine auf der Oberfläche der Einheit ist nahezu einheitlich, außer für die Spalte mit der aktiven Stelle und die flache Oberfläche, die mit der 30S Untereinheit wechselwirkt.
In der Kronenansicht liegen die Proteine um die Peripherie der Untereinheit (siehe 7(A)), aber wenn sie von der Seite gegenüber der Bindungsstelle der 30S Untereinheit betrachtet werden (der „rückwärtigen Seite"), erscheinen sie ein fast uniformes Netz über ihre gesamte Oberfläche zu bilden (siehe 7(B)). In ähnlicher Weise ist die untere Oberfläche der Untereinheit, die den Ausgang des Polypeptidtunnels einschließt, mit Proteinen bedeckt (siehe 7(C)). In der Tat können die fünf Proteine, die den Tunnelausgang umgeben, eine Rolle bei der Proteinsekretion spielen, da sie Teil der Oberfläche, die dem Membran gegenüber liegt, und des Translocons sind, wenn Membran und sezernierte Proteine synthetisiert werden.
Obwohl 7 Proteinketten zeigt, die in das Ribosominnere verschwinden, kann der Grad, zu dem Proteine den Körper des Partikels penetrieren, nur dann in vollem Umfang gewürdigt werden, wenn die RNA entfernt wird. Das Innere des Partikels ist nicht Protein frei, aber ist Protein arm verglichen mit der Oberfläche des Partikels. Ausgedehnte Tentakeln des Polypeptids, viele davon stammen aus globulären Domänen der Oberfläche, penetrieren in das Innere, und füllen die Lücken zwischen benachbarten Elementen der RNA Sekundärstruktur (siehe 8(E)). Die bizarren Strukturen dieser Fortsätze lassen sich durch ihre Wechselwirkungen mit RNA erklären.
Obwohl ausgedehnte nicht globuläre Strukturen selten in der Protein Data Base sind, sind sie nicht unbekannt. Protein Termini in Fortsätzen bilden häufig Zwischenprotein Kontakte, z.B. in viralen Kapsiden, und nehmen vermutlich fixe Strukturen nur an nach Kapsidbildung. Die basischen „Schwänze" von Histonen verhalten sich vielleicht in der gleichen Weise, wenn sich Nukleosomen bilden. Die N-terminalen Sequenzen der Kapsidproteine sind oft positiv aufgeladen, und in Viruskristallstrukturen, verschwindet die Elektronendichte für diese Sequenzen oft in das Innere des Virus, wo diese Sequenzen vermutlich mit asymmetrisch angeordneter Nukleinsäure wechselwirken.
Die Wechselwirkungen von Polypeptiden in Fortsätzen und RNA in der großen Untereinheit, die ihre massive Nukleinsäurestruktur stabilisiert, resultiert in einem Durcheinander von RNA und Protein in dem Zentrum der Untereinheit (siehe 8(A) und 8(B)). Es ist schwierig sich vorzustellen, dass so ein Objekt aus seinen Komponenten effizient aufgebaut wird auf eine andere als in einer hoch geordneten Weise. Chaperone können wohl benötigt werden, um die Aggregation der Fortsatzregionen dieser Proteine zu verhindern, die wahrscheinlich ungeordnet sind außerhalb des Kontextes, der durch rRNA bereitgestellt wird, und die wahrscheinlich die Faltung der rRNA organisieren.
8. Protein und RNA Wechselwirkungen
Da Protein die große Untereinheit bis zu einem überraschenden Grad durchdringt, gibt es nur wenige Segmente der 23S rRNA, die überhaupt nicht mit Protein wechselwirken. Von den 2923 Nukleotiden in der 23S rRNA, machen 1157 Nukleotide wenigstens von der Waals Kontakt mit Protein (siehe 8(D)), und es gibt nur zehn Sequenzen länger als 20 Nukleotide, bei denen kein Nukleotid Protein kontaktiert. Die längste solche Sequenz enthält 47 Nukleotide, und ist der Teil der Domäne IV, die die Kante der Spalte mit der aktiven Stelle bildet.
Das Ausmaß der Wechselwirkungen zwischen RNA und Protein, das vorkommt, wenn die große Untereinheit sich assembliert kann quantitativ abgeschätzt werden. Unter Verwendung des Richards Algorithmus (Lee, B. et al. (1971) J. Mol. Biol. 55: 379-400) und einer 1.7 Å Radius Sonde, um die zugänglichen Oberflächengebiete zu berechnen, kann gezeigt werden, dass 180,000 Å² der Oberfläche verborgen werden, wenn die Untereinheit sich bildet aus ihren isolierten aber vollkommen strukturierten Komponenten. Die ist ungefähr die Hälfte ihrer kompletten Oberfläche. Der Durchschnitt ist ungefähr 6,000 Å² pro Protein. Während dies eine enorme Menge ist verglichen mit der Oberfläche, die verborgen wird, wenn die meisten Proteinoligomere sich bilden, sollte erkannt werden, dass Ribosomezusammenbau mit einem großem Verlust an konformationaler Entropie einhergeht, der nicht auftritt, wenn die meisten Proteine oligomerisieren. Die Proteintermini-Fortsätze und Loops der ribosomalen Proteine sich in Isolation fast sicher flexibel, und ohne Protein ist die RNA wahrscheinlich auch ziemlich flexibel. Somit kann das Verbergen einer großen Menge von Oberfläche notwendig sein, um die Energie bereitzustellen, die notwendig ist, um die Strukturen dieser Moleküle zu fixieren.
All die Proteine in dem Partikel außer L12 wechselwirken direkt mit RNA und alle bis auf sieben der restlichen 30 Proteine wechselwirken mit zwei rRNA Domänen oder mehr (Tabelle 2). Der „Champion" in dieser Hinsicht ist L22, welches das einzige Protein ist, das mit RNA Sequenzen wechselwirkt, die zu allen 6 Domänen der 23 rRNA gehört (siehe 8(C)). Die Protein vermittelten Wechselwirkungen zwischen 5S rRNA und 23S rRNA sind besonders intensiv. Protein L18 heftet sich an Helix 1 und Helix 2/3 der 5S rRNA an Helix 87 der 23S rRNA. Protein L31e vermittelt eine Wechselwirkung zwischen dem gleichem Teil der 5S rRNA und Domänen II und V. Loop C ist verbunden mit Domäne V durch Protein L5 und Loop D ist angebracht an Domänen II und V durch Protein L10e. Was sie auch immer sonst machen können, es ist klar, dass eine wichtige Funktion dieser Proteine die Stabilisierung der relativen Orientierungen der direkt benachbarten RNA Domänen ist. Viele helfen auch, die tertiären Strukturen der Domänen zu sichern, mit denen sie wechselwirken.
Da die meisten ribosomalen Proteine mit vielen RNA Sequenzen wechselwirken und die Zahl der Proteine die Zahl der RNA Domänen bei weitem übertrifft, kann es kaum überraschen, dass jede rRNA Domäne mit multiplen Proteinen wechselwirkt (Tabelle 2). Domäne V zum Beispiel wechselwirkt mit 13 Proteinen, mit einigen intensiv und mit einigen nur schwach.
Es ist klar, dass die Oligonukleotidbindungsexperimente, auf die sich in Hinblick auf Information über die RNA Bindungseigenschaften der ribosomalen Proteinen lange verlassen wurde, zur Untereinschätzung des Potential dieser Proteine bezüglich ihrer Wechselwirkung mit RNA führten. Die Hochaffinitäts-RNA Bindungsstelle, die auf einem Protein durch solch ein Experiment identifiziert wurden, kann in der Tat für den Ribosomenzusammenbau wichtig sein, aber ihre zahlreichen schwächeren Wechselwirkungen mit anderen Sequenzen werden wahrscheinlich übersehen werden, und sie können auch für die Ribosomenstruktur absolut notwendig sein. Die meisten ribosomalen Proteine quervernetzen RNA und Quervernetzung ist unmöglich ohne multiple Wechselwirkungen. Ähnliche Betrachtungen können auf Proteine zutreffen, die Komponenten anderer Ribonukleoproteine sind, wie dem Splicosom.
Von den sieben Proteinen, die mit nur eine Domäne wechselwirken, nehmen drei (L1, L10, L11) direkt an dem Proteinsyntheseprozess teil. Statt in dem Ribosom enthalten zu sein, um sicherzustellen, dass die RNA die richtige Konformation annimmit, erscheint es angebrachter zu sein, die RNA als so strukturiert zu betrachten, dass ihre korrekte Platzierung sichergestellt wird. Drei andere (L24, L29, L18e) wechselwirken mit zahlreichen Sekundärstrukturelementen innerhalb der Domänen, an die sie binden, und haben vermutlich die Funktion, die tertiären Strukturen ihrer Domänen zu stabilisieren. Das letzte der Einzel RNA Domänenproteine, L7ac, gibt Rätsel auf. Einerseits kann es nicht als ein RNA stabilisierendes Protein funktionieren, da es nur mit einer einzelnen kurzen Sequenz in Domäne I wechselwirkt, und andererseits ist es weit entfernt von den wichtigen funktionalen Stellen in der Untereinheit, der Peptidyltransferase Stelle und der Faktorbindungsstelle. Es ist ziemlich nah an L1, was jedoch wichtig für die Funktion der E-Stelle zu sein scheint (Agrawal et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 8723-8729), und vielleicht ist es bei dieser Aktivität involviert.
Während viele ribosomale Proteine primär mit RNA wechselwirken, wechselwirken einige wenige signifikant mit anderen Proteinen. Die am meisten beeindruckende Struktur, die durch Pxotein-Protein Wechselwirkungen erzeugt wird, ist die Proteingruppierung zusammengesetzt aus L3, L6, L14, L19 und L24e, die nahe an der Faktorbindungsstelle gefunden wird. Die Proteinoberfläche, die sie zur Verfügung stellen, kann wichtig sein für Faktorwechselwirkungen.
Die oben präsentierte Struktur verdeutlicht sowohl die Stärken als auch die Schwächen von Herangehensweisen an komplexe Zusammensetzungen, die davon abhängen, die Strukturen der Komponenten in Isolation zu bestimmen. Die Strukturen der globulären Domänen der Homologen der Proteine in der großen ribosomalen Untereinheit von H. marismortui sind weitgehend die gleichen, wie diejenigen der entsprechenden Domänen in der intakten Untereinheit, obwohl Anpassungen bei Domänenpositionen bisweilen notwendig sind. Konsequenterweise waren diese Strukturen sehr nützlich zum Lokalisieren von Proteinen, und Interpretieren von Elektronendichtekarten mit niedriger Auflösung. Aus jedoch offensichtlichen Gründen können die Strukturen der Schwanz- und Loopfortsätze der ribosomalen Proteine nicht bestimmt werden in der Abwesenheit der RNAs, die ihnen die Struktur geben, und die Durchführbarkeit von Strategien, die von dem Produzieren von RNA-Protein Komplexen niedrigen Molekulargewichts abhängen, die all die RNA Kontakte besitzen, die notwendig sind, um die Strukturen solcher Proteine zu fixieren, scheint weit entfernt zu sein. RNA ist auch ein Problem. Während der Sarcin/Ricin Loop in Isolation weitestgehend die gleiche Struktur wie in dem Ribosom besitzt, unterscheidet sich die Struktur der 5S rRNA in Isolation in einigen Aspekten von der, die im Ribosom gesehen wird, und die Struktur des isolierten P-Loops (Puglisi et al. (1997) Nat. Struct. Biol. 4: 775-778) ähnelt überhaupt nicht der Struktur des P-Loops in dem Ribosom. Klarerweise hätte eine „Strukturelle Genomics" Herangehensweise an das Ribosom, was die Bestimmung der Strukturen all seiner Proteine und aller möglichen rRNA Fragmente nach sich gezogen hätte, nicht funktioniert. Er mag auch bei anderen makromolekularen Zusammensetzungen ebenfalls nicht erfolgreich sein.
B. Die strukturelle Basis der Ribosomenaktivität bei der Peptidbindungssynthese
Analyse der in Abschnitt IIA oben diskutierten Atom Koordinaten zusammen mit zusätzlichen Atom Koordinaten einer mit zahlreichen Analogen komplexierten ribosomalen Untereinheit, die ähnlich verfeinert wurden, erlaubte ein Analyse der Ribosomenfunktion. Entsprechend basiert die vorliegende Erfindung auch auf den Kristallen einer Haloarcula marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die entweder mit dem Yarus Übergangszustandsanalog CCdA-p-Puro oder mit einem Minihelix Analog einer Aminoacyl-tRNA komplexiert wurde. Die vorliegende Erfindung stellt die Strukturen beider Komplexe zur Verfügung. Die Atom Koordinaten der Strukturen beider Komplexe wurden am 26. Juli 2000 bei der Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB) Protein Data Bank (PDB) (Berman et al. (2000) Nucleic Acids Research 28, 235-242; http:www.rcsb.org/pdb) unter den Accession Numbers PDB ID: 1FFZ (50S Ribosom/CCdA-p-Puro Komplex) und PDB ID: 1FG0 (50S Ribosom/aa-tRNA Analog) hinterlegt.
Wie oben diskutiert, zeigen die vollständigen atomaren Strukturen der großen ribosomalen Untereinheit und ihrer Komplexe mit zwei Substratanalogen, dass das Ribosom ein Ribozym ist. Die vollständigen atomaren Strukturen stellen auch Information zur Verfügung über die katalytischen Eigenschaften seiner vollständig aus RNA bestehenden aktiven Stelle. Beide Substratanaloge stehen ausschließlich mit konservierten rRNA Resten aus Domäne V der 23S rRNA in Kontakt; es gibt keine Proteinseitenketten, die näher als ungefähr 18 Å an der Peptidbindung sind, die synthetisiert wird. Der Mechanismus der Peptidbindungssynthese scheint der Umkehr des Deacylierungsschritts bei Serinproteasen zu ähneln, wobei die Base von A2486 (A2451) in E. coli die gleiche generelle Basenrolle wie His57 in Chymotrypsin spielt. Der ungewöhnliche pKa, den A2486 besitzen muss, um diese Funktion zu erfüllen, leitet sich aus seiner Wasserstoff Brückenbindung mit G2482 (G2447) her, das mit einem verborgenen Phosphat wechselwirkt, das die ungewöhnliche Tautomere aus zwei Basen stabilisieren könnte, die für die Katalyse notwendig sind. Der Polypeptidaustrittstunnel ist größtenteils aus RNA gebildet, zu ihm tragen aber wesentlich die Proteine L22, L39 und L4 bei und sein Ausgang ist durch die Proteine L19, L22, L23a, L24 und L29 eingekreist.
Die CCdA des Yarus Analogs bindet an den so genannten P-Loop und muss daher in der P-Stelle sein. Nur das terminale CCA des aa-tRNA Analogs ist sichtbar, aber da es korrekterweise mit dem A-Loop wechselwirkt (Kim et al. (1999) Molec. Cell 4: 859-864), muss es die A-Stelle sein. Die Puromycingruppe nimmt in beiden Strukturen den gleichen Platz ein, und nahe dieser Seite sind keine Proteine. Daher muss die katalytische Aktivität der aktiven Stelle vollständig von RNA abhängen. Das N3 von A2486 (E. coli A2451) ist die titrierbare Gruppe, die der zu synthetisierenden Peptidbindung am nächsten ist und hat wahrscheinlich die Funktion einer allgemeinen Base, um den nukleophilen Angriff durch die -Aminogruppe des A-Stellen Substrats zu ermöglichen. Um in dieser Eigenschaft zu funktionieren, muss der pKa dieser Base grob 5 Einheiten höher sein als normalerweise.
1. Strukturen der Substratanalog Komplexe
Um herausfinden, wie Substrate an der A-Stelle und der P-Stelle der großen Untereinheit Wechselwirken, wurden zwei Substratanaloge verwendet werden. Eines der Analoge, das konstruiert wurde den Akzeptor-Stamm einer aa-tRNA nachzuahmen und an die A-Stelle zu binden, war eine zwölf Basenpaaren RNA Haarnadel mit einem aminoacylierten vier-Nukleotid Fortsatz an seinem 3' Ende (siehe 9). Die verwendete Sequenz war diejenige des tRNA tyr Akzeptor-Stamms und sie schließt ab mit Puromycin, das seinerseits ein Analog von Tyrosyl-A76 ist. Das zweite verwendete Analog war das Yarus Übergangszustand Analog, CCdA-p-Puromycin. Wie in dem Fall des A-Stellen Substratanalogs, wird erwartet, dass das Puromycin des Yarus Inhibitors an die A-Stelle bindet, während seine CCdA Einheit an die P-Stelle binden sollte.
Die Positionen des Yarus Inhibitors und des tRNA Akzeptor-Stamm Analogs wurden bestimmt, indem diese Moleküle durch Eintauchen in die Kristalle des H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit eingebracht wurden, Messen der Beugungsdaten bis zu 3.2 Å Auflösung und Berechnen der Differenz Elektronendichtekarten (Welch et al. (1997) Biochemistry 36: 6614-6623). Karten der Komplexe wurden auch berechnet mit 2F₀(komplexiert)-F₀(nicht komplexiert) als Koeffizienten, um die Verschiebungen der Positionen der Ribosomenreste zu untersuchen, die auftreten, wenn diese Analoge binden (siehe 10(B) und Tabelle 3). Tabelle 3 Statistiken für Datensammlung und Skalierung.

*Statistiken in Klammern sind berechnet für die Hochauflösungsgruppe, die, wie angemerkt manchmal eine niedrige Auflösung hatte, als die Hochauflösungsgruppe, die bei der Datenreduktion verwendet wurde. † R_vereinigt Σ_i|I_(h) – I_(h)i|/ΣΣ: I_(h)i, wobei I(h) die mittlere Dichte nach den Reflektionen ist. ‡ R_iso: Σ|F_PH – F_P|/Σ F_PH, wobei F_PH und F_p die eingetauchten bzw. die nativen Kristallstrukturamplituden sind.

Ein Modell für den gesamten Yarus Inhibitor konnte in die Differenzdichte eingepasst werden (siehe 10(A)), und die Elektronendichtekarte des Komplexes zeigt, dass N3 des A2486 (2451) innerhalb des Wasserstoff Brückenbindungsabstands eines nicht verbrückten Sauerstoffs des Phosphoramids (siehe 10(B)). Die 2 Cs des Inhibitors, die den C74 und C75 der Peptidyl-tRNA entsprechen, sind mit G2285 (2252) bzw. G2284 (2251) in dem P-Loop Watson-Crick basengepaart (siehe 11(A)). Die C74-G2285 (2252) Wechselwirkung wurde durch die Ergebnisse von Noller und Mitarbeiter vorhergesagt (Noller et al. (1992) Science 256: 1416-1419). Das dA, das dem A76 einer t-RNA in der P-Stelle entspricht, ist nicht basengepaart, sondern ist gestapelt auf der Ribose von A2486 und hat Wasserstoff Brückenbindungen mit dem 2' OH des Nukleotids A2485 (siehe 12(B)).
Nur die CC-Puromycin Einheit des Minihelix Akzeptorstamm Analogs zeigte geordnete Elektronendichte in ihrer Differenz Elektronendichtekarte (siehe 10(C)). Das C75 des Akzeptorstamm CCAs ist Watson-Crick basengepaart mit G2588 (2553) des A Loops, wobei das C74 weniger geordnet und nicht basengepaart ist, aber auf einer Ribosomenbase aufgestapelt zu sein scheint. Das Dimethyl A des A-Stellen Inhibitors Puromycin ist identisch zu dem Dimethyl A des Yarus Inhibitors positioniert. Ferner wechselwirkt das Dimethyl A von Puromycin, das das A76 Aquivalent einer A-Stellen t-RNA ist, mit dem A-Loop in ziemlich der gleichen Weise, wie das A76 aus dem P-Stellen CCA mit dem P-Loop wechselwirkt (siehe 11(B)).
Die bemerkenswerteste der zahlreichen konformationellen Änderungen in dem Ribosom, die durch die Bindung des Übergangszustandsanalogs induziert wird, ist der Übergang der Base A2637 (2602) in einen geordneten Zustand, die in dem Enzym ohne Liganden in einem ungeordneten Zustand ist (siehe 11(B)). Sie wird zwischen dem CCA gebunden an der A-Stelle und dem CCA gebunden an der P-Stelle positioniert. Die Base von U2620 (2585) bewegt sich auch, so dass sie eine Wasserstoffbrücken Bindung mit dem 2' Hydroxyl der Ribose des A76 an der A-Stelle ausbilden kann, und U2619 und G2618 sich verschieben, um dem A76 zu ermöglichen positioniert zu werden. Kleinere Verschiebungen der Positionen werden bei den Positionen von A2486 beobachtet, dessen N3 dem nicht verbrückten Sauerstoff des Phosphats nah ist, und einem der G Reste, mit dem es wechselwirkt, G2102 (2482).
2. Lokalisierung und chemische Zusammensetzung der Peptidyltransferase Stelle
Die Inhibitoren sind an eine Stelle gebunden, die vollständig aus 23S rRNA gemacht ist ohne nah gelegene Proteine, belegend, dass das Ribosom ein Ribozym ist. Sowohl der Yarus Inhibitor als auch das A-Stellen Analog der aa-tRNA bindet an die große Untereinheit an dem Boden der großen und tiefen Spalte an dem Eingang zu dem 100 Å langen Polypeptidaustrittstunnel, der durch den rückwärtigen Teil der Untereinheit läuft (12). Diese Stelle ist umgeben von Nukleotiden, die zu dem zentralen Loop der 23S RNA Domäne V gehören, dem „Peptidyltransferase Loop". Nukleotide aus den einzelsträngigen Teilen dieses Loops machen die engste Annäherung an das Phosphat, das das tetrahedrische Kohlenstoff Intermediat nachahmt. Im Allgemeinen stehen die Helices, die von dem Peptidyltransferase Loop in 2 Sekundärstrukturdiagrammen der 23S rRNA abstehen, auch von der aktiven Stelle in der tertiären Struktur ab (siehe 13). Obgleich es 13 Proteine gibt, die mit Domäne V wechselwirken (siehe 14(A)), gibt es keine globulären Proteine in der Nachbarschaft des Inhibitors. Die nahesten Polypeptide sind die nicht globulären Fortsätze von vielen Proteinen (L2, L 3, L4, L10e), die tief in Domäne V eindringen und sich der aktiven Stelle nähern (siehe 14(B)). Diese Fortsätze füllen viele der Leeräume zwischen den RNA Helices der Domäne V auf, neutralisieren Phosphatrückratsladung, und stabilisieren vermutlich die Struktur der Domäne und ihre Assoziierung mit anderen RNA Regionen. Jedoch ist keines ihrer Seitenkettenatome näher als 18 Å an dem Phosphor der Phosphatgruppe des Inhibitors, der die Stelle markiert, an dem sich Peptidbindungen bilden. Weiterhin ist das Substratanalog vollständig in einer rRNA Höhlung eingeschlossen, die so dicht gepackt ist, dass es keine Möglichkeit gibt, dass ein unidentifiziertes Peptid in der Nähe lauern könnte (siehe 15). Somit muss die katalytische Einheit in dem Ribosom RNA sein.
Zwei der Proteine mit langen Termini oder Loops, die das rRNA Gerüst der Domäne V durchdringen, sind Proteine, die vorher nicht von einer Beteiligung an der Peptidyltransferase Reaktion ausgeschlossen werden konnten, L2 und L3 (Noller (1991) Ann. Rev. Biochem. 60: 191-227). Noller und Mitarbeiter (Noller et al. (1992) supra) fanden heraus, das unter Bedingungen, die RNA Denaturierung verhindern, intensiver Verdau von Thermus thermophilus 50S Untereinheiten mit Proteasen gefolgt durch Extraktion mit Phenol und anderen Agenzien, die Protein-RNA Wechselwirkungen unterbrechen, nicht viele Peptide aus der Untereinheit entfernten, die ein Molekulargewicht von weniger als 10,000 besaßen. Die Struktur macht klar, warum diese Proteinfragmente besonders resistent sind gegenüber Protease Behandlungen. Während die Protease Behandlung die globulären Proteindomänen auf der Oberfläche der großen Untereinheit verdauen konnte, konnte sie nicht die großen Termini und Loops entfernen, die tief in die 23S rRNA eindringen, da sie durch die RNA vollkommen in Beschlag genommen sind und somit vor Spaltung geschützt sind, unabhängig von den globulären Domänen.
3. Peptidyltransferase Stelle
Die RNA, die die Substratanaloge umgibt, ist eng gepackt, sehr ähnlich dem Bereich der aktiven Stelle eines Proteinenzyms und die Nukleotide in Kontakt mit dem Inhibitor sind zu mehr als 95% in allen drei Reichen des Lebens konserviert (siehe 15). Somit ist es klar, dass das Ribosom ein Ribozym ist, aber was gibt der RNA ihre katalytische Energie? Ohne damit zu beabsichtigen, an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, ist der Rest, der am wahrscheinlichsten an der Katalyse beteiligt ist, vermutlich als eine allgemeine Base, A2486, dessen N3 ungefähr 3 Å von dem Phosphoramid Sauerstoff des Yarus Inhibitor entfernt ist, der das Analog des Carbonylsauerstoffs einer entstehenden Peptidbindung ist und ungefähr 4 Å von dem Amid entfernt ist, der dem Amid Sticktstoff der zu synthetisierenden Peptidbindung entspricht. Normalerweise ist der pKa des N1 des Adenosin-monophosphat ungefähr 3.5 und der seines N3 ist vielleicht 2 pH Einheiten niedriger (Saenger (1984) Principles of Nucleic Acid Structure, (C.R. Cantor, Hrg.), Springer Advanced Texts in Chemistry, Springer-Verlag, New York, NY), und, um für A2486 als eine allgemeine Base zu funktionieren, müsste sein pKa auf 7 oder höher erhöht werden. Die Kristallstruktur selbst lässt vermuten, dass sein pKa in der Tat sehr ungewöhnlich ist. Das N3 des A2486 kann, wie beobachtet, nur Wasserstoff Brückenbindungen mit dem Phosphat Sauerstoff eingehen, wenn es (oder der Phosphat Sauerstoff) protoniert ist. Der Abstand zwischen diesen zwei Atomen beträgt ungefähr 3 Å, was anzeigt, dass eine Wasserstoff Brückenbindung in der Tat zwischen diesen existiert. Da der Kristall bei pH 5.8 ist, impliziert dies, dass der pKa des N3 größer ist als 6. Muth und Strobel haben den pKa des entsprechenden A in E. coli 23S RNA gemessen durch Untersuchen seiner Dimethylsulfat Reaktivität als einer Funktion des pH und haben geschlossen, das er 7.6 beträgt, obgleich sie aufgrund ihrer Experimente nicht sicher sein können, ob es das N3 oder N1 ist, dessen pKa sie gemessen haben (Muth et al. (2000) Science 289: 947-950). Da es keine andere verfügbare titrierbare funktionale RNA Gruppe gibt, die näher als ungefähr 7 Å an der entstehenden Peptidbindung ist, gibt es keine andere Gruppe, die verfügbar ist als eine allgemeine Base zu funktionieren.
Es gibt mehrere Merkmale der Umgebung von A2486 (2451), die seinen pKa beeinflussen können. Der pKa des N3 von A2486 (2451) kann signifikant erhöht sein, zum Teil durch einen Ladungsverschiebungsmechanismus, analog zu dem, der in der aktiven Stelle der Serinproteasen vorkommt, wobei das verborgene Phosphat von A2485 (2450) eine ähnlich Funktion durchführt wie das verborgene Carboxylat von Asp102 des Chymotrypsin. Das N6 des A2486 wechselwirkt mit den O6 Atomen des G2482 (2447) und G2102 (2061) (siehe 16(A)). Das N2 des G2482 wechselwirkt auch mit einem nicht verbrückten Sauerstoff der Phosphatgruppe des A2485 (2450), das unter den insgesamt 3 am wenigsten Lösungsmittel zugänglichen Phosphat Gruppen (826, 1497 und 2485) in der großen ribosomalen Untereinheit, für das wir kein neutralisierendes Gegenion in der 2.4 Å Auflösungskarte sehen, ist. Eine schwache Dichte, die vielleicht einem Wassermolekül entspricht, ist über eine Wasserstoff Brückenbindung an das andere nicht verbrückte Sauerstoff gebunden. Ein neutralisierendes Gegenion ist in dieser Struktur nicht offensichtlich. Das verborgene Phosphat des A2485 könnte das Proton von dem exozyklischen N2 des G2482 wegziehen, um seine energetisch ungünstige verborgene negative Ladung zu neutralisieren. Dieses würde im Gegenzug das sonst seltene Imino Tautomer dieser Base stabilisieren. Die Wechselwirkung eines Iminos von G2482 mit A2486 kann ebenso das Imino Tautomer des A2486 stablisieren, die in einer negativen Ladung auf seinem N3 resultieren würden, wenn es unprotoniert wäre (siehe 16(C)). Auf diese Weise könnte einiges der negativen elektrostatischen Ladung, die von dem verborgenen Phosphat von A2485 stammt, auf das N3 des A2486 verlagert werden, wodurch sein pKa erhöht wurde.
Ein zweites Merkmal der Umgebung der katalytischen Stelle, die ihre Stabilität, ihren tautomeren Zustand und ihre elektrostatische Ladungsverteilung beeinflussen kann, ist ein gebundenes monovalentes Kation. Ein Kalium oder ein Natrium Ion wechselwirkt mit dem O6 von G2482 und G2102 wie auch mit drei anderen Basen. Seine Identität als ein Kaliumion wurde festgestellt durch sein beobachtetes Fortfahren und durch ein unabhängiges Experiment, das zeigte, dass ein Rubidium Ion an diese Stelle binden kann. Das monovalente Ion kann auch nicht Standart Tautomere stabilisieren, aber sein erwarteter Einfluss auf den pKa von A2486 ist weniger offensichtlich. Frühe biochemische Experimente haben die Wichtigkeit von Kalium für die Peptidyltransferase Aktivität gezeigt (Monro (1967) supra; Maden et al. (1986) supra) und diese Bindungsstelle könnte für diesen Effekt verantwortlich sein.
Es kann auch der Fall sein, dass Stabilisierung eines Imino Tautomers durch ein verborgenes Phosphat den erwarteten höheren pKa eines katalytischen Cytosins in der aktiven Stelle des Hepatitis Delta Virus Ribozyms erklärt (Ferne-D'Amare et al. (1998) Nature 395: 567-574; Naharo et al. (2000) Science 287: 1493-1497). In diesem Fall wird beobachtet, dass ein Rückgratphosphat, dessen Lösungsmittelzugänglichkeit ähnlich dem von A2485 in dem Ribosom ist, an das N4 von C Wasserstoff Brückenbindungen eingeht, und die protonierte Form des Imino Tautomers dieses Cs würde das Phosphat neutralisieren, wodurch die Funktion seines N3 als eine allgemeine Säure bewirkt würde (Naharo et al. (2000) supra).
4. Katalytischer Mechanismus der Peptidbindungsbildung
Die Nähe des N3 von A2486 (2451) zu der zu synthetisierenden Peptidbindung und die Eigenart der katalysierten Reaktion legen einen chemischen Mechanismus der Peptidsynthese nahe, die analog ist zu der Umkehr des Deacylierungsschritts, der bei Serinproteasen während der Peptidhydrolyse gesehen wird. (Blow et al. (1969) Nature 221: 337-340; Steitz et al. (1982) Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 11: 419-444). In jenem Mechanismus zieht die basische Form von His57 ein Proton von der Aminogruppe des Peptidprodukts ab, wenn es das Acyl-Ser195 angreift. Bildung des tetrahedrischen Carbonyl Kohlenstoff Intermediats wird durch die Wechselwirkung des Oxyanions stabilisiert, das mit Rückgrat Amiden (dem „Oxyanion Loch") gebildet wird; His57 überträgt das Proton, das von dem -NH₂ erhalten wurden auf das Ser195, wenn das tetrahedrische Intermediat zusammenbricht.
Der Rest A2486 (2451) scheint das Analoge zu dem His57 in Chymotrypsin zu sein, und die Peptidyl-tRNA ist das Analoge zu der Acyl-Ser195. Somit zieht das N3 von A2486, mit seinem stark erhöhtem pKa, ein Proton von der Aminogruppe der A-Stellen gebundenen Aminoacyl-tRNA, was den nukleophilen Angriff dieser Aminogruppe auf den Carbonyl Kohlenstoff ermöglicht, der das 3' OH der tRNA in der P-Stelle acyliert (siehe 17(A)). Im Gegensatz zu den Serinproteasen ist das Oxyanion des tetrahedrischen Intermediats jedoch nahe dem protonierten N3 von A2486 (A2451) statt einer separaten Oxyanion Bindungsstelle nahe zu sein. Somit könnte es sein, dass das protonierte N3 von A2486 die Bildung des Oxyanions durch Wasserstoff Brückenbindung an dieses stabilisiert, wie wir es in dem Yarus Inhibitor Komplex beobachten (siehe 17(B)). Das N3 von A2486 könnte dann anschließend sein Proton auf das 3' Hydroxyl der P-Stellen gebundenen t-RNA übertragen, die freigesetzt wird, wenn das Peptid zu der A-gebundenen tRNA verschoben wird (siehe 17(C)).
Eine zusätzliche Frage ist, wie die katalysierte Hydrolyse der Peptidyl tRNA in der P-Stelle verhindert wird vor der Anlieferung der nächsten geeigneten aa-tRNA an die A-Stelle? Es erscheint von diesem Komplex, das Wasser nicht von dem Zugang zu der Peptidylverbindung zu der P-Stellen tRNA ausgeschlossen werden könnte, wenn die A-Stelle leer wäre. Ein analoges Problem wurde von Koshland in den 1960ern diskutiert (Koshland, Jr. (1963) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 28: 473-489), der darüber Theorien aufstellte, warum Hexokinase nicht ATP in der Abwesenheit von Glucose hydrolisiert, da Wasser perfekt and die Bindungsstelle binden sollte, die durch das 6-Hydroxyl der Glucose verwendet wird. Die vorgeschlagene Antwort war induzierte Anpassung, d.h. Hexokinase ist katalytisch nicht kompetent bis die Glucose bindet und eine konformationelle Anderung hervorruft, die Substrate und katalytische Gruppen optimal orientiert. Die scheint in der Tat der Fall zu sein (Bennett, Jr. et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4848-4852). In ähnlicher Weise könnte es sein, dass das katalytische A2486 und/oder das Peptidylsubstrat nicht korrekt ausgerichtet ist oder dass die Bindungsstelle für die -NH₂ Gruppe durch eine reorientierte Ribosomenbase in der Abwesenheit einer aa-tRNA in der A-Stelle blockiert ist. Wir beobachten, dass die Base von U2620 dem A2486 in der Liganden freien Struktur nahe ist, und sie kann als ein geeigneter Stecker dienen, der spontane Hydrolyse von Peptidyl-tRNA verhindert.
Somit erscheint es, dass dieses RNA Enzym die gleichen Katalyseprinzipien verwendet wie ein Proteinenzym. Erst wird eine große katalytische Verbesserung erreicht durch genaues Ausrichten der zwei Reaktanden, des NH₂ aus der A-Stellen Aminoacyl tRNA und des Carbonyl Kohlenstoffs aus der P-Stellen Peptidyl-tRNA. Dies kann erreicht werden zum Teil durch die Wechselwirkungen der CCA Enden der A-Stellen und P-Stellen tRNAs mit dem A-Loop bzw. dem P-Loop. Als zweites wird Säure-Base Katalyse und Übergangszustand Stabilisierung erreicht durch eine funktionale Gruppe eines Enzyms (A2486 (2451) in diesem Fall), dessen chemische Eigenschaften in geeigneter Weise durch die Umgebung der aktiven Stelle geändert werden. Zum dritten können ähnliche chemische Prinzipien durch RNA und Protein Enzyme verwendet werden, um die pKa's der funktionalen Gruppen zu ändern. Ein verborgenes Carboxylat von Asp102, das über His47 wirkt, ändert die Nukleophilizität von Ser195 in Chymotrypsin (Blow et al. (1969) supra). In dem Ribosom kann ein Lösungsmittel unzugängliches Phosphat durch G2482 (2447) wirken, und die Nukleophilizität des N3 von A2486 (2451) ändern. Es könnte sein, dass RNA Moleküle, signifikant viel länger vor den Protein Moleküle, es "lernten", wie die chemischen Prinzipien der Katalyse zu benützen sind.
5. tRNA Bindung
Während es aus sterischen Gründen nicht möglich ist tRNA Moleküle an die A- oder P-Stellen in diesen Kristallen zu binden, ist es möglich die A-, P- und E-Stellen tRNA Moleküle auf der großen ribosomalen Untereinheit in der in der gleichen relativen Orientierung zu platzieren, die Cate et al. in seiner kristallographischen Studie des Thermus aquaticus 70S Ribsoms beobachtete. Die Koordinaten der drei tRNA Moleküle in den relativen Positionen, die in dem 70S Ribosom gesehen werden, können auf die Haloarcula marismortui große ribosomale Untereinheit in einer Weise übertragen werden, die sterische Zusammestöße vermeidet, und die Akzeptor Stämme der A-Stellen und P-Stellen tRNAs nahe der Positionen der CCAs positioniert, die wir an den A-Loop und P-Loop gebunden beobachtet haben (siehe 18). Obgleich Nukleotide C74 und C75 in einer unterschiedlichen Konformotion auf der 7.8 Å Ribsomenkarte modelliert wurden, können die C74 Reste aus den CCAs in sowohl den A- als auch den P-Stellen mit Rest 72 der darüber gelagerten A-Stellen und P-Stellen tRNAs über einen modellierten Rest 73 verbunden werden, und es scheint, dass die tRNA Moleküle sich gut auf die Oberfläche der Untereinheit einpassen. Unerwarteteweise platziert die Modellierung die E-Stellen, P-Stellen und A-Stellen gebundenen tRNA Moleküle in enge Nähe zu den drei ribosomalen Proteinen. Proteine L5 und L10e sind nahe tRNAs in der P-Stelle und A-Stelle. Da beide diese Proteine auch mit 5S rRNA wechselwirken, entsteht durch diese Beobachtung die Möglichkeit, dass 5S rRNA und einige ihrer assoziierten Proteine die Positionierung der Ribosomen gebundenen tRNAs stabilisieren helfen können und ist konsistent mit der Tatsache, dass 5S rRNA die ribosomale Aktivität erhöht, ist aber nicht absolut essentiell dafür (Moore, Ribosomal RNA & Structure, Evolution, Processing and Function in Protein Biosynthesis (1996), supra, S. 199-236). Protein L44e scheint mit der E-Stellen tRNA wechselzuwirken und kann zur E-Stellen Aktivität beitragen, Gemäß diesem Überlagerungsexperiment wechselwirkt die A-Stellen t-RNA mit den hoch konservierten Stamm-Loop 2502-2518 (2467-2483), der zusammen mit L10e eine große konkave Oberfläche bildet, die tRNA auf dem T-Stamm kontaktiert, unter Verwendung der exakt gleichen Bindungsstelle, die durch EF-Tu genutzt wird (Gutell et al. (2000) supra).
Untersuchung der Beziehungen zwischen den in den A- und P-Stellen gebundenen CCAs und den tRNAs, mit denen sie verbunden sind, wie auch ihrer Wechselwirkungen mit dem Ribosom führt auch zu einigen Einsichten in die Translokation. Unmittelbar nach Bildung der neuen Peptidbindung und Deacylierung der P-Stellen tRNA bewegt sich das Akzeptor Ende der P-Stellen tRNA bekannterweise zu der E-Stelle und das der A-Stellen tRNA bewegt sich zu der P-Stelle (Blobel et al. (1970) J. Cell. Biol. 45: 130-145).
Das ungefähre Modellieren der 3 tRNA Moleküle auf der großen Untereinheit legt ein paar mögliche Beiträge zu diesem Prozess nahe. Zuerst gibt es zwei Basenpaare zwischen der P-Stellen tRNA und dem P-Loop und nur eines zwischen der A-Stelle und dem A-Loop. Das Bewegen aus der A- zu der P-Stelle erhöht die Basenpaarung, obwohl es eine gleichzeitige Anziehung der deacylierten P-Stellen tRNA zu einer E-Stelle geben muss. Weiterhing stehen die CCAs, die an die A und P Loops gebunden sind, durch 180° Rotation in Bezug zueinander, wobei die tRNAs, an denen sie angebracht sind, nicht in Bezug zueinander stehen. Somit können die Beziehungen der CCAs zu den Akzeptor Stämmen nicht bei beiden Stellen die gleichen seien und sind vielleicht nicht gleich stabil. Wenn die Konformation der A-Stellen tRNA weniger stabil ist, dann ist das Bewegen einer tRNA aus der A- in die P-Stelle vielleicht energetisch begünstigt.
6. Polypeptid Austrittstunnel
Es scheint aus der Struktur her sehr wahrscheinlich zu sein, dass alle entstehenden Polypeptide durch den Polypeptid Austrittstunnel hindurchtreten bevor sie aus dem Ribosom austreten, da es anscheinend keinen anderen Weg hinaus gibt. Wir sind nun in der Lage uns zwei wichtigen Fragen über das Funktionieren des Polypeptid Austrittstunnels zu widmen: (1) Warum kleben entstehende Proteine nicht an ihre Wände? Teflon besitzt die großartig Eigenschaft nicht an denaturierte Eiproteine zu kleben, also wie hat das Ribosom eine ähnliche nicht anheftende Oberfläche für die denaturierten Proteine bewerkstelligt, die durch den Tunnel hindurchtreten müssen? (2) Falten Proteine zu irgendeinem Grad in dem Tunnel, wodurch dem Ribosom eine Chaperon-artige Funktion gegeben würde?
Die Länge des Tunnels von der Stelle der Peptidsynthese bis zu seinem Ausgang ist ungefähr 100 Å, weitesgehend konsistent mit der Länge des entstehenden Polypeptids, die von proteolytischer Spaltung durch das Ribosom geschützt ist (Moazed et al. (1989) Natura 342: 142) und der Minimumlänge, die für Antikörper Erkennung an dem Ausgang benötigt wird (Picking et al. (1992) Biochemistry 31: 2368-2375). Der Tunnel ist größtenteils gerade, außer für eine Biegung von 20 bis 35 Å von dem Peptidyltransferase Zentrum (siehe 19). Sein Durchmesser variiert von ungefähr 20 Å an seinem weitesten Punkt bis zu einer Engstelle von ungefähr 10 Å umittelbar am Anfang und an einer Stelle 28 Å vom Tunnelausgang mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr 15 Å. Da die kleinste Öffnung, durch die das Polypeptidprodukt hindurchgehen muss nur gerade den Durchmesser eines Helix Durchmessers beherbergen kann, erscheint es unwahrscheinlich, das signifikante Proteinfaltung sich über die Bildung einer -Helix hinaus sich innerhalb des Ribosoms ereignen kann.
Der überwiegende Teil der Tunneloberfläche wird durch die Domänen I-V der 23S rRNA gebildet, aber signifikante Beiträge werden auch durch die nicht globulären Regionen der Proteine L22, L4 und L39 gemacht, die nicht nur einige der Leerstellen in dem RNA Gerüst auffüllen, sondern auch signifikante Teile der Tunneloberfläche bilden (siehe 19). Der größte Beitrag eines Proteins zu der Oberfläche des Tunnels stammt von L22, dessen langer Haarnadel Loop zwischen den RNA Segmenten der Domänen I bis IV liegt und ungefähr parallel mit der Achse des Tunnels ist. Anders als die anderen Tunnelproteine besitzt L39 keine globuläre Domäne an der Oberfläche des Partikels und ist fast vollständig verborgen in Domänen I und III unterhalb des Proteins L23. Interesanterweise stammen die Nukleotide der 23S rRNA, die die Tunnelwand bilden, vorwiegend aus Loops in der 23S rRNA Sekundärstruktur (siehe 19). Wenn es durch den Tunnel von der aktiven Stelle aus voranschreitet, trifft ein entstehendes Polypeptid erst Domäne V gefolgt 20 Å weiter von Domänen II und IV und Proteinen L4 und L22. Die letzte Hälfte des Tunnels wird durch Domänen I und III und dem Protein L39e gebildet.
Der engste Teil des Tunnels wird durch Proteine L22 und L4 gebildet, die sich dem Tunnel von entgegengesetzten Seiten nähern, und bilden, was eine Toröffnung zu seien scheint (siehe 19c). Die Funktion dieser Verengung, wenn sie überhaupt eine hat, ist nicht offensichtlich. Es kann der Ort sein, an dem die Eigenart der entstehenden Kette wahrgenommen wird und die Information an die Oberfläche des Partikels, vielleicht duch L22 oder L4 weitergereicht wird. Die Haarnadel von L22 an der Stelle dieser Öffnung und der mit ihr wechselwirkenden 23S rRNA sind hoch konserviert; sein globulärer Teil liegt unmittelbar neben dem Tunnelausgang auf der Oberfläche, die dem Translocon während der Proteinsezernierung gegenüberliegt (siehe 19).
Die „nicht anheftende" Eigenschaft der Tunnelwand muss ein Fehlen struktureller und polarer Komplementarität zu jeglicher Proteinsequenz oder Konformation wiederspiegeln, der sie begegnet. Die Tunneloberfläche ist größtenteils hydrophil und schließt ein exponierte Wasserstoff Brückenbindungsgruppen von Basen, Rückgratphosphaten und polaren Proteinseitenketten (siehe 19). Während es viele hydrophobe Gruppen gibt (Zucker, Basen, Proteinseitenketten), die auch am Tunnel liegen, gibt es keine Flächen von hydrophober Oberfläche, die groß genug wären, um eine bedeutende Bindungsstelle für hydrophobe Sequenzen in dem entstehenden Polypeptid zu bilden. Da der Tunnel 20 Å im Durchmesser ist und mit Wasser gefüllt ist und das neu synthetisierte Polypeptid vermutlich frei beweglich ist, würde die Bindung eines Peptids an die Tunnelwand in einem großen Entropieverlust resultieren, die durch eine große komplementäre Wechselwirkungsoberfläche kompensiert werden müsste, die größer als 700 Å ist (Chotia et al. (1975) Nature 256. 705-708). In ähnlicher Weise muss, während Arg und Lys Seitenketten aus einem entstehenden Peptid in der Tat mit den in dem Tunnel exponierten Phosphaten wechselwirken können, der Grad der strukturellen Komplementarität und der Netto Bindungsenergie, die nach dem Verdrängen der gebundenen Gegenionen erhalten wurde, zu klein sein, um die große ungünstge Immobilisierungs Entropie zu überkommen, die aus der Peptid Bindung resultieren würde. Somit erinnnert, obwohl der Ribosomentunnel primär aus RNA gemacht ist, die Beschaffenheit seiner Oberfläche an die innere Oberfläche des Chaperons GroEL (Xu et al. (1998) J. Struct. Biol. 124: 129-141) in seiner nicht bindenden Konformation. Nur in der Konformation, die eine große hydrophobe Oberfläche exponiert, bindet GroEL ein denaturiertes Protein.
Es gibt sechs Proteine (L19, L22, L23, L24, L29 und L31e), die an dem Ausgang des Tunnels lokalisiert sind, gegenüber dem Translocon, an das das Ribosom während der Proteinsezernierung andockt. Es gibt Belege, das das Ribosom das Translocon selbst nach intensivem Verdau seines Proteins durch Protease bindet, was impliziert, dass die Wechselwirkung zwischen dem Translocon und dem Ribosom durch RNA vermittelt ist. Die Nähe dieser Proteine zu dem Translocon, lässt uns jedoch fragen, welche Rollen, wenn überhaupt, sie in dem Proteinsezernierungsprozess spielen mögen. Kürzlich aus dem Dobberstein Labor erhaltene Daten zeigen, dass die N-terminale Domäne von SRP54, dem G-Protein aus dem Signalerkennungspartikel, das in Signalpeptidbindung involviert ist, mit den ribosomalen Proteinen L23 und L29 quervernetzt werden kann. Diese zwei Proteine liegen direkt nebeneinander und sind an dem Tunnelausgang (siehe 19).
7. Evolution.
In vitro Evolution von RNA Oligonukleotiden brachte kleine RNA Moleküle hervor, die Moleküle, wie den Yarus Inhibitor, effizient binden oder die Peptidyltransfer Reaktion katalysieren (Zhaug et al. (1998) Chem. Biol. 5: 539-553; Welch et al. (1997) supra). Die Sequenz und Sekundärstruktur einer dieser selektierten RNAs erinnert an den Peptidyltransferase Loop in Domäne V der 23S rRNA (Zhaug et al. (1998) supra). Die beeindruckenste Ähnlichkeit ist eine fünf Nukleotide Sequenz, die identisch ist zu einer Sequenz in Domäne V, die das katalytische A2486, G2482 und das verborgene Phosphat von A2485 einschließt. Bemerkenswerterweise liegen all die Gruppen, die in dem vorgeschlagenen Ladungsverschiebungssystem zum Aktivieren von A2486 in dem Ribosom involviert sind, in dem in vitro selektierten Ribozym vor. Somit scheint es, obwohl der umgebendende strukturelle Kontext wahrscheinlich unterschiedlich ist, plausibel, dass dieses künstlich entwickelte Ribozym die gleichen Mechanismen wie das Ribosom verwendet, um den pKa eine Adenins zu verschieben und es dieses in ähnlicher Weise als eine Base für Peptidsynthese verwendet. Eine zweite RNA (Welch et al. (1997) supra) enthält einen 12 Nukleotid Loop, der eine 9 Basen Sequenz einschließt identisch zu der, die in der gleichen Region des Peptidyltransferase Loops gefunden wird.
Die beeindruckenden Änlichkeiten zwischen den Sequenzen, die katalytische Schlüsselelemente enthalten, die in der aktiven Stelle der Peptidyltransferase Stelle des Ribosoms gefunden werden und den Sequenzen von in vitro selektierten RNAs mit verwandten Aktivitäten machen klar, dass das Auftreten einer kleinen RNA Domäne, die in der Lage ist Peptidyltransferase zu katalysieren, ein erster plausibler Schritt in der Evolution der Proteinsynthese des Ribosoms war. Die ersten Peptide, die durch dieses ursprüngliche Peptid synthetisierende Enzym synthetisiert wurden, können zufällige Polymere und Kopolymere gewesen sein, und könnten mit Substraten so einfach wie einer amimoacylierten CCA funkioniert haben. Einfache Peptide des Typs, der beobachtet wurde, die nicht globulären Fortsätze zu bilden, die zusammen mit der 23S rRNA falten, könnten zu den ersten Peptiden gehört haben, die funktionell nützlich waren. Solche Peptide können die Stabilität des Protoribosoms und anderer früherer Ribozyme erhöht haben, wie die komplexeren Peptide der heutigen Ribosomen es zu tun scheinen.
C. Atomare Struktur der großen ribosomalen Untereinheit bei 2.4 Å Auflösung, vollständige Verfeinerung
Die dreidimensionale Struktur der großen ribosomalen Untereinheit von Haloarcula marismortui wurden nun vollständig bei einer Auflösung von 2.4 Å Auflösung verfeinert. Das Modell schließt 2876 RNA Nukleotide, 3701 Aminosäuren aus 28 ribosomalen Proteinen, 117 Magnesiumionen, 88 monovalente Kationen und 7898 Wassermoleküle ein. Viele seiner Proteine bestehen aus einer Oberflächen exponierten globulären Domäne und einem oder mehreren basischen nicht globulären Fortsätzen, die in rRNA verborgen sind. Die Hälfte von diesen schließt Motive ein, die in nicht ribosomalen Proteinen üblich sind, zum Beispiel RRM Domänen, SH3-artige Fässer und Zinkfinger. Proteine, die signifikante Sequenzähnlichkeit und strukturelle Ähnlichkeit besitzen, wie L15 und L18e, üben essentiell identische Wechselwirkungen mit rRNA aus.
Genauer gesagt wurde die H. marismortui 50S Untereinheit vollständig wieder aufgebaut und verfeinert durch aufeinander folgende Runden der Gradienten Energieminimierung und B-Faktor Verfeinerung unter der Verwendung von CNS (Brünger et al. (1998) supra). Ribosomale Proteine und rRNA wurden vollständig wieder aufgebaut mit 2F₀-Fc Elektronendichtekarten unter Verwendung des Softwareprogramms „O" (Jones, T.A. et al. (1991) Acta Crystallogr. A46: 110-119) vor der Modellierung des Lösungsmittels und der Metallionen. Modellierungsfehler in den Proteinen wurden identifiziert mit PROCHECK (Laskowski et al. (1993) J. Appl. Cryst. 26: 283-291) und durch Inspektion der F₀-Fc Karten. Differenzkarten halfen auch bei der Identifizierung von Fehlern in der rRNA, die meistens mit Zuckerfaltungen einhergingen. Bei diesem Vorgang wurden einige Anpassungen bei den Aminosäurekonformationen, Sequenzregister und in Sequenzen selbst gemacht. Vorgenommene Sequenzänderungen waren weitesgehenst begrenzt auf L10e, L15e und L37Ae, den einzigen drei Proteinen aus der H. marismortui 50S, die nicht direkt sequenziert wurden. Zusätzlich wurden 51 Aminosäuren zu dem Modell hinzugefügt, das in Abschnitt IIA beschrieben wurde, wobei 44 dieser Aminosäuren aus L10 an der Basis des L7/L12 Stammes und L39e kamen, das einen Teil der Wand des Polypeptidaustrittstunnels einkleidet. Weniger Anpassungen wurden an der rRNA Struktur durchgeführt. 49 neue Nukleotide wurden modelliert und verfeinert, hauptsächlich in Helices 43 und 44 in Domäne II der 23S rRNA. Zusätzlich wurden Zuckerfaltung oder Konformation um die glykosidische Bindung für einige Nukleotide angepasst. Der Verfeinerungsprozess wurde über die Qualität der Elektronendichtekarten beobachtet, die mit den Phasen berechnet wurden, die aus dem Modell wie auch den R/R_frei Werten abgeleitet wurden. Das vollständig verfeinerte Modell schließt nun 2876 RNA Nukleotide, 3701 Aminosäuren, 210 Metallionen und 7898 Wassermoleküle ein. Das Modell verfeinert bis zu einem R/R_frei von 18.9%/22.3% und besitzt eine exzellente Geometrie (Tabelle 4).
Lösungsmittelmodellierung begann mit der Erzeugung ein Liste möglicher Magnesiumionen, die durch automatische Peak Selektion mit CNS erhalten wurden. Peaks größer als 3.5 in F₀-Fc Karten, die innerhalb der inneren Sphären Magnesium Koordinaten Distanz von 1.9-2.1 Å von N oder O Atomen positioniert waren, wurden ausgewählt. Die resultierende Liste wurde per Hand inspiziert und nur Peaks, die ein klare octahedrische Koordinatengeometrie aufwiesen, wurden als Magnesium ausgewählt.
Monovalenten Kationen wurden auf der Basis von isomorphen Unterschieden zwischen Rubidium getränktem und nativen Kristall der H. marismortui 50S Untereinheit identifiziert. Da native Kristalle in der Gegenwart von 1.6 M NaCl stabilisiert waren, wurden diese Stellen zuerst moduliert und als Na⁺¹ verfeinert. Verfeinerung dieser Stellen als K⁺¹ führte fast immer zu ungewöhlich hohen Temperaturfaktoren, mit zwei Ausnahmen, an denen wir K⁺¹ modelliert haben. Die meisten der monovalenten Stellen in der 50S Untereinheit erscheinen durch Na⁺¹ in unseren Kristallen besetzt zu sein, aber es ist wahrscheinlich, dass diese Stellen in vivo mit K⁺¹ besetzt sind.
Wassermoleküle wurden als Peaks größer als 3.5 in F₀-Fc Elektronendichtekarten und zwischen 2.5 und 3.3 Å von N oder O Atomen ausgewählt. Individuelle B-Faktor Werte wurden verwendet, um die Zuordnung der Wassermoleküle abzuschätzen. Eine Anzahl von Wassermolekülen verfeinerten zu B-Faktoren, die signifikant niedriger waren, als die der umgebenden RNA und Proteinatome. In vielen Fällen stellt sich heraus, dass die Peaks Metall oder Chlorid Ionen waren. Ein kleine Anzahl von Wassermolekülen mit niedrigem B-Faktor wurde in dem Endmodell beibehalten, da sie nicht eindeutig anderen Spezies zugeordnet werden konnten. In Folge der Hinzufügens von Metallionen und Wassermolekülen enthält das Endmodell nun 98,547 nicht Wasserstoff Atome. Die Verfeinerungs- und Modellstatistiken für die große ribosomale Untereinheit sind in Tabelle 4 zusammengefasst. Tabelle 4 Verfeinerungs- und Modellstatistiken für die H. marismortui 50S Untereinheit
Verfeinung ermöglichte auch das zusätzliche Modellieren von L10, L39e und der L11 Bindungsstelle in der 23S rRNA. Ferner wurde entdeckt, das bestimmte Motive, zum Beispiel RRM Topologien, SH3-artige Fässer und Zinkfinger in den 50S Proteinen üblich sind und jedes davon rRNA auf vielen verschiedenen Wegen erkennt. Proteine jedoch, die eine signifikante dreidimensionale Homologie aufweisen, wie L15 und L18e wie auch L18 und S11 führen essentiell identische Wechselwirkungen mit rRNA durch. Zusätzliche strukturelle Homologien zwischen 50S Proteinen und nicht ribosomalen Proteinen sind auch offensichtlich. Die Lösungsmittel exponierten Oberflächen dieser globulären Proteindomänen sind reich an Aspartat und Glutamat Resten, während unregelmäßige Proteinfortsätze in den RNA Kern des Ribosoms eindringen. Diese Fortsätze sind häufig hoch konserviert, und die hohe Anzahl von Arginin, Lysin und Glycin Resten darin ist wichtig für ihre Funktion. Zusammen genommen zeigen diese Ergebnisse evolutionäre Verbindungen zwischen vielen ribosomalen Proteinen und veranschaulichen, das Protein-RNA Wechselwirkungen in dem Ribosom, obwohl sie größtenteils einzigartig sind, einige gemeinsame Prinzipien teilen.
D. Antibiotika Bindungsstellen
Zusätzlich zu den vorstehenden strukturellen Studien wurde die Struktur der großen ribosomalen Untereinheit von H. marismortui komplexiert mit sieben verschiedenen Antibiotika bestimmt. Genauer gesagt, wurden die Kristalle der H. marismortui großen ribosomalen Untereinheit mit einem der folgenden Antibiotika getränkt: Anisomycin, Blasticidin, Carbomycin, Tylosin, Sparsomycin, Virginiamycin oder Spiramycin. Die Struktur der großen ribosomalen Untereinheit komplexiert mit jedem Antibiotikum wurde dann basierend auf Röntgenstrahlen Beugungsdaten, die für jeden Kristall erzeugt wurden, aufgelöst.
Kurz gesagt, wurde eine kleine Menge einer konzentrierten Antibiotika Lösung zu einem großen Untereinheits-Kristall hinzugefügt, in einer Stabilisierungslösung aufgenommen und für zahlreiche Stunden inkubiert. Nach dem Gefrieren und den anderen Prozeduren, die normalerweise verwendet wurden, um solche Kristalle für experimentelle Verwendung vorzubereiten, wurden Röntgenstrahlen Beugungsdaten aus den Antibiotika enthaltenden Kristallen gesammelt. Da die Kristalle zu den Kristallen, von denen oben die Stuktur beschrieben wurde, abgeleitet wurde, isomorph waren, wurden die Phasen, die vom nativen Kristall erhalten wurden, mit den Beugungintensitäten kombiniert, die von den Antibiotika getränkten Kristallen erhalten wurden, um eine Struktur der Letztgenannten zu erhalten. Die Position des Antibiotikums in dem Kristall, an die gebunden wurde, wurde am klarsten in Elektronendichtekarten enthüllt, die Elektronendichtekarten sind, die mit den Phasen, auf die eben Bezug genommen wurde, und den Amplituden, die erhalten wurden durch Abziehen der Amplituden des Kristalls, der kein Antibiotikum enhält, von den (in geeingneter Weise skalierten) Amplituden von den Kristallen, die Antibiotikum enthalten. Durch Anwendung der vorstehenden Verfahren war es möglich die Atom Koordinaten zu bestimmen, die die räumliche Beziehung zwischen bestimmten Antibiotika und ihren Bindungsstellen innerhalb der großen ribosomalen Untereinheit zeigen. Es wird auch erwogen, das ähnliche Verfahren verwendet werden können, um die Struktur anderer Antibiotika aufzulösen, die mit der großen ribosomalen Untereinheit komplexiert wurden.
Die Atom Koordinaten der großen ribosomalen Untereinheit komplexiert mit Anisomycin sind in einer Tabelle auf Compact Disk Nr. 3 von 3 und dem Dateinamen anisomycin.pdb aufgeführt. Zusätzlich zeigt 20 die räumliche Beziehung zwischen dem Antibiotikum Anisomycin und der großen ribosomalen Untereinheit.
Die Atom Koordinaten der großen ribosomalen Untereinheit komplexiert mit Blasticidin sind in einer Tabelle auf Compact Disk Nr. 3 von 3 und dem Dateinamen blasticidin.pdb aufgeführt. 21 zeigt die räumliche Beziehung zwischen dem Antibiotikum Blasticidin und der großen ribosomalen Untereinheit. Zur Orientierung enthält 21 auch ein Substrat für die P-Stelle.
Die Atom Koordinaten der großen ribosomalen Untereinheit komplexiert mit Carbomycin sind in einer Tabelle auf Compact Disk Nr. 3 von 3 und dem Dateinamen carbomycin.pdb aufgeführt. 22 zeigt die räumliche Beziehung zwischen dem Antibiotikum Carbomycin und der großen ribosomalen Untereinheit. 22 zeigt auch einen Teil des Polypeptidaustrittstunnels.
Die Atom Koordinaten der großen ribosomalen Untereinheit komplexiert mit Tylosin sind in einer Tabelle auf Compact Disk Nr. 3 von 3 und dem Dateinamen tylosin.pdb aufgeführt. 22 zeigt die räumliche Beziehung zwischen dem Antibiotikum Tylosin und der großen ribosomalen Untereinheit. 22 zeigt auch einen Teil des Polypeptidaustrittstunnels.
Die Atom Koordinaten der großen ribosomalen Untereinheit komplexiert mit Sparsomycin sind in einer Tabelle auf Compact Disk Nr. 3 von 3 und dem Dateinamen sparsomycin.pdb aufgeführt. 23 zeigt die räumliche Beziehung zwischen dem Antibiotikum Sparsomycin und der großen ribosomalen Untereinheit. Zur Orientierung enthält 23 auch ein Substrat für die P-Stelle.
Die Atom Koordinaten der großen ribosomalen Untereinheit komplexiert mit Virginiamycin sind in einer Tabelle auf Compact Disk Nr. 3 von 3 und dem Dateinamen virginiamycin.pdb aufgeführt. 24 zeigt die räumliche Beziehung zwischen dem Antibiotikum Virginiamycin wie auch Carbomycin und der großen ribosomalen Untereinheit.
Die Atom Koordinaten der großen ribosomalen Untereinheit komplexiert mit Spiramycin sind in einer Tabelle auf Compact Disk Nr. 3 von 3 und dem Dateinamen spiramycin.pdb aufgeführt.
25 zeigt die räumliche Ausrichtung von zahlreichen Antibiotika, namentlich Blasticidin, Anisomycin, Virginiamycin und Carbomycin, wie sie an ihre jeweilige Antibiotikum Bindungsstelle innerhalb der großen ribosomalen Untereinheit binden. Zur Hilfe der Orientierung des Lesers, werden die Positionen der P-Stelle, A-Stelle und der Polypeptidaustrittstunnels in 25 gezeigt. Wie offenbar ist, binden diese Antibiotika an oder stehen in Kontakt mit spezifischen Stellen innerhalb der großen ribosomalen Untereinheit, um die Proteinbiosynthese zu unterbrechen. Zum Beispiel erscheint es, dass Blasticidin die große ribosomale Untereinheit in der Nachbarschaft der P-Stelle bindet; Anisomycin und Virginiamycin binden die große ribosomale Untereinheit in der Nachbarschaft der A-Stelle; und Carbomycin (ein Macrolid) bindet die große ribosomale Untereinheit in der Nachbarschaft des Polypetidaustrittstunnels direkt neben der Peptidyltransferase Stelle.
Aus 25 heraus ist es offenbar, dass der Fachmann bestimmte Teile jedes Antibiotikums identifizieren kann, die mit Regionen in der großen ribosomalen Untereinheit in Kontakt stehen. Durch Kennen der räumlichen Beziehung zueinander kann der Fachmann ein Hybrid Antibiotikum Molekül erzeugen, das einen Teil eines ersten Matrizenantibiotikums und einen Teil eines zweiten, unterschiedlichen Matrizenantibiotikums umfasst. Die zwei Teile können durch einen chemischen Linker verbunden sein, so dass die räumliche Ausrichtung eines Teils in Bezug zu dem anderen Teil erhalten bleibt. Infolgedessen kann das Hybridantibiotikum an jede der Regionen der ribosomalen Untereinheit binden, die typischerweise durch das jeweilige Matrizenantibiotikum gebunden werden. Die Konstruktion und Testung solcher Moleküle wird in größerem Detail unten diskutiert.
E. Experimentelle Techniken, die Röntgenstrahlen Beugungsdaten benützen
Basierend auf Röntgenstrahlen Beugungsmustern, die durch die Anordnung der Moleküle oder Atome in einem kristallinen Feststoff erhalten wurden, kann die Elektronendichte dieses Feststoffs mit Hilfsmitteln rekonstruiert werden, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Kristallographie und Röntgenstrahlen Beugungstechniken wohl bekannt sind. Zusätzliche Phaseninformation, die entweder aus den Beugungsdaten extrahiert wurde und verfügbar aus in der veröffentlichten Literatur und/oder aus ergänzenden Experimenten ist, können dann verwendet werden, um die Rekonstruktion zu vervollständigen.
Für grundlegende Konzepte und Prozeduren des Sammelns, Analysierens und Verwendens von Röntgenstrahlen Beugungsdaten zur Konstruktion von Elektronendichten, siehe zum Beispiel, Campbell et al.. (1984) Biological Spectroscopy, The Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc., (Menlo Park, CA); Cantor et al. (1980) Biophysical Chemistry. Part II: Techniques for the study of biological structure and function, W.H. Freeman and Co., San Francisco, CA; A.T. Brünger (1993) X-PLOR Version 3.1: A system fer X-ray cxystailography and NMR, Yale Univ. Pr., (New Haven, CT); M.M. Woolfson (1997) An Introduction to X-ray Crystallography, Cambridge Univ. Pr., (Cambridge, UK); J. Drenth (1999) Principles of Protein X-ray Crystallography (Springer Advanced Texts in Chemistry), Springer Verlag; Berlin; Tsirelson et al. (1996) Electron Density and Bonding in Crystals: Principles, Theory and X-ray Diffraction Experiments in Solid Stare Physics and Chemistry, Inst. Of Physics Pub.; U.S. Patent Nr. 5,942,428; U.S. Patent Nr. 6,037,117; U.S. Patent Nr. 5,200,910 and U.S. Patent Nr. 5,365,456 ("Method for Modeling the Electron Density of a Crystal").
Ein molekulares Modell kann dann fortschreitend aufgebaut werden mit der Elektronendichte Information und weiter gegen die Rötgenstrahlen Beugungsdaten verfeinert werden, resultierend in einer zutreffenden molekulare Struktur des Feststoffs.
F. Strukturelle Bestimmung anderer großer ribosomaler Untereinheiten
Es versteht sich, dass der Fachmann, wenn ihm die Atom Koordinaten eines ersten Makromoleküls bereitgestellt werden, diese Information verwendet kann, um schnell und einfach die dreidimensionale Struktur eines verschiedenen aber strukturell verwandten Makromoleküls zu bestimmen. Zum Beispiel können die Atom Koordinaten, die die große ribosomale Untereinheit aus H. marismortui definieren, verwendet werden, um die Struktur der großen ribosomalen Untereinheit aus anderen Species zu bestimmen entweder als eine isolierte Untereinheit, im Komplex mit der kleinen Untereinheit, oder jede/r von diesen komplexiert mit funktionell wichtigen Liganden, zum Beispiel: Aminoacyl tRNA; verschiedenen Proteinsynthese Faktoren, wie Elongationsfaktor G, Elongationsfaktor Tu, Terminationsfaktor oder Wiederwendungsfaktor; sowohl in seinen GTP als GDP konformationellen Zuständen; und Proteinsynthese Inhibitoren, zum Beispiel Antibiotika. Zusätzlich können die H. marismortui Untereinheits Koordinaten verwendet werden, um die Strukturen von ribosomalen Komplexen mit Komponenten der Proteinsezernierungsmaschinerie zu lösen, zum Beispiel dem Signalerkennungspartikel, und dem Translocon.
Wenn der zu untersuchende Kristall ein Makromolekül unbekannter Struktur enthält und keine zusätzliche Information verfügbar ist, können zusätzliche Experimente machmal benötigt werden, um die relevanten Phasen des Makromoleküls zu bestimmen. Diesen Studien können of Zeit raubend sein und mit unklaren Erfolgsausichten (Blundell et al. (1976) supra). Wenn jedoch zusätzliche Information, zum Beispiel strukturelle und/oder kristallographische Information, für Moleküle verfügbar sind, die in einer gewissen Weise mit dem interressierenden Makromolekül verwand sind, dann ist der Prozess des Lösens der Struktur des interessierenden Moleküls eine wesentlich weniger fordernde und zeitraubende Aufgabe.
Entsprechend kann der Fachmann die Information, die aus der vorher aufgelösten Struktur gewonnen wurde, verwenden, um ein dreidimensionales Modell eines neuen interessierenden Moleküls zu entwickeln. Weiterhin kann der Fachmann eine Vielzahl von Ansätzen verwenden, um die dreidimensionale Struktur des neuen Moleküls aufzuklären. Die Ansätze können davon abhängen, ob Kristalle des interessierenden Moleküls verfügbar sind und/oder ob das interessierenden Molekül ein Homolog besitzt, dessen Struktur bereits bestimmt wurde.
In einem Ansatz, wenn das interessierende Molkekül Kristalle bildet, die isomoph sind, d.h. die die gleichen Einheitszell Dimensionen und Raumgruppen haben, wie ein verwandtes Molekül, dessen Struktur bestimmt wurde, dann können die Phasen und/oder Koordinaten für das verwandte Molekül direkt mit neu beobachteten Amplituden kombiniert werden, um Elektronendichtekarten und konsequenterweise Atom Koordinaten des interessierenden Moleküls zu erhalten. Die resultierenden Karten und/oder Atom Koordinaten können dann verfeinert werden mit Standard Verfeingungstechniken, die in der Technik bekannt sind. In einem anderen Ansatz, wenn das interessierende Molekül mit einem anderen Molekül mit bekannter dreidimensionaler Struktur verwandt ist, aber in einer unterschiedlichen Einheitszelle mit unterschiedlicher Symmetrie kristallisiert, kann der Fachmann eine Technik verwenden, die als molekulare Ersetzung bekannt ist, um nützliche Phasen aus den Koordinaten des Moleküls zu erhalten, dessen Struktur bekannt ist (Blundell et al. (1976) supra). Diese Phasen können dann verwendet werden, um Elektronendichtekarten und/oder Atom Koordinaten des interessierenden Moleküls zu erzeugen. In einem anderen Ansatz, wenn keine Kistalle für das interessierende Molekül vorhanden sind, aber es homolog ist zu einem anderen Molekül, dessen dreidimensionale Struktur bekannt ist, kann der Fachmann einen Prozess verwenden, der als Homologie Modellierung bekannt ist, um ein dreidimensionales Modell des interessierenden Moleküls zu erzeugen. Es wird erwogen, das andere Ansätze nützlich sein können, um ein dreidimensionales Modell eines interessierenden Moleküls abzuleiten. Entsprechend kann Information betreffend die Kristalle und/oder Atom Koordinaten eines Moleküls die Bestimmung der Strukturen von verwandten Molekülen beträchtlich vereinfachen.
Das Verfahren der molekularen Ersetzung, zuerst entwickelt durch Rossmann und Blow in den 1960ern, wird nun routienmäßig verwendet, um die Kristall Strukturen von Makromolekülen von unbekannten Strukturen mit der Struktur eines homologen Moleküls oder eines Moleküls in einem unterschiedlichen Zustand der Ligation zu erstellen (M.G. Rossmann, Hrg. „The Molecular Replacement Methods," Int. Sci. Rev. J. No. 13, Gordon & Breach, New York, NY (1972); Eaton Lattman, „Use of Rotation and Translation Functions," H.W. Wyckoff C.H.W. Hist. (S.N. Timasheff, Hrg.) Methods in Enzymology, 115: 55-77 (1985)). Für ein Beispiel der Anwendung der molekularen Ersetzung, siehe zum Beispiel Rice, P.A. & Steitz, T.A. (1994) EMBO J. 13: 1514-24.
Bei der molekularen Ersetzung wird die dreidimensionale Struktur des bekannten Moleküls innerhalb der Einheitszelle des neuen Kristalles durch Auffinden der Ausrichtung und Position platziert, die die beste Übereinstimmung zwischen den beobachteten Beugungsamplituden und den aus den Koordinaten der positionierten Untereinheit berechneten Beugungsamplituden liefert. Aus dieser Modellierung können ungefähre Phasen des unbekannten Kristalls abgeleitet werden. Um eine bekannte Struktur in der Einheitszelle in einer unbekannten, aber verwandten zu positionieren, müssen drei Rotationswinkel und drei Verschiebungen relativ zu dem Ursprung der Einheitszelle bestimmt werden. Die Rotationssuche wird durch Suchen für eine Übereinstimmung zwischen der Patterson Funktion der Suche und Zielstrukturen als einer Funktion ihrer relativen Orientierung (die Rotationsfunktion) durchgeführt. X-PLOR (Brünger et al. (1987) Science 235: 458-460; CNS (Crystallography & NMR System), Brünger et al., (1998) Acta Cryst. Sect. D 54. 905-921) und AMORE: an Automated Package for Molecular Replacement (Navaza, J. (1994) Acta Cryst. Sect. A, 50: 157-163) sind Computerprogramme, die Rotations- und Verschiebungsfunktionssuchen ausführen können. Wenn einmal die Orientierung eines Testmoleküls bekannt ist, muss die Position des Moleküls mit einer Verschiebungssuche gefunden werden. Nachdem die bekannte Struktur in der Einheitszelle des unbekannten Moleküls positioniert wurde, können Phasen für die beobachteteten Beugungsdaten aus den Atom Koordinaten der strukturell verwandten Atome des bekannten Moleküls berechnet werden. Durch Verwenden der berechneten Phasen und der Röntgenstrahlen Beugungsdaten für das unbekannte Moleküle kann der Fachmann eine Elektronendichtekarte und/oder Atom Koordinaten des interessierenden Moleküls erzeugen.
Es wird zum Beispiel erwogen, dass ein dreidimensionales Modell einer ribosomalen Untereinheit, verschieden von dem, das aus H. marismortui abgeleitet wurde, durch molekulare Ersetzung erzeugt werden kann. In diesem Verfahren werden die H. marismortui Untereinheit Strukturen innerhalb der Einheitszelle des neuen Kristalles durch Auffinden der Ausrichtung und Position platziert, die die beste Übereinstimmung zwischen den beobachteten Beugungsamplituden und den aus den Koordinaten der positionierten Untereinheit berechneten Beugungsamplituden liefern. Eine Start-Elektronendichtekarte, die berechnet wurde mit 2F_hkl(beobachtet)-F_hkl(berechnet), wobei F(beobachtet) die Beugungsamplituden sind, die aus Kristallen der unbekannten Strukture gemessen wurden, und F(berechnet) die Beugungsamplituden sind, die aus der positionierten H. marismortui Untereinheit Struktur berechnet wurden. Verfeinerung des Startmodells kann durchgeführt werden, wie sie Standard ist in dem Gebiet der makromolekularen Kristallographie.
Die H. marismortui 50S Struktur kann auch verwendet werden, um die Struktur eines 70S Ribosoms oder 50S Ribosoms aufzudecken, für die eine Elektronendichtekarte bei einer Auflösung berechnet wurde, die sonst zu niedrig gewesen wäre, um interpretiert zu werden, während eine Karte mit 5 Å Auflösung nicht in atomaren Begriffen de novo interpretiert werden könnte, kann ein plausibles Atommodell konstruiert werden durch Einpassen der H. marismortui 50S Struktur in eine Karte mit niedrigerer Auflösung (z.B. 4.5 Å bis 8 Å). Dieses Einpassen kann kombiniert werden mit Homologie Modellierung, um ein dreidimensionales Modell eines Ribosoms oder ribosomalen Untereinheit aus einer unterschiedlichen Spezies zu erhalten. Es wird erwogen, dass ähnliche Prozeduren verwendet werden können, um die Struktur der eurkaryotischen 60S Untereinheit und/oder eines eurkaryotischen Ribosoms zu bestimmen.
Im Allgemeinen hängt der Erfolg der molekularen Ersetzung zum Lösen von Strukturen von der Fraktion der Strukturen ab, die verwandt sind, und von ihrem Grad der Identität. Zum Beispiel, wenn ungefähr 50% oder mehr der Struktur einen r.m.s. Unterschied zwischen den entsprechenden Atomen in dem Bereich von ungefähr 2 oder weniger anzeigen, kann die bekannte Struktur erfolgreich verwendet werden, um die unbekannte Struktur zu lösen.
Homologie Modellierung, auch bekannt als vergleichende Modellierung oder wissensbasierte Modellierung, kann verwendet werden, um ein dreidimensionales Modell für ein Molekül basierend auf der bekannten Struktur von Homologen zu erzeugen. Im Allgemeinen kann die Prozedur einen oder mehrere der folgenden Schritte umfassen: Abgleichen der Aminosäuresequenz oder Nukleinsäuresequenz eines unbekannten Moleküls mit der Aminosäuresequenz oder Nukleinsäuresequenz eines Moleküls, dessen Struktur zuvor bestimmt worden war; Identifizieren der strukturell konservierten und strukturell variable Regionen; Erzeugen von Atom Koordinaten für Kern (strukturell konservierte) Reste der unbekannten Struktur, aus den Atom Koordinaten der bekannten Struktur(en); Erzeugen von Konformationen für die anderen (strukturell varirablen) Reste in der unbekannten Struktur; Gestalten der Seitenkettenkonformationen; und Verfeinern und/oder Evaluieren der unbekannten Struktur.
Es ist zum Beispiel möglich, wenn die Nukleotidsequenzen aller bekannten 50S Untereinheit rRNAs relativ zu einander und mit H. marismortui 23S und 5S rRNAs abgeglichen werden können, Modelle der Strukturen der anderen 50s ribosomalen rRNAs, insbesondere in den Regionen des Tunnels und der aktiven Stellen, mit den H. marismortui Strukturen zu konstruieren. In ähnlicher Weise können homologe Proteine auch mit ähnlichen Methodologien modelliert werden. Verfahren, die nützlich sind für die vergleichende RNA Sequenzanalyse, sind in der Technik wohl bekannt, und schließen ein visuelle Verfahren und Zahlenmusterverfahren, wie auch Verfahren, die Quadrat-chi Statistiken, phylogenetische Algorithmen, oder empirische Algorithmen anwenden. Beschreibungen einiger der vorstehenden Verfahren sind verfügbar zum Beispiel bei http://www.rna.icmb.utexas.edu/; Gutell (1996), „Comperative Sequence Analysis and the Structure of 16S and 23S rRNA," Ribosomal RNA. Structure, Evolution, Processing, and Function in Protein Biosynthesis, (Dahlberg A. und Zimmerman B., Hrg.) CRC Press. Boca Raton, S. 111-128; Gutell et al. (1993) Nucl. Acid Res. 21: 3055-3074; Schnare et al. (1996) J. Mol. Biol. 256: 701-719. Besonders nützliche visuelle Inspektionsverfahren schließen ein den Vergleich einer bestimmten Position in einem H. marismortui Sekundärstruktur Diagramm mit den Resten, die an analogen Positionen auf einem E. coli Sekundärstrukturdiagramm lokalisiert sind. Ein Softwareprogramm, das besonders nützlich bei Homologie Modellierung ist, schließt ein XALIGN (Wishart, D. et al. (1994) Cabios 10: 697-88). Siehe auch U.S. Patent Nr. 5,884,230.
Um die rRNA einer neuen Spezies zu modellieren, können Basen der H. marismortui rRNA ersetzt werden mit einem Computergraphikprogramm wie „O" (Jones et al. (1991) Acta Cryst. Sect. A, 47: 110-119), durch diejenigen Basen der homologen rRNA, in denen sie sich unterscheiden. In vielen, wenn nicht den meisten Fällen, wird die gleiche Orientierung der Base zutreffend sein. Insertionen und Deletionen können schwieriger und spekulativer sein, aber die rRNA, die die Peptidyltransferase Stelle und den Teil des Tunnels, der ihr am nächsten ist, bildet, sind sehr hoch konserviert mit essentiell keinen Insertionen und Deletionen. Automatisiertes netzbasiertes Homologie Modellieren kann durchgeführt werden mit, zum Beispiel den Computerprogrammen SWISS-MODEL, das erhältlich ist über Glaxa Wellcome Experimental Research in Genf, Schweiz, WHATIF, verfügbar auf den EMBL Servern.
Für andere Beschreibungen der Homologie Modellierung siehe, zum Beispiel, Gutell R.R. (1996), supra; Gutell R.R., et al. (1993) Nucleic Acids Res. 21: 3055-3074; Schnare et al. (1996) J. Mol. Biol. 256: 701-719; Blundell et al. (1987) Nature 326: 347-352; Fetrow und Bryant (1993) Bio/Technology 11: 479-484; Greer (1991) Methods in Enzymology 202: 239-252; und Johnson et al. (1994) Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 29: 1-68. Ein Beispiel für Homologie Modellierung kann zum Beispiel gefunden werden bei Szklarz G.D. (1997) Life Sci. 61: 2507-2520.
Wie zuvor diskutiert wurde, sind die große ribosomale Untereinheit von Prokaryoten und Eukaryoten strukturell konserviert. Die Aminosäuresequenzen der großen ribosomalen Untereinheit aus Prokaryoten und Eurkaryoten können wegen der evolutionären Konservierung der Identität von Aminosäureresten abgeglichen werden, die wichtig sind für die dreidimensionale Struktur, die Eigenart und die Form der Bindungsstellen für Substrate und die katalystische Stelle. Diese Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz der homologen großen ribosomalen Untereinheit ermöglicht die Konstruktion von Modellen, über Homologie Modelllierung, für die Moleküle, deren Kristallstrukturen noch nicht gelöst wurden.
Die neuen Ribosom oder große ribosomale Untereinheit Strukturen, die mit H. marismortui Kristallen und/oder Atom Koordinaten bestimmt wurden, können dann für Struktur basiertes Wirkstoff Design verwendet werden unter Verwendung eines oder mehrerer hier beschriebener Ansätze. Diese Information kann dann verwendet werden, um Moleküle zu konstruieren, die selektiv binden und die Proteinsynthese in den Ribosomen der Pathogene unterbrechen, während sie die Ribosomen ein Wirts vergleichsweise unbeeinflusst lassen.
G. Rationales Wirkstoff Design
1. Einführung
Es wird erwogen, dass die Atom Koordinaten, die eine interessierende große ribosomale Untereinheit definieren, seien sie abgeleitet von einer oder mehreren Röntgenstrahlen Kristallographie(n), molekularen Modellierung, Homologie Modellierung oder molekulare Ersetzung, bei rationalen Wirkstoff Design (RDD) verwendet werden können, um ein neues interessierendes Molekül zu konstruieren, zum Beispiel neue Modulatoren (zum Beispiel induzierende Agenzien, Nachahmer oder Inhibitoren) der Ribosom Funktion. Weiterhin wird erwogen, dass durch Verwendung der hier offenbarten Prinzipien der Fachmann neue Proteinsyntheseinhibitoren konstruieren, herstellen, testen, verfeinern und verwenden kann, die spezifisch konstruiert wurden, ribosomale Funktion in einem interessierenden Organismus oder einer interessierenden Spezies zu reduzieren, unterbrechen, oder auf andere Weise zu hemmen. Zum Beispiel kann der Fachmann durch Verwendung der hier diskutierten Prinzipien neue Moleküle konstruieren, die die ribosomale Funktion in einem Pathogen, zum Beispiel einem bestimmten prokaryotischen Organismus, spezifisch anzielen und hemmen, während die ribosomale Funktion in einem Wirt, zum Beispiel einem eukaryotischen Organismus, spezifisch einem Säuger, und am spezifischesten einem Menschen erhalten wird. Folglich ermöglichen die Atom Koordinaten, die hier bereitgestellt und diskutiert werden, dem Fachmann, neue Antibiotika zu konstruieren, die bestimmte pathogene Organismen töten können, während sie bei dem beabsichtigten Empfänger, zum Beispiel einem Menschen, wenig oder gar nicht toxisch sind.
Es wird erwogen, dass RDD mit Atom Koordinaten der großen ribosomalen Untereinheit am leichtesten bewerkstelligt werden kann über Computer gestütztes Wirkstoff Design (CADD) mit konventioneller Computer Hard- und Software, die in der Technik bekannt ist und verwendet wird. Die Kandidaten Moleküle können de novo konstruiert werden oder als eine modifizierte Version eines bereits existierenden Moleküls konstruiert werden, zum Beispiel ein bereits existierendes Antibiotikum, mit konventionellen Methodologien. Nach der Konstruktion können Kandidaten Moleküle synthetisiert werden unter Verwendung von Standard Methodologien, die in der Technik bekannt sind und verwendet werden. Nach der Synthese können die Kandidaten Moleküle auf Bioaktivität hin durchustert werden, zum Beispiel durch ihre Fähigkeit Ribosom Funktion, ihre Fähigkeit mit einem Ribosom oder einer ribosomalen Untereinheit zu wechselwirken oder an diese zu binden, zu reduzieren oder zu hemmen. Zum Teil auf diesen Ergebnissen basierend können die Kandidaten Moleküle iterativ verfeinert werden mit einem oder mehreren der vorstehenden Schritte, um ein gewünschteres Molekül mit einer gewünschten biologischen Aktivität herzustellen. Die resultierenden Moleküle können nützlich sein bei der Behandlung, Hemmung oder Vermeidung der biologischen Aktivitäten der Zielorganismen, wodurch die Organismen getötet werden oder deren Wachstum behindert wird. Alternativ können die resultierenden Moleküle nützlich sein bei der Behandlung, Hemmung oder Vermeidung von mikrobiellen Infektionen in jedem Organismus, besonders Tieren, insbesondere Menschen.
Zusammenfassend gesagt, können die Hilfsmittel und Methodologien, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, verwendet werden, um interessierende Moleküle zu identifizieren und/oder designen, die auf gewünschte Arten an Ribosomen und ribosomalen Untereinheiten binden und/oder diesen wechselwirken. Grundsätzlich verwenden diese Prozeduren einen iterativen Prozess, bei dem die Moleküle synthetisiert, getested und charakterisiert werden. Neue Moleküle können konstruiert werden basierend auf der Information, die bei Testen und Charakterisieren der ersten Moleküle gewonnen wurden, und dann können solch neu identifizierten Moleküle selbst getestet und charakterisiert werden. Diese Folge von Prozessen kann so oft wie notwendig wiederholt werden, um Moleküle mit gewünschten Bindungseigenschaften und/oder biologischen Aktivitäten zu erhalten. Verfahren zur Identifikation von Kandidaten Molekülen werden detailierter weiter unten diskutiert.
2. Identifrkation von Kandidatenmolekülen
Es wird erwogen, dass die Konstruktion der interessierenden Kandidatenmoleküle durch konventionelle Kugel und Stab artige Modellierungsprozeduren erleichtert werden kann. In Anbetracht der Größe und Komplexität der ribosomalen Untereinheit wird es jedoch erwogen, dass die Fähigkeit Kandidaten Moleküle zu konstruieren signifikant verbessert werden kann mit der Verwendung von Computer basierten Modellierungs- und Design Protokollen.
a. Molekulare Modellierung
Es wird erwogen, dass die Konstruktion der Kandidaten Moleküle, wie hier im Detail hier unten diskutiert wird, vereinfacht werden kann mit der Verwendung von konventionellen Computern oder Arbeitsstationen, kommerziell verfügbar von, zum Beispiel Silicon Graphics Inc. Und Sun Microsystems, auf denen, zum Beispiel UNIX basierte, Windows NT oder IBM OS/2 Betriebssysteme laufen, und die in der Lage sind, konventionelle Computerprogramme zum molekularen Modellieren und rationalen Wirkstoff design auszuführen.
Es versteht sich, dass jedes Computersystem, das die Gesamteingeschaften, die in 27 widergegeben sind, nützlich ist für die Ausführung dieser Erfindung. Genauer gesagt ist 27 eine schematische Darstellung einer typischen Computer Arbeitsstation, die eine zentrale Recheneinheit (101), einen Speicher mit zufälligem Zugang (RAM) (102), ein Nur Lese Speicher (ROM) (103), einen Monitor oder Terminal (104), und optimalerweise eine externes Speichergerät, zum Beispiel, eine Diskette, CD ROM oder magnetisches Band (105) besitzt, die miteiander in elektrischer Kommunikation (100) stehen über, zum Beispiel, einen internen Bus oder externes Netzwerk.
Die erfindungsgemäßen Computer basierten Systeme umfassen vorzugsweise ein Datenaufbewahrungsmittel, in dem ein Ribosom oder ribosomale Untereinheit oder Fragmentsequenz und/oder Atom Koordinaten/Röntgenstrahlen Beugungsdaten der vorliegenden Erfindung gespeichert sind, und die notwendigen Hardware Mittel und Software Mittel zur Unterstützung und Implementierung von Analyse Mitteln. Wie hier verwendet, bezieht sich „ein Computer System" oder ein „Computer basiertes System" auf die Hardware Mittel, Software Mittel, und Datenspeicherungsmittel, die verwendet werden, um die erfindungsgemäße Sequenz, Röntgenstrahlen Beugungsdaten und/oder Atom Koordinaten zu analysieren. Wie hier verwendet, wird der Begriff „Datenspeicherungsmittel" verstanden, sich auf jeden Erinnerungsspeicher zu beziehen, der Sequenzdaten, Röntgenstrahlen Beugungsdaten und/oder Atom Koordinaten speichern kann, oder auf Speicherzugangsmittel, die Zugang haben können zu Erzeugnissen, die auf sich die erfindungsgemäßen Atom Koordinaten gespeichert haben.
In einer Ausführungsform werden ein erfindungsgemäßes Ribosom oder ribosomale Untereinheit, wenigstens eine Subdomäne davon, Aminosäuresequenz oder Nukleinsäuresequenz und/oder Atom Koordinaten/Röntgenstrahlen Beugungsdaten auf einem Computer lesbaren Medium gespeichert. Wie hier verwendet, wird der Begriff „Computer lesbares Medium" verstanden jedes Medium zu bedeuten, das direkt durch einen Computer gelesen werden kann und zugänglich ist. Solche Medien schließen ein, sind aber nicht eingeschränkt auf: magetische Speichermedien, wie Floppy Disketten, Festplatten Speichermedien, und magnetisches Band; optische Speichermedien, wie optische Disks oder CD-ROM; elektrische Speichermedien wie RAM und ROM; und Hybride dieser Kategorien wie magnetische/optische Medien. Ein Fachmann kann leicht abschätzen, wie jedes der gegenwärtig bekannten Computer lesbaren Medien verwendet werden kann, um ein Erzeugnis zu erstellen, das ein Computer lesbares Medium umfasst, auf dem eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz oder Nukleinsäuresequenz und/oder Atom Koordinaten/Röntgenstrahlen Beugungsdaten aufgezeichnet sind.
Wie hier verwendet, wird der Begriff „aufgezeichet" verstanden als jeder Prozess zum Speichern von Information auf einem Computer lesbaren Medium. Ein Fachman kann leicht jedes der gegenwärtig bekannten Verfahren zum Aufzeichen von Information auf einem Computer lesbaren Medium anpassen, um Erzeugnisse herzustellen, die eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz oder Nukleinsäuresequenz und/oder Atom Koordinaten und/oder Röntgenstrahlen Beugungsdaten umfassen.
Eine Vielzahl von Datenaufbewahrungsstrukturen sind für den Fachman verfügbar, um ein Computer lesbares Medium zu erzeugen, das auf sich erfindungsgemäße Aminosäure- und/oder Nukleinsäuresequenz, Atom Koordinaten und/oder Röntgenstrahlen Beugungsdaten aufgezeichnet hat. Die Wahl der Datenaufbewahrungsstruktur wird generell auf den Mitteln basieren, die gewählt wurde, um sich zu der gepeicherten Information Zugang zu verschaffen. Zustätzlich kann eine Vielzahl von Datenprozessorprogrammen und Formaten verwendet werden, um erfindungsgemäße Sequenzinformation, Röntgenstrahlen Beugungsdaten und/oder Atom Koordinaten zu speichern. Die vorstehende Information, Daten und Kooridnaten können in einer Textverarbeitungs-Textdatei dargestellt werden, die mit kommerziell verfügbarer Software wie WordPerfect und MICROSOFT Word formatiert ist, oder dargestellt werden in der Form einer ASCII Datei, die in einer Datenbank Anwendung, wie DB2, Sybase, Oracle oder ähliche gespeichert wird. Ein Fachmann kann leicht jede Anzahl von Datenverarbeitungsstrukturformaten (z.B. Textdatei oder Datenbank) anpassen, um ein Computer lesbares Medium zu erhalten, auf dem die Information der vorliegenden Erfindnung aufgezeichnet ist.
Durch Bereitstellen eines Computer lesbaren Mediums, auf dem eine Ribosom- oder ribosomale Untereinheitsequenz und/oder Atom Koordinaten gespeichert sind, kann ein Fachmann routinemäßig auf die Sequenz und/oder Atom Koordinaten zugreifen, um ein Ribosom oder ribosomale Untereinheit, eine Subdomäne davon, Nachahmer oder einen Liganden davon zu modellieren. Computer Algorithmen sind öffentlich und kommerziell erhältlich, die es dem Fachmann ermöglichen, auf diese Daten, die auf dem Computer lesbaren Medium bereitgstellt sind, zuzugreifen, und sie für die molekulare Modellierung und/oder RDD zu analysieren. Siehe, z.B. Biotechnology Software Directory, MaryAnn Liebert Publ., New York, NY (1995).
Obwohl Computer nicht benötigt werden, kann molekulares Modellieren am leichtesten bewerkstelligt werden durch die Verwendung von Computern, um realistische Modelle eines Ribosoms, einer ribosomalen Untereinheit, oder eines Teils davon aufzubauen. Molekulares Modellieren erlaubt auch das Modellieren neuer kleiner Moleküle, zum Beispiel, Liganden, Agenzien und anderen Moleküle, die an ein Ribosom, eine ribosomale Untereinheit, oder Teil darin binden können. Die Verfahren, die beim molekularen Modellieren verwendet werden, reichen von molekularen Graphiken (d.h. dreidimensionalen Darstellungen) bis zu berechneter Chemie (d.h. Berechnungen der physikalischen und chemischen Eigenschaften), um Voraussagen zu machen über die Bindung der kleinen Moleküle oder ihrer Aktivitäten, neue Moleküle zu konstruieren; und neue Moleküle vorauszusagen, einschließlich Liganden wie Wirkstoffen für die chemischen Synthese.
Für grundsätzliche Information über das molekulare Modellieren siehe, zum Beispiel M. Schlecht, Molecular Modelilng on the PC (1998) John Wiley & Sons; Gans et al., Fundamentale Principles of Molecular Modeling (1996) Plenum Pub. Corp.; N.C. Cohen, Hrg., Guidebook on Molekular Modeling in Drug Design (1996) Academich Press; und W.B. Smith, Introduction to Theoretical Organic Chemistry and Molecular Modeling (1996). U.S. Patente, die detailierte Information über das molekulare Modellieren bereit stellen, schließen zum Beispiel ein: U.S. Patent Nr. 6,093,573; 6,080,576; 6,075,014; 6,075,123; 6,071,700; 5,994,503; 5,884,230; 5,612,894; 5,583,973; 5,030,103; 4,906,122; und 4,812,12.
Dreidimensionales Modellieren kann einschließen, ist aber nicht beschränkt auf, das Erstellen von dreidimensionalen Darstellungen von Strukturen, das Zeichnen von Bildern der Strukturen, das Aufbauen physikalischer Modelle von Strukturen und das Bestimmen der Strukturen der verwandten Ribosomen, ribosomalen Untereinheiten und Ribosom/Ligand und ribosmalen Untereinheit/Ligand Komplexen mit den bekannten Koordinaten. Die geeigneten Koordinaten werden in ein oder mehrere Computer Programme zum molekularen Modellieren eingegeben, wie in der Technik bekannt ist. Zur Veranschaulichung schließt eine Liste von Computer Programmen, die nützlich für das Betrachten und Manipulieren dreidimensionaler Strukturen sind, ein: Midas (University of California, San Francisco); MidasPlus (University of California, San Francisco); MOIL (University of Illinois); Yummie (Yale University); Sybyl (Tripos, Inc.); Insight/Discover (Biosym Technologies); MacxoModel (Columbia University); Quanta (Molecular Simulations, Inc.); Ccrius (Molecular Simulations, Inc.); Alchemy (Tripos, Inc.); Lab Vision (Tripos, Inc.); Rasmol (Glaxo Research and Development); Ribbon (University of Alabama); NAOMI (Oxford University); Explorer Eyechem (Silicon Graphics, Inc.); Univision (Cray Research); Molscript (Uppsala University); Chem-3D (Cambridge Scientific); Chain (Baylor College of Medicine); O (Uppsala University): GRASP (Columbia Universit y); X-Plor (Molecular Simulations, Inc.; Yale University); Spartan (Wavcfunetion, Inc.); Catalyst (Molecular Simulations, Inc.); Molcadd (Tripos, Inc.); VMD (University of Illinois/Beckman Institute); Sculpt (Interactive Simulations, Inc.); Procheck (Brookhaven National Library); DGEOM (QCPE); REJVTEW (Brunell University); Modeller (Birbeck College, University of London); Xmol (Minnesota Supercomputing Center); Protein Expert (Cambridge Scientific); HyperChem (Hypercube); MD Display (University of Washington); PKB (National Center for Biotechnology Information, N1H); ChemX (Chemical Design, Ltd.); Cameleon (Oxford Molecular, Inc.); und Iditis (Oxford Molecular, Inc.).
Ein Ansatz zu RDD ist es, nach bekannten molekularen Strukturen zu suchen, die an eine interessierende Stelle binden könnten. Mit molekularer Modellierung können RDD Programme eine bestimmte Menge von unterschiedlichen molekularen Strukturen betrachten, die an die interessierende Stelle binden können, und dadurch dass sie auf dem Computerschirm bewegt werden können oder über Berechnung kann entschieden werden, welche Strukturen tatsächlich gut in die Stelle passen (William Bains (1998) Biotechnology from A to Z, zweite Ausgabe, Oxford University Press, S. 259).
Ein alternativer aber verwandter Ansatz beginnt mit der bekannten Struktur eines Komplexes mit einem kleinen Molekül als Ligand und modelliert Modifikationen dieses kleinen Moleküls mit der Absicht zusätzliche günstige Wechselwirkungen mit einem Ribosom oder ribosomalen Untereinheit herzustellen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Verwendung von molekularen und Computer Modellierungstechniken, um neue Moleküle zu konstruieren und selektieren, wie Antibiotika oder andere therapeutische Agenzien, die mit Ribosomen und ribosomalen Untereinheiten Wechselwirken. Solche Antibiotika und andere Typen von therapeutischen Agenzien schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Fungizide, Antiviralia, Bakterizide, Insektizide, Herbizide, Mitizide, Rodentizide, etc.
Um das molekulare Modellieren und/oder RDD zu ermöglichen, kann der Fachmann eine oder alle der Atom Koordinaten verwenden die bei der RCSB Protein Data Bank unter den Accession Numbers PDB ID: 1FFK, 1JJ2, 1FFZ, oder 1FG0 hinterlegt wurden, und/oder deren Atom Koordinaten auf Disk Nr. 1, 2, oder 3 von 3 enthalten sind. Weiterhin kann der Fachmann mit den vorstehenden Atom Koordinaten zusätzliche Atom Koordinaten erzeugen, zum Beispiel über molekulares Modellieren, mit zum Beispiel Homologie Modellieren und/oder molekularen Ersetzungstechniken, die zusammen wenigstens einen Teil eines Modells eines Ribosoms aus einer anderen interessierenden Spezies definieren. Durch Verwendung der vorstehenden Atom Koordinaten kann der Fachmann Inhibitoren der Proteinsynthese konstruieren, die so „geschneidert" werden können, dass sie gegen Ribosomen aus einer oder mehreren Spezies wirksam sein können, aber nur ein kleinen oder keinen Effekt auf Ribosomen anderer Spezies haben. Solche Inhibitoren können kompetetive Inhibitoren sein. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „kompetetive Inhibitor" auf einen Inhibitor, der an die aktive Form eines Ribosoms oder ribosomalen Untereinheit an den gleichen Stellen wie seine Substrat(e) oder tRNA(s) bindet, und somit direkt mit ihnen kompetiert. Der Begriff „aktive Form" eines Ribosoms oder ribosomalen Untereinheit bezieht sich auf ein Ribosom oder ribosomale Untereinheit in einem Zustand, der es in die Lage versetzt, Proteinsythese zu betreiben. Kompetitive Inhibitoren können vollständig revertiert werden, indem die Substrat oder tRNA Konzentration erhöht werden.
Die Erfindung ermöglicht die Konstruktion von Molekülen, die als unkompetetive Inhibitoren der Proteinsynthese funktionieren. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff „unkompetetiver Inhibitor" auf eine Molekül, das die funktionale Aktivität eines Ribosoms oder ribosomalen Untereinheit hemmt durch Bindung einer unterschiedliche Stelle auf dem Ribosom oder der ribosomalen Untereinheit als sein Substrate, oder tRNA. Solche Inhibitoren können oft an Ribosomen oder ribosomale Untereinheiten mit dem Substrat oder der tRNA und nicht selbst an das Ribosom und die ribosomale Unterheit binden. Unkompetetive Inhibition kann nicht vollständig revertiert werden durch Erhöhen der Substrat Konzentration. Diese Inhibitoren können an alle oder einen Teil der aktiven Stellen oder anderen Regionen der großen ribosomalen Untereinheit, das bereits an sein Substrat gebunden ist, binden, und können potenter und weniger unspezifisch sein, als bekannte kompetitive Inhibitoren, die um aktive Stellen der großen ribosomalen Untereinheit oder um Bindung an die große ribosomale Untereinheit kompetetieren.
In ähnlicher Weise können nicht kompetetive Inhibitoren, die binden und die Proteinsynthese hemmen, egal ob sie an eine andere chemische Entität gebunden sind, konstruiert werden unter Verwendung der Atom Koordinaten der großen ribosomalen Untereinheiten oder Komplexen, die die große ribosomale Untereinheit dieser Erfindung umfassen. Wie hier verwendet bezieht sich der Begriff „nicht kompetetiver Inhibitor" auf einen Inhibitor, die entweder an die freie oder Substrat gebundene oder tRNA gebundene Form des Ribosoms oder ribosomalen Untereinheit binden kann.
Fachleute können Inhibitoren als kompetetiv, unkompetetiv oder nicht kompetetiv durch Computer angepasste enzymkinetische Daten identifizierten unter Verwendung einer Standartgleichung gemäß Segel, I.H., (1975) Enzyme Kinetics: Behaviour and Analysis of Rapid Equilibrium and Steady-State Enzyme Systems, (Wiley Classics Library). Es versteht sich auch, dass unkompetetive oder nicht kompetetive Inhibitoren gemäß der vorliegenden Erfindung die gleichen oder verschiedene Bindungsstellen binden können.
Alternativ sind die Atom Koordiaten, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt werden, nützlich bei der Konstruktion verbesserter Analoge von bekannten Proteinsyntheseinhibitoren oder bei der Konstruktion von neuen Klassen von Inhibitoren basierend auf den atomaren Strukturen und Koordinaten der Kristalle des 50S ribosomalen Untereinheit/CCda-p-Puro Komplex und des 50S ribosomalen Untereinheit/aa-tRNA Komplex. Dies stellt eine neuen Weg bereit zur Konstruktion von Inhibitoren der Proteinsynthese mit Qualitäten sowohl hinsichtlich hoher Spezifität, Stabilität und anderen Medikamenten-artiger Qualitäten (Lipinski et al. (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 23:3).
Die Atom Koordinaten der vorliegenden Erfindung ermöglichen auch das Sondieren der dreidimensionalen Struktur eines Ribosoms oder ribosomalen Untereinheit oder eines Teils davon mit Molekülen, die zusammengesetzt sind aus einer Vielzahl von verschiedenen chemischen Merkmalen, um die die optimalen Stellen für Wechselwirkung zwischen Kandidateninhibitoren und/oder Aktivatoren und dem Ribosom oder der ribosomalen Untereinheit zu bestimmen. Zum Beispiel erlauben Atom Koordinaten mit hoher Auflösung basierend auf Röntgenstrahlen Beugungsdaten, die über mit Lösungsmitteln gesättigten Kristallen gesammelt wurden, die Bestimmung, wo jeder einzelne Typ Lösungsmittelmolekül anheftet. Kleine Moleküle, die an diese Stellen binden, können dann konstruiert und synthetisiert und getest werden in Hinblick auf ihre inhibitorische Aktivität (Travis, J. (1993) Science 262: 1374). Ferner kann jedes bekannte Antibiotikum, jeder bekannte Inhibitor oder andere kleine Molekül, das an die H. marismortui große Untereinheit bindet in H. marismortui großen Untereinheit Kristallen durch Eintauchen eingeführt werden und ihre exakte Bindungsweise durch Differenz Elektronendichtekarten bestimmt werden. Diese Moleküle können Leit Verbindungen darstellen, aus denen bessere Medikamenten-artige Verbindungen synthetisiert werden können.
b. Identifikation von Zielstellen
Die Atom Koordinaten der Erfindung ermöglichen dem Fachmann, Zielstellen in einem Ribosom oder großen ribosomalen Untereinheit zu identifizieren, die als ein Startpunkt beim rationalen Wirkstoffdesign dienen können. Als ein Mindestkriterium ermöglichen die Atom Koordinaten der Erfindung dem Fachmann, spezifische Regionen innerhalb eines Ribosoms oder ribosomalen Untereinheit zu identifizieren, die an der Proteinsynthese und/oder Proteinsezernierung aus dem Ribosom beteiligt sind. Weiterhin ermöglichen die erfindungsgemäßen Atom Koordinaten einem Fachmann weiterhin Teile dieser Regionen zu identifizieren, die zwischen verschienden Organismen konserviert oder nicht konserviert sind. Zum Beispiel kann durch das Identifizieren der Teile dieser Regionen, die bei bestimmten Pathogenen, zum Beispiel bestimmten Prokaryoten, konserviert sind, aber nicht konserviert sind in einem Wirtsorganismus, zum Beispiel einem Eukaryoten, bevorzugter einem Säuger, der Fachmann Moleküle konstruieren, die selektiv die Syntheseaktivität der Ribosmen des Pathogens aber nicht des Wirts inhibieren oder unterbrechen. Weiterhin ist es durch Analysieren der Regionen, die zwischen bestimmten Pathogenen entweder konserviert oder nicht konserviert sind, möglich Proteinsyntheseinhibitoren mit breitem oder engen Spektrum zu konstruieren, z.B. Antibiotika, wenn ein bestimmter Bedarf auftritt.
28 ist eine schematische Darstellung einer großen ribosomalen Untereinheit, die ein Vielzahl von exemplarischen Zielstellen identifiziert, die an der Proteinsynthese innerhalb des Ribosoms und/oder des Exports oder der Translokation des neu synthetisierten Proteins aus dem Ribosom hinaus beteiligt zu sein scheinen. Die Zielstellen schließen ein, zum Beispiel die P-Stelle (200), die A-Stelle (201), das Peptidyltransferasezentrum (202), die Peptidyltransferasestelle (203), die einschließt wenigstens einen Teil der P-Stelle und der A-Stelle, eine Faktorbindungsdomäne (204) einschließlich, zum Beispiel, der EF-Tu Bindungsdomäne und der EF-G Bindungsdomäne, der Polypeptidaustrittstunnel (205) einschließlich der Höhlungen, die durch die Wand des Austrittstunnels definiert werden, und die Signalerkennungspartikeldomäne (206).
Beispielhaft hat die Inspektion der Atom Koordinaten der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit eine Vielzahl von Zielregionen identifiziert, die als eine Basis für das rationale Wirkstoff Design von neuen oder modifizierten Proteinsyntheseinhibitoren dienen können. Die Zielregionen schließen ein die Peptidyltransferasestelle, A-Stelle, P-Stelle, den Polypeptidaustrittstunnel, bestimmte Höhlungen, die in der Wand der Polypeptidaustrittstunnels angebracht sind (zum Beispiel Höhlung 1 und Höhlung 2), und bestimmte Antibiotika Bindungstaschen. Die Reste, die zusammen wenigstens einen Teil jeder dieser vorstehenden Regionen definieren, sind in den folgenden Tabellen identifiziert. Es wird jedoch erwogen, dass die gleichen oder ähnliche Zielstellen in einem interessierenden Ribosom oder einer ribosomalen Untereinheit mit den hier beschriebenen Prinzipien identifiziert werden können. Weiterhin können diese Prinzipien angewendet werden mit jedem der primären Sätze von Atom Koordinaten, die hier bereitgestellt werden, oder allen zusätzlichen Atom Koordinaten Sätzen, zum Beispiel sekundären Atom Koordinaten Sätze, die duch molekulares Modellieren jedes interessierenden Ribosoms oder ribosomalen Untereinheit erzeugt werden können.
Tabelle 5 identifiziert die Reste in der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die zusammen wenigstens einen Teil der ribosomalen Peptidyltransferasestelle definieren. Zusätzlich identifiziert Tabelle 5 welche dieser Reste, die wenigstens einen Teil der ribosomalen Peptidyltransferasestelle definieren, nicht zwischen H. marismortui und E. coli konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen H. marismortui und Ratte konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen E. coli und Ratte konserviert sind, und diejenigen die nicht zwischen Eubakterien und Eukaryoten konserviert sind. Die nicht konservierten Reste wurden durch Vergleich von Sequenzen der H. marismortui 23S rRNA, die die oben erwähnten Stellen bilden, mit den entsprechenden Sequenzen der abgeglichenen rRNA aus den anderen Organismen identifiziert. Tabelle 5 Reste, die die ribosomale Peptidyltransferase Stelle bestimmen
Reste wurden bestimmt durch eine 5.8 Angstrom Abstandsmessung zwischen den Atomen des CCdA-p-Puromycin A-Stellen Liganden und des CCdA-Puromycin Übergangszustands Inhibitors (PDB Accession Codes: 1fg0 bzw. 1ffz) und des 50S Ribosoms mit dem Programm SPOCK. Konservierte Reste wurden bestimmt durch Vergleich zwischen den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von H. marismortui, E. coli und Rattus norwegicus
Tabelle 6 identifiziert die Reste in der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die zusammen wenigstens einen Teil der ribosomalen A-Stelle definieren. Zusätzlich identifiziert Tabelle G welche dieser Reste, die wenigstens einen Teil der A-Stelle definieren, nicht zwischen H. marismortui und E. coli konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen H. marismortui und Ratte konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen E. coli und Ratte konserviert sind, und diejenigen die nicht zwischen Eubakterien und Eukaryoten konserviert sind. Die nicht konservierten Reste wurden identifiziert, wie zuvor für Tabelle 5 beschrieben. Tabelle 6 Reste, die die ribosomale A-Stelle definieren
Reste wurden bestimmt durch eine 5.8 Angstrom Abstandsmessung zwischen den Atomen des CC-Puromycin A Stellen Liganden und des 50S Ribosoms (PDB Accession Code 1fg0) mit dem Programm SPOCK. Konservierte Reste wurden bestimmt durch Vergleich zwischen den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von H. marismortui, E. coli und Rattus norwegicus.
Tabelle 7 identifiziert die Reste in der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die zusammen wenigstens einen Teil der ribosomalen P-Stelle definieren. Wie in Tabelle 7 gezeigt wird, sind alle Reste in diesem Teil der P-Stelle konserviert zwischen H. marismortui und E. coli, zwischen H. marismortui und Ratte, zwischen E. coli und Ratte, und zwischen Eubakterien und Eukaryoten, was bestimmt wurde mit dem Vergleichsverfahren, das zuvor für Tabelle 5 beschrieben wurde. Tabelle 7 Reste, die die ribosomale P-Stelle definieren
Reste wurden bestimmt durch eine 5.8 Angstrom Abstandsmessung zwischen den Atomen der CCA-PO₂ Einheit des CCdA-Puromycin Übergangszustands Inhibitors und des 50S Ribosoms (PDB Accession Code 1ffz) mit dem Programm SPOCK. Konservierte Reste wurden bestimmt durch Vergleich zwischen den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von H. marismortui, E. coli und Rattus norwegicus.
Tabelle 8 identifiziert die Reste in der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die zusammen wenigstens einen Teil des ribosomalen Polypeptidaustrittstunnels definieren. Zusätzlich identifiziert Tabelle 8 welche dieser Reste, die wenigstens einen Teil des Polypeptidaustrittstunnels definieren, die nicht zwischen H. marismortui und E. coli konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen H. marismortui und Ratte konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen E. coli und Ratte konserviert sind, und diejenigen die nicht zwischen Eubakterien und Eukaryoten konserviert sind. Die nicht konservierten Reste wurden identifiziert, wie zuvor für Tabelle 5 beschrieben. Tabelle 8 Reste, die den ribosomale Peptidaustrittstunnel definieren

** Da die Homologe für das H. marismortui ribosomale Protein L39E derzeit nicht bekannt sind, sind Sequenzvergleiche zwischen E. coli und Rattus norwegicus nicht möglich.

Reste wurden bestimmt durch eine 10 Angstrom Abstandsmessung zwischen den Atomen eines Modells eines neu sythetisierten Peptids, das in dem Zentrum der Austrittstunnels und des 50S Ribosoms positioniert wurde, unter Verwendung des Programms SPOCK. Konservierte Reste wurden bestimmt durch Vergleich zwischen den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von H. marismortui, E. coli und Rattus norwegicus.
26 zeigt eine Region der großen ribosomalen Untereinheit, in der ein Antibiotikum bindet. 26(A) zeigt einen vergrößerten Teil der ribosomalen Untereinheit mit dem Antibiotikum Tylosin gebunden an das Obere des Polypetidaustrittstunnels direkt neben der Peptidyltransferase Stelle. 26(B) und 26(C) sind Ansichten, die jede Hälfte einer großen ribosomalen Untereinheit zeigen, die entlang des Polypeptidsaustrittstunnels aufgeschnitten ist, und bereitgestellt werden, um den Leser zu orientieren, um die Tylosin Bindungsstelle relativ zu der großen ribosomalen Einheit als Ganzes zu zeigen. 26(A) zeigt auch zwei Hohlungen, die durch die Wand des Polypeptidaustrittstunnels definiert werden, und als „Höhlung 1" und „Höhlung 2" bezeichnet werden. Zusätzlich zeigt 26(A) auch eine Disaccharid Bindungstasche. Die Richtung, in die die neu synthetisierten Polypeptidketten das Ribosom über den Polypeptidaustrittstunnel verlassen, ist durch einen Pfeil gekennzeichnet.
Tabelle 9 identifizert die Reste in der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die zusammen eine erste Höhlung innerhalb der Wand des Polypeptidaustrittstunnels definieren (Höhlung 1). Zusätzlich identifiziert Tabelle 9 welche dieser Reste, die die Höhlung 1 definieren, nicht zwischen H. marismortui und E. coli konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen H. marismortui und Ratte konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen E. coli und Ratte konserviert sind, und diejenigen die nicht zwischen Eubakterien und Eukaryoten konserviert sind. Die nicht konservierten Reste wurden identifiziert, wie zuvor für Tabelle 5 beschrieben. Tabelle 9 Reste, die die Höhlung 1 in dem ribosomalen Peptidaustrittstunnel definieren
Höhlungsreste wurden bestimmt unter Verwendung des Programms SPOCK. Konservierte Reste wurden bestimmt durch Vergleich zwischen den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von H. matismortui, E. coli und Rattus norwegicus.
Tabelle 10 identifizert die Reste in der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die zusammen eine zweite Höhlung innerhalb der Wand des Polypeptidaustrittstunnels definieren (Höhlung 2). Zusätzlich identifiziert Tabelle 10 welche dieser Reste, die Höhlung 2 definieren, nicht zwischen H. marismortui und E. coli konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen H. marismortui und Ratte konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen E. coli und Ratte konserviert sind, und diejenigen die nicht zwischen Eubakterien und Eukaryoten konserviert sind. Die nicht konservierten Reste wurden identifiziert, wie zuvor für Tabelle 5 beschrieben. Tabelle 10 Reste, die die Höhlung 2 in dem ribosomalen Pepitidaustrittstunnel definieren
Höhlungsreste wurden bestimmt unter Verwendung des Programms SPOCK. Konservierte Reste wurden bestimmt durch Vergleich zwischen den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von H. marismortui, E. coli und Rattus norwegicus.
Tabellen 9 und 10 definieren jedoch nur zwei oder mehrere Höhlungen, die innerhalb der Wand des Polypeptidaustrittstunnels angelegt sind. Jedoch kann der Fachmann durch Verwendung der hier beschriebenen Atom Koordinaten und molekularen Modellierungsmethodologien, die Reste identifizieren (,die beigetragen werden von Aminosäuren, Nukleotiden oder einer Kombination davon), die zusammen andere Höhlungen innerhalb der Wand des Polypeptidaustrittstunnels definieren.
Zusätzlich kann durch Verwendung der hier beschriebenen Atom Koordinaten der Fachmann die Antibiotika Bindungsstelle jedes interessierenden Antibiotikums identifizieren. Diese Information stellt auch Kontaktstellen zwischen einem Antibiotikum und den Resten in einem Ribosom und einer ribosomalen Untereinheit zur Verfügung, die verwendet werden können, um bei der Konstruktion von neuen oder modifizierten Proteinsyntheseinhibitoren von Vorteil sein zu können. Die Bindungs- und Kontaktstellen für ein Vielzahl von Antibiotika wer in mehr Detail weiter unten diskutiert.
Tabelle 11 identifizert die Reste in der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die zusammen mindestenes einen Teil eine Anisomycin Bindungstasche definieren. Zusätzlich identifiziert Tabelle 11 welche dieser Reste, die mindestenes einen Teil einer Anisomycin Bindungstasche definieren, nicht zwischen H. marismortui und E. coli konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen H. marismortui und Ratte konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen E. coli und Ratte konserviert sind, und diejenigen die nicht zwischen Eubakterien und Eukaryoten konserviert sind. Die nicht konservierten Reste wurden identifiziert, wie zuvor für Tabelle 5 beschrieben. Tabelle 11 Reste, die die Anisomycin Bindungstasche definieren
Reste wurden durch eine 5.8 Angstrom Abstandsmessung zwischen den Atomen von Anisomycin und des 50S Ribosoms bestimmt unter Verwendung des Programms SPOCK. Konservierte Reste wurden bestimmt durch Vergleich zwischen den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von H. marismortui, E. coli und Rattus norwegicus.
Tabelle 12 identifiziert die Reste in der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die zusammen wenigstens einen Teil einer Blasticidin Bindungsstelle definieren. Wie in Tabelle 12 gezeigt wird, sind alle Reste in diesem Teil der P-Stelle konserviert zwischen H. marismortui und E. coli,, zwischen H. marismortui und Ratte, zwischen E. coli und Ratte, und zwischen Eubakterien und Eukaryoten, was bestimmt wurde mit dem Vergleichsverfahren, das zuvor für Tabelle 5 beschrieben wurde Tabelle 12 Reste, die die Blasticidin Bindungstasche definieren
Reste wurden durch eine 5.8 Angstrom Abstandsmessung zwischen den Atomen von Blasticidin und des 50S Ribosoms bestimmt unter Verwendung des Programms SPOCK. Konservierte Reste wurden bestimmt durch Vergleich zwischen den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von H. marismortui, E. coli und Rattus norwegicus.
Tabelle 13 identifizert die Reste in der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die zusammen mindestenes einen Teil einer Carbomycin Bindungstasche definieren. Zusätzlich identifiziert Tabelle 13 welche dieser Reste, die mindestenes einen Teil einer Carbomycin Bindungstasche definieren, nicht zwischen H. marismortui und E. coli konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen H. marismortui und Ratte konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen E. coli und Ratte konserviert sind, und diejenigen die nicht zwischen Eubakterien und Eukaryoten konserviert sind. Die nicht konservierten Reste wurden identifiziert, wie zuvor für Tabelle 5 beschrieben. Tabelle 13 Reste, die die Carbomycin Bindungstasche definieren
Reste wurden durch eine 5.8 Angstrom Abstandsmessung zwischen den Atomen von Carbomycin und des 50S Ribosoms bestimmt unter Verwendung des Programms SPOCK. Konservierte Reste wurden bestimmt durch Vergleich zwischen den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von H. marismortui, E. coli und Rattus norwegicus.
Tabelle 14 identifizert die Reste in der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die zusammen mindestenes einen Teil einer Tylosin Bindungstasche definieren. Zusätzlich identifiziert Tabelle 14 welche dieser Reste, die mindestenes einen Teil einer Tylosin Bindungstasche definieren, nicht zwischen H. marismortui und E. coli konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen H. marismortui und Ratte konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen E. coli und Ratte konserviert sind, und diejenigen die nicht zwischen Eubakterien und Eukaryoten konserviert sind. Die nicht konservierten Reste wurden identifiziert, wie zu zuvor für Tabelle 5 beschrieben. Tabelle 14 Reste, die die Tylosin Bindungstasche definieren
Reste wurden durch eine 5.8 Angstrom Abstandsmessung zwischen den Atomen von Tylosin und des 50S Ribosoms bestimmt unter Verwendung des Programms SPOCK. Konservierte Reste wurden bestimmt durch Vergleich zwischen den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von H. marismortui, E. coli und Rattus norwegicus.
Tabelle 15 identifiziert die Reste in der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die zusammen wenigstens einen Teil einer Sparsomycin Bindungstasche definieren. Wie in Tabelle 15 gezeigt wird, sind alle Reste in diesem Teil der Sparsomycin Bindungstasche konserviert zwischen H. marismortui und E. coli, zwischen H. marismortui und Ratte, zwischen E. coli und Ratte, und zwischen Eubakterien und Eukaryoten, was bestimmt wurde mit dem Vergleichsverfahren, das zuvor für Tabelle 5 beschrieben wurde Tabelle 15 Reste, die die Sparsomycin Bindungstasche definieren
Reste wurden durch eine 5.8 Angstrom Abstandsmessung zwischen den Atomen von Sparsomycin und des 50S Ribosoms bestimmt unter Verwendung des Programms SPOCK. Konservierte Reste wurden bestimmt durch Vergleich zwischen den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von H. marismortui, E. coli und Rattus norwegicus.
Tabelle 16 identifiziert die Reste in der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die zusammen wenigstens einen Teil einer Virginiamycin Bindungstasche definieren. Wie in Tabelle 16 gezeigt wird, sind alle Reste in diesem Teil der Virginiamycin Bindungstasche konserviert zwischen H. marismortui und E. coli, zwischen H. marismortui und Ratte, zwischen E. coli und Ratte, und zwischen Eubakterien und Eukaryoten, was bestimmt wurde mit dem Vergleichsverfahren, das zuvor für Tabelle 5 beschrieben wurde. Tabelle 16 Reste, die die Virginiamcin Bindungstasche definieren
Reste wurden durch eine 5.8 Angstrom Abstandsmessung zwischen den Atomen von Virginiamycin und des 50S Ribosoms bestimmt unter Verwendung des Programms SPOCK. Konservierte Reste wurden bestimmt durch Vergleich zwischen den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von H. marismortui, E. coli und Rattus norwegicus.
Tabelle 17 identifizert die Reste in der H. marismortui 50S ribosomalen Untereinheit, die zusammen mindestenes einen Teil einer Spiramycin Bindungstasche definieren. Zusätzlich identifiziert Tabelle 17 welche dieser Reste, die mindestenes einen Teil einer Spiramycin Bindungstasche definieren, nicht zwischen H. marismortui und E. coli konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen H. marismortui und Ratte konserviert sind, diejenigen die nicht zwischen E. coli und Ratte konserviert sind, und diejenigen die nicht zwischen Eubakterien und Eukaryoten konserviert sind. Die nicht konservierten Reste wurden identifiziert, wie zuvor für Tabelle 5 beschrieben. Tabelle 17 Reste, die die Spiramycin Bindungstasche definieren
Reste wurden durch eine 5.8 Angstrom Abstandsmessung zwischen den Atomen von Spiramycin und des 50S Ribosoms bestimmt unter Verwendung des Programms SPOCK. Konservierte Reste wurden bestimmt durch Vergleich zwischen den vorgeschlagenen Sekundärstrukturen von H. marismortui, E. coli und Rattus norwegicus.
Der Fachmann kann, wenn er in Besitz der vorstehenden oder anderen exemplarischen Zielstellen ist, den Prozess des rationalen Wirkstoff Designs verwenden, um Moleküle zu identifizieren, die potentiell an eine oder mehrere Zielstellen binden und/oder ribosomale Aktivität hemmen. Weitherhin kann der Fachmann, wenn er berücksichtigt, welche der Reste, die die Zielstelle definieren, zwischen Pathogenen, aber nicht zwischen Wirtspezies konservert sind, neue Spezies spezifische Proteinsynthesinhibitoren konstruieren. Es ist offensichtlich, dass der Fachmann aus Regionen Nutzen ziehen kann, die nicht zwischen E. coli und Ratte konserviert sind, um Zielregionen für rationales Wirkstoff Design bereitzustellen. 29 zeigt beispielhaft bestimmte Regionen des Polypeptid Ausgangstunnels, die zwischen E. coli und Ratte (in Rot gekennzeichnet) konserviert sind und Regionen des Polypeptid Ausgangstunnels, die nicht zwischen E. coli und Ratte konserviert sind (in Blau gekennzeichnet). 29(A) und 29(B) stellen vergrößerte Ansichten einer großen ribosomalen Untereinheit zur Verfügung, die entlang des Polypeptid Ausgangstunnels halbiert wurde. 29(C) wird zur Verfügung gestellt, um dem Leser eine Orientierungshilfe für 29(A) relativ zu der großen ribosomalen Untereinheit zu geben. 29(D) wird zur Verfügung gestellt, um dem Leser eine Orientierungshilfe für 29(B) relativ zu der großen ribosomalen Untereinheit zu geben. Zusätzlich kann der Fachmann, wenn er in Besitz von Mutanten ist, die eine Antibiotika Aktivität verhindern oder vermindern (d.h., sie mit einer Antibiotika Resistenz in Verbindung stehen), diese Information verwenden, um das relevante Antibiotika Bindungsprodukt zu modellieren, welches dann als eine Basis für ein rationelles Design von Arzneimitteln verwendet werden kann, um kleine Moleküle zu identifizieren, die eine Arzneimittelresistenz überwinden. Es ist beabsichtigt, dass eine Vielzahl von Computer Modellierungsverfahren, zum Beispiel Homologie Modellierungsprotokolle, verwendet werden können, um ein Modell einer Arzneimittelresistenz Zielstelle zur Verfügung zu stellen, durch Einführen von sequenzspezifischer Mutagenese der Nukleotide und/oder Aminosäuren und anschließende Verwendung der angemessenen Energieminimierungs- und Verfeinerungsprotokolle.
c. Identifizierung von Kandidatenmolekülen
Es ist beabsichtigt, dass Kandidatenmoleküle, die die Proteinbiosynthese inhibieren, vollständig de novo konstruiert werden können, oder auf einem vorher bestehenden Proteinbiosyntheseinhibitor basieren können. Jeder dieser Ansätze kann erzielt werden mittels computergestützten Durchmusterns von Datenbanken und Bibliotheken von kleinen Molekülen nach chemischen Einheiten, Agenzien, Liganden, oder Verbindungen, die als ganzes oder teilweise an Ribosomen und ribosomale Untereinheiten, bevorzugter an große ribosomale Untereinheiten und sogar noch bevorzugter an 50S ribosomale Untereinheiten binden können. Während dieser Durchmusterung kann die Qualität der Passung solcher Einheiten oder Verbindungen mit der Bindestelle oder – stellen entweder über die Komplementarität des Umrisses, oder über die geschätzte Interaktionsenergie (Meng et al. (1992) J. Coma. Chem. 13:505-524) beurteilt werden.
Die erfindungsgemäße Konstruktion von Molekülen, die an Ribosomen oder ribosomale Untereinheiten binden, oder deren funktionelle Aktivität inhibieren, schließt generell die Beachtung von zwei Faktoren ein.
Erstens muss das Molekül fähig sein, physikalisch und strukturell mit der großen ribosomalen Untereinheit zu assoziieren. Nicht-kovalente molekulare Wechselwirkungen, die für die Assoziierung von Ribosomen und ribosomalen Untereinheiten mit dem Molekül wichtig sind, schließen Wasserstoffbrückenbindung, van der Waals und hydrophobe Wechselwirkungen ein. Zweitens muss das Molekül in der Lage sein, eine Konformation einzunehmen, die es ihm erlaubt, mit den Ribosomen oder den ribosomalen Untereinheiten zu assoziieren, bevorzugter mit den großen ribosomalen Untereinheiten und sogar noch bevorzugter mit der 50S ribosomalen Untereinheit. Gleichwohl bestimmte Teile des Moleküls nicht direkt an dieser Assoziierung mit einem Ribosom oder ribosomalen Untereinheiten beteiligt sein können, können diese Teile dennoch die Gesamtkonformation des Moleküls beeinflussen. Dieses wiederum kann signifikante Auswirkungen auf die Bindungsaffinitäten, therapeutische Effizienz, arzneimittelähnliche Qualitäten und Wirksamkeit haben. Solche konformativen Erfordernisse beinhalten die gesamte dreidimensionale Struktur und Orientierung der chemischen Einheit oder des Moleküls in Relation zu der gesamten oder einem Teil der aktiven Stelle oder einer anderen Region des Ribosoms oder der ribosomalen Untereinheit, oder dem Abstand zwischen den funktionellen Gruppen eines Moleküls umfassend verschiedene chemische Einheiten, die direkt mit den Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten interagieren, vorzugsweise mit den großen ribosomalen Untereinheiten und sogar noch bevorzugter mit der 50S ribosomalen Untereinheit.
Der potentielle vorhergesagte inhibitorische oder bindende Effekt eines Moleküls auf die Ribosomen und ribosomalen Untereinheiten kann vor der eigentlichen Synthese und Testung mittels Verwendung von Computer Modellierungstechniken analysiert werden. Wenn die theoretische Struktur eines gegebenen Moleküls eine unzureichende Interaktion und Assoziation zwischen ihm und den Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten nahe legt, wird die Synthese und Testung des Moleküls unnötig. Wenn jedoch die Computermodellierung eine starke Interaktion anzeigt, kann das Molekül dann synthetisiert und auf seine Fähigkeit hin getestet werden, mit den Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten zu interagieren und Proteinsynthese zu inhibieren. Auf diese Weise kann die Synthese von unwirksamen Molekülen vermieden werden. In einigen Fällen werden inaktive Moleküle hergestellt, die aufgrund der Modellierung vorhergesagt wurden und dann getestet, um eine SAR (structure-activity relationship; Struktur-Aktivitäts Beziehung) für Moleküle zu entwickeln, die mit einer bestimmten Region des Ribosoms oder der ribosomalen Untereinheit, bevorzugter der großen ribosomalen Untereinheit und sogar noch bevorzugter der 50S ribosomalen Untereinheit, interagieren. Wie hier verwendet, soll sich die Bezeichnung „SAR" insgesamt auf die Struktur-Aktivitäts/Struktur Eigenschaftsverhältnisse, betreffend die/das Verhältnisse) zwischen der Aktivität/den Eigenschaften einer Verbindung und seiner chemischen Struktur beziehen.
d. De Novo Konstruktion
Der Fachmann kann eines von vielen Verfahren verwenden, um die Fähigkeit chemischer Gruppen oder Einheiten, Verbindungen, oder andere Agenzien zu identifizieren, mit einer zuvor ausgesuchten Zielstelle innerhalb eines Ribosoms oder einer ribosomalen Untereinheit zu assoziieren. Dieser Prozess kann begonnen werden mit einer visuellen Untersuchung oder einer computergestützten Modellierung von, zum Beispiel, der Zielstelle auf dem Computerbildschirm, basierend auf den atomaren Koordinaten der 50S ribosomalen Untereinheit und/oder ihrer Komplexe mit anderen Analogen und Antibiotika, die in der RSCB Protein Datenbank unter den Hinterlegungsnummern PDB ID: 1FFK, 1JJ2, 1FFZ oder 1FG0 hinterlegt wurden, und/oder in einer Tabelle auf Diskette Nr. 1, 2, oder 3 von 3 gelistet sind. In einer Ausführungsform verwendet die Verbindungsmodellierung ein Computer Modellierungprogramm, welches errechnet, wie verschiedene Moleküle mit den unterschiedlichen Stellen des Ribosoms, der ribosomalen Untereinheit, oder einem Fragment davon, wechselwirken. Ausgewählte chemische Gruppen oder Einheiten, Verbindungen oder Agenzien können dann in einer Vielzahl von Orientierungen positioniert oder angedockt werden, in wenigstens einem Teil der Zielstelle eines Ribosoms oder einer ribosomalen Untereinheit, bevorzugter einer großen ribosomalen Untereinhet und sogar noch bevorzugter einer 50S ribosomalen Untereinheit. Datenbanken von chemischen Strukturen sind verfügbar von, zum Beispiel, Cambridge Crystallographic Data Center (Cambridge, U.K.) und Chemical Abstrcts Service (Columbus, OH). Das Andocken kann unter Verwendung von Software wie Quanta und Sybyl erreicht werden, gefolgt von Energieminimierung und molekularen Dynamiken mit standardmäßigen molekularmechnischen Kraftfeldern, wie CHARMM und AMBER.
Spezialisierte Computerprogramme können auch den Prozess der Auswahl chemischer Einheiten unterstützen. Diese schließen ein, ohne darauf limitiert zu sein:

(1) GRID (Goodford, P.J., „A Computational Procedure fo Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules" (!985) J. Med. Chem. 28, 849-857). Software wie GRID, ein Programm, dass die wahrscheinlichen Interaktionsstellen zwischen Sonden mit verschiedenen funtionellen Gruppencharakteristiken und der makromolekularen Oberfläche bestimmt, kann verwendet werden, um die Oberflächenstellen zu analysieren, um Strukturen von ähnlichen inhibierenden Proteinen oder Molekülen zu bestimmen. Die Berechnungen von GRID, mit geeigneten inhibierenden Gruppen auf den Molekülen (z.B. protonierte primäre Amine) als Sonde, werden verwendet um potentielle Hotspots um zugängliche Positionen herum, mit geeigneten Energiekonturleveln zu identifizieren. GRID ist erhältlich von der Oxford Universität, Oxford UK.
(2) MCSS (Miranker, A. und M. karplus (1991) „Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method" Proteins: Structure, Function and Genetics 11:29-34): MCSS ist erhältlich von Molecular Simulations, Burlingten, MA.
(3) AUTODOCK (Goodsell, D.S. und A.J. Ohlsen (1990) "Automated Docing of Substrates to Proteins by Simulated Annealing" Proteins: Structure, Function, and Genetics 8:195-202). AUTODOCK ist erhältlich von Scripps Research Institute, La Jolla, CA.
(4) DOCK (Kuntz, I.D. et al. (1982) „A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions" J. Mol. Biol. 161:269-288). Das Programm DOCK kann verwendet werden, um eine aktive Stelle, oder eine Ligandenbindungsstelle zu analysieren und um Liganden mit komplementären sterischen Eigenschaften vorzuschlagen. DOCK ist erhältlich von der University of California, San Francisco, CA.
(5) ALADDIN (Van Drie et al. (1998) „ALADDIN: An Integrated Tool of Computer Assisted Molecular Design and Pharmacophore Recognition From Geometric, Steric and Substructure Searching of Three-Dimensional Structures" J. Comp-Aided Mol. Des. 3:225).
(6) CLIX (Davie und Lawrence (1992) "CLIX: A Search Algorithm for Funding Novel Ligands Capable of Binding Proteins of Known Three-Dimensional Structure" Proteins 12:31-41).
(7) GROUPBUILD (Rotstein und Murcko (1993) "GroupBuild: A Fragment-Based Method for De Novo Drug Design" J. Med. Chem 36:1700).
(8) GROW (Moon und Howe (1991) "Computer Design of Bioactive Molecules: A Method for Receptor-Based De Novo Ligand Design" Proteins 11:314).

Sobald geeignete chemische Gruppen oder Einheiten, Verbindungen oder Agenzien ausgewählt wurden, können sie zu einem einzelnen Molekül zusammengesetzt werden. Das Zusammensetzen kann mittels visueller Inspektion und/oder Computermodellierung und rechnerischer Analyse der räumlichen Beziehung der chemischen Gruppen oder Einheiten, Verbindungen oder Agenzien zueinander im dreidimensionalen Raum fortschreiten. Dieses könnte dann von einer Modellbildung unter Verwendung von Software wie Quanta oder Sybyl gefolgt werden.
Nützliche Programme, die dem Fachmann bei der Verbindung der einzelnen chemischen Einheiten, Verbindungen oder Agenzien von Nutzen sein können sind, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein:

(1) CAVEAT (Barlett, P.A. et al. (1989) "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules". In "Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems", Special Pub., Royal Chem. Soc. 78:82-196) and (Bacon et al. (1992) J. Mol. Biol. 225:849-858): CAVEAT verwendet Datenbanken von zyklischen Verbindungen, die als „Spacer" agieren können, um jegliche Anzahl von chemischen Fragmenten, die bereits in der aktiven Stelle positioniert sind, zu verbinden. Dieses erlaubt dem Fachmann, schnell hunderte von Möglichkeiten zu erzeugen, um die Fragmente zu verbinden, von denen bereits bekannt ist, oder von denen vermutet wird, dass sie für eine feste Bindung nötig sind. CAVEAT ist erhältlich von der University of California, Berkeley, CA.
(2) 3D Datenbanksysteme, wie MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, (CA). Eine Übersicht über dieses Gebiet gibt Martin, Y.C., (1992) „ 3D Database Searching in Drug Design", j. Med. Chem. 35:2145-2154.
(3) HOOK (erhältlich von Molecular Simulations, Burlington, MA.).

Anstatt ein interessierendes Molekül wie oben in einer Schritt-für-Schritt Art und Weise, mit jeweils einer chemischen Einheit pro Zeitpunkt aufzubauen, kann das interessierende Molekül auch als Ganzes konstruiert werden unter Verwendung von entweder einer leeren aktiven Stelle, oder optional, einschließlich eines Teils oder Teile eines bekannten Inhibitors oder Inhibitoren. Software, die diese Verfahren implementiert schließt ein:

(1) LUDI (Bohm, H. -J. (1992) „The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors", J. ComR. Aid. Molec. Design 6:61-78). Das LUDI Programm kann eine Liste von Interaktionsstellen bestimmen, in welchen sowohl Wasserstoff bindende als auch hydrophobe Fragmente platziert werden können. LUDI verwendet dann eine Bibliothek von ungefähr 600 Linkern, um bis zu vier unterschiedliche Interaktionsstellen in Fragmenten zu verbinden. Danach werden kleinere „bridging" Gruppen, wie -CH₂- und -COO-, verwendet, um diese Fragmente zu verbinden. Zum Beispiel wurde für das Enzym DHFR die Platzierung von funktionalen Schlüsselgruppen des wohlbekannten Inhibitors Methotrexat mittels LUDI reproduziert. Siehe auch, Rothstein und Murcko, (1992) J. Med. Chem. 36:1700-1710. LUDI ist erhältlich von Biosyn Technologies, San Diego, CA.
(2) LEGEND (Nishibata, Y. und A. Itai (1991) Tetrahedron 47, 8985): LEGEND ist erhältlich von Molecular Simulations, Burlignton, MA.
(3) LeapFrog (erhältlich von Tripos Associates, St. Louis, M.).
(4) Aladdin (erhältlich von Daylight Chemical Information Systems, Irvine, CA)

Andere molekulare Modellierungstechniken können ebenfalls im Einklang mit dieser Erfindung eingesetzt werden. Siehe, z.B., Cohen, N.C. et al (1990) „Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry", J. Med. Chem. 33:883-894. Siehe auch Navia, M.A. und M.A. Murcko (1992) "The Use of Structural Information in Drug Design"; Current Opinions in Structural Biology 2:202-210; und Jorgensen (1998) "BOSS-Biochemical and Organic Simulation System" in der Encyclopedia of Computaional Chemistry (P.V.R. Schleyer, ed.) Wiley & Sonstra, Athens, U.S.A. 5:3281-3285).
Es ist beabsichtigt, dass es während der Modellierung möglich ist, chemische Einheiten in das interessierende Molekül einzubringen, die für ein Molekül von Nutzen sein können, welches als ein Pharmazeutikum verabreicht werden soll. Zum Beispiel kann es möglich sein, chemische Einheiten in das interessierende Molekül einzuführen, oder davon auszulassen, die nicht direkt die Bindung des Moleküls an die Zielregion beeinflussen, aber die, zum Beispiel, zu der Gesamtlöslichkeit des Moleküls in einem pharmazeutisch verträglichen Träger, der Bioverfügbarkeit des Moleküls und/oder der Toxizität des Moleküls beitragen. Überlegungen und Verfahren zur Optimierung der Pharmakologie der interessierenden Moleküle kann zum Beispiel gefunden werden in „Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics" Eighth Edition (Goodman Gilman, Rall, Nies & Taylor (eds.)). Pergaman Press (1985); Jorgensen & Duffy (2000) Bioorg. Med. Chem. Lett. 10:1155-1158.
Weiterhin kann das Computerprogramm „Qik Prop" verwendet werden, um schnelle Vorhersagen für physikalisch signifikante Beschreibungen und pharmazeutisch-relevante Eigenschaften eines interessierenden organischen Moleküls zur Verfügung zu stellen. Ein „Rule of Five" Wahrscheinlichkeitsschema kann verwendet werden, um die orale Absorption der neu synthetisierten Verbindungen abzuschätzen (Lipinski et al. (1997) Adv. Drug Deliv. Rev. 23:3).
Programme, die für die Phamarkophorselektion und Konstruktion geeignet sind schließen ein:

(1) DISCO (Abbot Laboratories, Abbot Park, Ill.).
(2) Catalyst (Bio-CAD Corp., Mountain View, CA).
(3) Chem DBS-3D (Chemical Design Ltd., Oxford, U.k.).

Weiterhin kann der Fachmann auch verfügbare Informationen darüber verwenden, wie geeignete, therapeutisch aktive und pharmazeutisch nützliche Verbindungen konstruiert werden, und diese Informationen für die Konstruktion von neuen erfindungsgemäßen Proteinsynthese Inhibitoren verwenden. Siehe, zum Beispiel, Lipinski et al. (1997) Ad. Drug Deliv. Reviews 23:3-25; Van de Waterbeemd et al. (1996) Quantitative Structure-Activity Relationships 15:480-490; und Cruciani et al. (2000), Theochem -J. Mol. Struct. 503:17-30.
Die oben diskutierte Eingabe der Koordinaten des Ribosomen- oder der ribosomalen Untereinheiten-Proteine und RNAs in das Computerprogramm, resultiert in der Errechnung der wahrscheinlichsten Struktur des Makromoleküls, einschließlich der Gesamt-Atom Koordinaten eines Ribosoms, einer ribosomalen Untereinheit, oder einem Fragment davon. Diese Strukturen können mittels zusätzlicher Berechnungen unter Verwendung von solchen Programme kombiniert oder verfeinert werden, um die wahrscheinliche oder tatsächliche dreidimensionale Struktur des Ribosoms, der ribosomalen Untereinheit oder einem Fragment davon zu bestimmen, einschließlich potentieller oder tatsächlicher aktiver oder Bindungsstellen von Liganden.
e. Modifikation von Existierenden Molekülen
Anstatt interessierende Moleküle komplett de novo zu konstruieren, ist es beabsichtigt, das vorher bestehende Moleküle oder Proteine davon als Ausgangspunkt für die Konstruktion eines neuen Kandidaten verwendet werden. Es ist beabsichtigt, dass viele der Ansätze, die für eine de novo Konstruktion von Molekülen nützlich sind, auch für die Modifikation von bestehenden Molekülen nützlich sind.
Es wird in Betracht gezogen, dass Wissen über die räumliche Beziehung zwischen einem Proteinbiosynthese Inhibitor, zum Beispiel einem Antibiotikum, und dessen respektiver Bindungsstelle innerhalb eines Ribosoms die Konstruktion eines modifizierten Inhibitors erlaubt, der bessere Bindungseigenschaften haben kann, zum Beispiel, höhere Bindungsaffinität und/oder – spezifität, relativ zu dem Molekül von dem er abgeleitet wurde. Alternativ erlaubt das Wissen über Kontaktstellen der Inhibitoren innerhalb eines Ribosoms die Synthese eines neuen Moleküls, das zum Beispiel einen Teil eines ersten Moleküls, das an die Kontaktstelle bindet und einen anderen Teil, der weitere Funktionalität beisteuert, beinhaltet.
Es wird in Betracht gezogen, dass eine Vielzahl von modifizierten Molekülen (zum Beispiel modifizierte Antibiotika) unter Verwendung der Atomkoordinaten, die hier bereitgestellt werden, konstruiert werden können. Zum Beispiel ist es beabsichtigt, dass es durch das Wissen um die räumliche Beziehung eines oder mehrerer Antibiotika relativ zu der großen ribosomalen Untereinheit möglich ist, neue antibiotika-basierte Moleküle zu generieren. Die Atomkoordinaten jedes Antibiotikums relativ zu der großen ribosomalen Untereinheit stellen Informationen darüber zur Verfügung, welche Teile des Ribosoms oder der ribosomalen Untereinheit und des Antibiotikums einander kontaktieren. Dementsprechend kann der Fachmann mittels dieser Information nicht nur die Kontaktstellen innerhalb des Ribosoms identifizieren, die wie oben diskutiert für eine de novo Konstruktion von Medikamenten verwendet werden können, sondern er kann auch Teile eines Antibiotikums identifizieren, die als ribosomale Bindungsdomäne fungieren können.
Basierend auf den hier zur Verfügung gestellten Informationen kann der Fachmann bequem hybride Antibiotika identifizieren und produzieren, die eine Ribosomen Bindungsdomäne eines ersten Antibiotikums und eine Ribosomen Bindungsdomäne eines zweiten, verschiedenen Antibiotikums einschließen. Die resultierenden hybriden Antibiotika binden vorzugsweise gleichzeitig an jede der jeweiligen Kontaktstellen innerhalb der ribosomalen Untereinheit. Die hier zur Verfügung gestellten Atomkoordinaten erlauben es dem Fachmann, Kandidaten Antibiotika zu identifizieren, die als Vorlage in der Synthese eines Hybrids verwendet werden können und stellen weiterhin die sterischen Informationen zur Verfügung, die nötig sind, um Verbindungschemien herzustellen, so dass jede Ribosomen Bindungsdomäne genau relativ zu ihrer jeweiligen Kontaktstelle ausgerichtet ist. Als Ergebnis wird in Betracht gezogen, dass der Fachmann ein hybrides Antibiotikum erzeugen kann, dass mit einer höheren Affinität an ein Ribosom oder eine ribosomale Untereinheit bindet und/oder eine höhere Proteinsynthese inhibitorische Aktivität aufweist, als jedes der beiden individuellen Vorlageantibiotika, die zur Herstellung des Hybrids verwendet wurden. Alternativ kann das hybride Antibiotikum Resistenzphänotypen überwinden, die sich gegen einen der beiden Vorlageantibiotika entwickelt haben könnten. Zum Beispiel legt die Nähe der Stelle, die durch die Disaccharidgruppe von Carbomycin besetzt wird zu der Stelle, die durch Anisomycin ausgefüllt wird, nahe, dass eine hybride Verbindung, die Teile von sowohl Carbomycin und Anisomycin einschließt, ein wirkungsvoller Inhibitor der Proteinsynthese sein könnte.
Weiterhin erlauben die hier zur bereitgestellten Atomkoordinaten dem Fachmann, die Verwendung der Informationen betreffend der Identifikation einer Ribosomenbindungsdomäne und die Konstruktion anderer Typen von Proteinsynthese Inhibitoren. Der Fachmann kann, zum Beispiel, mit dem Wissen über die Ribosomen Kontaktregion und der umgebenden Umgebung, neue Moleküle zur Verfügung stellen, von denen ein Teil auf die Antibiotika Bindungsregion (Bindungs Domäne) basiert und von denen ein anderer Teil (Effektor Domäne) als eine neue raumausfüllende Domäne konstruiert sein kann, welche die Proteinbiosynthese innerhalb des Ribosoms oder Sekretion durch den Polypeptid Ausgangstunnel sterisch unterbindet oder unterbricht. Der Fachmann kann zum Beispiel die Ribosomenbindungsdomäne des Antibiotikums Tylosin, die an eine Seite des Polypeptid Ausgangstunnels, nahe der Peptidyltransferasestelle bindet, mit einer neuen chemischen Gruppe kombinieren; die sperrig genug ist, um den Polypeptid Ausgangstunnel zu blockieren. Es wird jedoch in Betracht gezogen, dass der Fachmann einen Vorteil aus einer oder mehreren der vielen hier offenbarten Antibiotika Kontaktregionen zieht, um gänzlich neue Bindungs- und Effektordomänen zu konstruieren.
Weiterhin erlaubt die vorliegende Erfindung dem Fachmann Moleküle zu konstruieren, zum Beispiel, selektive Proteinsynthese Inhibitoren, die darauf zugeschnitten sind wirkungsvoller für Ribosomen eines Zielorganismus zu sein, zum Beispiel ein Pathogen wie eine Mikrobe, und weniger wirkungsvoll, d.h. weniger toxisch, für das Ribosom eines Nicht-Zielorganismus, z.B., einem Wirtsorganismus wie dem Menschen. Die Erfindung erlaubt dem Fachmann weiterhin die Atomkoordinaten und Strukturen der großen ribosomalen Untereinheit und ihrer Komplexe mit Proteinsynthese Inhibitoren zu verwenden, um Modifikationen der Ausgangsverbindungen zu konstruieren, wie Antibiotika, die fester an ein Zielribosom binden (z.B. die 50S ribosomale Untereinheit der Bakterien) und weniger fest an ein Nicht-Zielribosom (z.B. die humane 60S ribosomale Untereinheit).
Die Struktur eines Komplexes zwischen der großen ribosomalen Untereinheit und der Ausgangsverbindung (z.B. Tylosin oder ein anderer Proteinsynthese Inhibitor) kann ebenfalls verwendet werden, um die Modifikation dieser Verbindung zu leiten, um neue Verbindungen zu produzieren, die andere erwünschte Eigenschaften für die industrielle Anwendbarkeit und andere Verwendungen aufweisen (z.B. als Pharmazeutika, Herbizide oder Insektizide) wie chemische Stabilität, Löslichkeit oder Membranpermeabilität.
Eine Vielzahl von Antibiotika binden die große ribosomale Untereinheit und unterbrechen die Proteinsynthese und schließen Mitglieder von Antibiotika-Familien ein, die zum Beispiel Chloramphenicole, Macrolide, Lincosamine, Streptogramine, Althiomycine, Oxazolinone, Nukleotidanaloge, Thiostreptone, Peptide, Glutarimide und Trichothecene einschließen.
Mitglieder der Cloramphenicol-Familie schließen zum Beispiel Chloramphenicol und Iodoamphenicol ein. Mitglieder der Macrolid-Familie schließen zum Beispiel Biaxin (Clarithromycin), Zithromax (Azithromycine), Ketek (Telithromycin; Ketolid), ABT-773, Tylosin, Spiramycin I, Spiramycin II, Spiramycin III, Erythromycin A, Carbomycin A, Telithromycin Methymycin, Narbomycin, Lankamycin, Oleandomycin, Megalomycin, Chalcomycin, Niddamycin, Leucomycin, Angolamycin und Relomycin ein. Mitglieder der Lincosamid-Familie schließen zum Beispiel Clindamycin und Lincomycin ein. Mitglieder der Streptogramin-Familie schließen zum Beispiel Streptogramin A, Streptogramin B, Ostreogrycin G, Synercid, Virginamycin S1, Virginamycin S2, Virginamycin S3, Virginamycin S4, Vernamycin B, Vernamycin C, Patricin A und Patricin B ein. Ein Mitglied der Althiomycin-Familie schließt zum Beispiel Althiomycin ein. Ein Mitglied der Oxazolidin-Familie schließt zum Beispiel Linezolid ein. Mitglieder der Familie der Nukleotidanaloge schließen zum Beispiel Sparsomycin, Puromycin, Anisomycin und Blasticidin S ein. Mitglieder der Thiostrepton-Familie schließen zum Beispiel Thiostrepton, Siomycin, Sporangiomycin und Thiopeptin ein. Mitgleider der Peptid-Familie schließen zum Beispiel Viomycin, Capreomycin IA, Capreomycin IB, Capreomycin IIA und Capreomycin IIB ein. Mitglieder der Glutarimid-Familie schließen zum Beispiel Cycloheximid, Streptovitacine, Streptimidon, Inacton, Actiphenol ein. Mitglieder der Trichothecen-Familie schließen zum Beispiel Trichodermin, Trichodermol, Trichodermon, Vomitoxin, T-2 Toxin, Trichothecin, Nivalenol und Verrucarin A ein.
Inhibitoren können in die stabilisierten Kristalle der großen ribosomalen Untereinheiten, wie in Beispiel 3, beschrieben diffundieren oder durch Einsickern eingeführt werden, um einen Komplex mit der großen ribosomalen Untereinheit zu bilden zur Sammlung von Röntgenstrahlen Beugungsdaten von. Alternativ können die Inhibitoren zusammen mit der großen ribosomalen Untereinheit kristallisiert werden, indem der Inhibitor mit der großen ribosomalen Untereinheit vor der Präzipitierung mit Hochsalz vermischt wird.
Ausgehend von der Struktur des Ribosoms von H. marismortui, kann die Struktur eines Nicht-Zielorganismus (zum Beispiel die humane 60S ribosomale Untereinheit) mittels Homologiemodellierung konstruiert werden, d.h. mittels Austausch der Struktur von Resten in der interessierenden Zielstelle mit den Resten an den gleichen Positionen des Nicht-Zielribosoms. Dieses wird durchgeführt mithilfe des Computers durch Entfernung der Seitenketten vom Ribosom bekannter Struktur und Ersetzen dieser mit den Seitenketten der unbekannten Struktur, die in sterisch plausible Positionen gebracht werden. Auf diese Art und Weise kann verstanden werden, wie sich die Formen der Zielstellen innerhalb der Ziel- und Nicht-Zielribosomen unterscheiden. Dieser Prozess stellt daher Informationen dazu bereit, wie ein Molekül, das an die Zielstelle bindet, chemisch verändert werden kann, um Moleküle herzustellen, die fest und spezifisch an das Zielribosom binden, aber bei denen gleichzeitig ein Binden an das Nicht-Zielribosom verhindert wird. Gleicherweise erlaubt Wissen über die Teile des gebundnen Moleküls, die dem Solvenz zugewandt sind, das Einführen von funktionellen Gruppen für weitere pharmazeutische Zwecke. Der Prozess des Homologie-Strukturmodellierens kann ebenfalls verwendet werden, um die Mechanismen zu verstehen, mittels derer mutante Ribosomen gegenüber den Effekten von Pharmazeutika oder Pestiziden, wie Herbiziden oder Insektiziden, resistent werden. Weiterhin kann der Fachmann mit Wissen über die Teile der ribosomalen Untereinheit, die an der Medikamentenresistenz beteiligt sind, neue Moleküle konstruieren, die das Problem der Medikamentenresistenz überwinden.
Die Verwendung des Homologie-Strukturmodellierens, um neue Moleküle zu konstruieren, die fester an das Zielribosom binden als an das Nicht-Zielribosom, besitzt eine weit verbreitete Anwendbarkeit. Die hier dargestellten Verfahren können verwendet werden, um jeden Zielorganismus, zum Beispiel ein Pathogen, zu kontrollieren, mittels Konstruktion von Molekülen, die die großen ribosomalen Untereinheiten des Zielorganismus inhibieren, während sie die 50S oder 60S ribosomale Untereinheit des Nicht-Zielorganismus, zum Beispiel eines Wirts, nicht im gleichen Ausmaß, oder überhaupt nicht inhibieren. Die mittels der Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten oder hergestellten Moleküle könne zur Kontrolle der Zielorganismen verwendet werden, während sie auf die Nicht-Zielorganismen nur geringe oder keine nachteilige Effekte haben. Daher können die mittels der Verfahren der vorliegenden Erfindung identifizierten oder entwickelten Moleküle so konstruiert werden, dass ihre Verabreichung den Zielorganismus töten, oder irgendeinen Aspekt der biologischen Funktionen des Zielorganismus inhibiert, während sie einen ähnlichen Effekt auf den Nicht-Zielorganismus nicht aufweisen. Die nachteiligen Effekte des Agens auf den Zielorganismus können einschließen, ohne darauf limitiert zu sein, Tod des Zielorganismus; Verlangsamung der Wachstumsraten; Verlangsamung oder Eliminierung der Passage von einer Wachstumsphase zu einer anderen (z.B. Verlängerung der Larven-Wachstumsphase); Verlangsamung oder Eliminierung der Reproduktion, Erniedrigung oder Verhinderung der Paarung, Verminderung oder Eliminierung der Produktion von Nachkommen, Beschränkung oder Eliminierung der Gewichtszunahme des Zielorganismus, Verminderung oder Eliminierung der Nahrungsaufnahme und Nahrungsgewohnheiten; und Unterbrechung von zellulären, Gewebs- und/oder Organfunktionen.
Die von der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogenen neuen Agenzien können nützlich sein als Herbizide, Pestizide (z.B. Insektizide, Nematozide, Rodentizide, etc.), Mitizide, oder antimikrobielle Agenzien (z.B. Fungizide, Bakterizide, Antiprotozoika, etc.) um auf spezifische Organismen abzuzielen. Zum Beispiel können die neuen Agenzien auf tier- und planzenparasitäre Nematoden, prokaryotische Organismen (krankheitsverursachende Mikroben) und eukaryotische multizelluläre Schädlinge abzielen. Spezifische Beispiele für multizelluläre Schädlinge schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Insekten, Pilze, Bakterien, Nematoden, Milben und Zecken, protozoische Pathogene, tier-parasitäre Leberegel und ähnliche.
Herbizide, Pestizide, Mitizide und antimikrobielle Agenzien, die die Proteinsynthese durch Interaktion mit Ribosomen inhibieren sind dem Fachmann bekannt. Einige Beispiele werden unten diskutiert. Diese bekannten Agenzien können mittels Computer-Modellierungstechniken und Wissen über die Struktur der Ribosomen und der ribosomalen Untereinheiten und der Struktur von Ribosom/Agens und ribosomaler Untereinheit/Agens Komplexen modifiziert werden, um neue Agenzien zu erhalten.
Das Ketolid ABT-773 bindet in S. pneumoniae fester an Ribosomen als Erythromycin und ist in der Lage, die Macrolidresistenz in Bakterien zu überwinden (Capobianco et al. (2000) Antimicrob Agents Chemother 44(6), 1562-1567). Die Werkzeuge und Methodologien der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Erythromycinderivate zu erhalten, die stärker an die Ribosomen oder. ribosomale Untereinheiten von Ziel-Bakterien binden, als sie an die Ribosomen und ribosomalen Untereinheiten von nicht-Zieltieren binden. Die Ziel-Bakterien können jedes beliebige Bakterium sein, besonders S. pneumoniae, und sogar noch besonderer erythromycin-resistentes S. pneumoniae. Die nicht-Zieltiere können jedes Tier sein, besonders Säugetiere, und sogar noch besonderer Menschen.
Beispiele für Antibiotika, die Inhibitoren der Proteinsynthese sind, schließen ein, ohne darauf beschränkt zu sein, Puromycin, Cycloheximid, Chloramphenicol, Tetracyclin und Streptomycin (Heldt, (1996) Plant Biochemistry and Molecular Biology 21.2:458-464). Puromycin bindet, wie zuvor diskutiert, als ein Analog einer Aminoacyl-t-RNA an die A-Stelle und wird an die nascierenden Peptidketten angehängt, seine schwache Bindung an das Ribosom verhindert weitere Verlängerungsschritte in Prokaryoten und Eukaryoten. Cycloheximid inhibiert die Peptidyltransferase in eukaryotischen Ribosomen. Chloramphenicol inhibiert die Peptidyltransferase in prokaryotischen Ribosomen. Tetracyclin bindet an die 30S Untereinheiten und inhibiert die Bindung von Aminoacyl-t-RNA an prokaryotische Ribosomen mehr als an eukaryotische Ribosomen. Steptomycin wechselwirkt mit 30S Ribsomen, was eine falsche Erkennung von mRNA Sequenzen zur Folge hat und daher die Initiation in prokaryotischen Ribosomen inhibiert. U.S. Patent Nr. 5,801,153 offenbart Antikörper gegen Pathogene. Aminoglycoside sind Beispiele für antibakterielle Antibiotika, die die Proteinsynthese zu inhibieren scheinen. Es gibt jedoch eine Limitierung für ihren Gebrauch wegen ihrer ototoxischen und nephrotoxischen Eigenschaften. Amikacinsulfat, Framycetinsulfat, Gentamycinsulfat, Kanamycinsulfat, Neomycinsulfat, Netilmycinsulfat, Paromomycinsulfat, Sissomycinsulfat, Tombramycin, Vancomycinhydrochlorid und Viomycinsulfat sind Mitgleider der Aminoglycosidfamilie. Die Werkzeuge und Methodologien der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um Derivate von jeglichem Antibiotikum der Wahl zu erhalten, so dass diese die Proteinsynthese eines Zielorganismus zu einen höheren Grad inhibieren, als sie die Proteinsynthese eines nicht-Zielorganismus, wie Menschen, inhibieren.
Beispiele von Ziel- und nicht-Zielorganismen schließen die in Tabelle 18 zur Verfügung gestellten ein, ohne darauf limitiert zu sein. Tabelle 18 Beispiele für Klassen von Molekülen die durch die Verfahren der Erfindung identifiziert und/oder entwickelt werden können und geeignete Ziel/Nicht-Zielorganismen
Es ist vorgesehen, dass die Werkzeuge und Methodologien der vorliegenden Erfindung zur Erlangung eines Inhibitors der Proteinsynthese von Zielinsekten verwendet werden können, wie Baumwollkapsekaupen und Moskitos, mehr als sie die Proteinsynthese von nicht-Zielinsekten, wie Käfern der Familie der Coccinellidae (z.B. Marienkäfer) und Apis mellifera (Honigbienen) inhibieren. Andere mögliche Zielinsekten schleißen ein, ohne darauf limitiert zu sein, Insekten ausgewählt aus der Ordnung der Coleoptera (Käfer), Diptera (Fliegen, Moskitos), Hymenoptera (Wespen, Ameisen, Blattwespen), Lepidoptera (Falter und Motten), Malophage (Läuse), Homoptera (Mottenläuse, Blattläuse), Hemiptera (Wanzen), Orthroptera (Heuschrecken, Kakerlaken), Thysanoptera (Blasenfüße), Dermaptera (Ohrwürmer), Isoptera, Anoplura, Siphonaptera und Trichoptera (Köcherfliegen).
Weiterhin ist es vorgesehen, dass die Werkzeuge und Methodologien der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, um Inhibitoren der Proteinsynthese von Zielpflanzen zu erhalten, die die Proteinsynthese der Zielpflanzen stärker inhibieren, als sie die Proteinsynthese von nicht-Zielpflanzen und -Tieren inhibieren. Die Zielpflanzen können jegliche ungewollte Pflanzenspecies sein, vor allem Unkräuter und sogar noch spezieller schädliche Unkräuter. Ob eine bestimmte Pflanze als Unkraut eingestuft wird, oder nicht, hängt vom Zusammenhang ab, in der sie wächst. Zum Beispiel könnten ungewollte Zea mays (Mais) Pflanzen, die in einem Glycine max (Sojabohne) Feld wachsen als Unkraut eingestuft werden. Beispiele für Unkräuter, die wahrscheinlich Zielpflanzen darstellen, sind, ohne darauf limitiert zu sein, Allium vineale (wilder Knoblauch), Bromus tectorum (Dach-Trespe), Triticum cylindricum (Zylindrischer Walch), Amaranthus spp. (Fuchsschwanz), Chenopodium album (Weisser Gänsefuß), Avenafatua (wilder Hafer), B. secalinus (Roggen-Traspe), Echinochloa crusgalli (Hühnerhirse), Alopecurus myosuroides (Acker-Fuchsschwanz), Setaria faberii (Fabers Borstenhirse), Xanthium strumarium (Spitzklette), Ambrosia artemisiifolia (Beifußblättriges Traubenkraut), und Ipomoea spp. (Trichterwinde).
Die nicht-Zielorganismen können jegliche Pflanze sein, vor allem jegliche wünschenswerte Pflanze, sogar noch spezieller jegliche Nutzpflanze. Die nicht-Zielorganismen können auch jegliches Tier sein, vor allem Säugetiere und sogar noch spezieller Menschen. In einer bevorzugten Ausführungsform können die Werkzeuge und Methodologien der vorliegenden Erfindung dazu verwendet werden, um Proteinsynthese Inhibitoren zu produzieren, die ein oder mehrere schädliche Unkräuterspecies abtöten oder schädigen aber nicht-Zielpflanzen und -tiere nicht schädigen.
Zielbakterien von Interesse schließen ein, ohne darauf limitiert zu sein, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus bovis, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catanhalis, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Bacillus anthracis, Corynebacterium diphlheriae, Listeria monocytogenes, Erysipelothrix rhusiopathiae, Clostridium perfringens, Clostridium tetani, Clostridium difficile, Eschericia coli, Proteus mirabilis, Psuedomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae, Haemophilus ducreyi, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Francisella tularensis, Pasteurella multocida, Vibrio cholerae, Flavobacterium meningosepticum, Pseudomonas mallei, Pseudomonas pseudomallei, Campylobacter jejuni, Campylobacter fetus, Fusobacterium nucleatum, Calymmatobacterium granulomatis, Streptobacillus moniliformis, Legionella pneumophila, Mycobacterium avium-intracellulare, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Treponema pallidum, Treponema pertenue, Borrelia burgdorferi, Borrelia recurrent is, Aclinomyces isrealii, Nocardia asteroides, Ureaplasma urealyticum, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pnemoniae, Pneumocystis carinii, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Sporothrix schenckii, Ctyptococcus neoformans.
Sobald ein Kandidatenmolekül mittels der obigen Verfahren konstruiert oder ausgewählt wurde, kann die Affinität, mit der das Molekül an das Ribosom oder die ribosomale Untereinheit binden kann, mittels computergestützter Auswertung getestet und optimiert werden und/oder durch Testung der biologischen Aktivität nach Synthese der Verbindung. Kandidatenmoleküle können mit den Ribosomen oder den ribosomalen Untereinheiten in mehr als einer Konformation interagieren, wovon jede eine ähnliche Gesamtbindungsenergie hat. In diesen Fällen kann die Deformationsenergie der Bindung als der Unterschied zwischen der Energie des freien Moleküls und der Durchschnittsenergie der beobachteten Konformationen betrachtet werden, wenn das Molekül an die Ribosomen oder ribosomalen Untereinheiten bindet, bevorzugter an die großen ribosomalen Untereinheiten und sogar noch bevorzugter an die 50S ribosomalen Untereinheiten.
Ein als an ein Ribosom oder eine ribosomale Untereinheit bindendes konstruiertes oder ausgewähltes Molekül kann weiterhin computergestützt optimiert werden, so dass ihm in seinem gebundenen Zustand vorzugsweise abstoßende elektrostatische Interaktion mit der Zielregion fehlt. Solche nicht-komplementäre (z.B. elektrostatische) Interaktionen schließen abstoßende Ladungs-Ladungs, Dipol-Dipol und Ladungs-Dipol Interaktionen ein. Speziell leistet die Summe aller elektrostatischen Interaktionen zwischen dem Inhibitor und dem Enzym, wenn der Inhibitor an das Ribosom oder die ribosomale Untereinheit gebunden ist, vorzugsweise einen neutralen oder vorteilhaften Beitrag zu der Bindungsenthalpie. Schwach bindende Verbindungen können ebenfalls mittels dieser Verfahren konstruiert werden, um die SAR zu bestimmen.
Besondere Computerprogramme, die die Deformationsenergie und elektrostatischen Interaktionen einer Verbindung auswerten können, sind in der Technik bekannt. Beispiele geeigneter Programe schließen ein: Gaussian 92, revision C (M.J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, PA); AMBER, version 4.0 (P.A. Kolman, University of California at San Francisco, CA); QUANTA/CHARMM (Molecular Simulations, Inc., Burlington, MA); und Insight II/Discover (Biosysm Technologies Inc., San Diego, CA). Diese Programme können zum Beispiel unter Verwendung einer Silicon Graphics Workstation, IRIS 4D/35 oder einer IBM RISC/6000 Workstation Modell 550 implementiert werden. Andere Hardwaresysteme und Softwarepakete sind dem Fachmann bekannt.
Sobald ein interessierendes Molekül, wie oben beschrieben, ausgewählt oder konstruiert wurde, können Substitutionen an einigen seiner Atome oder Seitengruppen durchgeführt werden, um seine Bindungseigenschaften zu verbessern oder zu modifizieren. Im Allgemeinen sind die anfänglichen Substitutionen konservativ, d.h. die Austauschgruppe wird sich derselben Größe, Form, Hydrophobizität und Ladung wie der der Originalgruppe annähern. Natürlich sollte verständlich sein, dass Komponenten vermieden werden sollten, von denen in der Technik bekannt ist, dass sie die Konformation verändern. Solche substituierten chemischen Verbindungen können dann hinsichtlich der Effizienz der Passung an das Ribosom oder der ribosomalen Untereinheit mittels derselben Computermethoden, wie oben im Detail beschrieben, analysiert werden.
Zusätzlich können die eigentlichen ribosomen-zugehörigen Liganden, Komplexe oder mimetischen Moleküle kristallisiert und mittels Röntgenbeugung analysiert werden. Die Koordinaten des Beugungsmusters werden auf die gleiche Weise verwendet um die dreidimensionale Interaktion eines Liganden und dem Ribosom, der ribosomalen Untereinheit oder einem mimetischen Molekül zu berechnen, um zu bestätigen dass der Ligand an einer bestimmten Stelle am Ribosom oder der ribosomalen Untereinheit bindet, oder dessen bzw. deren Konformation verändert, oder, an welcher Stelle das mimetische Molekül eine ähnliche dreidimensionale Struktur zu der des Ribosoms, der ribosomalen Untereinheit oder einem Fragment davon hat.
3. Synthese von Leitmolekülen
Ein Leitmolekül der vorliegenden Erfindung kann sein, ohne darauf beschränkt zu sein, wenigstens eines ausgewählt aus einem Lipid, einer Nukleinsäure, einem Peptid, einem kleinen organischen oder anorganischen Molekül, einer chemischen Verbindung, einem Element, Saccharid, Isotop, Kohlenhydrat, Visualisierungsagens, Lipoprotein, Glycoprotein, Enzym, einer analytischen Sonde, und einem Antikörper oder Fragment davon, jeglicher Kombination jeder der vorher genannten und jegliche chemische Modifikation oder Variante jeder der vorher genannten. Zusätzlich kann ein Leitmolekül optional eine detektierbare Markierung umfassen. Solche Markierungen schließen ein, ohne darauf limitiert zu sein, enzymatische Markierungen, Radioisotope oder radioaktive Verbindungen oder Elemente, fluoreszierende Verbindungen oder Metalle, chemilumineszierende Verbindungen und biolumineszierende Verbindungen. Wohlbekannte Verfahren können verwendet werden, um solch eine detektierbare Markierung an einem Leitmolekül anzubringen.
Verfahren die nützlich sind, Leitmoleküle wie Lipide, Nukleinsäuren, Peptide, kleine organische oder anorganische Moleküle, chemische Verbindungen, Elemente, Saccharide, Isotope, Kohlenhydrate, Visualisierungsagenzien, Lipoproteine, Glycoproteine, Enzyme, analytische Sonden, Antikörper und Antikörperfragmente zu synthetisieren, sind in der Technik bekannt. Solche Methoden schließen den traditionellen Ansatz der Synthetisierung jeweils eines solcher Leitmoleküle, wie ein einzelnes definiertes Peptid, ein, wie auch die kombinierte Synthese von mehreren Leitmolekülen in einem oder mehreren Behältnissen. Solche mehreren Leitmoleküle können eine oder mehrere Varianten der zuvor definierten Leitmoleküle einschließen. Verfahren zur kombinierten Synthese von mehreren Leitmolekülen sind besonders bei der Herstellung kombinatorischer Bibliotheken nützlich, die in Durchmusterungstechniken, die in der Technik bekannt sind, verwendet werden können.
Als ein Beispiel ist es in der Technik wohlbekannt, dass mehrere Peptide und Oligonukleotide gleichzeitig synthetisiert werden können. Leitmoleküle, die kleine Peptide bis zu 50 Aminosäuren Länge sind, können unter Verwendung von Standard-Festphasensythese Prozeduren synthetisiert werden, zum Beispiel Prozeduren, ähnlich denen, die in Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc., 85:2149 beschrieben sind. Zum Beispiel werden während der Synthese N-α-geschützte Aminosäuren, die geschützte Seitenketten haben, schrittweise an eine wachsende Polypeptidkette addiert, die über ihr C-terminales Ende mit einem unlöslichen, polymeren Träger, z.B. Styroporkügelchen, verbunden ist. Die Peptide werden synthetisiert, indem eine Aminogruppe einer N-α-entschützten Aminosäure mit einer α-Carboxygruppe einer N-α-geschützten Aminosäure verbunden wird, die dadurch aktiviert wurde, dass sie mit einem Reagenz wie Dicyclohexylcarbodiimid reagieren gelassen wurde. Das Anbringen einer freien Aminogruppe an das aktivierte Carboxyl führt zur Bildung einer Peptidbindung. Die am gewöhnlichsten verwendeten N-α-schützenden Gruppen schließen Boc ein, das eine instabile Säure ist und Fmoc, das eine instabile Base ist.
Kurz gesagt, die C-terminal N-α-geschützte Aminosäure wird zuerst an die Styroporkügelchen angebracht. Dann wird die N-α-schützende Gruppe entfernt. Die entschützte α-Aminogruppe wird an die aktivierte α-Carboxylatgruppe der nächsten N-α-geschützten Aminosäure gekoppelt. Der Prozess wird wiederholt, bis das gewünschte Peptid synthetisiert ist. Die resultierenden Peptide werden vom unlöslichen Polymerträger gespalten und die Aminosäureseitenketten werden entschützt. Längere Peptide, zum Beispiel mit einer Länge von mehr als ungefähr 50 Aminosäuren, werden typischerweise aus einer Kondensation von geschützten Peptidfragmenten abgeleitet. Details von angemessenen Chemien, Granulaten, Schutzgruppen, geschützte Aminosäuren und Reagenzien sind in der Technik wohlbekannt und werden daher hier nicht eingehend diskutiert. Siehe, zum Beispiel, Atherton et al. (1963) Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press) und Bodanszky (1993) Peptide Chemisty, A Practical textbook, 2nd Ed. Springer-Verlag, und Fields et al. (1990) Int. J. Peptide Protein Res. 35:161-214.
Die Aufreinigung der resultierenden Peptide wird mittels konventioneller Prozeduren erreicht, wie präparativer HPLC, z.B. Gelpermeation, Partition und/oder Ionenaustauscherchromatographie. Die Wahl der angemessenen Matrizen und Puffer ist in der Technik wohlbekannt und deswegen hier nicht im Detail beschrieben.
Es ist beabsichtigt, dass ein synthetisches Peptid in Übereinstimmung mit der Erfindung, natürlich vorkommende Aminosäuren, unnatürliche Aminosäuren und/oder Aminosäuren mit bestimmten Charakteristika, wie zum Beispiel Aminosäuren, die positiv geladen, negativ geladen, hydrophob, hydrophil oder aromatisch sind, umfasst. Wie hierin verwendet bezieht sich der Term „natürlich vorkommende Aminosäuren" auf die L-Isomere der Aminosäuren, die normalerweise in Proteinen gefunden werden. Die vorherrschend natürlich vorkommenden Aminosäuren sind Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Methionin, Threonin, Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan, Cystein, Prolin, Histidin, Asparaginsäure, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin, Arginin und Lysin. Wenn nicht besonders angegeben, sind alle in dieser Anmeldung angegebenen Aminosäuren in der L-Form. Weiterhin bezieht sich der Term „unnatürliche Aminosäuren", wie hier verwendet, auf Aminosäuren, die nicht natürlicherweise in Proteinen gefunden werden. Zum Beispiel Selenomethionin.
Aminosäuren, die „positiv geladen" sind, schließen jegliche Aminosäure ein, die unter normalen physiologischen Bedingungen eine positiv geladene Seitenkette haben. Beispiele für positiv geladene, natürlich vorkommende Aminosäuren schließen zum Beispiel ein Arginin, Lysin und Histidin. Umgekehrt, schließen Aminosäuren, die „negativ geladen" sind, jegliche Aminosäuren ein, die unter normalen physiologischen Bedingungen eine negativ geladene Seitenkette haben. Beispiele für negativ geladene, natürlich vorkommende Aminosäuren schließen zum Beispiel ein Asparaginsäure und Glutaminsäure.
Wie hier verwendet schließt der Term „hydrophobe Aminosäure" jegliche Aminosäure ein, die eine ungeladene, unpolare Seitenkette hat, de relativ unlöslich in Wasser ist. Beispiele für natürlich vorkommende, hydrophobe Aminosäuren schließen zum Beispiel ein Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Zusätzlich bezieht sich der Begriff „hydrophile Aminosäure", wie hierein verwendet, auf jegliche Aminosäure, die eine ungeladene, polare Seitenkette hat, die relativ löslich in Wasser ist. Beispiele für natürlich vorkommende, hydrophile Aminosäuren schließen zum Beispiel ein Serin, Threonin, Tyrosin, Asparagin, Glutamin und Cystein.
Schließlich bezieht sich der Term „aromatisch", wie hierin verwendet, auf Aminosäurereste, dessen Seitenketten ein delokalisiertes konjugiertes System haben. Beispiele für aromatische Aminosäuren schließen zum Beispiel ein Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin.
Hinsichtlich der Produktion von kleinen nicht-peptidischen organischen Molekülen, die in der vorliegenden Erfindung als Ligand agieren, können diese Moleküle unter Verwendung von standard-organischer Chemie hergestellt werden, die wohlbekannt ist und gründlich in der Patent- und anderen Literaturen dokumentiert ist.
Viele der bekannten Verfahren, die zur Synthese von Leitmolekülen der vorliegenden Erfindung nützlich sind, können automatisiert werden, oder können anderweitig in einem kommerziellen Maßstab ausgeführt werden. Als solches können, sobald bei einem Leitmolekül ein kommerzielles Potential identifiziert wurde, große Mengen dieses Moleküls einfach produziert werden.
4. Charakterisierung von Molekülen
Moleküle, die mittels der oben beschriebenen Verfahren konstruiert, ausgewählt und/oder optimiert wurden können, sobald sie hergestellt wurden, unter Verwendung einer Vielzahl von Assays charakterisiert werden, die dem Fachmann bekannt sind, um zu bestimmen ob die Verbindungen eine biologische Aktivität besitzen. Zum Beispiel können Moleküle mittels konventioneller Assays einschließend, ohne darauf limitiert zu sein, jener Assays, die unten beschrieben werden, charakterisiert werden um festzustellen, ob sie eine vorhergesagte Aktivität, Bindungsaktivität und/oder Bindungsspezifität haben.
Weiterhin kann eine Hochdurchsatzdurchmusterung verwendet werden, um die Analyse unter Verwendung solcher Assays zu beschleunigen. Als ein Resultat kann es möglich sein unter Verwendung der Werkzeuge und Verfahren der vorliegenden Erfindung, schnell neue Moleküle auf deren Fähigkeit hin zu durchmustern, mit einem Ribosom oder einer ribosomalen Untereinheit zu interagieren. Generelle Methodologien zur Durchführung einer Hochdurchsatzdurchmusterung werden, zum Beispiel, in Devlin, (1998), High Troughput Screening, Marcel Dekker; und U.S. Patent Nr. 5,763,263 beschrieben. Hochdurchsatz-Assays können eine oder mehrere verschiedene Techniken verwenden, einschließlich der unten beschriebenen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
(1) Oberflächenbindungs-Studien.
Eine Vielzahl von Bindungsassays kann zur Durchmusterung von neuen Molekülen hinsichtlich ihrer Bindungsaktivität nützlich sein. Ein Ansatz schließt die Oberflächen Plasmon Resonanz (SPR) ein, die verwendet werden kann um die Bindungseigenschaften der interessierenden Moleküle hinsichtlich eines Ribosoms, einer ribosomalen Untereinheit oder einem Fragment davon zu bewerten.
SPR Methodologien messen die Interaktion zwischen zwei oder mehreren Makromolekülen in Echtzeit durch die Erzeugung eines quanten-mechanischen Oberflächen Plasmons. En Gerät (BIAcore Biosensor RTM von Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.J.) stellt einen fokussierten Strahl polychromatischen Lichts auf die Interphase zwischen einer Goldschicht (bereitgestellt als Einweg-Biosensor „Chip") und einem Pufferkompartiment, welches durch den Benutzer reguliert werden kann, bereit. Eine 100 nm dickes „Hydrogel", bestehend aus einem carboxyliertem Dextran, das eine Matrix für die kovalente Immobilisierung der interessierenen Analyten bereitstellt, wird an der Goldschicht angebracht. Wenn das fokussierte Licht mit der freien Elektronenwolke der Goldschicht interagiert, wird die Plasmon Resonanz verstärkt. Das resultierende reflektierte Licht wird spektral um diejenigen Wellenlängen vermindert, welche die Resonanz optimal entwickelte. Durch Auftrennung des reflektierten polychromatischen Lichts (mittels eines Prismas) in seine einzelnen Wellenlängen und Bestimmung der verminderten Wellenlängen, eröffnet die BIAcore eine optische Schnittstelle, die genau das Verhalten der erzeugten Oberflächen Plasmon Resonanz zurückmeldet. Wenn wie oben konstruiert, ist die Plasmon Resonanz (und damit das Verminderungsspektrum) empfindlich gegenüber Masse im schwindenden Feld (welches ungefähr mit der Dicke des Hydrogels korrespondiert). Falls eine Komponente eines interagierenden Paars auf dem Hydrogel immobilisiert wird und der interagierende Partner mittels des Puffer-Kompartiments bereitgestellt wird, kann die Interaktion zwischen den beiden Partnern in Echtzeit gemessen werden, basierend auf der Ansammlung von Masse im schwindenden Feld und seiner korrespondierenden Effekte auf die Plasmon Resonanz wie durch das Verminderungsspektrum gemessen. Dieses System erlaubt die schnelle und empfindliche Echtzeitmessung der molekularen Interaktionen ohne die Notwendigkeit, einen der beiden Komponenten markieren zu müssen.
(2) Immunodiagnostiken und Immunoassays.
Diese sind eine Gruppe von Techniken, welche für die Messung spezifischer biochemischer Substanzen, gewöhnlich in geringen Konzentrationen in komplexen Mischungen wie biologischen Flüssigkeiten verwendet werden können, die von der Spezifität und hohen Affinität abhängen, die von geeignet hergestellten und ausgewählten Antikörpern gegenüber ihren komplementären Antigenen gezeigt werden. Eine zu messende Substanz muss, notwendigerweise, antigenisch sein – entweder ein immunogenes Makromolekül oder ein haptenes kleines Molekül. Zu jeder Probe wird ein bekannter und mengenmäßig limitierter spezifischer Antikörper hinzu gegeben und der Bruchteil des mit ihm kombinierenden Antigens, oft als die gebunden:frei Ratio angegeben, abgeschätzt unter Verwendung einer Form des Antigens markiert mit einem Radioisotop (Radioimmunoassay), fluoreszierenden Molekül (Fluoroimmunoassay), stabilen freien Radikal (Spinimmunoassay), Enzym (Enzymimmunoassay), oder anderer einfach unterscheidbarer Markierung, als Indikator.
Antikörper können auf verschiedenen Wegen markiert werden, einschließlich: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA); Radioimmunoassay (RIA); Fluoreszenzimmunoassay (FIA); Chemilumineszenzimmunoassay (CLIA); und Markierung des Antikörpers mit kolloiden Goldpartikeln (Immunogold).
Gebräuchliche Assayformate schließen den Sandwich-Assay, kompetitiven oder Kompetitionsassay, Latexagglutinationsassay, homogenen Assay, Mikrotiterplattenassay und den mikropartikelbasierten Assay ein.
(3) Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA).
Der ELISA ist eine immunochemische Technik, die die Gefahren der Radiochemikalien und den Aufwand der Fluoreszenzdetektion umgeht. Stattdessen verwendet der Assay Enzyme als Indikatoren. Der ELISA ist eine Form des quantitativen Immunoassays, basierend auf der Verwendung von Antikörpern (oder Antigenen), die mit einer unlöslichen Trägeroberfläche gekoppelt sind, die dann verwendet wird, um das relevante Antigen (oder den Antikörper) in der Testlösung zu „fangen". Der Antigen-Antikörper Komplex wird dann mittels Detektion der Aktivität eines angemessenen Enzyms gemessen, welches zuvor kovalent an das Antigen (oder den Antikörper) gebunden worden war.
Generelle Verfahren und Zusammensetzungen um einen ELISA durchzuführen sind, zum Beispiel, beschrieben in Crowther (1995) ELISA – Theory and Practice (Methods in Molecular Biology), Humana Press; Challacombe and Kemeny, (1998) ELISA and Other Solid Pahse Immunoassays – Theoretical and Practical Aspects, John Wiley; Kemeny, (1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press; Ishikawa, (1991) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay (Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology) Elsevier.
(4) Colorimetrische Assays.
Colorimetrie ist jegliches Verfahren der quantitativen chemischen Analyse, in dem die Konzentration oder Menge einer Verbindung mittels Bestimmung der Farbe, die durch die Reaktion eines Reagens mit sowohl Standard als auch Testmengen der Verbindung erzeugt wird, bestimmt wird, häufig unter Verwendung eines Coloriemeters. Ein Coloriemeter ist ein Gerät zur visuellen oder photoelektrischen Messung der Farbintensität oder der Unterschiede in der Farbintensität.
Standard-colorimetrische Assays der beta-Galaktosidaseenzymaktivität sind dem Fachmann wohlbekannt (siehe, zum Beispiel, Norton et al. (1995) Mol. Cell. Biol. 5:218-290). Ein colorimetrischer Assay kann mit Gesamtzelllysaten unter Verwendung von O-Nitrophenyl-D-Galactopyranosid (ONPG; Sigma) als Substrat in einem Standard colorimetrischen beta-Galaktosidaseassay (Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press) durchgeführt werden. Automatisierte colorimetrische Assays sind ebenfalls für die Detektion der Galaktosidaseaktivität erhältlich, wie in U.S. Patent Nr. 5,733,720 beschrieben.
(5) Immunofluoreszenzassays.
Immunofluoreszenzassays oder Immunofluoreszenzmikroskopie ist eine Technik in welcher ein Antigen oder Antikörper mittels Konjugation an einen fluoreszierenden Farbstoff fluoreszierend gemacht wurde und ihm dann erlaubt wurde, mit dem komplementären Antikörper oder Antigen in einem Gewebeschnitt oder Abstrich zu reagieren. Die Lokalisierung des Antigens oder Antikörpers kann dann mittels Beobachten der Fluoreszenz durch ein Mikroskop unter ultraviolettem Licht bestimmt werden.
Eine generelle Beschreibung immunofluoreszenter Techniken ist zum Beispiel in Knapp et al. (1978) Immunofluorescence and Related Staining Techiques, Elsevier; Allan, (1999) Protein Localization by Fluorescent Microscopy – A Practical Approach (The Practical Approach Series) Oxford University Press; Caul (1993) Immunofluorescence Antigen Detection Techniques in Diagnostic Microbiology, Cambridge University Press erschienen. Für detaillierte Erklärungen zu Immunofluoreszenztechniken, die auf die vorliegende Erfindung anwendbar sind, siehe zum Beispiel, U.S. Patent Nr. 5,912,176; U.S. Patent Nr. 5,869,264; U.S. Patent Nr. 5,866,319; und U.S. Patent Nr. 5,861,259.
(6) Fluoreszenzpolarisation.
Fluoreszenzpolarisation (FP) ist eine Messtechnik die einfach auf Protein-Protein und Protein-Ligand Wechselwirkungen angewendet werden kann, um die IC₅₀s und Kds der Assoziationsreaktion zwischen den zwei Molekülen abzuleiten. Bei dieser Technik wird eines der beiden Moleküle von Interesse mit einem Fluorophor konjugiert. Generell ist dies das kleinere Molekül im System (in diesem Fall das interessierende Molekül). Die Probenmischung, enthaltend sowohl das Liganden-Sonden Konjugat als auch das Ribosom, die ribosomale Untereinheit, oder ein Fragment davon, wird mit vertikal polarisiertem Licht angeregt. Das Licht wird durch die Sondenfluoxophore absorbiert und eine kurze Zeit später rcemittiert. Der Grad der Polarisierung des emittierten Lichts wird gemessen. Die Polarisierung des emittierten Lichts hängt von mehreren Faktoren ab, jedoch am wichtigsten, von der Viskosität der Lösung und dem apparenten Molekulargewicht des Fluorophors. Mit zweckmäßiger Kontrolle hängen Änderungen im Grad der Polarisierung des emittierten Lichts lediglich von Änderungen im apparenten Molekulargewicht des Fluorophors ab, was wiederum davon abhängig ist, ob das Sonden-Liganden Konjugat sich in freier Lösung befindet, oder an einen Rezeptor gebunden ist. Auf FP basierende Bindungsassays haben eine Reihe von wichtigen Vorteilen, einschließlich der Messung von IC₅₀s und Kds unter wahren homogenen Gleichgewichtsbedingungen, der Schnelligkeit der Analyse und der Annehmlichkeit der Automatisierung und Möglichkeit in trüben Suspensionen und gefärbten Lösungen zu durchmustern.
(7) Proteinsynthese.
Es ist beabsichtigt, dass zusätzlich zu der Charakterisierung mittels der vorhergehenden biologischen Assays, das interessierende Molekül ebenfalls als ein Modulator (zum Beispiel ein induzierendes Agens der Proteinsynthese oder ein Inhibitor der Proteinsynthese) der funktionalen Aktivität des Ribosoms oder der ribosomalen Untereinheit charakterisiert werden kann.
Inhibitoren der Proteinsynthese können auf zellulärer Ebene getestet werden. Zum Beispiel können interessierende Moleküle auf inhibitorische Funktion gegen Organismen, zum Beispiel, Mikroorganismen getestet werden, indem der interessierende Mikroorganismus in Medium wachsen gelassen wird, welches entweder das interessierende Molekül enthält oder nicht enthält. Eine Wachstumshemmung kann anzeigen, dass das Molekül als ein Proteinsyntheseinhibitor wirken kann.
Weiterhin können spezifischere Proteininhibitoren-Assays durchgeführt werden, indem die Verbindung an eine(n) ganze(n) Organismus, Gewebe, Organ, Organell, Zelle, zellulären oder subzellulären Extrakt, oder eine aufgereinigte Ribosomenpräparation verabreicht wird und seine pharmakologischen und inhibitorischen Eigenschaften durch Bestimmung von, zum Beispiel, seiner Inhibitionskonstante (IC₅₀) für die Inhibierung der Proteinsynthese, beobachtet werden. Der Einbau von ³H Leucin oder ³⁵S Methionin oder ähnliche Experimente können durchgeführt werden, um die Proteinsyntheseaktivität zu untersuchen.
Eine Änderung in der Menge oder der Rate der Proteinsynthese in der Zelle, in Gegenwart eines interessierenden Moleküls weist darauf hin, dass das Molekül ein induzierendes Agens der Proteinsynthese ist. Eine Abnahme der Rate oder der Menge der Proteinsynthese weist darauf hin, dass das Molekül ein Inhibitor der Proteinsynthese ist.
H. Wirkstoffformulierung und -verabreichung
Es ist beabsichtig, dass das erfindungsgemäße Molekül, sobald es identifiziert wurde, vor Verwendung in jegliche geeignete Trägersubstanz eingebracht werden kann. Genauer, wird die Dosis an aktivem Molekül, die Art der Verabreichung und die Verwendung einer geeigneten Trägersubstanz vom interessierenden Ziel- und nicht-Zielorganismus abhängen.
Es ist beabsichtigt, dass bezüglich von Säugetier-Empfängern, die interessierenden Verbindungen mittels jeglichem bekannten und/oder in der Technik verwendeten Ansatz verabreicht werden können. Daher kann, wie angemessen, die Verabreichung oral, parenteral, einschließlich intravenöser und intraperitonealer Verabreichungsrouten, sein. Zusätzlich kann die Verabreichung mittels periodischer Injektionen eines Bolus, oder kontinuierlicher mittels intravenöser oder intraperitonealer Verabreichung aus einem Reservoir, welches extern ist (z.B. ein intravenöser Beutel) durchgeführt werden. In bestimmten Ausführungsformen können die erfindungsgemäßen Verbindungen von therapeutischer Güteklasse sein. Dies bedeutet, dass bestimmte Ausführungsformen den Reinheitsstandards und der Qualitätskontrolle entsprechen, die für die Verabreichung an Menschen vorgeschrieben sind. Tiermedizinische Anwendungen sind ebenfalls in der hier verwendeten Bedeutung umfasst.
Die Formulierungen der Wirkstoffe gemäß der vorliegenden Erfindung, sowohl für die tiermedizinische als auch für die humanmedizinische Verwendung, umfassen typischerweise solche Wirkstoffe in Verbindung mit einer geeigneten Trägersubstanz und wahlweise (einem) anderen therapeutischen Inhaltsstoffe. Die Trägersubstanzen) sollten geeignet sein, in dem Sinn, dass sie mit den anderen Inhaltsstoffen der Formulierung verträglich sind und für den Empfänger derselben nicht schädlich sind. In dieser Hinsicht ist beabsichtigt, dass pharmazeutisch geeignete Trägersubstanzen jegliche und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Beschichtungen, antibakterielle und fungizide Agenzien, isotonische und absorptionsverzögernde Agenzien, und ähnliche beinhalten, die mit einer pharmazeutischen Verabreichung verträglich sind. Die Verwendung solcher Medien und Agenzien für pharmazeutisch aktive Substanzen ist in der Technik bekannt. Ausgenommen, insoweit als irgendein konventionelles Medium oder Agens unverträglich mit der aktiven Verbindung ist, ist dessen Verwendung in den Zusammensetzungen beabsichtigt. Ergänzende aktive Verbindungen (identifiziert oder konstruiert gemäß der Erfindung und/oder in der Technik bekannt) können ebenfalls in die Zusammensetzungen eingebracht werden. Die Formulierungen können bequem in der Form von Dosierungseinheiten vorliegen und können mittels jeglicher der in der pharmazeutischen/mikrobiologischen Technik bekannten Verfahren hergestellt werden. Im Allgemeinen werden einige Formulierungen hergestellt, indem der Wirkstoff in Verbindung mit einer flüssigen Trägersubstanz, oder einer fein zerteilten, festen Trägersubstanz, oder beidem gebracht wird und dann, falls nötig, das Produkt in die gewünschte Formulierung geformt wird.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzug sollte so formuliert sein, dass sie mit der angestrebten Verabreichungsroute verträglich ist. Beispiele für Verabreichungsrouten schließen orale oder parenterale, z.B. intravenöse, intradermale, inhalatorische, transdermale (topische), transmucosale und rektale Verabreichung ein. Lösungen oder Suspensionen, die für die parenterale, intradermale oder subcutane Anwendung verwendet werden, könne die folgenden Komponenten beinhalten: ein steriles Diluent wie Wasser zur Injektion, Salzlösung, fixierte Öle, Polyethylenglykole, Glyzerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Agenzien, wie Benzylalkohol oder Methylparabene; Antioxidanzien, wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; chelatierende Agenzien, wie Ethylendiamintetracssigsäure; Puffer, wie Azetate, Citrate oder Phosphate und Agenzien für die Einstellung der Oberflächenspannung, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Der pH kann mittels Säuren oder Basen, wie Salzsäure oder Natriumhydroxid eingestellt werden.
Nützliche Lösungen für die orale oder parenterale Verabreichung können mittels jeglichem der in der pharmazeutischen Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, wie zum Beispiel beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences, (Gennaro, A. ed.) Mack Pub., (1990). Formulierungen für die parenterale Verabreichung können ebenfalls Glycocholat für die buccale Verabreichung, Methoxysalicylat für die rektale Verabreichung, oder Zitronensäure für die vaginale Verabreichung, einschließen. Das parenterale Präparat kann in Ampullen, Einwegspritzen oder Mehrdosenfläschchen aus Glass oder Plastik enthalten sein. Zäpfchen für die rektale Verabreichung können ebenfalls durch Mischen des Wirkstoffs mit einem nichtreizenden Arzneiträger, wie Kakaobutter, anderen Glyzeriden, oder Zusammensetzungen, die bei Raumtemperatur fest und bei Körpertemperaturen flüssig sind, hergestellt werden. Die Formulierungen können zum Beispiel ebenfalls Polyalkylenglykole, wie Polyethylenglykol, Öle pflanzlichen Ursprungs, hydrogenierte Naphtalene und ähnliche, enthalten. Formulierungen zur direkten Verabreichung können Glyzerol und andere Zusammensetzung mit hoher Viskosität einschließen. Andere potentiell nützliche parenterale Trägersubstanzen für diese Wirkstoffe schließen Ethylen-Vinyl Acetat Kopolymerpartikel, osmotische Pumpen, implantierbare Infusionssysteme und Liposomen ein. Formulierungen zur inhalatorischen Verabreichung können als Arzneiträger zum Beispiel Laktose enthalten, oder können wässrige Lösungen sein, enthaltend zum Beispiel Polyoxythylen-9-Lauryläther, Glycocholat und Deoxycholat, oder ölige Lösungen zur Verabreichung in Form von Nasentropfen, oder als ein Gel zur intranasalen Anwendung. Für längeres Verhalten bestimmte Einläufe können ebenfalls für die rektale Verabreichung verwendet werden.
Erfindungsgemäße Formulierungen, die für die orale Verabreichung geeignet sind können in der Form von separaten Einheiten, wie Kapseln, Gelatinekapseln, Päckchen, Tabletten, runden Tabletten, oder Lutschtabletten vorliegen, von der jede eine vorherbestimmte Menge des Wirkstoffs enthält; in Form von Puder oder Granulat; in Form einer Lösung oder einer Suspension in einer wässrigen Flüssigkeit oder nicht-wässrigen Flüssigkeit; in Form einer Öl-in-Wasser Emulsion oder einer Wasser-in-Öl Emulsion. Der Wirkstoff kann auch in Form eines Bolus, einer Latwerge oder Paste verabreicht werden. Eine Tablette kann durch Pressen oder Formen des Wirkstoffs, optional mit einem oder mehreren zusätzlichen Inhaltsstoffen, hergestellt werden. Komprimierte Tabletten können durch Kompression des Wirkstoffs in einer freifließenden Form, wie Puder oder Granulat, optional vermischt mit einem Arzneiträger, Feuchthaltemittel, inerten Diluent, oberflächenaktiven oder zerstreuenden Agens, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden. Geformte Tabletten können durch Formung einer Mischung des pudrigen Wirkstoffs und einer geeigneten Trägersubstanz, die mit einem inerten flüssigen Feuchthaltemittel angefeuchtet wurde, in einer geeigneten Maschine hergestellt werden.
Orale Zusammensetzungen enthalten im Allgemeinen ein inertes Diluent oder eine essbare Trägersubstanz. Zum Zweck der oralen therapeutischen Verabreichung, kann die aktive Verbindung mit Arzneiträgern vereinigt werden. Orale Zusammensetzungen, die unter Verwendung einer flüssigen Trägersubstanz für den Gebrauch als Mundspülung hergestellt wurden, enthalten die Zusammensetzung in einer flüssigen Trägersubstanz und werden oral angewendet und zur Spülung verwendet und ausgespuckt, oder geschluckt. Pharmazeutisch verträgliche Bindungsagenzien und/oder förderliche Materialien können als Teil der Zusammensetzung enthalten sein. Die Tabletten, Pillen, Kapseln, runden Tabletten und ähnliche können jeglichen der folgenden Inhaltsstoffe oder Zusammensetzungen ähnlicher Art enthalten: ein Arzneiträger, wie mikrokristalline Cellulose, Tragantgummi oder Gelatine; ein Arzneiträger wie Stärke oder Laktose; ein sich auflösendes Agens wie Algininsäure, Primogel oder Maisstärke; ein Feuchthaltemittel wie Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Fließregulierungsmittel, wie kolloides Silikondioxid; ein Süßungsmittel, wie Saccharose oder Saccharin; oder ein Geschmacksmittel wie Pfefferminz, Methylsalicylate oder Orangengeschmack.
Pharmazeutische Zusammensetzungen, die für die Injektion geeignet sind, verwenden sterile wässrige Lösungen (wenn wasserlöslich) oder Dispersionen und sterile Puder für die unvorbereitete Herstellung für sterile, injizierbare Lösungen und Dispersionen. Für die intravenöse Verabreichung schließen geeignete Trägersubstanzen physiologische Kochsalzlösung, bakteriostatisches Wasser, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) oder phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ein. In allen Fällen sollte die Zusammensetzung steril sein und flüssig sein, in dem Maße, als das eine einfache Injizierbarkeit vorhanden ist. Es sollte unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und gegen die kontaminierenden Einflüsse von Mikroorganismen wie Bakterien und Pilzen aufbewahrt werden. Die Trägersubstanz kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, das, zum Beispiel, Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und ähnliche) und geeignete Mischungen davon enthält. Die richtige Fluidität kann aufrechterhalten werden, zum Beispiel, mittels Verwendung einer Beschichtung, wie Lecithin, durch Aufrechterhaltung der benötigten Partikelgröße im Falle einer Dispersion und mittels Verwendung von Tensiden. Die Verhinderung von Einflüssen von Mikroorganismen kann erzielt werden durch verschiedenartige antibakterielle und fungizide Agenzien, zum Beispiel, Parabene, Chlorobutanol, Phenol, Ascorbinsäure, Thimerosal und ähnliche. In vielen Fällen werden vorzugsweise isotonische Agenzien, wie Zucker, Polyalkohole, wie Manitol, Sorbitol, Natriumchlorid in die Zusammensetzung eingearbeitet. Eine anhaltende Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch Einarbeitung eines Agens, das die Absorption verlangsamt, in die Zusammensetzung erreicht werden, zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine.
Sterile injizierbare Lösungen können durch Einbringen der aktiven Verbindung in der benötigten Menge in ein angemessenes Lösungsmittel hergestellt werden, mit einem oder einer Kombination der oben aufgezählten Inhaltsstoffe nach Bedarf, gefolgt von Sterilfiltrierung. Im Allgemeinen werden Dispersionen hergestellt, indem die aktive Verbindung in einen sterilen Arzneiträger eingebracht wird, das ein einfaches Dispersionsmedium und die benötigten der oben aufgezählten Inhaltsstoffe enthält. Im Fall von sterilen Pudern zur Herstellung von sterilen injizierbaren Lösungen, schließen die Methoden der Herstellung Vakuumtrocknung und Gefriertrocknung ein, welche zu einem Puder des aktiven Inhaltsstoffs puls zusätzlich gewünschter Inhaltsstoffe von einer zuvor sterilfiltrierten Lösung davon führt.
Geeignete Formulierungen für die intra-artikulare Verabreichung können in Form eines sterilen, wässrigen Präparats des Wirkstoffs vorliegen, der in mikrokristalliner Form sein kann, zum Beispiel in der Form einer wässrigen mikrokristallinen Suspension. Liposomale Formulierungen oder biologisch abbaubare Polymersysteme können ebenfalls verwendet werden, um den Wirkstoff für sowohl die intra-artikulare als auch ophtalmische Verabreichung bereitzustellen.
Für die topische Verabreichung geeignete Formulierungen, einschließlich der Augenbehandlung, enthalten flüssige oder halbflüssige Präparate, wie Einreibemittel, Lotionen, Gele, Trägersubstanzen, Öl-in-Wasser oder Wasser-in-Öl Emulsionen, wie Cremes, Salben oder Pasten; oder Lösungen oder Suspensionen wie Tropfen. Formulierungen für die topische Verabreichung an die Hautoberfläche können durch Dispersion des Wirkstoffs mit einer dermatologisch verträglichen Trägersubstanz, wie einer Lotion, Creme, Salbe oder Seife, hergestellt werden. Besonders nützlich sind Trägersubstanzen, die in der Lage sind, einen Film oder eine Schicht über der Haut zu bilden um die Aufbringung zu lokalisieren und die Entfernung zu verhindern. Für die topische Verabreichung an interne Gewebsoberflächen kann das Agens in einem flüssigen Gewebsadhesiv oder anderen Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie die Absorption an eine Gewebsoberfläche verbessern, verteilt werden. Zum Beispiel können Hydroxypropylcellulose oder Fibrinogen/Thrombin Lösungen zum Vorteil genutzt werden. Alternativ können gewebe-ummantelnde Lösungen, wie Pektin enthaltende Formuierungen, verwendet werden.
Für Inhalationsbehandlungen kann die Inhalation von Puder (aus eigener Kraft angetrieben oder Spray-Formulierungen), die mittels einer Sprühflasche, eines Verneblers oder eines Atomisierers verteilt werden, verwendet werden. Solche Formulierungen können in Form eines feinen Puders vorliegen, für die pulmonale Verabreichung mittels eines Puderinhalationsgeräts oder mittels aus eigener Kraft angetriebener puder-verteilender Formulierungen. Im Fall einer aus eigener Kraft angetriebenen Lösung und Spray-Formulierungen kann der Effekt entweder durch die Wahl eines Ventils mit den gewünschten Sprüheigenschaften (d.h. in der Lage seiend, ein Spray mit der gewünschten Partikelgröße zu erzeugen) oder durch Einarbeiten des aktiven Inhaltstoffs als ein suspendiertes Puder in einer kontrollierten Partikelgröße erreicht werden. Für die Verabreichung durch Inhalation, können die Verbindungen ebenfalls in der Form eines Aerosolsprays aus einem unter Druck stehenden Gefäß oder Spender bereitgestellt werden, der ein geeignetes Treibmittel, z.B. ein Gas wie Kohlendioxid enthält, oder einem Vernebler.
Die systemische Verabreichung kann auch über den transmucosalen oder transdermalen Weg erfolgen. Für die transmucosale oder transdermale Verabreichung werden Durchdringungsmittel, die der zu durchdringenden Barriere angemessen sind, verwendet. Solche, im Allgemeinen in der Technik bekannten Durchdringungsmittel, schließen ein, zum Beispiel, für die transmucosale Verabreichung Detergenzien, Gallensalze und Fusidinsäurederivate. Die transmucosale Verabreichung kann durch Verwendung von Nasensprays oder Zäpfchen erreicht werden. Für die transdermale Verabreichung, werden die aktiven Verbindungen in Salben, Wundsalben, Gelen oder Cremes eingearbeitet, wie im Allgemeinen in der Technik bekannt.
Die aktiven Verbindungen können mit Trägersubstanzen hergestellt werden, die die Verbindung gegen ein schnelle Ausscheidung aus dem Körper schützen, wie Formulierungen für die kontrollierte Abgabe, einschließlich Implantate und mikroverkapselte Versorgungssysteme. Biologisch abbaubare, biokompatible Polymere können verwendet werden, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, polyglykolische Säure, Kollagen, Polyorthoester und polylaktische Säure. Die Verfahren zur Herstellung solcher Formulierungen werden dem Fachmann offensichtlich sein. Die Materialien sind kommerziell erhältlich von Alza Corporation und Nova Pharmaceuticals, Inc. Liposomale Suspensionen können ebenfalls als pharmazeutisch verträgliche Trägersubstanzen verwendet werden. Diese können gemäß den Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind hergestellt werden, zum Beispiel wie beschrieben in U.S. Patent Nr. 4,522,811. Microsomen und Micropartikel können ebenfalls verwendet werden.
Orale oder parenterale Zusammensetzungen können zur Einfachheit der Verabreichung und Gleichheit der Dosierung in Dosierungseinheitsform hergestellt werden. Die Dosierungseinheitsform bezieht sich auf physikalisch diskrete Einheiten, die als Einzelgaben für das zu behandelnde Subjekt geeignet sind; jede Einheit enthaltend eine vorherbestimmte Quantität der aktiven Verbindung, von der errechnet wurde, dass sie den gewünschten therapeutischen Effekt in Verbindung mit der benötigten pharmazeutischen Trägersubstanz erzielt. Die Festlegung der erfindungsgemäßen Dosierungseinheitsform werden von den einzigartigen Charakteristika der aktiven Verbindung und dem bestimmten zu erzielenden therapeutischen Effekt und den inhärenten Limitierungen der Technik zum Verbinden einer solchen Verbindung für die Behandlung von Individuen diktiert und sind davon direkt abhängig.
Wie oben erwähnt, können die erfindungsgemäß identifizierten und konstruierten Wirkstoffe in pharmazeutische Zusammensetzungen durch Vermischung mit pharmazeutisch verträglichen nichtgiftigen Arzneiträgern und Trägersubstanzen hergestellt werden. Solche Zusammensetzungen können für die parenterale Verabreichung, vor allem in Form von flüssigen Lösungen oder Suspensionen hergestellt werden; für die orale Verabreichung, vor allem in Form von Tabletten und Kapseln; oder intranasal, vor allem in Form von Pudern, Nasentropfen oder Aerosolen. Wenn die Adhäsion an eine Gewebsoberfläche erwünscht ist, kann die Zusammensetzung den in einer Fibrionogen-Thrombin Zusammensetzung oder anderem Bioadhäsiv verteilten Wirkstoff enthalten. Der Wirkstoff kann dann aufgetragen, gesprüht oder anderweitig auf die gewünschte Gewebsoberfläche aufgebracht werden. Alternativ können die Wirkstoffe für die parenterale oder orale Verabreichung an Menschen oder andere Säugetiere hergestellt werden, zum Beispiel, in therapeutisch wirksamen Mengen, z.B. Mengen, die eine angemessene Konzentration des Wirkstoffs an das Zielgewebe für eine Zeitdauer bereitstellen, die ausreichend sind, den gewünschten Effekt zu erzeugen.
Falls die aktive Verbindung innerhalb eines Transplantationsvorgangs verwendet werden soll, kann sie dem lebenden Gewebe oder Organ, das zu transplantieren ist, vor der Entfernung des Organs vom Spender beigebracht werden. Der Wirkstoff kann dem Spenderwirt beigebracht werden. Alternativ, oder zusätzlich, kann das Organ oder das lebende Gewebe nach Entfernung vom Spender in einer Erhaltungslösung, enthaltend die aktive Verbindung, eingelegt werden. In allen Fällen kann die aktive Verbindung direkt an das gewünschte Gewebe verabreicht werden, wie mittels Injektion in das Gewebe, oder sie kann systemisch bereitgestellt werden, entweder mittels oraler oder parenteraler Verabreichung unter Verwendung jeglicher der Verfahren und Formulierungen, die hier beschrieben und/oder in der Technik bekannt sind.
Falls der Wirkstoff einen Teil einer Gewebs- oder Organerhaltungslösung umfasst, kann jede kommerziell erhältliche Erhaltungslösung vorteilhaft verwendet werden. Zum Beispiel schließen nützliche, in der Technik bekannte Lösungen die Collins Lösung, Wisconsin Lösung, Belzer Lösung, Eurocollins Lösung und die laktierte Ringer Lösung ein.
Die wirksame Konzentration der Verbindung, die in einer therapeutischen Zusammensetzung verabreicht wird, variiert abhängig von einer Anzahl von Faktoren, einschließlich der abschließenden gewünschten Dosis der Verbindung, die verabreicht werden soll und der Verabreichungsroute. Die bevorzugte, zu verabreichende Dosis hängt wahrscheinlich auch von solchen Variablen wie der Art und dem Ausmaß der Krankheit oder der zu behandelnden Indikation, dem Gesamtgesundheitsstatus des bestimmten Patienten, der relativen biologischen Wirksamkeit der zu verabreichenden Verbindung, der Formulierung des Wirkstoffs, der Gegenwart und der Art von Arzneimittelträgern in der Formulierung und der Verabreichungsroute ab. Allgemein ausgedrückt, kann der erfindungsgemäße Wirkstoff einem Individuum unter Verwendung von typischen Dosiseinheiten, die aus früher beschriebenen Säugetierstudien mit Verwendung von nicht-humanen Primaten und Nagern abgeleitet wurden, verabreicht werden.
Falls die aktiven Verbindungen Nukleinsäuremoleküle sind, kann die Nukleinsäure in Vektoren integriert und als Gentherapievektoren verwendet werden. Gentherapievektoren können einem Subjekt mittels, zum Beispiel, intravenöser Injektion, lokaler Verabreichung (siehe U.S. Pat. Nr. 5,328,470) oder mittels stereotaktischer Injektion (siehe z.B. Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057) verabreicht werden. Das pharmazeutische Präparat des Gentherapievektors kann den Gentherapievektor in einem verträglichen Diluent enthalten, oder kann eine Matrix für die langsame Abgabe umfassen, in welcher das Genzuführungsvehikel eingebettet ist. Alternativ, kann das pharmazeutische Präparat, wenn das gesamte Genzuführungsvehikel intakt aus rekombinaten Zellen produziert werden kann, z.B. retrovirale Vektoren, eine oder mehrere Zellen, die das Genzuführungsvehikel produzieren, enthalten.
Wenn die erfindungsgemäße aktive Verbindung für die Verabreichung an einen Pflanzenwirt vorgesehen ist, kann die Erfindung direkt auf die Pflanzenumgebung angewendet werden, z.B. auf die Oberfläche der Blätter, Knospen, Wurzeln oder Teile der Blüte. Alternativ kann die vorliegende Erfindung als Samenummantelung verwendet werden. Die Bestimmung einer wirksamen, wie benötigten, Menge der vorliegenden Erfindung für eine bestimmte Pflanze liegt innerhalb der Fähigkeiten des Fachmanns und hängt von solchen Faktoren wie der Pflanzenart, der Anpflanzungsmethode und der Art des Bodens ab. Es ist beabsichtigt, dass Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Wirkstoffe enthalten, mittels Formulierung solcher Wirkstoffe mit Adjuvanzien, Diluenten, Trägern etc. hergestellt werden können, um die Zusammensetzungen in der Form von Füllungen/geteilter partikulärer Feststoffe, Granulate, Pellets, befeuchtbare Puder, Staub, wässrige Suspensionen oder Dispersionen und Emulsionen bereitzustellen. Es ist weiterhin beabsichtigt, solche Wirkstoffe in eingekapselter Form zu verwenden, zum Beispiel können die Wirkstoffe eingekapselt werden innerhalb eines Polymers, von Gelatine, Lipiden oder andere Formulierungshilfen, wie Emulgatoren, Tensiden, Befeuchtungsmitteln, Antischaumagenzien und Gefrierschutzagenzien können in solche Zusammensetzungen eingearbeitet werden, vor allem, wenn solche Zusammensetzungen für eine beliebige Zeitspanne vor der Verwendung gelagert werden. Die Anwendung von Zusammensetzungen, die die erfindungsgemäßen Wirkstoffe als aktives Agens enthalten, können mittels konventioneller Techniken ausgeführt werden. Wenn die Verabreichung einer aktiven Verbindung an einen Insektenwirt beabsichtigt ist, werden Standardverfahren wie, aber nicht limitiert auf, Verbreitung durch die Luft in Erwägung gezogen.
Aktive, durch ein erfindungsgemäßes Verfahren identifizierte oder konstruierte Verbindungen schließen ebenfalls Vorläufer der aktiven Verbindung ein. Der Begriff Vorläufer bezieht sich auf ein pharmakologisch inaktives (oder teilweise inaktives) Derivat eines Ausgangsmoleküls, das innerhalb des Organismus entweder spontaner oder enzymatischer Biotransformation bedarf, um die aktiven Zusammensetzungen freizusetzen. Vorläufer sind Variationen oder Derivate der erfindungsgemäßen Verbindungen, die unter Stoffwechselbedingung spaltbare Gruppen haben. Vorläufer werden zu den erfindungsgemäßen aktiven Verbindungen, die in vivo pharmazeutisch aktiv sind, wenn sie eine Solvolyse unter physiologischen Bedingungen oder einen enzymatische Abbau erfahren. Vorläuferformen bieten häufig die Vorteile der Löslichkeit, Gewebsverträglichkeit oder der verzögerten Freisetzung im Organismus des Säugetiers (siehe Bundgard, Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevir, Amsterdam (1985); und Silverman, The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, pp. 352-401, Academic Press, San Diego, CA (1992).
Aktive, durch die hierein beschriebenen Verfahren identifizierte oder konstruierte Verbindungen, können an Individuen verabreicht werden, um Erkrankungen zu behandeln (prophylaktisch oder therapeutisch). In Zusammenhang mit einer solchen Behandlung können die Pharmacogenomics betrachtet werden (d.h. das Studium der Beziehung zwischen dem Genotyp eines Individuums und dem Ansprechen des Individuums auf eine fremde Verbindung oder einen fremden Wirkstoff). Unterschiede in der Verstoffwechslung der Therapeutika können zu ernster Toxizität oder therapeutischem Misserfolg führen, durch Veränderung der Beziehung zwischen Dosis und Blutkonzentration des pharmakologisch aktiven Wirkstoffs. Daher kann ein Arzt oder klinischer Arzt in Betracht ziehen, das in relevanten pharmacogenomischen Studien erworbene Wissen bei der Bestimmung, ob ein Wirkstoff angewendet werden sollte, sowie bei der Einstellung der Dosierung und/oder der therapeutischen Kur der Behandlung mit dem Wirkstoff, anzuwenden.
Im Hinblick auf Säugetiere ist es beabsichtigt, dass die wirksame Dosis eines Proteinsynthese induzierenden Agens, oder Inhibitors im Bereich von ungefähr 0.01 bis ungefähr 50 mg/kg, vorzugsweise ungefähr 0.1 bis ungefähr 10 mg/kg Körpergewicht liegt, die in einer einzelnen oder mehreren Dosen verabreicht wird. Typischerweise kann das induzierende Agens oder der Inhibitor einem humanen, behandlungsbedürftigen Empfänger, in einem täglichen Dosierungsbereich von ungefähr 1 bis ungefähr 2000 mg pro Patient verabreicht werden.
Im Lichte der vorhergehenden generellen Diskussion sind die untenstehenden Beispiele nur illustrativer Art und sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken. Andere generische und spezifische Konfigurationen werden für den Fachmann offenkundig sein.
III. Beispiele
A. Beispiel 1: Präparation von Kristallen der 50S ribosomalen Untereinheit
H. marismortui (ATCC 43049) wurde, wie zuvor beschrieben (Ban et al. (1998) supra) auf einer etwas modifizierten Version des ATCC Kulturmediums 1230, das mit 4.3 g Hefeextrakt, 5.1 g Tris und 3.4 g Glukose pro Liter supplementiert war, angezogen. Die Bakterien wurden bei 37°C bis zu einer OD_550nm zwischen 1.0 und 2.2 angezogen. Sie wurden durch Zentrifugation geerntet und bei –80°C aufbewahrt. Die Zellen wurden mittels einer French Press aufgeschlossen. Die Ribosomen wurden durch Zentrifugation aus den Lysaten gewonnen und die Untereinheiten in Saccharosegradienten isoliert (Shevack et al. (1985) FEBS Lett. 184:68-71).
1. Reverse Extraktion

(1) Nehme 1 mg der Untereinheiten eines konzentrierten 50S ribosomalen Untereinheiten-Vorrats (30 mg/ml in 1.2 M KCl, 0.5 M NH₄CL, 20 mM MgCl₂, Tris 10 mM, CdCl₂ 1 mM, Tris 5 mM, pH 7.5) und vermische dies mit ½ vol. 30% PEG6000 (300 g PEG, 700 ml H₂O um 1 Liter 30% PEG zu ergeben; filtriere durch ein 0.2 μm Filter). Für 1 bis 2 hr auf Eis stehen lassen.
(2) Das Präzipitat für ungefähr 30 Sekunden unter Verwendung einer Tischzentrifuge herunterzentrifugieren.
(3) Den Überstand entfernen und 100 μl RE-Puffer: 7% PEG6000, 1.2 M KCl, 0.5 M NH₄Cl, 100 mM KAc, 30 mM MgCl₂, 10 mM Tris, 10 mM MES (pH 7.5) und 1 mM CdCl₂ hinzugeben.
(4) Das Pellet bei Raumtemperatur resuspendieren durch Mischen mit einer P200 Pipette, die auf 50 μl eingestellt ist. Das resuspendierte Material sollte leicht trübe erscheinen.
(5) Die Eppendorf-Reagenzröhrchen in Aluminiumfolie einwickeln und zur Äquilibrierung für 30-60 min bei Raumtemperatur belassen. Die Lösung wird mit 50S gesättigt sein.
(6) Für 2 Minuten in der Tischzentrifuge bei Raumtemperatur herunterzentrifugieren, den Überstand in ein neues Eppendorf-Reagenzröhrchen überführen. Etwas Pellet sollte im Reagenzröhrchen, das für die Zentrifugation verwendet wurde, gefunden werden. Bewahre den Überstand bei Raumtemperatur auf.
(7) Bringe 8-10 μl des Überstands in die Probenvertiefung eines Sitzender-Tropfen-Kastens (Charles-Supper). Nach einer Stunde Keime von einem Keim-Vorrat einstreichen. Der Keim-Vorrat wird durch Einbringen von zuvor hergestellten Kristallen in einen Stabilisierungspuffer A (siehe unten), und anschließendem heftigen Vortexen hergestellt. Um Keime einzustreichen, wird ein menschliches Haar, das mit Wasser und Ethanol gereinigt und danach getrocknet wurde, durch die gevortexte Lösung geführt und danach mit den neuen Kristallisationstropfen in Verbindung gebracht. Die Tropfen sollten trübe aussehen. Die Reservoirs in den Sitzender-Tropfen-Kästen enthalten 1000 μl einer Lösung enthaltend 8% PEG6000, 1.2 M KCl, 0.5 M NH₄Cl, 100 mM KAc, 6.5 mM HAc (ergibt pH 5.8), 30 mM MgCl₂ und 1 mM CdCl₂.
(8) Nach einem Tag überprüfen, ob die Keimung gelungen ist. Wenn ja, den Kristall für drei Wochen wachsen lasssen.

2. Stabilisierungsprotokoll
Wenn die Kristalle mit dem Wachsen fertig sind (nach ungefähr 3 Wochen) wird jeder Sitzender-Tropfen-Kasten geöffnet, indem nur ein einziger Schnitt (Schlitz), der von der Mitte zu der Kante der Vertiefungen reicht gemacht wird. Durch diesen engen Schlitz werden 10 μL Puffer A (1.2 M KCl, 0.5 M NH₄Cl, 30 mM MgCl₂, 10% PEG6000, 1 mM CdCl₂, 100 mM KAc, 10 mM Tris (titriert auf einen End-pH von 6.1), 30 mM MES) bei Raumtemperatur zu jedem Tropfen hinzugegeben und 45 μl von Puffer C (0.667 M MES, 0.333 M Tris) in jedes Reservoir hinzugefügt.
Die Kästen werden in eine Plastikkiste mit Deckel gegeben und in einen 16°C Inkubator für ungefähr einen Tag gestellt und dann für einen weiteren Tag nach 12°C überführt. Die Plastikkiste wird dann in einen Styroporbehälter mit Deckel gegeben und für einen weiteren Tag in einen Kühlraum gestellt. Kristalle können auf diese Weise für eine Lange Zeit aufbewahrt werden, müssen jedoch vor Verwendung einem weiteren Puffertausch unterzogen werden.
Folgende Übergangsserien werden unter Verwendung von Puffer A und Puffer B (1.7 M NaCl, 0.5 M NH₄Cl, 30 mM MgCl₂, 1 mM CdCl₂, 12% PEG6000, 20% EG, 100 mM KAC (titriert auf einen End-pH von 5.8 mit HAC) hergestellt um Endverhältnisse von Puffer B zu Puffer A von: 1/16, 1/8, ¼, ½, ¾, zu erreichen. Alle Lösungen sollten sich bei Raumtemperatur befinden. Alle Manipulationen an den Tropfen werden durch den engen Schlitz vorgenommen.

(1) 40 μl „1/16" zum Tropfen hinzugeben und für 15 Minuten ruhen lassen.
(2) 40 μl „1/8" zum Tropfen hinzugeben und für 30-60 Minuten ruhen lassen.
(3) 40 μl aus dem Tropfen entnehmen (im Reservoir entsorgen), 40 μl „1/4" hinzugeben und für 30-60 Minuten ruhen lassen.
(4) 40 μl aus dem Tropfen entnehmen (im Reservoir entsorgen), 40 μl „1/2" hinzugeben und für 15 Minuten ruhen lassen.
(5) 40 μl aus dem Tropfen entnehmen (im Reservoir entsorgen), 40 μl „ 3/4" hinzugeben und für 15 Minuten ruhen lassen.
(6) 40 μl aus dem Tropfen entnehmen (im Reservoir entsorgen), 40 μl Puffer B hinzugeben und für 15 Minuten ruhen lassen.
(7) 60-80 μl aus dem Tropfen entnehmen (im Reservoir entsorgen), 60-80 μl Puffer B hinzugeben und Reservoirs mit 500 μl Puffer B ersetzen..

B. Beispiel 2: Bestimmung der Kristallstruktur der 50S ribosomalen Untereinheit, mit anfänglicher Verfeinerung
Alle Daten, mit Ausnahme der zwei nativen Datensätze, wurden am National Synchrotron Light Source (Brookhaven) aus bei 100 K gefrorenen Kristallen und unter Verwendung der Strahllinien X12b und X25 und aufgezeichnet unter Verwendung einer 345 mm MAR Bilddarstellungsplatte, gesammelt. Für jedes Schweratomderivat wurden anomale Beugungsdaten bei der Wellenlänge, die mit der spitzenanomalen Streuung korrespondieren, gesammelt. Die Strahlgtöße betrug 100 × 100 μm für die meisten Datensammlungen bei X25 und 200 × 200 μm für Strahllinie X12b. Die Kristalle wurden entlang der langen Achse der Einheitszelle (570 Å) ausgerichtet, sodass 1.0° Oszillationen verwendet werden konnten, um Reflexionen bis zu einem Maximum von 2.7 Å Auflösung auf der Kante des MAR Detektors zu sammeln. Bei Strahllinie X12b variierte die Distanz von Kristall zu Detektor zwischen 450.0 mm und 550.0 mm, abhängig von Wellenlänge, Kristallqualität und Strahldivergenz und sie wurde so ausgewählt, dass Daten maximaler Auflösung gesammelt werden konnten, während ein Überlapp der Punkte vermieden wurde. Bei Strahllinie X25 wurde der Detektor auf einer starren Plattform bei 480 mm positioniert, was eine Datensammlung bis 3.2 Å für Iridium- und Osmiumderivate erlaubte, wobei die Wellenlänge auf die anomale Kante gesetzt war. Native Daten bis 2.4 Å Auflösung wurden bei der strukturbiologischen Strahllinie ID19 der Advanced Photon Source (Argonne) unter Verwendung eines CCD Detektors (etc.) gesammelt. Die Datensätze wurden mittels DENZO und SCALEPACK (Otwinowski, (1993) Data Collection and Processing) verarbeitet.
Die auf Schweratomen basierende Phasengebung wurde bis zu einer 3.2 Å Auflösung erweitert mittels der Kombination von MIR Phasen, die für zwei unterschiedlich isomorphe Datengruppen (MIR1 und MIR2, Tabelle 1) berechnet wurden, mit einzelnen derivativanomalen Dispersionsphasen (SAD). Die besten zwei Derivate waren Osmiumpentamin und Irridiumhexamin, wovon jedes der beiden eine große Anzahl von Bindestellen besaß (Tabelle 1). Viele andere Derivative mit kleinerer Anzahl von Stellen verbesserten zusätzlich die Kartenqualität. Die gesamte Phasierung wurde mittels maximum likelihood Verfahren, implementiert in CNS (Brünger et al. (1998) supra) durchgeführt, mit Ausnahme der Ta₆Br₁₂ Derivative, die in SHARP (de La Fortelle, (1997) Meth. Enzymol. 276:472-494) verfeinert wurden, dargestellt als sphärische mittlere Elektronendichte (Tabelle 1). Die Phasen wurden durch Lösungsmitteltausch (Abrahams et al. (1996) supra) verbessert und ausgedehnt von 3.3 Å auf 2.4 Å und Modelle wurden gebaut.
C. Beispiel 3: Präparation von Kristallen des 50S ribosomalen Untereinheiten/Puromycin Komplex und Sammlung von Röntgenstrahlen Beugungsdaten
Kristalle der 50S ribosomalen Untereinheiten wurden, wie früher beschrieben, gezüchtet und stabilisiert. CCdA-p-Puromycin (siehe 9A) war ein großzügiges Geschenk von Michael Yarus (Welch, et al. (1995) supra). Oligonukleotide von amino-N-acylierten Minihelices (siehe 9B) wurden durch Dharmacon synthetisiert. Nach Entschützung wurden die Oligonukleotide kurz auf 100°C erhitzt und auf Eis schockgekühlt um wieder zu annealen. Kristalle der ribosomalen 50S Untereinheit wurden stabilisiert und vor der Cryovitrifikation in flüssigem Propan und Sammlung von Röntgenstrahlbeugungsdaten danach für 24 Stunden in Stabilisierungspuffer plus 100 μM CCdA-p-Puromycin oder amino-N-acylierten Minihelices eingelegt. Die Phasen wurden über die Dichtemodifikation berechnet (CNS), beginnend mit den besten experimentalen Phasen unter Verwendung von 2F₀(analog)-F₀(nativ) als Amplituden, von 60.0 bis 3.2 Å. (Native Amplituden stammten vom am meisten isomorphen nativen Datensatz 1, ausgenommen für diejenigen Amplituden, die lediglich im kompletteren nativen Datensatz 2 enthalten waren. Berechnete 2F₀-F₀ Amplituden, die geringer waren als das doppelte der korrespondierenden berechneten, wurden durch F₀(analog) ersetzt). Danach wurden Karten unter Verwendung der Phasen aus der Dichte, modifiziert durch 2F₀(analog)-F₀(nativ) oder F₀(analog)-F₀(nativ)Amplituden, berechnet.
D. Beispiel 4: Antibiotikabindestellen, die im Polypeptid-Ausgangstunnel nahe dem Peptidyltransferasezentrum lokalisiert sind
Kristalline Komplexe der großen Untereinheit von H. marismortui, komplexiert mit drei Antibiotika wurden bei etwa 3.0 Å Auflösung ermittelt. Die Elektronendichtekarten bei dieser Auflösung erlaubten uns, die Antibiotika Tylosin, Carbomycin und Anisomycin in etwa auf dem Ribosom zu positionieren. Wir beobachteten, dass diese Antibiotika alle an eine Region des Ribosoms binden, die zwischen dem Peptidyltransferasezentrum, wie durch den Yarus Inhibitor CCdA-p-Puromycin definiert, und den Spitzen der Proteine L22 und L4 an dem Punkt, in dem sie eine kleine Öffnung im Polypeptid-Ausgangstunnel bilden, liegt. Die allgemeine Lokalisierung dieser Haupt-Antibiotikabindestelle ist in 19 gezeigt. Tylosin und Carbomycin scheinen über ein Blockieren des Austritts des neu synthetisierten Polypeptids zu funktionieren. Anisomycin blockiert die A Stelle.
Es ist wegen der Ähnlichkeit der beiden Moleküle vorgesehen, dass das Antibiotikum Erythromycin an fast genau dieselbe Stelle wie Tylosin bindet und weil Erythromycin-Resistenzmutationen in sowohl der Spitze des L4 Proteins als auch in Teilen der RNA nahe der Tylosinbindestelle bekannt sind.
Die große Mehrzahl der Wechselwirkungen zwischen jenen Antibiotika und dem Ribosom finden durch die rRNA statt, die die A Stelle und die Oberfläche des Tunnels zwischen Peptidyltransferasezentrum und Protein L22 bildet. Da diese Antibiotika nicht identisch binden, wird es viele zusätzliche Wege geben, auf die Verbindungen kleiner Moleküle unter Verwendung der Werkzeuge und Methodologien der vorliegenden Erfindung konstruiert werden können, um in dieser Region zu binden. Zum Beispiel wird es möglich sein, durch Verbindung von Komponenten von jedem der verschiedenen Antibiotika, die an nicht-überlappende Stellen binden, neue Antibiotika zu kreieren (siehe Beispiel 6). Zusätzlich werden wir, basierend auf den Prinzipien der Interaktion von kleinen Molekülen und RNA, die durch diese Antibiotikakomplexe gezeigt werden, in der Lage sein, gänzlich neue kleine Moleküle zu konstruieren, die an diese Stellen des Ribosoms binden, sowie an andere potentielle RNA Ziele.
E. Beispiel 5: Konstruktion und Testung von Hybridantibiotika
Viele Antibiotika, die auf Ribosomen, genauer große ribosomale Untereinheiten, zielen und die Proteinsynthese stören, sind komplexe Moleküle, die effektive Verkettungen von einfacheren Unterstrukturen, von denen wenigstens eine mit einem diskreten Teil eines Ribosoms wechselwirkt. Wenn die fragliche Verbindung mehrere interaktive Unterstrukturen enthält, ist seine Bindungsstelle effektiv die Summe der Unterstellen, die jede solche Unterstruktur kontaktieren und einnehmen. Es wurde herausgefunden, dass viele, auf die große ribosomale Untereinheit zielende, Antibiotika die ribosomale Untereinheit an Stellen binden, die nahe beieinander liegen. Daher besteht die Möglichkeit, dass neue Antibiotika synthetisiert werden können, bei denen eine ribosomen-bindende Gruppe eines ersten bekannten Antibiotikums chemisch mit einer ribosomen-bindenen Gruppe eines zweiten bekannten Antibiotikums verbunden ist, das mit einer benachbarten Unterstelle wechselwirkt. Die resultierende neue Zusammensetzung ist daher eine Chimäre der beiden Antibiotika von denen sie abgeleitet ist.
Chimäre Antibiotika können, unter Verwendung der hierin zuvor diskutierten Strukturen der Antibiotika/Ribosomen Komplexe, konstruiert werden. Diese Strukturen erlauben die Identifizierung von Antibiotikaunterbindungsstellen des Ribosoms und die Spezifizierung der chemischen Einheiten, die mit diesen wechselwirken. Mit solchem Wissen ausgestattet, können Fachleute auf dem Gebiet der organischen Synthese Verbindungen synthetisieren, die die interessierenden Unterstrukturen auf solchen Wegen verbinden, die es ihnen erlaubt, mit ihren jeweiligen Unterstellen zur gleichen Zeit zu wechselwirken. Jede Verbindung, die auf diese Weise entwickelt wurde und auf diese beabsichtigte Art funktioniert, wird wahrscheinlich das Zellwachstum und, wenn es dieses tut, die Proteinsynthese in vivo, inhibieren. Allerwenigstens sollte es die Proteinsynthese in in vitro Assaysystemen blockieren. Weitere Informationen zu den ribosomalen Wechselwirkungen einer solchen Verbindung können durch Bestimmung der Struktur des von ihr mit dem Ribosom gebildeten Komplexes unter Verwendung der Verfahren, die in Abschnitt D, hier zuvor beschrieben wurden, erhalten werden.
Zum Beispiel ist, als ein Resultat der hierin beschriebenen Arbeit, entdeckt worden, dass die Disaccharidgruppe von Carbomycin die große Untereinheit an einer Stelle, in großer Nähe zu der Bindestelle für ein Teil des Anisomycin, bindet. Unter Verwendung dieser Information und der hier zuvor beschriebenen Softwarepakete, kann der Fachmann ein Hybridantibiotikum konstruieren, das die relevanten ribosomenbindenen Teile von Carbomycin und Anisomycin durch einen geeigneten chemischen Linker verbunden, umfasst. Dieses Hybridmolekül kann, nachdem es erst einmal konstruiert ist, und unter Verwendung von konventionellen synthetischen organischen Chemien und konventionellen Aufreinigungsschemata synthetisiert und aufgereinigt werden. Nachdem es erst einmal synthetisiert und aufgereinigt wurde, kann das Hybridmolekül auf seine Bioaktivität hin durchmustert werden. Diese Durchmusterungen können einschließen, zum Beispiel, das Anzüchten von Mikoorganismen auf oder in Medium, dass entweder mit dem Hybridmolekül supplementiert ist, oder dieses nicht enthält. Jegliche Verringerung in der Anzahl der Mikroorganismen oder der Größe der Kolonien in Gegenwart des Hybridmoleküls wäre ein Hinweis auf Bioaktivität. Weiterhin könnte das Hybridmolekül in einem zellfreien Translationssystem in der Gegenwart von einer oder mehreren markierten Aminosäuren getestet werden. Jegliche Verringerung des Grads der in die Proteine des zellfreien Systems eingebauten markierten Aminosäuren, die das Hybridmolekül enthalten, relativ zu einem zellfreien System in dem das Hybridmolekül fehlt, währe ein Anzeichen dafür, dass das Hybridmolekül als ein funktioneller Proteinsyntheseinhibitor fungiert. Es ist beabsichtigt, dass das Hybridmolekül dann iterativ verfeinert werden könnte, wie hier zuvor diskutiert, um seine bioaktiven Peptide und Bioverfügbarkeit zu verbessern.
Kopien der Compact Disks, die hierin zuvor als Compact Disk 1 von 3, 2 von 3 und 3 von 3 bezeichnet wurden, werden gleichzeitig mit dieser Anmeldung zur Einbeziehung in die öffentliche Akte dieser EPA Anmeldung mit eingereicht. Die Auflistungen der Atomkoordinaten der Dateien PDF1FFK.DOC, PDB1FFZ.DOC und PDF1FG0.DOC der Compact Disk 1 von 3, der Datei 1JJ2.RTF von Compact Disk 2 von 3 und der Dateien anisomycin.pdb, blasticidin.pdb, carbomycin.pdb, sparsomycin.pdb, spiramycin.pdb, tylosin.pdb und virginiamycin.pdb der Compact Disk 3 von 3 sind ebenfalls in der geschriebenen Beschreibung der Anmeldung enthalten.
Wie früher in der Beschreibung bemerkt, enthalten 1 bis 29 Abbildungen in Farbe. Schwarz-weiß Versionen dieser Zeichnungen sind ebenfalls in dieser Anmldung als 1 bis 29 enthalten. Eine Compact Disk, bezeichnet mit „Figures", all dieser Abbildungen, farbig und schwarz-weiß wird gleichzeitig mit dieser Anmeldung für die Einbeziehung in die öffentliche Akte dieser Anmeldung miteingereicht.
Die Beschreibung wird nun mit den Auflistungen der Atomkoordinaten von Compact Disks 1 von 3, 2 von 3 und 3 von 3, wie oben erwähnt, und einer Sequenzliste fortgeführt.
Die nächste Seite dieser Anmeldung ist Seite 1 der Auflistung PDB1FFK.DOC.
SEQUENZ PROTOKOLL

Claims

Ein im Wesentlichen reines Präparat von Kristallen einer großen ribosomalen Untereinheit aus Haloarcula marismortui, in welcher die Kristalle (i) unverzwillingt sind, (ii) eine mittlere Dicke größer etwa 15 μm aufweisen und (iii) Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von mindestens 5 Å beugen und wahlweise ferner einen darin angeordneten Liganden umfassen.
Präparat nach Anspruch 1, bei welchem die Kristalle in dem Präparat befähigt sind, eine Elektronendichtekarte mit einer Auflösung von mindestens etwa 4,5 Å zu erzeugen.
Präparat nach Anspruch 2, bei welchem die Kristalle in dem Präparat befähigt sind, eine Elektronendichtekarte mit einer Auflösung von mindestens etwa 3,0 Å zu erzeugen.
Präparat nach Anspruch 3, bei welchem die Kristalle in dem Präparat befähigt sind, eine Elektronendichtekarte mit einer Auflösung von mindestens etwa 2,4 Å zu erzeugen.
Präparat nach Anspruch 1, bei welchem die Kristalle in einer Salzlösung mit einer Komentration von über 1,2 M stabilisiert sind.
Präparat nach Anspruch 1 oder 4, bei welchem die mittlere Dicke der Kristalle ausgewählt ist aus der Gruppe der Vertreter mit ca. 16 μm bis ca. 65 μm, mit ca. 66 μm bis ca. 105 μm, mit ca. 104 μm bis ca. 155 μm und mit ca. 156 μm bis ca. 205 μm.
Präparat nach Anspruch 1 oder 4, bei welchem die mittlere Dicke der Kristalle von ca. 100 μm bis ca. 200 μm reicht.
Präparat nach Anspruch 1 oder 4, bei welchem die große ribosomale Untereinheit eine 50S-Ribosomen-Untereinheit ist.
Aus dem Präparat nach Anspruch 1 oder 4 gewonnener unverzwillingter Kristall, welcher ferner einen an die große ribosomale Untereinheit gebundenen Liganden umfasst.
Kristall nach Anspruch 9, in welchem der Ligand ein Antibiotikum ist.
Kristall nach Anspruch 10, in welchem das Antibiotikum ein Makrolidantibiotikum ist.
Kristall nach Anspruch 10, bei welchem das Antibiotikum ausgesucht ist aus der Gruppe Anisomycin, Blasticidin, Carbomycin, Sparsomycin, Spiramycin, Tylosin und Virginiamycin.
Aus dem Präparat nach Anspruch 1 oder 2 gewonnener Kristall, wobei der Kristall Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von mindestens etwa 3,01 beugt.
Kristall nach Anspruch 13, wobei der Kristall Röntgenstrahlen bis zu einer Auflösung von mindestens etwa 2,4 Å beugt.
Kristall nach Anspruch 14, der eine Atomstruktur aufweist, die durch eine Anzahl von bei der Protein Data Bank unter der Accession Number PDB ID: 1JJ2 hinterlegten Atomkoordinaten charakterisiert ist.
Kristall nach Anspruch 14, der eine Atomstruktur aufweist, die durch eine Anzahl von in den Tabellen 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 oder 17 wiedergegebenen Resten charakterisiert ist.
Verfahren zum Züchten des Präparats nach Anspruch 1 in den Schritten: (a) Isolierung einer großen ribosomalen Untereinheit; (b) Fällung der großen ribosomalen Untereinheit; (c) Rückextraktion der gefällten großen ribosomalen Untereinheit, um eine Lösung zu erhalten; (d) Ansetzen der rückextrahierten Lösung; (e) Züchten der Kristalle in der angesetzten Lösung mittels Dampfdiffusion bei Zimmertemperatur; und (f) Einsammeln der Kristalle.
Verfahren nach Anspruch 17 mit den weiteren Schritten: (g) Stabilisierung der Kristalle durch stufenweises Überführen in eine Lösung mit hoher Salzkonzentration; und (h) Aufbewahren der Kristalle unter der hoher Salzkonzentration.
Verfahren nach Anspruch 18, in welchem die hohe Salzkonzentration ca. 1,2 M Salz bis ca. 1,7 M Salz enthält.
Verfahren nach Anspruch 18 mit dem weiteren Schritt: (i) Einfrieren eines Kristalls.
Verfahren zur Gewinnung von Röntgenbeugungsdaten für eine große ribosomale Untereinheit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Gewinnung eines Kristall aus dem Präparat des Anspruchs 1; und (b) Einsatz der Röntgenkristallographie zur Gewinnung von Röntgenbeugungsdaten für den Kristall.
Verfahren nach Anspruch 21 mit dem zusätzlichen Schritt der Erlangung einer Elektronendichtekarte der großen ribosomalen Untereinheit.
Verfahren nach Anspruch 21 mit dem zusätzlichen Schritt der Diffusion eines Liganden in den Kristall, um einen Komplex zu bilden.
Verfahren nach Anspruch 23 mit dem zusätzlichen Schritt der Erstellung einer Elektronendichtekarte des Komplexes.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, in welchem der Ligand ein Antibiotikum ist.
Verfahren nach Anspruch 25, in welchem das Antibiotikum ein Makrolid ist.
Verfahren zur Identifizierung eines ausgewählten Moleküls in den Schritten: (a) Beschaffen eines Molekülmodells von einem ribofunktionellen Lokus einer großen Untereinheit eines Ribosoms, wobei das Molekülmodell des ribofunktionellen Lokus (i) aus den bei der Protein Data Bank unter der Accession Number PDB ID: 1JJ2 hinterlegten Atomkoordinaten erstellt wird; oder (ii) aus einem Molecular Modeling mit den bei der Protein Data Bank unter der Accession Number PD BID: 1JJ2 hinterlegten Atomkoordinaten stammt; und (b) Verwendung des Modells zur Identifizierung eines ausgewählten Moleküls, das eine komplementär zu dem ribofunktionellen Lokus ausgebildete Oberfläche aufweist.
Verfahren nach Anspruch 27, in welchem das ausgewählte Molekül eine Bindungsspezifität für den ribofunktionellen Lokus der großen Untereinheit des Ribosoms aufweist.
Verfahren nach Anspruch 27 mit dem zusätzlichen Schritt der Bestimmung, ob das ausgewählte Molekül die ribosomale Aktivität moduliert.
Verfahren nach Anspruch 29 mit dem zusätzlichen Schritt der Identifizierung eines modifizierten ausgewählten Moleküls.
Verfahren nach Anspruch 27, in welchem das ausgewählte Molekül ein Antibiotikum oder eine einem Antibiotikum analoge Substanz ist.
Verfahren nach Anspruch 31, in welchem das modifizierte ausgewählte Molekül ein Antibiotikum oder eine einem Antibiotikum analoge Substanz ist.
Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, in welchem das Antibiotikum oder die einem Antibiotikum analoge Substanz ein Makrolid ist.
Verfahren nach Anspruch 27, in welchem der ribofunktionelle Lokus mindestens einen Abschnitt eines aktiven Bereiches umfasst.
Verfahren nach Anspruch 34, in welchem der aktive Bereich mindestens einen Abschnitt eines Peptidyltransferasebereichs umfasst.
Verfahren nach Anspruch 35, in welchem der Peptidyltransferasebereich durch eine Anzahl von in Tabelle 5 angeführten Resten definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 27, in welchem der ribofunktionelle Lokus mindestens einen Abschnitt eines A-Bereichs umfasst.
Verfahren nach Anspruch 37, in welchem der A-Bereich durch eine Anzahl von in Tabelle 6 angeführten Resten definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 37, in welchem der ribofunktionelle Lokus mindestens einen Abschnitt eines P-Bereichs umfasst.
Verfahren nach Anspruch 39, in welchem der P-Bereich durch eine Anzahl von in Tabelle 7 angeführten Resten definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 27 oder 37, in welchem der ribofunktionelle Lokus mindestens einen Abschnitt eines Exit Tunnels für ein Polypeptid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 41, in welchem der Exit Tunnel durch eine Anzahl von in Tabelle 8, Tabelle 9 oder Tabelle 10 wiedergegebenen Resten definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 39, in welchem der ribofunktionelle Lokus mindestens einen Abschnitt eines Exit Tunnels für ein Polypeptid umfasst.
Verfahren nach Anspruch 43, in welchem der Exit Tunnel durch eine Anzahl von in Tabelle 8, Tabelle 9 oder Tabelle 10 wiedergegebenen Resten definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 27, in welchem der Exit Tunnel durch eine Anzahl von in Tabelle 11, Tabelle 12, Tabelle 13, Tabelle 14, Tabelle 15, Tabelle 16 oder Tabelle 17 wiedergegebenen Resten definiert ist.
Verfahren nach jedem der Ansprüche 27 bis 45, in welchem das Molekülmodell eine Elektronenform aufweist.
Verfahren nach Anspruch 27, in welchem das in Schritt (a)(ii) erstellte Molekülmodell durch Homology Modeling gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 27, in welchem das in Schritt (a)(ii) erstellte Molekülmodell durch Molecular Replacement gewonnen wird.
Verfahren nach Anspruch 27, in welchem das Molekülmodell Reste umfasst, welche unter prokaryotischen Organismen konserviert sind.
Verfahren nach Anspruch 27, in welchem das Molekülmodell einen Rest umfasst, welcher in einem prokaryotischen Ribosom vorkommt, in einem eukaryotischen Ribosom aber fehlt.
Verfahren nach Anspruch 50, in welchem das eukaryotische Ribosom ein Ribosom von Säugetieren ist.