JP3836648B2

JP3836648B2 - 検出装置及び検出方法

Info

Publication number: JP3836648B2
Application number: JP34429099A
Authority: JP
Inventors: 謙次楢原
Original assignee: Mizuho Medy Co Ltd
Current assignee: Mizuho Medy Co Ltd
Priority date: 1999-12-03
Filing date: 1999-12-03
Publication date: 2006-10-25
Anticipated expiration: 2019-12-03
Also published as: JP2001159632A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料液体（尿や血液など）内における検出物質（生体成分）の存否を検出する検出装置及び検出方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
生体成分からなる検出物質の検出手法として、抗原又は抗体を用いた免疫学的検出方法がある。この方法は、高感度であり、特異性、簡便性に優れ、広く臨床検査領域で使用されている。そして、最近では、特殊な技術や訓練を経なくとも、この方法による検査を簡便に達成できる技術が種々提案されている。
【０００３】
このうち、特に操作性、判定性が優れ、短時間で結果を得られる免疫クロマトグラフィー法と呼ばれる一群の測定方法が提案され（日本国特開平９−１７８７４８号公報）、既に一般大衆向けに商品化されている。
【０００４】
この免疫クロマトグラフィー法は、予めニトロセルロース等の展開層に、着色ラテックス、金コロイド等を標識した試薬（着色標識体）と、展開層上の検出区域に固定化した無標識の試薬とを用い、試料液体中の検出物質の存在下で、免疫反応複合物を生成させ、この反応により、捕捉された着色標識体を目視確認するものである。この方法によれば、単に試料液体を添加位置に添加し、一定時間後に、検出区域における着色標識体の着色量を目視確認しさえすればよい。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
そして、この免疫クロマトグラフィー法を応用した、従来の検出装置では、無標識の試薬を展開層上の検出区域に固定化していた。このような構成によると、この試薬の量は、蛋白結合能などにより制限を受けるので、固定化する量を一定量以上に多くすることは難しい。また、検出物質が検出されるためには、検出物質がこの試薬の成分と標識成分の双方に、生物化学的に結合する必要があり、この試薬の量の制限から、感度を一定水準よりも高くすることができなかった。
【０００６】
さらに、この試薬は、展開層に固定化されているから、展開層内を検出物質がクロマト的に移動する時間のうち、検出物質がこの試薬に出会う、極く短時間のうちにしか反応を起こす機会がなく、反応性が低くなりがちである。したがって、この様な理由から、このように、従来の検出装置では、反応性が低いという問題点があった。この点、磁力を利用しようとする技術が提案されている（特開平５−５２８４９号公報）が、磁性を有する物質を使用することが不可避であり、広範な物質には適用しがたい。
【０００７】
そこで本発明は、量の制限を受けず、感度が高い検出装置及び検出方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明では、試料液体に接触させる採液部と、採液部に接続される反応試薬部と、反応試薬部に接続される多孔質性担体とを備え、反応試薬部には、検出に影響しない粒子と、検出物質存在下において粒子と検出物質を介して生物化学的反応により結合する標識成分とが、多孔質性担体に対して移動自在に含有され、粒子と標識成分とが検出物質と結合することにより生成される、反応生成物のクロマト的な移動を禁止し、かつ粒子と結合していない標識成分のクロマト的な移動を許可する捕捉部を、検出区域に設け、捕捉部の孔径は、反応生成物の粒径よりも小さく、かつ、粒子と結合していない標識成分の粒径よりも大きくし、捕捉部は、多孔質坦体の途中に設けられ、クロマト的な移動方向において捕捉部の前後に位置する多孔質坦体の孔径は、捕捉部の孔径よりも大きくしている。
【０００９】
【発明の実施の形態】
請求項１記載の検出装置では、試料液体に接触させる採液部と、採液部に接続される反応試薬部と、反応試薬部に接続される多孔質性担体とを備え、反応試薬部には、検出に影響しない粒子と、検出物質存在下において粒子と検出物質を介して生物化学的反応により結合する標識成分とが、多孔質性担体に対して移動自在に含有され、粒子と標識成分とが検出物質と結合することにより生成される、反応生成物のクロマト的な移動を禁止し、かつ粒子と結合していない標識成分のクロマト的な移動を許可する捕捉部を、検出区域に設け、捕捉部の孔径は、反応生成物の粒径よりも小さく、かつ、粒子と結合していない標識成分の粒径よりも大きくし、捕捉部は、多孔質坦体の途中に設けられ、クロマト的な移動方向において捕捉部の前後に位置する多孔質坦体の孔径は、捕捉部の孔径よりも大きい。
【００１０】
この構成により、無標識の試薬は、多孔質担体に固相化されるのではなく、反応試薬部に含有されているに過ぎないので、無標識の試薬の量は、固相化するための制限を受けず、従来の検出装置よりも、より大量の無標識の試薬を存在させることができ、検出感度を向上できる。しかも、無標識の試薬は、多孔質担体に物理的に拘束されていないので、多孔質担体中を自由に移動することができ、各成分の自由運動（衝突）により、従来よりも反応が速くかつ効率的に促進され、検出性能を向上できる。
【００１１】
また、このようにしても、検出物質が存在した際、標識物質は、粒子と結合し反応生成物となって、捕捉部に拘束されるので、検出結果の取得には支障がない。
【００１２】
そして、孔径と粒径の大小関係によって、標識成分が粒子と結合した反応生成物が、捕捉部にせき止められて捕捉される。
【００１３】
請求項２記載の検出装置では、捕捉部の孔径は、粒子の粒径より小さい。
【００１４】
この構成により、結合していない粒子も捕捉部にせき止められる。この大小関係は、検出物質が、同種の免疫学的反応部位を１つだけ持つ場合に適する。この場合、反応生成物と１つの粒子とは、ほぼ同様の大きさになり、反応生成物を捕捉部にせき止めることができる。
【００１５】
請求項３記載の検出装置では、捕捉部の孔径は、粒子の粒径より大きい。
【００１６】
この構成により、結合していない粒子は、捕捉部にせき止められず、捕捉部を通過する。この大小関係は、検出物質が、同種の免疫学的反応部位を複数持つ場合に適する。この場合、検出物質が複数の粒子と結合することとなり、反応生成物は、１つの粒子よりも、かなり大きい凝集体に成長する。このような場合、粒子の粒径を小さくしないと、大きな凝集体となった、反応生成物が多孔質担体の途中で詰まってしまい、捕捉部まで到達しないことがある。したがって、粒子の粒径を小さくし、反応生成物が捕捉部までクロマト的に移動できるようにすると良い。
【００１７】
（第１の実施の形態）
次に図面を参照しながら、本発明の第１の実施の形態について説明する。図１（ａ）は、本発明の第１の実施の形態における検出装置の正面図、図１（ｂ）は同側面図である。
【００１８】
第１の実施の形態では、▲１▼ 粒子１３の粒径＞捕捉部１６の孔径という大小関係をとっている。この形態は、検出物質Ｔ（図２参照）が、同種の免疫学的反応部位を１つだけ有する場合に適する。検出物質Ｔの例としては、ｈＣＧ（ヒト胎盤絨毛性ゴナドトロピン：human chorionic gonadotropin）、ＬＨ (黄体形成ホルモン：luteinzing hormone)、ＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン：follicle-stimulating hormone）、ＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン：thyroid stimulating hormone）、インシュリン（Insulin）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原：carcinoembryonic antigen）などがある。
【００１９】
さて、図１に示すように、この検出装置において、採液部１１は、例えば濾紙などから構成され、尿などの試料液体が、滴下されるか、あるいは、漬け込まれることにより、試料液体に接触する。反応試薬部１２は、採液部１１に連続し、粒子１３及び標識成分１４を含有する。
【００２０】
ここで、粒子１３は、判定において影響を与えないようになっており、目視判定を行う場合には、白色又は透明のものとする。標識成分１４は、検出物質の存在下で、粒子１３と生物化学的な反応（例えば免疫反応）をして結合し、反応生成物１８となる。
【００２１】
また多孔質担体１５は、反応支持体としての機能を有する。多孔質担体１５の孔径は、粒子１３や反応生成物１８の粒径よりも大きくし、標識成分１４、粒子１３や反応生成物１８が多孔質担体１５内を、自由にクロマト的に移動できる。
【００２２】
そして、多孔質担体１５の途中（検出区域）に、捕捉部１６を設ける。この捕捉部１６の孔径は、粒子１３や反応生成物１８の粒径より小さく標識成分１４の粒径よりも大きくする。また、捕捉部１６とその前後の多孔質担体１５は、直列に継ぎ合わせるものとする。
【００２３】
さらに、多孔質担体１５には、試料液体をクロマト的に移動させるため、必要に応じて濾紙などからなる吸液部１７を接続する。ここで、第１の実施の形態では、採液部１３，多孔質担体１５及び吸液部１７から展開層が構成される。
【００２４】
次に、図２を参照しながら、図１の検出装置による、検出過程を説明する。ここで、図２において、Ｎは、試料液体の移動方向を示す。
【００２５】
まず、採液部１１に試料液体を接触させると、試料液体が矢印Ｎ方向に移動を始める。そして、試料液体が反応試薬部１２に達すると、反応試薬部１２内の粒子１３及び標識成分１４が、試料液体と共に移動を開始する。ここで、粒子１３は、多孔質担体１５などに固定されていないので、自由に移動することができる。
【００２６】
そして、試料液体に検出物質が存在すれば、多孔質担体１５内において、図２（ｃ）に示すような反応生成物１８ができる。即ち、粒子１３と検出物質Ｔとが結合し、検出物質Ｔと標識成分１４とが結合することにより、標識成分１４は検出物質Ｔを介して粒子１３と結合する。一方、検出物質Ｔが存在しなければ、図２（ｃ）のような反応生成物１８はできず、図２（ｂ）に示すように、標識成分１４は粒子１３と別個に移動する。ここで、図２（ｃ）に示しているように、第１の実施の形態における反応生成物１８は、粒子１３とほぼ同様のサイズを持つ。
【００２７】
そして、捕捉部１６まで至ると、粒子１３及び反応生成物１８は、捕捉部１６に捕捉され、これ以上移動できなくなるが、標識成分１４は、捕捉部１６を通過して、吸液部１７へ至る。
【００２８】
この結果、検出物質が存在し、陽性であるとき、図２（ａ）に示すように、反応生成物１８が捕捉部１６に拘束され、標識成分１４も捕捉部１６にとどまる。逆に、検出物質が存在せず、陰性であるとき、粒子１３のみが捕捉部１６に拘束され、標識成分１４は、捕捉部１６を通過し、捕捉部１６にとどまることはない。
【００２９】
このため、捕捉部１６を目視するか、または、センシングすることにより、陽性あるいは陰性の判定をすることができる。
【００３０】
以上の説明では、孔径のより小さい捕捉部１６を多孔質担体１５と直列的に継ぎ合わせて使用する例を述べたが、本発明は、かかる構成に限定されるものではなく、例えば、多孔質担体１５自体に熱処理や薬品処理を行ったり、白色ラテックスなどの粒子を多孔質担体１５に埋め込む化学的又は物理的処理により、実質的に孔径を小さくして、これを捕捉部１６としても差し支えない。
【００３１】
さて、以上のように、第１の実施の形態では、無標識の試薬を多孔質担体１５に固相せずに、検出を可能にできる。このため、従来の検出装置における、無標識の試薬の制限がなく、反応量自体を大幅に増やして、検出感度を上昇させることができる。
【００３２】
また、粒子１３や標識成分１４の使用濃度の調整が自由になるので、生産管理が容易になる。しかも、従来の検出装置では、製造工程において、多孔質担体に未標識成分を固定したり、多孔質担体内の流れや安定性を高めるために、特別な工程を付加しているが、このような工程の負担を軽減できる。
【００３３】
次に、第１の実施の形態による実施例を説明する。まず、この実施例における望ましい諸元は、図４の▲１▼欄に記載してある。そして、次のように各部材を構成し、試験を行った。
【００３４】
実施例１（検出物質は、妊娠マーカーであるｈＣＧ）
（１）部材作製
粒子１３である1μm白ラテックスに抗βhCG抗体を結合させ、標識成分である0.3μm着色ラテックスまたは0.02μｍ金コロイドに、抗hCG抗体を結合させた。結合の要領は、常法によった。
【００３５】
反応試薬部は次のように構成した。即ち、粒子を0.1％濃度でテスト当たり4.8μｌ、および標識成分を着色ラテックスの場合は0.3％濃度でテスト当たり3.6μｌ、金コロイドの場合は、520nmの吸光度が5.0となる濃度でテスト当たり4.8μｌそれぞれ混合し、多孔質性担体であるガラス繊維パッドの途中に塗布した。採液部として、ろ紙を上記ガラスパッドと連結させ、さらにニトロセルロースメンブレン（ミリポア社：ＳＣＨＦ（商標））を捕捉部として重ね合わせて検出装置を作製した。
（２）試験及びその結果
採液部にｈCGを含む陽性試料およびｈＣＧを含まない陰性試料をそれぞれ80ul吸収させ、5分後に捕捉部に現れる着色を目視にて判定した。ｈCGを含む試料では50mIU/ml -1000000mIU/mlの範囲で捕捉部に標識成分に由来する発色が現れ陽性と判定された。ｈCGを含まない試料については発色せず陰性と判定された。
【００３６】
（第２の実施の形態）
図３（ａ）は、本発明の第２の実施の形態における検出装置の正面図、図３（ｂ）は同側面図である。
【００３７】
第２の実施の形態では、▲２▼ 粒子１９の粒径＜捕捉部１６の孔径という大小関係をとっている。この形態は、検出物質Ｓ（図３参照）が、同種の免疫学的反応部位を複数有する場合に適する。検出物質Ｓの例としては、ＨＢsＡｇ(B型肝炎表面抗原：hepatitis B surface antigen）、ＣＲＰ(C反応性蛋白：C-reactive protein)、ヘモグロビン（hemoglobin）、各種の抗体（antibody detect）などがある。
【００３８】
さて、第１の実施の形態に対して、第２の実施の形態では、大小関係と、検出物質Ｓの性質に相違がある。特に、検出物質Ｓが、同種の免疫学的反応部位を複数有すると、図３（ｃ）に示すように、一つの検出物質Ｓが複数の粒子１９と結合し、さらに、その粒子１９が別の検出物質Ｓに結合することがある。このように、結合が連鎖的に起こると、反応生成物２０は、複数の粒子１３などの凝集体となって、そのサイズは、１つの粒子１３のサイズよりも相当大きくなる。ここで、粒子１３を大きくすると、反応生成物２０もそれにほぼ比例して大きくなり、多孔質担体１５の途中で詰まって、図３の矢印Ｎのような、クロマト的な移動ができなくなることがある。こうなると、捕捉部１６における陽性／陰性判定が不可能になる。
【００３９】
そこで、▲２▼ 粒子１９の粒径＜捕捉部１６の孔径という大小関係をとる。このようにすると、図３（ａ）に示すように、大きく成長した反応生成物２０は、捕捉部１６にせき止められるが、図３（ｂ）に示すように、反応生成物２０ができないときは、標識成分１４だけでなく、粒子１９も捕捉部１６を通過し、吸液部１７まで到達する。その他、陽性又は陰性の判定や、作用効果は、第１の実施の形態と同様である。
【００４０】
次に、第２の実施の形態による実施例を説明する。まず、この実施例における望ましい諸元は、図４の▲２▼欄に記載してある。そして、次のように各部材を構成し、試験を行った。
【００４１】
実施例２（検出物質は、ＨＢsＡｇ）
（１）部材作製
粒子１９である0.3μm白ラテックスに抗HBs Ag抗体を結合させ、標識成分である金コロイドに別の抗原認識部位を持つ抗HBs Ag抗体を、結合させた。結合の要領は、常法によった。
【００４２】
反応試薬部は次のように構成した。即ち、粒子を0.01％濃度でテスト当たり60μｌ、および標識成分を520nmの吸光度が0.8となる濃度でテスト当たり60μｌ混合し多孔質性担体であるガラス繊維パッドの途中に塗布した。採液部としてろ紙を上記ガラスパッドと連結させ、さらにニトロセルロースメンブレン（ミリポア社：ＳＣＨＦ（商標））を捕捉部として重ね合わせて検出装置を作製した。
（２）試験及びその結果
採液部に HBsAgを含む陽性試料およびHBsAgを含まない陰性試料をそれぞれ80ul吸収させ、15分後に捕捉部に現れる着色を目視にて判定した。HBsAgを含む試料では10ng/ml-25μg/ml の範囲で捕捉部に標識成分に由来する発色が現れ陽性と判定された。HBsAgを含まない試料については発色せず陰性と判定された。
【００４３】
【発明の効果】
本発明によれば、標識成分や粒子の濃度を増やし、また標識成分や粒子の移動をスムーズにして、検出感度を向上できる。また、製造工程の負担を軽減できる。
【図面の簡単な説明】
【図１】（ａ）本発明の第１の実施の形態における検出装置の正面図
（ｂ）同側面図
【図２】（ａ）本発明の第１の実施の形態における検出装置の正面図（陽性）
（ｂ）同正面図（陰性）
（ｃ）同模式図（陽性）
【図３】（ａ）本発明の第２の実施の形態における検出装置の正面図（陽性）
（ｂ）同正面図（陰性）
（ｃ）同模式図（陽性）
【図４】本発明の第１、第２の実施の形態における諸元表
【符号の説明】
１１採液部
１２反応試薬部
１３、１９粒子
１４標識成分
１５多孔質担体
１６捕捉部
１７吸液部
１８、２０反応生成物

Claims

試料液体に接触させる採液部と、前記採液部に接続される反応試薬部と、前記反応試薬部に接続される多孔質性担体とを備え、
前記反応試薬部には、検出に影響しない粒子と、検出物質存在下において前記粒子と検出物質を介して生物化学的反応により結合する標識成分とが、前記多孔質性担体に対して移動自在に含有され、
前記粒子と前記標識成分とが検出物質と結合することにより生成される、反応生成物のクロマト的な移動を禁止し、かつ前記粒子と結合していない前記標識成分のクロマト的な移動を許可する捕捉部を、検出区域に設け、
前記捕捉部の孔径は、前記反応生成物の粒径よりも小さく、かつ、前記粒子と結合していない前記標識成分の粒径よりも大きく、前記捕捉部は、前記多孔質坦体の途中に設けられ、クロマト的な移動方向において前記捕捉部の前後に位置する前記多孔質坦体の孔径は、前記捕捉部の孔径よりも大きいことを特徴とする検出装置。
前記捕捉部の孔径は、前記粒子の粒径より小さいことを特徴とする請求項１記載の検出装置。
前記捕捉部の孔径は、前記粒子の粒径より大きいことを特徴とする請求項１記載の検出装置。
試料液体内における検出物質の存在を検出する検出方法であって、試料液体を採液部に接触させ、試料液体を前記採液部、反応試薬部、多孔質性担体の順にクロマト的に移動させると共に、
前記反応試薬部に検出に影響しない粒子と、検出物質存在下において前記粒子と検出物質を介して生物化学的反応により結合する標識成分とを、前記多孔質性担体に対して移動自在に含有させておき、
前記多孔質性担体の途中に設けた捕捉部の孔径を、前記反応生成物の粒径よりも小さく、かつ、前記粒子と結合していない前記標識成分の粒径よりも大きくすることにより、この捕捉部において、前記反応生成物のクロマト的な移動を禁止し、かつ前記粒子と結合していない前記標識成分のクロマト的な移動を許可すると共に、前記捕捉部は、前記多孔質坦体の途中に設けられ、クロマト的な移動方向において前記捕捉部の前後に位置する前記多孔質坦体の孔径は、前記捕捉部の孔径よりも大きいことを特徴とする検出方法。