JP3812204B2 - カルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物 - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はトリグリセリンの中央にカルボキシル基または活性化されたカルボキシル基を導入したポリオキシアルキレン化合物に関する。さらに詳しくは、ポリペプチド、生理活性蛋白質、酵素などへのポリオキシアルキレン修飾や、リポソーム、ポリマーミセルなどの薬物送達システム（以下ドラッグデリバリーシステムという）におけるポリオキシアルキレン修飾など、主として医薬用途でのポリオキシアルキレン修飾に用いられる末端カルボキシル基を有するポリオキシアルキレン化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでポリオキシアルキレングリコールの末端水酸基をカルボキシル基に置換した化合物は、たとえば特公昭６３−４８７７号公報には潤滑油として、あるいは特開昭６３−１８２３４３号公報には合成樹脂添加剤として記載されており、幅広く利用されている。
近年になり、ポリオキシアルキレン化合物は、ドラッグデリバリーシステムの重要な担体として注目を集めるようになり、ポリオキシアルキレン化合物にアミノ基やカルボキシル基を導入した化合物についても研究が盛んに行われるようになっている。なかでも、２本のポリオキシアルキレン鎖を持つ化合物として、特開平３−７２４６９号公報に示されているトリアジン環を介した２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロロ−Ｓ−トリアジン（以下「活性化ＰＥＧ２」という）が知られている。また、ポリオキシアルキレン基の側鎖に多数のカルボキシル基を持つポリオキシアルキレン化合物も知られている（特開平８−４８７６３号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
特に、ポリオキシアルキレン化合物にて修飾した化合物ないしは薬剤（例えば、蛋白質、生理活性物質、ＤＮＡ等）、該修飾を利用するドラッグデリバリーシステムにおいては、▲１▼抗原性（免疫反応性）の低減、▲２▼化合物ないしは薬剤としての安定性の増加、▲３▼体内滞留時間の延長などの効果が得られるとされている。
ところが、これら従来のカルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物は、例えば一本鎖の末端カルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物の場合、これを用いて対象物質を修飾すると、一本鎖であるが故に、ポリオキシアルキレンの持つ抗原性の低減、対象物質の安定化などの性能が十分に発揮できないケースが多々ある。
【０００４】
また、前述した活性化ＰＥＧ２はトリアジン環を持つため、医薬品として体内に投与した場合、毒性が生じる可能性がある。
さらに、ポリオキシアルキレン骨格の側鎖に多数のカルボキシル基を持つものは、反応点が多数あるため修飾反応を制御するのが難しく、単一の化合物を得ることが困難である。
【０００５】
本発明の目的は、化合物ないしは薬剤の抗原性の低減、安定化、体内（血中）滞留時間の延長などの目的をもって、化合物ないしは薬剤を修飾するために使用され、しかも修飾された化合物ないしは薬剤は毒性が少なく、さらに副生物の生成が少ないカルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、トリグリセリンの中央の水酸基にカルボキシル基およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミドまたはｐ−ニトロフェノールで活性化したカルボキシル基を導入したポリオキシアルキレン化合物が、上記した目的を達成できることを見出し、本発明に到達した。
すなわち本発明は、式（１）で示されるカルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物である。
【０００７】
【化４】
【０００８】
（式中、Ｒ1は水素原子、炭素数１〜２４の炭化水素基または炭素数１〜２４のアシル基、Ｒ2は炭素数３または４の炭化水素基、Ｒ3は炭素数１〜１０の炭化水素基、ＡＯは炭素数３または４のオキシアルキレン基、Ｙは水素原子、式（２）あるいは式（３）で示される活性基を示し、ｎはオキシエチレン基の平均付加モル数で１〜１０００であり、ｍは炭素数３または４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で０〜２５０であり、ｎ／（ｎ＋ｍ）は０．８以上であり、オキシエチレン基と炭素数３または４のオキシアルキレン基の付加状態はブロック状でもランダム状でもよい。）
【０００９】
【化５】
【００１０】
【化６】
【００１１】
【発明の実施の形態】
式（１）において、Ｒ1で示される炭素数１〜２４の炭化水素基としては、脂肪族炭化水素基として、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第三ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、イソヘプチル基、オクチル基、２−エチルヘキシル基、ノニル基、イソノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、イソトリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、イソヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、イソオクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基、オクチルドデシル基、ヘンエイコシル基、ドコシル基、デシルテトラデシル基などの直鎖または分岐状のアルキル基、芳香族炭化水素基として、ブチルフェニル基、ジブチルフェニル基、オクチルフェニル基、ジノニルフェニル基およびα−メチルベンジルフェニル基などのアリール基、ベンジル基などのアラルキル基、およびクレジル基などが挙げられる。
【００１２】
また、炭素数１〜２４のアシル基としては、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、カプリル酸、２−エチルヘキサン酸、イソノナン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、桂皮酸、没食子酸などに由来するアシル基が挙げられる。
これらのなかでも、Ｒ1としては、水素原子および炭素数１〜４の直鎖のアルキル基が好ましく、水素原子およびメチル基が特に好ましい。なお、式（１）中にはＲ1が４つ存在するが、これらは同一または異なっていてもよい。
【００１３】
Ｒ2で示される炭素数３または４の炭化水素基としては、重合性不飽和基をもつ炭化水素基に由来する基、好ましくはアリル基、メタリル基など二重結合をもつ炭化水素基に由来する基、トリメチレン基、ブチレン基等の直鎖または分岐状のアルキレン基などが挙げられる。
【００１４】
Ｒ3で示される炭素数１〜１０の炭化水素基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基およびトリメチレン基などの直鎖または分岐状のアルキレン基、フェニレン基および式（４）で示される２価の芳香族炭化水素基が挙げられ、メチレン基およびエチレン基が好ましい。
【００１５】
【化７】
【００１６】
ＡＯで示される炭素数３または４のオキシアルキレン基のアルキレン部分は、直鎖または分岐状のいずれでもよく、このようなオキシアルキレン基として、たとえば、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基などが挙げられる。
【００１７】
Ｙは水素原子、式（２）または式（３）で示される活性基であるが、対象物質との反応性の点から式（２）および式（３）で示される活性基が好ましい。
ｎはオキシエチレン基の平均付加モル数で１〜１０００であり、ｍは炭素数３または４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で０〜２５０であり、ｎ／（ｎ＋ｍ）は０．８以上、好ましくは０．９以上、より好ましくは１．０以上である。
オキシエチレン基と炭素数３または４のオキシアルキレン基の付加状態はブロック状でもランダム状でもよい。
【００１８】
式（１）で示される本発明のカルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物は、例えば、以下のようにして製造することができる。
まず、式（５）
【００１９】
【化８】
【００２０】
（式中、Ｒ2'は重合性不飽和基をもつ炭化水素基、好ましくはアリル基あるいはメタリル基などの炭素数３または４の二重結合含有アルキル基を示す。）
で示される化合物に、エチレンオキシド単独、あるいはエチレンオキシドおよび炭素数３または４のアルキレンオキシドとを付加させる。この際、式（５）で示される化合物にエチレンオキシドを付加させた後、炭素数３または４のアルキレンオキシドを付加させてもよいし、エチレンオキシドと炭素数３または４のアルキレンオキシドとを混合して一度に付加反応を行ってもよい。エチレンオキシドと炭素数３または４のアルキレンオキシドの付加モル数の比率は、修飾化時に修飾率が低下する恐れがあるので、オキシエチレン基が８０％以上となるようにする。
【００２１】
具体的には、まず式（５）で示される化合物を反応釜に仕込み、窒素置換を行い、１００〜１４０℃でエチレンオキシド単独、あるいはエチレンオキシドと炭素数３または４のアルキレンオキシドとの混合物であるアルキレンオキシドを圧入し、反応させる。反応終了後、減圧下で未反応アルキレンオキシドを除去し、８０℃に冷却し、リン酸、塩酸などの酸を加え中和し、脱水および濾過を行い、式（６'）
【００２２】
【化９】
【００２３】
（式中の記号は前記と同義）
で示される化合物を得る。
必要に応じて末端水酸基をアルキル化あるいはアシル化するなど、炭化水素基の導入を行って、式（６''）
【００２４】
【化１０】
【００２５】
（式中、Ｒ1'は炭素数１〜２４の炭化水素基または炭素数１〜２４のアシル基を示し、その他の記号は前記と同義）
で示される化合物となる。
例えば、アルキル化反応は、Ｒ1で示される炭化水素基を有するアルキルハライド（ハロゲン化アルキル）、アルケニルハライドなどのアルキル化剤を、化合物（６'）の水酸基に対して１．１〜３．０倍モル加え、９０〜１２０℃で２〜５時間反応を行い、水洗し、未反応物を除去し、中和、脱水および濾過を行う。アシル化の反応は、Ｒ1で示されるアシル基を有するハロゲン化アシルやカルボン酸無水物などのアシル化剤を、式（６'）で示される化合物の水酸基に対して１．１〜２．０倍モル加え、ｐ−トルエンスルホン酸存在下、１１０〜１４０℃で９時間、脱水縮合反応を行い、吸着剤処理し、脱水、濾過する。
【００２６】
上記のハロゲン化物やカルボン酸無水物中のＲ1が芳香族炭化水素基である化合物を用いた場合、芳香族炭化水素基が導入される。この場合の反応条件も上記したアルキル化およびアシル化に準じる。
このようにして得た式（６）
【００２７】
【化１１】
【００２８】
（式中の各記号は前記と同義）
で示される化合物に、式（７）
ＨＳ−Ｒ3−ＣＯＯＨ （７）
（式中Ｒ3は前記と同義）
で示される化合物を、式（６）で示される化合物中のアリル基またはメタリル基に対して１．５〜１０倍モル加え、例えばメタノール、エタノールなどのアルコール中で３０〜４０℃で３〜７時間反応させ、カルボキシル基の導入を行う。
反応終了後、アルコールを留去し、反応混合物をクロロホルムやジクロロメタンなどの溶媒に溶解し、その後水洗して未反応の式（７）で示される化合物を除去する。ついで溶媒を留去し、濾過し、式（１）で示される化合物（ただし、式中のＹは水素原子）を得る。
【００２９】
その後、例えばジメチルホルムアミド、クロロホルム、トルエンなどの溶媒中、ジシクロヘキシルカルボジイミド存在下で、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドまたはｐ−ニトロフェノールを３０〜４０℃で反応させ、濾過後、イソプロピルアルコールやヘキサンで晶析を行うことによって、カルボキシル基が活性化された式（１）（ただし、式中のＹは式（２）または（３）で示される活性基）の化合物となる。
【００３０】
本発明のカルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物は、例えば（１）抗腫瘍蛋白質であるアスパラギナーゼ、アルギナーゼなどに対する修飾、（２）代謝異常酵素であるアデノシンデアミナーゼ、インスリン、ウリカーゼなどに対する修飾、（３）抗原蛋白質である免疫グロブリン、血清アルブミンなどに対する修飾、（４）抗炎症酵素であるカタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼなどに対する修飾、（５）血液成分蛋白質であるアルブミン、顆粒球コロニー刺激因子などに対する修飾に使用することが考えられる。
【００３１】
また、ドラッグデリバリーシステムへの利用としては、制癌剤であるアドリアマイシン、シスプラチンなどを内包するリポソームの基材であるリン脂質への化学修飾などが考えられる。
いずれも、ポリオキシアルキレン基で修飾されることにより、免疫原性の向上、薬物の安定化、血中滞留時間の延長などの効果が期待される。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
製造例１
トリグリセリルモノアリルエーテル１４０ｇ（０．５モル）と水酸化カリウム１ｇを５リットル容オートクレーブに仕込み、系内を窒素ガスに置換した後、１２０℃に昇温した。次いでエチレンオキシド２３６０ｇ（５４モル）を圧入後、１３０±５℃で１時間反応を行った。次いで、窒素ガスを通じながら減圧下（２００ｍｍＨｇ、０．５時間）で未反応のエチレンオキシドを除去し、８０℃まで冷却した。その後、１０重量％塩酸水溶液でｐＨを７．０に調整し、１００±５℃で１００ｍｍＨｇ、１時間脱水を行った。次いで反応混合物を８０℃に冷却し、析出した塩を濾別して化合物２４１０ｇを得た。
得られた化合物の水酸基価は、４５．２（計算値は４４．９）、不飽和度は０．１９（計算値は０．２）であった。
なお、水酸基価は、ＪＩＳ Ｋ−１５５７ ６．４（１９７０）の方法に準じて、不飽和度は、ＪＩＳ Ｋ−１５５７ ６．７（１９７０）の方法に準じて測定した。
化合物の赤外線吸収スペクトルを図１に示す。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ／ＴＭＳ）
δ＝５．２ｐｐｍ （Ｃ＝ＣＨ 2 ）
δ＝５．９ｐｐｍ （−ＣＨ＝）
出発原料、反応条件及び上記の分析値より、得られた化合物は式（８）
【００３３】
【化１２】
【００３４】
で示される化合物（平均分子量：４９６５）と推定した。
【００３５】
製造例２
トリグリセリルモノアリルエーテル１４０ｇ（０．５モル）と水酸化カリウム０．６ｇを５リットル容オートクレーブに仕込み、系内を窒素ガスに置換した後、１００℃に昇温した。次いでエチレンオキシド１３２０ｇ（３０モル）、プロピレンオキシド１１６ｇ（２モル）を計量槽に計り取り、均一になるまで混合した。
１１０±５℃、１０ｋｇ／ｃｍ2以下の条件で計量槽よりエチレンオキシドとプロピレンオキシド混合物を８時間かけて圧入した。圧入後、１時間反応を行い、次いで、窒素ガスを通じながら２００ｍｍＨｇの減圧下、３０分間で未反応のエチレンオキシドとプロピレンオキシドを除去した後、８０℃まで冷却した。その後、１０重量％塩酸水溶液でｐＨを７．０に調整し、１００±５℃、１００ｍｍＨｇの条件で１時間脱水を行った。次に８０℃に冷却して、析出した塩を濾別して化合物１５０５ｇを得た。
得られた化合物の水酸基価は７２．０（計算値は７１．２）、不飽和度は０．３０（計算値は０．３２）であった。
なお、水酸基価および不飽和度は、製造例１と同様にして測定した。
出発原料、反応条件及び上記の分析値より、得られた化合物は式（９）
【００３６】
【化１３】
【００３７】
で示される化合物（平均分子量：３１１７）と推定した。
【００３８】
製造例３
製造例２で得られた式（９）の化合物１０００ｇ（０．３２モル）と水酸化カリウム１５０ｇを、５リットル容オートクレーブに仕込み、系内を窒素ガスに置換した後、１００℃に昇温した。次いでメチルクロリド８７．０ｇ（１．６８モル）を１００±５℃の条件下で仕込んだ。４時間反応後、８０℃に冷却し、窒素ガスを通じながら減圧下（２００ｍｍＨｇ以下）で０．５時間、未反応のメチルクロリドを除去した。
次いで５００ｇの水を系中に加え撹拌を行った後、静置して分層を行い下層の過剰のアルカリ分を取り除いた。その後、１０重量％塩酸水溶液でｐＨを７．０に調整し、１００±５℃、１００ｍｍＨｇの条件で１時間脱水を行った。次に８０℃に冷却し、析出した塩を濾別して化合物９４７ｇを得た。
得られた化合物の水酸基価は０．０７（計算値は０）、不飽和度は０．２８（計算値は０．３２）であった。
なお、水酸基価および不飽和度は製造例１と同様にして測定した。
出発原料、反応条件及び上記の分析値より、得られた化合物は式（１０）
【００３９】
【化１４】
【００４０】
で示される化合物（平均分子量：３１７３）と推定した。
【００４１】
実施例１
四つ口フラスコに式（７）の化合物としてメルカプト酢酸（ＨＳＣＨ2ＣＯＯＨ）３７ｇ（０．４モル）を入れ、攪拌しながら温度を３５±５℃に保持した。次いで製造例１で合成した式（８）の化合物５００ｇ（０．１モル）をメタノール５００ｇに溶解させ、滴下ロートにより四つ口フラスコに５時間かけて滴下した。全量滴下終了後、更に４０±５℃で５時間保持して反応を続けた。
次に６０±１０℃、２００ｍｍＨｇ以下の減圧下でメタノールを留去したのち、反応混合物をクロロホルム１０００ｇに再び溶解させた。次に全量を分液ロートに移し、飽和食塩水１リットルで３回水洗し、未反応のメルカプト酢酸を除去した。次いで１１０±１０℃、窒素雰囲気下、５０ｍｍＨｇ以下の減圧下でクロロホルムおよび水を留去し、析出した食塩を濾過により除去し、化合物（分子量：５０４５）４７０ｇを得た。
得られた化合物の酸価は１１．５（計算値は１１．１）、不飽和度０．０２（計算値は０）であった。
なお、酸価はＪＩＳ Ｋ−１５５７，６．６（１９７０）の方法に準じて測定し、不飽和度は製造例１と同様にして測定した。
赤外線吸収スペクトルを図２に示す。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ／ＴＭＳ）
δ＝１．８５ｐｐｍ （−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ 2 ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝２．７５ｐｐｍ （−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 2 −Ｓ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝３．２ｐｐｍ （−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ 2 −ＣＯＯＨ）
出発原料、反応条件および上記の分析値より、得られた化合物は式（１１）
【００４２】
【化１５】
【００４３】
で示される化合物と推定した。
【００４４】
実施例２
四つ口フラスコに式（７）の化合物としてメルカプト酢酸（ＨＳＣＨ2ＣＯＯＨ）５９ｇ（０．６４モル）を入れ、かき混ぜながら温度を３５±５℃に保持した。次いで製造例３で合成した式（１０）の化合物５００ｇ（０．１６モル）をメタノール５００ｇに溶解させ、滴下ロートにより四つ口フラスコに５時間かけて滴下した。全量滴下終了後、更に４０±５℃で５時間保持して反応を続けた。次に６０±１０℃、２００ｍｍＨｇ以下の減圧下でメタノールを留去したのち、クロロホルム１０００ｇに再び溶解させた。次に全量を分液ロートに移し、飽和食塩水１リットルで３回水洗し、未反応のメルカプト酢酸を除去した。次いで１１０±１０℃、窒素雰囲気下、５０ｍｍＨｇ以下の減圧下でクロロホルムおよび水を留去し、析出した食塩を濾過により除去し、化合物（分子量：３２５３）４６８ｇを得た。
得られた化合物の酸価は１７．７（計算値は１７．２）、不飽和度０．０３（計算値は０）であった。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ／ＴＭＳ）
δ＝１．８５ｐｐｍ （−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ 2 ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝２．７５ｐｐｍ （−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 2 −Ｓ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝３．２ｐｐｍ （−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ 2 −ＣＯＯＨ）
出発原料、反応条件および上記の分析値より、得られた化合物は式（１２）
【００４５】
【化１６】
【００４６】
で示される化合物と推定した。
【００４７】
実施例３
四つ口フラスコに式（７）の化合物として３−メルカプトプロピオン酸（ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）４２ｇ（０．４モル）を入れ、攪拌しながら温度を３５±５℃に保持した。次いで製造例１で合成した式（８）の化合物５００ｇ（０．１モル）をメタノール５００ｇに溶解させ、滴下ロートにより四つ口フラスコに５時間かけて滴下した。全量滴下後、更に４０±５℃で５時間保持して反応を続けた。
次に６０±１０℃、２００ｍｍＨｇ以下の減圧下でメタノールを留去したのち、クロロホルム１０００ｇに再び溶解させた。次に全量を分液ロートに移し、飽和食塩水１リットルで３回水洗し、未反応の３−メルカプトプロピオン酸を除去した。次いで１１０±１０℃、窒素雰囲気下、５０ｍｍＨｇ以下の減圧下でクロロホルムおよび水を留去し、析出した食塩を濾過により除去し、化合物（分子量：５０５９）４８１ｇを得た。
得られた化合物の酸価は１１．４（計算値は１１．１）、不飽和度０．０２（計算値は０）であった。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ／ＴＭＳ）
δ＝１．８５ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ 2 ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝２．７５ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 2 −Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝２．８５ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ 2 ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝２．８１ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ 2 −ＣＯＯＨ）
出発原料、反応条件および上記の分析値より、得られた化合物は式（１３）
【００４８】
【化１７】
【００４９】
で示される化合物と推定した。
実施例４
四つ口フラスコに実施例１で得られた式（１１）の化合物３００ｇ（０．０６モル）とジメチルホルムアミド４５０ｇを入れ、かき混ぜながら温度を５０℃まで昇温し溶解した。次いで温度を３５±５℃まで冷却し、窒素雰囲気下でＮ−ヒドロキシコハク酸イミド８．３ｇ（０．０７モル）、ジシクロヘキシルキシルカルボジイミド１４．７ｇ（０．０７モル）を加え２時間反応を行った。
反応終了後、加圧濾過を行い得られた溶液に、−１０℃に冷却したイソプロピルアルコール５リットルを加え、０．５時間、室温で撹拌を行い、ポリオキシアルキレン化合物の結晶を析出させた。得られた結晶を減圧濾過により分取した後、再び−１０℃に冷却した後に、イソプロピルアルコール５リットルを加え、０．５時間洗浄を行った。減圧濾過により再び結晶を取り出した後、ヘキサン１０リットルを加え洗浄を行った。
最後に得られた結晶を真空乾燥機を使用して３５℃、５０ｍｍＨｇ以下で４時間真空乾燥を行い、化合物（分子量：５１６２）２５３ｇを得た。
赤外線吸収スペクトルを図３に示す。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ／ＴＭＳ）
【００５０】
【化１８】
【００５１】
出発原料、反応条件および上記の分析値より、得られた化合物は式（１４）
【００５２】
【化１９】
【００５３】
で示される化合物と推定した。
同様に、前記のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの代わりにｐ−ニトロフェノールを反応させて、式（３）で示される活性基をもつ化合物を得た。
【００５４】
試験例１
Ｌ−アスパラギナーゼ１０ｍｇを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）２ｍｌに、実施例４で得られた式（１４）の化合物をアスパラギナーゼ分子中のアミノ基に対して１５倍モル比加え、３７℃で１時間反応させた。常法により精製し、白色粉末の修飾アスパラギナーゼを得た。分子量は４０万であり、アミノ基の分析の結果、５０個が結合していたので、付加部分の分子量５０×５１６２＝約２５．８万とアスパラギナーゼの分子量１３．４万との合計値とほぼ一致した。このものは抗体との結合能は完全に消失しているが、酵素活性はＡ法で３５％、Ｂ法で４０％保持していた。これらの結果を表１に示す。
なお、アスパラギナーゼ分子中の結合したアミノ基の数の測定は、トリニトロベンゼンスルホン酸を用いて測定を行った。
また、酵素活性の測定は、Ｌ−グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼを用い、リンゴ酸の生成に伴うＮＡＤ＋の変化量を分光学的に測定する方法（Ａ法）及びアスパラギン酸とヒドロキシアミン共存下における同酵素によるアスパラギン酸ヒドロキサメートの生成を塩化第二鉄による発色させる方法（Ｂ法）により測定した。
更に抗原性の測定は、ウサギをＬ−アスパラギナーゼで免役した杭血清を用い、抗原−抗体反応により生ずる沈澱量を測定する方法により行い、抗体との結合能（抗原性）を測定した。
【００５５】
比較試験例１
Ｌ−アスパラギナーゼ１０ｍｇを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）２ｍｌに式（１５）
【００５６】
【化２０】
【００５７】
の化合物をアスパラギナーゼ分子中のアミノ基に対して１１倍モル比加え、３７℃で１時間反応させた。常法により精製し、白色粉末の修飾アスパラギナーゼを得た。分子量は４２万であり、アミノ基の分析結果、５４個が結合していたので、付加部分の分子量５４×５２００＝約２８万とアスパラギナーゼの分子量１３．４万との合計値とほぼ一致した。そして、このものは抗体との結合能は３５％になった。酵素活性はＡ法で１５％、Ｂ法で２２％保持していた。これらの結果を表１に示す。
なお、アスパラギナーゼ分子中の結合したアミノ基の数の測定は、トリニトロベンゼンスルホン酸を用いて測定を行った。
また、酵素活性の測定は、Ｌ−グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼを用い、リンゴ酸の生成に伴うＮＡＤ＋の変化量を分光学的に測定する方法（Ａ法）及びアスパラギン酸とヒドロキシアミン共存下における同酵素によるアスパラギン酸ヒドロキサメートの生成を塩化第二鉄による発色させる方法（Ｂ法）により測定した。
更に抗原性の測定は、ウサギをＬ−アスパラギナーゼで免役した杭血清を用い、抗原−抗体反応により生ずる沈澱量を測定する方法により行い、抗体との結合能（抗原性）を測定した。
【００５８】
【表１】
【００５９】
【発明の効果】
本発明の化合物はトリグリセリンの中央の水酸基にカルボキシル基あるいは活性化されたカルボキシル基を有するため、ポリペプチド、生理活性蛋白質、酵素等のアミノ基や水酸基と容易に反応することができ、かつ４本のポリオキシアルキレン鎖によって、当該物質の抗原性の低減、安定化、体内（血中）滞留時間の延長等の性能が発揮でき、毒性も少なく、さらに副生物の生成が少ないカルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】製造例１で得た化合物の赤外吸収スペクトルを示す。
【図２】実施例１で得た化合物の赤外吸収スペクトルを示す。
【図３】実施例４で得た化合物の赤外吸収スペクトルを示す。
【発明の属する技術分野】
本発明はトリグリセリンの中央にカルボキシル基または活性化されたカルボキシル基を導入したポリオキシアルキレン化合物に関する。さらに詳しくは、ポリペプチド、生理活性蛋白質、酵素などへのポリオキシアルキレン修飾や、リポソーム、ポリマーミセルなどの薬物送達システム（以下ドラッグデリバリーシステムという）におけるポリオキシアルキレン修飾など、主として医薬用途でのポリオキシアルキレン修飾に用いられる末端カルボキシル基を有するポリオキシアルキレン化合物に関する。
【０００２】
【従来の技術】
これまでポリオキシアルキレングリコールの末端水酸基をカルボキシル基に置換した化合物は、たとえば特公昭６３−４８７７号公報には潤滑油として、あるいは特開昭６３−１８２３４３号公報には合成樹脂添加剤として記載されており、幅広く利用されている。
近年になり、ポリオキシアルキレン化合物は、ドラッグデリバリーシステムの重要な担体として注目を集めるようになり、ポリオキシアルキレン化合物にアミノ基やカルボキシル基を導入した化合物についても研究が盛んに行われるようになっている。なかでも、２本のポリオキシアルキレン鎖を持つ化合物として、特開平３−７２４６９号公報に示されているトリアジン環を介した２，４−ビス（Ｏ−メトキシポリエチレングリコール）−６−クロロ−Ｓ−トリアジン（以下「活性化ＰＥＧ２」という）が知られている。また、ポリオキシアルキレン基の側鎖に多数のカルボキシル基を持つポリオキシアルキレン化合物も知られている（特開平８−４８７６３号公報）。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
特に、ポリオキシアルキレン化合物にて修飾した化合物ないしは薬剤（例えば、蛋白質、生理活性物質、ＤＮＡ等）、該修飾を利用するドラッグデリバリーシステムにおいては、▲１▼抗原性（免疫反応性）の低減、▲２▼化合物ないしは薬剤としての安定性の増加、▲３▼体内滞留時間の延長などの効果が得られるとされている。
ところが、これら従来のカルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物は、例えば一本鎖の末端カルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物の場合、これを用いて対象物質を修飾すると、一本鎖であるが故に、ポリオキシアルキレンの持つ抗原性の低減、対象物質の安定化などの性能が十分に発揮できないケースが多々ある。
【０００４】
また、前述した活性化ＰＥＧ２はトリアジン環を持つため、医薬品として体内に投与した場合、毒性が生じる可能性がある。
さらに、ポリオキシアルキレン骨格の側鎖に多数のカルボキシル基を持つものは、反応点が多数あるため修飾反応を制御するのが難しく、単一の化合物を得ることが困難である。
【０００５】
本発明の目的は、化合物ないしは薬剤の抗原性の低減、安定化、体内（血中）滞留時間の延長などの目的をもって、化合物ないしは薬剤を修飾するために使用され、しかも修飾された化合物ないしは薬剤は毒性が少なく、さらに副生物の生成が少ないカルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、トリグリセリンの中央の水酸基にカルボキシル基およびＮ−ヒドロキシコハク酸イミドまたはｐ−ニトロフェノールで活性化したカルボキシル基を導入したポリオキシアルキレン化合物が、上記した目的を達成できることを見出し、本発明に到達した。
すなわち本発明は、式（１）で示されるカルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物である。
【０００７】
【化４】
（式中、Ｒ1は水素原子、炭素数１〜２４の炭化水素基または炭素数１〜２４のアシル基、Ｒ2は炭素数３または４の炭化水素基、Ｒ3は炭素数１〜１０の炭化水素基、ＡＯは炭素数３または４のオキシアルキレン基、Ｙは水素原子、式（２）あるいは式（３）で示される活性基を示し、ｎはオキシエチレン基の平均付加モル数で１〜１０００であり、ｍは炭素数３または４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で０〜２５０であり、ｎ／（ｎ＋ｍ）は０．８以上であり、オキシエチレン基と炭素数３または４のオキシアルキレン基の付加状態はブロック状でもランダム状でもよい。）
【０００９】
【化５】
【化６】
【発明の実施の形態】
式（１）において、Ｒ1で示される炭素数１〜２４の炭化水素基としては、脂肪族炭化水素基として、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、第三ブチル基、ペンチル基、イソペンチル基、ヘキシル基、ヘプチル基、イソヘプチル基、オクチル基、２−エチルヘキシル基、ノニル基、イソノニル基、デシル基、ウンデシル基、ドデシル基、トリデシル基、イソトリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ヘキサデシル基、イソヘキサデシル基、ヘプタデシル基、オクタデシル基、イソオクタデシル基、ノナデシル基、エイコシル基、オクチルドデシル基、ヘンエイコシル基、ドコシル基、デシルテトラデシル基などの直鎖または分岐状のアルキル基、芳香族炭化水素基として、ブチルフェニル基、ジブチルフェニル基、オクチルフェニル基、ジノニルフェニル基およびα−メチルベンジルフェニル基などのアリール基、ベンジル基などのアラルキル基、およびクレジル基などが挙げられる。
【００１２】
また、炭素数１〜２４のアシル基としては、酢酸、プロピオン酸、酪酸、イソ酪酸、カプリル酸、２−エチルヘキサン酸、イソノナン酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、アラキン酸、ベヘン酸、パルミトレイン酸、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、桂皮酸、没食子酸などに由来するアシル基が挙げられる。
これらのなかでも、Ｒ1としては、水素原子および炭素数１〜４の直鎖のアルキル基が好ましく、水素原子およびメチル基が特に好ましい。なお、式（１）中にはＲ1が４つ存在するが、これらは同一または異なっていてもよい。
【００１３】
Ｒ2で示される炭素数３または４の炭化水素基としては、重合性不飽和基をもつ炭化水素基に由来する基、好ましくはアリル基、メタリル基など二重結合をもつ炭化水素基に由来する基、トリメチレン基、ブチレン基等の直鎖または分岐状のアルキレン基などが挙げられる。
【００１４】
Ｒ3で示される炭素数１〜１０の炭化水素基としては、メチレン基、エチレン基、プロピレン基およびトリメチレン基などの直鎖または分岐状のアルキレン基、フェニレン基および式（４）で示される２価の芳香族炭化水素基が挙げられ、メチレン基およびエチレン基が好ましい。
【００１５】
【化７】
ＡＯで示される炭素数３または４のオキシアルキレン基のアルキレン部分は、直鎖または分岐状のいずれでもよく、このようなオキシアルキレン基として、たとえば、オキシプロピレン基、オキシトリメチレン基、オキシブチレン基、オキシテトラメチレン基などが挙げられる。
【００１７】
Ｙは水素原子、式（２）または式（３）で示される活性基であるが、対象物質との反応性の点から式（２）および式（３）で示される活性基が好ましい。
ｎはオキシエチレン基の平均付加モル数で１〜１０００であり、ｍは炭素数３または４のオキシアルキレン基の平均付加モル数で０〜２５０であり、ｎ／（ｎ＋ｍ）は０．８以上、好ましくは０．９以上、より好ましくは１．０以上である。
オキシエチレン基と炭素数３または４のオキシアルキレン基の付加状態はブロック状でもランダム状でもよい。
【００１８】
式（１）で示される本発明のカルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物は、例えば、以下のようにして製造することができる。
まず、式（５）
【００１９】
【化８】
（式中、Ｒ2'は重合性不飽和基をもつ炭化水素基、好ましくはアリル基あるいはメタリル基などの炭素数３または４の二重結合含有アルキル基を示す。）
で示される化合物に、エチレンオキシド単独、あるいはエチレンオキシドおよび炭素数３または４のアルキレンオキシドとを付加させる。この際、式（５）で示される化合物にエチレンオキシドを付加させた後、炭素数３または４のアルキレンオキシドを付加させてもよいし、エチレンオキシドと炭素数３または４のアルキレンオキシドとを混合して一度に付加反応を行ってもよい。エチレンオキシドと炭素数３または４のアルキレンオキシドの付加モル数の比率は、修飾化時に修飾率が低下する恐れがあるので、オキシエチレン基が８０％以上となるようにする。
【００２１】
具体的には、まず式（５）で示される化合物を反応釜に仕込み、窒素置換を行い、１００〜１４０℃でエチレンオキシド単独、あるいはエチレンオキシドと炭素数３または４のアルキレンオキシドとの混合物であるアルキレンオキシドを圧入し、反応させる。反応終了後、減圧下で未反応アルキレンオキシドを除去し、８０℃に冷却し、リン酸、塩酸などの酸を加え中和し、脱水および濾過を行い、式（６'）
【００２２】
【化９】
（式中の記号は前記と同義）
で示される化合物を得る。
必要に応じて末端水酸基をアルキル化あるいはアシル化するなど、炭化水素基の導入を行って、式（６''）
【００２４】
【化１０】
（式中、Ｒ1'は炭素数１〜２４の炭化水素基または炭素数１〜２４のアシル基を示し、その他の記号は前記と同義）
で示される化合物となる。
例えば、アルキル化反応は、Ｒ1で示される炭化水素基を有するアルキルハライド（ハロゲン化アルキル）、アルケニルハライドなどのアルキル化剤を、化合物（６'）の水酸基に対して１．１〜３．０倍モル加え、９０〜１２０℃で２〜５時間反応を行い、水洗し、未反応物を除去し、中和、脱水および濾過を行う。アシル化の反応は、Ｒ1で示されるアシル基を有するハロゲン化アシルやカルボン酸無水物などのアシル化剤を、式（６'）で示される化合物の水酸基に対して１．１〜２．０倍モル加え、ｐ−トルエンスルホン酸存在下、１１０〜１４０℃で９時間、脱水縮合反応を行い、吸着剤処理し、脱水、濾過する。
【００２６】
上記のハロゲン化物やカルボン酸無水物中のＲ1が芳香族炭化水素基である化合物を用いた場合、芳香族炭化水素基が導入される。この場合の反応条件も上記したアルキル化およびアシル化に準じる。
このようにして得た式（６）
【００２７】
【化１１】
（式中の各記号は前記と同義）
で示される化合物に、式（７）
ＨＳ−Ｒ3−ＣＯＯＨ （７）
（式中Ｒ3は前記と同義）
で示される化合物を、式（６）で示される化合物中のアリル基またはメタリル基に対して１．５〜１０倍モル加え、例えばメタノール、エタノールなどのアルコール中で３０〜４０℃で３〜７時間反応させ、カルボキシル基の導入を行う。
反応終了後、アルコールを留去し、反応混合物をクロロホルムやジクロロメタンなどの溶媒に溶解し、その後水洗して未反応の式（７）で示される化合物を除去する。ついで溶媒を留去し、濾過し、式（１）で示される化合物（ただし、式中のＹは水素原子）を得る。
【００２９】
その後、例えばジメチルホルムアミド、クロロホルム、トルエンなどの溶媒中、ジシクロヘキシルカルボジイミド存在下で、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドまたはｐ−ニトロフェノールを３０〜４０℃で反応させ、濾過後、イソプロピルアルコールやヘキサンで晶析を行うことによって、カルボキシル基が活性化された式（１）（ただし、式中のＹは式（２）または（３）で示される活性基）の化合物となる。
【００３０】
本発明のカルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物は、例えば（１）抗腫瘍蛋白質であるアスパラギナーゼ、アルギナーゼなどに対する修飾、（２）代謝異常酵素であるアデノシンデアミナーゼ、インスリン、ウリカーゼなどに対する修飾、（３）抗原蛋白質である免疫グロブリン、血清アルブミンなどに対する修飾、（４）抗炎症酵素であるカタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼなどに対する修飾、（５）血液成分蛋白質であるアルブミン、顆粒球コロニー刺激因子などに対する修飾に使用することが考えられる。
【００３１】
また、ドラッグデリバリーシステムへの利用としては、制癌剤であるアドリアマイシン、シスプラチンなどを内包するリポソームの基材であるリン脂質への化学修飾などが考えられる。
いずれも、ポリオキシアルキレン基で修飾されることにより、免疫原性の向上、薬物の安定化、血中滞留時間の延長などの効果が期待される。
【００３２】
【実施例】
以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。
製造例１
トリグリセリルモノアリルエーテル１４０ｇ（０．５モル）と水酸化カリウム１ｇを５リットル容オートクレーブに仕込み、系内を窒素ガスに置換した後、１２０℃に昇温した。次いでエチレンオキシド２３６０ｇ（５４モル）を圧入後、１３０±５℃で１時間反応を行った。次いで、窒素ガスを通じながら減圧下（２００ｍｍＨｇ、０．５時間）で未反応のエチレンオキシドを除去し、８０℃まで冷却した。その後、１０重量％塩酸水溶液でｐＨを７．０に調整し、１００±５℃で１００ｍｍＨｇ、１時間脱水を行った。次いで反応混合物を８０℃に冷却し、析出した塩を濾別して化合物２４１０ｇを得た。
得られた化合物の水酸基価は、４５．２（計算値は４４．９）、不飽和度は０．１９（計算値は０．２）であった。
なお、水酸基価は、ＪＩＳ Ｋ−１５５７ ６．４（１９７０）の方法に準じて、不飽和度は、ＪＩＳ Ｋ−１５５７ ６．７（１９７０）の方法に準じて測定した。
化合物の赤外線吸収スペクトルを図１に示す。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ／ＴＭＳ）
δ＝５．２ｐｐｍ （Ｃ＝ＣＨ 2 ）
δ＝５．９ｐｐｍ （−ＣＨ＝）
出発原料、反応条件及び上記の分析値より、得られた化合物は式（８）
【００３３】
【化１２】
で示される化合物（平均分子量：４９６５）と推定した。
【００３５】
製造例２
トリグリセリルモノアリルエーテル１４０ｇ（０．５モル）と水酸化カリウム０．６ｇを５リットル容オートクレーブに仕込み、系内を窒素ガスに置換した後、１００℃に昇温した。次いでエチレンオキシド１３２０ｇ（３０モル）、プロピレンオキシド１１６ｇ（２モル）を計量槽に計り取り、均一になるまで混合した。
１１０±５℃、１０ｋｇ／ｃｍ2以下の条件で計量槽よりエチレンオキシドとプロピレンオキシド混合物を８時間かけて圧入した。圧入後、１時間反応を行い、次いで、窒素ガスを通じながら２００ｍｍＨｇの減圧下、３０分間で未反応のエチレンオキシドとプロピレンオキシドを除去した後、８０℃まで冷却した。その後、１０重量％塩酸水溶液でｐＨを７．０に調整し、１００±５℃、１００ｍｍＨｇの条件で１時間脱水を行った。次に８０℃に冷却して、析出した塩を濾別して化合物１５０５ｇを得た。
得られた化合物の水酸基価は７２．０（計算値は７１．２）、不飽和度は０．３０（計算値は０．３２）であった。
なお、水酸基価および不飽和度は、製造例１と同様にして測定した。
出発原料、反応条件及び上記の分析値より、得られた化合物は式（９）
【００３６】
【化１３】
で示される化合物（平均分子量：３１１７）と推定した。
【００３８】
製造例３
製造例２で得られた式（９）の化合物１０００ｇ（０．３２モル）と水酸化カリウム１５０ｇを、５リットル容オートクレーブに仕込み、系内を窒素ガスに置換した後、１００℃に昇温した。次いでメチルクロリド８７．０ｇ（１．６８モル）を１００±５℃の条件下で仕込んだ。４時間反応後、８０℃に冷却し、窒素ガスを通じながら減圧下（２００ｍｍＨｇ以下）で０．５時間、未反応のメチルクロリドを除去した。
次いで５００ｇの水を系中に加え撹拌を行った後、静置して分層を行い下層の過剰のアルカリ分を取り除いた。その後、１０重量％塩酸水溶液でｐＨを７．０に調整し、１００±５℃、１００ｍｍＨｇの条件で１時間脱水を行った。次に８０℃に冷却し、析出した塩を濾別して化合物９４７ｇを得た。
得られた化合物の水酸基価は０．０７（計算値は０）、不飽和度は０．２８（計算値は０．３２）であった。
なお、水酸基価および不飽和度は製造例１と同様にして測定した。
出発原料、反応条件及び上記の分析値より、得られた化合物は式（１０）
【００３９】
【化１４】
で示される化合物（平均分子量：３１７３）と推定した。
【００４１】
実施例１
四つ口フラスコに式（７）の化合物としてメルカプト酢酸（ＨＳＣＨ2ＣＯＯＨ）３７ｇ（０．４モル）を入れ、攪拌しながら温度を３５±５℃に保持した。次いで製造例１で合成した式（８）の化合物５００ｇ（０．１モル）をメタノール５００ｇに溶解させ、滴下ロートにより四つ口フラスコに５時間かけて滴下した。全量滴下終了後、更に４０±５℃で５時間保持して反応を続けた。
次に６０±１０℃、２００ｍｍＨｇ以下の減圧下でメタノールを留去したのち、反応混合物をクロロホルム１０００ｇに再び溶解させた。次に全量を分液ロートに移し、飽和食塩水１リットルで３回水洗し、未反応のメルカプト酢酸を除去した。次いで１１０±１０℃、窒素雰囲気下、５０ｍｍＨｇ以下の減圧下でクロロホルムおよび水を留去し、析出した食塩を濾過により除去し、化合物（分子量：５０４５）４７０ｇを得た。
得られた化合物の酸価は１１．５（計算値は１１．１）、不飽和度０．０２（計算値は０）であった。
なお、酸価はＪＩＳ Ｋ−１５５７，６．６（１９７０）の方法に準じて測定し、不飽和度は製造例１と同様にして測定した。
赤外線吸収スペクトルを図２に示す。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ／ＴＭＳ）
δ＝１．８５ｐｐｍ （−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ 2 ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝２．７５ｐｐｍ （−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 2 −Ｓ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝３．２ｐｐｍ （−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ 2 −ＣＯＯＨ）
出発原料、反応条件および上記の分析値より、得られた化合物は式（１１）
【００４２】
【化１５】
で示される化合物と推定した。
【００４４】
実施例２
四つ口フラスコに式（７）の化合物としてメルカプト酢酸（ＨＳＣＨ2ＣＯＯＨ）５９ｇ（０．６４モル）を入れ、かき混ぜながら温度を３５±５℃に保持した。次いで製造例３で合成した式（１０）の化合物５００ｇ（０．１６モル）をメタノール５００ｇに溶解させ、滴下ロートにより四つ口フラスコに５時間かけて滴下した。全量滴下終了後、更に４０±５℃で５時間保持して反応を続けた。次に６０±１０℃、２００ｍｍＨｇ以下の減圧下でメタノールを留去したのち、クロロホルム１０００ｇに再び溶解させた。次に全量を分液ロートに移し、飽和食塩水１リットルで３回水洗し、未反応のメルカプト酢酸を除去した。次いで１１０±１０℃、窒素雰囲気下、５０ｍｍＨｇ以下の減圧下でクロロホルムおよび水を留去し、析出した食塩を濾過により除去し、化合物（分子量：３２５３）４６８ｇを得た。
得られた化合物の酸価は１７．７（計算値は１７．２）、不飽和度０．０３（計算値は０）であった。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ／ＴＭＳ）
δ＝１．８５ｐｐｍ （−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ 2 ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝２．７５ｐｐｍ （−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 2 −Ｓ−ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝３．２ｐｐｍ （−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ 2 −ＣＯＯＨ）
出発原料、反応条件および上記の分析値より、得られた化合物は式（１２）
【００４５】
【化１６】
で示される化合物と推定した。
【００４７】
実施例３
四つ口フラスコに式（７）の化合物として３−メルカプトプロピオン酸（ＨＳＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ）４２ｇ（０．４モル）を入れ、攪拌しながら温度を３５±５℃に保持した。次いで製造例１で合成した式（８）の化合物５００ｇ（０．１モル）をメタノール５００ｇに溶解させ、滴下ロートにより四つ口フラスコに５時間かけて滴下した。全量滴下後、更に４０±５℃で５時間保持して反応を続けた。
次に６０±１０℃、２００ｍｍＨｇ以下の減圧下でメタノールを留去したのち、クロロホルム１０００ｇに再び溶解させた。次に全量を分液ロートに移し、飽和食塩水１リットルで３回水洗し、未反応の３−メルカプトプロピオン酸を除去した。次いで１１０±１０℃、窒素雰囲気下、５０ｍｍＨｇ以下の減圧下でクロロホルムおよび水を留去し、析出した食塩を濾過により除去し、化合物（分子量：５０５９）４８１ｇを得た。
得られた化合物の酸価は１１．４（計算値は１１．１）、不飽和度０．０２（計算値は０）であった。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ／ＴＭＳ）
δ＝１．８５ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ 2 ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝２．７５ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ 2 −Ｓ−ＣＨ2ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝２．８５ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ 2 ＣＨ2−ＣＯＯＨ）
δ＝２．８１ｐｐｍ（−Ｏ−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−Ｓ−ＣＨ2ＣＨ 2 −ＣＯＯＨ）
出発原料、反応条件および上記の分析値より、得られた化合物は式（１３）
【００４８】
【化１７】
で示される化合物と推定した。
実施例４
四つ口フラスコに実施例１で得られた式（１１）の化合物３００ｇ（０．０６モル）とジメチルホルムアミド４５０ｇを入れ、かき混ぜながら温度を５０℃まで昇温し溶解した。次いで温度を３５±５℃まで冷却し、窒素雰囲気下でＮ−ヒドロキシコハク酸イミド８．３ｇ（０．０７モル）、ジシクロヘキシルキシルカルボジイミド１４．７ｇ（０．０７モル）を加え２時間反応を行った。
反応終了後、加圧濾過を行い得られた溶液に、−１０℃に冷却したイソプロピルアルコール５リットルを加え、０．５時間、室温で撹拌を行い、ポリオキシアルキレン化合物の結晶を析出させた。得られた結晶を減圧濾過により分取した後、再び−１０℃に冷却した後に、イソプロピルアルコール５リットルを加え、０．５時間洗浄を行った。減圧濾過により再び結晶を取り出した後、ヘキサン１０リットルを加え洗浄を行った。
最後に得られた結晶を真空乾燥機を使用して３５℃、５０ｍｍＨｇ以下で４時間真空乾燥を行い、化合物（分子量：５１６２）２５３ｇを得た。
赤外線吸収スペクトルを図３に示す。
1Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果を以下に示す。
1Ｈ−ＮＭＲ（δ（ｐｐｍ），ＣＤＣｌ／ＴＭＳ）
【００５０】
【化１８】
出発原料、反応条件および上記の分析値より、得られた化合物は式（１４）
【００５２】
【化１９】
で示される化合物と推定した。
同様に、前記のＮ−ヒドロキシコハク酸イミドの代わりにｐ−ニトロフェノールを反応させて、式（３）で示される活性基をもつ化合物を得た。
【００５４】
試験例１
Ｌ−アスパラギナーゼ１０ｍｇを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）２ｍｌに、実施例４で得られた式（１４）の化合物をアスパラギナーゼ分子中のアミノ基に対して１５倍モル比加え、３７℃で１時間反応させた。常法により精製し、白色粉末の修飾アスパラギナーゼを得た。分子量は４０万であり、アミノ基の分析の結果、５０個が結合していたので、付加部分の分子量５０×５１６２＝約２５．８万とアスパラギナーゼの分子量１３．４万との合計値とほぼ一致した。このものは抗体との結合能は完全に消失しているが、酵素活性はＡ法で３５％、Ｂ法で４０％保持していた。これらの結果を表１に示す。
なお、アスパラギナーゼ分子中の結合したアミノ基の数の測定は、トリニトロベンゼンスルホン酸を用いて測定を行った。
また、酵素活性の測定は、Ｌ−グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼを用い、リンゴ酸の生成に伴うＮＡＤ＋の変化量を分光学的に測定する方法（Ａ法）及びアスパラギン酸とヒドロキシアミン共存下における同酵素によるアスパラギン酸ヒドロキサメートの生成を塩化第二鉄による発色させる方法（Ｂ法）により測定した。
更に抗原性の測定は、ウサギをＬ−アスパラギナーゼで免役した杭血清を用い、抗原−抗体反応により生ずる沈澱量を測定する方法により行い、抗体との結合能（抗原性）を測定した。
【００５５】
比較試験例１
Ｌ−アスパラギナーゼ１０ｍｇを含む０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ１０）２ｍｌに式（１５）
【００５６】
【化２０】
の化合物をアスパラギナーゼ分子中のアミノ基に対して１１倍モル比加え、３７℃で１時間反応させた。常法により精製し、白色粉末の修飾アスパラギナーゼを得た。分子量は４２万であり、アミノ基の分析結果、５４個が結合していたので、付加部分の分子量５４×５２００＝約２８万とアスパラギナーゼの分子量１３．４万との合計値とほぼ一致した。そして、このものは抗体との結合能は３５％になった。酵素活性はＡ法で１５％、Ｂ法で２２％保持していた。これらの結果を表１に示す。
なお、アスパラギナーゼ分子中の結合したアミノ基の数の測定は、トリニトロベンゼンスルホン酸を用いて測定を行った。
また、酵素活性の測定は、Ｌ−グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼを用い、リンゴ酸の生成に伴うＮＡＤ＋の変化量を分光学的に測定する方法（Ａ法）及びアスパラギン酸とヒドロキシアミン共存下における同酵素によるアスパラギン酸ヒドロキサメートの生成を塩化第二鉄による発色させる方法（Ｂ法）により測定した。
更に抗原性の測定は、ウサギをＬ−アスパラギナーゼで免役した杭血清を用い、抗原−抗体反応により生ずる沈澱量を測定する方法により行い、抗体との結合能（抗原性）を測定した。
【００５８】
【表１】
【発明の効果】
本発明の化合物はトリグリセリンの中央の水酸基にカルボキシル基あるいは活性化されたカルボキシル基を有するため、ポリペプチド、生理活性蛋白質、酵素等のアミノ基や水酸基と容易に反応することができ、かつ４本のポリオキシアルキレン鎖によって、当該物質の抗原性の低減、安定化、体内（血中）滞留時間の延長等の性能が発揮でき、毒性も少なく、さらに副生物の生成が少ないカルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物を得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】製造例１で得た化合物の赤外吸収スペクトルを示す。
【図２】実施例１で得た化合物の赤外吸収スペクトルを示す。
【図３】実施例４で得た化合物の赤外吸収スペクトルを示す。
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- 式（１）で示されるカルボキシル基含有ポリオキシアルキレン化合物。
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