JP3735641B2 - 遺伝子導入方法及び薬剤導入方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、動物細胞に外来遺伝子を導入する遺伝子導入方法と生物細胞に薬剤を導入する薬剤導入方法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
細胞に外来遺伝子を導入する手法は、種々あるが、広範な生物種に適用できるエレクトロポレーションによる方法が注目を集めている。エレクトロポレーション法は、導入したい外来遺伝子の存在下において、電気パルスを印加し、細胞内に外来遺伝子を導入するものである。ここで、この電気パルスとしては、AC(交流)パルス、エクスポネンシャルパルスなどがある。
【0003】
そして、近年、DC(直流)パルスを印加できる遺伝子導入装置が実用化され、DCパルスによる遺伝子導入が試みられ始めている。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】
ところが、従来のDCパルスによる遺伝子導入方法(以下単に「従来方法」という)では、DCパルスのオン時間の長さ、電圧を、遺伝子導入の効率を確かめながら、導入対象にあわせて設定していた。このような設定を工夫すると、遺伝子導入の効率をある程度高くすることができる。
【0005】
しかしながら、細胞に遺伝子を導入できても、導入後まもなく、細胞が壊死してしまうことが多く、バイアビリティ(遺伝子導入後に細胞が生きている率)が低く、また、著しい奇型が生じやすいという問題点があった。
【0006】
ところで、従来方法では、DCパルスのオン時間とオフ時間の和(周期)は、約1秒に固定されていた。これは、この種の遺伝子導入装置として、米国BTX社T820(商標)なる製品が、デファクトスタンダードとなっており、右製品では、一周期を約1秒に固定した設定しか行えないようになっているためと思われる。
【0007】
したがって、1秒間に何周期も連続してDCパルスを印加する手法は試みられていない。一方で、本出願人らは、1秒間に何周期も連続してDCパルスを印加できる遺伝子導入装置を開発した。そして、右装置を用いて、本発明者らが、鋭意実験研究を行った結果、バイアビリティを大幅に向上でき、奇型が全く生じないとの知見を得た。即ち、本発明は、DCパルスによるエレクトロポレーションを用い、バイアビリティを大幅に向上でき、奇型の発生を抑制できる遺伝子導入方法を提供することを第1の目的とする。
【0008】
また、同様に、エレクトロポレーションは、抗癌剤等の薬剤を生物細胞に導入する用途にも用いられる。しかしながら、従来の遺伝子導入装置では、高電場強度である1000〜3000v/cmの高電圧を1秒に1回印加するものとなっており、組織細胞に対する電気的損傷があり、細胞への薬剤導入効率が低いので、実際の臨床応用には不適であった。
【0009】
そこで本発明は、従来法に比べて、電場強度を大幅に低下でき、臨床応用に適した薬剤導入方法を提供することを第2の目的とする。
【0010】
【課題を解決するための手段】
第1の目的のため、本発明の遺伝子導入方法は、非ヒト動物細胞へエレクトロポレーションにより外来遺伝子を導入するにあたり、電気パルスとしてDCパルスを用い、DCパルスのオン時間とオフ時間とを定め、オン時間とオフ時間との時間和を一周期とし、1秒間に複数回連続して周期によるDCパルスを発生させることにより、外来遺伝子を導入する。
【0011】
この構成により、DCパルスによるエレクトロポレーションを用い、バイアビリティを大幅に向上でき、奇型の発生を抑制できる。
【0012】
また、第2の目的のため、本発明の薬剤導入方法は、非ヒト生物細胞へエレクトロポレーションにより薬剤を導入するにあたり、電気パルスとしてDCパルスを用い、DCパルスのオン時間とオフ時間とを定め、オン時間とオフ時間との時間和を一周期とし、1秒間に複数回連続して周期によるDCパルスを発生させることにより、薬剤を導入する。
【0013】
この構成により、従来法に比べて印加電場強度を約10分の1程度に下げることができ、組織(細胞)は電気的損傷を被ることなく、細胞への薬剤導入効率が著しく高くなるので、臨床応用への道を開くことができる。
【0014】
【発明の実施の形態】
請求項1記載の遺伝子導入方法では、非ヒト動物細胞へエレクトロポレーションにより外来遺伝子を導入するにあたり、電気パルスとしてDCパルスを用い、DCパルスのオン時間とオフ時間とを定め、オン時間とオフ時間との時間和を一周期とし、1秒間に複数回連続して周期によるDCパルスを発生させることにより、外来遺伝子を導入する。
【0015】
請求項2記載の遺伝子導入方法では、DCパルスのオン時間の電場強度は、1〜500v/cmである。この電場強度の中から、対象となる動物細胞や緩衝液などの条件に合う電場強度を選択できる。
【0016】
請求項3記載の遺伝子導入方法では、オン時間及びオフ時間は、1〜999msecである。このオン時間及びオフ時間の中から、対象となる動物細胞や緩衝液などの条件に合うオン時間及びオフ時間を選択できる。
【0017】
請求項4記載の遺伝子導入方法では、周期は、1秒間に2〜99回連続する。この周期の連続回数の中から、対象となる動物細胞や緩衝液などの条件に合う周期の連続回数を選択できる。
【0018】
以上の構成は、薬剤の導入にも応用できる。
【0019】
(第1の実施の形態)
次に図面を参照しながら、本発明の第1の実施の形態について説明する。図1は、本発明の第1の実施の形態における遺伝子導入装置の概念図である。ここでは、後述するように、動物細胞として角膜内皮細胞を選ぶ。
【0020】
図1において、1は、ステンレス鋼、金、白金などの導電性材料から構成される電極部であり、そのうち、2は、細長い円柱状の第1電極であり、その外周を円環状をなす第2電極3が同心円状かつ一体的に取り囲んでいる。即ち、第1電極2と第2電極3との間には、リング状の空間4が開けてあり、第1電極2と第2電極3とは、電気的に絶縁されている。
【0021】
第1電極2の下面は、緩衝液の注入口に接触させる第1接触面5であり、第2電極3の下面は、この注入口の外周側で眼球の角膜に接触する第2接触面6であり、第1接触面5と第2接触面6とは、ほぼ面一になっている。
【0022】
7は、例えばベークライトやテフロン等で円筒状に形成される握り部であって、作業者が片手でつかみやすい形状にする。8、9は、握り部7内を貫通し、第1電極2と第2電極3にそれぞれ電気的に接続される配線である。配線8、9の外周は、例えば絶縁体からなるパイプで包囲されており、配線8、9によって、電極部1は握り部7に剛結された状態にあり、電極部1は、握り部7に対して、ペン状に支持されている。したがって、作業者が握り部7を把持し、握り部7を移動させると、電極部1を容易に任意の位置へ移動させることができる。配線8、9の後端部は、端子10、11となっており、次に述べるパルス印加手段12に電気的に接続される。
【0023】
パルス印加手段12のうち、13は、矩形波印加手段である。矩形波印加手段13は、上述のように、第1電極2及び第2電極3に接続され、これらの電極2、3にDCパルスを印加するものであって、オン時間及びオフ時間を100μs〜1000msecの範囲で設定でき、オン時の電場強度を1〜500v/cmの範囲で設定可能なものを用いる。
【0024】
また、パルス印加手段12のうち、14は、インピーダンス測定手段であり、DCパルス印加前後において、これらの電極2、3間のインピーダンスを測り、細胞の損傷程度を知るためのものである。このインピーダンスを適切にすると、矩形波印加手段13の印加条件を最適化できる。
【0025】
さて、以上の装置を用いるに先立ち、外来遺伝子を緩衝液に含有させ、この緩衝液を、対象となる動物細胞に注入する。そして、第1接触面5を注入口に接触させ、その外周に第2接触面6を接触させ、矩形波印加手段13を用いて、これらの電極2、3巻にDCパルスを印加する。このDCパルスの印加によって、外来遺伝子は、電極部1が接触している箇所において、対象となる動物細胞へ導入される。なお、本出願人が開発したCUY21(商標)又はその後続の製品には、以上のパルス印加手段12が搭載されている。
【0026】
(実験例1)
本発明者は、次の実験を行った。まず、遺伝子の導入対象として、ウィスター系成熟ラットの角膜内皮を選び、BSS(balanced salt saline)からなる緩衝液に、lacZ遺伝子を含んだプラスミドDNAを0.5μg/l入れた。そして、この緩衝液を、30Gの針を付けたマイクロシリンジに入れ、上記ラットの眼球の前房内に注入した。
【0027】
さて、遺伝子の導入が成功したかどうかを直接測ることは、容易でない。このため、本実験では、遺伝子の導入ができたかどうかを確認できるマーカーとなりうるlacZ遺伝子を用いた。勿論、これは、実験結果を確認するための選択であって、実際に治療などに応用する際には、マーカーとなり得ない他の遺伝子を用いることができる。
【0028】
さて、lacZ遺伝子の導入が成功しlacZ遺伝子が角膜内皮中に存在したとすると、X−gal(本実験では、1mg/ml)と反応させることにより、緑様の呈色があらわれる。つまり、この呈色の有無及びその広さを調べることにより、遺伝子導入の成否及びその効果を知ることができる。そして、この効果を示す指標として、本実験では、呈色が確認された面積を、電極部1の外周で囲まれる円の面積で除した面積比(%)を用いている。
【0029】
次に、図1に示した電極部1の第1接触面5の中心をハミルトンシリンジの針による注入口に合わせて接触させ、その外周に第2接触面6を接触させる。そして、矩形波印加手段13により、次の周期を連続8回行った。
オン時の電場強度 200v/cm(電極間のギャップは1mm)
オン時間 50msec、
オフ時間 80msec、
周期 130msec。
そして、ラットから眼球を摘出し、面積比を求めたところ、面積比は100%であった。
【0030】
一方、比較例1として、上記の条件に対し、以下の点のみを変更した実験を行った。
オフ時間 1000msec、
周期 1050msec。これによる面積比は、20%弱であった。
【0031】
結果を比べると、比較例1に対し、実験例1では、導入効率が面積で5倍以上高まり、しかも、壊死による障害は軽減した。つまり、実験例1のバイアビリティは、比較例1の5倍以上に向上したものである。勿論、本発明は、本形態や実験例1のみに限定されるものではない。
【0032】
(第2の実施の形態)
次に、図2〜図6を参照しながら、本発明の第2の実施の形態を説明する。ここで、パルス印加手段12は、第1の実施の形態と同様のものを用いる。
【0033】
第2の実施の形態では、遺伝子導入対象となる動物細胞として、ニワトリ初期胚(以下単に「胚」という)を選ぶ。そして、次のような導入装置を用意する。
【0034】
図2、図3に示すように、ガラス製のシャーレ15の底面に、円板状の液担体16を載置する。この液担体16は、硬いシリコンゴムや合成樹脂などから構成され、上面が平坦になるように仕上げられている。そして、液担体16の上部中央には、凹部17が形成され、凹部17に緩衝液を溜めうるようになっている。
【0035】
さらに、図3矢印で拡大して示しているように、凹部17の底面には、矩形板状の導電体からなる第1電極18が装着され、第1電極18の周縁には、絶縁体19が装填されている。そして、第1電極18は、配線20によってパルス印加手段12の−極側に電気的に接続され、この例では、上方に2mm角だけ露出している。また、第1電極18と同外形を持つ、第2電極21を、図4に示すように形成し、パルス印加手段12の+極側へ接続する。なお、後述するように、凹部17に緩衝液23を溜めるので、胚は第1電極18に直接接触しないようになっている。
【0036】
次に、図5、図6を用いて、以上の装置による遺伝子導入過程を説明する。まず、卵から、卵黄膜25、外胚葉28及び内胚葉29を含む、胚を取り出す。また、導入する遺伝子27として、チキン胚導入遺伝子GFP(Plasmid name:pCAGGS-AFP)を用意する。
【0037】
そして、図5(a)に示すように、液担体16の凹部17に、緩衝液23を溜める。次に、図5(b)に示すように、胚を、その導入箇所が緩衝液23上に位置するように、液担体16の上に敷く。さらに、図5(c)及び図6に示すように、ガラス製円環状のリング26を胚の上に載せる。
【0038】
そして、図5(d)に示すように、胚の周囲を折り畳み、図6(b)に示すように、リング26にならわせて整形する。本来、図6に示すように、胚は、不定形で変形しやすいが、以上の整形によって、胚はリング26に拘束された一定の姿勢を保持し、テンションを有する状態となる。次いで、胚の卵黄膜25と外胚葉28との間に遺伝27を注入する。
【0039】
次に、図5(e)に示すように、内胚葉29に第2電極21を接近させ、凹部17内の第1電極18と第2電極21との間(電極間のギャップは1mm)に、パルス印加手段12からDCパルスを印加して、エレクトロポレーションを行う。
【0040】
(実験2)
以上の要領で、本発明者は、次の実験を行った。ここでの導入対象は、上述のようにニワトリ初期胚であり、より詳しくは、同初期胚の予定神経板である。また、緩衝液23として、次のものを使用した。
PBS(+)
1リットル中、8.0g NaCl,0.2g KCl,2.9g Na2HPO4・12H2O,0.2g KH2PO4に、
0.1g MgCl2・6H2O,0.1g CaCl2を加えて、緩衝液23とする。
【0041】
そして、矩形波印加手段13により、次の周期を連続8回行った。
オン時の電場強度 100v/cm(電極間のギャップは1mm)、
オン時間 50msec、
オフ時間 100msec、
周期 150msec。
これによるバイアビリティは、100%であり、奇型は全く生じなかった。そして、導入済みの胚をインキュベターにより1〜2日培養し、脳に該当する部分を切り出して、別の新しい卵の脳に関与する部位へ移植すると、継続して長期間内用できる。
【0042】
一方、比較例2として、上記の条件に対し、以下の点のみを変更した実験を行った。
オン時の電場強度 200v/cm(電極間のギャップは1mm)、
オン時間 50msec、
オフ時間 1000msec、
周期 1050msec。ここで、周期1000msec程度では、この条件が最良の結果となり、バイアビリティは100%であったが、全てに著しい奇型が生じて、導入後の追跡が不可能となった。
【0043】
結果を比べると、比較例2に対し、実験例2では、奇型発生率は0%であった。勿論、本発明は、本形態や実験例2のみに限定されるものではない。
【0044】
以上をまとめると、本発明では、図7に示すタイムチャートのようなDCパルスの印加を行っていることが理解されよう。そして、ここでは、動物細胞へエレクトロポレーションにより外来遺伝子を導入するにあたり、電気パルスとしてDCパルスを用いている。そして、DCパルスのオン時間とオフ時間とを定め、オン時間とオフ時間との時間和を一周期とし、1秒間に複数回連続して周期によるDCパルスを発生させている。
【0045】
また、DCパルスのオン時間の電場強度は、1〜500v/cmであり、オン時間及びオフ時間は、1〜999msecであり、周期は、1秒間に2〜99回連続する。ものである。勿論、細かな条件は、対象となる動物細胞や緩衝液などに合うように定める。
【0046】
(第3の実施の形態)
本形態では、以上の2つの実施の形態と異なり、薬剤の導入に関する。但し、導入装置としては、第1,第2の実施の形態と同様のものを用い、電極の形態を若干変更すればよい。そして、この例では、生物組織として、ヒト子宮平滑筋肉腫を選ぶ。
【0047】
(実験3)
まず、上記肉腫をヌードマウス皮下に移植した。そして、抗癌剤であるプレオマイシンを生理食塩水で20μg/0.1mlの濃度に調整し、ヌードマウスで生育した移植片へ注入した。
【0048】
さて、プレオマイシンの導入が成功し、プレオマイシンがヌードマウス皮下のヒト子宮平滑筋肉腫組織中に存在すると、DNAに亀裂を生じさせ、細胞死を誘導することとなる。つまり、ヌードマウス皮下の上記肉腫組織が、増殖を停止するか、または縮小する。そして、この肉腫組織の大きさを計測することによって、薬剤導入の成否及びその効果を知ることができる。
【0049】
ここでは、プレオマイシンを添加し、次の周期で連続8回DCパルスを印加した(本群)。
オン時の電場強度 100v/cm、
オン時間 50msec、
オフ時間 75msec、
周期 125msec。
なお、これは一例であって、細かな条件は、対象となる組織やその形状、大きさなどに合うように定める。
【0050】
また、比較のため、プレオマイシン添加を行いパルスを印加しない群(比較第1群)、プレオマイシンを添加せずパルスを印加する群(比較第2群)及びプレオマイシンを添加せずパルスも印加しない群(比較第3群)についても、調べた。その結果を、図8に示す。図8の縦軸は、ヒト子宮筋平滑筋肉腫組織の体積を%表示したもので、横軸は、経過日である。上記組織が増殖を停止すれば、平坦な線となり、縮小すれば右下がりの線となる。特に、0%付近で停滞すれば、上記細胞はほとんど死滅したということができる。
【0051】
その結果、比較第1,第2及び第3群では、概ね右上がりの線となり、腫瘍の増大に有意な差は認められなかった。しかし、本群では、0%付近で停滞する線となり、印加後に腫瘍の増大が有意に抑制されている。さらに、ヌードマウス5匹で8日後に腫瘍の消失が確認された。
【0052】
つまり、100v/cm程度の(臨床応用に好適な)低電場強度でも、上記条件による印加を行うエレクトロポレーションによって、腫瘍に対して抗腫瘍効果があることが明らかとなった。
【0053】
【発明の効果】
本発明の遺伝子導入方法は、以上のように構成したので、DCパルスのエレクトロポレーションを用いながら、バイアビリティを大幅に向上でき、奇形の発生を抑制できる。したがって、導入遺伝子の発現及びその利用に資することができる。
【0054】
また、本発明の薬剤導入方法によれば、従来法に比べて印加電場強度を大幅に低下でき、導入効果を向上できるだけでなく、また、組織(細胞)に対する電気的損傷を抑制し、特的部位の組織(例えば腫瘍など)への薬剤導入効率を向上させることができ、臨床応用への適性を高め得る。
【図面の簡単な説明】
【図1】 本発明の第1の実施の形態における遺伝子導入装置の概念図
【図2】 本発明の第2の実施の形態における陽極の平面図
【図3】 同陽極の側面図
【図4】 同陰極の斜視図
【図5】 (a)同遺伝子導入過程の説明図
(b)同遺伝子導入過程の説明図
(c)同遺伝子導入過程の説明図
(d)同遺伝子導入過程の説明図
(e)同遺伝子導入過程の説明図
(f)同遺伝子導入過程の説明図
【図6】 (a)同遺伝子導入過程の説明図
(b)同遺伝子導入過程の説明図
(c)同遺伝子導入過程の説明図
【図7】 本発明におけるDCパルスの印加要領を示すタイムチャート
【図8】 本発明の第3の実施の形態における組織増殖経過を示すグラフ
【符号の説明】
2、17 第1電極
3、21 第2電極
Claims (9)
- 非ヒト動物細胞へエレクトロポレーションにより外来遺伝子を導入するにあたり、電気パルスとしてDCパルスを用い、DCパルスのオン時間とオフ時間とを定め、オン時間とオフ時間との時間和を一周期とし、1秒間に複数回連続して前記周期によるDCパルスを発生させることにより、外来遺伝子を導入することを特徴とする遺伝子導入方法。
- 前記DCパルスのオン時間の電場強度は、1〜500v/cmであることを特徴とする請求項1記載の遺伝子導入方法。
- 前記オン時間及び前記オフ時間は、1〜999msecであることを特徴とする請求項1記載の遺伝子導入方法。
- 前記周期は、1秒間に2〜99回連続することを特徴とする請求項1記載の遺伝子導入方法。
- 非ヒト生物細胞へエレクトロポレーションにより薬剤を導入するにあたり、電気パルスとしてDCパルスを用い、DCパルスのオン時間とオフ時間とを定め、オン時間とオフ時間との時間和を一周期とし、1秒間に複数回連続して前記周期によるDCパルスを発生させることにより、薬剤を導入することを特徴とする薬剤導入方法。
- 前記DCパルスのオン時間の電場強度は、1〜500v/cmであることを特徴とする請求項5記載の薬剤導入方法。
- 前記オン時間及び前記オフ時間は、1〜999msecであることを特徴とする請求項5記載の薬剤導入方法。
- 前記周期は、1秒間に2〜99回連続することを特徴とする請求項5記載の薬剤導入方法。
- 前記薬剤は、抗癌剤であることを特徴とする請求項5記載の薬剤導入方法。
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