JP3670745B2

JP3670745B2 - Confocal microscope

Info

Publication number: JP3670745B2
Application number: JP03216496A
Authority: JP
Inventors: 久雄北川
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1996-02-20
Filing date: 1996-02-20
Publication date: 2005-07-13
Anticipated expiration: 2016-02-20
Also published as: JPH09230245A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、共焦点顕微鏡に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来共焦点顕微鏡として、特開平５−６０９８０に開示された共焦点用光スキャナを組み合わせたものがある。図４に示すように共焦点用光スキャナ（ディスクスキャナ）１０は、複数のマイクロレンズ付マルチピンホール開口を用いた集光ディスク１と、該マルチピンホール開口に対応した複数のピンホール１３が形成されたピンホールディスク２をドラム３にて連結してモータ４で回転し、図示しないレーザ光源からのレーザ光がコリメートされた照射光を集光ディスク１を介してピンホールディスク２、対物レンズ１４を通過させて試料１５に照射させ、試料１５から再び対物レンズ１４、ピンホールディスク２を通過した戻りの光を、ピンホールディスク２と集光ディスク１との間に構成した光路分割手段例えばビームスプリッタ７によってレーザ照明光路と分岐し、結像光学系例えば集光レンズ８で結像させた試料１５の投影像をカメラ９で撮像できるように構成したものである。
【０００３】
以上述べた共焦点用光スキャナ１０を顕微鏡に用いた場合には、顕微鏡視野に相当する範囲に存在する複数のマイクロレンズ付マルチピンホール開口とピンホールを同時に照射して共焦点に結像させる、マルチピンホール方式を用いているため、ガルバノメータミラなどの往復回転鏡による光学偏向方式に比べ、高速走査に適している。
【０００４】
ここで、図４の共焦点用光スキャナ１０の作用効果について、図５を参照して説明する。図５はマイクロレンズ付マルチピンホール開口とピンホールを単純化した図である。コリメートされたレーザ光１１は、マイクロレンズ１２を通過してピンホール上に集光され、スポットを形成する。ピンホール１３を通過したレーザ光は、対物レンズ１４に入射し、試料１５の上に縮小投影されたスポットを形成する。試料１５からの反射光や蛍光などの戻りの光は、再び対物レンズ１４を通過してピンホール１３の裏側へ至り、拡大投影されたスポットを形成する。ピンホール１３を再び通過した戻りの光は、ビームスプリッタ７によってレーザ光と分離され、結像光学系１７によって結像され、撮像デバイス１８の撮像面へと至る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
ここで、共焦点顕微鏡として、回折限界による究極の性能の引き出し、かつ、不必要な光量損失を防ぐためには、対物レンズ１４の像側の開口数（以下対物レンズ１４の像側のＮＡと称する）と、マイクロレンズ１２の開口数（以下マイクロレンズ１２のＮＡと称する）を一致させ、またマイクロレンズ１２による回折限界スポット直径に対してピンホール１３の開口直径が等しいか、または若干大きくさせることが必要である。
【０００６】
以下このことについて具体的に説明する。
該共焦点顕微鏡のマイクロレンズ付き開口とピンホールの仕様として、例えば油浸１００倍対物レンズ１４（ＮＡ：１．２５）に適合するように仕様を設定すると、
マイクロレンズ１２のＮＡ＝０．０１２５、ピンホール１３の開口直径＝φ５０μｍ
となる。
【０００７】
ここで、マイクロレンズ１２のＮＡは、油浸１００倍対物レンズ１４（ＮＡ：１．２５）の像側のＮＡ（１．２５／１００＝０．０１２５）に適合するように、０．０１２５を設定した。
【０００８】
また、レーザ光源として、アルゴンレーザ４８８nmを用いた場合、マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径は、エアリーディスク直径で、
１．２２×０．４８８／０．０１２５＝４７．６μｍ
と計算され、これに適合するように、ピンホール１３の開口直径をφ５０μｍと設定した。
【０００９】
次に、前述の最適設定からズレを生じた場合の影響について説明する。
（１）対物レンズ１４の像側のＮＡとマイクロレンズ１２のＮＡが一致しない場合
（１−１）対物レンズ１４の像側のＮＡ＜マイクロレンズ１２のＮＡ
図６のごとく、レーザ光１１が対物レンズ１４の外周まで拡がり、光量損失が大きくなる。
【００１０】
（１−２）対物レンズ１４の像側のＮＡ＞マイクロレンズ１２のＮＡ
図７のごとく対物レンズ１４のＮＡの真ん中にしかレーザ光が行かず、実効ＮＡが小さくなる。このため、共焦点効果のうちの重要なセクショニング効果が劣化する。
【００１１】
（２）マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径とピンホール１３の開口直径とが一致しない場合
（２−１）マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径＜ピンホール１３の開口直径
ピンホール１３が大きすぎ、セクショニング効果が劣化する。
【００１２】
（２−２）マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径＞ピンホール１３の開口直径
ピンホール１３によるケラレが発生し、光量損失が大きくなる。
【００１３】
（３）対物レンズ１４の像側のＮＡで決まる回折限界スポット直径とピンホール１３の開口直径とが一致しない場合
（３−１）対物レンズ１４の像側のＮＡで決まる回折限界スポット直径＜ピンホール１３の開口直径
ピンホール１３が大きすぎ、セクショニング効果が劣化する。
【００１４】
（３−２）対物レンズ１４の像側のＮＡで決まる回折限界スポット直径＞ピンホール１３の開口直径
ピンホール１３によるケラレが発生し、光量損失が大きくなる。
【００１５】
一方、セクショニング効果と並ぶ共焦点効果の一つである超解像効果については、理論的には対物レンズ１４の像側のＮＡとマイクロレンズ１２のＮＡが適合し、マイクロレンズ１２による回折限界スポット直径》ピンホール１３の開口直径（》：十分に小さいことを意味し、約１／８程度である）の全てを満足した条件で得られることになるが、（２−２）項と、（３−２）項に該当するため、光量損失は極めて大きくなる。
【００１６】
従って、一般に試料１５が例えば生物標本であってこの蛍光観察を行う場合には、共焦点効果のうちの超解像効果が重要ではなく、セクショニング効果が重要である。
【００１７】
次に、油浸１００倍対物レンズ（ＮＡ：１．２５）を基準に仕様設定した図４に示す共焦点用光スキャナ１０を用いて生物標本の深部を（セクショニング効果を生かして）観察しようとする場合、油浸対物レンズや乾燥対物レンズでは生物標本と液浸用オイル又は空気の屈折率差による収差の増大を招くために使用することができない。このため、油浸対物レンズに変えて水浸対物レンズを用いる必要がある。水浸対物レンズを用いた場合、どういう不都合が生ずるかを説明する。
【００１８】
例えば、低倍率の対物レンズ１４は、試料１５の細胞集団の全体像を把握して、高倍率の対物レンズ１４で観察すべき細胞を見つけだしたり、細胞集団としての組織形態を観察するのに用いる。
【００１９】
顕微鏡のレボルバやスライダなどの対物レンズ倍率変更手段を用いて、水浸６０倍対物レンズ（ＮＡ：０．９）に変更したとする。この場合、対物レンズの像側のＮＡは、０．９／６０＝０．０１５であり、相当する対物レンズの像側の回折限界スポット直径は、エアリーディスク直径で、１．２２×０．４８８／０．０１５＝３９．７μｍである。これを前述の比較条件に当てあてはめると、前述の（１−２）項と、（３−１）項に該当することになる。すなわち、水浸６０倍の対物レンズ１４を使用する場合には、ピンホール１３が大き過ぎて、セクショニング効果が劣化することになる。
【００２０】
つまり、図４の共焦点用光スキャナ１０を用いた共焦点顕微鏡では、ピンホールディスクの交換が困難であり、ピンホールディスクとしてピンホール直径が油浸１００倍対物レンズに対応させた５０μｍのものを用いるしかない。このピンホールディスク（ピンホール直径５０μｍ）を用いた場合、倍率の異なる対物レンズ１４に変更すると、この対物レンズ１４の像側のＮＡによる回折限界スポット直径がピンホール１３の直径５０μｍより小さくなるために、この対物レンズ１４の性能を生かした共焦点効果、特にセクショニング効果が得られないという問題が生ずる。このことは、水浸対物レンズのある倍率、例えば６０倍の水浸対物レンズを基準にした場合の像側のＮＡによる回折限界スポット直径を満たすピンホール（ピンホール直径４０μｍ）１３を有するピンホールディスク２と仮に交換できたとしても、６０倍の対物レンズ以外の倍率の対物レンズに関しては上述と同様の問題が生ずる。
【００２１】
本発明の目的は、使用目的や試料に応じて対物レンズの倍率を変更しても、各対物レンズの性能を生かし、共焦点効果のうちの特にセクショニング効果の劣化を防止でき、また光量損失を少なくすることが可能な共焦点顕微鏡を提供することにある。
【００２２】
【課題を解決するための手段】
前記目的を達成するため、請求項１に対応する発明は、光源と、前記光源から発した照射光を試料上に集光する対物レンズと、前記光源と前記対物レンズ間の像面に回転可能に配置され、前記照射光を通過する複数のピンホールを有するピンホール板と、前記対物レンズと前記光源との間に配置された光分岐光学系と、前記光分岐光学系で分岐した前記試料上の検査信号を検出する検出器とを備え、前記照射光を試料に対して走査する共焦点顕微鏡において、前記対物レンズの倍率を変更可能な対物レンズ倍率変更手段と、前記対物レンズと前記ピンホール板との間に配置され、前記試料から該ピンホール板への倍率を、前記対物レンズ倍率変更手段により変更される倍率に対応して変更可能な中間倍率変更手段とを具備した共焦点顕微鏡である。
【００２３】
請求項１に対応する発明によれば、中間倍率変更手段を設けたので、使用する対物レンズの倍率を変更しても、ピンホール板に投影される像の像側のＮＡが一定になるように補正される。これにより、使用する各対物レンズ毎に回折限界で決まる究極の共焦点効果、特にセクショニング効果の劣化を防止できる。
【００２４】
前記目的を達成するため、請求項２に対応する発明は、請求項１記載の共焦点顕微鏡において、光分岐光学系と検出器に至る光学系上に配置され、対物レンズ倍率変更手段により変更された対物レンズの倍率に対応して投影倍率を変更可能な結像系倍率変更手段をさらに追加した共焦点顕微鏡である。
【００２５】
請求項２に対応する発明によれば、対物レンズの呼称倍率で検出する必要がある場合には、中間倍率の変化分を結像光学系の倍率を変えることで相殺し、対物レンズの呼称倍率に対応した観察像倍率を得ることができる。
【００２６】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について図１を参照して説明する。前述した従来の図５とは異なる点は、試料１５から対物レンズ１４以降、ピンホールディスク２に至る光学系に中間倍率変更手段例えば中間変倍光学系２０を設け、これにより試料１５からピンホールディスク２への投影倍率を変更可能に構成にしたこと、および、ピンホールディスク２から撮像デバイス１８に至る結像光学系の投影倍率を変換可能に構成した結像系倍率変更手段例えば結像変倍光学系２１を設けたものである。
【００２７】
このような構成の共焦点顕微鏡は、以下のような動作を行う。複数のマイクロレンズ付開口を用いた集光ディスク１と、該集光ディスク１のマイクロレンズ付開口に対応した位置に複数のピンホール１３が形成されたピンホールディスク２をドラム３にて連結してモータ４で回転し、コリメートされたレーザ光を集光ディスク１を介してピンホールディスク２、中間変倍光学系２０、対物レンズ１４を通過させて試料１５に照射させ、試料１５から再び対物レンズ１４、ピンホールディスク２と集光ディスク１との間に構成した光路分割手段例えばビームスプリッタ７によってレーザ照明光路と分岐し、結像変倍光学系２１で結像させた投影像を撮像デバイス１８で撮像できるように構成したものである。
【００２８】
ここでの試料１５としては、例えば生物標本、特に生きた組織細胞であり、具体的には４０μｍ程度の厚さを持つ心筋である。生組織の表面約１０μｍは、組織切断時の損傷などにより死んでおり、組織切片内約２０μｍ程度の深さで共焦点効果によるセクショニングを行って、光学的な切片像を観察する。
【００２９】
通常の顕微鏡では、このように厚い切片の内部を観察することは不可能であり、高倍率観察・低倍率観察によらず、共焦点効果によるセクショニングが必要である。観察・測定の対象は、主として蛍光試薬の蛍光観察・測光による生細胞内のイオンの動的変化測定であり、ディスクスキャナによる高速走査性が有用である。
【００３０】
ここで、高倍率観察では、細胞内構造の微小構造、例えば細胞膜など、内のイオンの動的変化を測定し、低倍率観察では、細胞全体、および、隣接した複数の細胞の間でのイオンの動的変化を測定する。これによって、前者では、細胞内構造のもつ生態機能の解明が行われ、また後者では細胞間の連携による生態機能の解明が行われる。このため、対物レンズ１４の倍率変更に伴う実験が行えるように装置を構成することが不可欠である。
【００３１】
このディスクスキャナ１０は、従来の技術で説明した、油浸１００倍対物レンズ（ＮＡ：１．２５）の像側のＮＡ（１．２５／１００＝０．０１２５）に適合するものであり、マイクロレンズＮＡ＝０．０１２５、ピンホール開口直径＝φ５０μｍに設定したディスクスキャナ１０を用いる。
【００３２】
以上述べた共焦点顕微鏡では、例えば蛍光試薬を狙いの細胞に微小注入（マイクロインジェクション）する必要があるため、顕微鏡はステージとして例えば固定型を用いる。ステージの上で培養液に浸された生組織を、作動距離の長い水浸対物レンズで観察する。生組織の屈折率はほぼ水と等しいため、水浸対物レンズを用いることで、深部観察における収差の発生は排除されている。また、対物レンズは、無限遠補正されており、適当な結像レンズとの組合せで用いる必要がある。
【００３３】
ここで、使用可能な市販の水浸対物レンズの仕様を示すと下記の通りである。
倍率ＮＡ作動距離（mm）
１００．３３．３
２００．５３．３
４００．８３．３
６００．９２．０
従来の技術で説明した通り、各対物レンズの像側のＮＡは、
像側のＮＡ＝対物レンズのＮＡ／対物倍率
で求められ、各対物レンズの像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）は、
像側の回折限界スポット直径＝１．２２／０．４８８／像側のＮＡ
で求められる。光の波長には、厳密には蛍光を励起するレーザ波長と蛍光波長とを用いる必要があるが、ここではレーザ波長４８８nmで代表することとする。
【００３４】
各対物レンズ毎の、像側のＮＡと像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）の計算結果は以下の通りである。
倍率ＮＡ像側のＮＡ回折限界スポット直径（μｍ）
１００．３０．０３１９．８
２００．５０．０２５２３．８
４００．８０．０２２９．８
６００．９０．０１５３９．７
従来の技術で説明した比較条件にあてはめて、ディスクスキャナ１０（ピンホール１３の直径５０μｍ）との適合性を評価すると、１０倍から６０倍の水浸対物レンズ１４では、前述の（１−２）項と、（３−１）項が該当する。すなわち、１０倍から６０倍の水浸対物レンズ１４のそれぞれの回折限界スポット直径に比較してピンホール１３の直径が大きすぎて、セクショニング効果が劣化することになる。
【００３５】
ここで、対物レンズ１４とディスクスキャナ１０との間に中間倍率を作用させ、各対物レンズ１４の像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）をピンホール１３の５０μｍに揃えるよう、中間倍率を計算する。
【００３６】
中間変倍光学系２０の倍率を作用させる場合の、各対物レンズ１４の像側のＮＡは、
像側のＮＡ＝対物レンズ１４のＮＡ／対物倍率／中間倍率
で求められ、各対物レンズ１４の像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）は、
像側回折限界スポット直径＝１．２２／０．４８８／像側ＮＡ
で求められる。
【００３７】
各対物レンズ１４の像側のＮＡによる回折限界スポット直径（μｍ）をピンホール１３の直径５０μｍに揃えるように設定した場合の、中間倍率の計算結果は以下のようになる。
【００３８】
倍率ＮＡ中間倍率像側のＮＡ回折限界スポット直径（μｍ）
１００．３２．４０．０１２５４７．６
２００．５２．００．０１２５４７．６
４００．８１．６０．０１２５４７．６
６００．９１．２０．０１２５４７．６
次に、中間倍率を導入した場合のセクショニング効果を計算により確認するが、始めにセクショニング効果の計算方法について説明する。円形開口の回折限界スポットの光軸上の分布はｓｉｎｃの二乗関数で表され、共焦点セクショニング効果は、回折限界スポットの光軸上輝度最大点からゼロ点（１次解）までのデフォーカス量Ｚの値で代表させる。
【００３９】
輝度最大点からゼロ点までのデフォーカス量Ｚ＝２ｎ×λ／対物ＮＡ²
ここで、ｎ：媒質の屈折率（水：１．３３）
λ：波長（４８８nm）
対物ＮＡ：対物レンズの開口数
であり、これらによりデフォーカス量Ｚを計算することができる。
【００４０】
次に、ピンホールが大き過ぎる場合のデフォーカス量Ｚの値の計算方法を説明する。ピンホールに対して、マイクロレンズのＮＡが適合していると仮定し、ピンホール径に相当する像側のＮＡを求める。
【００４１】
像側のＮＡ＝１．２２×０．４８８／５０＝０．０１１９
と計算できる。これに、対物レンズ１４の倍率と中間倍率とを掛けたものを対物レンズの実効のＮＡとし、
輝度最大点からゼロ点までのデフォーカス量（Ｚ）＝２ｎ×λ／（実効ＮＡ² ）によって計算する。これをスキャナ１０に依存するセクショニング効果の代表値として用いることにする。
【００４２】
つまり、ピンホールサイズが大きい場合には、スキャナ１０に依存した実効ＮＡを用いて算出したＺ値を用い、ピンホールサイズが適当な場合には、対物レンズ１４のＮＡを用いて算出したデフォーカス量Ｚの値を用いることとする。これにより、ピンホールサイズが適当であれば、両者は一致することとなり、ピンホールサイズが大きければ、スキャナ１０に依存して実効ＮＡが小さくなり、Ｚの値が大きくなることになる。
【００４３】
なお、本実施形態における計算では該当しないが、もしピンホールディスク２に形成されているピンホール１３の方が小さい場合には、対物レンズ１４のＮＡを用いて算出したデフォーカス量Ｚ値よりもセクショニング効果が向上することは期待できないので、対物レンズ１４のＺ値を用いることとすればよい。
【００４４】
まず、中間変倍光学系２０の倍率を導入しない場合のデフォーカス量Ｚの計算結果をまとめると次のようになる。
中間倍率を導入しない場合（従来の技術の場合）
倍率ＮＡ中間倍率総合倍率Ｚ値（μｍ）
１００．３１１０９１．７
２００．５１２０２２．９
４００．８１４０５．７
６００．９１６０２．５
次に、中間倍率を導入した場合のＺ値の計算結果は次のようになる。
【００４５】
倍率ＮＡ中間倍率総合倍率Ｚ値（μｍ）
１００．３２．４２４１４．４
２００．５２．０４０５．２
４００．８１．６６４２．０
６００．９１．２７２１．６
以上述べた計算の結果から明らかなように、試料１５からピンホールディスク２までの光学系に対物レンズ１４とは別の中間変倍光学系２０を設け、使用する対物レンズ１４の倍率に合わせて、像側のＮＡがピンホール１３のサイズと適合するように構成することで、Ｚ値を小さくすること、すなわち、共焦点効果であるセクショニング分解能を向上させることができる。
【００４６】
なお、図１の実施形態において、試料１５から撮像デバイス１８までの総合倍率は、対物レンズ１４の倍率とピンホールディスク２までの中間変倍光学系２０の倍率の積に、ピンホールディスク２から撮像デバイス１８までの結像光学系２１の倍率を掛けたものである。従って、対物レンズ１４の呼称倍率で撮像する必要がある場合には、中間倍率の変化分を結像光学系の倍率を変えることで相殺し、対物レンズ１４の呼称倍率に対応した観察像倍率を得ることができる。
【００４７】
ただし、本発明の実施の形態の結像変倍光学系２１により結像光学系の倍率を変えることは、本発明の基本的な効果である共焦点セクショニングの効果の向上には寄与するものではなく、本発明の実施形態において必ずしも必要なものではない。また、観察像倍率の補正すなわち、結像変倍光学系２１の倍率の変更は必ずしも必要なものではなく、その代わりに画像処理により表示倍率の変換を行うことなど、代替案が考えられる。
【００４８】
ここで、図１における中間変倍光学系２０の具体的な例について、図２、図３を参照して説明する。図２は、中間変倍光学系２０としては、結像レンズ２２、２３を図示しないレボルバまたはスライダ等の変換機構に取り付けたものである。
【００４９】
この場合、対物レンズ１４は前述の使用可能な対物レンズのうち、４０倍、ＮＡが０．８の対物レンズである。対物レンズ１４は無限遠補正されており、所定の焦点距離ｆを有する結像レンズ２２によって、４０倍（中間倍率：１倍）の像を結ぶ。中間倍率は、焦点距離の異なる結像レンズ２２を用いることにより、ｆと結像レンズ２２の焦点距離との比が中間倍率となる。
【００５０】
図２（ａ）には、中間倍率１倍の結像レンズ２２を用いた場合、図２（ｂ）には前述した計算結果に応じた中間倍率１．６倍の結像レンズ２３（１．６ｆ）を用いた場合をそれぞれ示している。
【００５１】
このように、結像レンズ２２，２３を変換する場合には、予め使用する対物レンズ１４の組み合わせを決めておき、それに応じた結像レンズ２２，２３の組み合わせを変倍ターレットに設置する必要がある。もし、使用する対物レンズ１４の組み合わせを変更する場合には、ターレットに取り付けられた複数の対物レンズのうち所望の倍率の対物レンズを光軸上に選択挿入すれば良い。図２においては、中間変倍光学系２０の作用を理解しやすいように、結像レンズを薄肉レンズとして図示したため、結像レンズ２２と２３の位置が、光軸方向にシフトしているが、複数枚の構成によって適宜レンズを設計することで、光軸方向の位置を合わせることができ、ターレット機構による変換を無理なく行うことが可能である。
【００５２】
図２（ａ）では、中間倍率が１倍のため、ピンホールディスク２から出射した光線の開き角（像側のＮＡ）の相当する対物レンズ１４の試料側のＮＡが小さくなっている。このため、破線で示す２０倍の対物レンズ１４が本来持っている試料１５側のＮＡを使いきれていない。
【００５３】
一方、図２（ｂ）では、中間倍率１．６倍の結像レンズ２３により、対物レンズ１４への平行光束が太くなり、ピンホールディスク２から出射した光線の開き角（像側のＮＡ）の相当する対物レンズ１４の試料１５側のＮＡが大きくなる。ＮＡが小さい場合には、共焦点効果、特にセクショニング効果が劣化するが、前述のようにＮＡを大きくすることで改善される。
【００５４】
図３は、中間変倍光学系２０として結像レンズ２２とアフォーカルズーム光学系２４を使用した例であり、この構成によれば、レンズ２枚の位置関係を回転カム機構など適宜調整するように構成し、中間倍率を連続的に可変することができる。これにより、新たな対物レンズを使用する場合でも最適に調整することができる。
【００５５】
また、実験をしながら対物レンズ１４の倍率設定手段を動かし、最適条件を探すことも可能である。この構成においても、図２で説明した作用効果と同一の作用効果が得られる。具体的には、図３（ａ）は中間倍率すなわち結像レンズ２２を１倍にした時であって、この場合には有効ＮＡが小さく、セクショニング効果が悪いが、図３（ｂ）は中間倍率すなわち結像レンズ２３を１．６倍にした時であって、この場合には有効ＮＡが大きく、セクショニング効果が良い。
【００５６】
図１における結像変倍光学系２１についても、中間変倍光学系２０と同様に、ターレット切換による方法と、ズーム機構による連続変換が可能である。ここで、ピンホールディスク２から撮像デバイス１８までの結像光学系２１の変倍を、中間変倍光学系２０の倍率と連動可能に構成することにより、中間倍率の変倍分を吸収し、対物レンズ１４の呼称倍率に対応した総合倍率を得ることができる。
【００５７】
なお、本発明の実施の形態では、ピンホール１３のサイズが大きすぎる場合のセクショニング効果の劣化に着目して、改善策として中間倍率として拡大倍率を作用させる場合についてのみ説明したが、ピンホールサイズが小さすぎて光量損失の大きい場合でも、中間倍率として縮小倍率を作用させることで、光量損失の少ない共焦点顕微鏡を実現することができる。つまり、本発明は中間倍率が拡大であっても、縮小であっても本発明の目的を達成することができる。
【００５８】
また、本発明の実施の形態では、油浸１００倍の対物レンズを基準に仕様設定したピンホール直径が５０μｍのピンホールを有するピンホールディスクを用いたが、ピンホールの直径は５０μｍに限定されるものではなく、基準となる乾燥または液浸対物レンズのある特定の倍率、例えば６０倍の水浸対物レンズの像側のＮＡによる回折限界スポット直径を満たす４０μｍのピンホール直径を有するピンホールディスクを用い、他の倍率の対物レンズの像側のＮＡによる回折限界スポット直径がほぼ４０μｍとなるように中間倍率を設定することも可能である。すなわち、ピンホールディスクのピンホール直径に各対物レンズの像側のＮＡによる回折限界スポット直径がほぼ満たされるように中間倍率を設定できるので、ピンホールディスクのピンホール直径の大きさに拘る必要がない。
【００５９】
【発明の効果】
以上述べた本発明によれば、使用目的や試料に応じて対物レンズの倍率を変更しても、各対物レンズの性能を生かした共焦点効果のうちの特にセクショニング効果の劣化を防止でき、また光量損失を少なくすることが可能な共焦点顕微鏡を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明による共焦点顕微鏡の実施形態の概略構成を示す図。
【図２】図１の中間変倍光学系の第１の例を説明するための図。
【図３】図１の中間変倍光学系の第２の例を説明するための図。
【図４】従来の共焦点顕微鏡の一例を説明するための図。
【図５】図４の問題点を説明するための図４の簡略図。
【図６】図５の問題点を説明するためのもので対物レンズの像側のＮＡ＜マイクロレンズのＮＡのときの状態を説明するための図。
【図７】図５の問題点を説明するためのもので対物レンズの像側のＮＡ＞マイクロレンズのＮＡのときの状態を説明するための図。
【符号の説明】
１…集光ディスク、
２…ピンホールディスク、
３…ドラム、
４…モータ、
７…ビームスプリッタ、
９…カメラ、
１０…共焦点用光スキャナ、
１１…レーザ光、
１２…マイクロレンズ、
１３…ピンホール、
１４…対物レンズ、
１５…試料、
１８…撮像デバイス、
２０…中間変倍光学系、
２１…結像変倍光学系、
２２，２３…結像レンズ、
２４…アフォーカルズーム光学系。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention,BothIt relates to a focusing microscope.
[0002]
[Prior art]
As a conventional confocal microscope, there is a combination of the confocal optical scanner disclosed in JP-A-5-60980. As shown in FIG. 4, the confocal optical scanner (disk scanner) 10 includes a condensing disk 1 using a plurality of multi-pinhole openings with microlenses and a plurality of pinholes 13 corresponding to the multi-pinhole openings. The pinhole disk 2 is connected by a drum 3 and rotated by a motor 4, and irradiated with collimated laser light from a laser light source (not shown) through the condensing disk 1, the pinhole disk 2 and the objective lens 14 are moved. An optical path splitting means configured between the pinhole disk 2 and the condensing disk 1, for example, a beam splitter 7 is configured so that the return light that has passed through the sample 15 and irradiated the sample 15 and passed through the objective lens 14 and the pinhole disk 2 again. Is branched from the laser illumination optical path by an image forming optical system, for example, a projection image of the sample 15 formed by the condenser lens 8 by the camera 9. Those configured to allow the image.
[0003]
When the above-described confocal optical scanner 10 is used for a microscope, a plurality of multi-pinhole openings with microlenses and pinholes existing in a range corresponding to the microscope field of view are simultaneously irradiated to form an image at the confocal point. Since the multi-pinhole method is used, it is suitable for high-speed scanning as compared with an optical deflection method using a reciprocating rotary mirror such as a galvanometer mirror.
[0004]
Here, the effect of the confocal optical scanner 10 of FIG. 4 will be described with reference to FIG. FIG. 5 is a simplified view of a multi-pinhole opening with microlenses and a pinhole. The collimated laser beam 11 passes through the microlens 12 and is condensed on the pinhole to form a spot. The laser beam that has passed through the pinhole 13 is incident on the objective lens 14 and forms a reduced projected spot on the sample 15. Return light such as reflected light and fluorescent light from the sample 15 passes through the objective lens 14 again and reaches the back side of the pinhole 13 to form an enlarged projected spot. The return light that has passed through the pinhole 13 again is separated from the laser beam by the beam splitter 7, imaged by the imaging optical system 17, and reaches the imaging surface of the imaging device 18.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Here, as a confocal microscope, in order to draw out the ultimate performance due to the diffraction limit and prevent unnecessary light loss, the numerical aperture on the image side of the objective lens 14 (hereinafter referred to as NA on the image side of the objective lens 14). ) And the numerical aperture of the microlens 12 (hereinafter referred to as the NA of the microlens 12), and the aperture diameter of the pinhole 13 is equal to or slightly larger than the diffraction limited spot diameter by the microlens 12. is required.
[0006]
This will be specifically described below.
As the specifications of the aperture and pinhole with a microlens of the confocal microscope, for example, the specification is set so as to be compatible with an oil immersion 100 × objective lens 14 (NA: 1.25).
NA of microlens 12 = 0.0125, diameter of pinhole 13 = φ50 μm
It becomes.
[0007]
Here, the NA of the microlens 12 is set to 0.0125 so as to match the NA (1.25 / 100 = 0.0125) on the image side of the oil immersion 100 × objective lens 14 (NA: 1.25). Set.
[0008]
Also,Laser light sourceWhen using an argon laser of 488 nm, the diffraction limited spot diameter by the microlens 12 is the Airy disk diameter,
1.22 × 0.488 / 0.0125 = 47.6 μm
The opening diameter of the pinhole 13 was set to φ50 μm so as to match this.
[0009]
Next, the effect when a deviation occurs from the above-described optimum setting will be described.
(1) When the NA on the image side of the objective lens 14 does not match the NA of the microlens 12
(1-1) NA on the image side of the objective lens 14 <NA of the microlens 12
As shown in FIG. 6, the laser light 11 spreads to the outer periphery of the objective lens 14, and the light amount loss increases.
[0010]
(1-2) NA on the image side of the objective lens 14> NA of the microlens 12
Only in the middle of NA of the objective lens 14 as shown in FIG.Laser lightDoes not go, and the effective NA becomes small. For this reason, the important sectioning effect of the confocal effect is deteriorated.
[0011]
(2) When the diffraction limit spot diameter by the microlens 12 does not match the opening diameter of the pinhole 13
(2-1) Diffraction-limited spot diameter by microlens 12 <opening diameter of pinhole 13
The pinhole 13 is too large and the sectioning effect is deteriorated.
[0012]
(2-2) Diffraction-limited spot diameter by microlens 12> opening diameter of pinhole 13
Vignetting due to the pinhole 13 occurs, and the light amount loss increases.
[0013]
(3) When the diffraction limit spot diameter determined by the NA on the image side of the objective lens 14 does not match the opening diameter of the pinhole 13
(3-1) Diffraction-limited spot diameter determined by NA on the image side of the objective lens 14 <opening diameter of the pinhole 13
The pinhole 13 is too large and the sectioning effect is deteriorated.
[0014]
(3-2) Diffraction-limited spot diameter determined by NA on the image side of the objective lens 14> opening diameter of the pinhole 13
Vignetting due to the pinhole 13 occurs, and the light amount loss increases.
[0015]
On the other hand, regarding the super-resolution effect, which is one of the confocal effects along with the sectioning effect, the NA on the image side of the objective lens 14 and the NA of the microlens 12 are theoretically matched, and the diffraction limited spot by the microlens 12 is matched. Diameter >> Opening diameter of pinhole 13 (>>: meaning that it is sufficiently small and about 1/8) can be obtained under conditions satisfying all of the conditions (2-2) and ( Since it corresponds to the item 3-2), the light quantity loss becomes extremely large.
[0016]
Therefore, in general, when the sample 15 is a biological specimen and this fluorescence observation is performed, the super-resolution effect of the confocal effect is not important, and the sectioning effect is important.
[0017]
Next, using the confocal optical scanner 10 shown in FIG. 4 which is set with reference to an oil immersion 100 × objective lens (NA: 1.25), an attempt is made to observe the deep part of the biological specimen (using the sectioning effect).When toAn oil immersion objective lens or a dry objective lens cannot be used because it causes an increase in aberrations due to a difference in refractive index between a biological specimen and immersion oil or air. For this reason, it is necessary to use a water immersion objective lens instead of the oil immersion objective lens. What inconveniences occur when using a water immersion objective lens will be described.
[0018]
For example, the low-magnification objective lens 14 is used to grasp the entire image of the cell population of the sample 15 and find cells to be observed with the high-magnification objective lens 14 or to observe the tissue morphology as the cell population. .
[0019]
Using objective lens magnification changing means such as a microscope revolver and slider,Water immersionAssume that the lens is changed to a 60 × objective lens (NA: 0.9). In this case, the NA on the image side of the objective lens is 0.9 / 60 = 0.015, and the diffraction-limited spot diameter on the image side of the corresponding objective lens is 1.22 × 0.488 as the Airy disk diameter. /0.015=39.7 μm. If this is applied to the above-mentioned comparison condition, it corresponds to the above-mentioned items (1-2) and (3-1). That is, when the objective lens 14 with 60 times of water immersion is used, the pinhole 13 is too large and the sectioning effect is deteriorated.
[0020]
That is, in the confocal microscope using the confocal optical scanner 10 of FIG. 4, it is difficult to replace the pinhole disk, and the pinhole disk has a pinhole diameter of 50 μm corresponding to an oil immersion 100 × objective lens. There is no choice but to use. When this pinhole disk (pinhole diameter 50 μm) is used, if the objective lens 14 is changed to a different magnification, the diffraction limited spot diameter due to the NA on the image side of the objective lens 14 is smaller than the diameter 50 μm of the pinhole 13. In addition, there arises a problem that a confocal effect utilizing the performance of the objective lens 14, in particular, a sectioning effect cannot be obtained. This is a pinhole having a pinhole (pinhole diameter 40 μm) 13 that satisfies the diffraction limit spot diameter due to NA on the image side when the immersion objective lens has a certain magnification, for example, a 60 × immersion objective lens. Even if it can be replaced with the disk 2, the same problem as described above occurs with respect to an objective lens having a magnification other than the 60 × objective lens.
[0021]
The purpose of the present invention is to change the magnification of the objective lens according to the purpose of use and the sample.,An object of the present invention is to provide a confocal microscope that makes use of the performance of each objective lens to prevent deterioration of the sectioning effect among confocal effects, and to reduce light loss.
[0022]
[Means for Solving the Problems]
  In order to achieve the object, an invention corresponding to claim 1 comprises a light source,Condensed light emitted from the light source on the sampleObjective lensWhen,The light sourceAnd a pinhole plate having a plurality of pinholes that are rotatably arranged on the image plane between the objective lens and the irradiation light, and a light branching optical system that is arranged between the objective lens and the light source. , The inspection signal on the sample branched by the optical branching optical systemA confocal microscope that scans the sample with the irradiation light, and an objective lens magnification changing unit capable of changing a magnification of the objective lens, and the objective lensPinhole plateBetween the sample andThePinholeBoardThe confocal microscope is provided with intermediate magnification changing means that can change the magnification of the zoom lens according to the magnification changed by the objective lens magnification changing means.
[0023]
According to the invention corresponding to claim 1, since the intermediate magnification changing means is provided, even if the magnification of the objective lens to be used is changed, the pinhole is changed.BoardIs corrected so that the NA on the image side of the image projected onto the image becomes constant. This prevents the ultimate confocal effect, especially the sectioning effect, which is determined by the diffraction limit for each objective lens used..
[0024]
  To achieve the object, the claims2The invention corresponding to1In the confocal microscope, the optical branching optical systemWhenThe confocal microscope further includes an imaging system magnification changing unit that is arranged on the optical system leading to the detector and can change the projection magnification in accordance with the magnification of the objective lens changed by the objective lens magnification changing unit.
[0025]
  Claim2According to the invention corresponding to the above, when it is necessary to detect with the nominal magnification of the objective lens, the change of the intermediate magnification is canceled by changing the magnification of the imaging optical system, so that it corresponds to the nominal magnification of the objective lens. An observation image magnification can be obtained.
[0026]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, an embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. 5 differs from the above-described conventional FIG. 5 in that an intermediate magnification changing means, for example, an intermediate magnification changing optical system 20 is provided in the optical system from the sample 15 to the objective lens 14 and thereafter to the pinhole disk 2.Pinhole disk 2And an imaging system magnification changing means configured to convert the projection magnification of the imaging optical system from the pinhole disk 2 to the imaging device 18, for example, an imaging variable magnification optical. A system 21 is provided.
[0027]
The confocal microscope having such a configuration performs the following operation. A condensing disc 1 using a plurality of apertures with microlenses and a pinhole disc 2 in which a plurality of pinholes 13 are formed at positions corresponding to the apertures with microlenses of the concentrating disc 1 are connected by a drum 3 to a motor. 4, the collimated laser beam passes through the pinhole disk 2, the intermediate variable magnification optical system 20, and the objective lens 14 through the condensing disk 1 to irradiate the sample 15. An imaging device 18 can capture a projected image that is branched from the laser illumination optical path by an optical path dividing means, for example, a beam splitter 7, formed between the pinhole disk 2 and the condensing disk 1 and imaged by the imaging variable magnification optical system 21. It is comprised as follows.
[0028]
The sample 15 here is, for example, a biological specimen, particularly a living tissue cell, and specifically a myocardium having a thickness of about 40 μm. About 10 μm of the surface of the living tissue is dead due to damage at the time of tissue cutting or the like, and sectioning by a confocal effect is performed at a depth of about 20 μm in the tissue section, and an optical section image is observed.
[0029]
With a normal microscope, it is impossible to observe the inside of such a thick section, and sectioning by the confocal effect is necessary regardless of high-magnification observation / low-magnification observation. The object of observation / measurement is mainly dynamic change measurement of ions in living cells by fluorescence observation / photometry of a fluorescent reagent, and high-speed scanning by a disk scanner is useful.
[0030]
Here, in high-magnification observation, the dynamic change of ions in the intracellular structure, such as a cell membrane, is measured. In low-magnification observation, ions in the whole cell and between multiple adjacent cells are measured. Measure dynamic changes in Thus, in the former, the ecological function of the intracellular structure is elucidated, and in the latter, the ecological function is elucidated by cooperation between cells. For this reason, it is indispensable to configure the apparatus so that an experiment accompanying a change in the magnification of the objective lens 14 can be performed.
[0031]
This disk scanner 10 conforms to the image side NA (1.25 / 100 = 0.0125) of the oil immersion 100 × objective lens (NA: 1.25) described in the prior art. A disk scanner 10 having a lens NA = 0.0125 and a pinhole opening diameter = φ50 μm is used.
[0032]
In the confocal microscope described above, for example, a fluorescent reagent needs to be microinjected into a target cell (microinjection), so the microscope uses, for example, a fixed type as a stage. The living tissue immersed in the culture solution on the stage is observed with a water immersion objective lens having a long working distance. Since the refractive index of living tissue is almost equal to that of water, the use of a water immersion objective lens eliminates the occurrence of aberrations in deep observation. Further, the objective lens is corrected to infinity, and must be used in combination with an appropriate imaging lens.
[0033]
Here, it is as follows when the specification of the commercially available water immersion objective lens which can be used is shown.
Magnification NA Working distance (mm)
10 0.3 3.3
20 0.5 3.3
40 0.8 3.3
60 0.9 2.0
As explained in the prior art, the NA on the image side of each objective lens is
NA on the image side = NA of the objective lens / objective magnification
The diffraction limited spot diameter (μm) by NA on the image side of each objective lens is
Image side diffraction limited spot diameter = 1.22 / 0.488 / image side NA
Is required. Strictly speaking, the wavelength of lightthe lightExcitation laser wavelength and fluorescencewavelengthIn this case, the laser wavelength is 488 nm.
[0034]
The calculation result of the diffraction limit spot diameter (μm) by the image side NA and the image side NA for each objective lens is as follows.
Magnification NA Image side NA Diffraction limited spot diameter (μm)
10 0.3 0.03 19.8
20 0.5 0.025 23.8
40 0.8 0.02 29.8
60 0.9 0.015 39.7
When the compatibility with the disk scanner 10 (the diameter of the pinhole 13 is 50 μm) is evaluated by applying the comparison conditions described in the related art, the above-described (1-2) ) And (3-1). That is, the diameter of the pinhole 13 is too large compared with the diffraction limit spot diameters of the water immersion objective lens 14 of 10 to 60 times, and the sectioning effect is deteriorated.
[0035]
Here, an intermediate magnification is applied between the objective lens 14 and the disk scanner 10, and the intermediate magnification is set so that the diffraction limit spot diameter (μm) due to the NA on the image side of each objective lens 14 is aligned with 50 μm of the pinhole 13. calculate.
[0036]
When the magnification of the intermediate variable magnification optical system 20 is applied, the NA on the image side of each objective lens 14 is
NA on the image side = NA of the objective lens 14 / objective magnification / intermediate magnification
The diffraction limit spot diameter (μm) by the NA on the image side of each objective lens 14 is
Image side diffraction limited spot diameter = 1.22 / 0.488 / image side NA
Is required.
[0037]
When the diffraction limit spot diameter (μm) due to the NA on the image side of each objective lens 14 is set to be equal to the diameter of the pinhole 13, the calculation result of the intermediate magnification is as follows.
[0038]
Magnification NA Intermediate magnification Image side NA Diffraction limited spot diameter (μm)
10 0.3 2.4 0.0125 47.6
20 0.5 2.0 0.0125 47.6
40 0.8 1.6 0.0125 47.6
60 0.9 1.2 0.0125 47.6
Next, the sectioning effect when the intermediate magnification is introduced will be confirmed by calculation. First, a method for calculating the sectioning effect will be described. The distribution on the optical axis of the diffraction limited spot of the circular aperture is expressed by a square function of sinc, and the confocal sectioning effect is a defocus amount from the maximum luminance point on the optical axis of the diffraction limited spot to the zero point (first order solution). Represented by the value of Z.
[0039]
Defocus amount from maximum luminance point to zero point Z = 2n × λ / objective NA²
Where n: refractive index of the medium (water: 1.33)
λ: Wavelength (488 nm)
Objective NA: Numerical aperture of objective lens
Accordingly, the defocus amount Z can be calculated.
[0040]
Next, a method for calculating the value of the defocus amount Z when the pinhole is too large will be described. Assuming that the microlens NA is suitable for the pinhole, the image-side NA corresponding to the pinhole diameter is obtained.
[0041]
NA on the image side = 1.22 × 0.488 / 50 = 0.119
Can be calculated. Multiplying this by the magnification of the objective lens 14 and the intermediate magnification is the effective NA of the objective lens,
Defocus amount from maximum luminance point to zero point (Z) = 2n × λ / (effective NA² ) To calculate. This will be used as a representative value of the sectioning effect depending on the scanner 10.
[0042]
That is, when the pinhole size is large, the Z value calculated using the effective NA depending on the scanner 10 is used, and when the pinhole size is appropriate, the defocus calculated using the NA of the objective lens 14. The value of the quantity Z is used. As a result, if the pinhole size is appropriate, the two coincide with each other, and if the pinhole size is large, the effective NA decreases depending on the scanner 10 and the value of Z increases.
[0043]
Although not applicable in the calculation in the present embodiment, if the pinhole 13 formed in the pinhole disk 2 is smaller, it is smaller than the defocus amount Z value calculated using the NA of the objective lens 14. Since the sectioning effect cannot be expected to improve, the Z value of the objective lens 14 may be used.
[0044]
First, the calculation results of the defocus amount Z when the magnification of the intermediate variable magnification optical system 20 is not introduced are summarized as follows.
When intermediate magnification is not introduced (conventional technologyPlaceCombined)
Magnification NA Intermediate magnification Overall magnification Z value (μm)
10 0.3 1 10 91.7
20 0.5 1 20 22.9
40 0.8 1 40 5.7
60 0.9 1 60 2.5
Next, introduce intermediate magnificationdidThe calculation result of the Z value in this case is as follows.
[0045]
Magnification NA Intermediate magnification Overall magnification Z value (μm)
10 0.3 2.4 24 14.4
20 0.5 2.0 40 5.2
40 0.8 1.6 64 64 2.0
60 0.9 1.2 72 1.6
As is apparent from the calculation results described above, an intermediate variable magnification optical system 20 different from the objective lens 14 is provided in the optical system from the sample 15 to the pinhole disk 2 so as to match the magnification of the objective lens 14 to be used. By configuring the NA on the image side so as to match the size of the pinhole 13, the Z value can be reduced, that is, the sectioning resolution that is a confocal effect can be improved.
[0046]
In the embodiment of FIG. 1, the total magnification from the sample 15 to the imaging device 18 is the product of the magnification of the objective lens 14 and the magnification of the intermediate variable magnification optical system 20 up to the pinhole disk 2 from the pinhole disk 2. The magnification of the imaging optical system 21 up to the imaging device 18 is multiplied. Therefore, when it is necessary to take an image at the nominal magnification of the objective lens 14, the change in the intermediate magnification is canceled by changing the magnification of the imaging optical system, and the observation image magnification corresponding to the nominal magnification of the objective lens 14 is set. Can be obtained.
[0047]
However, changing the magnification of the imaging optical system by the imaging variable magnification optical system 21 according to the embodiment of the present invention does not contribute to the improvement of the confocal sectioning effect which is a basic effect of the present invention. It is not necessarily required in the embodiment of the present invention. Further, the correction of the observation image magnification, that is, the change of the magnification of the imaging variable magnification optical system 21 is not necessarily required. Instead, an alternative such as conversion of the display magnification by image processing is conceivable.
[0048]
Here, a specific example of the intermediate variable magnification optical system 20 in FIG. 1 will be described with reference to FIGS. In FIG. 2, as the intermediate variable magnification optical system 20, the imaging lenses 22 and 23 are attached to a conversion mechanism such as a revolver or a slider (not shown).
[0049]
In this case, the objective lens 14 is an objective lens having 40 times the NA and 0.8 NA among the above-described usable objective lenses. The objective lens 14 is corrected to infinity, and an image of 40 times (intermediate magnification: 1 time) is formed by the imaging lens 22 having a predetermined focal length f. For the intermediate magnification, by using the imaging lens 22 having a different focal length, the ratio of f to the focal length of the imaging lens 22 becomes the intermediate magnification.
[0050]
2A, when an imaging lens 22 having an intermediate magnification of 1 is used, FIG. 2B shows an imaging lens 23 having an intermediate magnification of 1.6 (1. 6f) is shown.
[0051]
As described above, when the imaging lenses 22 and 23 are converted, it is necessary to determine the combination of the objective lenses 14 to be used in advance and install the corresponding combination of the imaging lenses 22 and 23 in the zoom turret. is there. If the combination of objective lenses 14 to be used is changed, an objective lens having a desired magnification among a plurality of objective lenses attached to the turret may be selectively inserted on the optical axis. In FIG. 2, since the imaging lens is illustrated as a thin lens so that the operation of the intermediate variable magnification optical system 20 can be easily understood, the positions of the imaging lenses 22 and 23 are shifted in the optical axis direction. By appropriately designing the lens with a plurality of configurations, the position in the optical axis direction can be matched, and conversion by the turret mechanism can be performed without difficulty.
[0052]
In FIG. 2A, since the intermediate magnification is 1, the NA on the sample side of the objective lens 14 corresponding to the opening angle (NA on the image side) of the light emitted from the pinhole disk 2 is small. For this reason, the NA on the sample 15 side originally possessed by the 20 × objective lens 14 indicated by a broken line is not used up.
[0053]
On the other hand, in FIG. 2B, the parallel light beam to the objective lens 14 is thickened by the imaging lens 23 having an intermediate magnification of 1.6 times, and the opening angle (NA on the image side) of the light beam emitted from the pinhole disk 2 is increased. The NA on the sample 15 side of the objective lens 14 corresponding to is increased. When the NA is small, the confocal effect, particularly the sectioning effect, deteriorates, but can be improved by increasing the NA as described above.
[0054]
FIG. 3 shows an example in which an imaging lens 22 and an afocal zoom optical system 24 are used as the intermediate variable magnification optical system 20. According to this configuration, the positional relationship between the two lenses is adjusted as appropriate, such as a rotating cam mechanism. The intermediate magnification can be continuously varied. Thereby, even when using a new objective lens, it can adjust optimally.
[0055]
It is also possible to search the optimum condition by moving the magnification setting means of the objective lens 14 while performing the experiment. Even in this configuration, the same effects as those described with reference to FIG. 2 can be obtained. Specifically, FIG. 3A shows the intermediate magnification, that is, when the imaging lens 22 is set to 1. In this case, the effective NA is small and the sectioning effect is bad, but FIG. In this case, the effective NA is large and the sectioning effect is good.
[0056]
As with the intermediate variable magnification optical system 20, the imaging variable magnification optical system 21 in FIG. 1 can be converted by a turret switching method and continuous conversion by a zoom mechanism. Here, the magnification of the imaging optical system 21 from the pinhole disk 2 to the imaging device 18 is configured to be interlocked with the magnification of the intermediate magnification optical system 20, thereby absorbing the magnification of the intermediate magnification, A total magnification corresponding to the nominal magnification of the objective lens 14 can be obtained.
[0057]
In the embodiment of the present invention, focusing on the degradation of the sectioning effect when the size of the pinhole 13 is too large, only the case where the enlargement magnification is used as an intermediate magnification has been described as an improvement measure. Even when the light loss is too small and the light loss is large, a confocal microscope with a small light loss can be realized by applying the reduction magnification as the intermediate magnification. That is, the present invention can achieve the object of the present invention regardless of whether the intermediate magnification is enlarged or reduced.
[0058]
Further, in the embodiment of the present invention, a pinhole disk having a pinhole with a pinhole diameter of 50 μm set based on an objective lens of 100 times oil immersion is used, but the diameter of the pinhole is limited to 50 μm. A pinhole disc having a pinhole diameter of 40 μm that satisfies the diffraction-limited spot diameter due to the NA on the image side of the immersion objective at a certain magnification, for example, 60 times the immersion objective, rather than a reference dry or immersion objective It is also possible to set the intermediate magnification so that the diffraction limited spot diameter due to the NA on the image side of the objective lens of other magnification becomes approximately 40 μm. That is, since the intermediate magnification can be set so that the pinhole diameter of the pinhole disk substantially satisfies the diffraction limit spot diameter due to the NA on the image side of each objective lens, it is necessary to be concerned with the size of the pinhole diameter of the pinhole disk. Absent.
[0059]
【The invention's effect】
According to the present invention described above, even if the magnification of the objective lens is changed according to the purpose of use or the sample.,It is possible to provide a confocal microscope that can prevent the deterioration of the sectioning effect among the confocal effects utilizing the performance of each objective lens, and can reduce the light loss.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing a schematic configuration of an embodiment of a confocal microscope according to the present invention.
FIG. 2 is a diagram for explaining a first example of the intermediate variable magnification optical system in FIG. 1;
FIG. 3 is a diagram for explaining a second example of the intermediate variable magnification optical system in FIG. 1;
FIG. 4 is a diagram for explaining an example of a conventional confocal microscope.
5 is a simplified diagram of FIG. 4 for explaining the problem of FIG. 4;
6 is a diagram for explaining the problem in FIG. 5 and illustrating a state when NA on the image side of the objective lens <NA of the microlens.
7 is a diagram for explaining the problem in FIG. 5, for explaining the state when NA on the image side of the objective lens> NA of the microlens. FIG.
[Explanation of symbols]
1 ... Condensing disc,
2 ... pinhole disc,
3 ... Drum,
4 ... motor,
7 ... Beam splitter,
9 ... Camera,
10 ... Confocal optical scanner,
11 ... Laser light,
12 ... Microlens,
13 ... pinhole,
14 ... Objective lens,
15 ... Sample,
18 ... Imaging device,
20: Intermediate zoom optical system,
21: Imaging magnification optical system,
22, 23 ... Imaging lens,
24: Afocal zoom optical system.

Claims

A light source, an objective lens that collects irradiation light emitted from the light source on a sample, and a plurality of pinholes that are rotatably disposed on an image plane between the light source and the objective lens and pass the irradiation light A pinhole plate; a light branching optical system disposed between the objective lens and the light source; and a detector for detecting an inspection signal on the sample branched by the light branching optical system. In a confocal microscope that scans the sample against
Objective lens magnification changing means capable of changing the magnification of the objective lens;
Wherein disposed between the objective lens and the pinhole plate, the magnification from the sample into the pin hole plate, and the objective lens magnification changer means it can be changed in response to the magnification which is changed by the intermediate magnification changing means ,
Confocal microscope equipped with

An imaging system magnification changing means arranged on the optical system leading to the optical branching optical system and the detector, and capable of changing a projection magnification corresponding to the magnification of the objective lens changed by the objective lens magnification changing means;
The confocal microscope according to claim 1 , further comprising: