JP3652029B2

JP3652029B2 - Highly sensitive immunoassay

Info

Publication number: JP3652029B2
Application number: JP27345196A
Authority: JP
Inventors: 美枝松本; 広志黒田
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1996-10-16
Filing date: 1996-10-16
Publication date: 2005-05-25
Anticipated expiration: 2016-10-16
Also published as: JPH10123137A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、特定の抗原に対するモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、水溶媒中で該抗原と反応させ、不溶性担体と抗原の結合物を選択的に凝集反応させる高感度免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、病院、検査センター等においては、省力化、コスト削減、多量検体処理等の要請から、臨床検査等の諸検査の自動化、および測定時間の短縮化が図られてきた。このような自動化に適した方法として、不溶性担体粒子の凝集反応を利用して抗原性物質を定性ないし定量する凝集法が知られている（特公昭５８−１１５７５号公報参照）。
【０００３】
この凝集法は、被検試料中における抗原性物質を測定するに当たり、該被検試料と、該抗原性物質に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させた不溶性担体とを反応させ、不溶性担体の凝集の程度を測定することにより、前記抗原性物質を検出または定量するものである。この場合、上記抗体としては、通常、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が適宜選択される。モノクローナル抗体は抗原分子上の特定のエピトープのみと反応するため、該抗原性物質は多価抗原である場合でも特定のエピトープに関しては多価であるとは限らない。従って、上記抗体としてモノクローナル抗体を用いた場合は、その抗原は、特定のモノクローナル抗体に対応するエピトープに関しては、一価抗原となる可能性が高くなる。測定の対象とする抗原物質が一価抗原である場合、不溶性担体に担持された１種類のモノクローナル抗体と被検試料中の該抗原性物質とが反応もしくは結合しても、通常、凝集は起こらない。このため、凝集の起こり易さという観点から、通常、ポリクローナル抗体が多用されている。
【０００４】
しかしながら、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を比較してみれば、抗原に対する特異性の点では、モノクローナル抗体の方が断然優れている。また、ポリクローナル抗体は動物の個体差や採血の時期により異なるため、常に同じ品質のものを得ることは難しく、特異抗体に精製する段階での該抗体の量および活性損失も大きい。これに対し、モノクローナル抗体は品質の一定した抗体を大量生産するのに向いている。
【０００５】
このような点を考慮して、特定の抗原に対する異なる２種または３種のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、該抗原と反応させて、不溶性担体の凝集の程度を測定することにより、前記抗原性物質を検出または定量する方法が提案されている（特公平３−４０３４１号公報参照）。
【０００６】
また、近年、免疫診断では尿、血清、血漿等に含まれる微量物質、たとえば癌マーカーであるα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）や、カルテイノエンブリオイックアンテイジエン（ＣＥＡ）などは１ｎｇ／ｍｌといった低濃度まで定量することが望まれている。このような物質を測定するために、平均粒径の異なる２種以上のラテックス粒子を混合することによって低濃度から高濃度までの広範囲濃度の抗原又は抗体の測定を可能にする方法も提案されている（特開昭６３−６５３６９号公報参照）。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、すべてのモノクローナル抗体を同一平均粒径の不溶性担体に担持させる方法では、不溶性担体による立体的障害のために、抗体と測定しようとする抗原物質との間の抗原抗体反応およびそれに続く凝集反応が阻害される可能性がある。すなわち、抗原性物質が、１種類のモノクローナル抗体と、少なくとももう１種類のモノクローナル抗体とに同時に結合することによって、不溶性担体の凝集が生じるわけであるが、すべてのモノクローナル抗体が不溶性担体に担持されていると、２種のモノクローナル抗体の認識する抗原のエピトープが構造的に互いに近接した部位にある場合、不溶性担体間の立体的障害によって、異なる２種または３種のモノクローナル抗体が１つの抗原物質に対し同時に結合することが阻害される場合がある。また、この２種あるいは３種のモノクローナル抗体の間で抗原と抗原との親和定数が大きく乖離している場合も上記と同様に該親和定数の高いモノクローナル抗体が優先的に抗原と結合し、他のモノクローナル抗体との結合およびそれに続く凝集を阻害する場合がある。これらの理由により、モノクローナル抗体を同一平均粒径の不溶性担体に担持させる方法では、抗原性物質を正確に定量できない可能性がある。
【０００８】
特開昭６３−６５３６９号公報は、上述したように、低濃度の抗原物質の検出を実現するために、平均粒径の異なる２種以上のラテックス粒子を混合する方法を開示しているが、この方法で用いられている抗体はポリクローナル抗体であり、かつこの公報記載の発明は抗原抗体反応系中に反応に関与する抗原または抗体をできるだけ多く存在させることを企図したものである。従って低濃度での反応量は増大するが、同時にバックグラウンドおよび抗原物質以外の物質に由来する非特異凝集が多いという欠点がある。
【０００９】
本発明の目的は、上記のごとき実情に鑑み、不溶性担体の立体的障害による凝集阻害がなく、非特異凝集を惹起することなく、抗原抗体反応系中に反応に関与する抗原または抗体をできるだけ多く存在させることができ、その結果、抗原性物質を正確に定量できる高感度免疫測定法を提供することにある。
【００１０】
【課題を解決するための手段】
本発明による高感度免疫測定法は、特定の抗原に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、水溶媒中で抗原と反応させ、不溶性担体と抗原の結合物を選択的に凝集させるに当たり、不溶性担体として平均粒径が０．０５〜０．５００μｍの範囲にあり、かつ、平均粒径の異なる２種以上の担体を用い、これら不溶性担体に各モノクローナル抗体をそれぞれ担持させることを特徴とする方法である。
【００１１】
本発明により検出するのに適した抗原性物質は、生体試料中に含まれる生理活性物質で、かつ該抗原性物質に対応するモノクローナル抗体の作成ないし入手が可能である限り特に限定されないが、一価の抗原でかつ１種類のモノクローナル抗体では検出不可能なものが特に望ましい。また、抗原性物質を検出する試験項目としては、臨床検査上重要な項目であり、かつ従来の凝集法では検出感度が不足であるとされていた項目が特に有用である。
【００１２】
例えば、癌検診のスクリーニングにおいて測定される、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９などの１ｎｇ／ｍｌまで検出感度が要求される項目などである。
【００１３】
本発明で使用するモノクローナル抗体は特定の抗原に対する異なる２種以上（例えば２種または３種、好ましくは２種）のモノクローナル抗体である。モノクローナル抗体は、細胞融合技術分野において、それ自体公知の手法を適宜に選択し、またそれらを組み合わせてモノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、該細胞株を利用して産生、取得することができる（「単クローン抗体・ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」岩崎辰夫ら著、講談社）。
【００１４】
細胞融合の一態様によれば、ある特定の完全抗原を用いて、これを適当な動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシなどの動物に、例えば、アジュバントとともに皮下注射するといった手法を用いて投与し、該動物を免疫した後、この免疫動物、例えば免疫マウスの該抗原に対する抗体産生細胞、例えば脾細胞、胸腺細胞、リンパ節細胞および／または末梢血細胞などの細胞を採取し、該細胞と自己増殖性を有するが抗体産生能を実質的に有しない適当な株化細胞、例えばマウス骨髄腫（ミエローマ）株化細胞とを、それ自体公知の手法により細胞融合処理する。
【００１５】
モノクローナル抗体を得るためのミエローマ細胞と抗体産生細胞との組み合わせは、各細胞が融合して増殖しつつ抗体を産生することが可能であれば、それぞれの細胞の由来する動物の種類は限定されず、任意の組み合わせでよい。
【００１６】
使用されるミエローマ細胞は特に限定はなく、多くのマウス、ラット、ウサギ、ヒトなどの動物の細胞体を使用することができる。好ましい株化細胞は薬剤抵抗性のものであり、かつ未融合のミエローマ細胞が選択培地で生存せず、一方融合細胞のみが生存するようなものである。通常用いられるものは、８−アザグアニジン抵抗性の株化細胞で、これはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミンプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できない性質を有している。さらに使用する株化細胞は「非分泌型」のものであることが好ましい。例えばマウスミエローマＭＯＰＣ−２１株由来のＰ₃／Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ₁（Ｐ₃Ｕ₁）、Ｐ₃／Ｘ６３−Ａｇ８・６・５・３、Ｐ₃／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４、ラットミエローマ２１０・ＲＣＹ３・Ａｇ１・２・３などが好適に用いられる。
【００１７】
該細胞融合処理は、例えば、通常イーグル最小基本（ＭＥＭ）培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地などの培地中で上記免疫マウスの脾細胞１×１０⁸〜５×１０⁸個と、上記マウス骨髄腫株化細胞１×１０⁷〜５×１０⁷個とを、混合して行うことができる。融合促進剤としては、平均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が好ましく、他の融合促進剤、例えば、ポリビニルアルコール、ウイルスなども使用することができる。ＰＥＧの使用濃度は好ましくは約３０〜５０％である。
【００１８】
上述のようにして得ることのできる融合細胞含有系から融合細胞を、それ自体公知の手法を利用して、選別処理、抗体活性スクリーニング処理およびクローニング処理して、免疫マウスの形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体産生能を有し、かつ自己増殖能を持つ融合細胞株を取得することができる。
【００１９】
上記融合細胞の選別処理は、例えば、２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などで細胞融合を終えた細胞を適当に希釈し、９６穴マイクロプレートに１０⁵〜１０⁶個／ウェル程度に分注し、各ウェルに選択培地（例えばＨＡＴ培地）を加え、以後選択培地交換を行いながら、５％ＣＯ₂培養器（３７℃）で培養を続けることにより行うことができる。ミエローマ細胞として８−アザグアニン抵抗性株を用いれば、未融合のミエローマ細胞はＨＡＴ培地で死滅し、また抗体産生細胞は正常細胞なので試験管内（in vitro）培養では長期間生育できない。したがって培養後１０〜１４日ぐらいから生育してくる細胞はすべて融合細胞である。
【００２０】
上述のようにして得ることのできる融合細胞株の抗体活性スクリーニング処理およびクローニング処理は、例えば以下のようにして常法により行うことができる。
【００２１】
融合細胞の生育したウェルの培養上清の一部を採取し、一定量の標識抗原とインキュベーションし、標識抗原との結合能を測定することにより目的とする抗体を分泌しているウェルを検索することができる。すなわち、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉなどのラジオアイソトープあるいは酵素などで標識した抗原と培養上清を反応させた後、各反応液について抗原−抗体結合物を分離し、標識量を測定することにより、目的とする抗体の存在および結合能を検索することができる。
【００２２】
目的とする抗体活性の認められる各ウェル中には２種以上の融合細胞が生育している可能性があるので、限界希釈法や軟寒天によるコロニー形成法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生融合細胞株を得ることができる。
【００２３】
上述のようにして得ることのできるモノクローナル抗体産生細胞株を用いて、前記免疫動物の形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体を取得するには、該モノクローナル抗体産生細胞株を、例えば適当な培地に培養し、培地からモノクローナル抗体を採取する方法、ミエローマ細胞由来動物と同系の動物に該細胞株を移植し腹水中のモノクローナル抗体を採取する方法など、それ自体公知の手法を利用することができる。
【００２４】
上記前者の方法によれば、例えば、モノクローナル抗体産生融合細胞株を１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地などの培養液で培養し、その培養上清液を硫安分画や、抗原を結合させたセファロース４Ｂなどのアフィニティークロマトグラフィーなどによって精製することにより目的とするモノクローナル抗体を採取することができる。
【００２５】
また、上記後者の方法によれば、例えば、同系動物にプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）などの鉱物油を腹腔内投与した後、融合細胞を腹腔内投与することにより生体内（in vivo ）で融合細胞を大量に増殖させる。その結果、形成される腹水には高濃度のモノクローナル抗体が含まれている。この腹水から硫安分画および必要に応じて前記アフィニティークロマトグラフィーなどにより、目的とするモノクローナル抗体を取得することができる。
【００２６】
上述のようにして取得できるようなモノクローナル抗体は市販品として入手することも可能であり、本発明方法に利用できる。
【００２７】
本発明で使用する不溶性担体としては、従来より免疫化学的凝集反応および凝集阻止反応において一般的に用いられている微粒子の担体を使用することができる。
【００２８】
このような不溶性担体としては、工業的に大量生産可能な有機系微粒子が好ましいが、これに限定されるものではない。工業的に大量生産可能な有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステルなどのビニル系モノマーの単独重合体および／または共重合体、スチレン−ブタジエン共重合体、メチルメタクリレート−ブタジエン共重合体などのブタジエン系共重合体などの微粒子、および官能基としてカルボキシル基、第１級アミノ基、またはカルボアミノ基（−ＣＯＮＨ₂）、水酸基、アルデヒド基などを有し、かつ基体が前記有機系微粒子からなる反応性有機系微粒子などが挙げられる。抗体の吸着性に優れており、かつ生物学的活性を長期間安定に保持できるなどの理由から、特にポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。
【００２９】
そのほか、動物の赤血球や細菌の細胞などの生物学的粒子、ベントナイト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン、炭素末など非生物学的粒子が挙げられる。
【００３０】
本発明で使用する不溶性担体の平均粒径は、不溶性担体上の抗体と、測定対象となる抗原物質の抗原抗体反応により惹起される凝集反応の結果生じた凝集塊が肉眼または光学的に検出できるに充分な大きさを呈するものであればよい。特に、平均粒径が０．０５〜０．５００μｍの範囲にある２種以上の不溶性担体（好ましくはラテックス粒子）を、最小粒子種（２種以上の不溶性担体のうち最も平均粒径の小さいもの）の平均粒径に対する他の粒子種（２種以上の不溶性担体のうち上記最小粒子種以外の１または２以上のもの）の平均粒径の比が３〜６の範囲になるように組み合わせて使用することが好ましい。
【００３１】
２種の不溶性担体を混合する際、その容量の比は１：１０〜１０：１の範囲で、測定対象物質の必要な検出下限に合わせて適宜選択される。３種以上の不溶性担体を混合する際にも上記と同様に混合比を決定すればよい。
【００３２】
上記不溶性担体の表面にモノクローナル抗体を感作させる手法は種々知られており、本発明において適宜利用できる。例えば、このような感作手法として不溶性担体表面にモノクローナル抗体を物理的に吸着させる手法や、官能基を有する不溶性担体表面に、既知の方法である化学結合法や共有結合法により、モノクローナル抗体を効率的に感作する手法が挙げられる。
【００３３】
抗体を担持させた不溶性担体と、抗原との反応は、抗原抗体反応及びそれに伴う凝集反応であり、該反応が起こりうる条件であれば、その反応条件は特に限定されないが、反応温度は恒温、特に２５℃〜３７℃の範囲内の恒温であることが好ましい。反応時間についても特に限定されないが、５秒〜１５分が好ましい。
【００３４】
反応液としては、抗原抗体反応が起こりうる生理的条件を満たす水溶液であればどのようなものでもよいが、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス塩酸緩衝液、グッド緩衝液等が好ましい。反応液のｐＨは、好ましくは５．５〜８．５、特に好ましくは６．５〜８．０である。上記反応液に、安定剤として牛血清アルブミン、ショ糖、または感度を高める効果が期待されるポリエチレングリコール、デキストランなどの水溶性多糖類、防腐剤としてアジ化ナトリウム、および塩濃度調整のために塩化ナトリウム等の添加剤を適宜溶解させてもよい。
【００３５】
不溶性担体の凝集の程度を測定する方法は、特に限定されない。例えば、凝集を定性的ないし半定量的に測定する場合には、既知の試料の濁度の程度との比較から、上記結合物の凝集の程度を目視によって判定することも可能である。該凝集を定量的に測定する場合、簡便性及び精度の点からは、例えば光学的に測定することが望ましい。
【００３６】
凝集の光学的測定法としては、公知の方法が利用可能である。より具体的には、例えば、いわゆる比濁法（凝集塊の形成を濁度の増加としてとらえる）、粒度分布による測定法（凝集塊の形成を粒度分布ないし平均粒径の変化としてとらえる）、積分球濁度法（凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し、透過光強度との比を比較する）などの種々の方式が利用可能である。
【００３７】
これらのそれぞれの測定法について、速度試験（レートアッセイ；異なる時点で少なくとも２つの測定値を得て、これらの時点間における該測定値の増加分（すなわち増加速度）に基づき凝集の程度を求める）と、終点試験（エンドポイントアッセイ；ある時点（通常は、反応の終点と考えられる時点）で１つの測定値を得て、この測定値に基づき凝集の程度を求める）が利用可能である。測定の簡便さ、迅速性の点からは、比濁法を用いた速度試験を行うことが望ましい。
【００３８】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施例を説明する。
【００３９】
実施例および比較例で用いた試薬および材料は、下記の通りである。
【００４０】
１）試薬および材料
下記の試薬および材料を用意ないしは調製した。
【００４１】
抗ヒトＣＥＡモノクローナル抗体：
抗ＣＥＡモノクローナル抗体（Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ６７、ＩｇＧ−１、ＤＡＫＯ社製、およびClone No. ＣＥＡ４−Ｇ１１、ＩｇＧ−１、ＤＡＫＯ社製）を用いた。
【００４２】
ラテックス：
平均粒径０．０８７μｍ、０．１２０μｍ、、０．２１０μｍ０．４００μｍ、０．４６４μｍのポリスチレン粒子をそれぞれ含む５種のラテックス（いずれも固形分１０％（Ｗ／Ｖ）、積水化学社製）を用いた。
【００４３】
ラテックス希釈用緩衝液：
５０ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄と５０ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄をｐＨ７．５０になるように混合し、得られた混合物をラテックス希釈用緩衝液として用いた。
【００４４】
抗体希釈用緩衝液：
上記ラテックス希釈用緩衝液を抗体希釈用緩衝液としても用いた。
【００４５】
ブロッキング用緩衝液：
１００ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄と１００ｍＭＮａＨ₂ＰＯ₄をｐＨ７．４０になるように混合し、得られた混合物にウシ血清アルブミン（Bovine serum albumin、Fraction V、Reagent Grade 、Miles Corp. 社製）を１％（Ｗ／Ｖ）になるように、またＮａＮ₃（試薬特級、ナカライテスク社製）を０．１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを、ブロッキング用緩衝液として用いた。
【００４６】
ＣＥＡ標準品：
ＣＥＡ標準品（ダイナボット社製、ＣＥＡ・リアビーズキット添付品）の０、５、２０、１００、５００ｎｇ／ｍｌをそのまま用いた。
【００４７】
検体希釈用希釈液（Ｒ１液）：
ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール６，０００（平均分子量７，５００、和光純薬社製）を３％（Ｗ／Ｖ）になるように添加したものを検体希釈用希釈液（Ｒ１液）として用いた。
【００４８】
実施例１
(1) ＣＥＡ測定用試薬の調製
平均粒径０．０８７μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％（Ｗ／Ｖ））１容に、ラテックス希釈用緩衝液９容を添加してラテックスを希釈し、１．０％ラテックス液とした。抗ＣＥＡ抗体（Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ６７）は、タンパク濃度が６６．７μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作用の抗体液とした。１．０％（Ｗ／Ｖ）ラテックス液６００μｌを２５℃のインキュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、これに抗体液１２００μｌを素早く添加し、２５℃にて１時間攪拌した。その後、ブロッキング用緩衝液を３．０ｍｌ添加し、２５℃にて続けて２時間攪拌した。その後、１５℃、１５，０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離した。得られた沈殿にブロッキング用緩衝液を４．０ｍｌ添加し、同様に遠心分離することにより、沈殿を洗浄した。洗浄操作は３回行った。この沈殿にブロッキング用緩衝液を１．８ｍｌ添加し、よく攪拌した後、超音波破砕機にて分散処理を行った。これにさらにブロッキング用緩衝液を１．８ｍｌ添加し、固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［１］とした。このようにして調製したＣＥＡ測定用試薬［１］は４℃にて保存した。
【００４９】
また、不溶性担体液として、平均粒径０．４６４μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％（Ｗ／Ｖ））を用い、感作用の抗体液として、抗ＣＥＡ抗体（Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ１１、ＩｇＧ−１）をタンパク濃度が１２．５μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈したものを用い、その他の点ではＣＥＡ測定用試薬［１］の場合と同様の操作を行って固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［２］を得、４℃にて保存した。
【００５０】
(2) ＣＥＡ量の測定
ＣＥＡ量の測定は、生化学用自動分析装置７１５０形（日立製作所社製）を用いて行った。上記(1) で得られた固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［１］および［２］を等量混合し、得られた混合液を試薬（Ｒ２液）（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））とした。測定条件は以下の通りである。
【００５１】
検体容量２０μｌ
検体希釈用希釈液（Ｒ１液）２１０μｌ
試薬（Ｒ２液）３０μｌ
測定波長５７０ｎｍ
測定温度３７℃
【００５２】
測定系に試薬（Ｒ２液）を添加してから約８０秒後の吸光度と約３２０秒後の吸光度の差（ΔＯＤ５７０）を測定し、この吸光度の差を１０，０００倍したものを吸光度変化量とした。検体として既知濃度のＣＥＡ標準品を用いて測定を行い、検量線を作成した。
【００５３】
比較例１（同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定）
実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［１］（ラテックス凝集免疫試薬（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））をそのまま試薬（Ｒ２液）として用いた点を除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００５４】
比較例２（同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定）
実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［２］（ラテックス凝集免疫試薬（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））をそのまま試薬（Ｒ２液）として用いた点を除いて、実施例１と同じ操作を行った。
【００５５】
試験結果
実施例１および比較例１、２で測定した吸光度変化量および作成した検量線を表１および図１に示す。
【００５６】
【表１】

【００５７】
表１および図１から明らかなように、本発明の方法による実施例１の測定値から作成された検量線は、ＣＥＡ低濃度域から高濃度域まで、良好な直線性を示した。これに対し、同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬による比較例１、２の検量線は、ＣＥＡ低濃度域および高濃度域において、本発明による方法よりも反応性が低いため、良好な直線性を示さなかった。
【００５８】
これは、実施例１では、２種のモノクローナル抗原を異なる平均粒径の不溶性担体に担持させてなるラテックス試薬を用いたため、比較例で用いた同一平均粒径のものよりもラテックス粒子間の立体障害が解消され、抗原抗体反応およびそれに続く凝集反応が促進されたためと推察される。
【００５９】
以上の結果から、本発明によるＣＥＡ定量法は、従来のラテックス凝集免疫試薬よりも高感度で優れた定量法であることが確認された。
【００６０】
実施例２
(1) ＣＥＡ測定用試薬の調製
不溶性担体液として、平均粒径０．１２０μｍおよび０．４００μｍの２種のポリスチレンラテックスを用い、感作用の抗体液として、抗ＣＥＡ抗体Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ６７をタンパク濃度が４８．３μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈したもの、および、抗ＣＥＡ抗体Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ１１をタンパク濃度が１４．５μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈したものをそれぞれ用い、その他の点ではＣＥＡ測定用試薬［１］の場合と同様の操作を行って固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［３］および［４］を得、４℃にて保存した。
【００６１】
(2) ＣＥＡ量の測定
上記(1) で得られた固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［３］および［４］を等量混合し、得られた混合液を試薬（Ｒ２液）とした点を除いて、実施例１と同じ操作を行ってＣＥＡ量を測定した。
【００６２】
比較例３（同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定）
実施例２で得られたＣＥＡ測定用試薬［３］（ラテックス凝集免疫試薬（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））をそのまま試薬（Ｒ２液）として用いた点を除いて、実施例２と同じ操作を行った。
【００６３】
比較例４（同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定）
実施例２で得られたＣＥＡ測定用試薬［４］（ラテックス凝集免疫試薬（固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ））をそのまま試薬（Ｒ２液）として用いた点を除いて、実施例２と同じ操作を行った。
【００６４】
試験結果
実施例２および比較例３、４で測定した吸光度変化量および作成した検量線を表２および図２に示す。
【００６５】
【表２】

【００６６】
表２および図２から明らかなように、本発明の方法による実施例２の測定値から作成された検量線は、実施例１と同様にＣＥＡ低濃度域から高濃度域まで、良好な直線性を示した。これに対し、同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬による比較例３、４の検量線は、ＣＥＡ低濃度域および高濃度域において、本発明による方法よりも反応性が低いため、良好な直線性を示さなかった。
【００６７】
実施例３
実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［１］と、実施例２で得られたＣＥＡ測定用試薬［４］とを等量混合し、得られた混合液を試薬（Ｒ２液）とした点を除いて、実施例１と同じ操作を行ってＣＥＡ量を測定した。
【００６８】
実施例４
実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［２］と、実施例２で得られたＣＥＡ測定用試薬［３］とを等量混合し、得られた混合液を試薬（Ｒ２液）とした点を除いて、実施例１と同じ操作を行ってＣＥＡ量を測定した。
【００６９】
試験結果
実施例３、４で測定した吸光度変化量および作成した検量線を表３および図３に示す。
【００７０】
【表３】

【００７１】
表３および図３から明らかなように、本発明の方法による実施例３、４の測定値から作成された検量線は、実施例１と同様にＣＥＡ低濃度域から高濃度域まで良好な直線性を示した。
【００７２】
実施例５
(1) ＣＥＡ測定用試薬の調製
不溶性担体液として、平均粒径０．２１０μｍのポリスチレンラテックスを用い、感作用の抗体液として、抗ＣＥＡ抗体Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ６７をタンパク濃度が２７．６μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈したものを用い、その他の点では実施例１のＣＥＡ測定用試薬［１］の場合と同様の操作を行って固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［５］を得、４℃にて保存した。
【００７３】
(2) ＣＥＡ量の測定
上記(1) で得られた固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［５］と、実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［２］とを等量混合し、得られた混合液を試薬（Ｒ２液）とした点を除いて、実施例１と同じ操作を行ってＣＥＡ量を測定した。
【００７４】
比較例５（同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬を用いたＣＥＡ量の測定）
(1) ＣＥＡ測定用試薬の調製
不溶性担体液として、平均粒径０．４６４μｍのポリスチレンラテックスを用い、感作用の抗体液として、抗ＣＥＡ抗体Clone No. ＣＥＡ４−Ｇ６７をタンパク濃度が１２．５μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈したものを用い、その他の点ではＣＥＡ測定用試薬［１］の場合と同様の操作を行って固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［６］を得、４℃にて保存した。
【００７５】
(2) ＣＥＡ量の測定
上記(1) で得られた固形分０．１７％（Ｗ／Ｖ）のＣＥＡ測定用試薬［６］と、実施例１で得られたＣＥＡ測定用試薬［２］とを等量混合し、得られた混合液を試薬（Ｒ２液）とした点を除いて、実施例１と同じ操作を行ってＣＥＡ量を測定した。
【００７６】
試験結果
実施例５および比較例５で測定した吸光度変化量および作成した検量線を表４および図３に示す。
【００７７】
【表４】

【００７８】
表４および図３から明らかなように、本発明の方法による実施例５の測定値から作成された検量線は、実施例１と同様にＣＥＡ低濃度域から高濃度域まで、良好な直線性を示した。これに対し、同一平均粒径のラテックス凝集免疫試薬による比較例５の検量線は、ＣＥＡ低濃度域および高濃度域において、本発明による方法よりも反応性が低いため、良好な直線性を示さなかった。
【００７９】
【発明の効果】
本発明による免疫測定法は以上の如く構成されているので、従来のラテックス凝集免疫試薬で見られたような不溶性担体の立体的障害による凝集阻害がなく、かつ非特異凝集を惹起することがなく、抗原抗体反応系中に反応に関与する抗原または抗体をできるだけ多く存在させることができる。その結果、抗原性物質を正確に定量することができ、低濃度域でも高い検出感度を示すことができる。特に、２種以上のモノクローナル抗体の認識する抗原のエピトープが構造的に互いに近接していたり、または抗原物質の分子量が小さく、同一平均粒径の不溶性担体では凝集反応が生じ難い場合に、より一層その効果が発揮される。したがって、本発明による測定法は、被検試料中の抗原性物質を正確に定量することを可能にし、疾患の発見、病態の把握、治療方法の決定などに有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、本発明のＣＥＡ測定方法による吸光度変化量の相関、および比較例１、２に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、従来法によるラテックス凝集免疫試薬による吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図２】実施例２に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、本発明のＣＥＡ測定方法による吸光度変化量の相関、および比較例３、４に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、従来法によるラテックス凝集免疫試薬による吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図３】実施例３、４および５に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、本発明のＣＥＡ測定方法による吸光度変化量の相関、および比較例５に使用された既知濃度のＣＥＡ標準品中のＣＥＡ量と、従来法によるラテックス凝集免疫試薬による吸光度変化量の相関を示すグラフである。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a highly sensitive immunoassay method in which a monoclonal antibody against a specific antigen is supported on an insoluble carrier, reacted with the antigen in an aqueous solvent, and a conjugate of the insoluble carrier and the antigen is selectively agglutinated.
[0002]
[Prior art]
In recent years, hospitals, test centers, and the like have been trying to automate various tests such as clinical tests and shorten measurement time due to demands for labor saving, cost reduction, and large sample processing. As a method suitable for such automation, an agglutination method is known in which an antigenic substance is qualitatively or quantified using an agglutination reaction of insoluble carrier particles (see Japanese Patent Publication No. 58-11575).
[0003]
In this agglutination method, in measuring an antigenic substance in a test sample, the test sample is reacted with an insoluble carrier carrying an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the antigenic substance, and insoluble. The antigenic substance is detected or quantified by measuring the degree of aggregation of the carrier. In this case, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody is usually appropriately selected as the antibody. Since a monoclonal antibody reacts only with a specific epitope on an antigen molecule, even when the antigenic substance is a multivalent antigen, the specific epitope is not always multivalent. Therefore, when a monoclonal antibody is used as the antibody, the antigen is likely to be a monovalent antigen with respect to the epitope corresponding to the specific monoclonal antibody. When the antigenic substance to be measured is a monovalent antigen, even if one kind of monoclonal antibody supported on an insoluble carrier reacts or binds to the antigenic substance in the test sample, aggregation usually does not occur. Absent. For this reason, in general, polyclonal antibodies are frequently used from the viewpoint of easy aggregation.
[0004]
However, comparing the polyclonal antibody with the monoclonal antibody, the monoclonal antibody is far superior in terms of specificity to the antigen. In addition, since polyclonal antibodies vary depending on individual animals and the timing of blood collection, it is difficult to always obtain the same quality, and the amount and activity loss of the antibodies at the stage of purification into specific antibodies are large. In contrast, monoclonal antibodies are suitable for mass production of antibodies of constant quality.
[0005]
In consideration of such points, two or three different monoclonal antibodies against a specific antigen are supported on an insoluble carrier, reacted with the antigen, and the degree of aggregation of the insoluble carrier is measured. A method for detecting or quantifying a sex substance has been proposed (see Japanese Patent Publication No. 3-40341).
[0006]
In recent years, in immunodiagnostics, trace substances contained in urine, serum, plasma, etc., such as α-fetoprotein (AFP), which is a cancer marker, and cartinoembryonic antigen (CEA), have a concentration as low as 1 ng / ml. It is desired to quantify. In order to measure such substances, a method that enables measurement of antigens or antibodies in a wide range from a low concentration to a high concentration by mixing two or more types of latex particles having different average particle diameters has been proposed. (See JP-A 63-65369).
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
However, in the method in which all monoclonal antibodies are supported on an insoluble carrier having the same average particle diameter, an antigen-antibody reaction and an subsequent agglutination reaction between the antibody and the antigen substance to be measured due to steric hindrance due to the insoluble carrier. May be inhibited. That is, an antigenic substance binds to one type of monoclonal antibody and at least one other type of monoclonal antibody at the same time to cause aggregation of the insoluble carrier, but all the monoclonal antibodies are supported on the insoluble carrier. If the epitopes of the antigens recognized by the two monoclonal antibodies are structurally close to each other, two or three different monoclonal antibodies may become one antigenic substance due to steric hindrance between the insoluble carriers. May be inhibited from binding simultaneously. Also, when the affinity constant between the antigen and the antigen is greatly deviated between the two or three monoclonal antibodies, the monoclonal antibody having a high affinity constant preferentially binds to the antigen in the same manner as described above. Binding to the monoclonal antibody and subsequent aggregation may be inhibited. For these reasons, there is a possibility that the antigenic substance cannot be accurately quantified by the method in which the monoclonal antibody is supported on an insoluble carrier having the same average particle diameter.
[0008]
As described above, JP-A-63-65369 discloses a method of mixing two or more types of latex particles having different average particle diameters in order to realize detection of a low concentration antigenic substance. The antibody used in this method is a polyclonal antibody, and the invention described in this publication intends to have as many antigens or antibodies involved in the reaction as possible in the antigen-antibody reaction system. Accordingly, the reaction amount at a low concentration increases, but at the same time, there is a disadvantage that there are many non-specific aggregations derived from substances other than the background and antigen substances.
[0009]
In view of the circumstances as described above, the object of the present invention is to prevent as much as possible antigens or antibodies involved in the reaction in the antigen-antibody reaction system without causing inhibition of aggregation due to steric hindrance of the insoluble carrier and causing nonspecific aggregation. An object of the present invention is to provide a highly sensitive immunoassay that can be present and, as a result, can accurately quantify antigenic substances.
[0010]
[Means for Solving the Problems]
In the highly sensitive immunoassay method according to the present invention, two or more different monoclonal antibodies against a specific antigen are supported on an insoluble carrier, reacted with the antigen in an aqueous solvent, and the insoluble carrier-antigen conjugate is selectively aggregated. As an insoluble carrierThe average particle size is in the range of 0.05 to 0.500 μm, andThe method is characterized in that two or more kinds of carriers having different average particle diameters are used and each of the monoclonal antibodies is supported on these insoluble carriers.
[0011]
The antigenic substance suitable for detection by the present invention is not particularly limited as long as it is a physiologically active substance contained in a biological sample and a monoclonal antibody corresponding to the antigenic substance can be prepared or obtained. Particularly preferred are antigens that are not detectable with a single monoclonal antibody. Moreover, as a test item for detecting an antigenic substance, an item that is important in clinical examination and that has been considered to have insufficient detection sensitivity in the conventional agglutination method is particularly useful.
[0012]
For example, items required for detection sensitivity up to 1 ng / ml, such as CEA and CA19-9, measured in screening for cancer screening.
[0013]
The monoclonal antibodies used in the present invention are two or more (for example, two or three, preferably two) different monoclonal antibodies against a specific antigen. Monoclonal antibodies can be produced and obtained by appropriately selecting methods known per se in the field of cell fusion technology and combining them to form a monoclonal antibody-producing fused cell line. ("Monoclonal antibody, hybridoma and ELISA" written by Ikuo Iwasaki et al., Kodansha).
[0014]
According to one aspect of cell fusion, a particular complete antigen is used and injected subcutaneously into an appropriate animal, such as an animal such as a mouse, rat, rabbit, goat, sheep, horse, cow, eg, with an adjuvant. And then immunizing the animal, and then collecting cells such as spleen cells, thymocytes, lymph node cells and / or peripheral blood cells, which produce antibody against the antigen of the immunized animal such as immunized mice. Then, an appropriate cell line that has self-proliferating ability but does not substantially have antibody-producing ability, for example, a mouse myeloma (myeloma) cell line, is subjected to cell fusion treatment by a technique known per se.
[0015]
The combination of myeloma cells and antibody-producing cells for obtaining monoclonal antibodies is not limited to the type of animal from which each cell is derived, as long as each cell can fuse and proliferate to produce antibodies. Any combination may be used.
[0016]
There are no particular limitations on the myeloma cells used, and many cell bodies of animals such as mice, rats, rabbits, and humans can be used. Preferred cell lines are those that are drug resistant and are such that unfused myeloma cells do not survive in the selective medium while only fused cells survive. Commonly used cells are 8-azaguanidine-resistant cell lines that lack hypoxanthine / guanine / phosphoribosyltransferase and cannot grow on hypoxanthine / aminepterin / thymidine (HAT) medium. ing. Furthermore, the cell line used is preferably “non-secretory”. For example, P derived from mouse myeloma MOPC-21 strain_Three/ X63-Ag8U₁(P_ThreeU₁), P_Three/ X63-Ag8 ・ 6 ・ 5 ・ 3, P_Three/ NSI-1-Ag4-1, Sp2 / O-Ag14, rat myeloma 210, RCY3, Ag1, 2, 3 and the like are preferably used.
[0017]
The cell fusion treatment is performed by, for example, 1 × 10 splenocytes of the immunized mouse in a medium such as an ordinary Eagle minimal basic (MEM) medium or RPMI-1640 medium.⁸~ 5x10⁸And 1 × 10 mouse myeloma cell line⁷~ 5x10⁷The individual can be mixed. As the fusion promoter, polyethylene glycol (PEG) having an average molecular weight of 1,000 to 6,000 is preferable, and other fusion promoters such as polyvinyl alcohol and viruses can also be used. The concentration of PEG used is preferably about 30-50%.
[0018]
Using a known method, fused cells from the fused cell-containing system obtained as described above are subjected to a selection process, an antibody activity screening process, and a cloning process to obtain a complete antigen used to form an immunized mouse. It is possible to obtain a fusion cell line having the ability to produce monoclonal antibodies against and having self-proliferating ability.
[0019]
For the selection process of the fused cells, for example, the cells after the cell fusion are completed with a RPMI-1640 medium containing 20% fetal calf serum and diluted appropriately, and 10 cells are added to a 96-well microplate.^Five-10⁶Dispense about 5 cells / well, add selective medium (for example, HAT medium) to each well, and perform 5% CO₂It can be performed by continuing the culture in an incubator (37 ° C.). If an 8-azaguanine resistant strain is used as the myeloma cell, the unfused myeloma cell is killed in the HAT medium, and the antibody-producing cell is a normal cell and cannot grow for a long time in in vitro culture. Therefore, all cells that grow from about 10 to 14 days after culture are fused cells.
[0020]
The antibody activity screening process and cloning process of the fusion cell line that can be obtained as described above can be carried out by a conventional method, for example, as follows.
[0021]
Collect a portion of the culture supernatant of the well in which the fused cells have grown, incubate with a certain amount of labeled antigen, and measure the ability to bind to the labeled antigen to search for wells secreting the desired antibody. be able to. That is,¹²⁵I,¹³¹After reacting an antigen labeled with a radioisotope such as I or an enzyme with a culture supernatant, the antigen-antibody conjugate is separated from each reaction solution, and the amount of labeling is measured to determine the presence of the target antibody and The binding ability can be searched.
[0022]
Since there may be two or more types of fused cells growing in each well in which the desired antibody activity is observed, monoclonal antibody-producing fused cells are cloned by limiting dilution or colony formation with soft agar. Stocks can be obtained.
[0023]
In order to obtain a monoclonal antibody against the complete antigen used for the formation of the immunized animal using the monoclonal antibody-producing cell line obtained as described above, the monoclonal antibody-producing cell line is placed in an appropriate medium, for example. Methods known per se, such as a method of culturing and collecting a monoclonal antibody from a medium, a method of transplanting the cell line to an animal syngeneic with a myeloma cell-derived animal and collecting a monoclonal antibody in ascites, can be used.
[0024]
According to the former method, for example, a monoclonal antibody-producing fusion cell line is cultured in a culture solution such as RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum, and the culture supernatant is combined with an ammonium sulfate fraction or an antigen. The desired monoclonal antibody can be collected by purification by affinity chromatography such as Sepharose 4B.
[0025]
In addition, according to the latter method, for example, a mineral oil such as pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) is intraperitoneally administered to a syngeneic animal, and then fused cells are administered intraperitoneally. Large amounts of fused cells grow in the body (in vivo). As a result, the ascites formed contains a high concentration of monoclonal antibodies. The target monoclonal antibody can be obtained from this ascites by ammonium sulfate fractionation and, if necessary, the affinity chromatography.
[0026]
Monoclonal antibodies that can be obtained as described above can also be obtained as commercial products and can be used in the method of the present invention.
[0027]
As the insoluble carrier used in the present invention, a particulate carrier generally used in immunochemical aggregation reaction and aggregation inhibition reaction can be used.
[0028]
Such an insoluble carrier is preferably organic fine particles that can be industrially mass-produced, but is not limited thereto. Examples of organic fine particles that can be industrially mass-produced include homopolymers and / or copolymers of vinyl monomers such as styrene, vinyl chloride, acrylonitrile, vinyl acetate, acrylic acid esters, and methacrylic acid esters, styrene- Fine particles such as butadiene copolymer, butadiene copolymer such as methyl methacrylate-butadiene copolymer, and carboxyl group, primary amino group, or carboamino group (—CONH) as a functional group₂), Reactive organic fine particles having a hydroxyl group, an aldehyde group, and the like, and the substrate is composed of the organic fine particles. Polystyrene latex particles are particularly preferred because they have excellent antibody adsorption properties and can retain biological activity stably for a long period of time.
[0029]
Other examples include biological particles such as animal erythrocytes and bacterial cells, and non-biological particles such as bentonite, collodion, cholesterol crystals, silica, kaolin, and carbon powder.
[0030]
The average particle size of the insoluble carrier used in the present invention is such that an aggregate formed as a result of an agglutination reaction caused by an antigen-antibody reaction between an antibody on the insoluble carrier and an antigen substance to be measured can be detected visually or optically. As long as it exhibits a sufficient size. In particular, two or more insoluble carriers (preferably latex particles) having an average particle size in the range of 0.05 to 0.500 μm are selected from the smallest particle species (the smallest average particle size of two or more insoluble carriers). The average particle size of other particle types (one or more of the two or more insoluble carriers other than the above-mentioned minimum particle types) is combined so that the average particle size ratio is in the range of 3-6. It is preferable to use it.
[0031]
When mixing two kinds of insoluble carriers, the ratio of the volumes is appropriately selected in the range of 1:10 to 10: 1 according to the required lower detection limit of the substance to be measured. When mixing three or more insoluble carriers, the mixing ratio may be determined in the same manner as described above.
[0032]
Various techniques for sensitizing a monoclonal antibody on the surface of the insoluble carrier are known and can be appropriately used in the present invention. For example, as such a sensitization method, a monoclonal antibody is physically adsorbed on the surface of an insoluble carrier, or a known method such as a chemical bonding method or a covalent bonding method is applied to the surface of an insoluble carrier having a functional group. There is a method to sensitize efficiently.
[0033]
The reaction between the insoluble carrier carrying the antibody and the antigen is an antigen-antibody reaction and an accompanying agglutination reaction, and the reaction conditions are not particularly limited as long as the reaction can occur, but the reaction temperature is constant temperature, In particular, a constant temperature within the range of 25 ° C to 37 ° C is preferable. The reaction time is not particularly limited, but is preferably 5 seconds to 15 minutes.
[0034]
The reaction solution may be any aqueous solution that satisfies physiological conditions that can cause an antigen-antibody reaction, but phosphate buffer, glycine buffer, Tris-HCl buffer, Good buffer, and the like are preferable. The pH of the reaction solution is preferably 5.5 to 8.5, particularly preferably 6.5 to 8.0. In the above reaction mixture, bovine serum albumin, sucrose as a stabilizer, water-soluble polysaccharides such as polyethylene glycol and dextran, which are expected to increase sensitivity, sodium azide as a preservative, and chloride for adjusting the salt concentration An additive such as sodium may be appropriately dissolved.
[0035]
The method for measuring the degree of aggregation of the insoluble carrier is not particularly limited. For example, when the aggregation is measured qualitatively or semi-quantitatively, it is possible to visually determine the degree of aggregation of the above-mentioned combined substance from the comparison with the known degree of turbidity of the sample. When quantitatively measuring the aggregation, it is desirable to measure, for example, optically from the viewpoint of simplicity and accuracy.
[0036]
As an optical measurement method of aggregation, a known method can be used. More specifically, for example, a so-called turbidimetric method (aggregate formation is regarded as an increase in turbidity), a measurement method based on particle size distribution (agglomerate formation is regarded as a change in particle size distribution or average particle size), integration Various methods such as a sphere turbidity method (a change in forward scattered light due to the formation of agglomerates is measured using an integrating sphere and a ratio with transmitted light intensity is compared) can be used.
[0037]
For each of these methods, rate testing (rate assay; obtain at least two measurements at different time points and determine the degree of aggregation based on the increase in the values between these time points (ie, the rate of increase)) And an endpoint test (endpoint assay; one measurement is obtained at a certain time point (usually considered as the end point of the reaction), and the degree of aggregation is determined based on this measurement value) is available. From the viewpoint of ease of measurement and rapidity, it is desirable to conduct a speed test using a turbidimetric method.
[0038]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples of the present invention will be described below.
[0039]
The reagents and materials used in Examples and Comparative Examples are as follows.
[0040]
1) Reagents and materials
The following reagents and materials were prepared or prepared.
[0041]
Anti-human CEA monoclonal antibody:
Anti-CEA monoclonal antibodies (Clone No. CEA4-G67, IgG-1, DAKO, and Clone No. CEA4-G11, IgG-1, DAKO) were used.
[0042]
latex:
Five types of latex each containing polystyrene particles having an average particle size of 0.087 μm, 0.120 μm, 0.210 μm, 0.400 μm, and 0.464 μm (all 10% solids (W / V), manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.) Using.
[0043]
Latex dilution buffer:
50 mM Na₂HPO_FourAnd 50 mM NaH₂PO_FourWere mixed to a pH of 7.50, and the resulting mixture was used as a latex dilution buffer.
[0044]
Antibody dilution buffer:
The latex dilution buffer was also used as an antibody dilution buffer.
[0045]
Blocking buffer:
100 mM Na₂HPO_FourAnd 100 mM NaH₂PO_FourThe bovine serum albumin (Bovine serum albumin, Fraction V, Reagent Grade, manufactured by Miles Corp.) to 1% (W / V) was added to the resulting mixture. NaN_ThreeWhat added the reagent special grade (made by Nacalai Tesque) so that it might become 0.1% (W / V) was used as a buffering solution for blocking.
[0046]
CEA standard products:
0, 5, 20, 100, and 500 ng / ml of CEA standard products (manufactured by Dynabot, attached to CEA / Rear Beads Kit) were used as they were.
[0047]
Diluent for sample dilution (R1 solution):
Polyethylene glycol 6,000 (average molecular weight 7,500, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) added to the blocking buffer so as to be 3% (W / V) is used as a sample dilution diluent (R1 solution). Using.
[0048]
Example 1
(1) Preparation of CEA measurement reagent
The latex was diluted by adding 9 volumes of a latex dilution buffer to 1 volume of polystyrene latex (solid content 10% (W / V)) having an average particle size of 0.087 μm to obtain a 1.0% latex solution. An anti-CEA antibody (Clone No. CEA4-G67) was diluted with an antibody dilution buffer so that the protein concentration was 66.7 μg / ml, and used as a sensitizing antibody solution. While stirring 600 μl of 1.0% (W / V) latex solution with a magnetic stirrer in an incubator at 25 ° C., 1200 μl of the antibody solution was quickly added thereto and stirred at 25 ° C. for 1 hour. Thereafter, 3.0 ml of blocking buffer was added and stirred at 25 ° C. for 2 hours. Then, it centrifuged for 15 minutes at 15 degreeC and 15,000 rpm. To the resulting precipitate, 4.0 ml of blocking buffer was added and centrifuged in the same manner to wash the precipitate. The washing operation was performed 3 times. After adding 1.8 ml of blocking buffer to this precipitate and stirring well, dispersion treatment was performed with an ultrasonic crusher. Further, 1.8 ml of blocking buffer was added thereto to obtain a CEA measurement reagent [1] having a solid content of 0.17% (W / V). The CEA measurement reagent [1] thus prepared was stored at 4 ° C.
[0049]
Further, as an insoluble carrier liquid, polystyrene latex (solid content 10% (W / V)) having an average particle diameter of 0.464 μm is used, and as a sensitive antibody liquid,AntiA CEA antibody (Clone No. CEA4-G11, IgG-1) diluted with an antibody dilution buffer so that the protein concentration is 12.5 μg / ml is used. In other respects, a reagent for CEA measurement [1] The CEA measurement reagent [2] having a solid content of 0.17% (W / V) was obtained by carrying out the same operation as in, and stored at 4 ° C.
[0050]
(2) Measurement of CEA amount
The CEA amount was measured using a biochemical automatic analyzer 7150 (manufactured by Hitachi, Ltd.). Equal amounts of CEA measurement reagents [1] and [2] with a solid content of 0.17% (W / V) obtained in (1) above were mixed, and the resulting mixture was used as a reagent (R2 liquid) (solid Min 0.17% (W / V)). The measurement conditions are as follows.
[0051]
Sample volume 20μl
Diluent for sample dilution (R1 solution) 210μl
Reagent (R2 solution) 30μl
Measurement wavelength 570nm
Measurement temperature 37 ℃
[0052]
The difference between the absorbance after about 80 seconds and the absorbance after about 320 seconds (ΔOD570) after the addition of the reagent (R2 solution) to the measurement system was measured, and the difference in absorbance was multiplied by 10,000. It was. Measurement was performed using a CEA standard product having a known concentration as a specimen, and a calibration curve was prepared.
[0053]
Comparative Example 1(Measurement of CEA amount using latex agglutination immunoreagent of the same average particle size)
Example 1 except that the CEA measurement reagent [1] obtained in Example 1 (latex agglutination immunoreagent (solid content 0.17% (W / V)) was used as it was as a reagent (R2 solution). The same operation was performed.
[0054]
Comparative Example 2(Measurement of CEA amount using latex agglutination immunoreagent of the same average particle size)
Example 1 except that the CEA measurement reagent [2] (latex agglutination immunoreagent (solid content 0.17% (W / V)) obtained in Example 1 was used as it was as the reagent (R2 solution). The same operation was performed.
[0055]
Test results
The absorbance change measured in Example 1 and Comparative Examples 1 and 2 and the prepared calibration curve are shown in Table 1 and FIG.
[0056]
[Table 1]

[0057]
As is clear from Table 1 and FIG. 1, the calibration curve created from the measured values of Example 1 according to the method of the present invention showed good linearity from the CEA low concentration range to the high concentration range. On the other hand, the calibration curves of Comparative Examples 1 and 2 using the latex agglutination immunoreagent having the same average particle diameter are less reactive than the method according to the present invention in the CEA low concentration region and the high concentration region, so that the linearity is good. Did not show.
[0058]
This is because, in Example 1, a latex reagent in which two types of monoclonal antigens were supported on an insoluble carrier having different average particle diameters was used, so that the three-dimensional structure between latex particles was higher than that of the same average particle diameter used in the comparative example. It is presumed that the obstacle was resolved and the antigen-antibody reaction and the subsequent aggregation reaction were promoted.
[0059]
From the above results, it was confirmed that the CEA quantification method according to the present invention is a quantification method with higher sensitivity and superior to the conventional latex agglutination immunoreagent.
[0060]
Example 2
(1) Preparation of CEA measurement reagent
As an insoluble carrier liquid, two kinds of polystyrene latex having an average particle size of 0.120 μm and 0.400 μm were used, and as a sensitive antibody liquid,AntiCEA antibody Clone No. CEA4-G67 diluted with an antibody dilution buffer so that the protein concentration is 48.3 μg / ml, andAntiThe CEA antibody Clone No. CEA4-G11 was diluted with an antibody dilution buffer so that the protein concentration would be 14.5 μg / ml, and the other points were the same as in the case of the CEA measurement reagent [1]. The operation was performed to obtain CEA measurement reagents [3] and [4] having a solid content of 0.17% (W / V) and stored at 4 ° C.
[0061]
(2) Measurement of CEA amount
Equal amounts of CEA measurement reagents [3] and [4] having a solid content of 0.17% (W / V) obtained in (1) above were mixed, and the resulting mixture was used as a reagent (R2 solution). Except for this point, the same operation as in Example 1 was performed to measure the CEA amount.
[0062]
Comparative Example 3(Measurement of CEA amount using latex agglutination immunoreagent of the same average particle size)
Example 2 except that the CEA measurement reagent [3] (latex agglutination immunoreagent (solid content 0.17% (W / V)) obtained in Example 2 was used as the reagent (R2 solution) as it was. The same operation was performed.
[0063]
Comparative Example 4(Measurement of CEA amount using latex agglutination immunoreagent of the same average particle size)
Example 2 except that the CEA measurement reagent [4] (latex agglutination immunoreagent (solid content 0.17% (W / V)) obtained in Example 2 was used as the reagent (R2 solution) as it was. The same operation was performed.
[0064]
Test results
The changes in absorbance measured in Example 2 and Comparative Examples 3 and 4 and the prepared calibration curves are shown in Table 2 and FIG.
[0065]
[Table 2]

[0066]
As is clear from Table 2 and FIG. 2, the calibration curve created from the measured values of Example 2 according to the method of the present invention is good linearity from the CEA low concentration region to the high concentration region as in Example 1. showed that. On the other hand, the calibration curves of Comparative Examples 3 and 4 with the latex agglutination immunoreagent having the same average particle size are less reactive than the method according to the present invention in the CEA low concentration region and the high concentration region, and therefore, good linearity is obtained. Did not show.
[0067]
Example 3
The CEA measurement reagent [1] obtained in Example 1 and the CEA measurement reagent [4] obtained in Example 2 were mixed in equal amounts, and the resulting mixture was used as a reagent (R2 solution). Except for this point, the same operation as in Example 1 was performed to measure the CEA amount.
[0068]
Example 4
The CEA measurement reagent [2] obtained in Example 1 and the CEA measurement reagent [3] obtained in Example 2 were mixed in equal amounts, and the resulting mixture was used as a reagent (R2 solution). Except for this point, the same operation as in Example 1 was performed to measure the CEA amount.
[0069]
Test results
Table 3 and FIG. 3 show the change in absorbance measured in Examples 3 and 4 and the prepared calibration curve.
[0070]
[Table 3]

[0071]
As is clear from Table 3 and FIG. 3, the calibration curve created from the measured values of Examples 3 and 4 according to the method of the present invention is a good straight line from the CEA low concentration range to the high concentration range as in Example 1. Showed sex.
[0072]
Example 5
(1) Preparation of CEA measurement reagent
As an insoluble carrier solution, polystyrene latex having an average particle size of 0.210 μm is used, and as a sensitive antibody solution,AntiThe CEA antibody Clone No. CEA4-G67 was diluted with an antibody dilution buffer so that the protein concentration was 27.6 μg / ml, and in other cases, the CEA measurement reagent [1] of Example 1 was used. The CEA measurement reagent [5] having a solid content of 0.17% (W / V) was obtained in the same manner as described above, and stored at 4 ° C.
[0073]
(2) Measurement of CEA amount
The CEA measurement reagent [5] having a solid content of 0.17% (W / V) obtained in (1) above and the CEA measurement reagent [2] obtained in Example 1 were mixed in an equal amount, The amount of CEA was measured by performing the same operation as in Example 1 except that the obtained mixed solution was used as a reagent (R2 solution).
[0074]
Comparative Example 5(Measurement of CEA amount using latex agglutination immunoreagent of the same average particle size)
(1) Preparation of CEA measurement reagent
As an insoluble carrier liquid, polystyrene latex having an average particle diameter of 0.464 μm is used, and as a sensitive antibody liquid,AntiUsing the CEA antibody Clone No. CEA4-G67 diluted with an antibody dilution buffer so that the protein concentration becomes 12.5 μg / ml, the same procedure as in the case of the CEA measurement reagent [1] is used in other respects. To obtain a CEA measurement reagent [6] having a solid content of 0.17% (W / V) and stored at 4 ° C.
[0075]
(2) Measurement of CEA amount
The CEA measurement reagent [6] having a solid content of 0.17% (W / V) obtained in (1) above and the CEA measurement reagent [2] obtained in Example 1 were mixed in equal amounts, The amount of CEA was measured by performing the same operation as in Example 1 except that the obtained mixed solution was used as a reagent (R2 solution).
[0076]
Test results
The amount of change in absorbance measured in Example 5 and Comparative Example 5 and the prepared calibration curve are shown in Table 4 and FIG.
[0077]
[Table 4]

[0078]
As is clear from Table 4 and FIG. 3, the calibration curve created from the measured values of Example 5 according to the method of the present invention is good linearity from the CEA low concentration region to the high concentration region as in Example 1. showed that. On the other hand, the calibration curve of Comparative Example 5 using the latex agglutination immunoreagent having the same average particle diameter shows good linearity because the reactivity is lower than the method according to the present invention in the CEA low concentration region and the high concentration region. There wasn't.
[0079]
【The invention's effect】
Since the immunoassay method according to the present invention is configured as described above, there is no aggregation inhibition due to steric hindrance of the insoluble carrier as seen with conventional latex agglutination immunoreagents, and no non-specific aggregation is caused. In the antigen-antibody reaction system, as many antigens or antibodies involved in the reaction as possible can be present. As a result, the antigenic substance can be accurately quantified, and high detection sensitivity can be exhibited even in a low concentration range. In particular, when the epitopes of antigens recognized by two or more monoclonal antibodies are structurally close to each other, or when the molecular weight of the antigen substance is small and an insoluble carrier having the same average particle size is difficult to cause an agglutination reaction, The effect is demonstrated. Therefore, the measurement method according to the present invention makes it possible to accurately quantify an antigenic substance in a test sample, and is useful for finding a disease, grasping a disease state, determining a treatment method, and the like.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows the correlation between the amount of CEA in a CEA standard product having a known concentration used in Example 1 and the change in absorbance by the CEA measurement method of the present invention, and the CEA having a known concentration used in Comparative Examples 1 and 2; It is a graph which shows the correlation of the amount of CEA in a standard product, and the light absorbency change amount by the latex aggregation immunoreagent by a conventional method.
FIG. 2 shows the correlation between the amount of CEA in a CEA standard product having a known concentration used in Example 2 and the amount of change in absorbance according to the CEA measurement method of the present invention, and the CEA having a known concentration used in Comparative Examples 3 and 4; It is a graph which shows the correlation of the amount of CEA in a standard product, and the light absorbency change amount by the latex agglutination immunoreagent by a conventional method.
FIG. 3 shows the correlation between the amount of CEA in CEA standard products of known concentrations used in Examples 3, 4 and 5 and the amount of change in absorbance according to the CEA measurement method of the present invention, and the known concentrations used in Comparative Example 5. 2 is a graph showing the correlation between the amount of CEA in the CEA standard product and the amount of change in absorbance by the latex agglutination immunoreagent according to the conventional method.

Claims

Two or more monoclonal antibodies against different specific antigens are carried on an insoluble carrier, in aqueous solvent is reacted with the antigen, when selectively agglutinate binding insoluble carrier and antigen, an average particle diameter as an insoluble carrier 0 A highly sensitive immunoassay characterized by using two or more kinds of carriers having a mean particle diameter of 0.05 to 0.500 μm and carrying each monoclonal antibody on these insoluble carriers.

2. The measuring method according to claim 1, wherein the insoluble carrier is latex particles.

Two or more insoluble carriers having an average particle size in the range of 0.05 to 0.500 μm so that the ratio of the average particle size of other particle types to the average particle size of the minimum particle type is in the range of 3 to 6 The measurement method according to claim 1, wherein the measurement method is used in combination.