JP3618909B2

JP3618909B2 - Immunoassay reagents and immunoassays

Info

Publication number: JP3618909B2
Application number: JP17916196A
Authority: JP
Inventors: 元人玉木; 美枝松本
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 1996-07-09
Filing date: 1996-07-09
Publication date: 2005-02-09
Anticipated expiration: 2016-07-09
Also published as: JPH1019893A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、抗原抗体反応による凝集反応によって抗原物質を測定する免疫測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、病院や検査センター等においては、人手不足、コスト削減、あるいは多量検体処理の要請等の点から、臨床検査などの諸検査の自動化及び測定時間の短縮化が図られている。このような自動化に適した方法として、不溶性担体粒子の凝集反応を利用して抗原性物質を定性ないし定量する方法が汎用されている（例えば、特公昭５８−１１５７５号公報等）。
上記の凝集法とは、被検試料中の抗原性物質を測定する場合、抗原性物質に特異的に結合する抗体もしくはそのフラグメントを担持させた不溶性担体と試料とを反応させ、不溶性担体の凝集の度合いを測定することにより、前記抗原性物質を検出または定量するものである。
【０００３】
上記抗体としては通常ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体が選択される。しかしながら、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体を比較すると、抗原に対する特異性はモノクローナル抗体の方がだんぜん優れている。またポリクローナル抗体は動物の固体差や採血の時期により同じ品質のものを常に得ることは難しく、特異抗体に精製する段階での抗体自信の損失や活性の低下が大きいのに対し、モノクローナル抗体はその点では品質の一定した抗体の大量生産に向いている。
一方モノクローナル抗体は、抗原分子上の特定のエピトープのみと反応するため、抗原性物質が多価抗原である場合でも、特定のエピトープに関しては多価であるとは限らない。従って、抗原は、特定のモノクローナル抗体に対するエピトープに関しては一価となる可能性が高くなる。測定の目的とする抗原物質が一価抗原である場合、不溶性担体に担持された１種のモノクローナル抗体と試料中の抗原性物質が反応もしくは結合しても、通常凝集はおこらない。このため、実質的にはポリクローナル抗体が多用されている。
【０００４】
このような問題点に対し、特公平３−４０３４１号公報には、特定の抗原に対して、異なる２種又は３種のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させ、抗原と反応させて不溶性担体の凝集の程度を測定することにより、抗原性物質を検出または定量する方法が開示されている。
しかしながら、上記のような従来のモノクローナル抗体を不溶性担体に担持させる方法では、不溶性担体の立体障害により、抗体と抗原性物質との間の抗原抗体反応とそれに続く凝集が阻害される可能性がある。すなわち抗原性物質が１種類のモノクローナル抗体と、少なくとももう１種類のモノクローナル抗体とに同時に結合することによって、不溶性担体の凝集が生じるわけであるが、全てのモノクローナル抗体が不溶性担体に担持されていると、２種のモノクローナル抗体の認識する抗原のエピトープが構造的に接近した部位にある場合、不溶性担体間の立体構造により、異なる２種または３種のモノクローナル抗体が１つの抗原性物質に対し、同時に結合することが阻害される場合がある。また、この方法では、不溶性担体に担持させうる抗体量に限界があり、不溶性担体への担持が困難なモノクローナル抗体もある。さらにモノクローナル抗体の性状によっては、不溶性担体に担持させた場合、自己凝集が生じて試薬としての性能を発揮できない場合がある。従って、上記の方法では抗原性物質を正確に定量できない可能性がある。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記問題点を解決するものであり、その目的とするところは、不溶性担体の立体障害による凝集阻害がなく、多量の抗体を用いることができ、その結果、正確な測定値を得ることのできる免疫測定試薬及び免疫測定法を提供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
本発明の免疫測定試薬は、特定の抗原物質に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体と水不溶性担体とからなり、上記特定の抗原物質に対するモノクローナル抗体の一部が水不溶性担体に担持される。
上記特定のモノクローナル抗体の水不溶性担体に担持されない抗体は、抗原抗体反応に伴う凝集反応において、水不溶性担体と立体障害をおこさない状態とされていればよく、例えば、水可溶性担体に担持されるか又は２以上の多量体とされるのが好ましい。
【０００７】
この時、水不溶性担体に担持されるモノクローナル抗体と、水可溶性担体に担持されるあるいは多量体とされるモノクローナル抗体は、特定の抗原物質に対する異なるモノクローナル抗体である。少なくとも１種の異なるモノクローナル抗体が担持あるいは多量体とされていれば、例えば、水不溶性担体に２種、水可溶性担体に別の１種が担持されていてもよい。
また、特定の抗原物質に対する異なる２種以上のモノクローナル抗体の混合物の、一部が水不溶性担体に担持され、一部が水可溶性担体に担持されるかあるいは２以上の多量体とされていてもよく、１種のモノクローナル抗体が水不溶性担体に担持され、異なる２種以上のモノクローナル抗体の混合物が水可溶性担体に担持されるかあるいは２以上の多量体とされていてもよい。
【０００８】
上記モノクローナル抗体の水不溶性担体に担持される量は、少なくなると凝集はしても凝集の程度を測定するのが困難となり、多くなると立体障害による凝集反応阻害が起こりやすくなるので、モノクローナル抗体全体の３０〜８０％が好ましい。
【０００９】
上記モノクローナル抗体としては、細胞融合技術分野において、公知の手法を適宜選択し、またはそれらを組み合わせることによりモノクローナル抗体産生融合細胞株を形成し、この細胞株を利用して産生、取得したものを用いることができる（「単クローン抗体・ハイブリドーマとＥＬＩＳＡ」，岩崎辰夫ら著；講談社）。
【００１０】
その一態様としては、ある特定の完全抗原を用いて、これを適当な動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ウシ等の動物に、例えば、アジュバントとともに皮下注射するなどの手法により投与し、動物を免疫した後、この免疫動物、例えば免疫マウスの上記抗原に対する抗体産生細胞、例えば脾細胞、胸腺細胞、リンパ節細胞及び／又は末梢血細胞等の細胞を採取し、これらの細胞と自己増殖能を有するが実質的に抗体産生能を有しない適当な株化細胞（ミエローマ細胞）、例えばマウス骨髄腫株化細胞とを、公知の手法により細胞融合処理する。
モノクローナル抗体を得るための抗体産生細胞とミエローマ細胞との組み合わせは、各細胞が融合して増殖しつつ抗体を産生することが可能であれば、それぞれの細胞の由来する動物の種類は限定されず、任意に組み合わせることができる。
【００１１】
上記ミエローマ細胞としては、特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヒト等の種々の動物の細胞体を用いることができる。好ましくは、株化細胞は薬剤抵抗性のものであり、かつ未融合のミエローマ細胞が選択培地で生存せず、融合細胞のみが生存するようなものである。
一般には、８−アザグアニジン抵抗性の株化細胞が用いられ、これはヒポキサンチン・グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミンプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できない性質を有する。
さらに、株化細胞としては非分泌型のものが好ましく、例えば、マウスミエローマＭＯＰＣ−２１株由来のＰ_３／Ｘ６３−Ａｇ８Ｕ_１（Ｐ_３Ｕ_１）、Ｐ_３／Ｘ６３−Ａｇ８・６・５・３、Ｐ_３／ＮＳＩ−１−Ａｇ４−１、Ｓｐ２／Ｏ−Ａｇ１４、ラットミエローマ２１０・ＲＣＹ３・Ａｇ１・２・３等が挙げられる。
【００１２】
上記細胞融合処理は、例えば、イーグル最小基本（ＭＥＭ）培地、ＲＰＭＩ−１６４０培地等の培地中で、上記免疫マウスの脾細胞１〜５×１０^８個と、上記マウス骨髄腫株化細胞１〜５×１０^７個とを混合して行うことができる。融合促進剤としては、平均分子量１０００〜６０００のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、ウイルス等が挙げられ、特にＰＥＧが好ましく、ＰＥＧは約３０〜５０重量％で用いられる。
上記のようにして得られる融合細胞含有系から、融合細胞を、公知の手法により、選別処理、抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処理して、免疫マウスの形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体産生能を有し、かつ自己増殖能をもつ融合細胞株を得ることができる。
【００１３】
上記融合細胞の選別処理は、例えば、２０重量％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地等で細胞融合を終えた細胞を適当に希釈し、９６穴マイクロプレートに１０^５〜１０^６個／ウェル程度に分注し、各ウェルに選択培地（ＨＡＴ培地等）を加え、以後選択培地の交換を行いながら、５％ＣＯ_２培養器（３７℃）で培養を続けることにより行うことができる。ミエローマ細胞として８−アザグアニン抵抗性株を用いれば、未融合のミエローマ細胞はＨＡＴ培地で死滅し、また抗体産生細胞は正常細胞なので、ｉｎｖｉｔｒｏ培養では長期間生育できない。従って、培養後１０〜１４日ぐらいから生育してくる細胞を融合細胞として選別できる。
【００１４】
上記のようにして得られる融合細胞株の抗体活性スクリーニング処理及びクローニング処理は、公知の方法により行うことができる。
例えば、融合細胞の生育したウェルの培養上清の一部を採取し、一定量の標識抗原とインキュベーションし、標識抗原との結合能を測定することにより目的とする抗体を分泌しているウェルを検索する方法が挙げられる。すなわち^１２５Ｉ、^１３１Ｉ等のラジオアイソトープ又は酵素等で標識した抗原と培養上清を反応させた後、各反応液について抗原−抗体結合物を分離し、標識量を測定することにより、目的とする抗体の存在及び結合能を検索することができる。
目的とする抗体活性の認められる各ウェル中には、２種以上の融合細胞が生育している可能性があるので、限界希釈法や軟寒天によるコロニー形成法によりクローニングを行い、モノクローナル抗体産生融合細胞株を得ることができる。
【００１５】
上記のようにして得られるモノクローナル抗体産生融合細胞株を用いて、前記免疫動物の形成に用いた完全抗原に対するモノクローナル抗体を取得する方法としては、例えば、上記モノクローナル抗体産生融合細胞株を適当な培地に培養し、培地からモノクローナル抗体を採取する方法、ミエローマ細胞由来動物と同系の動物に上記細胞株を移植し、腹水中のモノクローナル抗体を採取する方法等の公知の手法が挙げられる。
上記前者の態様としては、例えば、モノクローナル抗体産生融合細胞株を１０重量％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地等の培養液で培養し、その培養上清を硫安分画、抗原を結合させたセファロース４Ｂ等のアフィニティークロマトグラフィーなどによって精製することにより目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。
【００１６】
また、上記後者の態様としては、例えば、同系動物にプリスタン（２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカン）等の鉱物油を腹腔内投与することによりｉｎｖｉｖｏで融合細胞を大量に増殖させ、高濃度のモノクローナル抗体が含まれた腹水を得る。この腹水から硫安分画及び必要に応じて前記アフィニティークロマトグラフィー等により、目的とするモノクローナル抗体を得ることができる。
本発明のモノクローナル抗体として、上述のようにして取得できるもの以外に市販のものを用いることも可能である。
【００１７】
前記水不溶性担体としては、従来より免疫化学的凝集反応及び凝集阻止反応において、一般的に用いられている微粒子の担体を用いることができるが、工業的に大量生産が可能な有機系微粒子が好ましい。
上記有機系微粒子としては、例えば、スチレン、塩化ビニル、アクリロニトリル、酢酸ビニル、アクリル酸エステル、メタクリル酸エステル等のビニル系モノマーの単一重合体及び／又は共重合体；スチレン−ブタジエン共重合体、メタクリル酸メチル−ブタジエン共重合体等のブタジエン系共重合体；並びに官能基としてカルボキシル基、第１級アミノ基、カルボアミノ基（−ＣＯＮＨ_２）、水酸基、アルデヒド基等を有し、かつ基体が前記有機系微粒子からなる反応性有機系微粒子などが挙げられ、抗体の吸着性に優れ、生物学的活性を長期間安定に保持できる等の理由から、特にスチレンを主成分とするポリスチレン系のラテックス粒子が好ましい。
【００１８】
その他、動物の赤血球、細菌の細胞等の生物学的粒子；ベントナイト、コロジオン、コレステロール結晶、シリカ、カオリン、炭素末等の非生物学的粒子なども用いることができる。
上記水不溶性担体の平均粒径は、測定方法、測定機器によって異なるが、０．０５〜１．０μｍのものが通常用いられる。
【００１９】
上記水不溶性担体にモノクローナル抗体を担持させる方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、水不溶性担体に物理的に吸着させる方法、官能基を有する水不溶性担体表面に、公知の化学結合法や共有結合法により担持させる方法等が挙げられる。
【００２０】
前記水可溶性担体としては、モノクローナル抗体を２以上担持でき、かつ水可溶性であれば特に限定されない。例えば、二塩酸スベリミジン酸ジメチル、アルキルジイミデート等のビスイミドエステル類；アシルアジド類；イソシアネート類；グルタルアルデヒド等のジアルデヒド類；メルカプトアルキルイミデート類；イミノチオ等のチオール化試薬；ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）；ＭＢＳ（ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）；ＧＭＢＳ（Ｎ−（γ−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド）；ＥＭＣＳ（Ｎ−（ε−マレイミドヘキサノイルオキシ）スクシンイミド）；ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）；ニトレン類；アリールハライド類；スルホニルハライド類；ブロモシアン；過ヨウ素酸塩等の低分子化合物などのタンパク質の架橋剤が挙げられ、なかでも二塩酸スベリミジン酸ジメチルが好ましい。
その他、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシエチルセルロース等のセルロース誘導体；ポリビニルアルコール等の水溶性高分子化合物などが挙げられる。
【００２１】
上記水可溶性担体にモノクローナル抗体を担持させる方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、公知の化学結合法や共有結合法により担持させる方法、水可溶性担体に物理的に吸着させる方法、アビジン−ビオチン等の親和性をもつ物質を用いて担持させる方法等が挙げられる。
【００２２】
前記モノクローナル抗体を２以上の多量体にする方法としては、公知の方法を用いることができ、例えば、抗体濃度５〜３０ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７〜１０の抗体希釈液を加熱し、熱変性により抗原認識部位に関与しないＦｃ部位で抗体どうしを結合させる方法等が挙げられる。
上記加熱処理は、温度が高かったり時間が長くなると抗体が変性するため、４０〜８０℃で６０分以内が好ましく、より好ましくは５０〜７５℃で３０分以内である。
【００２３】
本発明の免疫測定法は、上記本発明の免疫測定試薬と、上記特定の抗原物質とを反応させ、凝集の度合いにより上記特定の抗原物質を測定する方法である。
【００２４】
上記抗体が担持された水不溶性担体、及び抗体が担持された水可溶性担体又は少なくとも２以上の抗体の多量体と、特定の抗原物質との反応は、抗原抗体反応及びそれに伴う凝集反応である。反応条件は、上記反応が起こりうるものであれば特に限定されないが、反応温度は恒温で２５〜３７℃の範囲内で行うのが好ましい。反応時間は５秒〜１５分が好ましい。
上記反応を行う際の反応液としては、抗原抗体反応が起こりうる生理的条件を満たす水溶液であれば特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。反応液のｐＨは、５．５〜８．５が好ましく、さらに好ましくは６．５〜８．０である。
【００２５】
上記反応液には、更に必要に応じて、牛血清アルブミン、ショ糖等の安定化剤、感度を高める効果が期待されるポリエチレングリコール、デキストラン等の水溶性多糖類、アジ化ナトリウム等の防腐剤、塩化ナトリウム等の塩濃度調整剤などを添加してもよい。
【００２６】
本発明の方法において、測定対象となる試料としては、抗原、抗体等の免疫学的に活性な抗原物質を含有する試料、特に生体試料である。生体試料としては、例えば、血液、胸水、腹水、リンパ液等の体液、尿、便、汗等の排泄物、及び組織の抽出物などが挙げられる。
【００２７】
上記特定の抗原物質としては、抗原抗体反応しうる抗原、抗体等の免疫学的に活性なあらゆる物質、すなわち従来測定されていた物質のいずれもが包含され、例えばタンパク質、ポリペプチド、多糖類、脂質、ステロイド等が挙げられる。上記タンパク質としては、例えば、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、フィブリノーゲン分解産物（ＦＤＰ）、Ｃ反応性タンパク（ＣＲＰ）、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）等の血液中タンパク質、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）等の感染症に対する抗原及びその抗体、レセプター、酵素などが挙げられる。
【００２８】
前記凝集の度合いを測定する方法としては、特に限定されないが、例えば、凝集を定性的又は半定量的に測定する場合には、既知の試料の濁度の程度との比較から、測定すべき試料の濁度の程度を目視により観察する方法を用いることができ、定量的に測定する場合には、簡便性及び精度の点から、上記濁度の程度を光学的に測定する方法が好ましい。
【００２９】
上記目視により観察する方法としては、、試料と抗体が担持された水不溶性担体及び抗体が担持された水可溶性担体（又は多量体）を含む溶液を判定板上で混合し、揺り動かした後、凝集の有無を判定する。判定には、単に肉眼で判定する以外に、ビデオカメラで撮影し画像処理を施すことによって判定することもできる。
【００３０】
上記光学的に測定する方法としては、公知の方法が用いられ、例えば、凝集塊の形成を濁度の増加としてとらえる比濁法、凝集塊の形成を粒度分布又は平均粒径の変化としてとらえる方法、凝集塊の形成による前方散乱光の変化を積分球を用いて測定し透過光強度との比を比較する積分球濁度法等が挙げられる。
上記の測定法において、異なる時点で少なくとも２つの測定値を得、これらの時点間における測定値の増加分（すなわち増加速度）に基づき凝集の程度を求める速度試験（レートアッセイ）、及びある時点（通常は反応の終点と考えられる時点）で１つの測定値を得、この測定値に基づき凝集の程度を求める終点試験（エンドポイントアッセイ）を利用でき、測定の簡便性、迅速性の点から比濁法による速度試験を行うことが好ましい。
【００３１】
【作用】
上述のように、本発明によれば、特定の抗原物質に対する２種以上のモノクローナル抗体の一部が水不溶性担体に担持され、例えば、残りの一部が水可溶性担体に担持されるか又は２以上の多量体とされていることにより、凝集反応の際に水不溶性担体の立体障害による凝集反応阻害が抑えられるので、特定の抗原物質との結合物を選択的に凝集させることができ、高感度に抗原物質量を測定することができる。
【００３２】
【実施例】
本発明を実施例につき説明する。実施例及び比較例に用いた試薬は以下のとおりである。
〔抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体〕
マウスの培養細胞上清からプロテインＡにより精製した、エピトープの異なる２種のマウス抗ヒトＡＦＰモノクローナル抗体、クローンＮｏ．ＡＦＰ４−Ｆ１１（ＩｇＧ−１、以下抗体Ｉとする）、及びクローンＮｏ．ＡＦＰ４−Ｆ６７（ＩｇＧ−１、以下抗体ＩＩとする）を用いた（共にＤＡＣＯ社製）。
〔抗体架橋反応用緩衝液〕
２００ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４と２００ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４をｐＨ８となるように混合して用いた。
〔ラテックス希釈用緩衝液、抗体希釈用緩衝液〕
５０ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４と５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４をｐＨ７．５となるように混合して用いた。
〔ブロッキング用緩衝液〕
１００ｍＭＮａ_２ＨＰＯ_４と１００ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４をｐＨ７．４となるように混合し、さらにウシ血清アルブミン（フラクションＶ、ＲｅａｇｅｎｔＧｒａｄｅ、ＭｉｌｅｓＣｏｒｐ．社製）を１％（Ｗ／Ｖ）になるように、またＮａＮ_３（試薬特級、ナカライテスク社製）を０．１％（Ｗ／Ｖ）になるように添加し溶解させたものを用いた。
〔検体希釈液〕
上記ブロッキング用緩衝液に、ポリエチレングリコール６０００（平均分子量７５００、和光純薬社製）を３％（Ｗ／Ｖ）となるように溶解して用いた。
【００３３】
（実施例１）
１）水可溶性担体試薬▲１▼の調製
抗体Ｉを、抗体架橋反応用緩衝液１５００ｍｌで透析した後、タンパク濃度が５ｍｇ／ｍｌとなるように抗体架橋反応用緩衝液で希釈し、抗体液とした。
また、二塩化スベリミジン酸ジメチル（東京化成社製）１１．４ｍｇを上記抗体架橋反応用緩衝液５ｍｌに溶解し、抗体架橋剤を調製した。
上記抗体液１ｍｌを２５℃のインキュベーター中でマグネチックスターラーで攪拌しながら、上記抗体架橋剤１μｌを２分おきに計５回添加し、その後さらに１０分間攪拌した。
次いで、酢酸アンモニウム（試薬特級、和光純薬社製）７．７ｍｇを上記抗体架橋反応用緩衝液５００μｌに溶解して調製した抗体架橋反応停止剤５μｌを添加し、この粗生成物を０．１５ＭＮａＣｌを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ＨＲ１０／３０（ゲル濾過カラム、ファルマシア社製）に供し、同緩衝液で０．５ｍｌ／分で溶出させ、分子量２５００００〜５０００００の画分を分取した。最終タンパク濃度が４０μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、水可溶性担体試薬▲１▼を調製した。
【００３４】
２）ＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製
平均粒径０．３０４μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０％（ｗ／ｖ）、積水化学工業社製）１容に、上記ラテックス希釈用緩衝液９容を添加希釈し、ラテックス液とした。
抗体ＩＩは、タンパク濃度が６６．７μｇ／ｍｌとなるように上記抗体希釈用緩衝液で希釈し、感作抗体液とした。
上記ラテックス液６００μｌを２５℃のインキュベーター中で、マグネチックスターラーで攪拌しながら、上記感作抗体液１２００μｌを素早く添加し、さらに１時間攪拌した。次いでブロッキング用緩衝液３ｍｌを添加し、２５℃で続けて２時間攪拌した。その後１５℃、１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し沈殿を得た。この沈殿にブロッキング用緩衝液４ｍｌを添加し、同様に遠心分離して沈殿を洗浄した。この洗浄操作をさらに２回行った後、ブロッキング用緩衝液１．８ｍｌを添加し、よく攪拌し、超音波破砕機で分散処理を行った。
この分散液に上記水可溶性担体試薬▲１▼１．８ｍｌを添加し、固形分０．１７％（ｗ／ｖ）のＡＦＰ測定試薬▲１▼を調製した。この試薬は４℃で保存した。
【００３５】
３）ＡＦＰ量の測定
ヒトプール血清から精製されたＡＦＰ標準品（ＷＨＯ標準品、９０８９０Ｉ．Ｕ．／ｍｌ、１１０μｇ／ｍｌ、ＤＡＣＯ社製）を用い、生理食塩水で２０００、５００、１００、２０、１０、５ｎｇ／ｍｌにそれぞれ希釈し、各濃度のＡＦＰ標準品を調製した。また、ＡＦＰ標準品を含まない生理食塩水のみのものを０ｎｇ／ｍｌとした。
測定は、各ＡＦＰ標準品２０μｌを分注後、直ちに上記検体希釈液２１０μｌを添加混合し、次いで上記ＡＦＰ測定試薬▲１▼３０μｌの添加混合を行った。
生化学用自動分析装置（日立７１５０型、日立製作所社製）を使用し、測定条件は温度３７℃、波長５７０ｎｍとした。
反応量は、ＡＦＰ測定試薬添加後８０秒後の吸光度と３２０秒後の吸光度を測定し、その差を１００００倍したものを吸光度変化量とし、各ＡＦＰ標準品の抗体濃度と吸光度変化量の検量線を作成した。結果を表２及び図１に示す。
【００３６】
（比較例１）
１）ＡＦＰ測定試薬▲２▼の調製
上記実施例１のＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製において、分散液に水可溶性担体試薬▲１▼を添加するかわりに、ブロッキング用緩衝液１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲２▼を調製した。
２）ＡＦＰ測定試薬▲３▼の調製
上記ＡＦＰ測定試薬▲２▼の調製において、抗体として抗体Ｉを用いて感作抗体液としたこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲３▼を調製した。
３）ラテックス凝集免疫試薬の調製
上記ＡＦＰ測定試薬▲２▼とＡＦＰ測定試薬▲３▼を等量混合し、固形分０．１７％（ｗ／ｖ）のラテックス凝集免疫試薬を調製した。この試薬は４℃で保存した。
４）ＡＦＰ量の測定
上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試薬▲１▼のかわりに、上記ラテックス凝集免疫試薬を用いたこと以外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成した。結果を表２及び図１に示す。
【００３７】
（実施例２）
１）抗体多量体▲１▼の調製
抗体Ｉの１ｍｌを、抗体架橋反応用緩衝液１５００ｍｌで透析した後、タンパク濃度が５ｍｇ／ｍｌになるように抗体架橋反応用緩衝液で希釈した。この抗体液１ｍｌを５６℃のインキュベーター中で３０分間加熱した後、氷冷した。この後タンパク濃度が４０μｇ／ｍｌになるように抗体希釈用緩衝液で希釈し、抗体多量体▲１▼を調製した。
【００３８】
２）ＡＦＰ測定試薬▲４▼の調製
上記実施例１のＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製において、分散液に水可溶性担体試薬▲１▼を添加するかわりに、上記抗体多量体▲１▼１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲４▼を調製した。この試薬は４℃で保存した。
３）ＡＦＰ量の測定
上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試薬▲１▼のかわりに、上記ＡＦＰ測定試薬▲４▼を用いたこと以外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成した。結果を表２及び図２に示す。
【００３９】
（実施例３）
１）水可溶性担体試薬▲２▼の調製
抗体Ｉ及びＩＩを、同じ濃度で等量混合し、抗ＡＦＰ抗体混合液とした。
上記実施例１の水可溶性担体試薬▲１▼の調製において、抗体Ｉのかわりに、上記抗ＡＦＰ抗体混合液を用いたこと以外は同様にして、水可溶性担体試薬▲２▼を調製した。
２）ＡＦＰ測定試薬▲５▼の調製
上記実施例１のＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製において、抗体ＩＩのかわりに上記抗ＡＦＰ抗体混合液を用い、分散液に水可溶性担体試薬▲１▼を添加するかわりに上記水可溶性担体試薬▲２▼１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲５▼を調製した。この試薬は４℃で保存した。
３）ＡＦＰ量の測定
上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試薬▲１▼のかわりに、上記ＡＦＰ測定試薬▲５▼を用いたこと以外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成した。結果を表２及び図３に示す。
【００４０】
（実施例４）
１）抗体多量体▲２▼の調製
上記実施例２の抗体多量体▲１▼の調製において、抗体Ｉのかわりに、上記実施例３で調製した抗ＡＦＰ抗体混合液を用いたこと以外は同様にして、抗体多量体▲２▼を調製した。
２）ＡＦＰ測定試薬▲６▼の調製
上記実施例１のＡＦＰ測定試薬▲１▼の調製において、抗体ＩＩのかわりに上記抗ＡＦＰ抗体混合液を用い、分散液に水可溶性担体試薬▲１▼を添加するかわりに上記抗体多量体▲２▼１．８ｍｌを添加したこと以外は同様にして、ＡＦＰ測定試薬▲６▼を調製した。この試薬は４℃で保存した。
３）ＡＦＰ量の測定
上記実施例１のＡＦＰ量の測定において、ＡＦＰ測定試薬▲１▼のかわりに、上記ＡＦＰ測定試薬▲６▼を用いたこと以外は同様にして、ＡＦＰ量を測定し、検量線を作成した。結果を表２及び図４に示す。
【００４１】
なお、各実施例及び比較例で用いたＡＦＰ測定試薬の、担体と抗体の種類の構成を表１に示す。
【００４２】
【表１】

【００４３】
【表２】

【００４４】
表２及び図１〜４より、実施例の本発明の試薬によって作成された検量線は、ＡＦＰ低濃度域から高濃度域まで良好な直線性を示したが、比較例１の従来法によるラテックス凝集免疫試薬による検量線は、低濃度域及び高濃度域において良好な直線性を示さなかった。
これは、本発明の特定の抗原物質に対する異なる２種のモノクローナル抗体を、１種は水不溶性担体に、もう１種は水可溶性担体に担持させるか又は多量体として反応させたため、２種のモノクローナル抗体をそれぞれ水不溶性担体に担持させて反応させた場合（比較例１）と比べて、水不溶性担体の立体障害がないためと考えられる。また、低濃度域での感度も高く、モノクローナル抗体の生理活性もより高く保持されていると考えられる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明の免疫測定試薬及び免疫測定方法は上述のとおりであるので、従来のラテックス凝集免疫試薬でみられたような水不溶性担体の立体障害による凝集阻害がなく、かつより多くの抗体を用いることができ、その結果、低濃度域でも高い検出感度を示す。
従って、被検試料中の抗原物質を正確に定量することが可能となり、疾患の発見、病態の把握、治療方法の決定等に有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１の免疫測定試薬と比較例１の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図２】実施例２の免疫測定試薬と比較例１の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図３】実施例３の免疫測定試薬と比較例１の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。
【図４】実施例４の免疫測定試薬と比較例１の従来法のラテックス凝集免疫試薬で、既知濃度のＡＦＰ標準品を測定したときのＡＦＰ量と吸光度変化量の相関を示すグラフである。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to an immunoassay method for measuring an antigen substance by an agglutination reaction by an antigen-antibody reaction.
[0002]
[Prior art]
In recent years, in laboratories, laboratories and the like, automation of various examinations such as clinical examinations and shortening of measurement time have been attempted from the viewpoint of labor shortage, cost reduction, or a request for processing a large amount of samples. As a method suitable for such automation, a method for qualitatively or quantitatively determining an antigenic substance using an agglutination reaction of insoluble carrier particles is widely used (for example, Japanese Patent Publication No. 58-11575).
The agglutination method described above means that when measuring an antigenic substance in a test sample, the sample is reacted with an insoluble carrier carrying an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the antigenic substance to aggregate the insoluble carrier. The antigenic substance is detected or quantified by measuring the degree of.
[0003]
As the above antibody, a polyclonal antibody or a monoclonal antibody is usually selected. However, comparing polyclonal and monoclonal antibodies, the monoclonal antibodies are more and more specific for the antigen. In addition, it is difficult to always obtain polyclonal antibodies of the same quality due to animal differences and the time of blood collection, and there is a large loss of antibody confidence and a decrease in activity at the stage of purification to specific antibodies. It is suitable for mass production of antibodies with constant quality.
On the other hand, since a monoclonal antibody reacts only with a specific epitope on an antigen molecule, even when the antigenic substance is a multivalent antigen, the specific epitope is not always multivalent. Thus, the antigen is likely to be monovalent with respect to the epitope for a particular monoclonal antibody. When the antigenic substance to be measured is a monovalent antigen, even if one kind of monoclonal antibody supported on the insoluble carrier and the antigenic substance in the sample react or bind, usually no aggregation occurs. For this reason, polyclonal antibodies are frequently used substantially.
[0004]
In order to solve this problem, Japanese Patent Publication No. 3-40341 discloses that two or three different monoclonal antibodies are supported on an insoluble carrier for a specific antigen and reacted with the antigen to aggregate the insoluble carrier. A method for detecting or quantifying an antigenic substance by measuring the degree of the above is disclosed.
However, in the above-described method for supporting a conventional monoclonal antibody on an insoluble carrier, the steric hindrance of the insoluble carrier may inhibit the antigen-antibody reaction and subsequent aggregation between the antibody and the antigenic substance. . That is, the antigenic substance simultaneously binds to one type of monoclonal antibody and at least one other type of monoclonal antibody, causing aggregation of the insoluble carrier. However, all the monoclonal antibodies are supported on the insoluble carrier. And when the epitopes of the antigens recognized by the two monoclonal antibodies are at structurally close sites, two or three different monoclonal antibodies can be used against one antigenic substance due to the three-dimensional structure between the insoluble carriers. Simultaneous binding may be inhibited. In this method, there is a limit to the amount of antibody that can be supported on an insoluble carrier, and there are monoclonal antibodies that are difficult to support on an insoluble carrier. Furthermore, depending on the properties of the monoclonal antibody, when it is supported on an insoluble carrier, self-aggregation may occur and the performance as a reagent may not be exhibited. Therefore, there is a possibility that the antigenic substance cannot be accurately quantified by the above method.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention solves the above-mentioned problems, and the object of the present invention is that there is no aggregation inhibition due to steric hindrance of an insoluble carrier, and a large amount of antibody can be used, and as a result, an accurate measurement value is obtained. It is to provide an immunoassay reagent and immunoassay that can be used.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
The immunoassay reagent of the present invention comprises two or more different monoclonal antibodies against a specific antigen substance and a water-insoluble carrier, and a part of the monoclonal antibody against the specific antigen substance is supported on the water-insoluble carrier.
The antibody not supported on the water-insoluble carrier of the specific monoclonal antibody may be in a state that does not cause steric hindrance with the water-insoluble carrier in the aggregation reaction accompanying the antigen-antibody reaction. For example, the antibody is supported on the water-soluble carrier. Or two or more multimers.
[0007]
At this time, the monoclonal antibody carried on the water-insoluble carrier and the monoclonal antibody carried on the water-soluble carrier or made into a multimer are different monoclonal antibodies against a specific antigen substance. As long as at least one different monoclonal antibody is supported or formed into a multimer, for example, two types may be supported on a water-insoluble carrier and another type may be supported on a water-soluble carrier.
Also, a mixture of two or more different monoclonal antibodies against a specific antigen substance may be partially supported on a water-insoluble carrier and partially supported on a water-soluble carrier or may be two or more multimers. Alternatively, one type of monoclonal antibody may be carried on a water-insoluble carrier, and a mixture of two or more different monoclonal antibodies may be carried on a water-soluble carrier, or two or more multimers.
[0008]
If the amount of the monoclonal antibody supported on the water-insoluble carrier decreases, it becomes difficult to measure the degree of aggregation even if aggregation occurs. If the amount increases, inhibition of the aggregation reaction due to steric hindrance tends to occur. 30 to 80% is preferable.
[0009]
As the monoclonal antibody, in the cell fusion technology field, a known method is appropriately selected, or a combination of them is used to form a monoclonal antibody-producing fusion cell line, which is produced and obtained using this cell line. ("Monoclonal antibody hybridoma and ELISA", written by Ikuo Iwasaki et al .; Kodansha).
[0010]
In one embodiment, a specific complete antigen is used, and this is injected into an appropriate animal such as a mouse, rat, rabbit, goat, sheep, horse, cow or the like, for example, subcutaneously with an adjuvant. And immunizing the animal, and then collecting the antibody-producing cells, such as spleen cells, thymocytes, lymph node cells, and / or peripheral blood cells, of these immunized animals, eg, immunized mice, and these cells. And a suitable cell line (myeloma cell) having self-proliferation ability but substantially no antibody production ability, for example, mouse myeloma cell line, is subjected to cell fusion treatment by a known technique.
The combination of antibody-producing cells and myeloma cells to obtain monoclonal antibodies is not limited to the type of animal from which each cell is derived, as long as each cell can fuse and proliferate to produce antibodies. Can be combined arbitrarily.
[0011]
Although it does not specifically limit as said myeloma cell, For example, the cell body of various animals, such as a mouse | mouth, a rat, a rabbit, and a human, can be used. Preferably, the cell line is drug resistant and is such that unfused myeloma cells do not survive in the selective medium and only fused cells survive.
Generally, 8-azaguanidine-resistant cell lines are used, which lack the hypoxanthine / guanine / phosphoribosyltransferase and have the property that they cannot grow on hypoxanthine / aminepterin / thymidine (HAT) medium.
Further, the cell line is preferably a non-secretory cell, such as P derived from mouse myeloma MOPC-21 strain. ₃ / X63-Ag8U ₁ (P ₃ U ₁ ), P ₃ / X63-Ag8 ・ 6 ・ 5 ・ 3, P ₃ / NSI-1-Ag4-1, Sp2 / O-Ag14, rat myeloma 210, RCY3, Ag1, 2, 3 and the like.
[0012]
The cell fusion treatment is performed, for example, in a medium such as Eagle's minimal basic (MEM) medium, RPMI-1640 medium, or the like in the immunized mouse splenocytes 1 to 5 × 10 6. ⁸ And 1 to 5 x 10 mouse myeloma cell lines ⁷ It can be carried out by mixing individual pieces. Examples of the fusion promoter include polyethylene glycol (PEG) having an average molecular weight of 1000 to 6000, polyvinyl alcohol, virus and the like. PEG is particularly preferable, and PEG is used at about 30 to 50% by weight.
From the fused cell-containing system obtained as described above, the fused cells are subjected to a selection process, an antibody activity screening process and a cloning process by a known method, and the ability to produce a monoclonal antibody against the complete antigen used to form the immunized mouse is obtained. It is possible to obtain a fused cell line having self-proliferating ability.
[0013]
For the selection process of the above fused cells, for example, cells that have been fused with 20% by weight fetal bovine serum-containing RPMI-1640 medium or the like are appropriately diluted, and 10 cells are added to a 96-well microplate. ⁵ -10 ⁶ Dispense into individual wells, add selective medium (HAT medium, etc.) to each well, and then change the selective medium to 5% CO2. ₂ It can be performed by continuing the culture in an incubator (37 ° C.). If an 8-azaguanine resistant strain is used as the myeloma cell, the unfused myeloma cell is killed in the HAT medium, and the antibody-producing cell is a normal cell, so that it cannot grow for a long time in in vitro culture. Therefore, cells that grow from about 10 to 14 days after culture can be selected as fusion cells.
[0014]
The antibody activity screening process and cloning process of the fusion cell line obtained as described above can be performed by known methods.
For example, a portion of the culture supernatant of a well in which fused cells have grown is collected, incubated with a certain amount of labeled antigen, and the well that secretes the target antibody is measured by measuring the binding ability with the labeled antigen. A search method is mentioned. Ie ¹²⁵ I, ¹³¹ After reacting an antigen labeled with a radioisotope such as I or an enzyme with a culture supernatant, the antigen-antibody conjugate is separated from each reaction solution, and the amount of labeling is measured to determine the presence of the target antibody and The binding ability can be searched.
In each well in which the desired antibody activity is observed, two or more types of fused cells may be grown. Therefore, cloning is performed by limiting dilution or colony formation with soft agar to produce a monoclonal antibody. Cell lines can be obtained.
[0015]
As a method for obtaining a monoclonal antibody against the complete antigen used for the formation of the immunized animal using the monoclonal antibody-producing fused cell line obtained as described above, for example, the above-mentioned monoclonal antibody-producing fused cell line can be obtained using an appropriate medium. And a known method such as a method of collecting a monoclonal antibody from a medium, a method of transplanting the above cell line into an animal similar to a myeloma cell-derived animal, and collecting a monoclonal antibody in ascites.
As the former embodiment, for example, a monoclonal antibody-producing fusion cell line is cultured in a culture solution such as RPMI-1640 medium containing 10% by weight of fetal bovine serum, and the culture supernatant is separated from an ammonium sulfate fraction and an antigen-bound Sepharose. The target monoclonal antibody can be obtained by purification by affinity chromatography such as 4B.
[0016]
In addition, as the latter aspect, for example, by injecting a mineral oil such as pristane (2,6,10,14-tetramethylpentadecane) intraperitoneally to a syngeneic animal, the fused cells are proliferated in large quantities in vivo. Ascites fluid containing high concentrations of monoclonal antibodies is obtained. The desired monoclonal antibody can be obtained from this ascites by ammonium sulfate fractionation and, if necessary, the affinity chromatography.
As the monoclonal antibody of the present invention, commercially available antibodies can be used in addition to those obtained as described above.
[0017]
As the water-insoluble carrier, a carrier of fine particles generally used in immunochemical agglutination and agglutination inhibition reactions can be used, but organic fine particles that can be industrially mass-produced are preferable. .
Examples of the organic fine particles include homopolymers and / or copolymers of vinyl monomers such as styrene, vinyl chloride, acrylonitrile, vinyl acetate, acrylic acid ester, and methacrylic acid ester; styrene-butadiene copolymer, methacrylic acid, and the like. Butadiene-based copolymers such as acid methyl-butadiene copolymer; and carboxyl groups, primary amino groups, carboamino groups (—CONH) as functional groups ₂ ), A reactive organic fine particle having a hydroxyl group, an aldehyde group, etc., and the substrate is composed of the organic fine particles, and the like. For this reason, polystyrene latex particles containing styrene as a main component are particularly preferred.
[0018]
In addition, biological particles such as animal red blood cells and bacterial cells; non-biological particles such as bentonite, collodion, cholesterol crystals, silica, kaolin, and carbon powder can also be used.
The average particle size of the water-insoluble carrier varies depending on the measuring method and measuring instrument, but 0.05 to 1.0 μm is usually used.
[0019]
As a method for supporting the monoclonal antibody on the water-insoluble carrier, a known method can be used. For example, a method of physically adsorbing the water-insoluble carrier, a known chemical bond on the surface of the water-insoluble carrier having a functional group. And a method of supporting by a covalent bond method.
[0020]
The water-soluble carrier is not particularly limited as long as it can carry two or more monoclonal antibodies and is water-soluble. For example, bisimide esters such as dimethyl suberimidate dihydrochloride and alkyldiimidate; acyl azides; isocyanates; dialdehydes such as glutaraldehyde; mercaptoalkylimidates; thiolation reagents such as iminothio; SPDP (N- Succiniimidyl-3- (2-pyridyldithio) propionate); MBS (m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide); GMBS (N- (γ-maleimidobutyryloxy) succinimide); EMCS (N- (ε -Maleimidohexanoyloxy) succinimide); EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide); nitrenes; aryl halides; sulfonyl halides; bromocyanide; low molecular weight compounds such as periodate of Examples thereof include protein cross-linking agents, and among them, dimethyl suberimidate dihydrochloride is preferable.
Other examples include cellulose derivatives such as methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose, and hydroxyethylcellulose; water-soluble polymer compounds such as polyvinyl alcohol.
[0021]
As a method of supporting the monoclonal antibody on the water-soluble carrier, a known method can be used, for example, a method of supporting by a known chemical bond method or a covalent bond method, a method of physically adsorbing to a water-soluble carrier, Examples thereof include a method of supporting using a substance having affinity such as avidin-biotin.
[0022]
As a method for converting the monoclonal antibody into two or more multimers, a known method can be used. For example, an antibody dilution solution having an antibody concentration of 5 to 30 mg / ml and a pH of 7 to 10 is heated, and antigen recognition is performed by heat denaturation. Examples include a method of binding antibodies at an Fc site not involved in the site.
The temperature of the heat treatment is preferably within 60 minutes at 40 to 80 ° C., more preferably within 30 minutes at 50 to 75 ° C., because the antibody is denatured when the temperature is high or the time is long.
[0023]
The immunoassay method of the present invention is a method of reacting the immunoassay reagent of the present invention with the specific antigen substance and measuring the specific antigen substance according to the degree of aggregation.
[0024]
The reaction between the water-insoluble carrier carrying the antibody and the water-soluble carrier carrying the antibody or the multimer of at least two or more antibodies and a specific antigen substance is an antigen-antibody reaction and an agglutination reaction associated therewith. Although reaction conditions will not be specifically limited if the said reaction can occur, Reaction temperature is preferable to carry out within the range of 25-37 degreeC by constant temperature. The reaction time is preferably 5 seconds to 15 minutes.
The reaction solution for performing the above reaction is not particularly limited as long as it is an aqueous solution that satisfies physiological conditions that can cause an antigen-antibody reaction. For example, phosphate buffer, citrate buffer, glycine buffer, Tris buffer Good buffer solution and the like. The pH of the reaction solution is preferably 5.5 to 8.5, and more preferably 6.5 to 8.0.
[0025]
If necessary, the reaction solution may further contain a stabilizer such as bovine serum albumin or sucrose, a water-soluble polysaccharide such as polyethylene glycol or dextran, which is expected to increase sensitivity, or a preservative such as sodium azide. Further, a salt concentration adjusting agent such as sodium chloride may be added.
[0026]
In the method of the present invention, the sample to be measured is a sample containing an immunologically active antigenic substance such as an antigen or an antibody, particularly a biological sample. Examples of biological samples include body fluids such as blood, pleural effusion, ascites and lymph, excreta such as urine, stool, and sweat, and tissue extracts.
[0027]
Examples of the specific antigen substance include all immunologically active substances such as antigens and antibodies capable of antigen-antibody reaction, that is, conventionally measured substances, such as proteins, polypeptides, polysaccharides, Examples thereof include lipids and steroids. Examples of the protein include blood proteins such as alphafetoprotein (AFP), fibrinogen degradation product (FDP), C-reactive protein (CRP), human chorionic gonadotropin (HCG), hepatitis B virus (HB), C Examples include antigens for infectious diseases such as hepatitis B virus (HC) and human immunodeficiency virus (HIV), and antibodies, receptors and enzymes thereof.
[0028]
The method for measuring the degree of aggregation is not particularly limited. For example, in the case of measuring aggregation qualitatively or semi-quantitatively, the sample to be measured is compared with the turbidity of a known sample. A method of visually observing the degree of turbidity can be used. When quantitatively measuring, the method of optically measuring the degree of turbidity is preferable from the viewpoint of simplicity and accuracy.
[0029]
As a method of observing by visual observation, a solution containing a sample, a water-insoluble carrier carrying an antibody and a water-soluble carrier (or multimer) carrying an antibody is mixed on a judgment plate, shaken, and then aggregated. The presence or absence of is determined. The determination can be made by taking a picture with a video camera and performing image processing in addition to the determination with the naked eye.
[0030]
As the optical measurement method, a known method is used. For example, a turbidimetric method in which the formation of an aggregate is regarded as an increase in turbidity, and a method in which the formation of an aggregate is regarded as a change in particle size distribution or average particle size. Integrating sphere turbidity method that measures the change of forward scattered light due to the formation of aggregates using an integrating sphere and compares the ratio with the transmitted light intensity.
In the measurement method described above, a rate test (rate assay) that obtains at least two measurements at different time points and determines the degree of aggregation based on the increase in measurement value between these time points (ie, rate of increase), and a certain time point ( An endpoint test (endpoint assay) that obtains a single measured value at the point of time (usually considered to be the end point of the reaction) and calculates the degree of aggregation based on this measured value can be used. It is preferable to perform a speed test by the turbidity method.
[0031]
[Action]
As described above, according to the present invention, a part of two or more monoclonal antibodies against a specific antigen substance is supported on a water-insoluble carrier, for example, the remaining part is supported on a water-soluble carrier or 2 By using the above multimer, inhibition of aggregation reaction due to steric hindrance of the water-insoluble carrier can be suppressed during the aggregation reaction, so that the conjugate with a specific antigen substance can be selectively aggregated. The amount of antigenic substance can be measured with sensitivity.
[0032]
【Example】
The present invention will be described with reference to examples. The reagents used in Examples and Comparative Examples are as follows.
[Anti-human AFP monoclonal antibody]
Two mouse anti-human AFP monoclonal antibodies with different epitopes purified from protein supernatant of mouse by protein A, clone no. AFP4-F11 (IgG-1, hereinafter referred to as antibody I), and clone no. AFP4-F67 (IgG-1, hereinafter referred to as antibody II) was used (both manufactured by DACO).
[Antibody crosslinking reaction buffer]
200 mM Na ₂ HPO ₄ And 200 mM NaH ₂ PO ₄ Were mixed and used so that pH might be set to 8.
[Latex dilution buffer, antibody dilution buffer]
50 mM Na ₂ HPO ₄ And 50 mM NaH ₂ PO ₄ Were mixed and used so that pH might be 7.5.
[Blocking buffer]
100 mM Na ₂ HPO ₄ And 100 mM NaH ₂ PO ₄ And bovine serum albumin (Fraction V, Reagent Grade, manufactured by Miles Corp.) to 1% (W / V) and NaN. ₃ A reagent special grade (manufactured by Nacalai Tesque) was added and dissolved so as to be 0.1% (W / V).
[Sample diluent]
Polyethylene glycol 6000 (average molecular weight 7500, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was dissolved in the blocking buffer so as to be 3% (W / V).
[0033]
(Example 1)
1) Preparation of water-soluble carrier reagent (1)
The antibody I was dialyzed against 1500 ml of an antibody crosslinking reaction buffer, and then diluted with an antibody crosslinking reaction buffer to obtain a protein concentration of 5 mg / ml to obtain an antibody solution.
Further, 11.4 mg of dimethyl suberimidate dichloride (manufactured by Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was dissolved in 5 ml of the above-mentioned antibody crosslinking reaction buffer to prepare an antibody crosslinking agent.
While stirring 1 ml of the antibody solution with a magnetic stirrer in a 25 ° C. incubator, 1 μl of the antibody cross-linking agent was added 5 times in total every 2 minutes, and then stirred for another 10 minutes.
Subsequently, 5 μl of an antibody crosslinking reaction terminator prepared by dissolving 7.7 mg of ammonium acetate (reagent special grade, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in 500 μl of the antibody crosslinking reaction buffer was added, and this crude product was added to 0.15 M. It was applied to Superose 6 HR10 / 30 (gel filtration column, manufactured by Pharmacia) equilibrated with 50 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing NaCl, eluted at 0.5 ml / min with the same buffer, and a molecular weight of 250,000 to 500,000. Fractions were collected. A water-soluble carrier reagent (1) was prepared by diluting with an antibody dilution buffer so that the final protein concentration was 40 μg / ml.
[0034]
2) Preparation of AFP measurement reagent (1)
To 1 volume of polystyrene latex having an average particle size of 0.304 μm (solid content 10% (w / v), manufactured by Sekisui Chemical Co., Ltd.), 9 volumes of the above-mentioned latex dilution buffer solution was added and diluted to obtain a latex liquid.
Antibody II was diluted with the above antibody dilution buffer so that the protein concentration was 66.7 μg / ml to obtain a sensitized antibody solution.
While stirring 600 μl of the latex solution with a magnetic stirrer in an incubator at 25 ° C., 1200 μl of the sensitizing antibody solution was quickly added and further stirred for 1 hour. Subsequently, 3 ml of blocking buffer was added and stirred at 25 ° C. for 2 hours. Thereafter, the mixture was centrifuged at 15 ° C. and 15000 rpm for 15 minutes to obtain a precipitate. To this precipitate, 4 ml of blocking buffer was added and centrifuged in the same manner to wash the precipitate. This washing operation was further performed twice, and then 1.8 ml of a blocking buffer solution was added, stirred well, and subjected to dispersion treatment with an ultrasonic crusher.
1.8 ml of the above water-soluble carrier reagent (1) was added to this dispersion to prepare an AFP measurement reagent (1) having a solid content of 0.17% (w / v). This reagent was stored at 4 ° C.
[0035]
3) Measurement of AFP amount
Using AFP standard (WHO standard, 90890 IU / ml, 110 μg / ml, manufactured by DACO) purified from human pooled serum, 2000, 500, 100, 20, 10, 5 ng / ml with physiological saline Each diluted AFP standard was prepared at each concentration. In addition, the physiological saline only without AFP standard was 0 ng / ml.
In the measurement, 20 μl of each AFP standard was dispensed, immediately 210 μl of the sample diluent was added and mixed, and then 30 μl of the AFP measurement reagent {circle around (1)} was added and mixed.
An automatic analyzer for biochemistry (Hitachi 7150, manufactured by Hitachi, Ltd.) was used, and the measurement conditions were a temperature of 37 ° C. and a wavelength of 570 nm.
The reaction amount was determined by measuring the absorbance after 80 seconds and the absorbance after 320 seconds after the addition of the AFP measurement reagent. The difference was multiplied by 10000, and the change in absorbance was used. Created a line. The results are shown in Table 2 and FIG.
[0036]
(Comparative Example 1)
1) Preparation of AFP measurement reagent (2)
In the preparation of the AFP measurement reagent (1) of Example 1, the AFP measurement was performed in the same manner except that 1.8 ml of blocking buffer was added to the dispersion instead of adding the water-soluble carrier reagent (1). Reagent (2) was prepared.
2) Preparation of AFP measurement reagent (3)
An AFP measurement reagent (3) was prepared in the same manner as in the preparation of the AFP measurement reagent (2) except that the antibody I was used as an antibody to prepare a sensitized antibody solution.
3) Preparation of latex agglutination immunoreagent
An equal amount of the AFP measurement reagent (2) and the AFP measurement reagent (3) were mixed to prepare a latex agglutination immunoreagent having a solid content of 0.17% (w / v). This reagent was stored at 4 ° C.
4) Measurement of AFP amount
In the measurement of the amount of AFP in Example 1, the amount of AFP was measured in the same manner except that the latex agglutination immunoreagent was used instead of the AFP measurement reagent (1), and a calibration curve was prepared. The results are shown in Table 2 and FIG.
[0037]
(Example 2)
1) Preparation of antibody multimer (1)
1 ml of antibody I was dialyzed against 1500 ml of antibody crosslinking reaction buffer, and then diluted with antibody crosslinking reaction buffer so that the protein concentration became 5 mg / ml. 1 ml of this antibody solution was heated in an incubator at 56 ° C. for 30 minutes and then cooled on ice. Thereafter, the antibody was diluted with an antibody dilution buffer so that the protein concentration was 40 μg / ml to prepare an antibody multimer (1).
[0038]
2) Preparation of AFP measurement reagent (4)
In the preparation of the AFP measurement reagent (1) in Example 1, the same procedure was performed except that 1.8 ml of the antibody multimer (1) was added to the dispersion instead of adding the water-soluble carrier reagent (1). AFP measurement reagent (4) was prepared. This reagent was stored at 4 ° C.
3) Measurement of AFP amount
In the measurement of the amount of AFP in Example 1, the amount of AFP was measured in the same manner except that the AFP measurement reagent (4) was used instead of the AFP measurement reagent (1), and a calibration curve was prepared. The results are shown in Table 2 and FIG.
[0039]
(Example 3)
1) Preparation of water-soluble carrier reagent (2)
Antibodies I and II were mixed in equal amounts at the same concentration to give an anti-AFP antibody mixture.
A water-soluble carrier reagent (2) was prepared in the same manner as in the preparation of the water-soluble carrier reagent (1) of Example 1 except that the anti-AFP antibody mixture was used instead of the antibody I.
2) Preparation of AFP measurement reagent (5)
In the preparation of the AFP measurement reagent (1) in Example 1, the anti-AFP antibody mixture was used in place of antibody II, and the water-soluble carrier reagent (1) was used instead of adding the water-soluble carrier reagent (1) to the dispersion. 2) AFP measurement reagent (5) was prepared in the same manner except that 1.8 ml was added. This reagent was stored at 4 ° C.
3) Measurement of AFP amount
In the measurement of the amount of AFP in Example 1, the amount of AFP was measured in the same manner except that the above AFP measurement reagent (5) was used instead of the AFP measurement reagent (1), and a calibration curve was prepared. The results are shown in Table 2 and FIG.
[0040]
(Example 4)
1) Preparation of antibody multimer (2)
In the preparation of the antibody multimer (1) in Example 2, the antibody multimer (2) was prepared in the same manner except that the anti-AFP antibody mixture prepared in Example 3 was used instead of Antibody I. Prepared.
2) Preparation of AFP measurement reagent (6)
In the preparation of the AFP measurement reagent (1) in Example 1, the anti-AFP antibody mixture was used in place of the antibody II, and the antibody multimer (2) was used instead of adding the water-soluble carrier reagent (1) to the dispersion. A reagent for measuring AFP (6) was prepared in the same manner except that 1.8 ml was added. This reagent was stored at 4 ° C.
3) Measurement of AFP amount
In the measurement of the amount of AFP in Example 1, the amount of AFP was measured in the same manner except that the above AFP measurement reagent (6) was used instead of the AFP measurement reagent (1), and a calibration curve was prepared. The results are shown in Table 2 and FIG.
[0041]
Table 1 shows the structure of the carrier and antibody types of the AFP measurement reagents used in the examples and comparative examples.
[0042]
[Table 1]

[0043]
[Table 2]

[0044]
From Table 2 and FIGS. 1 to 4, the calibration curve prepared by the reagent of the present invention of the example showed good linearity from the AFP low concentration range to the high concentration range. The calibration curve with the agglutination immunoreagent did not show good linearity in the low concentration range and the high concentration range.
This is because two different monoclonal antibodies against a specific antigenic substance of the present invention were reacted with one kind on a water-insoluble carrier and the other on a water-soluble carrier, or reacted as a multimer. This is probably because there is no steric hindrance of the water-insoluble carrier as compared with the case where each antibody is supported on the water-insoluble carrier and reacted (Comparative Example 1). In addition, it is considered that the sensitivity in the low concentration range is high, and the biological activity of the monoclonal antibody is kept higher.
[0045]
【The invention's effect】
Since the immunoassay reagent and immunoassay method of the present invention are as described above, there is no aggregation inhibition due to the steric hindrance of the water-insoluble carrier as seen with conventional latex agglutination immunoreagents, and more antibodies are used. As a result, high detection sensitivity is exhibited even in a low concentration range.
Therefore, the antigenic substance in the test sample can be accurately quantified, which is useful for finding a disease, grasping a disease state, determining a treatment method, and the like.
[Brief description of the drawings]
1 is a graph showing the correlation between the amount of AFP and the amount of change in absorbance when an AFP standard product having a known concentration is measured using the immunoassay reagent of Example 1 and the conventional latex agglutination immunoreagent of Comparative Example 1. FIG.
2 is a graph showing the correlation between the amount of AFP and the amount of change in absorbance when an AFP standard product having a known concentration is measured using the immunoassay reagent of Example 2 and the conventional latex agglutination immunoreagent of Comparative Example 1. FIG.
3 is a graph showing the correlation between the amount of AFP and the amount of change in absorbance when an AFP standard product having a known concentration is measured using the immunoassay reagent of Example 3 and the conventional latex agglutination immunoreagent of Comparative Example 1. FIG.
4 is a graph showing the correlation between the amount of AFP and the amount of change in absorbance when an AFP standard product having a known concentration is measured with the immunoassay reagent of Example 4 and the conventional latex agglutination immunoreagent of Comparative Example 1. FIG.

Claims

An immunoassay reagent comprising two or more different monoclonal antibodies against a specific antigen substance and a water-insoluble carrier, wherein a part of the monoclonal antibody is supported on the water-insoluble carrier.

An immunoassay reagent comprising: a water-insoluble carrier on which at least one of two or more different monoclonal antibodies against a specific antigen substance is supported; and a water-soluble carrier on which at least another one is supported.

An immunoassay reagent comprising a water-insoluble carrier on which at least one of two or more different monoclonal antibodies against a specific antigen substance is supported, and at least another one or more multimers.

An immunoassay reagent comprising a mixture of two or more different monoclonal antibodies against a specific antigen substance, a partially water-insoluble carrier and a partially water-soluble carrier.

An immunoassay reagent comprising a water-insoluble carrier partially supported by a mixture of two or more different monoclonal antibodies against a specific antigen substance, and a part of two or more multimers.

The immunoassay reagent according to any one of claims 1 to 5, wherein the water-insoluble carrier is a polystyrene latex.

The immunoassay reagent according to any one of claims 1 to 6, wherein the specific antigen substance is alpha fetoprotein.

An immunoassay method comprising: reacting the immunoassay reagent according to any one of claims 1 to 7 with the specific antigen substance, and measuring the specific antigen substance according to the degree of aggregation.