JP3630344B2

JP3630344B2 - Process for producing inositol stereoisomers

Info

Publication number: JP3630344B2
Application number: JP32250595A
Authority: JP
Inventors: 健司神辺; 信吉田; 清平沢; 聖佐藤
Original assignee: Hokko Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Hokko Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1995-11-17
Filing date: 1995-11-17
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2015-11-17
Also published as: JPH09140388A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明はアグロバクテリウム属微生物を利用し、安価なミオ−イノシトール（ｍｙｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）を原料として、付加価値の高いＤ−キロ−イノシトール（Ｄ−ｃｈｉｒｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、Ｌ−キロ−イノシトール（Ｌ−ｃｈｉｒｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、シロ−イノシトール（ｓｃｙｌｌｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）、ネオ−イノシトール（ｎｅｏ−ｉｎｏｓｉｔｏｌ）（以下、これらを単に「イノシトール立体異性体」という。）等のイノシトール立体異性体を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
イノシトールの立体異性体の生理作用についてはいくつか知られている。例えば、Ｄ−キロ−イノシトールは、インシュリン非依存性糖尿病の治療薬又は予防薬として注目されている〔ダイアベイテスフロンティア（ＤｉａｂｅｔｅｓＦｒｏｎｔｉｅｒ）第４巻，第６３７頁〜第６３８頁，１９９３年〕。また、Ｌ−キロ−イノシトールは生体内における情報伝達作用に有用であることが知られている〔バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第３３巻，第８３６７頁〜第８３７４頁，１９９４年〕。さらに、シロ−イノシトールは、脳肝症患者の脳中での減少が報告され、発症との相関が注目されている〔ライフサイエンス（ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）第５４巻，第１５０７頁〜第１５１２頁，１９９４年〕。また、Ｄ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトールは研究用試薬として使用されている。
【０００３】
一方、Ｄ−キロ−イノシトールを得る方法としては次の（ａ）〜（ｇ）などが知られている。
（ａ）ブーゲンビリアやサトウマツ（Ｓｕｇａｒｐｉｎｅ）、アメリカ杉等の植物から、これに含まれているピニトール（ｐｉｎｉｔｏｌ）を適当な溶媒で抽出し、次にヨウ化水素酸等で脱メチル化してＤ−キロ−イノシトールを得る方法。
（ｂ）大豆や白つめくさ等に微量含まれているＤ−キロ−イノシトールを抽出精製する方法〔ジャーナルオブアグリカルチャーアンドフードケミストリー（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．ＦｏｏｄＣｈｅｍ．）第３２巻，第１２８９頁〜第１２９１頁，１９８４年〕。
【０００４】
（ｃ）クロレラの培養細胞を用いてミオ−イノシトールをＤ−キロ−イノシトールへ変換する方法〔モナシェフテフュールケミ−（Ｍｏｎａｔｓｈ．Ｃｈｅｍ．）第１０２巻，第４５９頁〜第４６４頁，１９７１年〕。
（ｄ）ネズミ由来の細胞を用いてミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールへ変換する方法〔ザジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）第２６７巻，第１６９０４頁〜第１６９１０頁，１９９２年〕。
【０００５】
（ｅ）カスガマイシンを強酸で加水分解して、その構成糖であるＤ−キロ−イノシトールを得る方法（米国特許第５，０９１，５９６号明細書）。
（ｆ）出発原料として１−クロロ−２，３−ジヒドロキシ−４，６−（１−クロロ−２，３−ジヒドロキシシクロヘキサ−４，６−ジエン）を用い、Ｄ−キロ−イノシトールを合成する方法〔ジャーナルオブオーガニックケミストリー（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．）第５８巻，第２３３１頁〜第２３３３頁，１９９３年〕。
（ｇ）出発原料としてハロゲノベンゼンを用い、数段階の反応を経てＤ−キロ−イノシトールを得る方法〔ジャーナルオブザケミカルソサイアティパーキントランザクションズ（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．ＰｅｒｋｉｎＴｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ１）第７４１頁〜７４３頁，１９９３年〕等がある。
【０００６】
また、Ｌ−キロ−イノシトールを得る方法としては次の（ｈ）、（ｉ）の方法が知られている。
（ｈ）天然ゴム中に含まれているケブラチトール（Ｌ−キロ−イノシトールのモノメチルエーテル体）を酸処理により脱メチル化し、Ｌ−キロ−イノシトールを得る方法。
（ｉ）微生物は特定されていないが、土壌微生物によりミオ−イノシトールからＬ−キロ−イノシトールに変換する方法〔ソイルサイエンスソサイアティーオブアメリカジャーナル（ＳｏｉｌＳｃｉ．Ｓｏｃ．ＡＭ．Ｊ．）第４１巻，第７３３〜第７３６頁，１９７７年〕。
【０００７】
さらに、シロ−イノシトールを得る方法としては次の（ｊ）、（ｋ）、（ｌ）などがある。
（ｊ）ウラジロガシ（Ｑｕｅｒｃｕｓｓｔｅｎｏｐｈｙｌｌａ）等に含まれているシロ−イノシトールを抽出精製する方法〔薬学雑誌，第８９巻，第１３０２頁〜第１３０５頁，１９６９年〕。
（ｋ）ミオ−イノシトールを原料に４段階の反応により化学合成する方法〔西ドイツ特許公開第３，４０５，６６３号公報〕。
（ｌ）ミオ−イノシトールを原料に２段階の反応により化学合成する方法〔リービッヒアナーレンデールケミー（ＬｉｅｂｉｇｓＡｎｎ．Ｃｈｅｍ．）第８６６頁〜第８６８頁，１９８５年〕。
【０００８】
また、イノシトール立体異性体が混合物として得られる方法としては次の（ｍ）、（ｎ）、（ｏ）などが知られている。
（ｍ）ミオ−イノシトールにラネイニッケルを触媒として作用させ、立体異性体のシロ−イノシトール、キロ−イノシトール、ネオ−イノシトール、ムコ−イノシトール、アロ−イノシトール、エピ−イノシトールを得る方法〔カーボハイドレイトリサーチ（ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ）第１６６巻，第１７１頁〜第１８０頁，１９８７年〕。
（ｎ）ゴキブリの脂肪体を用い、ミオ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトール、エピ−イノシトール、ネオ−イノシトールへ変換する方法〔バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）第１２巻，第４７０５頁〜第４７１２頁，１９７３年〕。
【０００９】
（ｏ）牛の脳細胞より抽出した粗酵素液を用い、ミオ−イノシトールからシロ−イノシトールおよびネオ−イノシトールへ変換する方法〔バイオケミカルアンドバイオフィジカルリサーチコミュニケーションズ（ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈＣｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）第７７巻，第３４０頁〜第３４６頁，１９７７年〕。
しかしながら、アグロバクテリウム属の微生物を用い、ミオ−イノシトールを原料とし、Ｄ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトールおよびネオ−イノシトールを製造する方法については知られていない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
前記の（ａ）から（ｏ）のイノシトール立体異性体を製造する方法は、いずれも工業的規模で製造する方法としては必ずしも満足しうるものではない。すなわち、植物からＤ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトールを抽出する前述の（ａ）、（ｂ）、（ｈ）、（ｊ）の方法は、植物体中における含有量が少ないため、抽出と精製が困難であり、収率も低い。
また、前記（ｃ）、（ｄ）、（ｊ）、（ｎ）、（ｏ）に記載のクロレラ、ネズミの細胞、土壌微生物、ゴキブリの脂肪体細胞、牛の脳細胞などを用いてＤ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトール、ネオ−イノシトール、エピ−イノシトールなどを得る方法では、放射標識した物質を検出する程度の反応であるため、収率が低い。
【００１１】
前記（ｅ）に記載のカスガマイシンを強酸で加水分解してＤ−キロ−イノシトールを得る方法では、精製工程が煩雑である。
また、前記（ｆ）、（ｇ）に記載のＤ−キロ−イノシトールを化学合成する方法は、立体特異的な合成が必要とされるため、反応収率が低い。
さらに、前記（ｋ）に記載のミオ−イノシトールからシロ−イノシトールを化学合成する方法は、操作が煩雑であり収率も低い。
また、（ｌ）に記載の方法は酸化白金を触媒として用いるので、コストの面で問題がある。
【００１２】
また、前記（ｍ）に記載のラネイニッケルを触媒として用い、シロ−イノシトール、キロ−イノシトール、ネオ−イノシトール、ムコ−イノシトール、アロ−イノシトール、エピ−イノシトールを得る方法は、１００℃で反応するため、加熱操作が必要であり副反応が伴うこと、および反応液中に多成分のイノシトールが同時に生成されるため、各成分の分離が困難であり、収率も低い。
本発明の目的は、従来法に比べて安価に、かつ簡単な操作で効率よくＤ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトールおよびネオ−イノシトールを得る製造方法を提供することにある。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するために鋭意検討を重ねた。その結果、アグロバクテリウム属に属する微生物をミオ−イノシトールを含有する培地で培養すると、培養液中にＤ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトールおよびネオ−イノシトールが効率よく生成すること、また、この培養液より得たアグロバクテリウム属に属する微生物の菌体または菌体処理物をミオ−イノシトールに作用させると、Ｄ−およびＬ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトールおよびネオ−イノシトールが簡単な操作で効率よく生成することを見いだした。
すなわち、第１の本発明の要旨とするところは、アグロバクテリウム属に属する微生物をミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、培地中にイノシトール立体異性体を生成蓄積させることを特徴とする、イノシトール立体異性体の製造方法にある。
【００１４】
また、第２の本発明の要旨とするところは、アグロバクテリウム属に属する微生物をミオ−イノシトールを含有する液体培地であらかじめ培養し、該培養液から分離した菌体を液体培地又は緩衝液中でミオ−イノシトールに作用させてイノシトール立体異性体を生成蓄積させることを特徴とする、イノシトール立体異性体の製造方法にある。
さらに、第３の本発明の要旨とするところは、アグロバクテリウム属に属する微生物をミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、該培養液から分離した菌体の菌体処理物を緩衝液中でミオ−イノシトールに作用させてイノシトール立体異性体を生成蓄積させることを特徴とする、イノシトール立体異性体の製造方法にある。
【００１５】
【発明の実施の形態】
次に、本発明によるイノシトール立体異性体の製造方法について具体的に説明する。
本発明の製造方法の原料であるミオ−イノシトールは動植物及び微生物に広く分布している。特に、穀物中に六燐酸エステルのＣａ、Ｍｇ塩であるフィチン酸として多量に存在しており、公知の方法により米糠等をアルカリ加水分解し、精製して得られる。
【００１６】
本発明において使用する微生物は、アグロバクテリウム属に属し、ミオ−イノシトールをミオ−イノシトール以外のイノシトール立体異性体に変換する能力を有する微生物であればいずれの菌株でもよい。具体的に例示すると、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）、アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）、アグロバクテリウム・ルビ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｒｕｂｉ）など（以下、特に、ことわりのないかぎり「アグロバクテリウム」という。）があり、これらはＡＴＣＣ（アメリカンタイプカルチャーコレクション）、ＩＦＯ（（財）発酵研究所）、ＩＡＭ（（財）応用微生物研究奨励会）などより入手できる。アグロバクテリウム属細菌のある菌株は、植物に根頭癌腫病や毛根病を起こすことが知られているが、同属には植物病原性がない菌株も多く、バラの根頭癌腫病に対する拮抗微生物として培養細菌が農業用に利用されている例もある。また、植物以外への病原性は知られておらず、特に、人間を含めて動物に対しては無害で安全性の高い微生物群である。
【００１７】
本発明の製造方法は３つの方法に分けることができる。それらを製造方法（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）として順次説明する。
製造方法（Ａ）
ミオ−イノシトールを含む液体培地にアグロバクテリウム属に属する微生物を接種して好気的に培養することにより、イノシトール立体異性体を生成蓄積させることができる。液体培地は、目的を達する限り何等特別の制限はなく、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよく、合成培地・天然培地のいずれも使用できる。炭素源としてはミオ−イノシトールを０．１〜１．５％、好ましくは０．２〜０．８％添加し、窒素源としては硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を０．０１〜１．０％、好ましくは０．０５〜０．５％添加するのが望ましい。有機栄養源としては酵母エキス、カザミノ酸等を極微量（０．００５〜０．０５％程度）添加すると、菌株によっては有効な場合がある。そのほか必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸等のイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することが有効である。培養液の水素イオン濃度はｐＨ６〜１０、好ましくはｐＨ７〜９に調製し培養すると、効率よくイノシトール立体異性体を得ることができる。
【００１８】
培養条件としては菌株や培地の種類によっても異なるが、培養温度は１５〜４０℃、好ましくは２０〜３５℃である。培養期間は通常１〜７日、好ましくは２〜５日である。また、培養は液体培地を振盪したり、液体培地中に空気を吹き込むなどして好気的に行えばよい。
培養液から目的物を採取する方法は、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち、培養液を活性炭やイオン交換樹脂などで処理することにより、イノシトール立体異性体以外の不純物のほとんどを除くことができる。その後、イオン交換樹脂のカラムクロマトグラフィーを用いる方法や溶液に対する溶解性の差を用いて分離する方法及び再結晶法などの方法を適宜組み合わせて用いることにより、目的物を単離することができる。
【００１９】
カラムクロマトグラフィーを用いる方法としては、カーボハイドレイトリサーチ（ＣａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅＲｅｓｅａｒｃｈ）第１６６巻，第１７１頁〜第１８０頁（１９８７年）やジャーナルオブアメリカンケミカルソサイアティー（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．）第７３巻，第２３９９頁〜第２３４０頁（１９５１年）に記載されている強塩基性イオン交換樹脂をホウ酸型にしてカラムにつめ、ホウ酸の濃度を徐々に高めて流すことにより、イノシトール立体異性体の各成分を分離する方法が有効である。このカラムを用いて、ミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトール及びネオ−イノシトールの混合物をカラムに供すると、シロ−イノシトールは樹脂に保持されることなくカラムを素通りし、他のイノシトール立体異性体は、０．５Ｍ程度のホウ酸溶液を流すと、まずミオ−イノシトールが溶出し、続いてＤ−キロ−イノシトールとＬ−キロ−イノシトールが同時に溶出し、その後ネオ−イノシトールが溶出する。また、強塩基性イオン交換樹脂を（ＯＨ⁻型）にしてカラムにつめ、イオン交換水を流して分離する方法もイノシトールの分離に有効な方法である。例えば、ミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、ネオ−イノシトール混合濃縮液を本方法のカラムに供すると、まず、ミオ−イノシトールとネオ−イノシトールがほとんど同時に溶出し、ついで、Ｄ−キロ−イノシトールとＬ−キロ−イノシトールが同時に溶出する。さらに、フルクトースとグルコースを工業的規模で分離する方法として知られている、強酸性イオン交換樹脂（カルシウム型）をカラムにつめ、水で展開して分離する方法も、前述と同様のイノシトール混合物の分離に有効である。すなわち、ミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、ネオ−イノシトール混合濃縮液をこのカラムで展開すると、ミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトールがほとんど同時に溶出し、その後遅れてネオ−イノシトールが溶出する。
このようにしてカラムクロマトグラフィーで得られる溶出液を任意に分画し、カラムクロマトグラフィーを幾度か繰り返すか、又は組み合わせることにより、純粋な物質を得ることができる。
【００２０】
一方、溶液に対する溶解度の差を利用して分離する方法としては、イノシトール立体異性体の水や低級アルコールに対する溶解性の差を利用して、分離することができる。例えば、シロ−イノシトールとネオ−イノシトールは、水に対する溶解性が他のイノシトールと比べて低いので、これらの物質が他のイノシトール立体異性体と混在している分画においては、溶解しやすいイノシトール立体異性体を最少必要量の水を加えて溶解して、溶液として除き、シロ−イノシトール又はネオ−イノシトールを固体として得ることができる。また、低級アルコールに対する溶解性の差を利用して、Ｄ−キロ−イノシトールとＬ−キロ−イノシトールの混合物を分離することができる。すなわち、Ｄ−キロ−イノシトールはＬ−キロ−イノシトールに比べてメタノールに対する溶解性が高いので、両者の混合物に適当量のメタノールを加え、Ｄ−キロ−イノシトールを溶解し、Ｌ−キロ−イノシトールを固体の状態に保ちガラスフィルターなどで濾別する。この溶解と濾別の操作を数回繰り返すことで純粋な物質を得ることができる。
【００２１】
再結晶法に関しては、イノシトールを水に溶解し、低級アルコールを任意の量を加えて混合溶媒系中で容易に結晶化することができる。生じた結晶は、ガラスフィルターや濾紙で母液より分離することができる。
菌株の種類や培養日数により、生成するイノシトール立体異性体の量及び存在比は異なるが、以上述べた分離方法を単独あるいは組み合わせて、必要に応じて繰り返し用いることにより、培養液または反応液からイノシトール立体異性体を適宜純粋な物質として単離することができる。
製造方法（Ａ）による製造法を実施例１に示した。
【００２２】
製造方法（Ｂ）
製造方法（Ｂ）は、製造方法（Ａ）により得た培養液から菌体を集め、これを液体培地又は緩衝液中でミオ−イノシトールと反応させることにより、イノシトール立体異性体を生成させるものである。菌体は、製造方法（Ａ）により得た培養液を、遠心分離、濾過などにより集菌したものを用いればよい。また、液体培地は製造方法（Ａ）と同様のものを用いればよい。緩衝液としてはリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）のＣＨＥＳ緩衝液などを１０〜５００ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭの濃度で用いればよい。
反応条件は、菌株や培地、緩衝液の種類によって異なるが、反応温度は１５〜６０℃、好ましくは２５〜５５℃であり、反応時間は１〜５０時間、好ましくは３〜４８時間であり、液体培地または緩衝液のｐＨは６〜１０、好ましくは７〜９である。
反応終了後の反応液からの目的物を単離する方法は製造方法（Ａ）と同様に行えばよい。
製造方法（Ｂ）による製造法を実施例２に示した。
【００２３】
製造方法（Ｃ）
製造方法（Ｃ）は製造方法（Ｂ）の菌体を菌体処理物に代えて反応させる方法である。菌体処理物としては、菌体を機械的破壊、超音波処理、凍結融解処理、乾燥処理、溶媒処理、界面活性剤処理、酵素処理などをしたもの、又はこれらより得られる酵素画分、菌体及び菌体処理物の固定化物などがある。
上記の菌体を処理する工程では緩衝液に還元剤としてメルカプタン、ジチオスレイトールなどを添加するのが好ましい。
反応条件は、菌株や緩衝液の種類によって異なるが、反応温度は１５〜６０℃、好ましくは２５〜４５℃であり、反応時間は１〜５０時間、好ましくは３〜４８時間であり、緩衝液のｐＨは７〜１０である。
緩衝液の種類と使用濃度は製造方法（Ｂ）と同じである。
また、緩衝液には補酵素としてβ−ＮＡＤ^＋・３Ｈ_２Ｏを原料のミオ−イノシトール１ｇに対して１〜８ｇ、好ましくは２〜５ｇを添加する。
反応終了後の反応液から目的物を単離する方法は製造方法（Ａ）と同様にして行えばよい。
製造方法（Ｃ）による製造法を実施例３に示した。
【００２４】
【実施例】
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。
〔実施例１〕製造方法（Ａ）
（１）イノシトール立体異性体の生成
ミオ−イノシトール０．５％（１５ｇ）、（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４０．１％、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．７％、ＫＨ_２ＰＯ_４０．２％、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．０１％および水９８．４９％を含むｐＨ７の液体培地３０００ｍｌを、１００ｍｌずつ５００ｍｌ容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＩＡＭ１０３７株（財団法人応用微生物学研究奨励会より購入）を接種し、２７℃で３日間振盪培養した。培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）し、上清を培養濾液とした。この培養濾液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養濾液中にはシロ−イノシトール０．８９ｍｇ／ｍｌ（反応収率１７．８％）、キロ−イノシトール０．１５ｍｇ／ｍｌ（反応収率３．０％）、ネオ−イノシトール０．０２ｍｇ／ｍｌ（反応収率０．４％）が生成した。
【００２５】
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下のとおりである。

【００２６】
（２）イノシトール立体異性体の単離
培養濾液を強酸性イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ｃ−２０（Ｈ^＋型）８００ｍｌを充填したカラム（内径６ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムを８００ｍｌのイオン交換水を通過させて洗浄した。この溶出液を、強塩基性イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３ＰＬＵＳ（ＯＨ⁻型）８００ｍｌを充填したカラム（内径６ｃｍ、長さ３０ｃｍ）に通過させ、その後このカラムを１２００ｍｌのイオン交換水で洗浄し、溶出液を得た。このようにして得られた溶出液中にはイノシトール立体異性体以外の不純物はほとんど存在していなかった。この溶液を強塩基性イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）Ａ−１１３ＰＬＵＳ（ホウ酸型）３００ｍｌを充填したカラム（内径３ｃｍ、長さ４３ｃｍ）に通過させ、イオン交換水６００ｍｌ、０．２Ｍホウ酸溶液６００ｍｌ、０．５Ｍホウ酸溶液１５００ｍｌの順で流し、溶出液を分画した。成分の分析は高速液体クロマトグラフィーで行った。素通りした画分及びイオン交換水で溶出した画分を濃縮し、水−エタノール（１：２）の混合溶媒中での結晶化により、純粋なシロ−イノシトールを１５１６ｍｇ（収率１０．１％）得た。また、０．５Ｍホウ酸溶液での溶出画分にはまずミオ−イノシトールが溶出し、続いてキロ−イノシトール（Ｄ−体とＬ−体の混合物）が同時に溶出し、次にネオ−イノシトールが溶出した。分画したフラクションのうち、キロ−イノシトールとネオ−イノシトールを多く含む分画を別個に集め、それぞれ減圧下濃縮した。それぞれ分画濃縮液を、強塩基性イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＣＧ−４００（ＯＨ⁻型）２００ｍｌを充填したカラム（内径１．８ｃｍ、長さ８０ｃｍ）に供しイオン交換水で溶出した。次に、この溶出液を分画したものを集め、これを強酸性イオン交換樹脂アンバーライト（登録商標）ＣＧ−１２０（カルシウム型）２００ｍｌを充填したカラム（内径１．８ｃｍ、長さ８０ｃｍ）に供し、イオン交換水で溶出し、溶出液を分画した。以上のカラムクロマトグラフィーで、キロ−イノシトールを高純度（９５％以上）に含む分画が得られ、これらを濃縮し、水−エタノール（１：９）の混合溶媒中で結晶化した。また、ネオ−イノシトールを高純度（９５％以上）に含む分画を濃縮乾固し、蒸留水１０ｍｌを加え不純物を溶解し除き、水に対して溶解度の低いネオ−イノシトールを、白色結晶として得た。
以上の操作で純粋なキロ−イノシトールを３１５ｍｇ（収率２．１％、比旋光度〔α〕_Ｄ＋１０°（ｃ＝１．０，Ｈ_２Ｏ）、Ｄ−体とＬ−体の存在比Ｄ：Ｌ＝５８：４２）、ネオ−イノシトールを２３ｍｇ（収率０．２％）単離した。
【００２７】
〔実施例２〕製造方法（Ｂ）
（１）菌体の生産
実施例１の培養で得られたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＩＡＭ１０３７株の培養液を遠心分離して得られた菌体を、蒸留水２００ｍｌで洗浄後、再度遠心分離し、洗浄した菌体を得た。
【００２８】
（２）異性化反応
上記により得た洗浄した菌体１５ｇを、ミオ−イノシトール２．５ｇを含有した０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５００ｍｌ（ミオ−イノシトール濃度５ｍｇ／ｍｌ）中に加え、５０℃、２０時間ゆるやかに撹拌しながら反応させた。反応終了後、反応液を液体クロマトグラフィーにより分析したところ、シロ−イノシトール１．２ｍｇ／ｍｌ（反応収率２４．０％）、キロ−イノシトール（Ｄ−体、Ｌ−体の混合物）０．１ｍｇ／ｍｌ（反応収率２．０％）、ネオ−イノシトール０．１ｍｇ／ｍｌ（反応収率２．０％）が蓄積していた。
反応液からのイノシトール立体異性体の各成分の単離方法は、実施例１に記載の方法に準じて行い、シロ−イノシトール５２０ｍｇ（収率２０．８％）、Ｄ−及びＬ−キロ−イノシトール３２ｍｇ（収率１．３％）、ネオ−イノシトール２７ｍｇ（収率１．１％）を得た。
【００２９】
〔実施例３〕製造方法（Ｃ）
（１）無細胞抽出液の調製
アグロバクテリウムツメファシエンスＩＡＭ１０３７株を実施例１と同様な培地１００ｍｌで、２７℃、２０時間振盪培養した。
次いで、培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分間）して菌を集め、ジチオスレイトール０．３ｍｇ／ｍｌ含む２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄したのち、再度遠心分離にて集菌を行い、これを同じ組成のリン酸緩衝液２２ｍｌに懸濁した。この菌懸濁液を超音波破砕機（ＢＲＡＮＳＯＮ社製、ＳＯＮＩＦＩＥＲＣＥＬＬＤＩＳＲＵＰＴＯＲ１８５）で処理し、菌体を破壊した後、１６０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離を行い、その上清として無細胞抽出液（タンパク量として４ｍｇ／ｍｌ）を得た。この無細胞抽出液を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に対して透析し、ミオ−イノシトールの異性化反応に供した。
【００３０】
（２）ミオ−イノシトールの異性化反応
ミオ−イノシトール２ｍｇ／ｍｌ溶液を５０μｌ、β−ＮＡＤ^＋・３Ｈ_２Ｏ４０ｍｇ／ｍｌ溶液を１０μｌ、０．５Ｍグッド（Ｇｏｏｄ’ｓ）のＣＨＥＳ緩衝液（ｐＨ１０．０）を２０μｌ及び無細胞抽出液（タンパク量として４ｍｇ／ｍｌ）を２０μｌ含む総容量１００μｌの溶液を３７℃で３時間培養した。
反応後、それぞれの反応液２０μｌを高速液体クロマトグラフィーで分析し、基質としたミオ−イノシトールから生成された異性体の同定を行った。
【００３１】
その結果、基質としたミオ−イノシトール（０．２９ｍｇ／ｍｌ）に加えて、シロ−イノシトール、キロ−イノシトール（Ｄ−体とＬ−体の混合物）、ネオ−イノシトールがそれぞれ０．１６ｍｇ／ｍｌ（反応収率８．０％）、０．０４ｍｇ／ｍｌ（反応収率２．０％）、０．０２ｍｇ／ｍｌ（反応収率１．０％）の濃度で検出された。
【００３２】
【発明の効果】
本発明の製造方法によれば、従来法に比べて安価で、かつ簡単な操作でＤ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトール及びネオ−イノシトールが得られる。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention utilizes Agrobacterium microorganisms, and uses low-priced myo-inositol as a raw material, and D-chiro-inositol, L-kiro-inositol (L The present invention relates to a method for producing inositol stereoisomers such as -chiro-inositol), scyllo-inositol, neo-inositol (hereinafter simply referred to as "inositol stereoisomer").
[0002]
[Prior art]
There are several known physiological actions of stereoisomers of inositol. For example, D-kilo-inositol has attracted attention as a therapeutic or prophylactic agent for non-insulin-dependent diabetes (Diabetes Frontier, Vol. 4, pages 637 to 638, 1993). In addition, L-kilo-inositol is known to be useful for in vivo information transmission (Biochemistry, Vol. 33, pages 8367 to 8374, 1994). Furthermore, scyllo-inositol has been reported to decrease in the brain of patients with cerebral hepatopathy, and its correlation with onset has attracted attention [Life Sciences, Vol. 54, pp. 1507 to 1512, 1994]. Year〕. Further, D-kilo-inositol and scyllo-inositol are used as research reagents.
[0003]
On the other hand, the following (a) to (g) are known as methods for obtaining D-kilo-inositol.
(A) From a plant such as bougainvillea, sugar pine, and American cedar, pinitol contained therein is extracted with a suitable solvent, then demethylated with hydroiodic acid or the like to form D- How to obtain kilo-inositol.
(B) A method for extracting and purifying D-kilo-inositol contained in a trace amount in soybeans, white pickles, etc. [Journal of Agriculture and Food Chemistry, Vol. 32, pp. 1289- 1291, 1984].
[0004]
(C) A method for converting myo-inositol into D-kilo-inositol using cultured cells of chlorella [Monashshte Chem. 102, 459-464, 1971].
(D) Method for converting myo-inositol to D-kilo-inositol using a mouse-derived cell [J. Biol. Chem., Vol. 267, pp. 16904-16910, 1992].
[0005]
(E) A method in which kasugamycin is hydrolyzed with a strong acid to obtain its constituent sugar, D-kilo-inositol (US Pat. No. 5,091,596).
(F) Using 1-chloro-2,3-dihydroxy-4,6- (1-chloro-2,3-dihydroxycyclohexa-4,6-diene) as a starting material, D-kilo-inositol is synthesized. Method [J. Org. Chem., 58, 2331-2333, 1993].
(G) Method of obtaining D-kilo-inositol through several steps of reaction using halogenobenzene as a starting material [J. Chem. Soc. Perkin Transactions 1) pp. 741-743 Page, 1993].
[0006]
As methods for obtaining L-kilo-inositol, the following methods (h) and (i) are known.
(H) A method of obtaining L-kilo-inositol by demethylating ketebratitol (monomethyl ether of L-kilo-inositol) contained in natural rubber by acid treatment.
(I) Although microorganisms are not specified, a method for converting myo-inositol into L-kilo-inositol by soil microorganisms [Soil Science Society of America Journal (Soil Sci. Soc. AM. J.), Vol. 41 733-page 736, 1977].
[0007]
Further, as methods for obtaining scyllo-inositol, there are the following (j), (k), (l) and the like.
(J) Vulture (Quercus  stenophylla) And the like to extract and purify scyllo-inositol (Pharmaceutical Journal, Vol. 89, pages 1302 to 1305, 1969).
(K) A method of chemically synthesizing myo-inositol as a raw material by a four-step reaction [West German Patent Publication No. 3,405,663].
(L) A method of chemically synthesizing myo-inositol as a raw material by a two-step reaction (Liebigs Ann. Chem., Pages 866 to 868, 1985).
[0008]
Further, the following (m), (n), (o) and the like are known as methods for obtaining inositol stereoisomers as a mixture.
(M) A method for obtaining stereoisomers of scyllo-inositol, kilo-inositol, neo-inositol, muco-inositol, allo-inositol, epi-inositol by reacting myo-inositol with Raney nickel as a catalyst [Carbohydrate Research ( Carbohydrate Research), 166, 171-180, 1987].
(N) A method of converting myo-inositol into D-kilo-inositol, scyllo-inositol, epi-inositol, neo-inositol using a fat body of cockroach [Biochemistry Vol. 12, pp. 4705- 4712, 1973].
[0009]
(O) A method of converting myo-inositol into scyllo-inositol and neo-inositol using a crude enzyme solution extracted from bovine brain cells [Biochemical and Biophysical Research Communications, Vol. 77, 340-346, 1977].
However, a method for producing D-kilo-inositol, L-kilo-inositol, scyllo-inositol and neo-inositol using a microorganism of the genus Agrobacterium and using myo-inositol as a raw material is not known.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
None of the above methods for producing the inositol stereoisomers from (a) to (o) is satisfactory as a method for producing them on an industrial scale. That is, the above-mentioned methods (a), (b), (h) and (j) for extracting D-kilo-inositol, L-kilo-inositol and scyllo-inositol from a plant have a content in the plant body. Since it is small, extraction and purification are difficult, and the yield is low.
In addition, using the chlorella, murine cells, soil microorganisms, cockroach fat body cells, bovine brain cells and the like described in (c), (d), (j), (n), (o), D- In the method of obtaining kilo-inositol, L-kilo-inositol, scyllo-inositol, neo-inositol, epi-inositol, etc., the reaction yields a low yield because it is a reaction that detects radiolabeled substances.
[0011]
In the method of obtaining D-kilo-inositol by hydrolyzing kasugamycin described in (e) with a strong acid, the purification step is complicated.
Moreover, since the method of chemically synthesizing D-kilo-inositol described in (f) and (g) requires stereospecific synthesis, the reaction yield is low.
Furthermore, the method of chemically synthesizing scyllo-inositol from myo-inositol described in (k) is complicated in operation and yield is low.
Moreover, since the method described in (l) uses platinum oxide as a catalyst, there is a problem in terms of cost.
[0012]
In addition, the method of obtaining scyllo-inositol, kilo-inositol, neo-inositol, muco-inositol, allo-inositol, epi-inositol using Raney nickel as described in (m) above as a catalyst, Since a heating operation is necessary and a side reaction is involved, and multi-component inositol is simultaneously generated in the reaction solution, it is difficult to separate the components and the yield is low.
An object of the present invention is to provide a production method for obtaining D-kilo-inositol, L-kilo-inositol, scyllo-inositol, and neo-inositol at low cost and with simple operation efficiently compared with the conventional method. .
[0013]
[Means for Solving the Problems]
The inventors of the present invention have made extensive studies in order to achieve the above object. As a result, when a microorganism belonging to the genus Agrobacterium is cultured in a medium containing myo-inositol, D-kilo-inositol, L-kilo-inositol, scyllo-inositol and neo-inositol are efficiently produced in the culture solution. In addition, when a cell of a microorganism belonging to the genus Agrobacterium obtained from the culture solution or a treated product of mycelium is allowed to act on myo-inositol, D- and L-kilo-inositol, scyllo-inositol and neo-inositol Found that it can be generated efficiently with simple operations.
That is, the gist of the first present invention is characterized in that a microorganism belonging to the genus Agrobacterium is cultured in a liquid medium containing myo-inositol, and inositol stereoisomers are produced and accumulated in the medium. And in a method for producing inositol stereoisomers.
[0014]
The gist of the second aspect of the present invention is that a microorganism belonging to the genus Agrobacterium is cultured in advance in a liquid medium containing myo-inositol, and the cells separated from the culture solution are stored in the liquid medium or buffer solution. In the method for producing inositol stereoisomers, wherein the inositol stereoisomers are produced and accumulated by acting on myo-inositol.
Furthermore, the gist of the third aspect of the present invention is that a microorganism belonging to the genus Agrobacterium is cultured in a liquid medium containing myo-inositol, and the processed bacterial cell product separated from the culture solution is buffered. The inositol stereoisomer is produced by accumulating inositol stereoisomers by causing them to act on myo-inositol.
[0015]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Next, the method for producing inositol stereoisomers according to the present invention will be specifically described.
Myo-inositol which is a raw material of the production method of the present invention is widely distributed in animals and plants and microorganisms. Particularly, it exists in cereals in large quantities as phytic acid, which is a Ca or Mg salt of hexaphosphate ester, and is obtained by subjecting rice bran etc. to alkaline hydrolysis and purification by a known method.
[0016]
The microorganism used in the present invention may be any strain as long as it belongs to the genus Agrobacterium and has the ability to convert myo-inositol into inositol stereoisomers other than myo-inositol. Specifically, Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium  tumefaciens), Agrobacterium radiobacter (Agrobacterium  radiobacter), Agrobacterium rhizogenes (Agrobacterium  rhizogenes), Agrobacterium ruby (Agrobacterium  rubi(Hereinafter referred to as “Agrobacterium” unless otherwise specified), and these are ATCC (American Type Culture Collection), IFO (Fermentation Institute), IAM (Applied Microbiology Research) Etc.) Some strains of the genus Agrobacterium are known to cause root cancer disease and hair root disease in plants, but there are many strains that are not phytopathogenic to the same genus, and antagonistic microorganisms against root cancer disease of roses In some cases, cultured bacteria are used for agriculture. Moreover, pathogenicity to other than plants is not known, and in particular, it is a microbial group that is harmless and highly safe for animals including humans.
[0017]
The production method of the present invention can be divided into three methods. These will be sequentially described as production methods (A), (B), and (C).
Manufacturing method (A)
Inositol stereoisomers can be generated and accumulated by inoculating a liquid medium containing myo-inositol with a microorganism belonging to the genus Agrobacterium and culturing aerobically. The liquid medium is not particularly limited as long as the purpose is achieved, and may be any medium containing a carbon source, a nitrogen source, an organic nutrient source, inorganic salts, and the like, and either a synthetic medium or a natural medium can be used. As the carbon source, myo-inositol is added in an amount of 0.1 to 1.5%, preferably 0.2 to 0.8%. As the nitrogen source, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, urea or the like is added in an amount of 0.01 to 1.%. It is desirable to add 0%, preferably 0.05 to 0.5%. Addition of a very small amount (about 0.005 to 0.05%) of yeast extract, casamino acid or the like as an organic nutrient source may be effective depending on the strain. In addition, it is effective to add inorganic salts, which can generate ions such as sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, manganese, zinc, iron, copper, molybdenum, phosphoric acid, sulfuric acid, etc., to the medium as necessary. is there. Inositol stereoisomers can be obtained efficiently when the culture solution is adjusted to a hydrogen ion concentration of pH 6 to 10, preferably pH 7 to 9, and cultured.
[0018]
Although culture conditions vary depending on the strain and the type of medium, the culture temperature is 15 to 40 ° C, preferably 20 to 35 ° C. The culture period is usually 1 to 7 days, preferably 2 to 5 days. Further, the culture may be performed aerobically by shaking the liquid medium or blowing air into the liquid medium.
As a method for collecting a target substance from a culture solution, a general method for isolating and purifying a normal water-soluble neutral substance can be applied. That is, most of the impurities other than the inositol stereoisomer can be removed by treating the culture solution with activated carbon, ion exchange resin, or the like. Thereafter, the target product can be isolated by appropriately combining a method using column chromatography of an ion exchange resin, a method of separating using a difference in solubility in a solution, and a method of recrystallization.
[0019]
Examples of methods using column chromatography include Carbohydrate Research Vol. 166, pp. 171 to 180 (1987) and Journal of American Chemical Society (J. Am. Chem. Soc.) 73. Vol. 2399-2340 (1951), a strongly basic ion-exchange resin made into a boric acid type, packed in a column and gradually increased in concentration of boric acid to flow inositol stereoisomerism. A method of separating each component of the body is effective. When a mixture of myo-inositol, D-kilo-inositol, L-kilo-inositol, scyllo-inositol and neo-inositol was applied to the column using this column, the scyllo-inositol was not retained by the resin. Pass through the other inositol stereoisomers, when 0.5M boric acid solution is passed, myo-inositol elutes first, then D-kilo-inositol and L-kilo-inositol elute simultaneously, Neo-inositol elutes. In addition, strongly basic ion exchange resin (OH⁻A method of separating by injecting ion-exchanged water into a column and making it into a column is also an effective method for inositol separation. For example, when myo-inositol, D-kilo-inositol, L-kilo-inositol, neo-inositol mixed concentrate is applied to the column of this method, first, myo-inositol and neo-inositol elute almost simultaneously, D-kilo-inositol and L-kilo-inositol elute simultaneously. Furthermore, a method of separating strong fructose and glucose on an industrial scale by packing a strongly acidic ion exchange resin (calcium type) in a column and developing it with water is the same as the inositol mixture described above. Effective for separation. That is, when myo-inositol, D-kilo-inositol, L-kilo-inositol, neo-inositol mixed concentrate is developed on this column, myo-inositol, D-kilo-inositol and L-kilo-inositol elute almost simultaneously. However, neo-inositol elutes later.
A pure substance can be obtained by arbitrarily fractionating the eluate obtained by column chromatography in this way and repeating or combining the column chromatography several times.
[0020]
On the other hand, as a method for separating using the difference in solubility in a solution, separation can be performed using the difference in solubility of inositol stereoisomers in water or lower alcohol. For example, since scyllo-inositol and neo-inositol are less soluble in water than other inositols, insoluble fractions in which these substances are mixed with other inositol stereoisomers are easily dissolved. The isomer can be dissolved by adding a minimum amount of water and removed as a solution to obtain scyllo-inositol or neo-inositol as a solid. In addition, a mixture of D-kilo-inositol and L-kilo-inositol can be separated using the difference in solubility in lower alcohols. That is, since D-kilo-inositol is more soluble in methanol than L-kilo-inositol, an appropriate amount of methanol is added to the mixture of both to dissolve D-kilo-inositol, and L-kilo-inositol is dissolved. Keep in a solid state and filter with a glass filter. A pure substance can be obtained by repeating this operation of dissolution and filtration several times.
[0021]
As for the recrystallization method, inositol can be dissolved in water and an arbitrary amount of lower alcohol can be added to easily crystallize in a mixed solvent system. The resulting crystals can be separated from the mother liquor with a glass filter or filter paper.
The amount and abundance ratio of inositol stereoisomers to be produced vary depending on the strain type and the number of culture days, but the inositol can be isolated from the culture solution or reaction solution by repeatedly using the separation methods described above alone or in combination as necessary. Stereoisomers can be isolated as pure material as appropriate.
The production method according to production method (A) is shown in Example 1.
[0022]
Manufacturing method (B)
In the production method (B), cells are collected from the culture solution obtained by the production method (A), and this is reacted with myo-inositol in a liquid medium or buffer to produce inositol stereoisomers. is there. What is necessary is just to use what collected the culture solution obtained by the manufacturing method (A) by centrifugation, filtration, etc. as a microbial cell. Moreover, what is necessary is just to use the same liquid culture medium as the manufacturing method (A). As the buffer solution, phosphate buffer solution, Tris buffer solution, Good's CHES buffer solution or the like may be used at a concentration of 10 to 500 mM, preferably 20 to 100 mM.
The reaction conditions vary depending on the strain, medium, and type of buffer, but the reaction temperature is 15 to 60 ° C, preferably 25 to 55 ° C, the reaction time is 1 to 50 hours, preferably 3 to 48 hours, The pH of the liquid medium or buffer is 6-10, preferably 7-9.
What is necessary is just to perform the method of isolating the target object from the reaction liquid after completion | finish of reaction similarly to a manufacturing method (A).
A production method by the production method (B) is shown in Example 2.
[0023]
Manufacturing method (C)
The production method (C) is a method in which the cells of the production method (B) are reacted instead of the treated cells. Examples of the treated microbial cells include those obtained by mechanically destroying, sonicating, freeze-thawing, drying, solvent treatment, surfactant treatment, enzyme treatment, etc., or enzyme fractions obtained from these, bacteria There are immobilization products of cells and processed bacterial cells.
In the step of treating the cells, it is preferable to add mercaptan, dithiothreitol or the like as a reducing agent to the buffer.
Although the reaction conditions vary depending on the strain and the type of buffer, the reaction temperature is 15 to 60 ° C., preferably 25 to 45 ° C., the reaction time is 1 to 50 hours, preferably 3 to 48 hours. The pH is 7-10.
The type and concentration of the buffer solution are the same as in the production method (B).
In addition, β-NAD is used as a coenzyme in the buffer.⁺・ 3H₂O is added in an amount of 1 to 8 g, preferably 2 to 5 g, based on 1 g of myo-inositol as a raw material.
What is necessary is just to perform the method of isolating a target object from the reaction liquid after completion | finish of reaction similarly to a manufacturing method (A).
A production method according to production method (C) is shown in Example 3.
[0024]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described specifically by way of examples.
[Example 1] Manufacturing method (A)
(1) Formation of inositol stereoisomers
Myo-inositol 0.5% (15 g), (NH₄)₂SO₄  0.1%, K₂HPO₄0.7%, KH₂PO₄  0.2% MgSO₄・ 7H₂3000 ml of a pH 7 liquid medium containing 0.01% O and 98.49% water was dispensed in 100 ml portions into a 500 ml baffled Erlenmeyer flask and sterilized by autoclave. In each Erlenmeyer flask, Agrobacterium tumefaciens (Agrobacterium  tumefaciens) IAM 1037 strain (purchased from Japan Foundation for Applied Microbiology Research) was inoculated and cultured at 27 ° C for 3 days with shaking. The culture solution was centrifuged (8000 rpm, 10 minutes), and the supernatant was used as a culture filtrate. The culture filtrate was analyzed by high performance liquid chromatography under the following conditions. As a result, scyllo-inositol 0.89 mg / ml (reaction yield 17.8%), kilo-inositol 0.15 mg / ml (reaction yield 3.0%), neo-inositol 0.02 mg was contained in the culture filtrate. / Ml (reaction yield 0.4%) was produced.
[0025]
The analysis conditions of high performance liquid chromatography are as follows.

[0026]
(2) Isolation of inositol stereoisomers
The culture filtrate was subjected to strong acidic ion exchange resin Duolite (registered trademark) C-20 (H⁺The column was passed through a column (inner diameter 6 cm, length 30 cm) packed with 800 ml, and then the column was washed with 800 ml of ion-exchanged water. This eluate was used as a strongly basic ion exchange resin Duolite (registered trademark) A-113 PLUS (OH⁻The column was passed through a column (inner diameter 6 cm, length 30 cm) packed with 800 ml, and then this column was washed with 1200 ml of ion-exchanged water to obtain an eluate. There were almost no impurities other than the inositol stereoisomer in the eluate thus obtained. This solution was passed through a column (inner diameter: 3 cm, length: 43 cm) packed with 300 ml of strongly basic ion exchange resin Duolite (registered trademark) A-113 PLUS (boric acid type). The eluate was fractionated by flowing 600 ml of acid solution and 1500 ml of 0.5M boric acid solution in this order. The components were analyzed by high performance liquid chromatography. The flow-through fraction and the fraction eluted with ion-exchanged water were concentrated, and 1516 mg (yield 10.1%) of pure scyllo-inositol was obtained by crystallization in a mixed solvent of water-ethanol (1: 2). Obtained. In the elution fraction with 0.5M boric acid solution, first, myo-inositol elutes, followed by kilo-inositol (mixture of D-form and L-form) at the same time, followed by neo-inositol. Eluted. Of the fractions fractionated, fractions rich in kilo-inositol and neo-inositol were collected separately and concentrated under reduced pressure. Each of the fraction concentrates was used as a strongly basic ion exchange resin Amberlite (registered trademark) CG-400 (OH⁻The sample was applied to a column (inner diameter 1.8 cm, length 80 cm) packed with 200 ml and eluted with ion-exchanged water. Next, a fraction obtained by fractionating the eluate was collected, and this was collected in a column (inner diameter 1.8 cm, length 80 cm) packed with 200 ml of strongly acidic ion exchange resin Amberlite (registered trademark) CG-120 (calcium type). And eluted with ion-exchanged water, and the eluate was fractionated. By the above column chromatography, fractions containing kilo-inositol in high purity (95% or more) were obtained, and these were concentrated and crystallized in a mixed solvent of water-ethanol (1: 9). In addition, the fraction containing neo-inositol in high purity (95% or more) is concentrated and dried, and 10 ml of distilled water is added to dissolve and remove impurities to obtain neo-inositol with low solubility in water as white crystals. It was.
By the above operation, 315 mg of pure kilo-inositol (yield 2.1%, specific rotation [α])_D+ 10 ° (c = 1.0, H₂O), abundance ratio of D-form and L-form D: L = 58: 42), and 23 mg (0.2% yield) of neo-inositol was isolated.
[0027]
[Example 2] Manufacturing method (B)
(1) Production of bacterial cells
Agrobacterium tumefaciens obtained by culturing in Example 1 (Agrobacterium tumefaciens) The cells obtained by centrifuging the culture solution of IAM 1037 strain were washed with 200 ml of distilled water and then centrifuged again to obtain washed cells.
[0028]
(2) Isomerization reaction
15 g of the washed cells obtained as described above were added to 500 ml of 0.05 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 2.5 g of myo-inositol (myo-inositol concentration 5 mg / ml), The reaction was carried out with gentle stirring for a period of time. After completion of the reaction, the reaction mixture was analyzed by liquid chromatography. As a result, scyllo-inositol 1.2 mg / ml (reaction yield 24.0%), kilo-inositol (mixture of D-form and L-form) 0.1 mg / Ml (reaction yield 2.0%) and neo-inositol 0.1 mg / ml (reaction yield 2.0%) were accumulated.
The isolation method of each component of the inositol stereoisomer from the reaction solution was performed according to the method described in Example 1, and 520 mg of scyllo-inositol (yield 20.8%), D- and L-kilo-inositol. 32 mg (yield 1.3%) and neo-inositol 27 mg (yield 1.1%) were obtained.
[0029]
[Example 3] Production method (C)
(1) Preparation of cell-free extract
Agrobacterium tumefaciens IAM 1037 strain was cultured with shaking in the same medium as in Example 1 at 27 ° C. for 20 hours.
Next, the culture solution is centrifuged (8000 rpm, 10 minutes) to collect bacteria, washed with 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.3 mg / ml dithiothreitol, and then collected again by centrifugation. This was suspended in 22 ml of a phosphate buffer having the same composition. This bacterial suspension was treated with an ultrasonic crusher (BRANSON, SONIFIER CELL DISTORUPTOR 185) to destroy the bacterial cells, followed by centrifugation at 16000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was cell-free extract ( As a protein amount, 4 mg / ml) was obtained. This cell-free extract was dialyzed against 20 mM phosphate buffer (pH 7.0) and subjected to myo-inositol isomerization reaction.
[0030]
(2) Myo-inositol isomerization reaction
50 μl of myo-inositol 2 mg / ml solution, β-NAD⁺・ 3H₂10 μl of 40 mg / ml solution, 20 μl of 0.5 M Good's CHES buffer (pH 10.0) and 20 μl of cell-free extract (4 mg / ml of protein) in a total volume of 100 μl The cells were cultured at 37 ° C for 3 hours.
After the reaction, 20 μl of each reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography, and the isomer produced from myo-inositol as a substrate was identified.
[0031]
As a result, in addition to myo-inositol (0.29 mg / ml) as a substrate, scyllo-inositol, kilo-inositol (mixture of D-form and L-form), and neo-inositol were each 0.16 mg / ml ( The reaction was detected at concentrations of 8.0%), 0.04 mg / ml (reaction yield 2.0%), and 0.02 mg / ml (reaction yield 1.0%).
[0032]
【The invention's effect】
According to the production method of the present invention, D-kilo-inositol, L-kilo-inositol, scyllo-inositol, and neo-inositol can be obtained at a lower cost and with a simple operation.

Claims

A method for producing an inositol stereoisomer, which comprises culturing a microorganism belonging to the genus Agrobacterium in a liquid medium containing myo-inositol and generating and accumulating the inositol stereoisomer in the culture solution.

Microorganisms belonging to the genus Agrobacterium are pre-cultured in a liquid medium containing myo-inositol, and the cells isolated from the medium are allowed to act on myo-inositol in a liquid medium or buffer to produce inositol stereoisomers. A method for producing an inositol stereoisomer, characterized by accumulating.

Microorganisms belonging to the genus Agrobacterium are cultured in a liquid medium containing myo-inositol, and the treated cells of the cells separated from the culture solution are allowed to act on myo-inositol in a buffer solution to produce inositol stereoisomers. A method for producing inositol stereoisomers, characterized by producing and accumulating.