KR101546674B1 - Process for Purifying D-Chiro-Inositol from Solution Containing Myo-Inositol and D-Chiro-Inositol - Google Patents

Process for Purifying D-Chiro-Inositol from Solution Containing Myo-Inositol and D-Chiro-Inositol Download PDF

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Abstract

본 발명은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 혼합용액으로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 분리 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 포함된 용액에 유기용매를 첨가하여 마이오-이노시톨의 침전을 유도하여 혼합액 중의 D-카이로-이노시톨의 순도를 증대시킨다. 본 발명의 방법에 의하면 매우 간단하고 저비용으로 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 혼합용액으로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 분리할 수 있다. The present invention relates to a method for separating and purifying D-chiro-inositol in high purity from a mixed solution of myo-inositol and D-chiro-inositol. In the method of the present invention, an organic solvent is added to a solution containing myo-inositol and D-chiro-inositol to induce precipitation of the myo-inositol to increase the purity of D-chiro-inositol in the mixture. According to the method of the present invention, D-chiro-inositol can be separated in high purity from a mixed solution of myo-inositol and D-chiro-inositol very simply and inexpensively.

Description

마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 포함된 용액으로부터 D-카이로-이노시톨을 정제하는 방법{Process for Purifying D-Chiro-Inositol from Solution Containing Myo-Inositol and D-Chiro-Inositol} [0001] The present invention relates to a process for purifying D-chiro-inositol from a solution containing D-Chiro-Inositol and D-Chiro-Inositol,

본 발명은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 포함된 용액으로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 분리하여 정제하는 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method of separating and purifying D-chiro-inositol from a solution containing myo-inositol and D-chiro-inositol in high purity.

D-카이로-이노시톨(D-chiro-inositol, cis-1,2,4-trans-3,5,6-cyclohexol)은 마이오-이노시톨(myo-inositol, cis-1,2,3,5-trans-4,6-cyclohexanehexol)의 스테레오이소머로서 3번 하이드록실 그룹이 에피머화 된 형태이다(도 1). D-카이로-이노시톨은 이노시톨 포스포글리칸(IPG)의 주요 구성성분으로 인슐린 신호전달의 중요한 매개체로 보고되어 있으며, 제2형 당뇨의 치료에 효과가 있다고 알려져 있다. D-카이로-이노시톨은 주로 진핵생물에서 발견되며, 마이오-이노시톨의 에피머화에 의해 생합성된다. D-카이로-이노시톨은 주로 피니톨(D-pinitol)이나 카스가마이신(kasugamycin)의 염산 가수분해에 의해 생산하고 있다(U.S. Pat No. 5827896, U.S. Pat No. 5091596, U.S. Pat No. 5463142, U.S. Pat No.5714643). 그러나, 원료인 피니톨이나 카스가마이신이 고가이며, 유기합성법(U.S. Pat No. 5406005, WO 96/25381)도 알려져 있으나, 부산물의 분리가 용이하지 않아 경제성이 낮다. D-카이로-이노시톨은 마이오-이노시톨로부터 이노시톨 디하이드로게나아제(inositol dehydrogenase) 및 이노소스 이소머라아제(inosose isomerase) 효소의 연속작용에 의해 생성될 수 있으며, 상기 효소를 마이오-이노시톨에 직접 반응시키거나, 상기 효소를 발현하도록 형질전환된 재조합 세포를 이용한 발효 방법에 의해 생산될 수 있다. 그러나, 상기 발효방법 또는 효소반응법을 통해 생산된 반응생성물에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합되어 있고, 혼합용액중에는 마이오-이노시톨에 비해 D-카이로-이노시톨의 농도가 상대적으로 낮다. 따라서, 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합물로부터 D-카이로-이노시톨을 농도를 높여 고순도로 정제하는 방법의 개발이 요구된다.
D-chiro-inositol (cis-1,2,4-trans-3,5,6-cyclohexol) is a myo-inositol, cis- trans-4,6-cyclohexanehexol) as a stereoisomer, and hydroxyl group 3 is epimerized (Fig. 1). D-cairo-inositol is a major component of inositol phosphoglycans (IPG) and has been reported to be an important mediator of insulin signaling and is known to be effective in the treatment of type 2 diabetes. D-cairo-inositol is found mainly in eukaryotes and is biosynthesized by epimerization of myo-inositol. D-chiro-inositol is mainly produced by hydrochloric acid hydrolysis of D-pinitol or kasugamycin (US Pat No. 5827896, US Pat No. 5091596, US Pat No. 5463142, US Pat No. 5714643). However, the raw materials, such as pinitol and casgalmycin, are expensive and organic synthesis methods (US Pat No. 5406005, WO 96/25381) are known, but the separation of by-products is not easy and economic efficiency is low. D-cairo-inositol can be produced from the myo-inositol by the action of inositol dehydrogenase and inosose isomerase enzyme, and the enzyme is directly added to the myo-inositol Or by a fermentation method using recombinant cells transformed to express the enzyme. However, the reaction product produced through the fermentation method or the enzyme reaction method contains a mixture of myo-inositol and D-chiro-inositol, and the concentration of D-chiro-inositol is relatively higher in the mixed solution than that of myo- low. Therefore, it is required to develop a method of purifying D-cairo-inositol from a mixture of myo-inositol and D-cairo-inositol at a high concentration and purifying it with high purity.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
Numerous papers and patent documents are referenced and cited throughout this specification. The disclosures of the cited papers and patent documents are incorporated herein by reference in their entirety to better understand the state of the art to which the present invention pertains and the content of the present invention.

형질전환세포를 이용한 발효방법 또는 효소반응 방법에 의해 마이오-이노시톨을 기질로 하여 D-카이로-이노시톨을 생산하는 공정의 최종 반응 생성물내에서 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합되어 존재한다. 본 발명자들은 이러한 이노시톨의 입체이성질체 혼합용액으로부터 D-카이로-이노시톨만을 고순도로 정제하는 방법을 개발하고자 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들은 입체이성질체 관계에 있는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 수용액 상에서 큰 용해도 차이를 보임을 확인하였고, 이러한 용해도 차이를 이용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 간단한 공정을 통해 효율적으로 분리하여 고순도로 정제할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Inositol and D-chiro-inositol are mixed and present in the final reaction product of the step of producing D-chiro-inositol using the myo-inositol as a substrate by a fermentation method or an enzyme reaction method using transformed cells do. The present inventors have made efforts to develop a method for purifying only D-chiro-inositol from such a mixture of inositol stereoisomers with high purity. As a result, the present inventors confirmed that a large difference in solubility between the myo-inositol and the D-chiro-inositol in the aqueous solution was observed, and the D-ciro-inositol was easily obtained from the myo-inositol And then purified to high purity. The present invention has been completed based on this finding.

따라서, 본 발명의 목적은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 함유된 용액으로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 정제하는 방법을 제공하는 데에 있다.
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for purifying D-cairo-inositol from a solution containing myo-inositol and D-chiro-inositol in high purity.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
The objects and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description of the invention, claims and drawings.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 함유된 용액으로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 정제하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는 방법을 제공한다: (a) 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 함유된 용액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계; (b) 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (c) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
According to one aspect of the present invention, there is provided a method for purifying D-chiro-inositol in high purity from a solution containing myo-inositol and D-chiro-inositol, comprising the steps of: (a) adding an organic solvent to a solution containing myo-inositol and D-chiro-inositol to produce an inositol precipitate; (b) separating the supernatant from the resulting inositol precipitate; And (c) drying the separated supernatant to obtain an inositol powder.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 단계 (c) 이후에 다음의 단계를 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다: (d) 상기 단계 (c)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하는 단계; (e) 상기 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계; (f) 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (g) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계. According to a preferred embodiment of the present invention, the present invention further provides, after step (c), a further step of: (d) dissolving the inositol powder obtained in step (c) To prepare an aqueous solution; (e) adding an organic solvent to the aqueous solution to produce an inositol precipitate; (f) separating the supernatant from the resulting inositol precipitate; And (g) drying the separated supernatant to obtain an inositol powder.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은 상기 단계 (c) 이후에 다음의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다: (d)′상기 단계 (c)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하고 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계; (e)′상기 수용액에서 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및 (f)′상기 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
According to another preferred embodiment of the present invention, the present invention further provides, after step (c), a further step of: (d) applying the inositol powder obtained in step (c) Dissolving in water to prepare an aqueous solution and producing an inositol precipitate; (e) separating the supernatant from the inositol precipitate produced in the aqueous solution; And (f) drying the supernatant to obtain an inositol powder.

이하에서 본 발명의 방법을 각 단계에 따라 보다 상세히 설명한다.
Hereinafter, the method of the present invention will be described in more detail by each step.

단계 (a): 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 함유된 용액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계 Step (a): an organic solvent is added to a solution containing myo-inositol and D-chiro-inositol to produce an inositol precipitate

마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 함유된 이노시톨 혼합용액은 마이오-이노시톨을 기질로 하여 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법에서 최종 반응 산물로 얻어 질 수 있다. 예를 들어, 마이오-이노시톨 트랜스포터(myo-inositol transporter), 이노시톨 디하이드로게나아제(inositol dehydrogenase) 및 이노소스 이소머라아제(inosose isomerase)를 발현하도록 형질전환된 재조합 세포를 이용한 발효 방법에서 마이오-이노시톨을 기질로 하여 배양한 배양 산물에는 반응하고 남은 반응기질 마이오-이노시톨과 반응 생성물인 D-카이로-이노시톨이 혼합된 이노시톨 혼합용액이 만들어진다. 또한, 상기 효소를 발현하도록 형질전환된 재조합 세포의 휴면세포(resting cell)를 마이오-이노시톨을 포함하는 최소배지에 접종하여 마이오-이노시톨을 D-카이로-이노시톨로 전환하는 방법의 경우에도 배양한 최종 배양 산물에 반응하고 남은 반응 기질 마이오-이노시톨과 반응 생성물인 D-카이로-이노시톨이 혼합된 이노시톨 혼합물이 만들어진다. 또한, 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제의 효소를 사용하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생성시키는 효소 반응법에서 반응을 완료한 최종 반응 산물에 반응하고 남은 반응 기질 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합된 이노시톨 혼합 용액이 만들어진다. 따라서, 본 발명의 방법은 예컨대 상술한 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 발효방법, 휴면세포 전환방법 및 효소 반응법의 최종 반응용액으로 만들어지는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합용액으로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 정제하는 방법에 적용될 수 있다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 혼합용액은 예컨대 재조합 세포를 사용한 발효액일 경우 영양배지(완전배지)일 수 있으며, 휴면세포 전환법에 의한 반응액일 경우 M9 최소배지일 수 있으며, 효소반응법에 의한 반응액일 경우 효소 반응 완충액이 될 수 있다. 상기 설명된 D-카이로-이노시톨을 제조하는 방법의 최종 반응용액내에서 D-카이로-이노시톨의 최종 평형 농도는 약 14％이므로, 이노시톨의 혼합 용액내의 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨은 약 86:14의 비율로 존재한다. The inositol mixed solution containing myo-inositol and D-cairo-inositol can be obtained as a final reaction product in a method of producing D-chiro-inositol using the myo-inositol as a substrate. For example, in a fermentation method using recombinant cells transformed to express myo-inositol transporter, inositol dehydrogenase, and inosose isomerase, Inocitol is incubated with the culture product of o-inositol as a substrate, and a mixed solution of inositol mixed with the remaining reaction substrate myo-inositol and the reaction product D-chiro-inositol is prepared. In the case of the method of transforming the myo-inositol into the D-chiro-inositol by inoculating the resting cells of the recombinant cells transformed to express the enzyme into the minimal medium containing the mi-inositol, An inositol mixture is prepared by mixing the reaction medium, the reaction medium, and the reaction product, D-chiro-inositol, in one final culture. In addition, the final reaction product in which the reaction is completed in the enzyme reaction method of producing D-chiro-inositol from the myo-inositol using the enzyme of the myo-inositol transporter, inositol dehydrogenase and inosone isomerase And a mixed solution of inositol mixed with the remaining reaction substrate, myo-inositol and D-chiro-inositol, is made. Thus, the method of the present invention can be used, for example, as a fermentation method for producing D-chiro-inositol from the above-mentioned myo-inositol, a method for converting dormant cells and myo-inositol and D- The present invention can be applied to a method of purifying D-chiro-inositol from a mixed solution of inositol with high purity. The mixed solution of myo-inositol and D-chiro-inositol to which the method of the present invention can be applied can be, for example, a nutrient medium (complete medium) in the case of a fermentation broth using a recombinant cell, And may be an enzyme reaction buffer in the case of a reaction solution by the enzyme reaction method. Since the final equilibrium concentration of D-chiro-inositol in the final reaction solution of the above-described method of preparing D-chiro-inositol is about 14%, the concentration of myo-inositol and D-chiro- 86:14.

본 발명의 방법은 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도 차이에 의해 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨 혼합 용액내에서 D-카이로-이노시톨의 순도를 높여 정제하는 방법이다. 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 물에 용해된 수용액내에서 각각의 이노시톨의 용해도 차이는 도 3에 나타나 있다. 본 발명의 방법에서, 먼저 상기 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨을 함유한 이노시톨 용액에 유기용매를 첨가한다. 상기 유기용매의 첨가에 의해 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 침전이 유도된다. 유기용매 첨가에 의해 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 침전율이 모두 증가되지만, D-카이로-이노시톨에 비해 마이오-이노시톨의 침전율이 훨씬 크게 증가한다(도 5 참조). 따라서, 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합된 용액에 유기용매를 첨가하여 D-카이로-이노시톨 보다 마이오-이노시톨을 더 많은 양으로 침전시켜 용액중의 D-카이로-이노시톨의 농도를 증대시킬 수 있다. The method of the present invention enhances the purity of D-chiro-inositol in a mixed solution of myo-inositol and D-chiro-inositol due to the difference in solubility between myo-inositol and D-chiro-inositol. The difference in solubility of each inositol in an aqueous solution of myo-inositol and D-cairo-inositol dissolved in water is shown in Fig. In the method of the present invention, an organic solvent is first added to an inositol solution containing the myo-inositol and the D-chiro-inositol. The addition of the organic solvent induces precipitation of myo-inositol and D-chiro-inositol. The precipitation rate of the myo-inositol and the D-chiro-inositol is both increased by the addition of the organic solvent, but the deposition rate of the myo-inositol is much larger than that of the D-chiro-inositol (see FIG. 5). Therefore, an organic solvent is added to a solution of a mixture of myo-inositol and D-chiro-inositol to precipitate a larger amount of myo-inositol than D-chiro-inositol to increase the concentration of D-chiro- Can be increased.

본 발명에서 사용할 수 있는 유기용매는 D-카이로-이노시톨의 침전 보다 마이오-이노시톨의 침전을 더욱 크게 유도할 수 있는 특성을 갖는 것이면 특별하게 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 유기용매는 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1, 3-부틸렌글리콜 또는 에테르이다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 유기용매는 탄소수 2-6개의 알코올이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 유기용매는 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세톤이다. The organic solvent usable in the present invention is not particularly limited as long as it has properties capable of inducing the precipitation of myo-inositol to a greater extent than the precipitation of D-cairo-inositol. According to one embodiment of the present invention, the organic solvent is an alcohol, acetone, ethyl acetate, butyl acetate, 1, 3-butylene glycol or ether. According to another embodiment of the present invention, the organic solvent is an alcohol having 2 to 6 carbon atoms. According to another embodiment of the present invention, the organic solvent is ethanol, isopropanol, or acetone.

상기 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합용액에 첨가되는 유기용매의 양은 특별히 한정되지 않고, 이노시톨 혼합용액 대비 0.1 - 9배(v/v)의 범위 내에서 적합한 양을 선택하여 첨가할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 의하면 상기 유기용매는 이노시톨 혼합용액 대비 0.1 - 6배(v/v)의 양으로 첨가된다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면 상기 유기용매는 이노시톨 혼합용액 대비 0.1 - 4배(v/v)의 양으로 첨가한다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면 상기 유기용매는 이노시톨 혼합용액 대비 0.1 - 2배(v/v)양으로 첨가한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면 상기 유기용매는 이노시톨 혼합용액 대비 0.1 - 1.5배(v/v)양으로 첨가한다. The amount of the organic solvent to be added to the mixed solution of the myo-inositol and the D-chiro-inositol is not particularly limited and may be appropriately selected within the range of 0.1 to 9 times (v / v) . According to an embodiment of the present invention, the organic solvent is added in an amount of 0.1 to 6 times (v / v) to the mixed solution of inositol. According to another embodiment of the present invention, the organic solvent is added in an amount of 0.1 to 4 times (v / v) to the mixed solution of inositol. According to another embodiment of the present invention, the organic solvent is added in an amount of 0.1 - 2 times (v / v) to the mixed solution of inositol. According to another embodiment of the present invention, the organic solvent is added in an amount of 0.1 to 1.5 times (v / v) to the mixed solution of inositol.

본 발명에서 유기용매의 첨가에 의해 유도되는 이노시톨 침전물에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 모두 포함되어 있으나, 마이오-이노시톨의 침전율이 더 높으므로, 마이오-이노시톨이 더 많이 포함되어 있다.
In the present invention, the inositol precipitate induced by the addition of the organic solvent contains both of the myo-inositol and the D-chiro-inositol, but since the precipitation rate of the myo-inositol is higher, have.

단계 (b): 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계 Step (b): separating the supernatant from the resulting inositol precipitate

상기 단계 (a)를 통해 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리한다. 상기 이노시톨 침전물은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전물이지만, 마이오-이노시톨이 더 큰 침전율을 나타내므로, D-카이로-이노시톨 보다는 마이오-이노시톨이 더욱 많은 양으로 포함되어 있다. 마이오-이노시톨의 다량 침전으로 인해 상층액 중에는 마이오-이노시톨의 농도가 낮아지게 되며, 반대로 D-카이로-이노시톨의 농도(순도)는 상대적으로 증가하게 된다. 이노시톨 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 또는 원심분리 방법을 사용하며, 바람직하게는 여과 방법을 사용하여 행한다. The supernatant is separated from the inositol precipitate produced in step (a). The inositol precipitate is a precipitate of myo-inositol and D-chiro-inositol, but the amount of myo-inositol is larger than that of D-chiro-inositol, since the myo-inositol exhibits a larger sedimentation rate. The concentration of the myo-inositol in the supernatant is lowered by the large amount of the precipitate of the myo-inositol, while the concentration (purity) of the D-cairo-inositol is relatively increased. Separation of the supernatant from the inositol precipitate is carried out by filtration or centrifugation, preferably by filtration.

단계 (c): 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계 Step (c): The separated supernatant is dried to obtain an inositol powder

상기 단계 (b)에서 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는다. 상기 상층액의 건조는 상층액을 가열하면서 행할 수 있으며, 또는 진공상태에서 행할 수 있다. 상층액을 건조시켜 얻은 이노시톨 건조물에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합되어 있으나, 상기 단계 (a)의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 함유된 용액에서와 비교하여 D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다.
The supernatant separated in the step (b) is dried to obtain an inositol powder. The drying of the supernatant may be carried out while heating the supernatant, or in a vacuum. Inositol and D-chiro-inositol are mixed in the dried product of inositol obtained by drying the supernatant. However, compared with the solution containing the myo-inositol and the D-chiro-inositol in the step (a) The purity of cairo-inositol is increasing.

본 발명의 방법은 상기 단계 (c) 이후에 추가적으로 하기 단계 (d) - 단계 (g)를 더욱 포함할 수 있다. The method of the present invention may further comprise the following step (d) -step (g) after step (c).

단계 (d): 상기 단계 (c)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하는 단계 Step (d): dissolving the inositol powder obtained in the step (c) in water to prepare an aqueous solution

상기 단계 (c)에서 얻은 이노시톨의 분말을 물에 용해시켜 이노시톨이 용해된 수용액을 제조한다. 상기 물은 바람직하게는 증류수이다. 본 발명의 일 구현예에 의하면 상기 이노시톨 분말은 물에 20％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 상기 이노시톨 분말은 물에 0.1％(w/v) 이상 20％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면 상기 이노시톨 분말은 0.1％(w/v) 이상 18％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면 상기 이노시톨 분말은 0.1％(w/v) 이상 15％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다.
The powder of inositol obtained in the step (c) is dissolved in water to prepare an aqueous solution in which inositol is dissolved. The water is preferably distilled water. According to an embodiment of the present invention, the inositol powder is dissolved in water at a concentration of 20% (w / v) or less. According to another embodiment of the present invention, the inositol powder is dissolved in water at a concentration of not less than 0.1% (w / v) and not more than 20% (w / v). According to another embodiment of the present invention, the inositol powder is dissolved at a concentration of not less than 0.1% (w / v) and not more than 18% (w / v). According to another embodiment of the present invention, the inositol powder is dissolved at a concentration of 0.1% (w / v) to 15% (w / v) or less.

단계 (e): 상기 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계상기 단계 (d)에서 얻은 이노시톨이 용해된 수용액에 유기용매를 첨가하여 이노시톨의 침전물을 생성시킨다. 상기 유기용매는 상기 단계 (a)에서 설명된 내용과 동일하다. 유기용매는 D-카이로-이노시톨의 침전 보다 마이오-이노시톨의 침전을 더욱 크게 유도할 수 있는 특성을 갖는 것이면 특별하게 한정되지 않는다. 본 발명의 일 구현예에 의하면 상기 유기용매는 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1, 3-부틸렌글리콜 또는 에테르이다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면 상기 유기용매는 탄소수 2-6개의 알코올이다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 상기 유기용매는 에탄올, 이소프로판올, 또는 아세톤이다. 본 발명의 일 구현예에 의하면, 상기 수용액에 첨가되는 유기용매의 양은 수용액 대비 0.1 - 10배(v/v)의 범위 내에서 적합한 양을 선택하여 첨가할 수 있다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면, 유기용매는 수용액 대비 1.5 - 9배(v/v)의 양으로 첨가한다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면, 유기용매는 수용액 대비 9배(v/v)의 양으로 첨가한다. 상기 이노시톨 침전물은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전물이지만, 마이오-이노시톨이 더 큰 침전율을 나타내므로, D-카이로-이노시톨 보다는 마이오-이노시톨이 더욱 많은 양으로 포함되어 있다.
Step (e): an organic solvent is added to the aqueous solution to produce an inositol precipitate. An organic solvent is added to the inositol- dissolved aqueous solution obtained in step (d) to produce a precipitate of inositol. The organic solvent is the same as described in step (a) above. The organic solvent is not particularly limited as long as it has properties capable of inducing the precipitation of the myo-inositol to a greater extent than the precipitation of the D-cairo-inositol. According to one embodiment of the present invention, the organic solvent is an alcohol, acetone, ethyl acetate, butyl acetate, 1, 3-butylene glycol or ether. According to another embodiment of the present invention, the organic solvent is an alcohol having 2 to 6 carbon atoms. According to another embodiment of the present invention, the organic solvent is ethanol, isopropanol, or acetone. According to an embodiment of the present invention, the amount of the organic solvent to be added to the aqueous solution may be appropriately selected in the range of 0.1 to 10 times (v / v) relative to the aqueous solution. According to another embodiment of the present invention, the organic solvent is added in an amount of 1.5 to 9 times (v / v) to the aqueous solution. According to another embodiment of the present invention, the organic solvent is added in an amount of 9 times (v / v) relative to the aqueous solution. The inositol precipitate is a precipitate of myo-inositol and D-chiro-inositol, but the amount of myo-inositol is larger than that of D-chiro-inositol, since the myo-inositol exhibits a larger sedimentation rate.

단계 (f): 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계 Step (f): separating the supernatant from the resulting inositol precipitate

상기 단계 (e)를 통해 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리한다. 이노시톨 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 또는 원심분리 방법을 사용하며, 바람직하게는 여과방법을 사용하여 행한다. 이노시톨 침전물에는 마이오-이노시톨이 다량 포함되어 있으므로 상층액에는 D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다.
The supernatant is separated from the inositol precipitate produced through step (e). Separation of the supernatant from the inositol precipitate is carried out by filtration or centrifugation, preferably by filtration. Since the inositol precipitate contains a large amount of myo-inositol, the purity of D-cairo-inositol is increased in the supernatant.

단계 (g): 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계 Step (g): The separated supernatant is dried to obtain an inositol powder

상기 단계 (f)에서 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는다. 상기 상층액의 건조는 상층액을 가열하면서 행할 수 있으며, 또는 진공상태에서 행할 수 있다. 상층액을 건조시켜 얻은 이노시톨 건조물에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합되어 있으나, D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다.
The supernatant separated in the step (f) is dried to obtain an inositol powder. The drying of the supernatant may be carried out while heating the supernatant, or in a vacuum. The dried inositol obtained by drying the supernatant is mixed with myo-inositol and D-chiro-inositol, but the purity of D-chiro-inositol is increased.

본 발명의 방법은 상기 단계 (c) 이후에 추가적으로 하기 단계 (d)′- 단계 (f)′를 더욱 포함할 수 있다.
The method of the present invention may further comprise the following step (d) '-step (f)' after step (c).

단계 (d)′: 상기 단계 (c)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 수용액을 제조하고 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계 Step (d): dissolving the inositol powder obtained in the step (c) in water to prepare an aqueous solution and to produce an inositol precipitate

상기 단계 (c)에서 얻은 이노시톨의 분말을 물에 용해시켜 이노시톨이 용해된 수용액을 제조한다. 상기 물은 바람직하게는 증류수이다. 본 발명의 일 구현예에 의하면 상기 이노시톨 분말은 물에 20％(w/v) 초과의 고농도로 용해시킨다. 본 발명의 다른 구현예에 의하면 상기 이노시톨 분말은 물에 20％(w/v) 초과 80％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 본 발명의 또 다른 구현예에 의하면 상기 이노시톨 분말은 물에 30％(w/v) 이상 70％(w/v) 이하의 농도로 용해시킨다. 하기 구체적인 실시예에 의하면, 물에 대한 마이오-이노시톨의 용해도는 최대 약 15％ 이며, D-카이로-이노시톨의 용해도는 최대 약 55％이므로, 상기 단계 (c)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 70％의 농도로 용해시키는 경우 마이오-이노시톨은 최대 15％ 농도로 용해될 것이며, 나머지 용해되지 않은 마이오-이노시톨은 침전물로 생성된다. D-카이로-이노시톨은 최대 55％의 용해도이므로 모든 D-카이로-이노시톨이 물에 용해된다. The powder of inositol obtained in the step (c) is dissolved in water to prepare an aqueous solution in which inositol is dissolved. The water is preferably distilled water. According to an embodiment of the present invention, the inositol powder is dissolved in water at a high concentration of more than 20% (w / v). According to another embodiment of the present invention, the inositol powder is dissolved in water at a concentration of not less than 20% (w / v) and not more than 80% (w / v). According to another embodiment of the present invention, the inositol powder is dissolved in water at a concentration of 30% (w / v) to 70% (w / v) or less. According to the following specific examples, the solubility of myo-inositol to water is at most about 15% and the solubility of D-chiro-inositol is at most about 55%. Therefore, the inositol powder obtained in step (c) %, The myo-inositol will dissolve to a maximum concentration of 15%, and the remaining undissolved myo-inositol will be precipitated. Since D-cairo-inositol has a solubility of up to 55%, all D-chiro-inositol dissolves in water.

단계 (e)′: 상기 수용액에서 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계 Step (e): separating the supernatant from the inositol precipitate produced in the aqueous solution

상기 단계 (d)′에서 생성된 이노시톨의 침전물로부터 상층액을 분리한다. 이노시톨 침전물로부터 상층액의 분리는 여과 또는 원심분리 방법을 사용하며, 바람직하게는 여과방법을 사용하여 행한다. 이노시톨 침전물에는 대부분이 마이오-이노시톨이 포함되어 있을 것이며, 상층액에는 D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다.
The supernatant is separated from the precipitate of inositol produced in step (d). Separation of the supernatant from the inositol precipitate is carried out by filtration or centrifugation, preferably by filtration. Most of the inositol precipitates will contain myo-inositol, and the purity of D-cairo-inositol in the supernatant is increased.

단계 (f)′: 상기 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계 Step (f): Step of drying the supernatant to obtain an inositol powder

상기 단계 (e)′에서 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는다. 상기 상층액의 건조는 상층액을 가열하면서 행할 수 있으며, 또는 진공상태에서 행할 수 있다. 상층액을 건조시켜 얻은 이노시톨 건조물에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합되어 있으나, D-카이로-이노시톨의 순도가 증가되어 있다. 하기 구체적인 일 실시예에 의하면, 상기 단계 (d)′에서 이노시톨 분말을 물에 약 70％(w/v)의 농도로 용해시킨 경우 건조된 분말에서의 D-카이로-이노시톨의 순도는 약 70％ 이상이 될 것이다.
The supernatant separated in the step (e) 'is dried to obtain an inositol powder. The drying of the supernatant may be carried out while heating the supernatant, or in a vacuum. The dried inositol obtained by drying the supernatant is mixed with myo-inositol and D-chiro-inositol, but the purity of D-chiro-inositol is increased. According to one embodiment of the present invention, when the inositol powder is dissolved in water at a concentration of about 70% (w / v), the purity of D-chiro-inositol in the dried powder is about 70% Or more.

본 발명의 이점 및 특징을 요약하면 다음과 같다. The advantages and features of the present invention are summarized as follows.

(i) 본 발명은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 혼합용액으로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다. (i) The present invention relates to a method for purifying D-chiro-inositol in high purity from a mixed solution of myo-inositol and D-chiro-inositol.

(ⅱ) 본 발명의 방법은 마이오-이노시톨와 D-카이로-이노시톨의 용해도 차이 원리에 기초한 것이다. (Ii) The method of the present invention is based on the solubility difference principle of myo-inositol and D-chiro-inositol.

(ⅲ) 본 발명의 방법에서 유기용매를 첨가하여 D-카이로-이노시톨의 용해도 감소 보다 마이오-이노시톨의 용해도를 더 크게 감소시켜 결과적으로 D-카이로-이노시톨 보다 마이오-이노시톨의 침전을 더 크게 유도한다. (Iii) In the method of the present invention, the solubility of the myo-inositol is further reduced by the addition of the organic solvent to the solubility of the D-chiro-inositol, resulting in a larger precipitation of the myo-inositol than the D- .

(ⅳ) 본 발명의 방법은 유기용매의 첨가, 상층액 분리(여과) 및 건조와 같은 간단한 공정을 사용하므로 저비용으로 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합용액으로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 분리 정제할 수 있다. (Iv) The method of the present invention uses D-cairo-inositol from a mixed solution of myo-inositol and D-cairo-inositol at a low cost by using a simple process such as addition of an organic solvent, It can be separated and purified with high purity.

(v) 본 발명의 방법에 의하면 분리된 D-카이로-이노시톨로부터 분리된 마이오-이노시톨은 기질로서 재사용이 가능하다.
(v) According to the method of the present invention, the myo-inositol separated from the separated D-chiro-inositol can be reused as a substrate.

본 발명은 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도 차이를 이용하여 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 혼합용액으로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 정제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 이노시톨의 혼합용액에 유기용매 첨가, 이노시톨 침전의 유도, 상층액의 분리, 및 상층액의 건조와 같은 간단한 공정을 통해 저비용으로 D-카이로-이노시톨의 순도를 크게 높일 수 있는 이점이 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면 분리된 마이오-이노시톨은 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생산하는 방법에서 기질로서 재사용이 가능하다.
The present invention relates to a method for purifying D-chiro-inositol with high purity from a mixed solution of myo-inositol and D-chiro-inositol using the difference in solubility between myo-inositol and D-chiro-inositol. The method of the present invention is advantageous in that the purity of D-cairo-inositol can be greatly increased at low cost through a simple process such as addition of an organic solvent to a mixed solution of inositol, induction of inositol precipitation, separation of supernatant, . In addition, according to the method of the present invention, the separated myo-inositol can be reused as a substrate in the method of producing D-chiro-inositol from myo-inositol.

도 1은 입체이성질체인 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 구조를 보여준다.
도 2는 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 혼합용액으로부터 D-카이로-이노시톨을 고순도로 정제하는 본 발명의 정제 공정을 보여준다.
도 3은 25℃ 증류수에서 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도를 보여준다. ■: 마이오-이노시톨의 용해도, ○: D-카이로-이노시톨의 용해도.
도 4는 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 용해되어 있는 다양한 종류의 혼합 용액(물, 식염수, 효소반응완충액, M9 배지, 및 TB 배지)에 에탄올을 첨가하여 이노시톨을 침전시킨 후 상층액내 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 농도를 측정한 결과이다. ■: 마이오-이노시톨의 농도, ○:D-카이로-이노시톨의 농도.
도 5는 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 용해되어 있는 다양한 종류의 혼합 용액(물, 식염수, 효소반응완충액, M9 배지, 및 TB 배지)에 에탄올을 첨가한 경우 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전율을 나타낸다. ■: 마이오-이노시톨의 침전율, ○: D-카이로-이노시톨의 침전율.
도 6은 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 용해되어 있는 다양한 종류의 용매 혼합 용액인 물, 식염수, 효소반응완충액, M9 배지, 및 TB 배지에 에탄올을 첨가하여 이노시톨을 침전시킨 후 얻은 상층액을 건조하여 얻은 이노시톨 분말 중의 D-카이로-이노시톨의 순도를 측정한 결과를 보여준다.
도 7은 1차 에탄올을 첨가하여 얻은 상층액의 건조 분말인 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말을 물에 다시 용해한 경우의 각 이노시톨의 용해 특성을 보여준다. 패널 A는 수용액의 상층액중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 농도를 보여준다. 패널 B는 수용액의 상층액중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 용해도를 보여준다. 패널 C는 수용액의 상층액중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전율을 보여준다. 패널 D는 수용액의 상층액 중의 D-카이로-이노시톨의 순도를 보여준다. ■: 마이오-이노시톨, ○: D-카이로-이노시톨.
도 8은 1차 에탄올을 첨가하여 얻은 상층액의 건조 분말인 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말을 35％ 내지 70％ 사이의 다양한 농도로 물에 다시 용해시켜 얻은 이노시톨 수용액에 다양한 양의 에탄올을 첨가한 후 상층액의 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 농도를 측정한 결과이다. 패널 A는 상층액의 마이오-이노시톨의 농도이다, 패널 B는 상층액의 D-카이로-이노시톨의 농도이다. ■: 35％, ○: 40％, ▲: 45％, ▽: 50％, ◆: 55％, ◁: 60％, ▶: 65％, ☆: 70％.
도 9는 1차 에탄올을 첨가하여 얻은 상층액의 건조 분말인 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말을 35％ 내지 70% 사이의 다양한 농도로 물에 다시 용해시켜 얻은 이노시톨 수용액에 다양한 양의 에탄올을 첨가한 후 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전율을 측정한 결과이다. 패널 A는 마이오-이노시톨의 침전율이다. 패널 B는 D-카이로-이노시톨의 침전율이다. ■: 35％, ○: 40％, ▲: 45％, ▽ : 50％, ◆ : 55％, ◁: 60％, ▶ : 65％, ☆ : 70％.
도 10은 1차 에탄올을 첨가하여 얻은 상층액의 건조 분말(마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말)을 70％ 함유하는 수용액으로 제조하여 침전물을 제거하고 상층액을 재건조하여 D-카이로-이노시톨의 비율이 70％ 이상으로 증가된 이노시톨 건조 혼합물을 10％ 내지 50％ 농도의 수용액으로 재용해한 후 다양한 양의 2차 알코올을 첨가하여 각 이노시톨의 침전양상을 측정한 결과이다. 패널 A는 상층액 중의 마이오-이노시톨의 농도이다. 패널 B는 상층액 중의 D-카이로-이노시톨의 농도이다. 패널 C는 마이오-이노시톨의 침전율이다. 패널 D는 D-카이로-이노시톨의 침전율이다. ■: 10％, ○: 20％, ▲: 30％, ▽: 40％, ◆: 50％.
도 11은 1차 에탄올을 첨가하여 얻은 상층액의 건조 분말(마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말)을 약 12％ 함유하는 수용액에 다양한 양의 에탄올을 첨가한 경우의 침전 및 정제 특성을 측정한 결과이다. 패널 A는 상층액 중의 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 농도를 측정한 결과이다. 패널 B는 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전율을 측정한 결과이다. 패널 C는 상층액내의 D-카이로-이노시톨의 순도를 나타낸 결과이다. ■: 마이오-이노시톨, ○: D-카이로-이노시톨. 도 12는 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 약 13:2의 중량비율로 용해된 M9 최소배지에 다양한 유기용매를 첨가한 경우에 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 침전 특성을 측정한 결과이다. 패널 A는 에탄올, 이소프로판올 및 아세톤을 첨가한 경우의 침전특성이다. 여기에서 흰색 막대는 마이오-이노시톨의 농도를, 진회색 막대는 D-카이로-이노시톨의 농도를 나타낸다. 패널 B는 에탄올에 대한 이소프로판올 및 아세톤의 상대적인 침전 특성을 보여준다. 여기에서 연회색 막대는 D-카이로-이노시톨이고, 진회색 막대는 마이오-이노시톨을 나타낸다.
Figure 1 shows the structure of the stereoisomers myo-inositol and D-chiro-inositol.
2 shows the purification process of the present invention in which D-chiro-inositol is highly purified from a mixed solution of myo-inositol and D-chiro-inositol.
Figure 3 shows the solubilities of myo-inositol and D-chiro-inositol in distilled water at 25 ° C. ■: solubility of myo-inositol, ○: solubility of D-cairo-inositol.
FIG. 4 shows the results of inoculating ethanol with various kinds of mixed solutions (water, saline, enzyme reaction buffer, M9 medium, and TB medium) in which myo-inositol and D-chiro- Inositol, and D-cairo-inositol. ■: concentration of myo-inositol, ○: concentration of D-cairo-inositol.
5 is a graph showing the results of measurement of the concentration of myo-inositol and D (2-chloro-4-methyl-2-oxo- - indicates the sedimentation rate of cairo-inositol. ■: sedimentation rate of myo-inositol, ○: sedimentation rate of D-cairo-inositol.
FIG. 6 is a graph showing the results obtained by adding ethanol to water, saline solution, enzyme reaction buffer, M9 medium and TB medium, which are various kinds of solvent mixture solutions in which myo-inositol and D- And the purity of D-chiro-inositol in the inositol powder obtained by drying the solution was measured.
FIG. 7 shows dissolution characteristics of each inositol when the mixed powder of the dry powder of the supernatant obtained by adding the primary ethanol and the mixture of the myo-inositol and the D-cairo-inositol is re-dissolved in water. Panel A shows the concentrations of myo-inositol and D-chiro-inositol in the supernatant of aqueous solution. Panel B shows the solubilities of myo-inositol and D-chiro-inositol in the supernatant of aqueous solution. Panel C shows the sedimentation rates of myo-inositol and D-chiro-inositol in the supernatant of aqueous solution. Panel D shows the purity of D-chiro-inositol in the supernatant of aqueous solution. ■: myo-inositol, ○: D-cairo-inositol.
Fig. 8 is a graph showing the results obtained by dissolving mixed powder of myo-inositol and D-chiro-inositol, which are dried powders of the supernatant obtained by addition of primary ethanol, in water at various concentrations of 35% to 70% And the concentration of myo-inositol and D-chiro-inositol in the supernatant after adding positive ethanol. Panel A is the concentration of myo-inositol in the supernatant, and Panel B is the concentration of D-chiro-inositol in the supernatant. : 35%, O: 40%, ▲: 45%, ▽: 50%, ◆: 55%, ◁: 60%, ▶: 65%, ☆: 70%.
Fig. 9 is a graph showing the results obtained by dissolving mixed powders of myo-inositol and D-chiro-inositol, which are dried powders of the supernatant obtained by adding primary ethanol, in water at various concentrations of 35% to 70% Inositol and D-chiro-inositol after the addition of an adequate amount of ethanol. Panel A is the sedimentation rate of the myo-inositol. Panel B is the sedimentation rate of D-cairo-inositol. : 35%, O: 40%, ▲: 45%, ▽: 50%, ◆: 55%, ◁: 60%, ▶: 65%, ☆: 70%.
10 is a graph showing the results of the measurement of the concentration of D-cysteine-inositol in the aqueous solution containing 70% of the dried powder (mixed powder of myo-inositol and D-cairo-inositol) of the supernatant obtained by adding the primary ethanol, removing the precipitate, - Inositol dry mixture in which the ratio of cairo-inositol was increased to 70% or more was redissolved in an aqueous solution of 10% to 50% concentration, and various amounts of secondary alcohol were added to measure the inositol precipitation pattern. Panel A is the concentration of myo-inositol in the supernatant. Panel B is the concentration of D-chiro-inositol in the supernatant. Panel C is the sedimentation rate of the myo-inositol. Panel D is the sedimentation rate of D-cairo-inositol. : 10%, O: 20%, ▲: 30%, ▽: 40%, ◆: 50%.
11 shows the results of precipitation and purification in the case where various amounts of ethanol were added to an aqueous solution containing about 12% of dry powder (mixed powder of myo-inositol and D-chiro-inositol) of the supernatant obtained by adding primary ethanol This is the result of measuring the characteristics. Panel A is the result of measuring the concentrations of myo-inositol and D-chiro-inositol in the supernatant. Panel B shows the results of measuring the sedimentation rates of myo-inositol and D-chiro-inositol. Panel C shows the purity of D-chiro-inositol in the supernatant. ■: myo-inositol, ○: D-cairo-inositol. 12 shows the precipitation characteristics of myo-inositol and D-chiro-inositol when various organic solvents were added to the M9 minimal medium in which the ratio of myo-inositol and D-chiro-inositol was dissolved in a weight ratio of about 13: . Panel A is the sedimentation characteristics when ethanol, isopropanol and acetone are added. The white bars show the concentration of myo-inositol and the dark gray bars show the concentration of D-cairo-inositol. Panel B shows the relative precipitation characteristics of isopropanol and acetone for ethanol. Wherein the light gray bar is D-cairo-inositol and the dark gray bar represents myo-inositol.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples. It is to be understood by those skilled in the art that these embodiments are only for describing the present invention in more detail and that the scope of the present invention is not limited by these embodiments in accordance with the gist of the present invention .

실시예 Example

실시예Example 1 : 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도 측정  1: Solubility measurement of myo-inositol and D-chiro-inositol

마이오-이노시톨(myo-inositol, MI)과 D-카이로-이노시톨(D-chiro-inositol, DCI)의 용해도를 측정하였다. 먼저 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨을 상온(약 25℃)에서 1차 증류수에 각각 5％(w/v) 내지 80％(w/v)의 농도가 되도록 용해시켰다. 각 용액에서 용해되지 않고 침전된 부분을 원심분리를 통하여 분리하고 이노시톨이 완전히 용해된 상층액 부분을 취하여 각각의 농도를 HPLC로 분석하였다. 분석조건은 HPLC(Shimadzu LC10Avp)를 이용하여, Kromasil 5NH2 칼럼(4.6 mm X 250 mm), 이동상 75％ 아세토니트릴, 칼럼 온도 40℃, RI 검출기를 이용하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다. 마이오-이노시톨(MI)의 용해도는 25℃에서 약 15％(w/v)로 나타났으며, D-카이로-이노시톨(DCI)의 경우 약 55％(w/v) 전후로 나타나, 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해도 차이가 매우 큰 것으로 확인하였다.
The solubilities of myo-inositol (MI) and D-chiro-inositol (DCI) were measured. First, the myo-inositol and the D-chiro-inositol were dissolved in the primary distilled water at a room temperature (about 25 ° C.) to a concentration of 5% (w / v) to 80% (w / v). The undissolved portions of each solution were separated by centrifugation, and the supernatant fraction in which the inositol was completely dissolved was analyzed for each concentration by HPLC. The analytical conditions were as follows: Kromasil 5NH2 column (4.6 mm X 250 mm), mobile phase 75% acetonitrile, column temperature 40 ° C, RI detector using HPLC (Shimadzu LC10Avp). The results are shown in Fig. The solubility of myo-inositol (MI) was about 15% (w / v) at 25 ° C and about 55% (w / v) for D- It was confirmed that the difference in solubility between inositol and D-chiro-inositol was very large.

실시예 2 : D-카이로-이노시톨의 고순도 정제를 위한 1차 에탄올 처리 Example 2: Primary ethanol treatment for high purity purification of D-chiro-inositol

마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합액은 마이오-이노시톨을 기질로하여 D-카이로-이노시톨을 생산하는 다양한 방법을 통해 얻어진다. 예를 들어, 마이오-이노시톨 트랜스포터(myo-inositol transporter), 이노시톨 디하이드로게나아제(inositol dehydrogenase) 및 이노소스 이소머라아제(inosose isomerase)를 발현하도록 형질전환된 재조합 세포를 기질인 마이오-이노시톨을 포함하는 배지에서 배양하는 경우 배양한 배지에는 반응하고 남은 마이오-이노시톨과 반응 생성물인 D-카이로-이노시톨이 혼합된 이노시톨 혼합용액이 만들어진다. 또한, 상기 효소를 발현하도록 형질전환된 재조합 세포의 휴면세포를 마이오-이노시톨을 포함하는 최소배지에서 접종하여 마이오-이노시톨을 D-카이로-이노시톨로 전환하는 방법의 경우에도 배양한 최종 배양 산물에 반응하고 남은 마이오-이노시톨과 반응 생성물인 D-카이로-이노시톨의 이노시톨 혼합물이 만들어진다. 또한, 마이오-이노시톨 트랜스포터, 이노시톨 디하이드로게나아제 및 이노소스 이소머라아제의 효소를 사용하여 기질인 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생성시키는 효소 반응방법의 반응을 완료한 최종 반응산물에 반응하고 남은 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 혼합된 혼합 용액이 만들어진다. 상기 D-카이로-이노시톨의 제조방법에서 반응 생성물내의 생성물인 D-카이로-이노시톨의 최종 평형 농도는 약 14％이므로, 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 최종 반응 혼합물에서 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨은 약 86:14의 비율로 존재한다. 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 생성하는 반응전의 반응액내에서 기질인 마이오-이노시톨은 물에 대한 용해도를 고려할 때 약 150 g/L의 농도로 포함되며, 반응 완료후 반응 생성물에는 129g/L의 마이오-이노시톨과 21g/L의 D-카이로-이노시톨이 포함되어 있다. 이노시톨의 혼합액은 재조합 세포를 사용한 발효방법인 경우 발효가 완료된 완전배지, 예를 들어 TB (terrific broth)일 수 있으며, 휴면세포를 이용한 전환법인 경우 M9 최소배지 또는 식염수일 수 있으며, 효소반응법인 경우 효소반응의 완충액이 될 수 있다. 이와 같은 다양한 반응액의 조성에서 에탄올을 첨가하여 마이오-이노시톨(MI)과 D-카이로-이노시톨(DCI)의 분리를 시험하였다. 발효방법의 경우를 실험하기 위해서 0.5％(w/v) 락토오스, 12.9％(w/v) 마이오-이노시톨, 2.1％(w/v) D-카이로-이노시톨을 첨가한 TB 배지[terrific broth, 1.2％(w/v) 트립톤, 2.4％ 효모추출물, 0.4％ 글리세롤, 0.17M K2HPO4, 0.72M KH2PO4]를 사용하였다. 휴면세포 전환법의 경우를 실험하기 위해서 0.5％(w/v) 락토오스, 12.9％(w/v) 마이오-이노시톨, 2.1％(w/v) D-카이로-이노시톨을 첨가한 M9 최소배지[6.4％(w/v) Na2HPO4ㆍ7H2O, 1.5％(w/v) KH2PO4, 0.25％(w/v) NaCl, 0.5％(w/v) NH4Cl, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2]와, 0.5％(w/v) 락토오스, 12.9％(w/v) 마이오-이노시톨, 2.1％(w/v) D-카이로-이노시톨을 첨가한 식염수(0.85％ NaCl)를 사용하였다. 효소반응법의 경우를 실험하기 위해서 50 mM Tris-HCl (pH8.0), 1 mM MgSO4, 0.1 mM MnSO4, 0.5 mM NAD의 조성의 반응 완충액에 12.9％(w/v) 마이오-이노시톨, 2.1％(w/v) D-카이로-이노시톨을 첨가하여 사용하였다. 대조구로서는 12.9％(w/v) 마이오-이노시톨, 2.1％(w/v) D-카이로-이노시톨이 포함된 증류수를 사용하였다. The mixed solution of myo-inositol and D-cairo-inositol is obtained through various methods for producing D-chiro-inositol using myo-inositol as a substrate. For example, recombinant cells transformed to express myo-inositol transporter, inositol dehydrogenase, and inosose isomerase can be transformed into myo-inositol transporter, myo-inositol transporter, In the case of culturing in a medium containing inositol, an inositol mixed solution containing a mixture of the remaining myo-inositol and the reaction product D-chiro-inositol is produced in the cultured medium. Further, even in the case of inoculating dormant cells of the recombinant cells transformed to express the enzyme into a minimal medium containing mi-inositol to convert the myo-inositol into D-chiro-inositol, the final culture product And inositol mixtures of the remaining myo-inositol and the reaction product D-chiro-inositol are made. In addition, a final reaction in which an enzyme reaction method for producing D-chiro-inositol from a substrate, myo-inositol, is performed using an enzyme of a myo-inositol transporter, inositol dehydrogenase and inosone isomerase A mixed solution of the mixture of the remaining myo-inositol and D-chiro-inositol is produced. The final equilibrium concentration of D-chiro-inositol, the product of the reaction product in the preparation of D-chiro-inositol, is about 14%, so that the final reaction mixture of the myo-inositol and D-chiro- The D-chiro-inositol is present in a ratio of about 86:14. In the reaction solution before the reaction for producing D-chiro-inositol from the myo-inositol, the substrate, myo-inositol, is contained at a concentration of about 150 g / L in consideration of the solubility in water. / L of myo-inositol and 21 g / L of D-chiro-inositol. Inositol may be a complete medium in which fermentation has been completed, for example, TB (terrific broth) in the case of a fermentation method using recombinant cells, or M9 minimal medium or saline in the case of using a dormant cell, It can be a buffer for enzymatic reaction. Separation of myo-inositol (MI) and D-chiro-inositol (DCI) was tested by adding ethanol to the composition of the various reaction solutions. In the case of the fermentation method, a TB culture medium supplemented with 0.5% (w / v) lactose, 12.9% (w / v) myo-inositol and 2.1% (w / v) D- 1.2% (w / v) tryptone, 2.4% yeast extract, 0.4% glycerol, 0.17 MK 2 HPO 4 , 0.72 M KH 2 PO 4 ]. In the case of the dormant cell transformation method, M9 minimal medium supplemented with 0.5% (w / v) lactose, 12.9% (w / v) myo-inositol and 2.1% (w / v) D- (W / v) NaCl, 0.5% (w / v) NH 4 Cl, 2 mM (w / v) NaH 2 HPO 4揃 7H 2 O, 1.5% (w / v) KH 2 PO 4 , MgSO 4 and 0.1 mM CaCl 2 ) and saline (0.85% w / v) supplemented with 0.5% (w / v) lactose, 12.9% (w / v) NaCl) was used. In the case of the enzyme reaction method, 12.9% (w / v) myo-inositol was added to the reaction buffer having a composition of 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM MgSO 4 , 0.1 mM MnSO 4 , , And 2.1% (w / v) D-chiro-inositol. As a control, distilled water containing 12.9% (w / v) myo-inositol and 2.1% (w / v) D-chiro-inositol was used.

상기 제조한 이노시톨 혼합액에 에탄올을 가하여, 이노시톨 혼합액 : 에탄올의 비율이 각각 10:0, 9:1(0.11배), 8:2(0.25배), 7:3(0.43배), 6:4(0.67배), 5:5(1배), 4:6(1.5배), 3:7(2.33배), 2:8(4배), 1:9(9배)로 되도록 하여 완전히 혼합한 후 실온(약 25℃)에서 1시간 동안 진탕하였다. 이를 3,500 rpm에서 30분간 원심분리한 후 상층액을 취하여 HPLC로 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 농도를 분석하였다. HPLC분석 방법은 실시예 1에서 설명된 방법과 같다. 분석한 결과는 도 4, 도 5 및 도 6에 나타내었다. Ethanol was added to the prepared inositol mixture so that the ratio of inositol mixture and ethanol was 10: 0, 9: 1, 0.1: 1, 8: 2, 0.25, (3 times), 2: 8 (4 times), and 1: 9 (9 times), respectively. And shaken at room temperature (about 25 DEG C) for 1 hour. After centrifugation at 3,500 rpm for 30 minutes, the supernatant was taken and the concentration of myo-inositol and D-chiro-inositol was analyzed by HPLC. The HPLC analysis method is the same as that described in Example 1. The results of the analysis are shown in Figs. 4, 5 and 6.

도 4는 각 이노시톨 혼합액에 에탄올 첨가한 후 생성된 침전물을 제거하여 얻은 상층액내에 남아있는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 농도를 나타낸 것이다. 마이오-이노시톨의 경우, 모든 배지 조건에서 에탄올 첨가량에 따라 농도가 빠르게 감소하여, 약 1 배수의 에탄올을 첨가한 경우 마이오-이노시톨은 초기 126 g/L 농도로부터 약 99 g/L이 침전되어 약 27 g/L의 마이오-이노시톨이 남아 있는 것으로 나타났다. 이에 비해, D-카이로-이노시톨의 감소량은 매우 낮아서 약 1 배수의 에탄올을 첨가하면 초기 17 g/L의 농도에서 15 g/L으로 감소되어 약 2 g/L만이 침전되는 것으로 나타났다. FIG. 4 shows the concentrations of the myo-inositol and the D-chiro-inositol remaining in the supernatant obtained by removing precipitates produced after adding ethanol to each inositol mixture. In the case of myo-inositol, the concentration rapidly decreased according to the amount of ethanol added in all the medium conditions. When approximately one-fold of ethanol was added, about 99 g / L of the myo-inositol was precipitated from the initial 126 g / L concentration About 27 g / L of myo-inositol remained. In contrast, the reduction of D-chiro-inositol is very low, and when approximately one-fold of ethanol is added, it decreases to 15 g / L at the initial concentration of 17 g / L, indicating that only about 2 g / L is precipitated.

상기 도 4에 나타난 결과를 침전율로 환산하여 도 5에 나타내었다. 마이오-이노시톨의 침전율은 에탄올 첨가량에 따라 급격히 증가하였으며, 1 배수의 에탄올을 첨가하였을 때 모든 반응액 조건에서 비교적 유사하게 70-80％의 침전율을 보였고, 약 2.5 배 이상의 에탄올 첨가 조건에서는 대부분의 마이오-이노시톨이 침전되는 것을 확인하였다. 이에 반하여 D-카이로-이노시톨의 침전율은 배지조건에 따라서 약간 다르게 나타났다. 약 1 배의 에탄올을 첨가할 때까지는 비교적 유사하게 전체적으로 약 15％ 이하의 침전율을 보였으나, 1.5 배 이상의 에탄올을 첨가한 경우 물, 식염수, 효소반응 완충액의 경우보다 M9 배지와 TB 배지에서 침전율이 급격하게 증가하는 양상을 보였다. 이러한 양상은 각 용액에 포함된 염(salt)의 양이 다르기 때문인 것으로 판단되는데, 물, 식염수, 효소반응 완충액에 함유되어있는 염의 양에 비해 M9 배지와 TB 배지에 함유된 염의 양이 더 많기 때문인 것으로 보인다. The result shown in FIG. 4 is converted into the sedimentation rate and is shown in FIG. The precipitation rate of myo - inositol increased rapidly with the addition of ethanol. When 1 - fold ethanol was added, the precipitation rate of 70 - 80% was comparatively similar under all reaction conditions. It was confirmed that the myo-inositol precipitated. On the contrary, the precipitation rate of D-cairo-inositol was slightly different depending on the medium conditions. The precipitation rate in the M9 medium and the TB medium was higher than that in the water, saline, and enzyme reaction buffer when ethanol of 1.5 times or more was added. And showed a rapid increase. This is because the amount of salt contained in each solution is different because the amount of salt contained in M9 medium and TB medium is larger than the amount of salt contained in water, saline, and enzyme reaction buffer Seems to be.

상기 도 4 및 도 5에 나타난 실험 결과를 토대로 D-카이로-이노시톨의 순도를 계산하여 도 6에 나타내었다. D-카이로-이노시톨의 순도는 1 배수의 에탄올을 첨가하였을 경우 모든 종류의 배양액에서 35-40％ 정도로 나타났으며, 그 이상의 양의 에탄올을 첨가하면 순도가 증가하지만, D-카이로-이노시톨의 손실율이 커지게 된다. 이상의 결과를 종합하면, 약 1 배수의 에탄올을 첨가할 경우 모든 종류의 배양액 조건에서 약 80％의 마이오-이노시톨이 침전되고, 이때 D-카이로-이노시톨의 침전율, 즉 손실율은 15％ 이하로 나타났으며, 초기 14％ 정도이었던 D-카이로-이노시톨의 순도를 약 30-40％로 증가시킬 수 있었다. 에탄올 첨가량이 1 배수를 초과할 경우 D-카이로-이노시톨의 침전율(손실율)이 급격히 증가므로, 약 1 배수의 에탄올을 첨가하는 경우 D-카이로-이노시톨의 손실율을 최소로 하면서 마이오-이노시톨을 침전시켜 분리 및 제거할 수 있을 것으로 기대된다. 상기한 실험에서 이노시톨이 혼합된 배양액에 대하여 약 1 배수의 에탄올을 첨가하여 침전시켰을 경우 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 비율은 약 63:37 정도인 것으로 나타났다.
Based on the experimental results shown in FIGS. 4 and 5, the purity of D-cairo-inositol was calculated and shown in FIG. The purity of D-cairo-inositol was about 35-40% in all kinds of cultures when 1-fold of ethanol was added. The purity of D-cairo-inositol increased with the addition of more ethanol, . As a result, about 80% of the myo-inositol precipitates in all kinds of culture conditions when the ethanol is added at about 1 time, and the precipitation rate of D-chiro-inositol, that is, the loss rate is below 15% And the purity of D-cairo-inositol, which was about 14% initially, could be increased to about 30-40%. When the amount of ethanol added exceeds 1, the precipitation rate (loss ratio) of D-chiro-inositol rapidly increases. Therefore, when ethanol is added in an amount of about one-fold, ethanol is precipitated with minimal loss of D- So that it can be separated and removed. In the above experiment, the ratio of myo-inositol to D-chiro-inositol was found to be about 63:37 when ethanol was added to about 1-fold amount of ethanol in the culture solution containing inositol.

실시예 3 : 1차 에탄올 처리 후 상층액의 농축 건조 및 재용해 Example 3: Concentration of supernatant after primary ethanol treatment Drying and redissolution

상기 실시예 2에서 설명된 방법과 같이, 이노시톨 혼합액에 동량(1:1)의 에탄올을 혼합한 후 침전물을 제거하여 얻은 상층액을 80℃로 가열하고 진공 상태에서 농축 및 건조하였다. 건조후 얻은 이노시톨의 건조 분말(마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 분말)을 15％ - 70％의 다양한 농도로 증류수에 용해시켜 각 농도에서의 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해 특성을 관찰하였다. HPLC를 이용한 이노시톨의 분석 방법은 실시예 1에서 설명된 내용과 동일하다. 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해특성을 분석한 결과는 도 7에 나타내었다. The inositol mixture was mixed with an equal volume of ethanol (1: 1) and the precipitate was removed. The supernatant was heated to 80 ° C, concentrated under vacuum, and dried. The dried powder of inositol (mixed powder of myo-inositol and D-chiro-inositol) obtained after drying was dissolved in distilled water at various concentrations of 15% to 70% to prepare a mixture of myo-inositol and D-cairo- Were observed. The analytical method of inositol using HPLC is the same as that described in Example 1. The dissolution characteristics of myo-inositol and D-cairo-inositol were analyzed and are shown in Fig.

도 7의 패널 A는 각 농도별 용액의 상층액 농도, 즉 용해도를 나타낸 것으로 마이오-이노시톨의 용해도의 경우 상기 실시예 2에서 나타난 바와 같이 약 15％ 이상으로는 더 증가하지 않는 것을 확인할 수 있었다. 한편, D-카이로-이노시톨의 경우 용해도가 약 55％이므로 건조분말을 70％ 농도로 용해시킨 경우에서도 모든 D-카이로-이노시톨이 용해된 것을 확인할 수 있었다. 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 용해특성을 용해도와 침전율로 표시한 결과는 각각 도 7의 패널 B와 패널 C에 나타내었다. 마이오-이노시톨은 약 20％ 용액부터 용해도가 감소하기 시작하여 용액의 농도가 증가할수록 계속적으로 감소하였고, 침전율은 용액의 농도가 증가함에 따라 증가하였다. D-카이로-이노시톨의 경우 용해도는 용액의 농도가 70％인 경우에 이르기까지 100％을 유지하였으며, 이에 따라 침전율도 0％로서 전혀 침전되지 않는 것으로 나타났다. 결론적으로 최대 70％ 용액을 제조하는 경우 마이오-이노시톨은 약 13％ 만이 용해되었고, D-카이로-이노시톨은 모두 용해되었다. 이때 D-카이로-이노시톨의 경우 순도는 약 73％ 정도인 것으로 측정되었다(도 7의 패널 D).
In FIG. 7, panel A shows the concentration of the solution in the supernatant solution, that is, the solubility of the solution. It was confirmed that the solubility of the myo-inositol did not increase more than about 15% as shown in Example 2 . On the other hand, since D-cairo-inositol has a solubility of about 55%, it was confirmed that all the D-cairo-inositol was dissolved even when the dry powder was dissolved at a concentration of 70%. The dissolution profiles of the myo-inositol and the D-cairo-inositol as solubility and sedimentation rate are shown in Panel B and Panel C of FIG. 7, respectively. The solubility of the myo - inositol began to decrease from about 20% solution, and it decreased continuously as the solution concentration increased. The precipitation rate increased with increasing solution concentration. In the case of D-chiro-inositol, the solubility was maintained at 100% until the concentration of the solution was 70%, indicating that the sedimentation rate was 0% and that no precipitation occurred at all. As a result, only about 13% of the myo-inositol was dissolved and D-cairo-inositol was completely dissolved when the 70% solution was prepared. At this time, the purity of D-chiro-inositol was measured to be about 73% (panel D in FIG. 7).

실시예 4 : 2차 에탄올 처리에 따른 정제 특성 Example 4: Purification characteristics by secondary ethanol treatment

실시예 3에서 제조한 각 농도별 혼합용액에서 마이오-이노시톨에 대한 포화용액, 즉, 마이오-이노시톨이 충분히 침전되기 시작하는 농도인 35％ 이상이 되는 농도의 각 용액에 에탄올을 첨가량을 달리하여 첨가하였다. 에탄올 첨가 후 침전물은 원심분리를 통하여 제거하고 상층액에 존재하는 이노시톨을 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC를 이용한 분석 방법은 실시예 1의 방법과 동일하였다. 이노시톨 농도를 분석한 결과는 도 8에 나타내었다. In the mixed solution prepared in Example 3, ethanol was added to each solution of the saturated solution for the myo-inositol, that is, the concentration at which the concentration of the myo-inositol began to sufficiently precipitate, which was more than 35% Lt; / RTI > After the addition of ethanol, the precipitate was removed by centrifugation and the inositol present in the supernatant was analyzed by HPLC. The analytical method using HPLC was the same as that of Example 1. The results of analyzing the inositol concentration are shown in Fig.

도 8의 패널 A는 상층액 중의 마이오-이노시톨 농도를 나타낸 것이며, 마이오-이노시톨의 용해도가 15％를 넘지 않으므로 에탄올을 첨가함에 따라 마이오-이노시톨이 침전되는 양상을 보여주고 있다. 에탄올을 첨가함에 따라 마이오-이노시톨의 농도가 급격히 감소하며, 2 배수의 에탄올 첨가시 많은 양의 마이오-이노시톨이 제거된 것을 확인할 수 있었다. 65％ 및 70％ 농도 용액의 경우 1 배수의 에탄올을 첨가한 경우 마이오-이노시톨이 제거되기 시작하였고, 이보다 낮은 농도의 용액의 경우에도 1.5 배의 에탄올을 첨가함에 따라 마이오-이노시톨이 제거되기 시작함을 확인하였다. Panel A of FIG. 8 shows the concentration of the myo-inositol in the supernatant. Since the solubility of the myo-inositol does not exceed 15%, it shows the manner in which the myo-inositol precipitates upon addition of ethanol. The concentration of myo-inositol rapidly decreased with the addition of ethanol, and it was confirmed that a large amount of myo-inositol was removed by the addition of ethanol twice. In the case of the 65% and 70% concentration solutions, the addition of 1-fold amount of ethanol started to remove the myo-inositol. In the case of the lower amount of the solution, 1.5-fold increase in the amount of ethanol resulted in the removal of the myo-inositol .

도 8의 패널 B은 D-카이로-이노시톨의 상층액내의 농도를 나타낸 것이며, D-카이로-이노시톨의 경우에도 적은 양의 에탄올이 첨가되면서 급격히 침전되는 것으로 나타났다. 마이오-이노시톨에서와 마찬가지로 65％ 및 70％ 농도 용액의 경우 1 배수의 에탄올부터 D-카이로-이노시톨이 침전되기 시작하였고, 1.5 배수의 에탄올에서 대부분의 침전이 일어났다. 용액의 농도가 낮을 경우, 즉 35％ 또는 40％에서는 침전의 정도가 미약하였으나, 약 2 배의 에탄올을 첨가하면서부터는 고농도의 용액에서와 비슷한 수준으로 침전이 일어남을 확인하였다. Panel B in FIG. 8 shows the concentration in the supernatant of D-chiro-inositol, and even in the case of D-chiro-inositol, a small amount of ethanol was added and precipitated rapidly. As in the case of myo-inositol, 65% and 70% concentration solutions started to precipitate from one-fold of ethanol to D-chiro-inositol, and most of the precipitation occurred in 1.5-fold of ethanol. When the concentration of the solution was low, that is, at 35% or 40%, the degree of precipitation was weak, but it was confirmed that precipitation occurred at a level similar to that of the high concentration solution after adding about 2 times of ethanol.

상기 실험결과로부터 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 함께 고농도로 존재하는 경우에는 에탄올을 첨가하여 마이오-이노시톨로부터 D-카이로-이노시톨을 분리하는 것이 용이하지 않다는 것을 알 수 있었다. From the above experimental results, it was found that it is not easy to separate D-chiro-inositol from myo-inositol by adding ethanol when the concentration of myo-inositol and D-chiro-inositol is high.

도 9는 도 8에 나타낸 이노시톨의 농도를 침전율로 환산하여 나타낸 것이다. 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨 모두 에탄올이 첨가됨에 따라 급격히 침전율이 증가하는 것으로 나타났으며, 침전율에 대하여 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨에서 침전율의 증가양상은 유사하게 나타났다. 도 9로 나타낸 결과에 의해서도 1차 에탄올을 처리후 얻은 침전물을 제거하고 건조한 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 건조물을 35％ 이상의 고농도로 재용해시킨 후 에탄올을 첨가하는 방법을 통해서는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨을 분리하는 것이 용이하지 않은 것으로 확인되었다.
FIG. 9 shows the conversion of the concentration of inositol shown in FIG. 8 into the sedimentation rate. Both the myo-inositol and the D-cairo-inositol increased rapidly with the addition of ethanol. The sedimentation rate of the myo-inositol and D-cairo-inositol increased rapidly. According to the results shown in Fig. 9, the precipitate obtained after the treatment with the primary ethanol was removed, and the dried mixture of the dried myo-inositol and the D-cairo- It has been confirmed that it is not easy to separate the myo-inositol and the D-chiro-inositol through the method of re-dissolving at a high concentration and then adding ethanol.

실시예Example 5 : D-카이로-이노시톨 비율이 높아진 다양한 농도의 용액에 대한 2차 에탄올 처리에 따른 정제 특성  5: Purification characteristics by secondary ethanol treatment on various concentrations of D-cairo-inositol solution

실시예 3에서 1차 에탄올 처리 후 침전물을 제거하여 얻은 상층액을 건조한 이노시톨 분말을 증류수에 용해시켜 약 70％농도의 이노시톨 용액을 만들었을 경우 마이오-이노시톨의 용해도의 한계 때문에 D-카이로-이노시톨의 순도가 약 73％까지 상승한다는 것을 확인하였다(도 7의 패널 D 참조). 이어서, 1차 에탄올 처리 후 얻은 건조한 이노시톨 분말을 약 70％ 농도로 용해시킨 용액의 상층액을 다시 건조하여, D-카이로-이노시톨의 비율(순도)이 70％ 이상으로 높아진 이노시톨의 건조 혼합물을 얻고, 이를 10％ 내지 50％ 농도로 증류수에 다시 용해하였다. 이 수용액에 2차 에탄올을 다양한 첨가량으로 첨가하여 정제 특성을 확인하였다. 이 실험은 D-카이로-이노시톨의 순도가 높을 경우 에탄올 처리에 의하여 침전되는 양상을 확인하기 위한 것이다. 실험결과는 도 10에 나타내었다. 도 10의 패널 A와 패널 B에는 D-카이로-이노시톨의 비율이 70％ 이상으로 높을 경우 에탄올의 첨가량을 0.5배 - 4배 까지 첨가한 경우에서 상층액의 마이오-이노시톨 농도와 D-카이로-이노시톨의 농도를 측정한 결과가 나타나 있다. 이노시톨 혼합물의 농도가 높을수록 적은 양의 에탄올에서 침전이 이루어졌으며, 에탄올 첨가량을 달리하면서 나타난 침전양상은 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨에서 차이가 없었다. 각 이노시톨 화합물에 대한 침전율을 환산하여 도 10의 패널 C와 패널 D에 나타내었다. 약 3배 이상의 에탄올 첨가량에서 마이오-이노시톨이 약간 침전되는 양상을 나타냈으나, 그 비율이 20％ 미만으로서 실제 D-카이로-이노시톨의 순도에 미치는 영향은 미미한 것으로 나타났다. 상기 실험결과에 의해 D-카이로-이노시톨의 농도가 높은 혼합물, 또는 이노시톨 혼합물의 농도가 높은 용액에서 에탄올 첨가에 의한 용해도 차이로 D-카이로-이노시톨과 마이오-이노시톨을 분리하는 것은 용이하지 않은 것으로 나타났다. When the inositol powder obtained by removing the precipitate after the primary ethanol treatment in Example 3 was dissolved in distilled water to prepare an inositol solution having a concentration of about 70%, the solubility limit of D-cairo-inositol Was increased to about 73% (see panel D of FIG. 7). Subsequently, the supernatant of the solution obtained by dissolving the dried inositol powder obtained after the primary ethanol treatment at a concentration of about 70% was re-dried to obtain a dry mixture of inositol in which the ratio (purity) of D-chiro-inositol was increased to 70% , And this was dissolved again in distilled water at a concentration of 10% to 50%. Secondary ethanol was added to this aqueous solution in various amounts to confirm purification characteristics. This experiment was conducted to confirm the precipitation of D-cairo-inositol by ethanol treatment when the purity was high. The experimental results are shown in Fig. In panel A and panel B of FIG. 10, when the ratio of D-cairo-inositol was high to 70% or more, when the addition amount of ethanol was 0.5 to 4 times, the concentration of the myo-inositol and the D- The results of measurement of the concentration of inositol are shown. The higher the concentration of the inositol mixture, the smaller the amount of ethanol precipitated, and the difference in the amount of ethanol added did not differ between the myo-inositol and the D-chiro-inositol. Panel C and panel D of FIG. 10 are shown in terms of sedimentation rates for each inositol compound. Although the myo-inositol was slightly precipitated at an ethanol addition rate of about 3 times or more, the effect was less than 20% and the effect on the purity of D-cairo-inositol was negligible. According to the above experimental results, it is not easy to separate D-cairo-inositol and myo-inositol from each other in a solution having a high concentration of D-cairo-inositol or a solution having a high concentration of an inositol mixture due to the difference in solubility by ethanol addition appear.

실시예 6 : 저농도의 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합 건조물 용액에 2차 에탄올을 처리한 경우의 정제 특성 Example 6 Purification Characteristics of Secondary Ethanol-Treated Mixture of Low Concentration Myo-Inositol and D-Cairo-Inositol Solution

마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 혼합 건조물을 저농도인 15％ 이하 농도의 용액으로 제조하여 여기에 에탄올을 첨가하는 실험을 수행하였다. 1차 에탄올 처리 후 상층액의 건조분말이 완전히 녹는 양의 물을 첨가하여 용해시켰으며, 이때 총 이노시톨 함량으로 약 11.5％가 되었고, 각각의 농도는 마이오-이노시톨 75 g/L 및 D-카이로-이노시톨 40 g/L 이었다. 이 혼합용액에 에탄올을 최대 19배 까지 첨가하면서 침전 및 분리 양상을 확인하였다. 그 결과는 도 11에 나타내었다. 도 11의 패널 A는 에탄올 첨가 후 상층액의 농도를 나타낸 것이며, 마이오-이노시톨의 경우 약 1 배수의 에탄올을 첨가할 때까지 큰 변화가 없었으나, 1.5 배의 에탄올이 첨가되면 절반 이상의 마이오-이노시톨이 침전되는 것으로 나타났다. 이에 반하여 D-카이로-이노시톨은 1.5 배수의 에탄올에서 약간 침전되는 것으로 나타났으며, 이후에도 침전량이 크게 증가되지는 않았다. 도 11의 패널 B는 침전율을 나타낸 것이며, 마이오-이노시톨의 경우 약 9배의 에탄올을 첨가할 경우 90％ 이상 침전되었으며, 이때 D-카이로-이노시톨의 침전율은 약 20％인 것으로 나타났다. 따라서 약 9 배 양의 에탄올을 첨가하면 대부분의 마이오-이노시톨을 제거하면서 D-카이로-이노시톨 손실율을 20％ 이하로 줄일 수 있고, D-카이로-이노시톨의 순도를 90％ 이상으로 정제 가능하였다(도 11의 패널 C 참조).
An experiment was conducted in which a mixed dried product of myo-inositol and D-cairo-inositol was prepared as a solution having a low concentration of 15% or less and ethanol was added thereto. After the first ethanol treatment, the total amount of inositol was about 11.5%, and the concentrations of the myo-inositol were 75 g / L and D-Cairo - Inositol was 40 g / L. Ethanol was added to the mixed solution up to 19 times, and precipitation and separation patterns were confirmed. The results are shown in Fig. Panel A of FIG. 11 shows the concentration of supernatant after ethanol addition. In the case of myo-inositol, there was no significant change until about one-fold increase in ethanol, but when 1.5-fold increase in ethanol was added, - Inositol was found to precipitate. On the contrary, D-cairo-inositol was found to precipitate slightly in 1.5 times of ethanol, and the sedimentation did not increase much after that. Panel B of FIG. 11 shows the sedimentation rate. In the case of the myo-inositol, about 90% or more of the ethanol was added when about 9 times the amount of ethanol was added, indicating that the sedimentation rate of D-cairo-inositol was about 20%. Therefore, the addition of about 9 times the amount of ethanol can reduce the D-chiro-inositol loss rate to 20% or less while removing most of the myo-inositol, and purify the D-cairo-inositol purity to 90% or more See Fig. 11, panel C).

실시예 7 : 에탄올 이외의 유기용매에 의한 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 선택적 침전 Example 7: Selective precipitation of myo-inositol and D-chiro-inositol by an organic solvent other than ethanol

상기 실시예 1 내지 6의 실험결과에서 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 큰 용해도 차이에 의해 에탄올을 이용한 분리가 가능함을 확인하였다. 2개의 탄소를 갖는 에탄올 이외의 다른 유기용매에 의해서도 이러한 분리가 가능한지 확인하기 위해 탄소수 3개의 알코올인 이소프로판올과 케톤인 아세톤을 이용하여 분리를 시도하였다. 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 혼합용액 제조 시, 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨의 비율은 일반적인 반응평형 도달 농도인 약 13:2로 하였으며, M9 최소배지 조건으로 전체 농도가 약 15％가 되도록 제조하였다. 제조한 이노시톨의 혼합용액에 동일부피의 에탄올, 이소프로판올, 아세톤을 첨가하여 실온에서 1시간 동안 진탕한 후 원심분리하고, 그 상층액을 HPLC로 분석하였다. 결과는 도 12에 나타내었다. 도 12의 패널 A는 실제 상층액에 존재하는 이노시톨의 농도를 나타낸 것이다. 마이오-이노시톨의 경우 에탄올과 이소프로판올은 그 농도가 크게 차이나지 않았으나, 아세톤에서는 약간 낮게 나타났다. D-카이로-이노시톨의 경우, 이소프로판올에서 에탄올에 비해 농도가 낮았던 반면, 아세톤의 경우에는 유기용매를 처리하지 않았던 농도와 같게 나타나 전혀 침전되지 않은 것으로 나타났다. 즉, 이소프로판올은 에탄올과 비교할 때 마이오-이노시톨 침전율은 비슷하고, D-카이로-이노시톨의 침전율(손실율)이 더 높았던 반면, 아세톤은 마이오-이노시톨에 대한 침전율이 더 높고, D-카이로-이노시톨의 손실율이 적은 것으로 보인다. 이는 에탄올의 침전율에 대한 상대값을 나타낸 도 12의 패널 B에서 쉽게 볼 수 있다. 이소프로판올은 에탄올에 대하여 마이오-이노시톨의 침전율은 동일하고, D-카이로-이노시톨의 침전율은 약 0.7 수준으로 높다. 반면 아세톤의 경우는 마이오-이노시톨의 침전율이 약 0.1배 높으며, D-카이로-이노시톨에 대해서는 약 1배 수준이 낮은 것으로 나타났다. 따라서 에탄올 이외의 유기용매가 에탄올과 같이 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨의 분리에 사용할 수 있는 것을 확인하였으며, 아세톤의 경우 에탄올에 비해 그 분리 특성이 유리할 수도 있다는 사실을 확인하였다.
It was confirmed from the results of the experiments of Examples 1 to 6 that the ethanol-based separation can be performed due to the large solubility difference between the myo-inositol and the D-chiro-inositol. Separation was attempted using isopropanol which is a three carbon alcohol and acetone which is a ketone in order to confirm whether this separation is possible by other organic solvents other than ethanol having two carbon atoms. In the preparation of the mixed solution of myo-inositol and D-cairo-inositol, the ratio of the myo-inositol and the D-chiro-inositol was about 13: 2, which is the general reaction equilibrium reached concentration. About 15%. The same volume of ethanol, isopropanol and acetone was added to the mixed solution of inositol, and the mixture was centrifuged at room temperature for 1 hour. The supernatant was analyzed by HPLC. The results are shown in Fig. Panel A of FIG. 12 shows the concentration of inositol present in the actual supernatant. In the case of myo-inositol, ethanol and isopropanol were not significantly different in their concentrations, but slightly lower in acetone. In the case of D-chiro-inositol, the concentration of isopropanol was lower than that of ethanol, whereas the concentration of acetone was the same as that of the organic solvent. That is, isopropanol had a similar sedimentation rate of myo-inositol and higher sedimentation rate (loss rate) of D-cairo-inositol as compared to ethanol, while acetone had a higher sedimentation rate to myo- Of the total loss. This can be easily seen in Panel B of FIG. 12, which shows the relative value of the precipitation rate of ethanol. The precipitation rate of myo-inositol for isopropanol is the same for ethanol, and the precipitation rate of D-chiro-inositol is as high as about 0.7 level. On the other hand, in the case of acetone, the sedimentation rate of myo-inositol was about 0.1 times higher than that of D-cairo-inositol, which was about 1 times lower. Therefore, it has been confirmed that an organic solvent other than ethanol can be used for the separation of myo-inositol and D-chiro-inositol like ethanol, and the separation characteristics of acetone may be advantageous compared to ethanol.

본 발명의 실험 결과를 요약하면 다음과 같다. The experimental results of the present invention are summarized as follows.

(ⅰ) 유기용매 1차 처리 방법에 의하면 D-카이로-이노시톨이 약 30％ 내지 40％의 순도를 갖는 이노시톨 혼합물을 얻을 수 있다. 재조합 세포 발효 방법, 휴면세포 전환 방법, 및 효소반응방법을 통해 얻은 최종 반응액에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨 혼합물이 약 15％의 농도로 용해되어 있고, 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨 비율은 약 13:2으로 용해되어 있다. 여기에 이노시톨이 포함된 혼합용액과 동일한 부피의 유기용매를 첨가하면 마이오-이노시톨을 상대적으로 더 많은 양으로 침전이 유도되고, 상층액에는 마이오-이노시톨과 D-카이로-이노시톨이 약 60:40 비율로 존재하게 된다. 상층액을 건조하면 30％ - 40％의 D-카이로-이노시톨 순도를 갖는 이노시톨 건조혼합물을 얻을 수 있다. (I) According to the first method of treating an organic solvent, an inositol mixture having a purity of about 30% to 40% by D-chiro-inositol can be obtained. In the final reaction solution obtained through the recombinant cell fermentation method, dormant cell conversion method and enzyme reaction method, the mixture of myo-inositol and D-chiro-inositol was dissolved at a concentration of about 15%, and the mixture of myo- The cairo-inositol ratio is about 13: 2. When an organic solvent having the same volume as the mixed solution containing inositol is added, a relatively larger amount of the myo-inositol is precipitated. In the supernatant, the myo-inositol and the D-chiro- 40 ratio. Upon drying the supernatant, a dry mixture of inositol with a purity of D-chiro-inositol of 30% to 40% can be obtained.

(ⅱ) 유기용매 1차 처리 방법에 의해 얻은 D-카이로-이노시톨 30％ - 40％의 순도의 이노시톨 건조 혼합물을 고농도, 예컨대 약 70％의 농도로 물에 용해시켜 생성된 침전물을 제거하고 상층액을 건조시키면 70％ - 80％의 D-카이로-이노시톨 순도를 갖는 이노시톨 건조 혼합물을 얻을 수 있다. (Ii) D-chiro-inositol obtained by an organic solvent first treatment method The inositol dry mixture having a purity of 30% to 40% is dissolved in water at a high concentration, for example, a concentration of about 70%, and the resulting precipitate is removed, Can be dried to obtain an inositol dry mixture having a purity of D-chiro-inositol of 70% to 80%.

(ⅲ) 유기용매 1차 처리 방법에 의해 얻은 D-카이로-이노시톨 30％ - 40％의 순도의 이노시톨 건조 혼합물을 저농도, 예컨대 약 15％의 농도로 물에 용해시키고, 여기에 용액 부피의 7-10배의 유기용매을 첨가하여 다시 침전을 유도한다. 침전물을 제거한 상층액을 건조시키면 90％ 이상의 D-카이로-이노시톨 순도를 갖는 이노시톨 건조 혼합물을 얻을 수 있다. (Iii) D-chiro-inositol obtained by an organic solvent primary treatment method A dried mixture of inositol with a purity of 30% to 40% is dissolved in water at a low concentration, for example, about 15%, and a solution volume of 7- 10 times more organic solvent is added to induce precipitation again. Drying the supernatant from which the precipitate has been removed can yield a dry mixture of inositol having a purity of at least 90% D-chiro-inositol.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. While the present invention has been particularly shown and described with reference to exemplary embodiments thereof, it is to be understood that the same is by way of illustration and example only and is not to be construed as limiting the scope of the present invention. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims (9)

삭제delete 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 함유된 용액으로부터 D-카이로-이노시톨을 90% 이상의 순도로 정제하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는 방법:
(a) 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 함유된 용액에 상기 이노시톨 혼합 용액 대비 0.1 - 1.5배 (v/v)의 에탄올 또는 아세톤을 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계;
(b) 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계;
(c) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계;
(d) 상기 단계 (c)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 0.1 - 15% (w/v) 농도의 이노시톨 수용액을 제조하는 단계;
(e) 상기 이노시톨 수용액에 상기 이노시톨 수용액 대비 8 - 9배(v/v)의 에탄올 또는 아세톤을 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계;
(f) 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및
(g) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
A method for purifying D-chiro-inositol from a solution containing myo-inositol and D-chiro-inositol at a purity of 90% or more, comprising the steps of:
(a) adding 0.1 to 1.5 times (v / v) ethanol or acetone to the solution containing myo-inositol and D-chiro-inositol to the inositol mixed solution to produce an inositol precipitate;
(b) separating the supernatant from the resulting inositol precipitate;
(c) drying the separated supernatant to obtain an inositol powder;
(d) dissolving the inositol powder obtained in the step (c) in water to prepare an aqueous solution of inositol at a concentration of 0.1 to 15% (w / v);
(e) adding an inositol aqueous solution to the inositol aqueous solution at a ratio of 8 to 9 times (v / v) of ethanol or acetone to produce an inositol precipitate;
(f) separating the supernatant from the resulting inositol precipitate; And
(g) drying the separated supernatant to obtain an inositol powder;
삭제delete 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 함유된 용액으로부터 D-카이로-이노시톨을 73%의 순도로 정제하는 방법으로서, 다음의 단계를 포함하는 방법:
(a) 마이오-이노시톨 및 D-카이로-이노시톨이 함유된 용액에 상기 이노시톨 혼합 용액 대비 0.1 - 1.5배(v/v)의 에탄올 또는 아세톤을 첨가하여 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계;
(b) 상기 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계;
(c) 상기 분리한 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계;
(d)′상기 단계 (c)에서 얻은 이노시톨 분말을 물에 용해시켜 65%(w/v) 초과 - 70%(w/v) 이하 농도의 이노시톨 수용액을 제조하고 이노시톨 침전물을 생성시키는 단계;
(e)′상기 수용액에서 생성된 이노시톨 침전물로부터 상층액을 분리하는 단계; 및
(f)′상기 상층액을 건조시켜 이노시톨 분말을 얻는 단계.
A method for purifying D-chiro-inositol at a purity of 73% from a solution containing myo-inositol and D-chiro-inositol, comprising the steps of:
(a) adding 0.1 to 1.5 times (v / v) ethanol or acetone to the solution containing myo-inositol and D-chiro-inositol to the inositol mixed solution to produce an inositol precipitate;
(b) separating the supernatant from the resulting inositol precipitate;
(c) drying the separated supernatant to obtain an inositol powder;
(d) dissolving the inositol powder obtained in step (c) in water to prepare an aqueous inositol solution having a concentration of greater than 65% (w / v) to less than 70% (w / v) to produce an inositol precipitate;
(e) separating the supernatant from the inositol precipitate produced in the aqueous solution; And
(f) drying the supernatant to obtain an inositol powder;
삭제delete 삭제delete 제 2 항 또는 제 4 항에 있어서, 상기 단계 (d) 또는 (d)′에서의 물은 증류수인 것을 특징으로 하는 방법.
The method according to claim 2 or 4, wherein the water in step (d) or (d) is distilled water.
삭제delete 삭제delete
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