JP4474060B2 - D-Allo-5-inosose and process for producing the same and process for producing allo-inositol, D-allo-3-inosose or D-kilo-inositol - Google Patents

Description

または次の立体構造式（Ａ’）

で表される既知の物質である。
【０００３】
また、本発明による新規物質、Ｄ−アロ−５−イノソースは次の平面式（I-1）

または次の平面式（Ｉ-Ｉ’）

または次の立体構造式（Ｉ-2）

または次の立体構造式（Ｉ-2’）

で表される新規の物質である。
【０００４】
さらに、アロ−イノシトールは次の平面式（Ｂ）

または次の立体構造式（Ｂ’）

で表される既知の物質である。
【０００５】
また、Ｄ−アロ−３−イノソースは次の平面式（Ｃ）

または次の立体構造式（Ｃ’）

で表される既知の物質である。
【０００６】
また、Ｄ−キロ−イノシトールは次の平面式（Ｄ）

または、次の立体構造式（Ｄ’）

で表される既知の物質である。
【０００７】
【従来の技術】
イノソース(Inososes, 別名ではPentahydroxycyclohexanonesまたは Alicyclic ketohexoses)は、一般的には、イノシトールの微生物的酸化〔A. J. Kluyver & A. Boezaardt: 「Rec. Trav. Chim.」 58巻、956頁（1939）〕、酵素的酸化〔L. Anderson 等：「Arch. Biochem. Biophys.」 78巻、518頁（1958）〕、白金触媒を用いた空気酸化〔K. Heyns and H. Paulsen:「Chem. Ber.」 86巻、 833頁（1953）〕、硝酸等の酸化剤による酸化〔T. Posternak:「Helv. Chim. Acta」19巻、 1333頁（1936）〕によって合成されることが知られている。
【０００８】
イノシトールのうち、エピ−イノシトールの微生物的酸化あるいは酵素的酸化で生成するイノソースは、これまでＬ−エピ−２−イノソース（別名Ｌ−エピ−イノソース−２）がある〔WO 00/75355号公報〕のみである。エピ−イノシトールを酸化してＤ−アロ−５−イノソースを生成する微生物はこれまで報告されていない。また、アロ−イノシトールの微生物的酸化あるいは酵素的酸化でＤ−アロ−３−イノソースを生成する微生物あるいは酵素はこれまで報告例がない。
【０００９】
イノシトールは、シクロヘキサンから誘導される６価アルコールの総称であり、イノシトールには９種の立体異生体が存在する。天然産イノシトールにはミオ−イノシトール、Ｄ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、ムコ−イノシトール、シロ−イノシトールの５種が見出されている。
【００１０】
Ｄ−キロ−イノシトールは、9種類存在するイノシトール立体異性体の一つで、その製造方法については次の(a)〜(d)などが知られている。
(a) カスガマイシンを分解して、その構成成分であるＤ−キロ−イノシトールを得る方法（強酸による加水分解法（米国特許第5,091,596号）、アセチル化した後に分解する方法（米国特許第5,463,142号）、強酸性イオン交換樹脂による加水分解法（米国特許第5,714,643号））。
(b) グルクロン酸を原料として10段階以上の化学合成ステップを経て、Ｄ−キロ−イノシトールを得る方法（米国特許第5,406,005号）。
(c) ブーゲンビリアなどの植物中に含まれるピニトールを、脱メチル化してD−キロ−イノシトールを調製する方法（米国特許第5,827,896号）。
(d) アグロバクテリウム属細菌により、ミオ−イノシトールから、Ｄ−キロ−イノシトール、Ｌ−キロ−イノシトール、シロ−イノシトール、ネオ−イノシトールの混合物の状態で製造する方法（特開平9-140,388）。
【００１１】
しかしながら、上記(a)〜(c)のＤ−キロ−イノシトールを製造する方法は、いずれも工業的規模で製造する方法としては操作の煩雑さ、あるいはコスト面で問題があり、必ずしも満足し得るものではない。また、(d)の方法は４種のイノシトール立体異性体の混合物が生成するため、特にD、Lイノシトールの分離が困難で精製操作が煩雑である。更に、Ｄ−キロ−イノシトールの最終的な収率は 1 %以下であり、低収率である。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は有用な新規物質としてＤ−アロ−５−イノソースを提供することにある。本発明の別の目的は、安価に製造可能となったエピ−イノシトール（WO 00/75355号公報）を原料として、Ｄ−アロ−５−イノソース、アロ−イノシトール、Ｄ−アロ−３−イノソースを順次経由して、医薬品として有望な、光学純度の高いＤ−キロ−イノシトール（D-chiro-Inositol）を効率よく安価に製造する新規な方法を提供することにある。
【００１３】
Ｄ−キロ−イノシトールは近年、インシュリン非依存性糖尿病の治療剤として（WO 90/10439号公報）あるいは多嚢胞性卵巣症候群の治療剤として(The New England Journal of Medicine、340:1314-1320、1999）有効であることが示され、注目されている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねてきた。その結果、先の研究においては、ミオ−イノシトールをＬ−エピ−２−イノソースに変換する酸化能をもつ微生物として、例えばキサントモナス・エスピーAB10119株あるいはシュードモナス・エスピーAB10215株（PCT/JP00/03687号の国際公開WO 00/75355号公報）の菌体をアロ−イノシトールに作用させると、アロ−イノシトールから定量的にＤ−アロ−３−イノソースが生成することを見出すことができ、またこのＤ−アロ−３−イノソースを水素化ホウ素ナトリウムで還元すると、高収率でＤ−キロ−イノシトールが生成することを見出した。
【００１５】
また、Ｄ−キロ−イノシトールの合成原料となるアロ−イノシトールの安価な製造法の研究の過程においては、今回は、エピ−イノシトールに、ミオ−イノシトールをＬ−キロ−１−イノソースに変換する酸化能をもつ微生物として例えばキサントモナス・エスピーAB10198株あるいはスフィンゴモナス・エスピーAB10233株（特願2000-186337号明細書参照）の菌体を作用させると、エピ−イノシトールから定量的にＤ−アロ−５−イノソースが生成することを見出すことができ、また、このＤ−アロ−５−イノソースを水素化ホウ素ナトリウムで還元すると、高収率でアロ−イノシトールが生成し且つエピ−イノシトールが副生することを見出した。前記の研究で見出されたエピ−イノシトールの微生物的酸化による変換の生成物の一つは、核磁気共鳴スペクトルの解析によりＤ−アロ−５−イノソースと判明し、該物質は新規物質と判明した。
【００１６】
また、アロ−イノシトール及びＤ−キロ−イノシトールの生成収率を向上させる研究の過程で、微生物酸化及び水素化ホウ素ナトリウムでの還元をアロ−イノシトール及びＤ−キロ−イノシトールのそれぞれの製造工程において二回繰り返すことにより、アロ−イノシトール及びＤ−キロ−イノシトールの生成収率がともに約1.5倍向上できることを見出した。前記の諸知見を得て発明を完成するに至った。
【００１７】
アロ−イノシトールの合成原料となるエピ−イノシトールは、安価且つ大量に入手可能なミオ−イノシトールを、微生物的酸化と適当な還元剤による還元との組合せで処理することによって、安価に製造可能となっている（PCT/JP00/03687号の国際公開WO 00/75355号公報参照）。
【００１８】
従って、第１の本発明によると下記の式（Ｉ）

で表されるＤ−アロ−５−イノソースが新規物質として提供される。
【００１９】
式(Ｉ)のＤ−アロ−５−イノソースは下記の物理化学的性状を有する。
（１）外 観： 白色粉末
（２）分子式： C₆H₁₀O₆
（３）分子量： 178
（４）比旋光度： -16° （c 1.0、H₂O、27℃）
（５）^１H-NMR（300MHz、D₂O）：
δ（ppm）：3.49(dd, 1H, J_1,2=3.3Hz, J_1,6=10.5Hz、1-H)、3.95(m, 2H, 2-H)、3.78(t, 1H, J_3,2=J_3,4=3.3Hz, 3-H）、3.68(dd, 1H, J_4,3=3.3Hz, J_4,2=1.6Hz, 4-H)、3.76(d, 1H, J_6,1=10.5Hz, 6-H）
（６）¹³C-NMR(75.5MHz、D₂O）
δ（ppm）：71.9(d、C-1）、75.1(d、C-2）、67.4(d、C-3），77.6(d、C-4）、95.8(s、C-5)、71.5(d、C-6)
（７）溶解性： 水、ジメチルスフォオキシドに可溶である。メタノール、エタノール、アセトンに不溶である。
【００２０】
上記のアロ−５−イノソースの製法として、基本的には、第２の本発明によると、エピ−イノシトールをＤ−アロ−５−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を、エピ−イノシトールに作用させて、前記エピ−イノシトールをＤ−アロ−５−イノソースへ変換させてＤ−アロ−５−イノソースを生成し、さらにＤ−アロ−５−イノソースを回収することからなることを特徴とする、Ｄ−アロ−５−イノソースの製造方法が提供される。この方法では、微量のＬ−エピ−２−イノソースが副生されることもある。
【００２１】
第２の本発明方法に用いられる微生物は、グラム陰性細菌であるシュードモナダセア(Pseudomonadaceae)科のキサントモナス(Xanthomonas)属またはシュードモナス(Pseudomonas)属の細菌、あるいはアセトバクテラセア(Acetobacteraceae)科のアセトバクター(Acetobacter)属またはグルコノバクター(Gluconobacter)属の細菌、あるいはリゾビアセア(Rhizobiaceae)科のアグロバクテリウム(Agrobacterium)属の細菌、あるいはエンテロバクテリアセア(Enterobacteriacea)科のエンテロバクター(Enterobacter)属、セラチア(Serratia)属またはエルシニア(Yersinia)属の細菌、あるいはパスツレラセア(Pasteurellaceae)科のパスツレラ(Pasteurella)属またはヘモフィルス(Haemophilus)属の細菌であることができ、また好ましくは、本発明者らにより分離された新微生物であるキサントモナスsp. AB10198株またはスフィンゴモナスsp. AB10233株であることができる。
【００２２】
上記のAB10198株およびAB10233株の菌学的物質は特願2000-186337号明細書に記載される。なお、前記のAB10198株およびAB10233株の菌学的性質の詳細を後記の表1a、表1b、表1cに記載する。
なお、これら菌株の同定の当たっては、新細菌培地学講座（第２版、近代出版）、医学細菌同定の手引き（第２版、近代出版）、細菌学実習提要（丸善）に準じて実験を行い、そして得られた実験結果を「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）１巻、1984年及び「Microbiology and Immunology」34巻、99頁、1990年、「International J. Systematic Bacteriology」45巻、334頁、1995年等に掲載されている最近の学術論文を参考に判断して、細菌の同定を行った。
【００２３】

【００２４】

【００２５】

【００２６】
AB10198株の主な性状は、次のとおりである。すなわち、本菌株はコロニーが黄色の色素を帯びるグラム陰性の桿菌で、大きさは0.3〜0.5×0.5〜1.6μｍ。本菌株はカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性であり、グルコースを好気的に分解し酸を生成する。本菌株は栄養要求性があり、最少培地にメチオニンを添加すると本菌株は良好に生育する。本菌株の細胞のユビキノン分子種はQ8で、DNAのGC含量は65％であった。
【００２７】
これらの菌学的性質を総合して、本菌株はAB10198株は、キサントモナス（Xanhtomonas）属に属する菌株であると判断した。「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology）１巻、199頁、1984年によると、キサントモナス属細菌には５種のスペシーズ（キサントモナス・カンペストリス；キサントモナス・フラガリアエ；キサントモナス・アルブリネンス；キサントモナス・アキソノポディス；キサントモナス・アメリザ）が知られている。AB10198株の菌学的性状を上記の既知のスペシーズと比較検討した結果、AB10198株はキサントモナス・カンペストリスに最も近縁の種とであると考えられた。しかし、本菌株の菌学的性質はキサントモナス・カンペストリスに完全には一致しなかったので、本AB10198株を公知のものと区別するため、キサントモナス・エスピーAB10198株と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究にFERM P-17893として、寄託した（寄託日は2000年6月12日）。
【００２８】
また、AB10233株の主な性状は次のとおりである。本菌株はコロニーが淡黄色の色素を帯びるグラム陰性の桿菌で、大きさは0.4〜0.8×0.4〜1.6μｍ。本菌株はカタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性であり、グルコースを好気的に分解し酸を生成する。最少培地での本菌株の生育は良好で、栄養要求性が無い。細胞のユビキノン分子種はQ10で、DNAのGC含量は64％であった。また、菌体脂肪酸に２−ヒドロキシ−テトラデカン酸を有し、更に菌体脂質としてスフィンゴ脂質を有していた。これらの菌学的性質を総合すると、本菌株は「Microbiology and Immunology」34巻、99頁、1990年、「International J. Systematic Bacteriology」45巻、334頁、1995年等に記載されているスフィンゴモナス（Sphingomonas）属に最も近縁な細菌であると考えられる。スフィンゴモナス属は上記論文(「Microbiology and Immunology」34巻、99頁、1990年）において初じめて新属として提唱され、現在まで少くとも12新種が提案されている。しかし、AB10233株は、その菌学的性質においてそれらに完全には合致しなかったので、本菌株を公知のものと区別するため、スフィンゴモナス・エスピーAB10233と命名し、工業技術院生命工学工業技術研究所にFERM P-17894として寄託した（寄託日は2000年6月12日）。
【００２９】
第２の本発明方法の第１の具体的方法として、第３の本発明においては、エピ−イノシトールをＤ−アロ−５−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を、エピ−イノシトール並びに炭素源及び窒素源を含有する液体培地で好気的に培養し、その培養中において培養液内で該微生物をエピ−イノシトールに作用させて培養液中にＤ−アロ−５−イノソースを生成、蓄積させ、さらに培養液からＤ−アロ−５−イノソースを回収することを特徴とする、Ｄ−アロ−５−イノソースの製造方法が提供される。この第３の本発明方法を、以下、製造方法（Ａ）という。
【００３０】
第２の本発明方法の第２の具体的方法として、第４の本発明においては、エピ−イノシトールをＤ−アロ−５−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を培地中で培養する工程と、得られた培養物から該微生物の菌体を分離する工程と、該菌体をエピ−イノシトールを含む緩衝液または液体培地に加える工程と、該緩衝液または液体培地中で該菌体をエピ−イノシトールと反応させ、得られた反応液中にＤ−アロ−５−イノソースを生成させる工程と、その反応液からＤ−アロ−５−イノソースを回収する工程を含むことを特徴とする、Ｄ−アロ−５−イノソースの製造方法が提供される。この第４の本発明方法を、以下、製造方法（Ｂ）という。
【００３１】
製造方法（Ａ）(第３の本発明方法)では、エピ−イノシトールを含む液体栄養培地に、所要の酸化能を有する微生物を接種して好気的に培養し、このことにより、Ｄ−アロ−５−イノソースを、生成蓄積させることができる。
【００３２】
使用される液体培地の組成は、目的に達する限り何ら特別の制限はなく、Ｄ−アロ−５−イノソースへの変換されるエピ−イノシトールに加えて、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよい。合成培地・天然培地のいずれも使用できる。培地には、エピ−イノシトールを0.1％〜40％、より好ましくは20〜30％添加し、炭素源としては、グルコース、シュークロース、マルトースあるいは澱粉を0.1％〜20％、より好ましくは0.5〜5％添加し、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を0.01％〜5.0％、好ましくは0.5％〜2.0％添加するのが望ましい。
【００３３】
その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することが有効である。培養液中の水素イオン濃度はpH4〜10、好ましくはpH5〜9に調整し培養すると、効率よくＤ−アロ−５−イノソースを得ることができる。
【００３４】
使用微生物の培養条件は、菌株や培地の種類によっても異なるが、培養温度は5〜40℃、好ましくは20〜37℃であり、また、培養は液体培地を振とうしたり、液体培地中に空気を吹き込むなどして好気的に行えば良い。培養期間は、培養液中にエピ−イノシトールが完全に消失し、且つ、Ｄ−アロ−５−イノソースが最大の蓄積量を示すまで行えば良く、通常1〜14日、好ましくは3〜10日である。
【００３５】
培養液から目的物のＤ−アロ−５−イノソースを採取する方法は、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち、培養液から菌体を除去した後、培養上清液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理することにより、Ｄ−アロ−５−イノソースを回収することができ、それら以外の不純物をほとんど除くことができる。しかし、強塩基性陰イオン交換樹脂のOH⁻型はＤ−アロ−５−イノソースを化学変化させるので使用することはできない。
【００３６】
Ｄ−アロ−５−イノソースを専ら含む溶液を濃縮することによってＤ−アロ−５−イノソースを粉末として単離することができる。
【００３７】
製造方法（Ｂ）（第４の本発明方法）では、所要の酸化能を有する微生物を培養し、培養物から分離して得られた菌体を、エピ−イノシトールを溶解、含有する緩衝液または液体培地中に添加し、その中で反応させ、エピ−イノシトールからＤ−アロ−５−イノソースを生成させるものである。
【００３８】
菌体としては、製造方法（Ａ）の過程で得た培養液から分離して集めた菌体を用いることができる。また、前記微生物を別途適当な培養条件で培養して得た菌体を用いてもよい。集菌は、培養液から遠心分離、濾過等公知の方法により行えばよい。
添加された菌体をエピ−イノシトールと反応させる反応媒質としては、液体培地、緩衝液などよりなる水性媒質が用いられる。液体培地としては、製造方法（Ａ）におけるものと同様のものを用いてもよく、また別途に前記微生物を培養した液体培地をそのまま用いてもよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド（Good’s）のCHES緩衝液等を10〜500mM、好ましくは20〜100mMの濃度で用いればよい。溶液中のエピ−イノシトールの濃度は0.1〜40％程度とするのが好ましい。
【００３９】
菌体とエピ−イノシトールとの反応条件は、菌株や培地、緩衝液の種類によって異なるが、反応温度は5〜60℃、好ましくは10〜45℃であり、反応時間は1〜50時間、好ましくは3〜48時間であり、液体培地または緩衝液のpHは2〜10、好ましくは3〜9である。
反応終了後の反応液からの目的物質を回収する方法は、製造方法（Ａ）と同様に行えばよい。
【００４０】
さらに、アロ−イノシトールの新規な製法として、基本的には、第５の本発明においては、Ｄ−アロ−５−イノソースを溶解、含有する水性媒質に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加する工程と、該還元剤で該水性媒質中のＤ−アロ−５−イノソースを還元する反応を行い、これによりアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを該水性媒質内で生成する工程と、その得られた還元反応からアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを回収する工程と、回収されたアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを相互から分離する工程とを有することを特徴とする、アロ−イノシトールの製造方法が提供される。この第５の本発明方法を、以下、製造方法（Ｃ）という。
【００４１】
製造方法（Ｃ）（第５の本発明方法）では、製造方法（Ａ）あるいは製造方法（Ｂ）で得られたＤ−アロ−５−イノソースを、水性媒質例えば水に溶解し、水素化ホウ素ナトリウム等の水系で使用可能な還元剤を添加し、水性媒質中でＤ−アロ−５−イノソースを還元剤で還元させ、アロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを生成させるものである。
【００４２】
水性媒質に溶解されるＤ−アロ−５−イノソースは0.1％〜60％濃度、好ましくは1％〜40％濃度とすることが望ましい。使用される還元剤は、水系中でＤ−アロ−５−イノソースをアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールに還元できる還元剤として、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウム、水素化トリメトキシホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウムであるのが望ましい。この還元剤をＤ−アロ−５−イノソースの溶液に添加する工程を行う。次に還元反応の第２工程を行う。この反応は0℃〜室温で行う。還元反応の反応混合物のpHはpH 4〜pH 10、好ましくはpH 5〜pH8であるのが望ましい。Ｄ−アロ−５−イノソースの消失した時点または反応生成物の生成量が適当になった時点で反応を終了する。これによって、生成されたアロ−イノシトール及び副生されたエピ−イノシトールを含有する水溶液が還元反応の反応液として得られる(第２工程)。
【００４３】
ここで得られた還元反応の反応液から、アロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを回収する第３の工程を次に行う。この第３の工程では、アロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを含有する還元反応液を、不望成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト(登録商標)C-20(Ｈ⁺型)を充填したカラムに通過させ、その通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併して弱塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト(登録商標)A113(OH⁻型)を充填したカラムに通過させ、その通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併してエピ−イノシトール及びアロ−イノシトールを含むがそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を収得する。
【００４４】
製造方法（Ｃ）の最終（第４）工程では、先の第３工程で回収されたアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールの水溶液からアロ−イノシトールとエピ−イノシトールを別々に分離する。このためには、前記の水溶液を濃縮し、得られた濃縮液を、４級アミン基を交換基とするスチレン重合体よりなる強酸性陽イオン交換樹脂（ホウ酸型）、例えばデュオライト(登録商標)A113(ホウ酸型)のカラムに通して、カラム樹脂にアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを吸着させ、ついでカラムを脱イオン水、ついで0.5M濃度のホウ酸水溶液で溶出する方法によって、エピ−イノシトールから目的のアロ−イノシトールを効率よく分離できることが本発明者等によって見出されている。このアロ−イノシトールを含む水溶液を濃縮、乾固することによって、純粋なアロ−イノシトールの粉末を得ることができる。
【００４５】
さらに、エピ−イノシトールから出発してアロ−イノシトールを作る新規な製法として、第６の本発明においては、エピ−イノシトールをＤ−アロ−５−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を、水性媒質中でエピ−イノシトールに作用させて、エピ−イノシトールの変換によりＤ−アロ−５−イノソースを該水性媒質中で生成する工程と、前記の工程で生成されたＤ−アロ−５−イノソースを含有する水性媒質から該微生物の菌体を除去して、得られたＤ−アロ−５−イノソースを含有するが菌体を含まない水性媒質を収得する工程と、菌体を含まない該水性媒質からＤ−アロ−５−イノソースを単離せずに、Ｄ−アロ−５−イノソースを含有する該水性媒質中に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加する工程と、該水性媒質中で該還元剤でＤ−アロ−５−イノソースを還元する反応を行い、Ｄ−アロ−５−イノソースの還元によりアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを生成する工程と、その得られた還元反応液からアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを回収する工程と、回収されたアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを相互から分離する工程とを有することを特徴とする、アロ−イノシトールの製造方法が提供される。この第６の本発明方法を、以下、製造方法（Ｄ）という。
【００４６】
製造方法（Ｄ）（第６の本発明方法）では、簡略的に言えば、先ず製造方法（Ｂ）（第４の本発明方法）を行い、Ｄ−アロ−５−イノソースを含有する菌体反応液を得て、それから、製造方法（Ｂ）で得られたＤ−アロ−５−イノソース含有の菌体反応液から菌体を除き、次いで菌体を含まない反応液から、Ｄ−アロ−５−イノソースを単離することなしに、前記のＤ−アロ−５−イノソース含有反応液に直接、製造方法（Ｃ）で用いる還元剤と同様な水系で使用可能な還元剤を添加し、さらに還元反応を行うことにより、アロ−イノシトールを生成させるものである。
【００４７】
製造方法（Ｄ）の第１工程では、製造方法（Ｂ）の方法に従ってエピ−イノシトールに菌体を反応させることによって、水性媒質中にＤ−アロ−５−イノソースを生成蓄積させる。この第１工程で得られたＤ−アロ−５−イノソースを含有の菌体反応液から遠心分離、濾過等の公知の手段により菌体を除去する工程を行う(第２工程)。次いで、このように菌体を除かれたＤ−アロ−５−イノソース含有の反応液に、還元剤としての水素化物を添加する第３工程を行う。次いでＤ−アロ−５−イノソースの還元反応を行い、これによりアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを生成する工程が行われる(第４工程)。還元反応の条件は製造方法（Ｃ）と同様に行えばよい。反応液からアロ−イノシトールとエピ−イノシトールを収得する工程(第５工程)及びアロ−イノシトールをエピ−イノシトールから分離する第６工程は、製造方法（Ｃ）の第３工程及び第４工程に準じて行うことができる。
【００４８】
なおアロ−イノシトールを効率よく生産させる条件を検討する中で、エピ−イノシトールをＤ−アロ−５−イノソースに変換する酸化能力を有する細菌株が、Ｄ−アロ−５−イノソースの還元により生成するアロ−イノシトールに対して反応しない性質を利用して、製造方法（Ｄ）の第２工程で分離、回収した菌体を、Ｄ−アロ−５−イノソースの還元により副生成されたエピ−イノシトールに再度作用させ、Ｄ−アロ−５−イノソースと不反応のアロ−イノシトールとの混合物の溶液を生成させ、さらにこの溶液から遠心分離、濾過等の手段により菌体を除去して得られた混合溶液に再度、還元剤としての水素化物を添加して、Ｄ−アロ−５−イノソースの還元反応を行い、これにより高濃度のアロ−イノシトールを生成する工程から成る多段階の方法を行うことができること、そしてこの方法が製造方法（Ｄ）の変法として利用できることが判明した。これにより、製造方法（Ｄ）に比べて約1.5倍のアロ−イノシトールを反応溶液中に生成蓄積させることができることが知見された。
【００４９】
従って、第７の本発明においては、エピ−イノシトールをＤ−アロ−５−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を培地で培養する工程と、得られた培養物から該微生物菌体を分離する工程と、該菌体を、エピ−イノシトールを含む緩衝液または液体培地よりなる水性媒質に添加する工程と、該水性媒質中で菌体をエピ−イノシトールに作用させて、エピ−イノシトールの変換によりＤ−アロ−５−イノソースを生成する工程と、前記の工程で生成されたＤ−アロ−５−イノソースを含有する水性媒質から該微生物の菌体を分離、回収して、得られたＤ−アロ−５−イノソースを含有するが菌体を含まない水性媒質を収得する工程と、菌体を含まない該水性媒質からＤ−アロ−５−イノソースを単離せずに、Ｄ−アロ−５−イノソースを含有する該水性媒質中に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加する工程と、該水性媒質中で、該還元剤でＤ−アロ−５−イノソースを還元する反応を行い、この還元反応によりアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを該水性媒質内で生成する工程と、その得られた還元反応液からアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを単離せずに、前記の工程で分離、回収された菌体をその還元反応液に添加する工程と、該反応液中のエピ−イノシトールにその添加菌体を作用させてＤ−アロ−５−イノソースを再び生成し、これにより再び生成されたＤ−アロ−５−イノソースと不反応のアロ−イノシトールと添加菌体とを含有する水性媒質を収得する工程と、前工程からの水性媒質から該添加菌体を除去する工程と、こうして、Ｄ−アロ−５−イノソースと不反応のアロ−イノシトールを含有する菌体を含まない水性媒質を収得する工程と、菌体を含まない該水性媒質からＤ−アロ−５−イノソースを単離せずに、水性媒質中に前記と同じ還元剤を添加する工程と、該水性媒質内で、該還元剤でＤ−アロ−５−イノソースを還元する反応を行い、Ｄ−アロ−５−イノソースの還元反応により、エピ−イノシトールとアロ−イノシトールを該水性媒質内で生成してエピ−イノシトールおよびアロ−イノシトールを高い濃度で含む還元反応液を得る工程と、その還元反応液から、アロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを回収する工程と、回収されたアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを相互から分離する工程とを有することを特徴とする、アロ−イノシトールの製造方法が提供される。この第７の本発明方法を以下、製造方法（Ｅ）という。
【００５０】
製造方法（Ｅ）においては、その各工程は、前記の製造方法（Ｂ）〜（Ｄ）における対応する工程と同様に実施できる。
【００５１】
さらに、Ｄ−アロ−３−イノソースの新規な製法として、第８の本発明においては、アロ−イノシトールをＤ−アロ−３−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を、アロ−イノシトールに作用させて、前記アロ−イノシトールをＤ−アロ−３−イノソースへ変換させてＤ−アロ−３−イノソースを生成させ、さらにＤ−アロ−３−イノソースを回収することからなることを特徴とする、Ｄ−アロ−３−イノソースの製造方法が提供される。この第８の本発明方法を製造方法（Ｆ）という。
【００５２】
製造方法（Ｆ）では、（第８の本発明方法）に使用できるところのアロ−イノシトールをＤ−アロ−３−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物は、グラム陰性細菌であるシュードモナダセア(Pseudomonadaceae)科のキサントモナス(Xanthomonas)属またはシュードモナス(Pseudomonas)属の細菌、あるいはアセトバクテラセア(Acetobacteraceae)科のアセトバクター(Acetobacter)属または、グルコノバクター(Gluconobacter)属の細菌、あるいはリゾビアセア(Rhizobiaceae)科のアグロバクテリウム(Agrobacterium)属の細菌、あるいはエンテロバクテリアセア(Enterobacteriacea)科のエンテロバクター(Enterobacter)属、セラチア(Serratia)属またはエルシニア(Yersinia)属の細菌、あるいはパスツレラセア(Pasteurellaceae)科のパスツレラ(Pasteurella)属またはヘモフィルス(Haemophilus)属等の細菌であることができる。この微生物は、キサントモナス・エスピーAB10119株（FERM BP-7168）あるいはシュードモナス・エスピーAB10215株（FERM BP-7170）であるのが好ましく、その菌学的性質はPCT出願、PCT/JP00/03687号の国際公開WO 00/75355号公報に記載される。これらAB10119株およびAB10215株は日生研ブダペスト条約の規約下に寄託されている。
【００５３】
第８の本発明方法(製造方法（Ｆ）)の第１の具体的方法として、第９の本発明においては、アロ−イノシトールをＤ−アロ−３−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を、アロ−イノシトール並びに炭素源及び窒素源を含有する液体培地で好気的に培養し、その培養液中において該微生物をアロ−イノシトールに作用させて培養液中にＤ−アロ−３−イノソースを生成、蓄積させ、さらにこれを回収することを特徴とする、Ｄ−アロ−３−イノソースの製造方法が提供される。この第９の本発明方法を以下、製造方法（Ｇ）という。
【００５４】
第８の本発明方法の第２の具体的方法としては、第１０の本発明においては、アロ−イノシトールをＤ−アロ−３−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を、培地で培養する工程と、得られた培養物から該微生物の菌体を分離する工程と、該菌体をアロ−イノシトールを含む緩衝液または液体培地に加える工程と、該緩衝液または液体培地中でアロ−イノシトールと反応させ、得られた反応液中にＤ−アロ−３−イノソースを生成させる工程と、さらにこれを回収する工程を含むことを特徴とする、Ｄ−アロ−３−イノソースの製造方法が提供される。この第１０の本発明方法を以下、製造方法（Ｈ）という。
【００５５】
前記の製造方法（Ｆ）では、製造方法（Ｃ）あるいは製造方法（Ｄ）あるいは製造方法(Ｄ)または（Ｅ）の変法等の方法で得られたアロ−イノシトールに、アロ−イノシトールをＤ−アロ−３−イノソースに変換できる酸化微生物を作用させることにより、Ｄ−アロ−３−イノソースを生成させることができる。
【００５６】
前記の製造方法(Ｇ)（第９の本発明方法）で用いられる液体培地の組成は、目的に達する限り何ら特別の制限はなく、Ｄ−アロ−３−イノソースへ変換されるアロ−イノシトール（原料）を含み、またこれに加えて、炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよい。合成培地・天然培地のいずれも使用できる。培地には、アロ−イノシトールを0.1％〜40％、より好ましくは20〜30％添加し、炭素源としては、グルコース、シュークロース、マルトースあるいは澱粉を0.1％〜20％、より好ましくは0.5〜5％添加し、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を0.01％〜5.0％、好ましくは0.5％〜2.0％添加するのが望ましい。
【００５７】
その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することが有効である。培養液中の水素イオン濃度はpH4〜10、好ましくはpH5〜9に調整し培養すると、効率よくＤ−アロ−３−イノソースを得ることができる。
【００５８】
微生物の培養条件は、菌株や培地の種類によっても異なるが、培養温度は5〜40℃、好ましくは20〜37℃であり、また、培養は液体培地を振とうしたり、液体培地中に空気を吹き込むなどして好気的に行えば良い。培養期間は、培養液中にアロ−イノシトールが完全に消失し、且つ、Ｄ−アロ−３−イノソースが最大の蓄積量を示すまで行えば良く、通常1〜14日、好ましくは3〜10日である。
【００５９】
生成されたＤ−アロ−３−イノソースを含有する培養液から目的物を採取する方法は、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち、培養液から菌体を除去した後、培養上清液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理することにより、Ｄ−アロ−３−イノソースを回収でき、それ以外の不純物をほとんど除くことができる。しかし、強塩基性陰イオン交換樹脂のOH⁻型はＤ−アロ−３−イノソースを化学変化させるので使用することはできない。
【００６０】
より具体的には、Ｄ−アロ−３−イノソースが蓄積した培養上清液を、不望成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト(登録商標)C-20(Ｈ^＋型)を充填したカラムに通過させ、その通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併して弱塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト(登録商標)A368S(遊離塩基型)を充填したカラムに通過させ、その通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併して、Ｄ−アロ−３−イノソースを含むがそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を収得する。この溶出液を濃縮することによってＤ−アロ−３−イノソースを粉末として単離することができる。
【００６１】
前記の製造方法（Ｈ）（第１０の本発明方法）では、所要の酸化能を有する微生物を培養し、菌体を分離、回収、回収された菌体を、アロ−イノシトールを含有する緩衝液または液体培地中に添加し、そして反応させ、アロ−イノシトールからＤ−アロ−３−イノソースを生成させるものである。
【００６２】
菌体としては、製造方法（Ｇ）の過程で得た培養液から分離して集めた菌体を用いてもよい。また、前記微生物を別途適当な培養条件で培養して得た菌体を用いてもよい。集菌は、培養液から遠心分離、濾過等公知の方法により行えばよい。
【００６３】
菌体をアロ−イノシトールを反応させる反応媒質としては、液体培地、緩衝液などが用いられる。液体培地としては、製造方法（Ａ）におけるものと同様のものを用いてもよく、また別途に前記微生物を培養した液体培地をそのまま用いてもよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド(Good’s)のCHES緩衝液等を10〜500mM、好ましくは20〜100mMの濃度で用いればよい。反応媒体としての溶液中のアロ−イノシトールの濃度は0.1〜40％程度とするのが好ましい。
【００６４】
反応条件は、菌株や培地、緩衝液の種類によって異なるが、反応温度は5〜60℃、好ましくは10〜45℃であり、反応時間は1〜50時間、好ましくは3〜48時間であり、液体培地または緩衝液のpHは2〜10、好ましくは3〜9である。
反応終了後の反応液からの目的のＤ−アロ−３−イノソースを単離する方法は製造方法（Ｇ）と同様に行えばよい。
【００６５】
さらに、前記の製造方法（Ｆ）〜（Ｈ）で得られたＤ−アロ−３−イノソースを、水中で水素化ホウ素ナトリウム等の水系で使用可能な還元剤で還元させると、Ｄ−キロ−イノシトールを生成させることができる。
【００６６】
従って、アロ−イノシトールから出発してＤ−キロ−イノシトールを作る新規な製法として、基本的には、第１１の本発明においては、アロ−イノシトールをＤ−アロ−３−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を、水性媒質中でアロ−イノシトールに作用させて、アロ−イノシトールのＤ−アロ−３−イノソースへの変換によりＤ−アロ−３−イノソースを生成する工程と、前記の工程で生成されたＤ−アロ−３−イノソースを含有する反応液の水性媒質から該微生物の菌体を除去して、生成されたＤ−アロ−３−イノソースを含有するが菌体を含まない水性媒質を収得する工程と、菌体を含まない該水性媒質からＤ−アロ−３−イノソースを単離せずに、該水性媒質中に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加する工程と、その水性媒質中で、該還元剤でＤ−アロ−３−イノソースを還元する反応を行い、これによりＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールを該水性媒質内で生成する工程と、その還元反応液からＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールを回収する工程と、回収されたＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールを相互から分離する工程とを有することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法が提供される。この第１１の本発明方法を以下、製造方法（Ｉ）という。
【００６７】
上記の製造方法（Ｉ）においては、アロ−イノシトールに微生物を作用させてＤ−アロ−３−イノソースを生成する第１工程は、前記の製造方法（Ｇ）または（Ｈ）におけるアロ−イノシトールに微生物を作用させる工程と同様に行うことができる。得られたＤ−アロ−３−イノソースを含有する培養液または反応液から微生物の菌体を分離、除去する第２工程は、遠心分離、瀘過等の公知方法で行い得る。次いで、得られたＤ−アロ−３−イノソースを含有する水性媒質に還元剤を添加する第３工程を行う。それに続く第４工程としては、還元剤でＤ−アロ−３−イノソースを還元する反応を行うが、この際の反応（水性）媒質に含有されたＤ−アロ−３−イノソースは0.1％〜60％濃度、好ましくは１％〜40％濃度とすることが望ましい。使用される還元剤は、水系中でＤ−アロ−３−イノソースをＤ−キロ−イノシトールに還元できる還元剤として、例えば、製造方法（Ｃ）に示した水素化物であるのが望ましい。還元反応の温度は0℃〜室温で行う。還元反応の反応混合物のpHはpH4〜pH10、好ましくはpH5〜pH8であるのが望ましい。Ｄ−アロ−３−イノソースの消失した時点または反応生成物の生成量が適当になった時点で反応を終了する。これによって、生成されたＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールを含有する水溶液が還元反応の反応液として得られる(第４工程)。
【００６８】
ここで得られた還元反応の反応液からＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールを回収する第５の工程を次に行う。この第５の工程では、Ｄ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールを含有する反応溶液を、不望成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト(登録商標)C-20(Ｈ^＋型)を充填したカラムに通過させ、通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併して弱塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト(登録商標)A113(OH⁻型)を充填したカラムに通過させ、通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併してＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールを含みそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を収得する。
【００６９】
上記の製造方法（Ｉ）の最終の第６工程では、先の第５工程で回収されたＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールの水溶液からＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールを別々に分離する。このためには、前記の水溶液を濃縮し、得られた濃縮液を、スルフォン酸基を交換基とするスチレン重合体よりなる強酸性陽イオン交換樹脂（カルシウム型）、例えばダイアイオン(登録商標)UBK520M（カルシウム型)のカラムを通して、カラムにＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールを吸着させ、ついでカラムを脱イオン水で溶出する方法によって、Ｄ−キロ−イノシトールをアロ−イノシトールから効率よく分離できる。このＤ−キロ−イノシトールを含む水溶液を濃縮し、エタノール水など結晶化することによって、純粋なＤ−キロ−イノシトールの結晶を得ることができる。
【００７０】
Ｄ−キロ−イノシトールを効率よく生成させる条件を検討する中で、アロ−イノシトールをＤ−アロ−３−イノソースに変換する能力を有する前記の細菌株が、Ｄ−アロ−３−イノソースの還元により生成したＤ−キロ−イノシトールに反応しない性質を利用して、前記の製造方法（Ｈ）あるいは製造方法（Ｉ）の第２工程で分離、回収した菌体を、Ｄ−アロ−３−イノソースを還元して副生成するアロ−イノシトールに再度作用させ、Ｄ−アロ−３−イノソースと未反応のアロ−イノシトールの混合溶液を生成させ、遠心分離、濾過等の手段により菌体を除去して得られた混合溶液に再度還元剤としての水素化物を添加して、Ｄ−アロ−３−イノソースの還元反応を行い、これにより高濃度のアロ−イノシトールを生成する工程を行うことができることが見出され、このことを前記の製造方法（Ｉ）の変法として利用できることが判明した。これにより、製造方法（Ｉ）の約1.5倍のＤ−キロ−イノシトールを反応溶液中に生成蓄積させることができることが見出された。
【００７１】
従って、第１２の本発明においては、アロ−イノシトールをＤ−アロ−３−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を培地で培養する工程と、得られた培養物から該微生物菌体を分離する工程と、分離、回収された該菌体をアロ−イノシトールを含む緩衝液または液体培地よりなるの水性媒質中に添加する工程と、該水性媒質でアロ−イノシトールに作用させて、アロ−イノシトールのＤ−アロ−３−イノソースへの変換によりＤ−アロ−３−イノソースを生成する工程と、前記の工程で生成されたＤ−アロ−３−イノソースを含有する反応液の水性媒質から該微生物の菌体を分離、回収する工程と、こうして、Ｄ−アロ−３−イノソースを含有するが菌体を含まない水性媒質を収得する工程と、この工程で得た該水性媒質からＤ−アロ−３−イノソースを単離せずに、Ｄ−アロ−３−イノソースを含有する該水性媒質中に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加する工程と、該還元剤でＤ−アロ−３−イノソースを還元する反応を行い、これによりＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールを該水性媒質内で生成する工程と、その得られた還元反応液からＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールを単離せずに、先の工程で回収された菌体を該還元反応液に添加する工程と、その還元反応液中のＤ−アロ−３−イノソースに添加された菌体を作用させ、Ｄ−アロ−３−イノソースを再び生成させる工程と、この工程で得られた再び生成されたＤ−アロ−３−イノソースと不反応のＤ−キロ−イノシトールを含有する水性媒質から、該微生物の菌体を除去して、生成されたＤ−アロ−３−イノソースと不反応のＤ−キロ−イノシトールとを含有するが菌体を含まない水性媒質を収得する工程と、菌体を含まない該水性媒質からＤ−アロ−３−イノソースを単離せずに、該水性媒質中に前記と同じ還元剤を添加する工程を該水性媒質中で、該還元剤でＤ−アロ−３−イノソースを還元してＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールを生成する反応を行い、これにより、アロ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールを還元反応液中に生成する工程と、こうして得た高濃度でＤ−キロ−イノシトールとアロ−イノシトールを含む還元反応液から、Ｄ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトール及びを回収する工程と、回収されたＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールを相互から分離する工程とを有することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法が提供される。第１２の本発明方法を以下、製造方法（Ｊ）という。
【００７２】
さらに、第１３の本発明においては、エピ−イノシトールをＤ−アロ−５−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を、水性媒質中でエピ−イノシトールに作用させて、エピ−イノシトールの変換によりＤ−アロ−５−イノソース及びＬ−エピ−２−イノソースを生成する工程と、前記の工程で生成されたＤ−アロ−５−イノソースを含有する水性媒質から該微生物の菌体を除去して、得られたＤ−アロ−５−イノソースを含有するが菌体を含まない水性媒質を収得する工程と、菌体を含まないがＤ−アロ−５−イノソースを含む該水性媒質からＤ−アロ−５−イノソースを単離した後に、または単離せずに、Ｄ−アロ−５−イノソースを含有する水性媒質中に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加する工程と、該水性媒質中で、該還元剤でＤ−アロ−５−イノソースを還元する反応を行い、これによりアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを該水性媒質内で生成する工程と、こうして得られたアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを含有する還元反応液の該水性媒質内にアロ−イノシトールをＤ−アロ−３−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を添加する工程と、微生物を該水性媒質中でアロ−イノシトールに作用させて、アロ−イノシトールのＤ−アロ−３−イノソースへの変換によりＤ−アロ−３−イノソースを生成する工程と、前記の工程で生成されたＤ−アロ−３−イノソースと不反応のエピ−イノシトールを含有する反応液の水性媒質から該微生物の菌体を除去して、得られたＤ−アロ−３−イノソースと不反応のエピ−イノシトールとを含有する水性媒質を収得する工程と、該水性媒質からＤ−アロ−３−イノソースを単離した後に、または単離せずに、Ｄ−アロ−３−イノソースを含む水性媒質中に還元剤として上記と同じ還元剤を添加する工程と、その水性媒質中で、該還元剤でＤ−アロ−３−イノソースを還元する反応を行い、これによりＤ−キロ−イノシトールとアロ−イノシトールを該水性媒質内で生成する工程と、こうして得たその還元反応の反応液からＤ−キロ−イノシトールとアロ−イノシトールを回収する工程と、回収されたＤ−キロ−イノシトールとアロ−イノシトールを相互から分離する工程とを有することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法が提供される。第１３の本発明方法を以下、製造方法（Ｋ）という。
【００７３】
さらにまた、第１４の本発明においては、エピ−イノシトールをＤ−アロ−５−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を培地で培養する工程と、得られた培養物から該微生物菌体を分離する工程と、分離、回収された該菌体をエピ−イノシトールを含む緩衝液または液体培地よりなる水性媒質中に添加する工程と、該水性媒質中で添加された菌体をエピ−イノシトールに作用させて、エピ−イノシトールの変換によりＤ−アロ−５−イノソースを生成する工程と、この工程で生成されたＤ−アロ−５−イノソースを含有する水性媒質から該微生物の菌体を分離、回収して、生成されたＤ−アロ−５−イノソースを含有する水性媒質を収得する工程と、該水性媒質からＤ−アロ−５−イノソースを単離せずに、Ｄ−アロ−５−イノソースを含有する該水性媒質中に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加する工程と、該還元剤でＤ−アロ−５−イノソースを還元する反応を行い、Ｄ−アロ−５−イノソースの還元によりアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを該水性媒質内で生成する工程と、その得られた還元反応液からアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを単離せずに、先行の工程で分離、回収された菌体をその還元反応液中に添加する工程と、該還元反応液中で添加された菌体をエピ−イノシトールに作用させ、Ｄ−アロ−５−イノソースを再び生成して、ここで生成されたＤ−アロ−５−イノソースと不反応のアロ−イノシトールを含有する水性媒質を収得する工程と、該水性媒質から該微生物の菌体を除去して、Ｄ−アロ−５−イノソースと不反応のアロ−イノシトールを含有する水性媒質を収得する工程と、Ｄ−アロ−５−イノソースとアロ−イノシトールを含有する該水性媒質からＤ−アロ−５−イノソースを単離せずに、該水性媒質中に前記と同じ還元剤を添加する工程と、その水性媒質中で、該還元剤でＤ−アロ−５−イノソースを還元する反応を行い、Ｄ−アロ−５−イノソースの還元により、エピ−イノシトールとのアロ−イノシトールを生成して、エピ−イノシトールとアロ−イノシトールを高濃度で含む水性媒質を収得する工程と、前記されたアロ−イノシトールをＤ−アロ−３−イノソースへ変換できる酸化能を有する微生物を培養する工程と、得られた培養物から該微生物菌体を分離、回収する工程と、この工程で回収された、該菌体を、先の工程で得られたところのエピ−イノシトールとアロ−イノシトールを高濃度で含有した水性媒質中に添加する工程と、その水性媒質中で添加された菌体をアロ−イノシトールに作用させて、アロ−イノシトールのＤ−アロ−３−イノソースへの変換によりＤ−アロ−３−イノソースを生成して、ここで生成されたＤ−アロ−３−イノソースと不反応のエピ−イノシトールを含有する水性媒質を収得する工程と、この水性媒質から該微生物の菌体を分離、回収して、生成されたＤ−アロ−３−イノソースと未反応のアロ−イノシトールと不反応のエピ−イノシトールを含有する水性媒質を収得する工程と、該水性媒質からＤ−アロ−３−イノソースを単離せずに、Ｄ−アロ−３−イノソースとエピ−イノシトールを含有する該水性媒質中に還元剤として水素化ホウ素アルカリ金属、水素化トリアルコキシホウ素アルカリ金属またはシアン化ホウ素アルカリ金属を添加する工程と、該水性媒質中で該還元剤でＤ−アロ−３−イノソースを還元する反応を行い、Ｄ−アロ−３−イノソースの還元によりＤ−キロ−イノシトールとアロ−イノシトールを生成して、Ｄ−キロ−イノシトールとアロ−イノシトールと不反応のエピ−イノシトールを含有する水性媒質を収得する工程と、その得られた還元反応液からＤ−キロ−イノシトールとアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを単離せずに、前記の工程の回収菌体（アロ−イノシトールをＤ−アロ−３−イノソースに変換できる酸化能を有する微生物の菌体）を該還元反応液に添加する工程と、その還元反応液中のアロ−イノシトールに添加菌体を作用させ、Ｄ−アロ−３−イノソースを再び生成して、ここで生成されたＤ−アロ−３−イノソースと不反応のＤ−キロ−イノシトールとエピ−イノシトールを含有する水性媒質を収得する工程と、水性媒質から該微生物の菌体を除去して、生成されたＤ−アロ−３−イノソースと不反応のＤ−キロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを含有する水性媒質を収得する工程と、該水性媒質からＤ−アロ−３−イノソースを単離せずに、該水性媒質中で前記と同じ還元剤を添加する工程と、該水性媒質中で、該還元剤でＤ−アロ−３−イノソースを還元する反応を行い、これにより、アロ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールを生成し、アロ−イノシトールとＤ−キロ−イノシトールを高濃度で含み且つ不反応のエピ−イノシトールを含む還元反応液を収得する工程と、この工程で得た還元反応液から、Ｄ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを回収する工程と、回収されたＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを相互から分離する工程とを有することを特徴とする、Ｄ−キロ−イノシトールの製造方法が提供される。第１４の本発明方法を以下、製造方法（Ｌ）という。
【００７４】
前記の製造方法（Ｊ）〜（Ｌ）では、エピ−イノシトールからＤ−アロ−５−イノソース、アロ−イノシトール、Ｄ−アロ−３−イノソースを経由して、Ｄ−アロ−５−イノソース、アロ−イノシトール、Ｄ−アロ−３−イノソースをそれぞれ単離することなしに、ワン・ポット法でＤ−キロ−イノシトールを生成させることができる。
【００７５】
製造方法（Ｊ）〜（Ｌ）では、エピ−イノシトールに、エピ−イノシトールをＤ−アロ−５−イノソースに変換する能力を有する微生物を作用させる工程が行われる。これにより、水性媒質中にＤ−アロ−５−イノソースを蓄積させ、次いで、菌体を除く工程が行われる。その後、Ｄ−アロ−５−イノソースを単離することなしに、水系で使用できる適当な還元剤を作用させ、水性媒質中にＤ−アロ−５−イノソースからアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを生成させ、再度、水性媒質中に蓄積しているエピ−イノシトールに前記の回収した菌体を作用させ、水性媒質中にＤ−アロ−５−イノソースを生成し、また未反応のアロ−イノシトールを蓄積させ、菌体を除菌後、再度、還元剤をＤ−アロ−５−イノソースに作用させ、高濃度のアロ−イノシトールを生成蓄積させる諸工程が行われるものである。この製造方法（Ｊ）〜（Ｌ）における微生物的変換及び化学的還元は、より具体的には前述の製造方法（Ｂ）及び製造方法（Ｃ）及び製造方法（Ｄ）及びその変法で説明したと同じ要領で行うことができる。
【００７６】
こうして得られたアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールの混合物を含む水性媒質に、アロ−イノシトールをＤ−アロ−３−イノソースに変換する酸化能力を有する微生物を作用させ、水性媒質中にＤ−アロ−３−イノソース及び不反応のエピ−イノシトールを蓄積させ、次いで、菌体を除いた後、Ｄ−アロ−３−イノソースを単離することなしに、適当な水系で使用できる還元剤を作用させ、水性媒質中にＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトール及び不反応のエピ−イノシトールを生成させる。その後再度、水性媒質中に蓄積しているアロ−イノシトールに前記の回収した菌体を作用させ、水性媒質中にＤ−アロ−３−イノソース及び不反応のＤ−キロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを生成させる。さらに、菌体を除菌後、再度還元剤をＤ−アロ−３−イノソースに作用させ、高濃度のＤ−キロ−イノシトールを生成蓄積させるものである。この際における微生物変換及び還元は、より具体的には前述の製造方法（Ｆ）〜（Ｉ）で説明したと同じ要領で行うことができる。
【００７７】
さらに、上記のようにして得られたＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを含む水性媒質から、Ｄ−キロ−イノシトールを精製単離する。このためには、前記のこの水溶液を濃縮し、得られた濃縮液を、スルフォン酸基を交換基とするスチレン重合体よりなる強酸性陽イオン交換樹脂（カルシウム型）、例えばダイアイオン(登録商標)UBK520M（カルシウム型)のカラムを通して、カラムにＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールを吸着させ、ついでカラムを脱イオン水で溶出することから成る方法によって、Ｄ−キロ−イノシトールを、アロ−イノシトール及びエピ−イノシトールから効率よく分離できる。このＤ−キロ−イノシトールを含む水溶液を濃縮し、エタノール水などで結晶化することによって、純粋なＤ−キロ−イノシトールの結晶を得ることができる。
【００７８】
【発明の実施形態】
以下に、本発明の実施例について具体的に説明する。
【００７９】
【実施例１】
製造方法（Ａ）（第３の本発明方法）によるＤ−アロ−５−イノソースの生成
（１）種培養液の製造
ミオ−イノシトール 0.5％、グルコース 0.5％、酵母エキス 0.3％を含むｐＨ未調整の液体培地100mlを、500ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。その三角フラスコにスフィンゴモナス・エスピーAB10233株（FERM P-17894）あるいはキサントモナス・エスピーAB10198株（FERM P-17893）を接種し、27℃で24時間振とう培養した。この培養液を種培養液とした。
【００８０】
（２）Ｄ−アロ−５−イノソースの生成（第１例）
エピ−イノシトール 12％、グルコース ２％、ミオ−イノシトール 0.5％、酵母エキス 0.6％を含むｐＨ未調整の液体培地100mlを、500ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。その三角フラスコに上記記載の方法で製造したスフィンゴモナス・エスピーAB10233株（FERM P-17894）の種培養液を2ml接種し、27℃で４日間振とう培養した。この培養液を遠心分離（8,000rpm、20分間）し、上清を培養上清液とした。
【００８１】
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析したその結果、培養上清液中にはＤ−アロ−５−イノソースが113mg/ml(変換率95.2％)生成していることがわかった。この時の培養液中にはエピ−イノシトールは検出されなかった。
【００８２】
なお、上記のＤ−アロ−５−イノソースの変換率は、次の計算式により求めた。
変換率（％）＝〔培養上清液１ml中のＤ−アロ−５−イノソースのモル数÷培地１ml中のエピ−イノシトールのモル数〕×100
カラム：Sugar-Pak Ca (Short) : 7.8 × 150mm
カラム温度 : 80℃
検出器 : RI DETECTER ERC-7515A (ERMA CR.INC.)
注入量 : 20μl
溶媒 : 水
溶出時間 : Ｄ−アロ−５−イノソース ; 12.0分
【００８３】
（３）Ｄ−アロ−５−イノソースの単離
実施例１(2)で得た培養上清液を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)C-20(Ｈ^＋型）20mlを充填したカラム(内径1.5cm、長さ30cm)に通過させ、その後このカラムに20mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を、弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)368S（遊離塩基型）40mlを充填したカラム(内径1.5cm、長さ30cm)に通過させ、その後このカラムに40mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。
【００８４】
こうして得られた通過液及び水洗浄液を減圧下で濃縮し、さらに凍結乾燥を行った。その結果、高純度のＤ−アロ−５−イノソースの白色粉末を9.9ｇ得た。この時の精製品回収収率は87.6％、エピ−イノシトールからのＤ−アロ−５−イノソースの全回収率は83.4％であった。
【００８５】
なお、上記Ｄ−アロ−５−イノソースの精製品回収率及びエピ−イノシトールからの全回収率は次式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製単離したＤ−アロ−５−イノソース÷培養上清液100ml中の精製前のＤ−アロ−５−イノソース〕×100
全回収率（％）＝〔精製単離したＤ−アロ−５−イノソースのモル数÷培地に添加したエピ−イノシトールのモル数〕×100
【００８６】
Ｄ−アロ−５−イノソースは下記の物理化学的性状を有する。
（１）外 観： 白色粉末
（２）分子式： C₆H₁₀O_６
（３）分子量： 178
（４）比旋光度： −16°(c 1.0、H₂O、27℃）
（５）¹H-NMR(300MHz、D₂O)
δ(ppm):3.49(dd, 1H, J_1,2=3.3Hz, J_1,6=10.5Hz、1-H)、3.95(m, 2H, 2-H) 、3.78(t, 1H, J_3,2=J_3,4=3.3Hz, 3-H)、3.68(dd, 1H, J_4,3=3.3Hz, J_4,2=1.6Hz、4-H)、3.76(d, 1H, J_6,1=10.5Hz, 6-H)
（６）¹³C-NMR(75.5MHz、D₂O)
δ(ppm):71.9(d, C-1)、75.1(d, C-2)、67.4(d, C-3)、77.6(d, C-4)、95.8(s, C-5)、71.5(d, C-6)
（７）溶解性：水、ジメチルスルフォキシドに可溶である。メタノール、エタノール、アセトンに不溶である。
【００８７】
【実施例２】
製造方法（Ａ）（第３の本発明方法）によるＤ−アロ−５−イノソースの生成（第２例）
エピ−イノシトール 8％、グルコース 0.5％、ミオ−イノシトール 0.5％、酵母エキス 0.45％、KH₂PO₄ 0.02％、K₂HPO₄ 0.18％を含むｐＨ未調整の液体培地100mlを、500ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。その三角フラスコに実施例1 (1)記載の方法で製造したキサントモナス・エスピーAB10198株（FERM P-17893）の種培養液を2ml接種し、27℃で４日間振とう培養した。この培養液を遠心分離（8,000rpm、20分間）し、上清を培養上清液とした。
【００８８】
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析したその結果、培養上清液にはＤ−アロ−５−イノソースが76mg/ml(変換率96.5％)生成していることがわかった。この時の培養液中にエピ−イノシトールは検出されなかった。なお、上記のＤ−アロ−５−イノソースの変換率の計算は、実施例１(2)に準じた。
【００８９】
また、生成したＤ−アロ−５−イノソースの単離は実施例１(3)に準じて行い、Ｄ−アロ−５−イノソースの白色粉末6.5ｇを得た。この時のＤ−アロ−５−イノソースの精製品回収率及びエピ−イノシトールからの全回収率はそれぞれ85.0％、82.0％であった。
【００９０】
なお、上記のＤ−アロ−５−イノソースの精製品回収率及びエピ−イノシトールからの全回収率は実施例１(3)に示した計算式から求めた。
【００９１】
【実施例３】
製造方法（Ｂ）（第４の本発明方法）によるＤ−アロ−５−イノソースの製造例
（１）菌体の生産
ミオ−イノシトール 0.5％、グルコース 0.5％、酵母エキス 0.4％、K₂HPO₄ 0.18％、KH₂PO₄ 0.02％を含むｐＨ未調整の液体培地４Ｌを、500ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコの培地にスフィンゴモナス・エスピーAB10233株（FERM P-17894）を接種し、27℃で３日間振とう培養した。この培養液を遠心分離して得られた菌体を、0.05M リン酸緩衝液（pH7.0) 200mlで洗浄後、再び遠心分離し、洗浄菌体16ｇ(湿重量)を得た。
【００９２】
（２）Ｄ−アロ−５−イノソースの生成
上記により得られた洗浄菌体の全部を、エピ−イノシトール16ｇを溶解、含有した0.05M リン酸緩衝液（pH6.0) の400ml(エピ−イノシトール濃度は40mg/ml)中に加え、27℃、24時間スターラーで攪拌しながら反応させた。反応終了後、反応液を液体クロマトグラフィーにより分析したところ、Ｄ−アロ−５−イノソースが36mg/ml(変換率95.0％)生成、蓄積していた。
【００９３】
なお、上記のＤ−アロ−５−イノソースの変換率は、次式より求めた。
変換率（％）＝〔反応終了後の反応液１ml中のＤ−アロ−５−イノソースのモル数÷反応前の緩衝液１ml中のエピ−イノシトールのモル数〕×100
【００９４】
（３）Ｄ−アロ−５−イノソースの単離
実施例３(2)で得た反応液から菌体を遠心分離で除去した。得られた反応液上清液のうちの100mlを、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)C-20(Ｈ^＋型)20mlを充填したカラム(内径1.5cm、長さ30cm)に通過させ、その後このカラムに20mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を、弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)368S（遊離塩基型）40mlを充填したカラム(内径1.5cm、長さ30cm)に通過させ、その後このカラムに40mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。
こうして得られた通過液及び水洗浄液中には、上記Ｄ−アロ−５−イノソース以外の不純物はほとんど存在していなかった。
【００９５】
上記により得たＤ−アロ−５−イノソース水溶液を減圧下で濃縮し、さらに凍結乾燥を行った。その結果、高純度のＤ−アロ−５−イノソースの白色粉末を2.3ｇ得た。この時のＤ−アロ−５−イノソースの精製品回収収率は61.2％、エピ−イノシトールからのＤ−アロ−５−イノソースの全回収率は58.1％であった。
【００９６】
なお、上記Ｄ−アロ−５−イノソースの精製品回収率は次式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製品として単離したＤ−アロ−５−イノソース量÷反応液100ml中に含まれた精製前のＤ−アロ−５−イノソース量〕×100
また、上記Ｌ−エピ−２−イノソースのエピ−イノシトールからの全回収率は次式により求めた。
全回収率（％）＝〔精製品として単離したＤ−アロ−５−イノソースのモル数÷反応前の溶液に添加したエピ−イノシトールのうち溶液100mlに含まれる該物質のモル数〕×100
【００９７】
【実施例４】
製造方法（Ｃ）（第５の本発明方法）によるアロ−イノシトールの製造例
（１）アロ−イノシトールの生成(第１例)
実施例２の方法に準じて調製したＤ−アロ−５−イノソースの４ｇを脱イオン水100mlに溶かした。得られた水溶液に、水素化ホウ素ナトリウム0.26ｇを徐々に加えた。還元終了後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、還元反応後の反応液は、主に生成したアロ−イノシトールの2.1ｇを含有し、副生成物として、エピ−イノシトールの1.9ｇを含有していることがわかった。アロ−イノシトールとエピ−イノシトールの合計還元収率は98.5％であり、Ｄ−アロ−５−イノソースからのアロ−イノシトールの還元収率は51.9％であった。
【００９８】
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。

【００９９】
上記のＤ−アロ−５−イノソースからのアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールの合計還元収率は次式により求めた。
アロ−イノシトール及びエピ−イノシトールの合計還元収率（％）＝〔還元反応後のアロ−イノシトールのモル数とアロ−イノシトールのモル数の合計÷還元反応前のＤ−アロ−５−イノソースのモル数〕×100
また、上記のＤ−アロ−５−イノソースからのアロ−イノシトールの還元収率は次式により求めた。
アロ−イノシトール還元収率（％）＝〔還元反応後のアロ−イノシトールのモル数÷還元反応前のＤ−アロ−５−イノソースのモル数〕×100
【０１００】
（２）アロ−イノシトールの単離
前項(1)で得た還元反応後の反応液を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)C-20(Ｈ^＋型）20mlを充填したカラム(内径1.5cm、長さ30cm)に通過させ、その後このカラムに20mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)A-113 (OH⁻型）40mlを充填したカラム(内径1.5cm、長さ30cm)に通過させ、その後このカラムに40mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。
【０１０１】
こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併して得られた水溶液は、主生成物としてアロ−イノシトールと、副生成物であるエピ−イノシトールを含有するが、これら以外の不純物をほとんど含有しなかった。
【０１０２】
上記により得たアロ−イノシトールとエピ−イノシトールの水溶液を減圧下で20mlまで濃縮し、その濃縮液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト (登録商標)A116（ホウ酸型）100mlを充填したカラム(内径３cm、長さ30cm)に通過させ、その後このカラムに脱イオン水を通過させ、次いで0.5Ｍホウ酸水を通過させて溶出した。該カラムの脱イオン水による溶出液及び0.5Ｍホウ酸水による溶出液はアロ−イノシトールのみが含まれていた。脱イオン水及びホウ酸水で溶出された両方の水溶液を濃縮乾固させ、この乾固物にメタノールを過剰量加え、加温しつつ減圧濃縮させた。ホウ酸をメタノールとともに共沸除去した。この操作で高純度のアロ−イノシトールの白色粉末を１．４ｇ得た（精製回収率69.0％)。この時のＤ−アロ−５−イノソースからのアロ−イノシトールの全回収率は35.8％であった。
【０１０３】
なお、上記アロ−イノシトールの精製回収率は次式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製単離したアロ−イノシトール量÷反応液100ml中の精製前のアロ−イノシトール量〕×100
また、上記アロ−イノシトールのＤ−アロ−５−イノソースからの全回収率は次式により求めた。
全回収率（％）＝〔精製単離したアロ−イノシトールのモル数÷反応前の溶液に添加したＤ−アロ−５−イノソースのモル数〕×100
【０１０４】
【実施例５】
製造方法（Ｅ）（第７の本発明方法）によるアロ−イノシトールの製造例
（１）アロ−イノシトールの生成
(i) 実施例３の(1)、(2)の方法を反復した。これで得たＤ−アロ−５−イノソース含有の反応液上清液のうちの100mlを分取した。これを５Ｍ塩酸にてｐＨを６に調整後、水素化ホウ素ナトリウム0.26ｇを徐々に加え還元反応を行った。還元終了後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにより実施例４(1)に記載した条件で分析した。その結果、還元反応後の反応液は、生成したアロ−イノシトールの2.1ｇを含有し、副生成物として、エピ−イノシトールの1.8ｇを含有していることがわかった。アロ−イノシトールとエピ−イノシトールの合計還元収率は97.0％であった。Ｄ−アロ−５−イノソースからのアロ−イノシトールの還元収率は52.5％であった。
【０１０５】
(ii) この還元反応液を５Ｍ塩酸にてｐＨ６に調整後、この溶液に対して実施例３(3)で分離、回収したAB10233株菌体の４分の１量を再度添加し、この微生物を27℃で24時間エピ−イノシトールに反応させた。反応終了後、反応液から除菌し、反応液上清液を高速液体クロマトグラフィーにより実施例１（１）に記載した条件で分析した。その結果、反応終了後の上清溶液中には、未反応のアロ−イノシトール2.1ｇと、エピ−イノシトールから再び生成されたＤ−アロ−５−イノソース1.7ｇ含まれていた。還元反応での副生成物であるエピ−イノシトールのＤ−アロ−５−イノソースへの変換率は94％であった。
(iii) 次に、上記(ii)の反応終了後の反応上清液を１Ｍ水酸化ナトリウムにてｐＨ６に調整後、この溶液に水素化ホウ素ナトリウム0.12ｇを徐々に加え、再び還元反応を行った。還元終了後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにより実施例４(1)に記載した条件で分析した。その結果、還元終了後の反応溶液中には、アロ−イノシトール３ｇを含有し、副生成物のエピ−イノシトールは0.8ｇ含有していることがわかった。この時のアロ−イノシトールとエピ−イノシトールの合計還元収率は96.5％であった。
全体を通して、Ｄ−アロ−５−イノソースからアロ−イノシトールへの全反応収率は75.0％であった。
【０１０６】
Ｄ−アロ−５−イノソースからのアロ−イノシトール及びエピ−イノシトールの合計還元収率及びＤ−アロ−５−イノソースからのアロ−イノシトールの還元収率は実施例４(1)に示した式により求めた。但し、前項(iii)における２回目の還元収率は、反応液中含まれているアロ−イノシトール量から未反応のアロ−イノシトール量を減じた値から求めた。
【０１０７】
Ｄ−アロ−５−イノソースの変換率は、実施例１(1)に示した式より求めた。
【０１０８】
また、アロ−イノシトールの全反応収率は次式により求めた。
アロ−イノシトールの全反応収率＝〔最終の還元反応終了液中のアロ−イノシトールのモル数÷反応開始前の溶液中のＤ−アロ−５−イノソースのモル数〕×100
【０１０９】
（２）アロ−イノシトールの単離
反応溶液中のアロ−イノシトールの単離は、実施例４(2)の方法に準じて行った。この操作で高純度のアロ−イノシトールの白色粉末を2.1ｇ得た（精製回収率72.0％）。この時のＤ−アロ−５−イノソースからのアロ−イノシトールの全回収率は53.5％であった。
なお、上記アロ−イノシトールの精製回収率及び反応開始前のアロ−イノシトールからの全回収率は実施例４(2)に示したにより求めた。
【０１１０】
【実施例６】
製造方法（Ｇ）（第９の本発明方法）によるＤ−アロ−３−イノソースの製造例
（１）Ｄ−アロ−３−イノソースの生成(第１例)
アロ−イノシトール ４．０％、グルコース １．０％、酵母エキス ０．７％を含むｐＨ未調整の液体培地100mlを500ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。この三角フラスコの培地にキサントモナス・エスピーAB10119株（FERM BP-7168）を接種し、27℃で５日間振とう培養した。培養液を遠心分離（8,000ｒｐｍ、20分間）し、上清を培養上清液とした。
【０１１１】
この培養上清液を下記に示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、培養上清液中にはＤ−アロ−３−イノソースが3.8ｇ(アロ−イノシトールからＤ−アロ−３−イノソースへの変換率93.0％)生成していることがわかった。この時の培養液中にはアロ−イノシトールは検出されなかった。
【０１１２】
なお、上記のＤ−アロ−３−イノソースの変換率は、次式により求めた。
変換率（％）＝〔培養上清液１ml中のＤ−アロ−３−イノソースのモル数÷培地１ml中のアロ−イノシトールのモル数〕×100
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。

【０１１３】
（２）Ｄ−アロ−３−イノソースの単離
実施例６(1)で得た培養液から菌体を遠心分離で除去し、上清液を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)C-20（Ｈ^＋型）20mlを充填したカラム(内径1.5cm、長さ30cm)に通過させた。その後このカラムに20mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を、弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)368S（遊離塩基型）40mlを充填したカラム(内径1.5cm、長さ30cm)に通過させ、その後このカラムに40mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。
【０１１４】
こうして得られた通過液及び水洗浄液中には上記Ｄ−アロ−３−イノソース以外の不純物はほとんど存在していなかった。
【０１１５】
上記により得たＤ−アロ−３−イノソース水溶液を減圧下で20mlまで濃縮し、エタノールを60ml加え結晶化した。その結果、純粋なＤ−アロ−３−イノソースの無色結晶を2.6ｇ得た。この時の精製品回収収率は68.0％、エピ−イノシトールからのＤ−アロ−３−イノソースの全回収率は65.3％であった。
【０１１６】
なお、上記Ｄ−アロ−３−イノソースの精製品回収率は次式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製単離したＤ−アロ−３−イノソース量÷培養上清液100ml中の精製前のＤ−アロ−３−イノソース〕×100
また、上記Ｄ−アロ−３−イノソースの全回収率は次式により求めた。
全回収率（％）＝〔精製単離したＤ−アロ−３−イノソースのモル数÷培地100ml中に添加したアロ−イノシトールのモル数〕×100
【０１１７】
【実施例７】
製造方法（Ｇ）（第９の本発明方法）によるＤ−アロ−３−イノソースの生成（第２例）
アロ−イノシトール 4.0％、グルコース 1.0％、酵母エキス 0.7％を含むｐＨ未調整の液体培地100mlを500ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。この三角フラスコの培地にシュードモナス・エスピー AB10215 株(FERM BP-7170)を接種し、27℃で５日間振とう培養した。培養液を遠心分離（8,000rpm、20分間）し、上清を培養上清液とした。
【０１１８】
この培養上清液を下記に示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、培養上清液中にはＤ−アロ−３−イノソースが3.7ｇ(アロ−イノシトールからＤ−アロ−３−イノソースへの変換率91.5％)生成していることがわかった。この時の培養液中にはアロ−イノシトールは検出されなかった。
【０１１９】
また、生成したＤ−アロ−３−イノソースの単離は実施例６(2)に準じて行い、Ｄ−アロ−３−イノソースの無色結晶2.4ｇ得た。このときの精製品回収率及びエピ−イノシトールからの全回収率は60.1％であった。
【０１２０】
【実施例８】
製造方法（Ｈ）（第 10 の本発明方法）によるＤ−アロ−３−イノソースの製造例
（１）菌体の生産
アロ−イノシトール 0.5％、グルコース２％、酵母エキス２％を含むｐＨ未調整の液体培地４Ｌを500ml容のバッフル付き三角フラスコに100mlずつ分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにキサントモナス・エスピーAB10119株（FERM BP-7168）を接種し、27℃で３日間振とう培養した。この培養液を遠心分離して得られた菌体を、0.05M リン酸緩衝液（pH 6.0）200mlで洗浄後、再度遠心分離し、洗浄菌体20ｇ(湿重量)を得た。
【０１２１】
（２）Ｄ−アロ−３−イノソースの生成
上記により得られた全洗浄菌体の全部を、アロ−イノシトール１６ｇを溶解、含有した0.05M リン酸緩衝液（pH 6.0) 400ml (アロ−イノシトール濃度40mg/ml)中に加えた。27℃、24時間スターラーで攪拌しながら微生物をアロ−イノシトールに反応させた。反応終了後、反応液から除菌した。得られた上清液を液体クロマトグラフィーにより分析したところＤ−アロ−３−イノソースが37.4mg/ml(変換率94.5％)生成、蓄積していた。この時の反応液中にはアロ−イノシトールは検出されなかった。
【０１２２】
なお、上記のＤ−アロ−３−イノソースの変換率は、次式により求めた。
変換率（％）＝〔反応終了液１ml中のＤ−アロ−３−イノソースのモル数÷反応前の溶液１ml中のアロ−イノシトールのモル数〕×100
【０１２３】
（３）Ｄ−アロ−３−イノソースの単離
実施例８(2)で得た反応液から菌体を遠心分離で除去し、そして得られた上清液のうちの100mlを、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)C-20（Ｈ^＋型）20mlを充填したカラム(内径1.5cm、長さ30cm)に通過させた。その後このカラムに20mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を、弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)368S（遊離塩基型）40mlを充填したカラム(内径1.5cm、長さ30cm)に通過させ、その後このカラムに40mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。
こうして得られた通過液及び水洗浄液中には上記Ｄ−アロ−３−イノソース以外の不純物はほとんど存在していなかった。
【０１２４】
上記により得たＤ−アロ−３−イノソース水溶液を減圧下で20mlまで濃縮し、エタノールを60ml加え結晶化操作を行った。その結果、純粋なＤ−アロ−３−イノソースの無色結晶を2.4ｇ得た。この時の精製品回収収率は63.0％、アロ−イノシトールからのＤ−アロ−３−イノソースの全回収率は59.5％であった。
【０１２５】
なお、上記Ｄ−アロ−３−イノソースの精製回収率は次式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製単離したＤ−アロ−３−イノソース量÷反応液100ml中の精製前のＤ−アロ−３−イノソース〕×100
また、上記Ｄ−アロ−３−イノソースのアロ−イノシトールからの全回収率は次式により求めた。
全回収率（％）＝〔精製単離したＤ−アロ−３−イノソースのモル数÷反応前の溶液に添加したアロ−イノシトールのうち100mlに含まれる該物質のモル数〕×100
【０１２６】
【実施例９】
製造方法（Ｉ）（第 11 の本発明方法）によるＤ−キロ−イノシトールの製造例
（１）Ｄ−キロ−イノシトールの生成
実施例８(1)〜(2)の方法を反復した。濃縮によりＤ−アロ−３−イノソースの４ｇを含む水溶液100mlを得た。この水溶液に水素化ホウ素ナトリウム0.26ｇを徐々に加えた。還元終了後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した．その結果、還元反応後の反応液は、生成したＤ−キロ−イノシトールの2.0ｇを含有し、副生成物として、アロ−イノシトールの1.9ｇを含有していることがわかった。Ｄ−キロ−イノシトールとアロ−イノシトールの合計還元収率は98.3％であった。Ｄ−アロ−３−イノソースからのＤ−キロ−イノシトールの還元収率は49.4％であった。
【０１２７】
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。

【０１２８】
Ｄ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールの合計還元収率（％）＝〔還元反応後のＤ−キロ−イノシトールのモル数とアロ−イノシトールのモル数の合計÷還元反応前のＤ−アロ−３−イノソースのモル数〕×100
また、上記のＤ−アロ−３−イノソースからのアロ−イノシトールの反応収率は次式により求めた。
反応収率（％）＝〔還元反応後のＤ−キロ−イノシトールのモル数÷還元反応前のＤ−アロ−３−イノソースのモル数〕×100
【０１２９】
（２）Ｄ−キロ−イノシトールの単離
前項(2)で得た還元反応後の反応液を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)C-20（Ｈ^＋型）20mlを充填したカラム(内径1.5cm、長さ30cm)に通過させた。その後このカラムに20mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト(登録商標)A-113（OH⁻型）40mlを充填したカラム(内径1.5cm、長さ30cm)に通過させ、その後このカラムに40mlの脱イオン水を通過させて洗浄した。
こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併して得られた水溶液は、Ｄ−キロ−イノシトールと副生成物であるアロ−イノシトールを含有するが、これら以外の不純物をほとんど含有しなかった。
【０１３０】
上記により得たＤ−キロ−イノシトールとアロ−イノシトールの水溶液を減圧下で20mlまで濃縮し、その濃縮液を強酸性陽イオン交換樹脂ダイアイオン (登録商標)UBK520M（Ca²⁺型）のカラム250mlを充填したカラム(内径３cm、長さ50cm)に通過させ、その後このカラムに脱イオン水を通過させて溶出した。該カラムの溶出液は所望なＤ−キロ−イノシトールを含む画分と、アロ−イノシトールを含む画分とに分け集めた。Ｄ−キロ−イノシトールを含む画分にはアロ−イノシトールは含まれていなかった。Ｄ−キロ−イノシトールを含む画分を20mlまで濃縮し、エタノールを60ml加え結晶化させた。この操作で高純度のアロ−イノシトールの無色結晶を1.4ｇ得た（精製品回収率67.5％)。この時のＤ−アロ−３−イノソースからのＤ−キロ−イノシトールの全回収率は33.8％であった。
【０１３１】
なお、上記Ｄ−キロ−イノシトールの精製品回収率及び全回収率は次式により求めた。
精製品回収率（％）＝〔精製単離したＤ−キロ−イノシトール量÷反応液100ml中の精製前のＤ−キロ−イノシトール量〕×100
全回収率（％）＝〔精製単離したＤ−キロ−イノシトールのモル数÷反応前の溶液に添加したＤ−アロ−３−イノソースのモル数〕×100
【０１３２】
【実施例１０】
製造方法（Ｊ）（第 12 の本発明方法）によるＤ−キロ−イノシトールの製造例
（１）Ｄ−キロ−イノシトールの生成
(i) 実施例８(1)、(2)の方法を反復した。これで得たＤ−アロ−３−イノソース含有の反応液の上清液のうち100mlを分取し、５Ｍ塩酸にてｐＨを５に調整後、水素化ホウ素ナトリウム0.26ｇを徐々に加えた。還元終了後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにより実施例７(1)に記載した条件で分析した。その結果、還元反応後の反応液は、生成したＤ−キロ−イノシトール1.9ｇを含有し、副生成物として、アロ−イノシトールの1.9ｇを含有していることがわかった。Ｄ−キロ−イノシトールとアロ−イノシトールの合計還元収率は99.0％であった。Ｄ−アロ−３−イノソースからのＤ−キロ−イノシトールの還元収率は49.5％であった。
【０１３３】
(ii) この還元反応液を５Ｍ塩酸にてｐＨ６に調整後、この溶液に、実施例８(2)で分離回収したAB10119株菌体の４分の１量を再度添加した。27℃で24時間、攪拌しながら微生物をアロ−イノシトールに反応させた。反応終了後、反応液から除菌した。得られた上清液を高速液体クロマトグラフィーにより実施例９(1)に記載した条件で分析した。その結果、反応終了後の反応溶液中には、未反応のＤ−キロ−イノシトール1.9ｇとＤ−アロ−５−イノソース1.8ｇ含まれていた。還元反応での副生成物であるアロ−イノシトールのＤ−アロ−３−イノソースへの変換率は95％であった。
【０１３４】
(iii) 次に、このＤ−キロ−イノシトールとＤ−アロ−５−イノソースを含む反応上清液を１Ｍ塩酸にてｐＨ５に調整後、この溶液に水素化ホウ素ナトリウム0.12ｇを徐々に加え、再度還元反応を行った。還元終了後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにより実施例９(1)に記載した条件で分析した。その結果、還元終了後の反応溶液中には、Ｄ−キロ−イノシトール2.8ｇを含有し、副生成物のアロ−イノシトールは0.9ｇ含有していることがわかった。この時のＤ−キロ−イノシトールとアロ−イノシトールの合計還元収率は98.5％であった。
全体を通して、Ｄ−アロ−３−イノソースからＤ−キロ−イノシトールへの全反応収率は74.1％であった。
【０１３５】
Ｄ−アロ−３−イノソースからのＤ−キロ−イノシトール及びアロ−イノシトールの合計還元収率及びＤ−アロ−５−イノソースからのアロ−イノシトールの還元収率は実施例７(1)に示した式により求めた。但し、２回目の還元収率は、反応液中含まれているＤ−キロ−イノシトール量から未反応のアＤ−キロ−イノシトール量を減じた値から求めた。
【０１３６】
Ｄ−アロ−３−イノソースの変換率は、実施例６(1)に示した式より求めた。
【０１３７】
また、アロ−イノシトールの全反応収率は次式により求めた。
Ｄ−キロ−イノシトールの全反応収率＝〔最終反応終了液のＤ−キロ−イノシトールのモル数÷反応開始前の溶液中のＤ−アロ−３−イノソースのモル数〕×100
【０１３８】
（２）Ｄ−キロ−イノシトールの単離
反応溶液中のＤ−キロ−イノシトールの単離は、実施例９(2)の方法に準じて行った。この操作で純粋なＤ−キロ−イノシトールの無色結晶を1.9ｇ得た（精製回収率69.5％）。この時のＤ−アロ−３−イノソースからのＤ−キロ−イノシトールの全回収率は51.5％であった。
なお、上記アロ−イノシトールの精製回収率及び反応開始前のアロ−イノシトールからの全回収率は実施例９(2)に示したにより求めた。
【０１３９】
【実施例１１】
製造方法（Ｌ）（第 14 の本発明方法）によるＤ−キロ−イノシトールの製造例
(i) 実施例２(1)の方法に準じて製造したスフィンゴモナス・エスピーAB10233株（FERM P-17894)の洗浄された静止菌体の５ｇを、エピ−イノシトールの４ｇを含む0.05Mリン酸緩衝液（pH 6.0) 100mlに添加し、27℃で24時間、攪拌しながら反応させた。反応終了後の反応液を実施例１(1)に示した条件で高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、反応液中にＤ−アロ−５−イノソースが38mg/ml含まれていた(変換率97.0％)。
【０１４０】
(ii) この反応液を遠心分離により除菌し、上清液を得た。除菌により回収された菌体は、下記の２回目の菌体反応に用いた。
(iii) 前項(ii)で得たＤ−アロ−５−イノソース含有の反応上清液を１Ｍ水酸化ナトリウムにてｐＨ６に調整後、この溶液に水素化ホウ素ナトリウム0.25ｇを徐々に加え還元反応を行った。還元終了後、生成されたアロ−イノシトールを含む反応液を高速液体クロマトグラフィーにより実施例４(2)に記載した条件で分析した。その結果、還元反応後の反応液には、生成したアロ−イノシトールの2.1ｇを含有し、副生成物として、エピ−イノシトールの1.8ｇを含有していることがわかった。アロ−イノシトールとエピ−イノシトールの合計還元収率は99.0％、Ｄ−アロ−５−イノソースからのアロ−イノシトールの還元収率は53.5％であった。
【０１４１】
(iv) この還元反応液を５Ｍ塩酸にてｐＨ６に調整後、この溶液に、前項(ii)で回収した菌体を再度入れた。27℃で24時間微生物をエピ−イノシトールに反応させた。反応終了後の溶液中には、未反応のアロ−イノシトール2.1ｇ、Ｄ−アロ−５−イノソース1.7g/ml含まれていた。
【０１４２】
(v) 次に、この反応液から菌体を除去した。得られた反応上清液を水酸化ナトリウムにてｐＨ６に調整後、この溶液に水素化ホウ素ナトリウム0.12ｇを徐々に加えた。還元終了後の反応溶液中には、アロ−イノシトール2.9ｇを含有し、副生成物のエピ−イノシトールは0.8ｇ含有していることがわかった。
【０１４３】
(vi) 次に、前項(v)で得たアロ−イノシトール及びエピ−イノシトール含有溶液を５Ｍ塩酸にてｐＨ６に調整した。その後、この溶液に、実施例８(1)の方法に準じて調製したキサントモナス・エスピーAB10119株（FERM P-7168)の洗浄された静止菌体の４ｇを加えた。27℃で24時間、攪拌しながら反応させた。その結果、反応終了後の反応液には、Ｄ−アロ−３−イノソースが2.8ｇ(変換率95.5％) 及び未反応のエピ−イノシトールが0.8ｇ含まれていた。
【０１４４】
(vii) この反応液を遠心分離により除菌し、上清液を得た。回収された菌体は、下記の２回目の菌体反応に用いた。
(viii) 前項(vii)で得られたＤ−アロ−３−イノソース含有の反応上清液を１Ｍ塩酸にてｐＨ５に調整後、この溶液に水素化ホウ素ナトリウム0.18ｇを徐々に加え還元反応を行った。還元終了後、反応液を高速液体クロマトグラフィーにより実施例９(2)に記載した条件で分析した。その結果、還元反応後の反応液には、生成したＤ−キロ−イノシトールの1.4ｇを含有し、副生成物として、アロ−イノシトールの1.4ｇ、未反応のエピ−イノシトール0.8ｇを含有していることがわかった。
【０１４５】
(ix) 前項(viii)で得られた還元反応液を５Ｍ塩酸にてｐＨ６に調整後、この溶液に、前項(vii)で回収した菌体を再度入れた。27℃で24時間微生物をエピ−イノシトールに反応させた。反応終了後の溶液中には、Ｄ−アロ−５−イノソース1.3ｇ、未反応のＤ−キロ−イノシトール1.4ｇ及びエピ−イノシトール0.8ｇ、含まれていた。
【０１４６】
(x) 次に、前項(ix)で得た反応液から除菌し、得られた反応液上清液を１Ｍ塩酸にてｐＨ５に調整後、この溶液に、水素化ホウ素ナトリウム0.1ｇを徐々に加えＤ−アロ−５−イノソースの還元反応を行った。還元終了後の反応溶液中には、Ｄ−キロ−イノシトールの2.0ｇ、アロ−イノシトールの0.6ｇ及びエピ−イノシトールの0.8ｇを含有していることがわかった。
【０１４７】
全体を通して、エピ−イノシトールからＤ−キロ−イノシトールへの全反応収率は49.6％であった。
Ｄ−キロ−イノシトールの全反応収率は次式により求めた。
Ｄ−キロ−イノシトールの全反応収率＝〔最終反応終了液のＤ−キロ−イノシトールのモル数÷反応開始前の溶液中のエピ−イノシトールのモル数〕×100
【０１４８】
（２）Ｄ−キロ−イノシトールの単離
反応溶液中のＤ−キロ−イノシトールの単離は、実施例９(2)の方法に準じて行った。この操作で純粋なＤ−キロ−イノシトールの無色結晶を1.3ｇ得た（精製回収率65.0％)。この時のエピ−イノシトールからのＤ−キロ−イノシトールの全回収率は32.3％であった。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel material D-allo-5-inosose (D-allo-5-Inosose) that has a high value as a raw material for pharmaceuticals. The present invention also relates to a method for producing D-allo-5-inosose in a single step from inexpensive epi-Inositol under the action of microorganisms. Furthermore, the present invention relates to a method for efficiently producing promising allo-Inositol by reducing D-allo-5-inosose, and using allo-inositol as a raw material. The present invention relates to a method for efficiently producing D-allo-3-inosose having high value as a raw material. Furthermore, the present invention relates to a method for efficiently producing D-chiro-Inositol, which is promising as a pharmaceutical, by reducing D-allo-3-inosose.
[0002]
Epi-inositol has the following planar formula (A)

Or the following three-dimensional structural formula (A ′)

It is a known substance represented by
[0003]
Further, the novel substance D-allo-5-inosose according to the present invention has the following planar formula (I-1)

Or the following plane formula (I-I ')

Or the following three-dimensional structural formula (I-2)

Or the following three-dimensional structural formula (I-2 ')

It is a novel substance represented by
[0004]
Furthermore, allo-inositol has the following planar formula (B)

Or the following three-dimensional structural formula (B ′)

It is a known substance represented by
[0005]
Further, D-allo-3-inosose has the following planar formula (C)

Or the following three-dimensional structural formula (C ′)

It is a known substance represented by
[0006]
In addition, D-kilo-inositol has the following planar formula (D)

Or the following three-dimensional structural formula (D ')

It is a known substance represented by
[0007]
[Prior art]
Inosose (also known as Pentahydroxycyclohexanones or Alicyclic ketohexoses) is generally the microbial oxidation of inositol [AJ Kluyver & A. Boezaardt: “Rec. Trav. Chim.” 58, 956 (1939)], enzymes Oxidation [L. Anderson et al .: “Arch. Biochem. Biophys.” 78, 518 (1958)], air oxidation using platinum catalyst [K. Heyns and H. Paulsen: “Chem. Ber.” 86 833 (1953)], and oxidation with an oxidizing agent such as nitric acid [T. Posternak: “Helv. Chim. Acta”, Vol. 19, 1333 (1936)].
[0008]
Among inositols, the inosource produced by microbial oxidation or enzymatic oxidation of epi-inositol is L-epi-2-inosose (also known as L-epi-inosose-2) [WO 00/75355]. Only. No microorganism has been reported so far that oxidizes epi-inositol to produce D-allo-5-inosose. There have been no reports of microorganisms or enzymes that produce D-allo-3-inosose by microbial oxidation or enzymatic oxidation of allo-inositol.
[0009]
Inositol is a general term for hexavalent alcohols derived from cyclohexane, and inositol has nine different steric organisms. As natural inositol, five kinds of myo-inositol, D-kilo-inositol, L-kilo-inositol, muco-inositol and scyllo-inositol have been found.
[0010]
D-kilo-inositol is one of nine types of inositol stereoisomers, and the following (a) to (d) are known for the production method.
(a) A method of degrading kasugamycin to obtain D-kilo-inositol as a constituent (hydrolysis method using a strong acid (US Pat. No. 5,091,596), a method of decomposing after acetylation (US Pat. No. 5,463,142) , Hydrolysis method using strong acid ion exchange resin (US Pat. No. 5,714,643)).
(b) A method for obtaining D-kilo-inositol through glucuronic acid as a raw material through 10 or more chemical synthesis steps (US Pat. No. 5,406,005).
(c) A method for preparing D-kilo-inositol by demethylating pinitol contained in a plant such as bougainvillea (US Pat. No. 5,827,896).
(d) A method of producing a mixture of D-kilo-inositol, L-kilo-inositol, scyllo-inositol, neo-inositol from myo-inositol using Agrobacterium (Japanese Patent Laid-Open No. 9-140,388).
[0011]
However, any of the above methods (a) to (c) for producing D-kilo-inositol has problems in terms of operational complexity or cost as a method for producing on an industrial scale, and may always be satisfactory. It is not a thing. In the method (d), since a mixture of four inositol stereoisomers is formed, separation of D and L inositols is particularly difficult and the purification operation is complicated. Furthermore, the final yield of D-kilo-inositol is less than 1%, which is a low yield.
[0012]
[Problems to be solved by the invention]
The object of the present invention is to provide D-allo-5-inosose as a useful new substance. Another object of the present invention is to prepare D-allo-5-inosose, allo-inositol, and D-allo-3-inosose from epi-inositol (WO 00/75355) which can be produced at low cost. An object is to provide a novel method for efficiently and inexpensively producing D-chiro-Inositol having high optical purity, which is promising as a pharmaceutical product, via a sequential route.
[0013]
D-kilo-inositol has recently been used as a therapeutic agent for non-insulin dependent diabetes (WO 90/10439) or as a therapeutic agent for polycystic ovary syndrome (The New England Journal of Medicine, 340: 1314-1320, 1999). ) It has been shown and effective.
[0014]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have intensively studied to achieve the above object. As a result, in the previous study, as a microorganism having an oxidizing ability to convert myo-inositol into L-epi-2-inosose, for example, Xanthomonas sp. AB10119 strain or Pseudomonas sp. AB10215 strain (PCT / JP00 / 03687 When the cells of WO 00/75355) are allowed to act on allo-inositol, it can be found that D-allo-3-inosose is quantitatively produced from allo-inositol. It was found that reduction of -3-inosose with sodium borohydride produced D-kilo-inositol in high yield.
[0015]
In addition, in the process of studying an inexpensive method for producing allo-inositol, which is a raw material for synthesizing D-kilo-inositol, this time, oxidation is performed to convert epi-inositol into myo-inositol and L-kilo-1-inosose. For example, when Xanthomonas sp. AB10198 strain or Sphingomonas sp. AB10233 strain (see Japanese Patent Application No. 2000-186337) is allowed to act as an active microorganism, D-allo-5-quantitatively is determined from epi-inositol. It can be seen that inosose is produced, and that this D-allo-5-inosose is reduced with sodium borohydride to produce allo-inositol and epi-inositol as a by-product in high yield. I found it. One of the products of transformation of epi-inositol found in the above research by microbial oxidation was found to be D-allo-5-inosose by analysis of nuclear magnetic resonance spectrum, and the substance was found to be a novel substance. did.
[0016]
In the course of research to improve the production yields of allo-inositol and D-kilo-inositol, microbial oxidation and reduction with sodium borohydride are carried out in the respective production processes of allo-inositol and D-kilo-inositol. It was found that the production yields of allo-inositol and D-kilo-inositol can be improved by about 1.5 times by repeating several times. Obtaining the above knowledge, the present invention has been completed.
[0017]
Epi-inositol, which is a raw material for the synthesis of allo-inositol, can be produced at low cost by treating myo-inositol, which is available in large quantities at low cost, in combination with microbial oxidation and reduction with an appropriate reducing agent. (See International Publication WO 00/75355 of PCT / JP00 / 03687).
[0018]
Therefore, according to the first invention, the following formula (I)

D-allo-5-inosose represented by the following formula is provided as a novel substance.
[0019]
D-Allo-5-inosose of formula (I) has the following physicochemical properties:
(1) Appearance: White powder
(2) Molecular formula: C₆H_TenO₆
(3) Molecular weight: 178
(4) Specific rotation: -16 ° (c 1.0, H₂O, 27 ℃)
(5)¹H-NMR (300MHz, D₂O):
δ (ppm): 3.49 (dd, 1H, J_1,2= 3.3Hz, J_1,6= 10.5Hz, 1-H), 3.95 (m, 2H, 2-H), 3.78 (t, 1H, J_3,2= J_3,4= 3.3Hz, 3-H), 3.68 (dd, 1H, J_4,3= 3.3Hz, J_4,2= 1.6Hz, 4-H), 3.76 (d, 1H, J_6,1= 10.5Hz, 6-H)
(6)¹³C-NMR (75.5MHz, D₂O)
δ (ppm): 71.9 (d, C-1), 75.1 (d, C-2), 67.4 (d, C-3), 77.6 (d, C-4), 95.8 (s, C-5), 71.5 (d, C-6)
(7) Solubility: Soluble in water and dimethyl sulfoxide. Insoluble in methanol, ethanol and acetone.
[0020]
As a method for producing the above allo-5-inosose, basically, according to the second invention, a microorganism having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol into D-allo-5-inosose acts on epi-inositol. The epi-inositol is converted to D-allo-5-inosose to produce D-allo-5-inosose, and the D-allo-5-inosose is recovered. A method for producing D-allo-5-inosose is provided. In this method, a trace amount of L-epi-2-inosose may be by-produced.
[0021]
The microorganism used in the second method of the present invention is a gram-negative bacterium Pseudomonadacea (Pseudomonadaceae) Family Xanthomonas (Xanthomonas) Genus or Pseudomonas (Pseudomonas) Bacteria or acetobacteracea (AcetobacteraceaeAcetobacter ()Acetobacter) Genus or Gluconobacter (Gluconobacter) Genus bacteria, or Rhizobiacea (RhizobiaceaeAgrobacterium ()Agrobacterium) Genus bacteria, or Enterobacteriaceae (EnterobacteriaceaEnterobacter ()Enterobacter), Serratia (Serratia) Genus or Yersinia (Yersinia) Genus bacteria, or Pasteuracea (Pasteurellaceae) Family Pasteurella (Pasteurella) Genus or hemophilus (Haemophilus), Preferably Xanthomonas sp. AB10198 or Sphingomonas sp. AB10233, which are new microorganisms isolated by the present inventors.
[0022]
The above-mentioned mycological substances of AB10198 strain and AB10233 strain are described in Japanese Patent Application No. 2000-186337. Details of the bacteriological properties of the AB10198 and AB10233 strains are described in Tables 1a, 1b, and 1c described later.
For identification of these strains, experiments were conducted according to the New Bacteriological Culture Course (2nd edition, Modern Publishing), Medical Bacterial Identification Guide (2nd edition, Modern Publishing), and Bacteriological Practice Guidelines (Maruzen). And the experimental results obtained are described in “Bergey's Manual of Systematic Bacteriology”, Vol. 1, 1984 and “Microbiology and Immunology”, Vol. 34, page 99, 1990, “International J. Systematic Bacteriology”, Vol. 45, page 334. Bacteria were identified by referring to recent academic papers published in 1995 and others.
[0023]

[0024]

[0025]

[0026]
The main characteristics of AB10198 are as follows. That is, this strain is a Gram-negative gonococcus whose colony has a yellow pigment, and the size is 0.3 to 0.5 × 0.5 to 1.6 μm. This strain is catalase positive and oxidase negative, and it decomposes glucose aerobically to produce acid. This strain is auxotrophic and the strain grows well when methionine is added to the minimal medium. The ubiquinone molecular species of the cells of this strain was Q8, and the GC content of DNA was 65%.
[0027]
Based on these bacteriological properties, the strain AB10198 was determined to be a strain belonging to the genus Xanhtomonas. According to “Bergey's Manual of Systematic Bacteriology”, Volume 1, 199, 1984, there are five species of Xanthomonas bacteria (Xanthomonas campestris; Xanthomonas fragaliae; Xanthomonas albrinens; As a result of comparing the bacteriological properties of AB10198 with the above-mentioned known species, AB10198 was considered to be the closest species to Xanthomonas campestris. Since the chemical properties did not completely match those of Xanthomonas campestris, this AB10198 strain was named Xanthomonas sp. AB10198 strain to distinguish it from known ones. FERM P-17893 (Deposit date is June 12, 2000).
[0028]
The main characteristics of AB10233 strain are as follows. This strain is a Gram-negative bacilli whose colonies are colored with a pale yellow pigment, and the size is 0.4 to 0.8 × 0.4 to 1.6 μm. This strain is catalase positive and oxidase negative, and it decomposes glucose aerobically to produce acid. The strain grows well on a minimal medium and is not auxotrophic. The ubiquinone molecular species of the cell was Q10, and the GC content of DNA was 64%. Moreover, it had 2-hydroxy-tetradecanoic acid in microbial cell fatty acid, and also had sphingolipid as microbial cell lipid. Summing up these bacteriological properties, this strain is identified as Sphingomonas described in “Microbiology and Immunology”, 34, 99, 1990, “International J. Systematic Bacteriology”, 45, 334, 1995, etc. It is considered to be the closest bacterium to the genus (Sphingomonas). The genus Sphingomonas was first proposed as a new genus in the above paper ("Microbiology and Immunology", 34, 99, 1990), and at least 12 new species have been proposed to date. However, since AB10233 strain did not match them completely in their bacteriological properties, in order to distinguish this strain from known ones, it was named Sphingomonas sp. AB10233. Deposited at the Institute as FERM P-17894 (date of deposit was June 12, 2000).
[0029]
As a first specific method of the second method of the present invention, in the third present invention, a microorganism having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol into D-allo-5-inosose is selected from epi-inositol and carbon source. And aerobic culture in a liquid medium containing a nitrogen source, and during the culture, the microorganism is allowed to act on epi-inositol in the culture solution to produce and accumulate D-allo-5-inosose in the culture solution. In addition, a method for producing D-allo-5-inosose is provided, which further comprises recovering D-allo-5-inosose from the culture solution. This third method of the present invention is hereinafter referred to as production method (A).
[0030]
As a second specific method of the second method of the present invention, in the fourth present invention, a step of culturing a microorganism having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol into D-allo-5-inosose in a medium; Separating the cells of the microorganism from the obtained culture, adding the cell to a buffer or liquid medium containing epi-inositol, and epithelializing the cells in the buffer or liquid medium. A step of reacting with inositol to produce D-allo-5-inosose in the obtained reaction solution, and a step of recovering D-allo-5-inosose from the reaction solution, A method for producing allo-5-inosose is provided. Hereinafter, the fourth method of the present invention is referred to as a production method (B).
[0031]
In the production method (A) (third method of the present invention), a liquid nutrient medium containing epi-inositol is inoculated with a microorganism having a required oxidizing ability and cultured aerobically. -5-inosose can be generated and accumulated.
[0032]
The composition of the liquid medium to be used is not particularly limited as long as the purpose is reached. In addition to epi-inositol to be converted to D-allo-5-inosose, a carbon source, nitrogen source, organic nutrient source, inorganic Any medium containing salts and the like may be used. Either a synthetic medium or a natural medium can be used. Epi-inositol is added to the medium in an amount of 0.1% to 40%, more preferably 20 to 30%, and as a carbon source, glucose, sucrose, maltose or starch is 0.1% to 20%, more preferably 0.5 to 5%. As the nitrogen source, 0.01% to 5.0%, preferably 0.5% to 2.0% of yeast extract, peptone, ammonium casamino acid sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate or urea is desirably added.
[0033]
In addition, it is effective to add inorganic salts that can generate ions such as sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, manganese, zinc, iron, copper, molybdenum, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. to the medium as needed. is there. When the concentration of hydrogen ions in the culture solution is adjusted to pH 4-10, preferably pH 5-9, and cultured, D-allo-5-inosose can be obtained efficiently.
[0034]
The culture conditions of the microorganism used vary depending on the strain and the type of medium, but the culture temperature is 5 to 40 ° C., preferably 20 to 37 ° C. The culture is performed by shaking the liquid medium or in the liquid medium. It can be done aerobically by blowing air. The culture period may be until epi-inositol disappears completely in the culture solution and D-allo-5-inosose shows the maximum accumulation amount, and is usually 1 to 14 days, preferably 3 to 10 days. It is.
[0035]
A general method for isolating and purifying a normal water-soluble neutral substance can be applied as a method for collecting the target D-allo-5-inosose from the culture solution. That is, after removing the cells from the culture solution, D-allo-5-inosose can be recovered by treating the culture supernatant with activated carbon, ion exchange resin, or the like, and almost all other impurities are removed. be able to. However, strong basic anion exchange resin OH⁻The mold cannot be used because it chemically changes D-allo-5-inosose.
[0036]
D-Allo-5-inosose can be isolated as a powder by concentrating a solution exclusively containing D-Allo-5-inosose.
[0037]
In the production method (B) (fourth method of the present invention), a microbial cell having a required oxidizing ability is cultured, and the bacterial cells obtained by separating from the culture are dissolved in epi-inositol or containing a buffer solution or It is added to a liquid medium and reacted therewith to produce D-allo-5-inosose from epi-inositol.
[0038]
As the cells, cells collected and collected from the culture solution obtained in the process of the production method (A) can be used. Moreover, you may use the microbial cell obtained by culture | cultivating the said microorganism separately on suitable culture conditions. Bacteria collection may be performed by a known method such as centrifugation or filtration from the culture solution.
As a reaction medium for reacting the added cells with epi-inositol, an aqueous medium composed of a liquid medium, a buffer solution or the like is used. As the liquid medium, the same one as in the production method (A) may be used, or a liquid medium in which the microorganism is separately cultured may be used as it is. As the buffer, phosphate buffer, Tris buffer, Good's CHES buffer, etc. may be used at a concentration of 10 to 500 mM, preferably 20 to 100 mM. The concentration of epi-inositol in the solution is preferably about 0.1 to 40%.
[0039]
The reaction conditions between the bacterial cells and epi-inositol vary depending on the strain, medium, and type of buffer, but the reaction temperature is 5 to 60 ° C, preferably 10 to 45 ° C, and the reaction time is 1 to 50 hours, preferably Is 3 to 48 hours, and the pH of the liquid medium or buffer is 2 to 10, preferably 3 to 9.
The method for recovering the target substance from the reaction solution after completion of the reaction may be performed in the same manner as in the production method (A).
[0040]
Furthermore, as a novel process for producing allo-inositol, basically, in the fifth aspect of the present invention, alkali metal borohydride, hydrogenated borohydride as a reducing agent is dissolved in an aqueous medium containing D-allo-5-inosose. Adding a trialkoxyboron alkali metal or alkali metal boron cyanide and a reaction of reducing D-allo-5-inosose in the aqueous medium with the reducing agent, whereby allo-inositol and epi-inositol A step of generating in the aqueous medium, a step of recovering allo-inositol and epi-inositol from the obtained reduction reaction, and a step of separating the recovered allo-inositol and epi-inositol from each other. A method for producing allo-inositol is provided. This fifth method of the present invention is hereinafter referred to as production method (C).
[0041]
In the production method (C) (fifth method of the present invention), D-allo-5-inosose obtained by the production method (A) or the production method (B) is dissolved in an aqueous medium such as water, and borohydride is obtained. A reducing agent that can be used in an aqueous system such as sodium is added, and D-allo-5-inosose is reduced with a reducing agent in an aqueous medium to produce allo-inositol and epi-inositol.
[0042]
The D-allo-5-inosose dissolved in the aqueous medium should have a concentration of 0.1% to 60%, preferably 1% to 40%. The reducing agent used is, for example, sodium borohydride, lithium borohydride, potassium borohydride, hydrogen as a reducing agent capable of reducing D-allo-5-inosose to allo-inositol and epi-inositol in an aqueous system. Preferred are sodium trimethoxyborohydride and sodium borohydride. The step of adding this reducing agent to the solution of D-allo-5-inosose is performed. Next, the second step of the reduction reaction is performed. This reaction is carried out at 0 ° C. to room temperature. The pH of the reaction mixture for the reduction reaction is desirably pH 4 to pH 10, preferably pH 5 to pH 8. The reaction is terminated when D-allo-5-inosose disappears or when the amount of reaction product formed becomes appropriate. As a result, an aqueous solution containing the produced allo-inositol and by-produced epi-inositol is obtained as a reaction solution for the reduction reaction (second step).
[0043]
Next, a third step of recovering allo-inositol and epi-inositol from the reaction solution of the reduction reaction obtained here is performed. In this third step, a reduction reaction solution containing allo-inositol and epi-inositol is converted into a strongly acidic cation exchange resin such as Duolite® C-20 (H⁺Type) and collect the flow-through, and then pass the deionized water through this column to wash it and collect the washing solution. The resulting flow-through and washing solution are combined to form a weakly basic anion exchange. Resins such as Duolite® A113 (OH⁻Type), and the flow-through solution is collected, and then the deionized water is passed through the column and washed to collect the washing solution. The obtained flow-through solution and washing solution are combined to produce epi-inositol and allo- An aqueous solution containing inositol but almost no other impurities is obtained.
[0044]
In the final (fourth) step of the production method (C), allo-inositol and epi-inositol are separated separately from the allo-inositol and epi-inositol aqueous solutions recovered in the third step. For this purpose, the aqueous solution is concentrated, and the resulting concentrated solution is a strongly acidic cation exchange resin (boric acid type) made of a styrene polymer having a quaternary amine group as an exchange group, such as Duolite (registered). (Trademark) A113 (boric acid type) column is used to adsorb allo-inositol and epi-inositol onto the column resin, and then elute the column with deionized water and then with 0.5M aqueous boric acid solution. It has been found by the present inventors that the desired allo-inositol can be efficiently separated from inositol. By concentrating and drying this aqueous solution containing allo-inositol, a pure allo-inositol powder can be obtained.
[0045]
Furthermore, as a novel process for producing allo-inositol starting from epi-inositol, in the sixth aspect of the present invention, a microorganism having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol into D-allo-5-inosose is used as an aqueous medium. Containing D-allo-5-inosose in the aqueous medium by reacting with epi-inositol in the aqueous solution by conversion of epi-inositol, and containing D-allo-5-inosose produced in the above step Removing the cells of the microorganism from the aqueous medium to obtain an aqueous medium containing the obtained D-allo-5-inosose but not containing the cells, and from the aqueous medium not containing the cells Without isolating D-allo-5-inosose, an alkali metal borohydride, trialkoxy borohydride as a reducing agent in the aqueous medium containing D-allo-5-inosose A step of adding an alkali metal or alkali metal boron cyanide, and a reaction of reducing D-allo-5-inosose with the reducing agent in the aqueous medium, and reducing the D-allo-5-inosose. A step of producing inositol and epi-inositol, a step of recovering allo-inositol and epi-inositol from the obtained reduction reaction solution, and a step of separating the recovered allo-inositol and epi-inositol from each other. A method for producing allo-inositol is provided. This sixth method of the present invention is hereinafter referred to as production method (D).
[0046]
In the production method (D) (sixth invention method), simply speaking, first, the production method (B) (fourth invention method) is carried out, and the microbial cells containing D-allo-5-inosose. A reaction solution was obtained, and then the cells were removed from the D-allo-5-inosose-containing cell reaction solution obtained by the production method (B), and then the D-allo- Without isolating 5-inosose, a reducing agent that can be used in an aqueous system similar to the reducing agent used in the production method (C) is added directly to the reaction solution containing D-allo-5-inosose. Allo-inositol is produced by performing a reduction reaction.
[0047]
In the first step of the production method (D), D-allo-5-inosose is produced and accumulated in an aqueous medium by reacting cells with epi-inositol according to the method of the production method (B). A step of removing the bacterial cells from the bacterial cell reaction solution containing D-allo-5-inosose obtained in the first step by known means such as centrifugation and filtration is performed (second step). Subsequently, the 3rd process which adds the hydride as a reducing agent to the reaction liquid containing D-allo-5-inosose from which the microbial cell was removed in this way is performed. Subsequently, a reduction reaction of D-allo-5-inosose is performed, and thereby a step of producing allo-inositol and epi-inositol is performed (fourth step). The conditions for the reduction reaction may be the same as in the production method (C). The step of obtaining allo-inositol and epi-inositol from the reaction solution (fifth step) and the sixth step of separating allo-inositol from epi-inositol are in accordance with the third and fourth steps of the production method (C). Can be done.
[0048]
In addition, in studying the conditions for efficiently producing allo-inositol, a bacterial strain having an oxidation ability to convert epi-inositol into D-allo-5-inosose is produced by reduction of D-allo-5-inosose. Utilizing the property of not reacting with allo-inositol, the cells separated and recovered in the second step of the production method (D) are converted into epi-inositol by-produced by reduction of D-allo-5-inosose. A mixed solution obtained by reacting again to produce a solution of a mixture of D-allo-5-inosose and unreacted allo-inositol, and further removing cells from the solution by means of centrifugation, filtration, etc. Again, a hydride as a reducing agent is added to perform a reduction reaction of D-allo-5-inosose, thereby producing a high concentration of allo-inositol. It can be carried out steps of the method, and it was found that this method can be used as a variant of the production method (D). Thereby, it was found that about 1.5 times as much allo-inositol as the production method (D) can be produced and accumulated in the reaction solution.
[0049]
Therefore, in the seventh aspect of the present invention, a step of culturing a microorganism having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol into D-allo-5-inosose in a medium, and separating the microbial cell from the obtained culture A step of adding the cell to an aqueous medium comprising a buffer or liquid medium containing epi-inositol, and allowing the cell to act on epi-inositol in the aqueous medium to convert epi-inositol. A step of producing D-allo-5-inosose, and separating and recovering the cells of the microorganism from the aqueous medium containing the D-allo-5-inosose produced in the above step; A step of obtaining an aqueous medium containing allo-5-inosose but not containing cells, and D-allo-5-inosose is not isolated from the aqueous medium containing no cells. Ino sauce Adding an alkali metal borohydride, a trialkoxyboron alkali metal hydride, or an alkali metal cyanoborohydride as a reducing agent to the aqueous medium, and D-allo-5 with the reducing agent in the aqueous medium. -A reaction for reducing inosource is performed, and allo-inositol and epi-inositol are produced in the aqueous medium by this reduction reaction, and allo-inositol and epi-inositol are not isolated from the obtained reduction reaction solution. The step of adding the cells separated and recovered in the above step to the reduction reaction solution, and the action of the added cells on epi-inositol in the reaction solution to re-add D-allo-5-inosose. To obtain an aqueous medium containing D-allo-5-inosose, unreacted allo-inositol and added cells produced A step of removing the added cells from the aqueous medium from the previous step, and thus a step of obtaining an aqueous medium containing no D-allo-5-inosose and unreacted allo-inositol-containing cells. Adding the same reducing agent as described above to the aqueous medium without isolating D-allo-5-inosose from the aqueous medium containing no bacterial cells, and D with the reducing agent in the aqueous medium. -A reaction for reducing allo-5-inosose is performed, and epi-inositol and allo-inositol are produced in the aqueous medium by the reduction reaction of D-allo-5-inosose to increase epi-inositol and allo-inositol. A step of obtaining a reduction reaction solution containing the concentration, a step of recovering allo-inositol and epi-inositol from the reduction reaction solution, and the recovered allo-inositol and epi-inositol A method for producing allo-inositol, comprising the step of separating the tools from each other. This seventh method of the present invention is hereinafter referred to as production method (E).
[0050]
In the production method (E), the respective steps can be performed in the same manner as the corresponding steps in the production methods (B) to (D).
[0051]
Furthermore, as a novel method for producing D-allo-3-inosose, according to the eighth aspect of the present invention, a microorganism having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol into D-allo-3-inosose is allowed to act on allo-inositol. The allo-inositol is converted to D-allo-3-inosose to produce D-allo-3-inosose, and D-allo-3-inosose is recovered. A method for producing allo-3-inosose is provided. This eighth method of the present invention is referred to as a production method (F).
[0052]
In the production method (F), the microorganism having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol into D-allo-3-inosose, which can be used in (the eighth invention method), is Pseudomonadacea, which is a gram-negative bacterium. (Pseudomonadaceae) Family Xanthomonas (Xanthomonas) Genus or Pseudomonas (Pseudomonas) Bacteria or acetobacteracea (AcetobacteraceaeAcetobacter ()Acetobacter) Genus or Gluconobacter (Gluconobacter) Genus bacteria, or Rhizobiacea (RhizobiaceaeAgrobacterium ()Agrobacterium) Genus bacteria, or Enterobacteriaceae (EnterobacteriaceaEnterobacter ()Enterobacter), Serratia (Serratia) Genus or Yersinia (Yersinia) Genus bacteria, or Pasteuracea (Pasteurellaceae) Family Pasteurella (Pasteurella) Genus or hemophilus (Haemophilus) Can be a bacterium such as a genus. This microorganism is preferably Xanthomonas sp. AB10119 strain (FERM BP-7168) or Pseudomonas sp. AB10215 strain (FERM BP-7170). It is described in the publication WO 00/75355. The AB10119 and AB10215 strains are deposited under the rules of the Nissei Laboratories Budapest Treaty.
[0053]
As a first specific method of the eighth method of the present invention (production method (F)), in the ninth present invention, a microorganism having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol into D-allo-3-inosose is used. Aerobic culture in a liquid medium containing allo-inositol and a carbon source and a nitrogen source, and the microorganism is allowed to act on allo-inositol in the culture solution to give D-allo-3-inosose in the culture solution. A method for producing D-allo-3-inosose is provided, which is characterized in that it is produced, accumulated, and recovered. This ninth method of the present invention is hereinafter referred to as production method (G).
[0054]
As a second specific method of the eighth method of the present invention, in the tenth present invention, a step of culturing a microorganism having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol into D-allo-3-inosose in a medium. Separating the cells of the microorganism from the obtained culture, adding the cells to a buffer or liquid medium containing allo-inositol, and allo-inositol in the buffer or liquid medium. There is provided a method for producing D-allo-3-inosose, characterized by comprising a step of reacting and producing D-allo-3-inosose in the resulting reaction solution, and a step of recovering this. The This tenth method of the present invention is hereinafter referred to as production method (H).
[0055]
In the production method (F), allo-inositol is added to allo-inositol obtained by the production method (C), the production method (D), the modified method of the production method (D), or (E). -D-allo-3-inosose can be produced by acting an oxidizing microorganism that can be converted into allo-3-inosose.
[0056]
The composition of the liquid medium used in the production method (G) (the ninth method of the present invention) is not particularly limited as long as the purpose is reached, and allo-inositol (converted into D-allo-3-inosose) Raw material), and in addition to this, a medium containing a carbon source, a nitrogen source, an organic nutrient source, inorganic salts and the like may be used. Either a synthetic medium or a natural medium can be used. Allo-inositol is added to the medium in an amount of 0.1% to 40%, more preferably 20 to 30%. As a carbon source, glucose, sucrose, maltose or starch is added in an amount of 0.1% to 20%, more preferably 0.5 to 5%. As a nitrogen source, 0.01% to 5.0%, preferably 0.5% to 2.0% of yeast extract, peptone, casamino acid, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, urea, or the like is desirably added.
[0057]
In addition, it is effective to add inorganic salts that can generate ions such as sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, manganese, zinc, iron, copper, molybdenum, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. to the medium as needed. is there. When the concentration of hydrogen ions in the culture solution is adjusted to pH 4-10, preferably pH 5-9, and cultured, D-allo-3-inosose can be obtained efficiently.
[0058]
Although the culture conditions of microorganisms vary depending on the strain and the type of medium, the culture temperature is 5 to 40 ° C., preferably 20 to 37 ° C. The culture is performed by shaking the liquid medium or air in the liquid medium. It can be done aerobically by blowing in. The culture period may be carried out until allo-inositol disappears completely in the culture solution and D-allo-3-inosose shows the maximum accumulation amount, and usually 1 to 14 days, preferably 3 to 10 days. It is.
[0059]
A general method for isolating and purifying a normal water-soluble neutral substance can be applied as a method for collecting a target product from a culture solution containing the produced D-allo-3-inosose. That is, after removing the bacterial cells from the culture solution, D-allo-3-inosose can be recovered by treating the culture supernatant with activated carbon, ion exchange resin or the like, and almost all other impurities can be removed. . However, strong basic anion exchange resin OH⁻The mold cannot be used because it chemically changes D-allo-3-inosose.
[0060]
More specifically, the culture supernatant liquid in which D-allo-3-inosose is accumulated is used for the purpose of removing undesired components, such as a strongly acidic cation exchange resin such as Duolite (registered trademark) C-20 (H⁺Type) and collect the flow-through, and then pass the deionized water through this column to wash it and collect the washing solution. The resulting flow-through and washing solution are combined to form a weakly basic anion exchange. Pass through a column packed with resin, e.g. Duolite® A368S (free base type), collect the flow through, then pass through the column and wash with deionized water to collect the wash, and the resulting flow through The solution and the washing solution are combined to obtain an aqueous solution containing D-allo-3-inosose but containing almost no other impurities. By concentrating the eluate, D-allo-3-inosose can be isolated as a powder.
[0061]
In said manufacturing method (H) (10th method of this invention), the microorganisms which have required oxidation ability are culture | cultivated, a microbial cell is isolate | separated, collect | recovered, and the collected microbial cell is a buffer solution containing allo-inositol. Alternatively, it is added to a liquid medium and reacted to produce D-allo-3-inosose from allo-inositol.
[0062]
As the cells, cells collected and collected from the culture solution obtained in the process of the production method (G) may be used. Moreover, you may use the microbial cell obtained by culture | cultivating the said microorganism separately on suitable culture conditions. Bacteria collection may be performed by a known method such as centrifugation or filtration from the culture solution.
[0063]
As a reaction medium for reacting bacterial cells with allo-inositol, a liquid medium, a buffer solution, or the like is used. As the liquid medium, the same one as in the production method (A) may be used, or a liquid medium in which the microorganism is separately cultured may be used as it is. As the buffer, phosphate buffer, Tris buffer, Good's CHES buffer, etc. may be used at a concentration of 10 to 500 mM, preferably 20 to 100 mM. The concentration of allo-inositol in the solution as the reaction medium is preferably about 0.1 to 40%.
[0064]
The reaction conditions vary depending on the strain, medium, and type of buffer, but the reaction temperature is 5 to 60 ° C, preferably 10 to 45 ° C, the reaction time is 1 to 50 hours, preferably 3 to 48 hours, The pH of the liquid medium or buffer is 2 to 10, preferably 3 to 9.
What is necessary is just to perform the method of isolating the target D-allo-3-inosose from the reaction liquid after completion | finish of reaction similarly to a manufacturing method (G).
[0065]
Furthermore, when the D-allo-3-inosose obtained by the above production methods (F) to (H) is reduced with a reducing agent usable in an aqueous system such as sodium borohydride in water, D-kilo- Inositol can be produced.
[0066]
Therefore, as a novel process for producing D-kilo-inositol starting from allo-inositol, basically, in the eleventh aspect of the present invention, oxidation ability capable of converting allo-inositol into D-allo-3-inosose. A step of producing D-allo-3-inosose by allowing allo-inositol to act on allo-inositol in an aqueous medium and converting allo-inositol to D-allo-3-inosose, and The microbial cells of the microorganisms are removed from the aqueous medium of the reaction solution containing the produced D-allo-3-inosose, and an aqueous medium containing the produced D-allo-3-inosose but not containing the microbial cells is obtained. And a step of obtaining an alkali metal borohydride, a hydrogenated trial as a reducing agent in the aqueous medium without isolating D-allo-3-inosose from the aqueous medium containing no bacterial cells. A step of adding an alkali metal xylon or alkali metal boron cyanide and a reaction for reducing D-allo-3-inosose with the reducing agent in the aqueous medium, whereby D-kilo-inositol and allo- A step of producing inositol in the aqueous medium, a step of recovering D-kilo-inositol and allo-inositol from the reduction reaction solution, and a step of separating the recovered D-kilo-inositol and allo-inositol from each other. A method for producing D-kilo-inositol is provided. This eleventh method of the present invention is hereinafter referred to as production method (I).
[0067]
In the above production method (I), the first step of producing D-allo-3-inosose by allowing microorganisms to act on allo-inositol is the same as the above-mentioned production method (G) or (H). It can be performed in the same manner as in the step of causing microorganisms to act. The second step of separating and removing microbial cells from the obtained culture solution or reaction solution containing D-allo-3-inosose can be performed by a known method such as centrifugation or filtration. Next, a third step of adding a reducing agent to the aqueous medium containing the obtained D-allo-3-inosose is performed. In the subsequent fourth step, a reaction for reducing D-allo-3-inosose with a reducing agent is performed. D-allo-3-inosose contained in the reaction (aqueous) medium at this time is 0.1% to 60%. % Concentration, preferably 1% to 40%. The reducing agent used is preferably, for example, a hydride shown in the production method (C) as a reducing agent capable of reducing D-allo-3-inosose to D-kilo-inositol in an aqueous system. The temperature of the reduction reaction is 0 ° C. to room temperature. The pH of the reaction mixture for the reduction reaction is desirably pH 4 to pH 10, preferably pH 5 to pH 8. The reaction is terminated when D-allo-3-inosose disappears or when the amount of reaction product formed becomes appropriate. As a result, an aqueous solution containing the produced D-kilo-inositol and allo-inositol is obtained as a reaction solution for the reduction reaction (fourth step).
[0068]
A fifth step of recovering D-kilo-inositol and allo-inositol from the reaction solution of the reduction reaction obtained here is then performed. In this fifth step, a reaction solution containing D-kilo-inositol and allo-inositol is mixed with a strongly acidic cation exchange resin such as Duolite® C-20 (H⁺Type) and collect the passing liquid, then pass deionized water through this column to wash and collect the washing liquid, and combine the obtained passing liquid and the washing liquid to form a weakly basic anion exchange resin. For example, Duolite (registered trademark) A113 (OH⁻The column is packed through the column, and the flow-through solution is collected. Thereafter, deionized water is passed through the column and washed to collect the washing solution, and the obtained passage solution and washing solution are combined to form D-kilo-inositol and allotrope. Obtain an aqueous solution containing inositol and almost no other impurities.
[0069]
In the final sixth step of the production method (I), D-kilo-inositol and allo-inositol are separated separately from the D-kilo-inositol and allo-inositol aqueous solutions recovered in the previous fifth step. . For this purpose, the aqueous solution is concentrated, and the resulting concentrated solution is converted into a strongly acidic cation exchange resin (calcium type) made of a styrene polymer having a sulfonic acid group as an exchange group, such as Diaion (registered trademark). D-Chiro-inositol can be efficiently separated from allo-inositol by adsorbing D-kilo-inositol and allo-inositol on the column through a column of UBK520M (calcium type) and then eluting the column with deionized water. . By concentrating the aqueous solution containing D-kilo-inositol and crystallizing ethanol water or the like, pure D-kilo-inositol crystals can be obtained.
[0070]
In examining conditions for efficiently producing D-kilo-inositol, the bacterial strain having the ability to convert allo-inositol into D-allo-3-inosose is obtained by reduction of D-allo-3-inosose. Utilizing the property of not reacting with the produced D-kilo-inositol, the cells separated and recovered in the second step of the production method (H) or the production method (I) are treated with D-allo-3-inosose. Re-acting on allo-inositol produced as a by-product by reduction to produce a mixed solution of D-allo-3-inosose and unreacted allo-inositol, and removing the cells by means of centrifugation, filtration, etc. Adding a hydride as a reducing agent to the mixed solution again to perform a reduction reaction of D-allo-3-inosose, thereby producing a high concentration of allo-inositol It was found possible, it has been found that can be used as a modification of the method of manufacturing said this (I). Thus, it was found that about 1.5 times as much D-kilo-inositol as production method (I) can be produced and accumulated in the reaction solution.
[0071]
Accordingly, in the twelfth aspect of the present invention, a step of culturing a microorganism having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol into D-allo-3-inosose in a medium, and separating the microbial cell from the obtained culture Adding the separated and recovered cells to an aqueous medium comprising a buffer solution or a liquid medium containing allo-inositol; and allowing allo-inositol to act on the allo-inositol in the aqueous medium. A step of producing D-allo-3-inosose by conversion to D-allo-3-inosose, and an aqueous medium of the reaction solution containing D-allo-3-inosose produced in the above step. A step of separating and recovering cells, thus obtaining an aqueous medium containing D-allo-3-inosose but not containing cells, and D-A from the aqueous medium obtained in this step Without isolating -3-inosose, an alkali metal borohydride, alkali metal borohydride or alkali metal borohydride is added as a reducing agent to the aqueous medium containing D-allo-3-inosose. And a step of reducing D-allo-3-inosose with the reducing agent, thereby producing D-kilo-inositol and allo-inositol in the aqueous medium, and the resulting reduction reaction solution Without isolating D-kilo-inositol and allo-inositol from the above step, the cells recovered in the previous step are added to the reduction reaction solution, and D-allo-3-inosose in the reduction reaction solution is added. A step of reacting the added cells to regenerate D-allo-3-inosose, and a step of regenerating D-allo-3-inosose obtained in this step and The microbial cells are removed from an aqueous medium containing a suitable D-kilo-inositol, and the produced microbial cells contain D-allo-3-inosose and unreacted D-kilo-inositol. And a step of adding the same reducing agent as described above to the aqueous medium without isolating D-allo-3-inosose from the aqueous medium containing no bacterial cells. In the medium, D-allo-3-inosose is reduced with the reducing agent to produce D-kilo-inositol and allo-inositol, thereby reducing allo-inositol and D-kilo-inositol. A step of producing in the liquid, and a step of recovering D-kilo-inositol and allo-inositol from the reduction reaction solution containing D-kilo-inositol and allo-inositol at a high concentration thus obtained. And a step of separating the recovered D-kilo-inositol and allo-inositol from each other, and a method for producing D-kilo-inositol is provided. Hereinafter, the twelfth method of the present invention is referred to as a production method (J).
[0072]
Furthermore, in the thirteenth aspect of the present invention, a microorganism having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol into D-allo-5-inosose is allowed to act on epi-inositol in an aqueous medium, whereby D-is converted by epi-inositol. A step of producing allo-5-inosose and L-epi-2-inosose, and removing the cells of the microorganism from the aqueous medium containing D-allo-5-inosose produced in the step, A step of obtaining an aqueous medium containing the obtained D-allo-5-inosose but not containing cells, and D-allo- from the aqueous medium containing no D but all but containing D-allo-5-inosose After or without isolating 5-inosose, an alkali metal borohydride, trialkoxyboron borohydride as a reducing agent in an aqueous medium containing D-allo-5-inosose. Adding potassium metal or alkali metal boron cyanide and reducing D-allo-5-inosose with the reducing agent in the aqueous medium, whereby allo-inositol and epi-inositol are A microorganism having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol into D-allo-3-inosose in the aqueous medium of the reduction reaction solution containing allo-inositol and epi-inositol thus obtained in a step of generating in the medium Adding D. allo-inositol by allowing microorganisms to act on allo-inositol in the aqueous medium and converting allo-inositol to D-allo-3-inosose, and The microorganism from the aqueous medium of the reaction solution containing D-allo-3-inosose and unreacted epi-inositol produced in the step A step of obtaining an aqueous medium containing the obtained D-allo-3-inosose and unreacted epi-inositol by removing the cells, and isolating D-allo-3-inosose from the aqueous medium After or without isolation, a step of adding the same reducing agent as the reducing agent to the aqueous medium containing D-allo-3-inosose in the aqueous medium, A step of reducing 3-inosose, thereby producing D-kilo-inositol and allo-inositol in the aqueous medium, and D-kilo-inositol and allo- from the reaction solution of the reduction reaction thus obtained. There is provided a method for producing D-kilo-inositol, which comprises a step of collecting inositol and a step of separating the recovered D-kilo-inositol and allo-inositol from each other. Provided. The thirteenth method of the present invention is hereinafter referred to as production method (K).
[0073]
Furthermore, in the fourteenth present invention, a step of culturing a microorganism having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol into D-allo-5-inosose in a medium, and separating the microbial cell from the obtained culture And the step of adding the separated and recovered cells to an aqueous medium comprising a buffer or liquid medium containing epi-inositol, and the cells added in the aqueous medium to act on epi-inositol. Then, a step of producing D-allo-5-inosose by conversion of epi-inositol, and separation and recovery of the microorganism cells from an aqueous medium containing D-allo-5-inosose produced in this step A step of obtaining an aqueous medium containing the produced D-allo-5-inosose, and without isolating D-allo-5-inosose from the aqueous medium. Adding an alkali metal borohydride, a trialkoxyboron alkali metal hydride, or an alkali metal cyanoborohydride as a reducing agent to the aqueous medium containing, and reducing D-allo-5-inosose with the reducing agent Performing a reaction to produce allo-inositol and epi-inositol in the aqueous medium by reduction of D-allo-5-inosose, and isolating allo-inositol and epi-inositol from the resulting reduction reaction solution Without adding the bacterial cells separated and recovered in the preceding step to the reduction reaction solution, causing the bacterial cells added in the reduction reaction solution to act on epi-inositol, -Regenerating the inosose to obtain an aqueous medium containing allo-inositol unreacted with the D-allo-5-inosose produced here. Removing the cells of the microorganism from the aqueous medium to obtain an aqueous medium containing D-allo-5-inosose and unreacted allo-inositol, and D-allo-5-inosose and allo- Without isolating D-allo-5-inosose from the aqueous medium containing inositol, adding the same reducing agent as described above into the aqueous medium, and with the reducing agent in the aqueous medium, An aqueous medium containing epi-inositol and allo-inositol at a high concentration is produced by performing a reaction to reduce -5-inosose and producing allo-inositol with epi-inositol by reduction of D-allo-5-inosose. A step of obtaining, a step of culturing a microorganism having an oxidizing ability capable of converting the above-described allo-inositol into D-allo-3-inosose, and separating the microbial cells from the obtained culture A step of recovering, and adding the cells recovered in this step to an aqueous medium containing epi-inositol and allo-inositol at a high concentration obtained in the previous step; The bacterial cells added in an aqueous medium are allowed to act on allo-inositol to produce D-allo-3-inosose by conversion of allo-inositol into D-allo-3-inosose, which is produced here. Obtaining an aqueous medium containing D-allo-3-inosose and unreacted epi-inositol, separating and recovering the cells of the microorganism from the aqueous medium, and producing the produced D-allo-3- Obtaining an aqueous medium containing inosose, unreacted allo-inositol and unreacted epi-inositol, and without isolating D-allo-3-inosose from the aqueous medium; Adding an alkali metal borohydride, alkali metal borohydride or alkali metal borohydride as a reducing agent to the aqueous medium containing lysine and epi-inositol; and the reducing agent in the aqueous medium To reduce D-allo-3-inosose, to produce D-kilo-inositol and allo-inositol by reduction of D-allo-3-inosose, and to reduce D-kilo-inositol and allo-inositol. A step of obtaining an aqueous medium containing epi-inositol for the reaction, and a recovered bacterial cell of the above step without isolating D-kilo-inositol, allo-inositol and epi-inositol from the obtained reduction reaction solution (Microbial body of microorganism having oxidation ability capable of converting allo-inositol into D-allo-3-inosose) The step of adding, and the added cells are allowed to act on allo-inositol in the reduction reaction solution to regenerate D-allo-3-inosose, which does not react with the produced D-allo-3-inosose A step of obtaining an aqueous medium containing D-kilo-inositol and epi-inositol, and removing microorganisms from the aqueous medium to react with D-allo-3-inosose produced Obtaining an aqueous medium containing kilo-inositol and epi-inositol, and adding the same reducing agent as described above in the aqueous medium without isolating D-allo-3-inosose from the aqueous medium; In the aqueous medium, a reaction for reducing D-allo-3-inosose with the reducing agent is carried out, whereby allo-inositol and D-kilo-inositol are produced, and allo-inositol and D-kito are produced. A step of obtaining a reduction reaction solution containing ro-inositol at a high concentration and containing unreacted epi-inositol, and D-kilo-inositol, allo-inositol and epi-inositol from the reduction reaction solution obtained in this step There is provided a method for producing D-kilo-inositol, comprising a step of collecting and a step of separating the recovered D-kilo-inositol and allo-inositol and epi-inositol from each other. The fourteenth method of the present invention is hereinafter referred to as production method (L).
[0074]
In the production methods (J) to (L), D-allo-5-inosose, alloin from epi-inositol via D-allo-5-inosose, allo-inositol, D-allo-3-inosose. -D-Chiro-inositol can be produced by a one-pot method without isolating inositol and D-allo-3-inosose, respectively.
[0075]
In the production methods (J) to (L), a step of allowing a microorganism having the ability to convert epi-inositol to D-allo-5-inosose is allowed to act on epi-inositol. As a result, a step of accumulating D-allo-5-inosose in the aqueous medium and then removing the bacterial cells is performed. Then, without isolating D-allo-5-inosose, an appropriate reducing agent that can be used in an aqueous system is allowed to act to produce allo-inositol and epi-inositol from D-allo-5-inosose in an aqueous medium. Again, the collected cells are allowed to act on epi-inositol accumulated in the aqueous medium to produce D-allo-5-inosose in the aqueous medium, and unreacted allo-inositol is accumulated. Then, after sterilizing the microbial cells, various steps are performed in which a reducing agent acts again on D-allo-5-inosose to produce and accumulate a high concentration of allo-inositol. More specifically, the microbial transformation and chemical reduction in the production methods (J) to (L) are explained in the production method (B), the production method (C), the production method (D), and the variations thereof. You can do it in the same way.
[0076]
The aqueous medium containing the mixture of allo-inositol and epi-inositol thus obtained is allowed to act on microorganisms having an oxidizing ability to convert allo-inositol into D-allo-3-inosose, so that D-allo- Accumulating 3-inosose and unreacted epi-inositol, and then removing the cells and then allowing a reducing agent that can be used in an appropriate aqueous system to act without isolating D-allo-3-inosose, D-Chiro-inositol and allo-inositol and unreacted epi-inositol are produced in an aqueous medium. Thereafter, the collected bacterial cells are allowed to act again on allo-inositol accumulated in the aqueous medium, and D-allo-3-inosose and unreacted D-kilo-inositol and epi-inositol are added to the aqueous medium. Generate. Furthermore, after sterilizing the cells, the reducing agent is again made to act on D-allo-3-inosose to produce and accumulate a high concentration of D-kilo-inositol. More specifically, the microbial conversion and reduction in this case can be performed in the same manner as described in the above production methods (F) to (I).
[0077]
Further, D-kilo-inositol is purified and isolated from the aqueous medium containing D-kilo-inositol and allo-inositol and epi-inositol obtained as described above. For this purpose, this aqueous solution is concentrated, and the resulting concentrated solution is converted into a strongly acidic cation exchange resin (calcium type) made of a styrene polymer having a sulfonic acid group as an exchange group, such as Diaion (registered trademark). ) D-kilo-inositol is obtained by a method comprising adsorbing D-kilo-inositol and allo-inositol and epi-inositol through a column of UBK520M (calcium type) and then eluting the column with deionized water. , Allo-inositol and epi-inositol. By concentrating the aqueous solution containing D-kilo-inositol and crystallizing with ethanol water or the like, pure D-kilo-inositol crystals can be obtained.
[0078]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Examples of the present invention will be specifically described below.
[0079]
[Example 1]
Production of D-Allo-5-inosose by Production Method (A) (Third Invention Method)
(1) Production of seed culture
100 ml of a non-pH-adjusted liquid medium containing 0.5% myo-inositol, 0.5% glucose and 0.3% yeast extract was dispensed into a 500 ml baffled Erlenmeyer flask and sterilized by autoclave. The Erlenmeyer flask was inoculated with Sphingomonas sp. Strain AB10233 (FERM P-17894) or Xanthomonas sp. Strain AB10198 (FERM P-17893) and cultured with shaking at 27 ° C. for 24 hours. This culture solution was used as a seed culture solution.
[0080]
(2) Production of D-allo-5-inosose (first example)
100 ml of a non-pH-adjusted liquid medium containing 12% epi-inositol, 2% glucose, 0.5% myo-inositol and 0.6% yeast extract was dispensed into a 500 ml baffled Erlenmeyer flask and sterilized by autoclave. The Erlenmeyer flask was inoculated with 2 ml of a seed culture solution of Sphingomonas sp. AB10233 strain (FERM P-17894) produced by the method described above, and cultured with shaking at 27 ° C. for 4 days. This culture solution was centrifuged (8,000 rpm, 20 minutes), and the supernatant was used as a culture supernatant solution.
[0081]
This culture supernatant was analyzed by high performance liquid chromatography under the following conditions. As a result, it was found that 113 mg / ml (conversion rate: 95.2%) of D-allo-5-inosose was produced in the culture supernatant. all right. Epi-inositol was not detected in the culture solution at this time.
[0082]
In addition, the conversion rate of said D-allo-5-inosose was calculated | required with the following formula.
Conversion rate (%) = [number of moles of D-allo-5-inosose in 1 ml of culture supernatant / number of moles of epi-inositol in 1 ml of medium] × 100
Column: Sugar-Pak Ca (Short): 7.8 x 150mm
Column temperature: 80 ℃
Detector: RI DETECTER ERC-7515A (ERMA CR.INC.)
Injection volume: 20μl
Solvent: water
Elution time: D-Allo-5-inosose; 12.0 minutes
[0083]
(3) Isolation of D-allo-5-inosose
The culture supernatant obtained in Example 1 (2) was added to the strongly acidic cation exchange resin Duolite (registered trademark) C-20 (H⁺The sample was passed through a column (inner diameter: 1.5 cm, length: 30 cm) filled with 20 ml, and then washed with 20 ml of ion-exchanged water. The passing liquid and the washing liquid were passed through a column (inner diameter 1.5 cm, length 30 cm) packed with 40 ml of weakly basic anion exchange resin Duolite (registered trademark) 368S (free base type), and then 40 ml of this column was passed through the column. Ion exchange water was passed through and washed.
[0084]
The passing liquid and water washing liquid thus obtained were concentrated under reduced pressure, and lyophilized. As a result, 9.9 g of high-purity D-allo-5-inosose white powder was obtained. The recovery yield of the purified product at this time was 87.6%, and the total recovery rate of D-allo-5-inosose from epi-inositol was 83.4%.
[0085]
The purified product recovery rate of D-allo-5-inosose and the total recovery rate from epi-inositol were determined by the following formulas.
Purified product recovery rate (%) = [purified and isolated D-allo-5-inosose ÷ D-allo-5-inosose before purification in 100 ml of culture supernatant] × 100
Total recovery (%) = [number of moles of purified and isolated D-allo-5-inosose / number of moles of epi-inositol added to the medium] × 100
[0086]
D-Allo-5-inosose has the following physicochemical properties.
(1) Appearance: White powder
(2) Molecular formula: C₆H_TenO₆
(3) Molecular weight: 178
(4) Specific rotation: -16 ° (c 1.0, H₂O, 27 ℃)
(5)¹H-NMR (300 MHz, D₂O)
δ (ppm): 3.49 (dd, 1H, J_1,2= 3.3Hz, J_1,6= 10.5Hz, 1-H), 3.95 (m, 2H, 2-H), 3.78 (t, 1H, J_3,2= J_3,4= 3.3Hz, 3-H), 3.68 (dd, 1H, J_4,3= 3.3Hz, J_4,2= 1.6Hz, 4-H), 3.76 (d, 1H, J_6,1= 10.5Hz, 6-H)
(6)¹³C-NMR (75.5MHz, D₂O)
δ (ppm): 71.9 (d, C-1), 75.1 (d, C-2), 67.4 (d, C-3), 77.6 (d, C-4), 95.8 (s, C-5), 71.5 (d, C-6)
(7) Solubility: Soluble in water and dimethyl sulfoxide. Insoluble in methanol, ethanol and acetone.
[0087]
[Example 2]
Production of D-Allo-5-inosose by Production Method (A) (Third Invention Method) (Second Example)
Epi-inositol 8%, glucose 0.5%, myo-inositol 0.5%, yeast extract 0.45%, KH₂PO_Four  0.02%, K₂HPO_Four  100 ml of a non-pH-adjusted liquid medium containing 0.18% was dispensed into a 500 ml baffled Erlenmeyer flask and sterilized by autoclave. The Erlenmeyer flask was inoculated with 2 ml of a seed culture solution of Xanthomonas sp. AB10198 strain (FERM P-17893) produced by the method described in Example 1 (1), and cultured with shaking at 27 ° C. for 4 days. This culture solution was centrifuged (8,000 rpm, 20 minutes), and the supernatant was used as a culture supernatant solution.
[0088]
This culture supernatant was analyzed by high performance liquid chromatography under the following conditions. As a result, it was found that 76 mg / ml (conversion rate 96.5%) of D-allo-5-inosose was produced in the culture supernatant. It was. Epi-inositol was not detected in the culture solution at this time. In addition, calculation of the conversion rate of said D-allo-5-inosose followed Example 1 (2).
[0089]
The produced D-allo-5-inosose was isolated according to Example 1 (3) to obtain 6.5 g of a white powder of D-allo-5-inosose. At this time, the recovery rate of the purified product of D-allo-5-inosose and the total recovery rate from epi-inositol were 85.0% and 82.0%, respectively.
[0090]
The purified product recovery rate of D-allo-5-inosose and the total recovery rate from epi-inositol were determined from the calculation formula shown in Example 1 (3).
[0091]
[Example 3]
Production Example of D-Allo-5-inosose by Production Method (B) (Fourth Invention Method)
(1) Production of bacterial cells
Myo-inositol 0.5%, glucose 0.5%, yeast extract 0.4%, K₂HPO_Four  0.18%, KH₂PO_Four  4 L of non-pH-adjusted liquid medium containing 0.02% was dispensed into a 500 ml baffled Erlenmeyer flask and sterilized by autoclave. Each Erlenmeyer flask medium was inoculated with Sphingomonas sp. AB10233 strain (FERM P-17894) and cultured with shaking at 27 ° C for 3 days. The cells obtained by centrifuging this culture solution were washed with 200 ml of 0.05M phosphate buffer (pH 7.0) and then centrifuged again to obtain 16 g (wet weight) of washed cells.
[0092]
(2) Production of D-allo-5-inosose
All of the washed cells obtained as described above were added to 400 ml (epi-inositol concentration is 40 mg / ml) of 0.05 M phosphate buffer (pH 6.0) containing 16 g of epi-inositol and containing 27 ° C. The mixture was reacted for 24 hours while stirring with a stirrer. After completion of the reaction, the reaction solution was analyzed by liquid chromatography. As a result, D-allo-5-inosose was produced and accumulated at 36 mg / ml (conversion rate: 95.0%).
[0093]
In addition, the conversion rate of said D-allo-5-inosose was calculated | required from following Formula.
Conversion rate (%) = [number of moles of D-allo-5-inosose in 1 ml of reaction solution after completion of reaction / number of moles of epi-inositol in 1 ml of buffer solution before reaction] × 100
[0094]
(3) Isolation of D-allo-5-inosose
Bacteria were removed from the reaction solution obtained in Example 3 (2) by centrifugation. 100 ml of the obtained supernatant of the reaction mixture was added to strongly acidic cation exchange resin Duolite (registered trademark) C-20 (H⁺The sample was passed through a column (inner diameter 1.5 cm, length 30 cm) packed with 20 ml, and then washed with 20 ml of deionized water. The passing liquid and the washing liquid were passed through a column (inner diameter 1.5 cm, length 30 cm) packed with 40 ml of weakly basic anion exchange resin Duolite (registered trademark) 368S (free base type), and then 40 ml of this column was passed through the column. Washed with deionized water.
In the passing liquid and the water washing liquid thus obtained, impurities other than the above D-allo-5-inosose were hardly present.
[0095]
The D-allo-5-inosose aqueous solution obtained above was concentrated under reduced pressure, and lyophilized. As a result, 2.3 g of white powder of high purity D-allo-5-inosose was obtained. At this time, the recovery yield of the purified product of D-allo-5-inosose was 61.2%, and the total recovery rate of D-allo-5-inosose from epi-inositol was 58.1%.
[0096]
The purified product recovery rate of the D-allo-5-inosose was determined by the following formula.
Purified product recovery rate (%) = [D-allo-5-inosose amount isolated as a purified product / D-allo-5-inosose amount before purification contained in 100 ml of reaction solution] × 100
Further, the total recovery rate of the L-epi-2-inosose from epi-inositol was determined by the following equation.
Total recovery (%) = [number of moles of D-allo-5-inosose isolated as a purified product / number of moles of the substance contained in 100 ml of the solution of epi-inositol added to the solution before the reaction] × 100
[0097]
[Example 4]
Production Example of Allo-Inositol by Production Method (C) (Fifth Invention Method)
(1) Production of allo-inositol (first example)
4 g of D-allo-5-inosose prepared according to the method of Example 2 was dissolved in 100 ml of deionized water. 0.26 g of sodium borohydride was gradually added to the obtained aqueous solution. After completion of the reduction, the reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography under the following conditions. As a result, it was found that the reaction solution after the reduction reaction mainly contained 2.1 g of allo-inositol produced, and contained 1.9 g of epi-inositol as a by-product. The total reduction yield of allo-inositol and epi-inositol was 98.5%, and the reduction yield of allo-inositol from D-allo-5-inosose was 51.9%.
[0098]
Analytical conditions for high performance liquid chromatography are as follows.

[0099]
The total reduction yield of allo-inositol and epi-inositol from the above D-allo-5-inosose was determined by the following formula.
Total reduction yield of allo-inositol and epi-inositol (%) = [total number of moles of allo-inositol after reduction reaction and number of moles of allo-inositol ÷ mole of D-allo-5-inosose before reduction reaction Number) x 100
Further, the reduction yield of allo-inositol from the above D-allo-5-inosose was determined by the following formula.
Allo-inositol reduction yield (%) = [number of moles of allo-inositol after reduction reaction / number of moles of D-allo-5-inosose before reduction reaction] × 100
[0100]
(2) Isolation of allo-inositol
The reaction solution obtained after the reduction reaction obtained in the above item (1) was used as a strongly acidic cation exchange resin Duolite (registered trademark) C-20 (H⁺The sample was passed through a column (inner diameter 1.5 cm, length 30 cm) packed with 20 ml, and then washed with 20 ml of deionized water. This flow-through solution and washing solution were used as a strongly basic anion exchange resin Duolite (registered trademark) A-113 (OH⁻The sample was passed through a column (inner diameter 1.5 cm, length 30 cm) packed with 40 ml, and then washed with 40 ml of deionized water.
[0101]
The aqueous solution obtained by combining the passing liquid and the water washing liquid thus obtained contains allo-inositol as a main product and epi-inositol as a by-product, but contains almost no impurities other than these. It was.
[0102]
The aqueous solution of allo-inositol and epi-inositol obtained as described above was concentrated to 20 ml under reduced pressure, and the concentrate was packed in a column packed with 100 ml of strongly acidic cation exchange resin Duolite (registered trademark) A116 (boric acid type) ( The column was passed through a column (3 cm in inner diameter, 30 cm in length), and then deionized water was passed through the column, followed by elution with 0.5 M aqueous boric acid. The eluate from the column with deionized water and the eluate with 0.5M aqueous boric acid contained only allo-inositol. Both aqueous solutions eluted with deionized water and boric acid water were concentrated to dryness, an excessive amount of methanol was added to the dried solid, and the mixture was concentrated under reduced pressure while warming. Boric acid was removed azeotropically with methanol. By this operation, 1.4 g of high-purity allo-inositol white powder was obtained (purification recovery rate 69.0%). At this time, the total recovery rate of allo-inositol from D-allo-5-inosose was 35.8%.
[0103]
The purification and recovery rate of allo-inositol was determined by the following formula.
Purified product recovery rate (%) = [Purified and isolated allo-inositol amount / Allo-inositol amount before purification in 100 ml reaction solution] × 100
The total recovery rate of the above allo-inositol from D-allo-5-inosose was determined by the following equation.
Total recovery (%) = [number of moles of purified and isolated allo-inositol ÷ number of moles of D-allo-5-inosose added to the solution before reaction] × 100
[0104]
[Example 5]
Production Example of Allo-Inositol by Production Method (E) (Seventh Invention Method)
(1) Production of allo-inositol
(i) The methods (1) and (2) of Example 3 were repeated. 100 ml of the supernatant of the reaction solution containing D-allo-5-inosose thus obtained was collected. After adjusting the pH to 6 with 5M hydrochloric acid, 0.26 g of sodium borohydride was gradually added to carry out a reduction reaction. After completion of the reduction, the reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 4 (1). As a result, it was found that the reaction solution after the reduction reaction contained 2.1 g of the produced allo-inositol and contained 1.8 g of epi-inositol as a by-product. The total reduction yield of allo-inositol and epi-inositol was 97.0%. The reduction yield of allo-inositol from D-allo-5-inosose was 52.5%.
[0105]
(ii) After adjusting this reduction reaction solution to pH 6 with 5M hydrochloric acid, a quarter amount of AB10233 strain cells separated and recovered in Example 3 (3) was added to this solution again, and this microorganism was added. Was reacted with epi-inositol at 27 ° C. for 24 hours. After completion of the reaction, the reaction solution was sterilized, and the reaction solution supernatant was analyzed by high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 1 (1). As a result, the supernatant solution after completion of the reaction contained 2.1 g of unreacted allo-inositol and 1.7 g of D-allo-5-inosose produced again from epi-inositol. The conversion rate of epi-inositol, which is a by-product in the reduction reaction, to D-allo-5-inosose was 94%.
(iii) Next, the reaction supernatant after completion of the reaction of (ii) above is adjusted to pH 6 with 1M sodium hydroxide, 0.12 g of sodium borohydride is gradually added to this solution, and the reduction reaction is performed again. It was. After completion of the reduction, the reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 4 (1). As a result, it was found that the reaction solution after completion of the reduction contained 3 g of allo-inositol and 0.8 g of by-product epi-inositol. The total reduction yield of allo-inositol and epi-inositol at this time was 96.5%.
Overall, the overall reaction yield from D-allo-5-inosose to allo-inositol was 75.0%.
[0106]
The total reduction yield of allo-inositol and epi-inositol from D-allo-5-inosose and the reduction yield of allo-inositol from D-allo-5-inosose are according to the formula shown in Example 4 (1). Asked. However, the second reduction yield in (iii) was determined from a value obtained by subtracting the amount of unreacted allo-inositol from the amount of allo-inositol contained in the reaction solution.
[0107]
The conversion rate of D-allo-5-inosose was determined from the formula shown in Example 1 (1).
[0108]
Moreover, the total reaction yield of allo-inositol was calculated | required by following Formula.
Total reaction yield of allo-inositol = [number of moles of allo-inositol in the final reduction reaction finished solution / number of moles of D-allo-5-inosose in the solution before the start of reaction] × 100
[0109]
(2) Isolation of allo-inositol
Isolation of allo-inositol in the reaction solution was performed according to the method of Example 4 (2). By this operation, 2.1 g of high-purity allo-inositol white powder was obtained (purification recovery rate: 72.0%). At this time, the total recovery rate of allo-inositol from D-allo-5-inosose was 53.5%.
The purification recovery rate of allo-inositol and the total recovery rate from allo-inositol before the start of the reaction were determined as shown in Example 4 (2).
[0110]
[Example 6]
Production Example of D-Allo-3-inosose by Production Method (G) (Ninth Invention Method)
(1) Generation of D-allo-3-inosose (first example)
100 ml of non-pH adjusted liquid medium containing 4.0% allo-inositol, 1.0% glucose and 0.7% yeast extract was dispensed into a 500 ml baffled Erlenmeyer flask and sterilized by autoclave. The Erlenmeyer flask medium was inoculated with Xanthomonas sp. AB10119 strain (FERM BP-7168) and cultured with shaking at 27 ° C for 5 days. The culture solution was centrifuged (8,000 rpm, 20 minutes), and the supernatant was used as the culture supernatant.
[0111]
The culture supernatant was analyzed by high performance liquid chromatography as described below. As a result, it was found that 3.8 g of D-allo-3-inosose (conversion rate from allo-inositol to D-allo-3-inosose 93.0%) was produced in the culture supernatant. No allo-inositol was detected in the culture solution at this time.
[0112]
In addition, the conversion rate of said D-allo-3-inosose was calculated | required by following Formula.
Conversion rate (%) = [number of moles of D-allo-3-inosose in 1 ml of culture supernatant / number of moles of allo-inositol in 1 ml of medium] × 100
Analytical conditions for high performance liquid chromatography are as follows.

[0113]
(2) Isolation of D-allo-3-inosose
The cells were removed from the culture solution obtained in Example 6 (1) by centrifugation, and the supernatant was removed from the strongly acidic cation exchange resin Duolite (registered trademark) C-20 (H⁺The sample was passed through a column (inner diameter 1.5 cm, length 30 cm) packed with 20 ml. The column was then washed by passing 20 ml of deionized water. The passing liquid and the washing liquid were passed through a column (inner diameter 1.5 cm, length 30 cm) packed with 40 ml of weakly basic anion exchange resin Duolite (registered trademark) 368S (free base type), and then 40 ml of this column was passed through the column. Washed with deionized water.
[0114]
There were almost no impurities other than the D-allo-3-inosose in the passing liquid and the water washing liquid thus obtained.
[0115]
The D-allo-3-inosose aqueous solution obtained above was concentrated to 20 ml under reduced pressure, and 60 ml of ethanol was added for crystallization. As a result, 2.6 g of colorless crystals of pure D-allo-3-inosose was obtained. At this time, the yield of the purified product was 68.0%, and the total recovery rate of D-allo-3-inosose from epi-inositol was 65.3%.
[0116]
The purified product recovery rate of the D-allo-3-inosose was determined by the following formula.
Purified product recovery rate (%) = [purified and isolated D-allo-3-inosose amount / D-allo-3-inosose before purification in 100 ml of culture supernatant] × 100
Moreover, the total recovery rate of the D-allo-3-inosose was determined by the following formula.
Total recovery (%) = [number of moles of purified and isolated D-allo-3-inosose ÷ number of moles of allo-inositol added in 100 ml of medium] × 100
[0117]
[Example 7]
Production of D-Allo-3-inosose by Production Method (G) (Ninth Invention Method) (Second Example)
100 ml of non-pH adjusted liquid medium containing 4.0% allo-inositol, 1.0% glucose and 0.7% yeast extract was dispensed into a 500 ml baffled Erlenmeyer flask and sterilized by autoclave. In this Erlenmeyer flask mediumPseudomonas SP AB10215 stock(FERM BP-7170) was inoculated and cultured with shaking at 27 ° C. for 5 days. The culture solution was centrifuged (8,000 rpm, 20 minutes), and the supernatant was used as the culture supernatant.
[0118]
The culture supernatant was analyzed by high performance liquid chromatography as described below. As a result, it was found that 3.7 g of D-allo-3-inosose was produced in the culture supernatant (conversion rate from allo-inositol to D-allo-3-inosose 91.5%). No allo-inositol was detected in the culture solution at this time.
[0119]
The produced D-allo-3-inosose was isolated according to Example 6 (2) to obtain 2.4 g of colorless crystals of D-allo-3-inosose. At this time, the recovery rate of the purified product and the total recovery rate from epi-inositol was 60.1%.
[0120]
[Example 8]
Manufacturing method (H) (No. Ten Production method of D-allo-3-inosose according to the present invention)
(1) Production of bacterial cells
100 ml of non-pH-adjusted liquid medium containing 0.5% allo-inositol, 2% glucose and 2% yeast extract was dispensed into 500 ml baffled Erlenmeyer flasks and sterilized by autoclave. Each Erlenmeyer flask was inoculated with Xanthomonas sp. AB10119 strain (FERM BP-7168) and cultured with shaking at 27 ° C for 3 days. The cells obtained by centrifuging this culture solution were washed with 200 ml of 0.05 M phosphate buffer (pH 6.0) and then centrifuged again to obtain 20 g (wet weight) of washed cells.
[0121]
(2) Generation of D-allo-3-inosose
All the washed cells obtained as described above were added to 400 ml of 0.05 M phosphate buffer (pH 6.0) (allo-inositol concentration 40 mg / ml) containing 16 g of allo-inositol. The microorganism was reacted with allo-inositol while stirring with a stirrer at 27 ° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction solution was sterilized. When the obtained supernatant was analyzed by liquid chromatography, 37.4 mg / ml (conversion 94.5%) of D-allo-3-inosose was produced and accumulated. No allo-inositol was detected in the reaction solution at this time.
[0122]
In addition, the conversion rate of said D-allo-3-inosose was calculated | required by following Formula.
Conversion rate (%) = [mole number of D-allo-3-inosose in 1 ml of reaction completed solution / mole number of allo-inositol in 1 ml of solution before reaction] × 100
[0123]
(3) Isolation of D-allo-3-inosose
The bacterial cells were removed from the reaction solution obtained in Example 8 (2) by centrifugation, and 100 ml of the obtained supernatant was removed from the strongly acidic cation exchange resin Duolite (registered trademark) C-20 ( H⁺The sample was passed through a column (inner diameter 1.5 cm, length 30 cm) packed with 20 ml. The column was then washed by passing 20 ml of deionized water. The passing liquid and the washing liquid were passed through a column (inner diameter 1.5 cm, length 30 cm) packed with 40 ml of weakly basic anion exchange resin Duolite (registered trademark) 368S (free base type), and then 40 ml of this column was passed through the column. Washed with deionized water.
There were almost no impurities other than the D-allo-3-inosose in the passing liquid and the water washing liquid thus obtained.
[0124]
The D-allo-3-inosose aqueous solution obtained above was concentrated to 20 ml under reduced pressure, and 60 ml of ethanol was added for crystallization. As a result, 2.4 g of colorless crystals of pure D-allo-3-inosose was obtained. At this time, the yield of the purified product was 63.0%, and the total recovery rate of D-allo-3-inosose from allo-inositol was 59.5%.
[0125]
In addition, the refinement | purification recovery rate of the said D-allo-3-inosose was calculated | required by following Formula.
Purified product recovery rate (%) = [purified and isolated D-allo-3-inosose amount / D-allo-3-inosose before purification in 100 ml of reaction solution] × 100
Further, the total recovery rate of D-allo-3-inosose from allo-inositol was determined by the following equation.
Total recovery (%) = [number of moles of purified and isolated D-allo-3-inosose ÷ number of moles of the substance contained in 100 ml of allo-inositol added to the solution before the reaction] × 100
[0126]
[Example 9]
Manufacturing method (I) (No. 11 Of D-kilo-inositol by the method of the present invention)
(1) Production of D-kilo-inositol
The method of Example 8 (1)-(2) was repeated. Concentration gave 100 ml of an aqueous solution containing 4 g of D-allo-3-inosose. To this aqueous solution, 0.26 g of sodium borohydride was gradually added. After completion of the reduction, the reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography under the following conditions. As a result, it was found that the reaction liquid after the reduction reaction contained 2.0 g of the produced D-kilo-inositol and 1.9 g of allo-inositol as a by-product. The total reduction yield of D-kilo-inositol and allo-inositol was 98.3%. The reduction yield of D-kilo-inositol from D-allo-3-inosose was 49.4%.
[0127]
Analytical conditions for high performance liquid chromatography are as follows.

[0128]
Total reduction yield of D-kilo-inositol and allo-inositol (%) = [sum of the number of moles of D-kilo-inositol after the reduction reaction and the number of moles of allo-inositol ÷ D-allo-3 before the reduction reaction -Number of moles of inosource] x 100
Moreover, the reaction yield of allo-inositol from said D-allo-3-inosose was calculated | required by following Formula.
Reaction yield (%) = [number of moles of D-kilo-inositol after reduction reaction ÷ number of moles of D-allo-3-inosose before reduction reaction] × 100
[0129]
(2) Isolation of D-kilo-inositol
The reaction solution obtained after the reduction reaction obtained in the above item (2) was used as a strongly acidic cation exchange resin Duolite (registered trademark) C-20 (H⁺The sample was passed through a column (inner diameter 1.5 cm, length 30 cm) packed with 20 ml. The column was then washed by passing 20 ml of deionized water. The passing liquid and the washing liquid were used as a strongly basic anion exchange resin Duolite (registered trademark) A-113 (OH⁻The sample was passed through a column (inner diameter 1.5 cm, length 30 cm) packed with 40 ml, and then washed with 40 ml of deionized water.
The aqueous solution obtained by combining the passing liquid and the water washing liquid thus obtained contained D-kilo-inositol and allo-inositol as a by-product, but contained almost no impurities other than these.
[0130]
The aqueous solution of D-kilo-inositol and allo-inositol obtained as described above was concentrated to 20 ml under reduced pressure, and the concentrated solution was subjected to strong acidic cation exchange resin Diaion (registered trademark) UBK520M (Ca²⁺The sample was passed through a column (inner diameter: 3 cm, length: 50 cm) packed with 250 ml of a column, and then deionized water was passed through the column for elution. The eluate of the column was separately collected into a fraction containing the desired D-kilo-inositol and a fraction containing allo-inositol. The fraction containing D-kilo-inositol did not contain allo-inositol. The fraction containing D-kilo-inositol was concentrated to 20 ml and crystallized by adding 60 ml of ethanol. By this operation, 1.4 g of colorless crystals of high-purity allo-inositol was obtained (refined product recovery rate: 67.5%). At this time, the total recovery rate of D-kilo-inositol from D-allo-3-inosose was 33.8%.
[0131]
The D-kilo-inositol purified product recovery rate and total recovery rate were determined by the following equations.
Purified product recovery rate (%) = [purified and isolated D-kilo-inositol amount / D-kilo-inositol amount before purification in 100 ml of reaction solution] × 100
Total recovery (%) = [number of moles of purified and isolated D-kilo-inositol ÷ number of moles of D-allo-3-inosose added to the solution before reaction] × 100
[0132]
[Example 10]
Manufacturing method (J) (No. 12 Of D-kilo-inositol by the method of the present invention)
(1) Production of D-kilo-inositol
(i) The method of Example 8 (1), (2) was repeated. 100 ml of the supernatant of the D-allo-3-inosose-containing reaction solution thus obtained was collected, adjusted to pH 5 with 5 M hydrochloric acid, and 0.26 g of sodium borohydride was gradually added. After completion of the reduction, the reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 7 (1). As a result, it was found that the reaction solution after the reduction reaction contained 1.9 g of produced D-kilo-inositol and contained 1.9 g of allo-inositol as a by-product. The total reduction yield of D-kilo-inositol and allo-inositol was 99.0%. The reduction yield of D-kilo-inositol from D-allo-3-inosose was 49.5%.
[0133]
(ii) This reduction reaction solution was adjusted to pH 6 with 5M hydrochloric acid, and then a quarter amount of AB10119 strain cells separated and recovered in Example 8 (2) was added to this solution again. The microorganism was reacted with allo-inositol with stirring at 27 ° C. for 24 hours. After the reaction, the reaction solution was sterilized. The obtained supernatant was analyzed by high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 9 (1). As a result, the reaction solution after completion of the reaction contained 1.9 g of unreacted D-kilo-inositol and 1.8 g of D-allo-5-inosose. The conversion rate of allo-inositol, which is a by-product in the reduction reaction, to D-allo-3-inosose was 95%.
[0134]
(iii) Next, after adjusting the reaction supernatant containing D-kilo-inositol and D-allo-5-inosose to pH 5 with 1M hydrochloric acid, 0.12 g of sodium borohydride was gradually added to this solution. The reduction reaction was performed again. After completion of the reduction, the reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 9 (1). As a result, it was found that the reaction solution after completion of the reduction contained 2.8 g of D-kilo-inositol and 0.9 g of allo-inositol as a by-product. At this time, the total reduction yield of D-kilo-inositol and allo-inositol was 98.5%.
Overall, the overall reaction yield from D-allo-3-inosose to D-kilo-inositol was 74.1%.
[0135]
The total reduction yield of D-kilo-inositol and allo-inositol from D-allo-3-inosose and the reduction yield of allo-inositol from D-allo-5-inosose are shown in Example 7 (1). Obtained by the formula. However, the second reduction yield was determined from the value obtained by subtracting the amount of unreacted D-kilo-inositol from the amount of D-kilo-inositol contained in the reaction solution.
[0136]
The conversion rate of D-allo-3-inosose was determined from the formula shown in Example 6 (1).
[0137]
Moreover, the total reaction yield of allo-inositol was calculated | required by following Formula.
Total reaction yield of D-kilo-inositol = [number of moles of D-kilo-inositol in the final reaction solution / number of moles of D-allo-3-inosose in the solution before the start of reaction] × 100
[0138]
(2) Isolation of D-kilo-inositol
Isolation of D-kilo-inositol in the reaction solution was performed according to the method of Example 9 (2). By this operation, 1.9 g of colorless crystals of pure D-kilo-inositol was obtained (purification recovery rate: 69.5%). At this time, the total recovery rate of D-kilo-inositol from D-allo-3-inosose was 51.5%.
The purification recovery rate of allo-inositol and the overall recovery rate from allo-inositol before the start of the reaction were determined as shown in Example 9 (2).
[0139]
Example 11
Manufacturing method (L) (No. 14 Of D-kilo-inositol by the method of the present invention)
(i) 5 M of washed static cells of Sphingomonas sp. AB10233 strain (FERM P-17894) produced according to the method of Example 2 (1), 0.05 M phosphoric acid containing 4 g of epi-inositol The solution was added to 100 ml of a buffer solution (pH 6.0) and reacted at 27 ° C. for 24 hours with stirring. The reaction solution after completion of the reaction was analyzed by high performance liquid chromatography under the conditions shown in Example 1 (1). As a result, the reaction solution contained 38 mg / ml of D-allo-5-inosose (conversion 97.0). %).
[0140]
(ii) The reaction solution was sterilized by centrifugation to obtain a supernatant. The cells recovered by sterilization were used for the following second cell reaction.
(iii) After adjusting the reaction supernatant containing D-allo-5-inosose obtained in (ii) above to pH 6 with 1M sodium hydroxide, 0.25 g of sodium borohydride is gradually added to this solution for reduction reaction. Went. After the reduction, the produced reaction solution containing allo-inositol was analyzed by high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 4 (2). As a result, it was found that the reaction solution after the reduction reaction contained 2.1 g of the produced allo-inositol and 1.8 g of epi-inositol as a by-product. The total reduction yield of allo-inositol and epi-inositol was 99.0%, and the reduction yield of allo-inositol from D-allo-5-inosose was 53.5%.
[0141]
(iv) The reduction reaction solution was adjusted to pH 6 with 5M hydrochloric acid, and the cells recovered in (ii) above were added again to this solution. Microorganisms were reacted with epi-inositol for 24 hours at 27 ° C. The solution after completion of the reaction contained 2.1 g of unreacted allo-inositol and 1.7 g / ml D-allo-5-inosose.
[0142]
(v) Next, the cells were removed from the reaction solution. The resulting reaction supernatant was adjusted to pH 6 with sodium hydroxide, and 0.12 g of sodium borohydride was gradually added to this solution. The reaction solution after the reduction was found to contain 2.9 g of allo-inositol and 0.8 g of by-product epi-inositol.
[0143]
(vi) Next, the allo-inositol and epi-inositol-containing solution obtained in the previous item (v) was adjusted to pH 6 with 5M hydrochloric acid. Thereafter, 4 g of washed static cells of Xanthomonas sp. AB10119 strain (FERM P-7168) prepared according to the method of Example 8 (1) was added to this solution. The reaction was carried out with stirring at 27 ° C. for 24 hours. As a result, the reaction liquid after completion of the reaction contained 2.8 g of D-allo-3-inosose (conversion 95.5%) and 0.8 g of unreacted epi-inositol.
[0144]
(vii) The reaction solution was sterilized by centrifugation to obtain a supernatant. The collected cells were used for the following second cell reaction.
(viii) After adjusting the reaction supernatant containing D-allo-3-inosose obtained in (vii) above to pH 5 with 1M hydrochloric acid, 0.18 g of sodium borohydride was gradually added to this solution to carry out the reduction reaction. went. After completion of the reduction, the reaction solution was analyzed by high performance liquid chromatography under the conditions described in Example 9 (2). As a result, the reaction solution after the reduction reaction contains 1.4 g of the produced D-kilo-inositol, and 1.4 g of allo-inositol and 0.8 g of unreacted epi-inositol as by-products. I found out.
[0145]
(ix) After the reduction reaction solution obtained in the previous item (viii) was adjusted to pH 6 with 5M hydrochloric acid, the cells recovered in the previous item (vii) were again added to this solution. Microorganisms were reacted with epi-inositol for 24 hours at 27 ° C. The solution after completion of the reaction contained 1.3 g of D-allo-5-inosose, 1.4 g of unreacted D-kilo-inositol and 0.8 g of epi-inositol.
[0146]
(x) Next, the reaction solution obtained in (ix) above was sterilized, and the resulting reaction solution supernatant was adjusted to pH 5 with 1M hydrochloric acid, and 0.1 g of sodium borohydride was gradually added to this solution. In addition to the above, D-allo-5-inosose was reduced. The reaction solution after completion of the reduction was found to contain 2.0 g of D-kilo-inositol, 0.6 g of allo-inositol and 0.8 g of epi-inositol.
[0147]
Overall, the overall reaction yield from epi-inositol to D-chiro-inositol was 49.6%.
The total reaction yield of D-kilo-inositol was determined by the following formula.
Total reaction yield of D-kilo-inositol = [number of moles of D-kilo-inositol in the final reaction solution / number of moles of epi-inositol in the solution before the start of reaction] × 100
[0148]
(2) Isolation of D-kilo-inositol
Isolation of D-kilo-inositol in the reaction solution was performed according to the method of Example 9 (2). By this operation, 1.3 g of pure crystals of pure D-kilo-inositol was obtained (purification recovery rate: 65.0%). At this time, the total recovery rate of D-kilo-inositol from epi-inositol was 32.3%.

Claims (20)

Formula (I) below

A novel substance represented by the formula: D-Allo-5-inosose. A microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Sphingomonas having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol into D-allo-5-inosose is allowed to act on epi-inositol, whereby the epi-inositol is converted into D- A method for producing D-allo-5-inosose, comprising: converting to allo-5-inosose to produce D-allo-5-inosose and recovering D-allo-5-inosose . A microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Sphingomonas having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol according to claim 2 into D-allo-5-inosose is Xanthomonas sp. AB10198 strain (FERM P-17893) or Sphingomonas sp. AB10233 The method according to claim 2, which is a strain (FERM P-17894). A microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Sphingomonas having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol according to claim 2 into D-allo-5-inosose is preferred in a liquid medium containing epi-inositol and a carbon source and a nitrogen source. In the culture, the microorganism is allowed to act on epi-inositol in the culture medium to produce and accumulate D-allo-5-inosose in the culture liquid. -A method for producing D-allo-5-inosose, characterized in that inosose is recovered. A step of culturing a microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Sphingomonas having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol according to claim 2 into D-allo-5-inosose in a medium, and from the obtained culture, A step of separating the cells, a step of adding the cells to a buffer or liquid medium containing epi-inositol, and a reaction obtained by reacting the cells with epi-inositol in the buffer or liquid medium A method for producing D-allo-5-inosose, comprising a step of producing D-allo-5-inosose in a liquid and a step of recovering D-allo-5-inosose from the reaction liquid. In order to recover D-allo-5-inosose produced and accumulated in an aqueous medium obtained as a culture solution or a reaction solution by the method according to claim 4 or claim 5 , After removal, high-purity D-allo-5-inosose is efficiently recovered from the aqueous medium by applying the aqueous medium to an ion exchange resin treatment method, an activated carbon treatment method, or a crystallization method. The method according to claim 4 or 5 .   Adding an alkali metal borohydride, alkali metal borohydride or alkali metal borohydride as a reducing agent to an aqueous medium in which D-allo-5-inosose is dissolved and contained; and A process for reducing D-allo-5-inosose in the aqueous solution, thereby producing allo-inositol and epi-inositol in the aqueous medium, and allo-inositol and epi-inositol from the resulting reduction reaction And a step of separating the recovered allo-inositol and epi-inositol from each other, and a method for producing allo-inositol. A microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Sphingomonas having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol into D-allo-5-inosose according to claim 2 is allowed to act on epi-inositol in an aqueous medium to produce epi-inositol. A step of producing D-allo-5-inosose in the aqueous medium by the conversion of the method, and removing the cells of the microorganism from the aqueous medium containing D-allo-5-inosose produced in the above step A step of obtaining an aqueous medium containing the obtained D-allo-5-inosose but not containing cells, and without isolating D-allo-5-inosose from the aqueous medium containing no cells. In the aqueous medium containing D-allo-5-inosose, an alkali metal borohydride, a trialkoxyboron alkali metal hydride or a boron cyanide as a reducing agent is used. A step of adding potassium metal and a reaction of reducing D-allo-5-inosose with the reducing agent in the aqueous medium, and forming allo-inositol and epi-inositol by reduction of D-allo-5-inosose A step of recovering allo-inositol and epi-inositol from the obtained reduction reaction solution, and a step of separating the recovered allo-inositol and epi-inositol from each other. A method for producing allo-inositol. A step of culturing a microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Sphingomonas having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol according to claim 2 into D-allo-5-inosose in a medium, and fungi of the microorganism from the obtained culture Separating the body, adding the cell to an aqueous medium comprising a buffer or liquid medium containing epi-inositol, allowing the cell to act on epi-inositol in the aqueous medium, A step of producing D-allo-5-inosose by conversion of inositol, and separating and recovering the cells of the microorganism from the aqueous medium containing D-allo-5-inosose produced in the above step. A step of obtaining an aqueous medium containing the produced D-allo-5-inosose but not containing microbial cells, and D-allo-5-inosose from the aqueous medium containing no microbial cells. Without adding an alkali metal borohydride, alkali metal borohydride or alkali metal cyanoborohydride as a reducing agent to the aqueous medium containing D-allo-5-inosose, and the aqueous medium A reaction for reducing D-allo-5-inosose with the reducing agent, and producing allo-inositol and epi-inositol in the aqueous medium by the reduction reaction, and the resulting reduction reaction solution Without isolating allo-inositol and epi-inositol from the step, adding the cells separated and recovered in the above step to the reduction reaction solution, and adding the added cells to epi-inositol in the reaction solution To produce D-allo-5-inosose again, thereby reacting with the regenerated D-allo-5-inosose and unreacted allo-inositol. A step of obtaining an aqueous medium containing microbial cells, a step of removing the added microbial cells from the aqueous medium from the previous step, and thus D-allo-5-inosose and unreacted allo-inositol. Obtaining an aqueous medium that does not contain bacterial cells, and adding the same reducing agent to the aqueous medium without isolating D-allo-5-inosose from the aqueous medium that does not contain bacterial cells; A reaction for reducing D-allo-5-inosose with the reducing agent is performed in the aqueous medium, and epi-inositol and allo-inositol are generated in the aqueous medium by the reduction reaction of D-allo-5-inosose. Thus, a step of obtaining a reduction reaction solution containing epi-inositol and allo-inositol at a high concentration, a step of recovering allo-inositol and epi-inositol from the reduction reaction solution, A process for separating allo-inositol and epi-inositol from each other. A microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Pseudomonas having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol into D-allo-3-inosose is allowed to act on allo-inositol, so that the allo-inositol is converted into D-allo. A process for producing D-allo-3-inosose, comprising converting to 3-inosose to produce D-allo-3-inosose, and further recovering D-allo-3-inosose. A microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Pseudomonas having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol according to claim 10 into D-allo-3-inosose is Xanthomonas sp. AB10119 strain (FERM BP-7168) or Pseudomonas sp. Strain AB10215 ( the method of claim 10 which is FERM BP-7170). A microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Pseudomonas having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol according to claim 10 into D-allo-3-inosose is aerobic in a liquid medium containing allo-inositol, a carbon source and a nitrogen source. D-allo-inositol is caused to act on allo-inositol in the culture solution to produce and accumulate D-allo-3-inosose in the culture solution, and this is recovered. A method for producing allo-3-inosose. A step of culturing a microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Pseudomonas having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol according to claim 10 into D-allo-3-inosose in a medium, and fungi of the microorganism from the obtained culture Separating the body, adding the cells to a buffer or liquid medium containing allo-inositol, reacting with allo-inositol in the buffer or liquid medium, and adding D- A method for producing D-allo-3-inosose, comprising the steps of generating allo-3-inosose and further recovering it. In order to recover D-allo-3-inosose produced and accumulated in an aqueous medium obtained as a culture solution or a reaction solution by the method according to claim 12 or claim 13 , bacterial cells are collected from the aqueous medium. After the removal, the aqueous medium containing D-allo-3-inosose is subjected to an ion exchange resin treatment method, an activated carbon treatment method, or a crystallization method, whereby high-purity D-allo-3-inosose is efficiently obtained. The method for producing D-allo-3-inosose according to claim 12 or 13 , wherein the process is recovered from an aqueous medium. A microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Pseudomonas having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol according to claim 10 into D-allo-3-inosose is allowed to act on allo-inositol in an aqueous medium, whereby D of allo-inositol is obtained. A step of producing D-allo-3-inosose by conversion to allo-3-inosose, and a fungus of the microorganism from an aqueous medium of the reaction solution containing D-allo-3-inosose produced in the above step Removing the body to obtain an aqueous medium containing the produced D-allo-3-inosose but not containing cells, and D-allo-3-inosose from the aqueous medium containing no cells Without isolation, alkali metal borohydride, trialkoxy boron alkali metal hydride or alkali metal cyanoborohydride is used as a reducing agent in the aqueous medium. And a step of reducing D-allo-3-inosose with the reducing agent in the aqueous medium, thereby producing D-kilo-inositol and allo-inositol in the aqueous medium; A step of recovering D-kilo-inositol and allo-inositol from the reduction reaction solution, and a step of separating the recovered D-kilo-inositol and allo-inositol from each other, D- A method for producing kilo-inositol. A step of culturing a microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Pseudomonas having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol according to claim 10 into D-allo-3-inosose in a medium, and microbial cells from the obtained culture A step of separating, a step of adding the separated and recovered cells to an aqueous medium comprising a buffer solution or a liquid medium containing allo-inositol, and allowing allo-inositol to act on the allo-inositol in the aqueous medium. Of D-allo-3-inosose by conversion of D-allo-3-inosose into a D-allo-3-inosose, and the microorganism from the aqueous medium containing the D-allo-3-inosose produced in the above step A step of separating and recovering the bacterial cells, a step of obtaining an aqueous medium containing D-allo-3-inosose but not containing the bacterial cells, and this process. In the aqueous medium containing D-allo-3-inosose, without isolating D-allo-3-inosose from the aqueous medium obtained in the above step, an alkali metal borohydride or trialkoxyboron alkali as a reducing agent A step of adding a metal or alkali metal boron cyanide and a reaction of reducing D-allo-3-inosose with the reducing agent, thereby producing D-kilo-inositol and allo-inositol in the aqueous medium A step of adding the cells recovered in the previous step to the reduction reaction solution without isolating D-kilo-inositol and allo-inositol from the obtained reduction reaction solution, and the reduction reaction solution The D-allo-3-inosose added to the cells was allowed to act to produce D-allo-3-inosose again, and the D-allo-3-inosose produced again was regenerated. -From the aqueous medium containing D-kilo-inositol unreacted with allo-3-inosose, the microbial cells of the microorganism are removed, and the produced D-kilo-inositol and unreacted D-kilo- A step of obtaining an aqueous medium containing inositol but not containing cells, and the same reduction as described above in the aqueous medium without isolating D-allo-3-inosose from the aqueous medium containing no cells. In the aqueous medium, a step of reducing D-allo-3-inosose with the reducing agent to produce D-kilo-inositol and allo-inositol is carried out in the aqueous medium, whereby allo-inositol and From the step of producing D-kilo-inositol in the reduction reaction solution and the reduction reaction solution containing D-kilo-inositol and allo-inositol at a high concentration thus obtained, D-kilo-inositol and alloiy A method for producing D-chiro-inositol, which comprises a step of recovering nositol and a step of separating the recovered D-chiro-inositol and allo-inositol from each other. A microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Sphingomonas having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol according to claim 2 into D-allo-5-inosose is allowed to act on epi-inositol in an aqueous medium to produce epi-inositol. A step of producing D-allo-5-inosose by conversion, and a D-allo-5-inosose produced in the above step is removed from the aqueous medium containing D-allo-5-inosose to obtain D- A step of obtaining an aqueous medium containing allo-5-inosose but not containing cells; and D-allo-5-inosose from the aqueous medium containing no cells but containing D-allo-5-inosose. After release or without isolation, an alkali metal borohydride, trialkoxyboron hydride as a reducing agent in an aqueous medium containing D-allo-5-inosose A step of adding a alkali metal or alkali metal boron cyanide, and a reaction of reducing D-allo-5-inosose with the reducing agent in the aqueous medium, whereby allo-inositol and epi-inositol are converted into the aqueous medium. A microorganism having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol into D-allo-3-inosose in the aqueous medium of the reduction reaction solution containing allo-inositol and epi-inositol thus obtained in a step of generating in the medium Adding D. allo-inositol by allowing microorganisms to act on allo-inositol in the aqueous medium and converting allo-inositol to D-allo-3-inosose, and From the aqueous medium of the reaction solution containing D-allo-3-inosose and unreacted epi-inositol produced in the step To obtain an aqueous medium containing the obtained D-allo-3-inosose and unreacted epi-inositol, and D-allo-3-inosose is simply obtained from the aqueous medium. After separation or without isolation, adding the same reducing agent as a reducing agent as described above to an aqueous medium containing D-allo-3-inosose; A reaction for reducing -3-inosose, thereby producing D-kilo-inositol and allo-inositol in the aqueous medium, and from the reaction solution of the reduction reaction thus obtained, D-kilo-inositol and allo-inositol. A method for producing D-kilo-inositol, which comprises a step of collecting inositol and a step of separating the collected D-kilo-inositol and allo-inositol from each other. A step of culturing a microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Sphingomonas having an oxidizing ability capable of converting epi-inositol according to claim 2 into D-allo-5-inosose in a medium, and the microorganism cells from the obtained culture Separating the recovered and recovered cells into an aqueous medium comprising a buffer or liquid medium containing epi-inositol, and adding the cells added in the aqueous medium to epi-inositol To produce D-allo-5-inosose by conversion of epi-inositol, and to separate the cells of the microorganism from the aqueous medium containing D-allo-5-inosose produced in this step Recovering and recovering the produced aqueous medium containing D-allo-5-inosose, and not isolating D-allo-5-inosose from the aqueous medium Adding an alkali metal borohydride, alkali metal borohydride or alkali metal borohydride as a reducing agent in the aqueous medium containing D-allo-5-inosose, and D- A step of reducing allo-5-inosose, producing allo-inositol and epi-inositol in the aqueous medium by reduction of D-allo-5-inosose, and allo-reaction from the resulting reduction reaction solution Without isolating inositol and epi-inositol, the step of adding the cells separated and recovered in the previous step to the reduction reaction solution, and adding the cells added in the reduction reaction solution to epi-inositol D-allo-5-inosose is produced again, and contains allo-inositol unreacted with the D-allo-5-inosose produced here. Obtaining an aqueous medium, removing the cells of the microorganism from the aqueous medium, obtaining an aqueous medium containing allo-inositol unreacted with D-allo-5-inosose, and D- Adding the same reducing agent to the aqueous medium without isolating D-allo-5-inosose from the aqueous medium containing allo-5-inosose and allo-inositol; , Reducing D-allo-5-inosose with the reducing agent, and reducing D-allo-5-inosose to produce epi-inositol and allo-inositol. A step of obtaining an aqueous medium containing a high concentration, and Xanthomonas spp. Or pseudo having an oxidizing ability capable of converting allo-inositol according to claim 7 into D-allo-3-inosose. A step of culturing microorganisms belonging to the genus Monas , a step of separating and recovering the microbial cells from the obtained culture, and the cells recovered in this step obtained in the previous step A step of adding epi-inositol and allo-inositol into an aqueous medium containing a high concentration, and allowing the cells added in the aqueous medium to act on allo-inositol, whereby D-allo-3 of allo-inositol Producing D-allo-3-inosose by conversion to inosource, obtaining an aqueous medium containing epi-inositol unreacted with the D-allo-3-inosose produced therein; Separating and recovering the cells of the microorganism from the medium, obtaining an aqueous medium containing the produced D-allo-3-inosose and unreacted epi-inositol; Without isolating 3-inosose, alkali metal borohydride, alkali metal borohydride or alkali metal cyanoborohydride as a reducing agent in the aqueous medium containing D-allo-3-inosose and epi-inositol And a reaction of reducing D-allo-3-inosose with the reducing agent in the aqueous medium to produce D-kilo-inositol and allo-inositol by reduction of D-allo-3-inosose A step of obtaining an aqueous medium containing epi-inositol unreacted with D-kilo-inositol and allo-inositol, and D-kilo-inositol, allo-inositol and epi- Without isolation of inositol, recovered cells of the above step (converting allo-inositol into D-allo-3-inosose) And adding the cells) of a microorganism belonging to the genus Xanthomonas or Pseudomonas having Kill oxidizing ability in the reducing reaction, the reduction reaction in allo - inositol is reacted with added bacteria, D- allo -3 Regenerating inosose to obtain an aqueous medium containing D-allo-3-inosose and D-kilo-inositol and epi-inositol unreacted therewith, and Removing a microbial cell to obtain an aqueous medium containing D-kilo-inositol and epi-inositol unreacted with the produced D-allo-3-inosose, and D-allo-3 from the aqueous medium; A step of adding the same reducing agent as described above in the aqueous medium without isolating the inosource, and a reaction of reducing D-allo-3-inosose with the reducing agent in the aqueous medium. And thereby producing allo-inositol and D-kilo-inositol, obtaining a reduction reaction solution containing allo-inositol and D-kilo-inositol at a high concentration and containing unreacted epi-inositol; Recovering D-kilo-inositol and allo-inositol and epi-inositol from the reduction reaction solution obtained in this step, and separating the recovered D-kilo-inositol, allo-inositol and epi-inositol from each other And a process for producing D-kilo-inositol. The reducing agent used in the step of reducing D-allo-5-inosose or D-allo-3-inosose is sodium borohydride, lithium borohydride, potassium borohydride, sodium methoxyborohydride or borohydride cyanide. The method according to claim 7 , 8 , 9 , 15 , 16 , 17 or 18 which is sodium. The method according to claim 7 , 8 , 9 , 15 , 16 , 17 or 18 , wherein the aqueous medium used is water and the reducing agent used is sodium borohydride.