JP3981597B2 - Method for producing scyllo-inosose and method for producing scyllo-inositol - Google Patents

Description

または次の立体構造式（A'）

で表される天然に産する既知の物質である。
【０００３】
また、シロ−イノソースは次の平面式（B）

または次の立体構造式（B'）

で表される既知の化合物である。さらに、シロ−イノシトールは次の平面式（C）

または次の立体構造式（C'）

で表される既知の化合物である。
【０００４】
シロ−イノシトールはミオ−イノシトールの立体異性体の一つで、動物・植物中に広く見出される物質である。また、シロ−イノソースはミオ−イノシトールの2位のアキシャルな水酸基が酸化された構造を有する化合物でこれも天然物として普遍的に存在する。
【０００５】
ミオ−イノシトールを酸化してシロ−イノソースへ変換する酵素（ミオ−イノシトールデヒドロゲナーゼ）は自然界に広く存在する酵素であり、動物、藻類、酵母、細菌等、多くの生物種からのものについて報告がある。上記酵素を有する代表的な微生物種としては、グルコノバクター属細菌（Helvetica Chimica Acta、第24巻、第1045〜1058頁、1941年及びJournal of Organic Chemistry、第26巻、第912〜918頁、1961年等）、バチルス属細菌（特開平4−126075号公報）、シュードモナス属細等（Monatshefle fur Chemie、第100巻、第1327〜1337頁、1969年及びJournal of Bacteriology、第131巻、第872〜875頁、1977年）がある。なお、グルコノバクター属細菌を記載する前記のHelvetica Chimica Acta、第24巻、第1045〜1058頁（1941年）及びJournal of Organic Chemistry、第26巻、第912〜918頁（1961年）等の論文中にはAcetobacter oxydansあるいはAcetobacter suboxydansと記載されているが、これらの菌株はその後Gluconobacter属として再分類され、Bargcy’s Manual of Deteminative Bacteriology第8版（1974年）から以降はGluconobacter属に移されている。
【０００６】
また、ミオ−イノシトールをシロ−イノシトールへ変換できる微生物としてはアグロバクテリウム属細菌が知られている（特開平9−140388号公報）。
【０００７】
一方、化学合成的手法でシロ−イノソースまたはシロ−イノシトールを製造する方法としては、(1)ヘキサヒドロキシベンゼンをラネイニッケルで還元し、シロ−イノシトールを得る方法（Journal of the American Chemical Society, 70巻、293頁、1948年）；(2)グルコフラノース誘導体から5段階の反応でシロ−イノソースを得た後、還元して、シロ−イノシトールを得る方法（Journal of the American Chemical Society、第90巻、第3289〜3290頁、1968年）；(3)シス−トリオキサ−トリス−ホモベンゼンを原料に4段階以上の反応でシロ−イノシトールを得る方法（Angwandte Chemie、第85巻、第1110〜1111頁、1973年）；(4)ミオ−イノシトールを白金触媒で酸化してシロ−イノソースを得、続いてエステル化した後、還元と加水分解を行って、シロ−イノシトールを得る方法（ドイツ連邦共和国公開特許第3,405,663号公報）等がある。
【０００８】
以上のように、ミオ−イノシトールを微生物により酸化してシロ−イノソースを生成する方法、及び、シロ−イノソースを適当な還元剤で還元してシロ−イノシトールを生成する方法は公知の技術である。
【０００９】
しかしながら、これら既知のシロ−イノソース及びシロ−イノシトールの製造方法は、いずれも工業的規模で実施する方法としては、使用される微生物の変換活性が弱く、また操作の煩雑さ、環境汚染あるいは経済性の面で問題があるので、これらの従来法は全て必ずしも満足し得るものではない。従って、工業規模で簡便に且つ効率よくシロ−イノソースを製造する方法、及びシロ−イノシトールを製造する方法が要望されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、高純度のシロ−イノソースを効率よく製造できる新しい方法及びシロ−イノシトールを効率よく製造できる新しい方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記目的を達成するために鋭意検討を重ねてきた。その結果、本発明者らが自然界より新たに分離した、シュードモナス属細菌と同定されてAB10064の菌株番号を付与された新菌株の細菌を、ミオ−イノシトールに作用させると、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを選択的に高収率で生成させ得る選択的な酸化の活性をもつことを見出した。また、同様な活性が別個に分離されたアセトバクター属細菌と同定されてAB10253の菌株番号を付与された菌株にも見出された。
【００１２】
本発明者らの研究によれば、ミオ−イノシトールと通常の炭素源及び窒素源とを含有する液体培地、あるいは通常の炭素源を特に含有しないでミオ−イノシトールと窒素源とを含有する液体培地で上記のアセトバクター・エスピーAB10253株の細菌を好気的に培養して、これにより得られた培養液中で、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成させ且つシロ−イノソースを高い含有量で蓄積させるようにしてシロ−イノソースの新しい製造法を本発明で実施できる。また、本発明のシロ−イノソースの新しい製造方法では、培養液中にまたは水性媒質中に高い含有量で蓄積したシロ−イノソースは、これに何ら化学的処理を施さずに、陽イオン交換樹脂、陰イオン交換樹脂等を使用するイオン交換樹脂処理あるいは活性炭処理あるいは晶析操作にかけることにより、あるいはこれらの処理の組合せにかけることにより、高純度なシロ−イノソースとして、効率よく回収するようにして実施できる。
【００１３】
さらに、本発明者らが別途の研究を行った結果、上記の培養液中に蓄積されたシロ−イノソースは、培養液から菌体を除去した後、得られた培養上清液に直接、適当な量の水素化ホウ素ナトリウム等の還元剤を添加して、培養上清液中で上記シロ−イノソースに該還元剤を反応させた場合には、シロ−イノソースはシロ−イノシトールに効率よく還元されること、およびミオ−イノシトールが副生されることが知見された。すなわち、培養上清液中のシロ−イノソースは、該上清液から単離されなくとも、上記還元剤との反応により培養上清液内でシロ−イノシトールに効率よく還元され得ることが見出された。また、このとき、シロ−イノシトールの生成と同時にミオ−イノシトールも副成することが見出された。こうして得られた還元反応液に対して、還元反応前に培養液から除去した前記AB10253株の細菌を再度添加し、酵母エキス等の適当な栄養源と共に反復回分培養を実施すると、還元反応液中のシロ−イノシトールには全く影響を与えずに、副成したミオ−イノシトールのみをシロ−イノソースへ変換する酸化反応が進行することが判明した。更に、この酸化の反応液（培養液）から除菌し、さらにその培養上清液に再度、還元剤を添加し、シロ−イノソースを還元すると、ここで得られた還元反応液中のシロ−イノシトールの含量が増大し、従って、このように行われた方法は効率的なシロ−イノシトールの製造方法として非常に有効な手段であることを知見した。この微生物的酸化反応と化学的還元反応は、繰り返し実施することで更に反応液または培養液（または培養上清液）中のシロ−イノシトールの含有量を増大させることが可能であることも知見した。
【００１４】
従って、第1の本発明においては、ミオ−イノシトールに、細菌であるアセトバクター・エスピーAB10253株（受託番号FERM P−18868として寄託）を作用させて、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースへ変換させることを特徴とする、シロ−イノソースの製造方法が提供される。
【００１５】
適当な精製方法、例えばイオン交換樹脂処理、あるいは晶析等あるいはこれらの組合せにかけることにより、上記の方法で得られた反応液または培養上清液から効率よくシロ−イノソースを回収することができる。
【００１６】
第1の本発明の方法は、具体的には以下に示す（A）及び（B）の2つの実施方法で行うことができる。
【００１７】
実施方法（A）では、ミオ−イノシトール並びに炭素源及び窒素源を含有する液体培地に、前記AB10253株の細菌を接種して好気的に培養し、得られた培養液中で該細菌をミオ−イノシトールに作用させて、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースへ変換させ、これにより培養液中でシロ−イノソースを生成させかつ蓄積させ、そして培養液から菌体を除き、得られた培養上清液で例えばイオン交換樹脂処理又は晶析操作又はこれらの組合せを行うことにより、培養上清液からシロ−イノソースを回収する。
【００１８】
実施方法（B）は、上記 AB10253株の細菌をミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、その培養液から菌体を除き、ここで得られた菌体或いはその破砕物を、ミオ−イノシトールを含む水溶液または緩衝液中でミオ−イノシトールに作用させて前記の水溶液または緩衝液中でシロ−イノソースを生成せしめ、そして、生成したシロ−イノソースを例えばイオン交換樹脂処理又は晶析操作又はこれらの組合せにより回収する。
【００１９】
以下においては、第1の本発明の方法の実施方法（A）及び（B）をより詳しく説明する。
【００２０】
実施方法（A）では、ミオ−イノシトールならびに炭素源及び窒素源を含む液体栄養培地に、前記AB10253株の細菌を接種して好気的に培養することにより、ミオ−イノシトールからシロ−イノソースを生成させ、蓄積させる。
【００２１】
用いる液体培地の組成は、目的を達成し得る限り何ら特別の制限はなく、シロ−イノソースへの変換原料であるミオ−イノシトールを含有しかつ更に炭素源、窒素源、有機栄養源、無機塩類等を含有する培地であればよい。合成培地、天然培地のいずれも使用できる。液体培地はミオ−イノシトールを0.1％〜40％、より好ましくは10％〜30％含有し、炭素源として、グリセロール、シュークロース、マルトースあるいは澱粉を0％〜20％、より好ましくは0％〜5％含有し、窒素源として、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムあるいは尿素等を0.01％〜5.0％、好ましくは0.5％〜2.0％含有することが望ましい。その他必要に応じ、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、コバルト、マンガン、亜鉛、鉄、銅、モリブデン、リン酸、硫酸などのイオンを生成することができる無機塩類を培地中に添加することが有効である。培地または培養液の水素イオン濃度をpH4〜10、好ましくはpH5〜9に調整して微生物を培養すると、ミオ−イノシトールを効率よくシロ−イノソースに変換することができる。
【００２２】
培養条件は、用いる培地の種類によっても異なる。培養温度は12〜35℃、好ましくは20〜27℃である。また、培養は液体培地を振盪したり、液体培地中に空気あるいは酸素ガスを吹き込むなどして好気的に行うのがよい。培養時間は、培養液中のミオ−イノシトールが完全に消失し、且つ、シロ−イノソースが最大の蓄積量を示すまで行えばよく、通常1〜10日、好ましくは3〜8日である。
【００２３】
培養後に、培養液（物）から菌体を除き、その培養上清液から目的物を採取する方法としては、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち、培養液から菌体を除去した後、培養上清液を活性炭やイオン交換樹脂等で処理することにより、シロ−イノソース以外の不純物をほとんど除くことができる。しかし、強塩基性陰イオン交換樹脂のOH⁻型はシロ−イノソースを化学変化させるので、使用することはできない。かくして、シロ−イノソースを含有する上澄液が得られる。その後、再結晶等の方法を用いることにより、目的物質を単離することができる。
【００２４】
より具体的には、シロ−イノソースが蓄積した培養上清液を、不望成分の除去の目的で強酸性陽イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）C−20（H^＋型）の充填カラムを通過させて通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ、洗浄して洗浄液を集め、得られた通過液及び洗浄液を合併する。こうして合併された水溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂、例えばデュオライト（登録商標）A368S（遊離塩基型）を充填したカラムを通過させ、通過液を集め、その後このカラムに脱イオン水を通過させ、洗浄して洗浄液を集め、ここで得られた通過液及び洗浄液を合併して、シロ−イノソースを含みかつそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を取得するのが好ましい。この水溶液を濃縮して得られたシロ−イノソースの濃厚溶液に、エタノールの適当量を加え、室温または低温で一晩放置すると、純粋なシロ−イノソースの結晶を晶出させることができる。
【００２５】
実施方法（B）では、アセトバクター・エスピー AB10253 株（受託番号 FERM P − 18868 ）を培養して得られた菌体を、あるいはその菌体の破砕物をミオ−イノシトールと緩衝液または液体培地中で反応させ、シロ−イノソースを生成させる。
【００２６】
菌体としては、実施方法（A）により得られた培養液から分離して集めた菌体を用いてもよく、また、前記微生物を別途、適当な培養条件で培養して得たものを用いてもよい。集菌すなわち、菌体の分離は、培養液から遠心分離、濾過等公知の方法により行えばよい。
【００２７】
得られた菌体または菌体破砕物をミオ−イノシトールと反応させる反応媒質としては、液体培地または緩衝液が用いられる。液体培地としては、実施方法（A）で用いたものと同様のものを用いてもよく、あるいは、別途、上記微生物を培養した液体培地をそのまま用いてもよい。緩衝液としては、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グッド（Good’s）のCHES緩衝液等を10〜500mM、好ましくは20〜100mMの濃度で用いればよい。溶液中のミオ−イノシトールの濃度は0.1〜40％程度とするのが好ましい。
【００２８】
反応条件は、用いる菌株や培地、緩衝液の種類によって異なる。反応温度は5〜60℃、好ましくは10〜45℃であり、反応時間は1〜50時間、好ましくは12〜36時間であり、液体培地または緩衝液のpHは2〜10、好ましくは3〜9である。反応終了後の反応液からの目的物質を単離する方法は実施方法（A）と同様に行えばよい。
【００２９】
第2の本発明においては、ミオ−イノシトールにアセトバクター・エスピー AB10253 株（受託番号 FERM P − 18868 ）の細菌を作用させて、ミオ−イノシトールから培養液または水性媒質中でシロ−イノソースを生成させかつ蓄積させ、その生成されたシロ−イノソースを含む反応液または該水性媒質から、生成したシロ−イノソースを単離することなしに、該シロ−イノソースを含有する該反応液または水性媒質に還元剤を添加して作用させ、シロ−イノソースを還元してシロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールを生成させることを特徴とする、シロ−イノシトールの製造方法が提供される。
【００３０】
第2の本発明方法は、具体的には以下に示す（C）、（D）の2つの実施方法で行うことができる。
【００３１】
実施方法（C）は、前記 AB10253株の細菌を、ミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、培養液中でミオ−イノシトールに当該細菌を作用させて、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースに変換することにより培養液中でシロ−イノソースを生成させかつ蓄積させ、ついで、得られた培養液から菌体を除去するがシロ−イノソースを単離することなしに、シロ−イノソースを含有する反応液（培養上清液）に還元剤を直接に添加して、該還元剤をシロ−イノソースに作用させてシロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールを生成させ、そして、還元後の培養上清液（反応液）からシロ−イノシトールを回収する方法である。すなわち、実施方法（C）は、第1の本発明の実施方法（A）により培養液中に生成させ、蓄積させたシロ−イノソースを、培養上清液から単離せずに、例えば水素化ホウ素アルカリ金属等の適当な還元剤で還元し、生成したシロ−イノシトール及びミオ−イノシトールの混合溶液から例えば活性炭処理、イオン交換樹脂処理又は晶析操作又はこれらの組合せを行うことにより、シロ−イノシトールを回収する方法である。
【００３２】
実施方法（D）は、前記 AB10253株の細菌を、ミオ−イノシトールを含有する液体培地で培養し、得られた培養液から菌体を除去し、ここで得られた菌体或いはその破砕物を、ミオ−イノシトールを含む水溶液または緩衝液中でミオ−イノシトールと反応させ、前記の水溶液または緩衝液中でシロ−イノソースを生成せしめ、ここで得た反応液中に生成したシロ−イノソースを単離すること無しに、シロ−イノソースを含有する該反応液に還元剤を直接に添加し、該還元剤をシロ−イノソースに作用させてシロ−イノシトールおよびミオ−イノシトールを生成させ、そして生成したシロ−イノシトールを回収する方法である。すなわち、実施方法（D）は、前記 AB10253株の細菌を使用して、第1の本発明の実施方法（B）により得られたシロ−イノソースを、単離せずに、例えば水素化ホウ素アルカリ金属等の適当な還元剤で還元し、シロ−イノソースから生成したシロ−イノシトール及びミオ−イノシトールの混合溶液から例えばイオン交換樹脂処理又は晶析操作又はこれらの組合せを行うことにより、シロ−イノシトールを回収する方法である。
【００３３】
以下においては、第2の本発明方法の実施方法（C）及び（D）をより詳しく説明する。
【００３４】
実施方法（C）では、前記第1の本発明の実施方法（A）の方法で培養液中にシロ−イノソースを生成させかつ蓄積させた後、培養液から菌体を除去するがシロ−イノソースを単離せず、培養上清液に適当な還元剤を添加し、還元反応を行う。こうして得られた還元反応液中から生成されたシロ−イノシトールを取得する。すなわち、培養液から菌体を除去後、得られた培養上清液に直接に還元剤を添加して還元反応を行う。これによって、培養上清液内でシロ−イノソースからシロ−イノシトール及びミオ−イノシトールが生成される。使用される還元剤は、水系中でシロ−イノソースをシロ−イノシトールに還元できる還元剤であり、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ホウ素カリウム、水素化トリメトキシホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウムであるのが望ましい。ここで得られた還元反応液からシロ−イノシトールを回収し、採取するには、通常の水溶性中性物質を単離精製する一般的な方法を応用することができる。すなわち還元反応液を、活性炭やイオン交換樹脂で処理することにより、シロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを含みそれ以外の不純物をほとんど含まない水溶液を得る。この水溶液からシロ−イノシトールだけを取得するには、主に水に対する溶解度の差を利用することが有効である。すなわち、前記の水溶液を濃縮し、水に対する溶解度の低いシロ−イノシトールを固体として析出せしめこれを取得すればよい。
【００３５】
実施方法（C）の改良方法として、以下に記す方法はシロ−イノシトールを効率良く取得するのにきわめて有効である。すなわち、シロ−イノソースを適当な還元剤で還元した溶液中ではシロ−イノシトールの他にミオ−イノシトールも生成されるが、この溶液に対して、遠心分離等で除いておいた前記 AB10253株の菌体を再び添加し、反復回で培養を行うことになり、シロ−イノシトールには何の変化を与えずに、ミオ−イノシトールをシロ−イノソースへ再度変換させ、培養液中にシロ−イノシトールとシロ−イノソースを蓄積させる。この際、ミオ−イノシトールの適量を追加添加したり、また炭素源や窒素源を培養開始前に添加しても良い。こうして得られた培養液から菌体を除いた後、培養上清液に再び還元剤を添加することによりシロ−イノソースを還元して、還元反応液中にシロ−イノシトールを多量に生成させ蓄積させることが可能であることが、本発明者らによって初めて明らかになった。この様にして得られた反応溶液からシロ−イノシトールを単離し、精製するには、前記した通常の手法を用いて実施することができる。本発明の方法は、前記 AB10253株の細菌が基質としてミオ−イノシトールを認識するがシロ−イノシトールは認識しないという前記 AB10253株の細菌の有するミオ−イノシトール酸化酵素の基質特異性を利用したもので、繰り返し実施することで生成シロ−イノシトールの蓄積量を更に高めることが出来る。
【００３６】
実施方法（D）では、液体栄養培地に、前記 AB10253株の細菌を接種して好気的に培養することにより、該菌体を取得し、こうして得られた該菌体を、緩衝液あるいは液体培地等の水性媒質中に溶解させたミオ−イノシトールに作用させて、シロ−イノソースを生成蓄積させ、シロ−イノソースを単離せず、適当な還元剤を添加し、還元反応を行い、こうして得られた還元反応液から、生成されたシロ−イノシトールを取得する。
【００３７】
この実施方法（D）で使用される菌体または菌体破砕物は、実施方法（B）と同様の手段で得ることができる。また、液体反応の方法も実施方法（B）と同様の手法で実施できる。シロ−イノソース含有反応液から遠心分離、濾過等の公知の手段により菌体を除去した後、得られた菌体を除去された反応液（培養上清液）に還元剤として水素化物を添加して、シロ−イノソースの還元反応を行い、これによりシロ−イノシトール及びミオ−イノシトールを生成させる。この還元反応は、実施方法（C）で説明したと同じ要領で行い得る。更に、シロ−イノシトール及びミオ−イノシトール含有の還元反応液からシロ−イノシトールを取得する方法は、先に実施方法（C）で説明した手法と同様に実施できる。
【００３８】
前述したようにミオ−イノシトールからシロ−イノソース生産する菌は多種存在するが、例えば本発明者らが神奈川県厚木市の土壌より分離したアセトバクター・エスピーAB10253株は本発明に最も有効に使用される菌株の例である。本菌株の菌学的性質を以下に示した。
【００３９】
なお、本菌株の同定の当たっては、「新細菌培地学講座」（第2版、近代出版）、「医学細菌同定の手引き」（第2版、近代出版）、「細菌学実習提要」（丸善）に準じて実験を行い、実験結果を「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」Vol.1（1984）を参考にして同定した。
前記したAB10064株の細菌の主性状は、グラム陰性の桿菌で、大きさは0.4〜0.7×0.6〜4.0μmである。本菌株は生育適温12℃〜34℃の中温菌でpH4.0では生育しない。硝酸塩の還元性はなく、カタラーゼ及びオキシダーゼ陽性であり、グルコースを好気的に分解し、酸を生成する。ユビキノンの分子種はQ9で、DNAのGC含量は62％であった。
【００４０】
これらの菌学的性質を総合して、前記 10064 株の菌株はシュードモナス（Pseudomonas）属に属する菌株であると判断した。「Bergey's Manual of Systematic Bacteriology」 Vol 1（1984）第141頁〜第199頁によると、シュードモナス属細菌は30種以上の種（species）が知られており、遺伝子的に幅のある分類群を形成している。
【００４１】
AB10064株の菌学的性状を上記の既知の種と比較検討した結果、AB10064株はシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）に最も近縁の種であると考えられた。しかし、本菌株の菌学的性質は炭素源の資化性等の結果が、シュードモナス・プチダの性状と完全には一致しなかったので、本AB10064株を公知のものと区別するため、シュードモナス・エスピーAB10064株と命名し、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−18330として寄託した（寄託日は平成13年5月17日）。
アセトバクター・エスピーAB10253株の菌学的性質を次に記載する。
（a）形態的特徴
（1）細胞形態：球桿菌で大きさは0.5〜0.8×0.6〜16μｍ。多形性は無い
（2）運動性：−（懸滴法）
（3）普通寒天培地上での生育：生育は極微。色調は黄土色〜黄色
（b）生理生化学的性状
（1）グラム染色： −（一部variable）
（2）OFテスト： O（Oxidative）
（3）好気条件での生育： ＋
（4）嫌気条件での生育： −
（5）生育温度：
10℃ −
12℃ ±
15℃ ＋
35℃ ＋
38℃ ＋
42℃ ±
（6）食塩耐性：
0% ＋
1% ＋
2% −
（7）グルコース耐性：
10% ＋
20% ＋
30% ＋
（8）エタノール耐性試験：
1% ＋
2% ＋
5% ＋
10% ＋
（9）生育pH：
pH3.0 −
pH4.0 ＋
pH5.0 ＋
pH7.0 ＋
pH8.0 ±
（10）色素の産生：
GYC培地 菌体周囲が黄土色〜茶色に着色
（11）チトクロームオキシダーゼ： −
（12）カタラーゼ： ＋
（13）硝酸塩還元性： −
（14）硫化水素産生： −
（15）ゼラチンの液化： −
（16）インドールの産生： −
（17）マロン酸の利用性： −
（18）ONPG分解性： −
（19）エスクリンの分解性： ＋
（20）クエン酸の利用性： −
（21）アルギニンヒロラーゼ活性： −
（22）尿素の分解性： −
（23）デオキシリボヌクレアーゼ活性：＋
（24）各種糖から酸の生成；
D−グルコース ＋
D−キシロース ＋
D−マンノース ＋
L−アラビノース ＋
D−フルクトース −
ガラクトース ＋
L−ラムノース −
マンニトール −
シュークロース −
アドニトール −
エリスリトール −
アラビトール −
ミオ−イノシトール ＋
ソルビトール −
トレハロース −
D−セロビオース −
エタノール ＋
グリセロール ＋
ラクトース −
リボース ＋
ラフィノース −
プロピレングリコール −
β−ヒドロキシーブチレート −
α−メチルーグルコース −
（25）炭素源の資化性
D−グルコース ＋
ガラクト−ス −
L−アラビノース −
D−キシロース −
グリセロール ＋
ミオ−イノシトール ＋
シュ−クロース −
L−ヒスチジン −
レバリン −
L−アルギニン −
L−セリン −
（26）ユビキノンの分子種： ユビキノン9（Q9）
（27）DNAのGC含量： 58%
【００４２】
以上のとおり、アセトバクター・エスピーAB10253株の主性状は、グラム陰性の球桿菌で、大きさは0.5〜0.8×0.6〜1.6μｍ。生育適温は30℃〜34℃の中温菌で至適生育pHはpH5。硝酸塩の還元性は無く、カタラーゼ陽性、オキシダーゼ陰性であり、30%グルコース培地で好気的に生育する。ユビキノンの分子種はQ9で、DNAのGC含量は58%であった。
【００４３】
これらの菌学的性質を総合して、本AB10253株はアセトバクター（Acetobacter）属に属する菌株であると判断した。Bergey's Manual of Systematic Bacteriology VOL.1（1984）268頁〜274頁によると、アセトバクター属はアセトバクター・アセティ（Acetobacter aceti）、アセトバクター・リケファシエンス（Acetobacter liquefaciens）、アセトバクター・パステウリアヌス（Acetocacter pasteurianus）、アセトバクター・ハンセニー（Acetobacter hansenii）の４つの種（species）から構成されている。AB10253株の菌学的性状を上記の既知の種と比較検討した結果、AB10253株はアセトバクター・アセティ（Acetobacter aceti）に最も近縁の種であると考えられた。しかし、高濃度のグルコース及びエタノールに対して耐性である点、生育温度において38℃でも生育する点、可溶性色素を産生する点など本菌株の有するいくつかの菌学的性質において、アセトバクター・アセティの性状とは一致しなかったので、本AB10253株を公知のものと区別するため、アセトバクター・エスピーAB10253株と命名し、産業枝術総合研究所特許生物寄託センターにFERM P−18868として寄託した（寄託日は平成14年5月27日）。
【００４４】
本明細書で先に記したように、1960年代まではアセトバクター属細菌とグルコノバクター属細菌は分類学的な境界が曖昧であり、本来はグルコノバクター属である微生物がアセトバクター属と同定され発表されていた。従ってアセトバクター属細菌によるミオ−イノシトール酸化活性は、本発明で開示したアセトバクター・エスピーAB10253株が初めての発見である。
【００４５】
【発明の効果】
本発明の方法によれば、医農薬合成原料として有用な、純度の高いシロ−イノソースと、医薬及び医農薬合成原料として有用なシロ−イノシトールとを工業的生産レベルで安価に製造することができる。
【００４６】
【発明の実施の形態】
以下に、第 1 の本発明方法（補正後の請求項 1 に係る発明）と、第 2 の本発明方法（補正後の請求項 4 に係る発明）とを、後記される実施例 7 で具体的に説明する。他方、下記に示される実施例 1 〜 6 は、補正後の請求項 1 の第 1 の本発明および補正後の請求項 4 の第 2 の本発明の範囲内では使用されないシュードモナス sp. AB10064 株の細菌を用いて方法を行う場合を例示するので、本発明（補正後の請求項 1 〜 10 に係る）の実施例に属さないけれども、後記の実施例 7 の実験手順の説明を理解するのに必要である関係から本明細書中に保留することを付記する。
実施例１
実施方法（ A ）によるシロ−イノソースの製造例
（1）シロ−イノソースの生成
ミオ−イノシトール12.0%、酵母エキス1.0%、（NH₄）₂S0₄ 0.1%、K₂HPO₄ 0.7%、KH₂PO₄ 0.2%、MgSO₄・7H₂O 0.01%を含む液体培地３リットルを、100 mlずつ500 ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌された液体培地を含む各々の三角フラスコにシュードモナス・エスピーAB10064株（FERM P−18330）のスラント培養物を1白金耳接種し、27℃で４日間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離（8,000rpm 20分間）し、上清を培養上清液（2900 ml）として得た。
【００４７】
この培養上清液を高速液体クロマトグラフィーにより下記の条件で分析した。その結果、培養上清液中にはシロ−イノソースが98mg/mlの濃度で生成していることがわかった（収量284ｇ、ミオ−イノシトールからの変換率80%）。この時の培養液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。
【００４８】
高速液体クロマトグラフィーの分析条件は以下の通りである。
カラム：Wakosil 5NH₂（4.6×250mm）
カラム温度：40℃
検出器：RIDETECTER ERC−7515A（ERMA CR. INC.）
注入量：20μl
溶媒：アセトニトリル−水＝4：1
流量：2 ml/min
溶出時間シロ−イノソース；11.6分
なお、上記のシロ−イノソースの変換率は、次式により求めた。
変換率（％）＝〔培養上清液中のシロ−イノソースのモル数÷培地中のミオ−イノシトールのモル数〕×100
【００４９】
（2）シロ−イノソースの単離
実施例1（1）で得た培養上清液を、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）C−20（H⁺型）500mlを充填したカラム（内径5cm、長さ40cm）を通過させ、その後、このカラムに500mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。ここで得られたカラム通過液及び洗浄液を合併し、合併した水溶液を弱塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）368S（遊離塩基型）1000mlを充填したカラム（内径7cm、長さ40cm）を通過させ、その後、このカラムに1000mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併した水溶液中には上記シロ−イノソースが含まれ、それ以外の不純物はほとんど存在していなかった。
【００５０】
上記により得たシロ−イノソース水溶液を減圧下で約700mlまで濃縮し、エタノールを3倍量加え5℃で一晩放置したところ、純粋なシロ−イノソースの精製品の無色結晶216gが得られた。この時の精製回収収率は76％で、ミオ−イノシトールからのシロ−イノソースの通算収率は61％であった。
【００５１】
なお、上記シロ−イノソースの精製回収率は次式により求めた；
精製回収率（％）＝〔精製単離したシロ−イノソースの量÷培養上清液中の精製前のシロ−イノソースの量〕×100
また、上記シロ−イノソースの全回収率は次式により求めた：
全回収率（％）＝〔精製単離したシロ−イノソースのモル数÷培地中に添加したミオ−イノシトールのモル数〕×100
【００５２】
実施例２
実施方法（ B ）によるシロ−イノソースの製造例
（1）菌体の生産
ミオ−イノシトール 0.5％、(NH₄)₂SO₄ 0.1％、K₂HPO₄ 0.7％、KH₂PO₄ 0.2％、MgSO₄・7H₂O 0.01％を含むpH7の液体培地2リットルを500ml容のバッフル付き三角フラスコに100mlずつ分注し、オートクレーブ滅菌した。滅菌された液体培地を含む各々の三角フラスコにシュードモナス・エスピーAB10064株を接種し、27℃で3日間振盪培養した。培養液を遠心分離して得られた菌体を、0.05M リン酸緩衝液（pH7.0）200mlで洗浄後、再度遠心分離し、洗浄菌体を得た。
【００５３】
（2）シロ−イノソースの製造
上記により得られた洗浄菌体30gを、溶解されたミオ−イノシトール 4.0gを含有した0.05M リン酸緩衝液（pH7.0）400ml（ミオ−イノシトール濃度10mg/ml）中に加え、得られた混合物を30℃で、24時間、緩やかにスターラーで攪拌しながら菌体をミオ−イノシトールに作用させて反応させた。反応終了後、得られた反応液から菌体を除き、その反応液濾液を液体クロマトグラフィーにより分析したところ、シロ−イノソースが8mg/mlの濃度（変換率82％）で蓄積していた。反応液濾液からのシロ−イノソースの回収と単離は、実施例1に記載した方法に準じて行い、シロ−イノソース2.5gを結晶として得た（精製回収率78％）。また、上記シロ−イノソースのミオ−イノシトールからの全回収率は64％であった。
【００５４】
なお、上記のシロ−イノソースの変換率は、実施例1に準じて求め、精製回収率は次式により求めた：
精製回収率（％）＝〔精製単離したシロ−イノソースの量÷反応液中の精製前のシロ−イノソースの量〕×100
また、上記シロ−イノソースのミオ−イノシトールからの全回収率は次式により求めた：
全回収率（％）＝〔精製単離したシロ−イノソースのモル数÷緩衝液中に添加したミオ−イノシトールのモル数〕×100
【００５５】
実施例３
実施方法（ C ）によるシロ−イノシトールの製造例の 1
（1）シロ−イノソースの生成
実施例1の（1）と全く同様の方法でAB10064株を3リットルの培地で培養し、培養液を遠心分離して菌体を除去した。シロ−イノソースを含有した培養上清液2900mlを得た。
この培養上清液を実施例1で示した高速液体クロマトグラフィーにより分析すると、培養上清液中にはシロ−イノソースが286g（ミオ−イノシトールからシロ−イノソースへの変換率は80％）生成していることがわかった。
【００５６】
変換率（％）＝〔培養上清液中のシロ−イノソースのモル数÷培地中のミオ−イノシトールのモル数〕×100
【００５７】
（2）シロ−イノソースの還元とシロ−イノシトールの生成
前項（1）で得たシロ−イノソース含有培養上清液の2900mlに水素化ホウ素ナトリウム 15.3gを徐々に加え、還元反応を実施した。還元終了後、培養上清液（すなわち還元反応液）を、実施例1で示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、その還元反応液（培養上清液）中には、シロ−イノシトールが105g存在し、副生成物として、ミオ−イノシトールを151g含有していることがわかった（シロ−イノシトールとミオ−イノシトールの合計反応収率は89％：計算式は下記に示す）。シロ−イノソースからのシロ−イノシトールの反応収率は36％であった。
なお、高速液体クロマトグラフィーにおける、各化合物の溶出時間は以下の通りである。
溶出時間：ミオ−イノシトール 17.0分、シロ−イノシトール 17.7分
【００５８】
シロ−イノシトールとミオ−イノシトールの合計反応収率（％）＝〔還元反応後の培養上清液中のシロ−イノシトールのモル数とミオ−イノシトールのモル数の合計÷還元反応前の培養上清液中のシロ−イノソースのモル数〕×100
【００５９】
また、上記のシロ−イノソースからのシロ−イノシトールの反応収率は次式により求めた：
反応収率（％）＝〔還元反応後の培養上清液中のシロ−イノシトールのモル数÷還元反応前の培養上清液中のシロ−イノソースのモル数〕×100
【００６０】
（3）シロ−イノシトールの単離
前項（2）で得た還元反応液を強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）C−20（H⁺型）400mlを充填したカラム（内径5cm、長さ40cm）に通過させ、その後、このカラムに400mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。ここで得られたカラム通過液及び洗浄液を合併し、合併した水溶液を強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）A−113（OH⁻型）800mlを充填したカラム（内径5cm、長さ60cm）を通過させ、その後、このカラムに800mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。
【００６１】
こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併して得られた水溶液は、シロ−イノシトールと副生成物であるミオ−イノシトールを含有するが、これら以外の不純物をほとんど含有しなかった。この水溶液を減圧下で濃縮すると、水溶解度の低いシロ−イノシトールのみが濃縮液中に析出した。500mlまで濃縮し、析出した結晶を濾過操作により取得した。このようにして得られた結晶（79g）の一部を水に溶解して、実施例1に記した方法による液体クロマトグラフィー及び他の分析装置で分析すると、この結晶はミオ−イノシトールを僅かに含有するシロ−イノシトールの結晶であることが判った。続いて、この結晶を全て4リットルの水に溶解し、グラスフィルターで濾過した後、再度400mlまで濃縮した。ここで析出した結晶を取得し、60gの白色結晶を得た。この結晶を液体クロマトグラフィー及びその他の分析装置で分析すると純粋なシロ−イノシトールであることが判明した。
【００６２】
以上の一連の操作での、シロ−イノシトールの精製回収率は57％、ミオ−イノシトールからのシロ−イノシトールの全収率は17％であった。
【００６３】
なお、上記シロ−イノシトールの精製回収率は次式により求めた；
精製回収率（％）＝〔結晶として単離したシロ−イノシトールの量÷還元反応後の上清液中のシロ−イノシトールの量〕×100
また、上記シロ−イノシトールのミオ−イノシトールからの全回収率は次式により求めた：
全回収率（％）＝〔結晶として単離したシロ−イノシトールの量÷培地中に添加したミオ−イノシトールの量〕×100
【００６４】
実施例４
実施方法（ C ）によるシロ−イノシトールの製造例の 2
（1）シロ−イノソースの生成と還元
実施例3の（1）と全く同様の方法でAB10064株を培養した。培養上清液中に生成したシロ−イノソースを実施例3の（2）と同様の方法で還元し、シロ−イノシトール（105g）とミオ−イノシトール（152g）を含有する混合溶液（2900ml）を得た。この溶液に、遠心分離により分取されたAB10064株の菌体と酵母エキス（6g）を添加した。得られた混合溶液を5L容ジャーファーメンターに装入して、培養温度27℃、攪拌回転数400rpm、通気量1vvmで3日間培養を行った。培養液を分析した結果、前記混合溶液中のミオ−イノシトールはシロ−イノソースに変換されていた。かくしてシロ−イノソース（122g）及びシロ−イノシトール（105g）と菌体を含有する混合溶液を得た。
【００６５】
この混合溶液から菌体を遠心分離により除き、得られた溶液（培養上清液）に水素化ホウ素ナトリウム 6.5gを徐々に加えて還元反応を実施した。その結果、還元反応後の反応溶液（培養上清液）中にはシロ−イノシトールが162g存在し、更に副生物として、ミオ−イノシトールが66g含有されていることがわかった。最終的にミオ−イノシトールからのシロ−イノシトール変換率は45％であった。
【００６６】
（2）シロ−イノシトールの単離
実施例3の（3）と同じ手法で還元反応液からシロ−イノシトールの単離を行った。即ちイオン交換樹脂による脱塩の後、溶液を約900mlに濃縮し、シロ−イノシトールの結晶を析出させ、この結晶を濾過することにより単離した。こうして取得したシロ−イノシトールの粗結晶を再度8リットルの水に溶解し、得られた水溶液からグラスフィルターで水不溶物を除去し、ついで減圧下濃縮した。水溶液を約800mlに濃縮した後、析出したシロ−イノシトールをグラスフィルターで濾過し、白色結晶（123g）として回収した。ミオ−イノシトールからの全回収率は34％であった。
全回収率（％）＝〔結晶として単離したシロ−イノシトールの量÷培地中に添加したミオ−イノシトールの量〕×100
【００６７】
実施例５
実施方法（ C ）によるシロ−イノシトールの製造例の 3
（1）シロ−イノソースの生成と還元
実施例4の（1）と全く同様の方法でAB10064株の培養、培養上清液の還元、還元反応液の再培養及び2度目の培養上清液の再還元を実施した。こうして得られた還元反応後の反応溶液（培養上清液）にはシロ−イノシトールが160g存在し、副生物として、ミオ−イノシトール65gが含有されていた。この混合溶液に再度、遠心分離して分取されておいたAB10064株の菌体と酵母エキス（2.5g）を添加した。得られた混合液を5L容ジャーファーメンターに装入し、培養温度27℃、攪拌回転数400rpm、通気量1vvmで3日間培養を行った。培養液を分析した結果、前記混合液中のミオ−イノシトールはシロ−イノソースに変換されていた。かくして、シロ−イノソース（52g）及びシロ−イノシトール（160g）と菌体を含有する混合溶液を得た。
【００６８】
この混合溶液から菌体を遠心分離により除き、得られた上清溶液に水素化ホウ素ナトリウム2.8gを徐々に加えて還元反応を実施した。還元反応後の反応溶液（培養上清液）にはシロ−イノシトールが180g存在し、副生物として、ミオ−イノシトール26gが含有されていることがわかった。最終的にミオ−イノシトールからのシロ−イノシトール変換率は50％であった。
【００６９】
（2）シロ−イノシトールの単離
実施例4の（2）と同じ手法でシロ−イノシトールの単離を行った。即ちイオン交換樹脂による脱塩の後、溶液を約900mlに濃縮し、シロ−イノシトールの結晶を析出させ、この結晶を濾過することにより単離した。こうして取得したシロ−イノシトールの粗結晶を再度８リットルの水に溶解し、得られた溶液を減圧下で濃縮した。約800mlに濃縮し、その結果析出したシロ−イノシトールをグラスフィルターで濾過し、白色結晶（140g）として得た。ミオ−イノシトールからの全回収率は39％であった。
【００７０】
実施例６
実施方法（ D ）によるシロ−イノシトールの製造例
実施例２と全く同様の方法で、AB10064株の洗浄菌体によるミオ−イノシトールの酸化でシロ−イノソースの製造を行った。すなわちミオ−イノシトール4.0gを含有する0.05M リン酸緩衝液（pH7.0）400ml（ミオ−イノシトール濃度10mg/ml）中にAB10064株の洗浄菌体30g加え、得られた混合物を30℃で24時間緩やかにスターラーで攪拌しながら菌体をミオ−イノシトールと反応させて、反応溶液中にシロ−イノソースを8mg/mlの濃度で蓄積させた。反応液を遠心分離して菌体を除き、得られた溶液（上清液）に水素化ホウ素ナトリウム170mgを徐々に加えて還元反応を実施した。その結果、反応液中にはシロ−イノシトールが1250mg存在し、副生物としてミオ−イノシトール1600mgが含有されていた。
【００７１】
実施例３の（3）と同様の手法でシロ−イノシトールの単離を行い、シロ−イノシトールの白色結晶800mgを得た。ミオ−イノシトールからの全回収率は20％であった。
【００７２】
実施例７
実施方法（ C ）によるシロ−イノシトールの製造例の４
（1）シロ−イノソースの生成
ミオ−イノシトール 16.0％、酵母エキス 16％を含む液体培地３リットルをpH5.0に調整し、100 mlずつ500 ml容のバッフル付き三角フラスコに分注し、オートクレーブ滅菌した。各々の三角フラスコにアセトバクター・エスピーAB10253株（FERM P−18868）のスラント培養物を１白金耳接種し、27℃で４日間振盪培養した。培養液を遠心分離（8,000rpm 20分間）して菌体を除き、上清を培養上清液（2900 ml）とした。遠心分離により得られた培養菌体は４℃で冷蔵保存した。
この培養上清液を実施例1と同様の方法で分析した。その結果培養上清液中にはシロ−イノソースが153mg/ml（459ｇ、変換率97%）生成していることがわかった。この時の培養液中にミオ−イノシトールは検出されなかった。
【００７３】
（2）培養上清液の還元
前項（1）で得たシロ−イノソース含有の培養上清液の2900 mlに水素化ホウ素ナトリウム30.6gを徐々に加え、還元反応を実施した。還元終了後、培養上清（反応液）を、実施例１で示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、還元反応後の反応液中（培養上清液）には、シロ−イノシトールが177ｇ存在し、副生成物として、ミオ−イノシトールを252ｇ含有していることがわかった。
【００７４】
（3）シロ−イノシトール粗結晶の単離と、菌体反応によるシロ−イノソースの生成
前項（2）で得た還元反応後の反応液を一晩、室温に静置して置くとシロ−イノシトールを含有する白色の沈殿物が生じた。この溶液をろ過し、白色固体と、ろ液に分けた。白色固体は乾燥重量で99ｇ得られた。ろ液は再度反応させるためにミオイノシトールの228ｇを追加し溶解させた後に、5N HClでpH5.0に調整した。これに前項（1）で分離されて保存しておいた培養菌体を懸濁し、約100 mlずつ500 ml容のバッフル付き三角フラスコに分注した。
【００７５】
菌体反応は純酸素ガスを三角フラスコ内の混合液に通気し、27℃で20時間、ロータリーシェーカーで反応させた。反応終了後、反応溶液を遠心分離（8,000rpm 20分間）し、上清を菌体反応上清液（3050 ml）とした。遠心分離により得られた培養菌体は４℃で冷蔵保存した。
【００７６】
（4）菌体反応上清液の還元
前項（3）で得たシロ−イノソース含有の培養上清液の3050 mlに水素化ホウ素ナトリウム31.1ｇを徐々に加え、に還元反応を実施した。還元終了後、菌体反応上清液（還元反応液）を、実施例1で示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、還元反応後の反応液中には、シロ−イノシトールが258ｇ存在し、副生成物として、ミオ−イノシトールを256ｇ含有していることがわかった。
【００７７】
（5）シロ−イノシトール粗結晶の単離と菌体再反応によるシロ−イノソースの生成
前記（4）で得た還元反応後の反応液を一晩、室温に静置して置くとシロ−イノシトールを含有する白色の沈殿物が生じた。この溶液をろ過し、白色固体と、ろ液に分けた。白色固体は乾燥重量で199ｇ得られた。ろ液は再度反応させるためにミオ−イノシトールの224ｇを追加し溶解させた後に、5N HClでpH5.0に調整した。これに前項（3）で分離され保存しておいた培養菌体を懸濁し、約100 mlずつ500 ml容のバッフル付き三角フラスコに分注した。
菌体反応は純酸素ガスを三角フラスコ内の混合液に通気し、27℃で20時間、ロータリーシェーカーで反応させた。菌体との再反応終了後、生成したシロ−イノソースを含有した培養液を遠心分離（8,000rpm 20分間）して菌体を除去し、上清を菌体再反応後の培養上清液（3170 m1）とした。遠心分離により得られた培養菌体は４℃で冷蔵保存した。
【００７８】
（6）菌体反応後の培養上清液の還元
前項（5）で得たシロ−イノソース含有の培養上清液の3170 mlに水素化ホウ素ナトリウム31.1ｇを徐々に加えた後に還元反応を実施した。還元終了後、ここで得た還元反応液を、実施例１で示した高速液体クロマトグラフィーにより分析した。その結果、還元反応液中（培養上清液）には、シロ−イノシトールが268ｇ存在し、副生成物として、ミオ−イノシトールを253g含有していることがわかった。
【００７９】
（7）シロ−イノシトール粗結晶の単離
前項（6）で得た還元反応液を一晩、室温に静置して置くとシロ−イノシトールを含有する白色の沈殿物が生じた。この溶液をろ過し、白色固体と、ろ液に分けた。白色固体は乾燥重量で197ｇ得られた。この白色沈殿物と、前項（3）と（5）で得られた白色沈殿物を合わせて、シロ−イノシトールを含有する白色沈殿物を合計495ｇ（99＋199＋197）得た。また、ここまでの反応に要したミオ−イノシトールは932ｇ（480＋228＋224）であった。
【００８０】
（8）シロ−イノシトールの精製と単離
これまでに得られた白色沈殿物487ｇを熱水25Lに溶解させた後、室温まで冷却し、強酸性陽イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）C−20（H^＋型）400 mlを充填したカラム（内径5cm、長さ40cm）に通過させ、その後このカラムに400 mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。この通過液及び洗浄液を、強塩基性陰イオン交換樹脂デュオライト（登録商標）A−113（OH⁻型）800 mlを充填したカラム（内径5cm、長さ60cm）に通過させ、その後このカラムに800 mlのイオン交換水を通過させて洗浄した。
【００８１】
こうして得られた通過液及び水洗浄液を合併して得られた水溶液は、シロ−イノシトールと副生成物であるミオ−イノシトールを含有するが、これら以外の不純物をほとんど含有しなかった。この水溶液を減圧下で濃縮すると、水溶解度の低いシロ−イノシトールのみが濃縮液中に析出した。500 mlまで濃縮し、析出した結晶を濾過操作により取得した。このようにして得られた結晶(421ｇ)の一部を水に溶解して実施例１に記した方法による液体クロマトグラフィー及び他の分析装置で分析すると、ミオ−イノシトールを含有しない純粋なシロ−イノシトールの結晶であった。
以上の一連の操作での、ミオ−イノシトールからのシロ−イノシトールの全収率は45％（421／932×100）であった。[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
  The present invention is newly separated from the natural world by the present inventors.TaThe present invention relates to a method for producing scyllo-Inosose having high utility value as a pharmaceutical or other raw material from inexpensive myo-Inositol using the strain Cetobacter AB10253 as a novel microorganism. In addition, the present invention chemically reduces scyllo-inosose obtained from myo-inositol to treat Alzheimer's disease (The Journal of Biological Chemistry, Vol. 275, No. 24, pp. 18495-18502, 2000). And scyllo-Inositol, which is expected to be used as a synthetic raw material for bioactive substances (US Pat. No. 5,412,080) and a synthetic raw material for liquid crystal compounds (German Patent Publication No. 3,642,999). The present invention also relates to a method for efficiently producing the above.
[0002]
[Prior art]
  Myo-inositol has the following planar formula (A)

Or the following three-dimensional structural formula (A ')

It is a known naturally occurring substance represented by
[0003]
  In addition, white-inosose is the following planar formula (B)

Or the following three-dimensional structural formula (B ')

It is a known compound represented by. Furthermore, scyllo-inositol has the following planar formula (C)

Or the following three-dimensional structural formula (C ')

It is a known compound represented by.
[0004]
  Scyllo-inositol is one of the stereoisomers of myo-inositol and is a substance widely found in animals and plants. Further, scyllo-inosose is a compound having a structure in which an axial hydroxyl group at the 2-position of myo-inositol is oxidized, and this also exists universally as a natural product.
[0005]
  An enzyme that oxidizes myo-inositol and converts it into scyllo-inosose (myo-inositol dehydrogenase) is an enzyme that exists widely in nature, and has been reported for many species including animals, algae, yeasts, and bacteria. . As representative microbial species having the above-mentioned enzymes, bacteria of the genus Gluconobacter (Helvetica Chimica Acta, 24, 1045-1058, 1941 and Journal of Organic Chemistry, 26, 912-918, 1961, etc.), Bacillus bacteria (Japanese Patent Laid-Open No. 4-12675), Pseudomonas genus, etc. (Monatshefle fur Chemie, Vol. 100, pp. 1327-1337, 1969 and Journal of Bacteriology, Vol. 131, 872) ~ 875 pages, 1977). In addition, Helvetica Chimica Acta, which describes Gluconobacter bacteria, Vol. 24, pages 1045-1058 (1941) and Journal of Organic Chemistry, Vol. 26, pages 912-918 (1961), etc. Although it is described as Acetobacter oxydans or Acetobacter suboxydans in the paper, these strains were later reclassified as the genus Gluconobacter and have been transferred to the genus Gluconobacter since Bargcy's Manual of Deteminative Bacteriology 8th edition (1974) .
[0006]
  A bacterium belonging to the genus Agrobacterium is known as a microorganism capable of converting myo-inositol into scyllo-inositol (Japanese Patent Laid-Open No. 9-140388).
[0007]
  On the other hand, as a method for producing scyllo-inosose or scyllo-inositol by a chemical synthesis method, (1) a method of reducing hexahydroxybenzene with Raney nickel to obtain scyllo-inositol (Journal of the American Chemical Society, Vol. 70, (2) A method of obtaining scyllo-inositol from a glucofuranose derivative by a five-step reaction followed by reduction to obtain scyllo-inositol (Journal of the American Chemical Society, Vol. 90, Vol. 1948). (3289-3290, 1968); (3) A method for obtaining scyllo-inositol by cis-trioxa-tris-homobenzene as a raw material in four or more steps (Angwandte Chemie, 85, 1110-1111, 1973) (4) A method of obtaining scyllo-inositol by oxidation of myo-inositol with a platinum catalyst to obtain scyllo-inosose, followed by esterification, followed by reduction and hydrolysis (German Federation) There is the Republic Patent Publication No. 3,405,663 Publication), and the like.
[0008]
  As described above, a method for producing scyllo-inosose by oxidizing myo-inositol with a microorganism and a method for producing scyllo-inositol by reducing scyllo-inosose with an appropriate reducing agent are known techniques.
[0009]
  However, these known methods for producing scyllo-inosose and scyllo-inositol are, as methods carried out on an industrial scale, the conversion activity of microorganisms to be used is weak, and the operation is complicated, environmental pollution or economic efficiency. All of these conventional methods are not always satisfactory. Accordingly, there is a demand for a method for producing scyllo-inosose easily and efficiently on an industrial scale and a method for producing scyllo-inositol.
[0010]
[Problems to be solved by the invention]
  An object of the present invention is to provide a new method capable of efficiently producing high-purity scyllo-inosose and a new method capable of efficiently producing scyllo-inositol.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
  The present inventors have intensively studied to achieve the above object. As a result, when a new strain of bacteria identified by the genus Pseudomonas, which was newly isolated from the natural environment by the present inventors and given the strain number of AB10064, was allowed to act on myo-inositol, the It has been found that it has a selective oxidation activity that can selectively generate inosose in high yield. A similar activity was also found in a strain identified as an Acetobacter bacterium that was separately isolated and given the strain number of AB10253.
[0012]
  According to the studies by the present inventors, a liquid medium containing myo-inositol and a normal carbon source and a nitrogen source, or a liquid medium containing myo-inositol and a nitrogen source without particularly containing a normal carbon source. AboveNoThe bacteria of Setobacter sp. AB10253 strain are aerobically cultured so that scyllo-inosose is produced from myo-inositol and scyllo-inosose is accumulated in a high content in the resulting culture solution. A new process for producing scyllo-inosose can be implemented with the present invention. In addition, in the new method for producing scyllo-inosose according to the present invention, scyllo-inosose accumulated in a culture solution or in an aqueous medium at a high content is not subjected to any chemical treatment, but a cation exchange resin, By performing an ion exchange resin treatment using an anion exchange resin or the like, an activated carbon treatment, a crystallization operation, or a combination of these treatments, it is possible to efficiently recover as a high purity scyllo-inosose. Can be implemented.
[0013]
  Furthermore, as a result of the inventors' separate research, the scyllo-inosose accumulated in the culture broth was removed directly from the culture broth and then directly applied to the obtained culture supernatant. When a sufficient amount of a reducing agent such as sodium borohydride is added and the scyllo-inosose is reacted with the scyllo-inosose in the culture supernatant, the scyllo-inosose is efficiently reduced to scyllo-inositol. And that myo-inositol is by-produced. That is, it is found that scyllo-inosose in the culture supernatant can be efficiently reduced to scyllo-inositol in the culture supernatant by reaction with the above reducing agent without being isolated from the supernatant. It was done. Also, at this time, it was found that myo-inositol also formed as a by-product simultaneously with the formation of scyllo-inositol. The reduction reaction solution thus obtained was removed from the culture solution before the reduction reaction.SaidAB10253 sharesBacteriaIs added again, and repeated batch culture is performed with an appropriate nutrient source such as yeast extract, so that only the by-produced myo-inositol is converted into scyllo-inosose without affecting the scyllo-inositol in the reduction reaction solution. It was found that the oxidation reaction for conversion proceeds. Further, the oxidization reaction solution (culture solution) is sterilized, and a reducing agent is added again to the culture supernatant to reduce scyllo-inosose. It has been found that the content of inositol is increased and thus the process carried out in this way is a very effective means for producing an efficient scyllo-inositol. It was also found that it is possible to further increase the content of scyllo-inositol in the reaction solution or culture solution (or culture supernatant solution) by repeatedly performing this microbial oxidation reaction and chemical reduction reaction. .
[0014]
  Therefore, in the first present invention, myo-inositol is a bacterium.RuaSetobacter SP AB10253 (Accession numberThere is provided a method for producing scyllo-inosose, characterized in that myo-inositol is converted to scyllo-inosose by acting as FERM P-18868.
[0015]
  By applying to an appropriate purification method such as ion exchange resin treatment, crystallization, or a combination thereof, scyllo-inosose can be efficiently recovered from the reaction solution or culture supernatant obtained by the above method. .
[0016]
  Specifically, the first method of the present invention can be performed by the following two methods (A) and (B).
[0017]
  In the implementation method (A), in a liquid medium containing myo-inositol and a carbon source and a nitrogen source,SaidAB10253 sharesBacteriaAnd inoculating the bacterium with myo-inositol in the resulting culture solution to convert myo-inositol into scyllo-inosose, thereby converting scyllo-inosose in the culture solution. Shiro-inosose is produced from the culture supernatant by producing and accumulating, removing the cells from the culture, and subjecting the resulting culture supernatant to, for example, ion exchange resin treatment or crystallization operation or a combination thereof. to recover.
[0018]
  Implementation method (B)Record AB10253 sharesBacteriaIs cultivated in a liquid medium containing myo-inositol, the cells are removed from the culture, and the cells obtained or the disrupted product thereof are converted into myo-inositol in an aqueous solution or buffer containing myo-inositol. The scyllo-inosose is produced in the aqueous solution or buffer, and the scyllo-inosose produced is recovered by, for example, ion exchange resin treatment or crystallization operation or a combination thereof.
[0019]
  In the following, the implementation methods (A) and (B) of the method of the first invention will be described in more detail.
[0020]
  In the implementation method (A), a liquid nutrient medium containing myo-inositol and a carbon source and a nitrogen source is used.The aboveAB10253 sharesBacteriaIs then inoculated and aerobically cultured to generate and accumulate scyllo-inosose from myo-inositol.
[0021]
  The composition of the liquid medium to be used is not particularly limited as long as the object can be achieved. It contains myo-inositol which is a raw material for conversion to scyllo-inosose, and further contains a carbon source, nitrogen source, organic nutrient source, inorganic salts, etc. As long as the medium contains Either a synthetic medium or a natural medium can be used. The liquid medium contains 0.1% to 40%, more preferably 10% to 30%, of myo-inositol, and 0% to 20%, more preferably 0% to 5% of glycerol, sucrose, maltose or starch as a carbon source. As a nitrogen source, 0.01% to 5.0%, preferably 0.5% to 2.0% of yeast extract, peptone, casamino acid, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium nitrate, urea, or the like is desirably contained. In addition, it is effective to add inorganic salts that can generate ions such as sodium, potassium, calcium, magnesium, cobalt, manganese, zinc, iron, copper, molybdenum, phosphoric acid, sulfuric acid, etc. to the medium as needed. is there. When microorganisms are cultured with the hydrogen ion concentration of the medium or the culture solution adjusted to pH 4 to 10, preferably pH 5 to 9, myo-inositol can be efficiently converted to scyllo-inosose.
[0022]
  The culture conditions vary depending on the type of medium used. The culture temperature is 12 to 35 ° C, preferably 20 to 27 ° C. In addition, the culture is preferably performed aerobically by shaking the liquid medium or blowing air or oxygen gas into the liquid medium. The culture time may be until the myo-inositol in the culture solution has completely disappeared and the scyllo-inosose shows the maximum accumulation amount, and is usually 1 to 10 days, preferably 3 to 8 days.
[0023]
  After culturing, the general method for isolating and purifying a normal water-soluble neutral substance can be applied as a method for removing cells from the culture solution (product) and collecting the target product from the culture supernatant. it can. That is, after removing the bacterial cells from the culture solution, impurities other than scyllo-inosose can be almost removed by treating the culture supernatant with activated carbon, ion exchange resin, or the like. However, strong basic anion exchange resin OH⁻Since the mold chemically changes the scyllo-inosose, it cannot be used. Thus, a supernatant containing scyllo-inosose is obtained. Thereafter, the target substance can be isolated by using a method such as recrystallization.
[0024]
  More specifically, the culture supernatant liquid in which scyllo-inosose is accumulated is used for the purpose of removing undesired components, such as a strongly acidic cation exchange resin such as Duolite (registered trademark) C-20 (H⁺The flow-through is collected through a packed column of the mold), and then deionized water is passed through the column, washed to collect the washing liquid, and the obtained passage liquid and washing liquid are combined. The aqueous solution thus combined is passed through a column filled with a weakly basic anion exchange resin, for example, Duolite (registered trademark) A368S (free base type), the passing solution is collected, and then deionized water is passed through this column. The washing liquid is collected by washing, and it is preferable to obtain an aqueous solution containing scyllo-inosose and containing almost no other impurities by combining the passing liquid and the washing liquid obtained here. When a suitable amount of ethanol is added to a concentrated solution of scyllo-inosose obtained by concentrating this aqueous solution and left overnight at room temperature or low temperature, pure scyllo-inosose crystals can be crystallized.
[0025]
  In method (B),Acetobacter SP AB10253 Stock (Trust number) FERM P − 18868 )The cells obtained by culturing the cells or the disrupted cells of the cells are reacted with myo-inositol in a buffer or liquid medium to produce scyllo-inosose.
[0026]
  As the cells, cells collected and collected from the culture solution obtained by the implementation method (A) may be used, or those obtained by culturing the microorganism separately under appropriate culture conditions may be used. May be. Bacteria collection, that is, separation of the bacterial cells may be performed by a known method such as centrifugation or filtration from the culture solution.
[0027]
  A liquid medium or a buffer solution is used as a reaction medium for reacting the obtained microbial cells or crushed cells with myo-inositol. As the liquid medium, the same one as used in the implementation method (A) may be used, or a liquid medium in which the microorganism is cultured may be used as it is. As the buffer, phosphate buffer, Tris buffer, Good's CHES buffer, etc. may be used at a concentration of 10 to 500 mM, preferably 20 to 100 mM. The concentration of myo-inositol in the solution is preferably about 0.1 to 40%.
[0028]
  The reaction conditions vary depending on the strain, medium, and type of buffer used. The reaction temperature is 5 to 60 ° C., preferably 10 to 45 ° C., the reaction time is 1 to 50 hours, preferably 12 to 36 hours, and the pH of the liquid medium or buffer is 2 to 10, preferably 3 to 9 The method for isolating the target substance from the reaction solution after completion of the reaction may be performed in the same manner as in the method (A).
[0029]
  In the second invention,Acetobacter sp to myo-inositol AB10253 Stock (Trust number) FERM P − 18868 ) From myo-inositolThe scyllo-inosose is produced and accumulated in a culture medium or an aqueous medium, and the scyllo-inosose is isolated without isolating the produced scyllo-inosose from the reaction liquid containing the scyllo-inosose or the aqueous medium. The reaction solution or aqueous medium containing inososeReturn toThe base agent is added to act to reduce scyllo-inosose to produce scyllo-inositol and myo-inositol.SakoA method for producing scyllo-inositol is provided.
[0030]
  Specifically, the second method of the present invention can be carried out by the following two methods (C) and (D).
[0031]
  Implementation method (C)Record AB10253 strain bacteria are cultured in a liquid medium containing myo-inositol, and the bacteria are allowed to act on myo-inositol in the culture medium to convert myo-inositol into scyllo-inosose. -Inosose is generated and accumulated and then reduced to a reaction solution (culture supernatant) containing scyllo-inosose without removing the cells from the resulting culture but isolating scyllo-inosose. The agent is directly added to cause the reducing agent to act on scyllo-inosose to produce scyllo-inositol and myo-inositol, and scyllo-inositol is recovered from the culture supernatant (reaction solution) after the reduction. Is the method. That is, in the method (C), the scyllo-inosose produced and accumulated in the culture solution according to the method (A) of the first invention is not isolated from the culture supernatant, for example, borohydride. The scyllo-inositol is reduced by a suitable reducing agent such as an alkali metal and the resulting scyllo-inositol and myo-inositol mixed solution is subjected to, for example, activated carbon treatment, ion exchange resin treatment or crystallization operation or a combination thereof to It is a method to collect.
[0032]
  Implementation method (D)Record AB10253 strain bacteria are cultivated in a liquid medium containing myo-inositol, the cells are removed from the obtained culture broth, and the cells obtained or the disrupted product thereof are used as an aqueous solution containing myo-inositol or Reacting with myo-inositol in a buffer solution to form scyllo-inosose in the above-mentioned aqueous solution or buffer solution, without isolating scyllo-inosose produced in the obtained reaction solution. In this method, a reducing agent is directly added to the reaction solution containing the above, the reducing agent is allowed to act on scyllo-inosose to produce scyllo-inositol and myo-inositol, and the produced scyllo-inositol is recovered. That is, the implementation method (D) isSaid AB10253 sharesBacteriaThe scyllo-inosose obtained by the method (B) according to the first aspect of the present invention is reduced using a suitable reducing agent such as an alkali metal borohydride without isolation. In this method, scyllo-inositol is recovered from the resulting mixed solution of scyllo-inositol and myo-inositol by, for example, ion exchange resin treatment, crystallization operation, or a combination thereof.
[0033]
  In the following, the methods (C) and (D) for carrying out the second method of the present invention will be described in more detail.
[0034]
  In the implementation method (C), after generating and accumulating scyllo-inosose in the culture solution according to the method of the implementation method (A) of the first aspect of the present invention, the cells are removed from the culture solution. Without the isolation, an appropriate reducing agent is added to the culture supernatant and a reduction reaction is performed. Scyllo-inositol produced from the thus obtained reduction reaction solution is obtained. That is, after removing the cells from the culture solution, a reducing agent is added directly to the obtained culture supernatant to perform a reduction reaction. Thereby, scyllo-inositol and myo-inositol are produced from scyllo-inosose in the culture supernatant. The reducing agent used is a reducing agent capable of reducing scyllo-inosose to scyllo-inositol in an aqueous system, such as sodium borohydride, lithium borohydride, potassium borohydride, sodium trimethoxyborohydride, hydrogen cyanide. Preferably it is sodium borohydride. In order to collect and collect scyllo-inositol from the reduction reaction solution obtained here, a general method for isolating and purifying a normal water-soluble neutral substance can be applied. That is, by treating the reduction reaction solution with activated carbon or an ion exchange resin, an aqueous solution containing scyllo-inositol and myo-inositol and containing almost no other impurities is obtained. In order to obtain only scyllo-inositol from this aqueous solution, it is effective to mainly use the difference in solubility in water. That is, the aqueous solution is concentrated, and scyllo-inositol having low solubility in water is precipitated as a solid to obtain this.
[0035]
  As an improvement method of the implementation method (C), the following method is extremely effective for obtaining scyllo-inositol efficiently. That is, in the solution obtained by reducing scyllo-inosose with an appropriate reducing agent, myo-inositol is also produced in addition to scyllo-inositol, but this solution was removed by centrifugation or the like.Said ABThe cells of 10253 strain were added again, and the cells were cultured repeatedly. The myo-inositol was converted again into the scyllo-inosose without any change in the scyllo-inositol, and the siro-inositol was transformed into the culture medium. -Accumulate inositol and scyllo-inosose. At this time, an appropriate amount of myo-inositol may be additionally added, or a carbon source or nitrogen source may be added before the start of culture. After removing the cells from the culture broth thus obtained, the reductant is added again to the culture supernatant to reduce scyllo-inosose, and a large amount of scyllo-inositol is generated and accumulated in the reductive reaction. It has been revealed for the first time by the inventors that this is possible. Isolation and purification of scyllo-inositol from the reaction solution thus obtained can be carried out using the conventional methods described above. The method of the present invention comprises:Said AB10253 sharesBacteriaRecognizes myo-inositol as a substrate but does not recognize scyllo-inositolSaid AB10253 sharesBacteriaIt is possible to further increase the amount of accumulated scyllo-inositol by repeatedly carrying out the substrate specificity of myo-inositol oxidase.
[0036]
  In method (D), the liquid nutrient mediumSaid AB10253 sharesBacteriaInoculated and then aerobically cultured to obtain the cells, and the cells thus obtained were allowed to act on myo-inositol dissolved in an aqueous medium such as a buffer solution or a liquid medium. Then, scyllo-inosose is produced and accumulated, scyllo-inosose is not isolated, an appropriate reducing agent is added and a reduction reaction is performed, and thus scyllo-inositol is obtained from the thus obtained reduction reaction solution.
[0037]
  The microbial cell or microbial cell crushed material used by this implementation method (D) can be obtained by the same means as the implementation method (B). Further, the liquid reaction method can be carried out in the same manner as the method (B). After removing microbial cells from the reaction solution containing scyllo-inosose by known means such as centrifugation and filtration, a hydride is added as a reducing agent to the obtained reaction solution (culture supernatant). Then, a reduction reaction of scyllo-inosose is performed, thereby generating scyllo-inositol and myo-inositol. This reduction reaction can be performed in the same manner as described in the implementation method (C). Furthermore, the method for obtaining scyllo-inositol from scyllo-inositol and myo-inositol-containing reduction reaction solution can be carried out in the same manner as the method described in the implementation method (C).
[0038]
  As described above, there are various types of fungi that produce scyllo-inosose from myo-inositol. For example, the present inventors isolated from soil in Atsugi City, Kanagawa Prefecture.Acetobacter SPThe AB10253 strain is an example of the strain most effectively used in the present invention. The mycological properties of this strain are shown below.
[0039]
  For identification of this strain, "New Bacteriological Culture Course" (2nd edition, Modern Publishing), "Medical Bacteria Identification Guide" (2nd edition, Modern Publishing), "Bacteriological Practice Recommendation" ( Maruzen), and the results were identified with reference to “Bergey's Manual of Systematic Bacteriology” Vol.1 (1984).It was.
  As described aboveAB10064 sharesBacteriaThe main property is gram-negative bacilli and the size is 0.4 to 0.7 × 0.6 to 4.0 μm. This strain is a mesophilic bacterium with an optimum growth temperature of 12 ° C to 34 ° C and does not grow at pH 4.0. Nitrate is not reducible, is positive for catalase and oxidase, decomposes glucose aerobically and produces acid. The molecular species of ubiquinone was Q9, and the GC content of DNA was 62%.
[0040]
  By combining these mycological properties,Said 10064 stockWas determined to be a strain belonging to the genus Pseudomonas. According to “Bergey's Manual of Systematic Bacteriology” Vol 1 (1984), pages 141-199, Pseudomonas bacteria are known for more than 30 species and form genetically broad taxa is doing.
[0041]
  As a result of comparing the bacteriological properties of the AB10064 strain with the above-mentioned known species, the AB10064 strain was considered to be the closest species to Pseudomonas putida. However, as for the bacteriological properties of this strain, the results of assimilation of carbon source etc. did not completely match the properties of Pseudomonas putida, so in order to distinguish this strain AB10064 from those known, It was named SP AB10064 and was deposited as FERM P-18330 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (the deposit date was May 17, 2001)Day).
  Acetobacter SPThe mycological properties of AB10253 strain are described below.
(A) Morphological features
  (1) Cell morphology: cocci and size is 0.5-0.8 × 0.6-16μm. No polymorphism
  (2) Mobility:-(hanging drop method)
  (3) Growth on ordinary agar medium: Growth is minimal. The color is ocher to yellow
(B) Physiological and biochemical properties
  (1) Gram staining:-(some variable)
  (2) OF test: O (Oxidative)
  (3) Growth under aerobic conditions: +
  (4) Growth under anaerobic conditions: −
  (5) Growth temperature:
        10 ° C −
        12 ° C ±
        15 ℃ +
        35 ℃ +
        38 ℃ +
        42 ° C ±
  (6) Salt tolerance:
        0% +
        1% +
        2% −
  (7) Glucose tolerance:
        10% +
        20% +
        30% +
  (8) Ethanol tolerance test:
        1% +
        2% +
        5% +
       10% +
  (9) Growth pH:
        pH3.0 −
        pH4.0 +
        pH 5.0 +
        pH 7.0 +
        pH 8.0 ±
  (10) Pigment production:
        GYC medium The area around the cells is colored from ocher to brown
  (11) Cytochrome oxidase: −
  (12) Catalase: +
  (13) Nitrate reducibility: −
  (14) Hydrogen sulfide production: −
  (15) Gelatin liquefaction: −
  (16) Indole production: −
  (17) Usability of malonic acid: −
  (18) ONPG degradability: −
  (19) Degradability of esculin: +
  (20) Usability of citric acid: −
  (21) Arginine hydrase activity: −
  (22) Degradability of urea: −
  (23) Deoxyribonuclease activity: +
  (24) acid generation from various sugars;
        D-glucose +
        D-xylose +
        D-Mannose +
        L-arabinose +
        D-fructose-
        Galactose +
        L-Rhamnose −
        Mannitol −
        Sucrose-
        Adonitol −
        Erythritol −
        Arabitol −
        Myo-Inositol +
        Sorbitol −
        Trehalose −
        D-cellobiose-
        Ethanol +
        Glycerol +
        Lactose −
        Ribose +
        Raffinose −
        Propylene glycol −
        β-hydroxybutyrate −
        α-Methyl-glucose −
  (25) Utilization of carbon sources
        D-glucose +
        Galactose-
        L-arabinose-
        D-xylose-
        Glycerol +
        Myo-Inositol +
        Sucrose-
        L-histidine −
        Revalin −
        L-Arginine −
        L-serine-
  (26) Molecular species of ubiquinone: Ubiquinone 9 (Q9)
  (27) DNA GC content: 58%
[0042]
  As aboveAcetobacter SPAB10253 strain is mainly gram-negative cocci and has a size of 0.5-0.8 × 0.6-1.6 μm. The optimal temperature for growth is mesophilic bacteria at 30 ° C to 34 ° C, and the optimal growth pH is pH 5. Nitrate is not reducing, catalase positive, oxidase negative, and grows aerobically in 30% glucose medium. The molecular species of ubiquinone was Q9, and the GC content of DNA was 58%.
[0043]
  Summarizing these mycological propertiesAB10253The strain was judged to be a strain belonging to the genus Acetobacter. According to Bergey's Manual of Systematic Bacteriology VOL.1 (1984) pp. 268-274, Acetobacter aceti, Acetobacter liquefaciens, Acetocacter pasteurianus ), Four species of Acetobacter hansenii. As a result of comparing the bacteriological properties of the AB10253 strain with the above-mentioned known species, the AB10253 strain was considered to be the closest species to Acetobacter aceti. However, some of the mycological properties of this strain, such as being resistant to high concentrations of glucose and ethanol, growing at 38 ° C at growth temperature, and producing soluble pigment, Therefore, in order to distinguish this AB10253 strain from the known one, it was named Acetobacter sp. AB10253 strain and deposited as FERM P-18868 at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center. (Deposit date is May 27, 2002).
[0044]
  As mentioned earlier in this specification, until the 1960s, the taxonomic boundaries between the Acetobacter bacterium and the Gluconobacter bacterium are ambiguous. It was identified and announced. Therefore, myo-inositol oxidation activity by Acetobacter bacteria was disclosed in the present invention.Acetobacter SPAB10253 strain is the first discovery.
[0045]
【The invention's effect】
  According to the method of the present invention, high-purity scyllo-inosose useful as a pharmaceutical and agricultural chemical synthesis raw material and scyllo-inositol useful as a pharmaceutical and medical and agricultural chemical synthesis raw material can be produced at an industrial production level at low cost. .
[0046]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
  Below 1 The method of the present invention (the amended claim) 1 Invention) and 2 The method of the present invention (the amended claim) Four According to the invention) 7 Will be described in detail. On the other hand, the examples shown below 1 ~ 6 Is the amended claim 1 The first 1 The present invention and amended claims Four The first 2 Pseudomonas not used within the scope of the present invention sp. AB10064 Since the case where the method is performed using bacteria of the strain is illustrated, the present invention (the amended claim) 1 ~ Ten Although it does not belong to the embodiment of 7 It is added in this specification that it is necessary to understand the explanation of the experimental procedure.
Example 1
  Implementation method ( A Example of the production of scyllo-inosose by
  (1) Generation of scyllo-inosose
  Myo-inositol 12.0%, yeast extract 1.0%, (NH_Four)₂S0_Four 0.1%, K₂HPO_Four 0.7%, KH₂PO_Four 0.2% MgSO_Four・ 7H₂3 liters of liquid medium containing 0.01% O was dispensed into 100 ml 500 ml baffled Erlenmeyer flasks and sterilized by autoclave. Each Erlenmeyer flask containing a sterilized liquid medium was inoculated with one platinum loop of Pseudomonas sp. Strain AB10064 (FERM P-18330) slant culture and cultured at 27 ° C for 4 days with shaking. The obtained culture solution was centrifuged (8,000 rpm for 20 minutes), and the supernatant was obtained as a culture supernatant solution (2900 ml).
[0047]
  The culture supernatant was analyzed by high performance liquid chromatography under the following conditions. As a result, it was found that scyllo-inosose was produced at a concentration of 98 mg / ml in the culture supernatant (yield 284 g, conversion rate from myo-inositol 80%). Myo-inositol was not detected in the culture solution at this time.
[0048]
  Analytical conditions for high performance liquid chromatography are as follows.
  Column: Wakosil 5NH₂(4.6 × 250mm)
  Column temperature: 40 ° C
  Detector: RIDETECTER ERC-7515A (ERMA CR. INC.)
  Injection volume: 20μl
  Solvent: acetonitrile-water = 4: 1
  Flow rate: 2 ml / min
  Elution time scyllo-inosose; 11.6 minutes
  In addition, the conversion rate of said scyllo-inosose was calculated | required by following Formula.
  Conversion rate (%) = [number of moles of scyllo-inosose in culture supernatant / number of moles of myo-inositol in culture medium] × 100
[0049]
(2) Isolation of scyllo-inosose
  The culture supernatant obtained in Example 1 (1) was added to the strongly acidic cation exchange resin Duolite (registered trademark) C-20 (H⁺The column was passed through a column (inner diameter 5 cm, length 40 cm) packed with 500 ml, and then washed with 500 ml of ion-exchanged water. The column passing solution and the washing solution obtained here were combined, and the combined aqueous solution was packed with 1000 ml of weakly basic anion exchange resin Duolite (registered trademark) 368S (free base type) (inner diameter 7 cm, length 40 cm) Then, 1000 ml of ion exchange water was passed through the column for washing. The scyllo-inosose was contained in the aqueous solution combined with the passing liquid and the water washing liquid thus obtained, and the other impurities were hardly present.
[0050]
  The aqueous scyllo-inosose solution obtained above was concentrated to about 700 ml under reduced pressure, 3 times the amount of ethanol was added and allowed to stand at 5 ° C. overnight, and 216 g of colorless crystals of pure scyllo-inosose purified product were obtained. The purification recovery yield at this time was 76%, and the total yield of scyllo-inosose from myo-inositol was 61%.
[0051]
  In addition, the purification recovery rate of the above-mentioned scyllo-inosose was calculated | required by following Formula;
  Purification recovery rate (%) = [amount of purified and isolated scyllo-inosose ÷ amount of scyllo-inosose in culture supernatant before purification] × 100
  The total recovery rate of the above-mentioned scyllo-inosose was determined by the following formula:
  Total recovery (%) = [number of moles of purified and isolated scyllo-inosose / number of moles of myo-inositol added to the medium] × 100
[0052]
Example 2
Implementation method ( B Example of the production of scyllo-inosose by
(1) Production of bacterial cells
  Myo-inositol 0.5%, (NH_Four)₂SO_Four 0.1%, K₂HPO_Four 0.7%, KH₂PO_Four 0.2% MgSO_Four・ 7H₂O 2% of a pH 7 liquid medium containing 0.01% was dispensed 100 ml each in a 500 ml baffled Erlenmeyer flask and sterilized by autoclave. Each Erlenmeyer flask containing a sterilized liquid medium was inoculated with Pseudomonas sp. AB10064 strain and cultured with shaking at 27 ° C. for 3 days. The cells obtained by centrifuging the culture solution were washed with 200 ml of 0.05M phosphate buffer (pH 7.0) and then centrifuged again to obtain washed cells.
[0053]
(2) Production of scyllo-inosose
  30 g of the washed cells obtained as described above were added to 400 ml of 0.05 M phosphate buffer (pH 7.0) containing 4.0 g of dissolved myo-inositol (myo-inositol concentration 10 mg / ml). The mixture was allowed to react with myo-inositol while gently stirring with a stirrer at 30 ° C. for 24 hours. After completion of the reaction, the cells were removed from the obtained reaction solution, and the reaction solution filtrate was analyzed by liquid chromatography. As a result, scyllo-inosose was accumulated at a concentration of 8 mg / ml (conversion rate: 82%). Recovery and isolation of scyllo-inosose from the reaction liquid filtrate was performed according to the method described in Example 1, and 2.5 g of scyllo-inosose was obtained as crystals (purification recovery rate 78%). The total recovery rate of scyllo-inosose from myo-inositol was 64%.
[0054]
  The conversion rate of the above scyllo-inosose was determined according to Example 1, and the purification recovery rate was determined by the following formula:
  Purification recovery rate (%) = [amount of purified and isolated scyllo-inosose ÷ amount of scyllo-inosose in the reaction solution before purification] × 100
  Further, the total recovery rate of scyllo-inosose from myo-inositol was determined by the following formula:
  Total recovery (%) = [number of moles of purified and isolated scyllo-inosose / number of moles of myo-inositol added to the buffer] × 100
[0055]
Example 3
Implementation method ( C Of the production of scyllo-inositol by 1
(1) Generation of scyllo-inosose
  AB10064 strain was cultured in 3 liters of medium in exactly the same manner as (1) of Example 1, and the culture was centrifuged to remove the cells. 2900 ml of culture supernatant containing scyllo-inosose was obtained.
  When this culture supernatant was analyzed by the high performance liquid chromatography described in Example 1, 286 g of scyllo-inosose (conversion rate from myo-inositol to scyllo-inosose was 80%) was produced in the culture supernatant. I found out.
[0056]
  Conversion rate (%) = [number of moles of scyllo-inosose in culture supernatant / number of moles of myo-inositol in culture medium] × 100
[0057]
(2) Reduction of scyllo-inosose and generation of scyllo-inositol
  15.2 g of sodium borohydride was gradually added to 2900 ml of the culture supernatant containing scyllo-inosose obtained in the preceding item (1) to carry out a reduction reaction. After completion of the reduction, the culture supernatant (that is, the reduction reaction solution) was analyzed by high performance liquid chromatography described in Example 1. As a result, it was found that 105 g of scyllo-inositol was present in the reduction reaction solution (culture supernatant) and 151 g of myo-inositol was contained as a by-product (scyllo-inositol and myo-). The total reaction yield of inositol is 89%: the calculation formula is shown below). The reaction yield of scyllo-inositol from scyllo-inosose was 36%.
  In addition, the elution time of each compound in high performance liquid chromatography is as follows.
  Elution time: myo-inositol 17.0 minutes, scyllo-inositol 17.7 minutes
[0058]
  Total reaction yield of scyllo-inositol and myo-inositol (%) = [total number of moles of scyllo-inositol and moles of myo-inositol in the culture supernatant after the reduction reaction ÷ culture supernatant before the reduction reaction Number of moles of scyllo-inosose in the liquid] × 100
[0059]
  Moreover, the reaction yield of scyllo-inositol from the above scyllo-inosose was determined by the following formula:
  Reaction yield (%) = [number of moles of scyllo-inositol in the culture supernatant after the reduction reaction / number of moles of scyllo-inosose in the culture supernatant before the reduction reaction] × 100
[0060]
(3) Isolation of scyllo-inositol
  The reduction reaction solution obtained in the previous item (2) was added to the strongly acidic cation exchange resin Duolite (registered trademark) C-20 (H⁺The sample was passed through a column (inner diameter 5 cm, length 40 cm) packed with 400 ml, and then washed with 400 ml of ion-exchanged water. The column passing solution and the washing solution obtained here were combined, and the combined aqueous solution was used as a strongly basic anion exchange resin Duolite (registered trademark) A-113 (OH⁻Mold) was passed through a column (inner diameter 5 cm, length 60 cm) packed with 800 ml, and then the column was washed with 800 ml of ion-exchanged water.
[0061]
  The aqueous solution obtained by combining the passing solution and the water washing solution thus obtained contained scyllo-inositol and myo-inositol as a by-product, but contained almost no impurities other than these. When this aqueous solution was concentrated under reduced pressure, only scyllo-inositol with low water solubility was precipitated in the concentrate. The solution was concentrated to 500 ml, and the precipitated crystals were obtained by filtration. When a part of the crystal (79 g) thus obtained was dissolved in water and analyzed by liquid chromatography and other analyzers according to the method described in Example 1, this crystal showed a slight amount of myo-inositol. It was found to be crystals of scyllo-inositol. Subsequently, all the crystals were dissolved in 4 liters of water, filtered through a glass filter, and concentrated again to 400 ml. The precipitated crystals were obtained to obtain 60 g of white crystals. The crystals were analyzed by liquid chromatography and other analyzers and found to be pure scyllo-inositol.
[0062]
  In the series of operations described above, the purification recovery rate of scyllo-inositol was 57%, and the overall yield of scyllo-inositol from myo-inositol was 17%.
[0063]
  The scyllo-inositol purification and recovery rate was determined by the following formula;
  Purification recovery rate (%) = [amount of scyllo-inositol isolated as crystals ÷ amount of scyllo-inositol in the supernatant after the reduction reaction] × 100
  The total recovery rate of scyllo-inositol from myo-inositol was determined by the following formula:
  Total recovery (%) = [amount of scyllo-inositol isolated as crystals ÷ amount of myo-inositol added to the medium] × 100
[0064]
Example 4
Implementation method ( C Of the production of scyllo-inositol by 2
(1) Generation and reduction of scyllo-inosose
  AB10064 strain was cultured in the same manner as in Example 3 (1). The scyllo-inosose produced in the culture supernatant is reduced in the same manner as in Example 3 (2) to obtain a mixed solution (2900 ml) containing scyllo-inositol (105 g) and myo-inositol (152 g). It was. To this solution, AB10064 strain cells and yeast extract (6 g) separated by centrifugation were added. The obtained mixed solution was placed in a 5 L jar fermenter, and cultured for 3 days at a culture temperature of 27 ° C., a stirring speed of 400 rpm, and an aeration rate of 1 vvm. As a result of analyzing the culture solution, myo-inositol in the mixed solution was converted to scyllo-inosose. Thus, a mixed solution containing scyllo-inosose (122 g) and scyllo-inositol (105 g) and the cells was obtained.
[0065]
  The bacterial cells were removed from this mixed solution by centrifugation, and 6.5 g of sodium borohydride was gradually added to the resulting solution (culture supernatant) to carry out a reduction reaction. As a result, it was found that 162 g of scyllo-inositol was present in the reaction solution (culture supernatant) after the reduction reaction, and 66 g of myo-inositol was further contained as a by-product. Finally, scyllo-inositol conversion from myo-inositol was 45%.
[0066]
(2) Isolation of scyllo-inositol
  In the same manner as in Example 3 (3), scyllo-inositol was isolated from the reduction reaction solution. That is, after desalting with an ion exchange resin, the solution was concentrated to about 900 ml to precipitate scyllo-inositol crystals, which were isolated by filtration. The crude scyllo-inositol crystals thus obtained were dissolved again in 8 liters of water, water-insoluble matter was removed from the resulting aqueous solution with a glass filter, and then concentrated under reduced pressure. After the aqueous solution was concentrated to about 800 ml, the precipitated scyllo-inositol was filtered through a glass filter and recovered as white crystals (123 g). The overall recovery from myo-inositol was 34%.
  Total recovery (%) = [amount of scyllo-inositol isolated as crystals ÷ amount of myo-inositol added to the medium] × 100
[0067]
Example 5
Implementation method ( C Of the production of scyllo-inositol by Three
(1) Generation and reduction of scyllo-inosose
  The AB10064 strain was cultured, the culture supernatant was reduced, the reduction reaction solution was re-cultured, and the second culture supernatant was re-reduced in the same manner as in Example 4 (1). 160 g of scyllo-inositol was present in the reaction solution after the reduction reaction (culture supernatant) thus obtained, and 65 g of myo-inositol was contained as a by-product. AB10064 strain cells and yeast extract (2.5 g) that had been separated by centrifugation were added to the mixed solution again. The obtained mixed solution was placed in a 5 L jar fermenter, and cultured for 3 days at a culture temperature of 27 ° C., a stirring speed of 400 rpm, and an aeration rate of 1 vvm. As a result of analyzing the culture solution, myo-inositol in the mixed solution was converted to scyllo-inosose. Thus, a mixed solution containing scyllo-inosose (52 g), scyllo-inositol (160 g), and bacterial cells was obtained.
[0068]
  The cells were removed from the mixed solution by centrifugation, and 2.8 g of sodium borohydride was gradually added to the resulting supernatant solution to carry out a reduction reaction. It was found that 180 g of scyllo-inositol was present in the reaction solution (culture supernatant) after the reduction reaction, and 26 g of myo-inositol was contained as a by-product. Finally, scyllo-inositol conversion from myo-inositol was 50%.
[0069]
(2) Isolation of scyllo-inositol
  Scyllo-inositol was isolated in the same manner as in Example 4 (2). That is, after desalting with an ion exchange resin, the solution was concentrated to about 900 ml to precipitate scyllo-inositol crystals, which were isolated by filtration. The thus obtained scyllo-inositol crude crystals were again dissolved in 8 liters of water, and the resulting solution was concentrated under reduced pressure. Concentrated to about 800 ml, and the resulting scyllo-inositol was filtered through a glass filter to obtain white crystals (140 g). The overall recovery from myo-inositol was 39%.
[0070]
Example 6
Implementation method ( D Example of production of scyllo-inositol by
  In the same manner as in Example 2, scyllo-inosose was produced by oxidation of myo-inositol with AB10064 strain washed cells. That is, 30 g of washed cells of AB10064 strain were added to 400 ml of 0.05 M phosphate buffer (pH 7.0) containing myo-inositol 4.0 g (myo-inositol concentration 10 mg / ml), and the resulting mixture was added at 30 ° C. for 24 hours. The cells were allowed to react with myo-inositol while gently stirring with a stirrer, and scyllo-inosose was accumulated in the reaction solution at a concentration of 8 mg / ml. The reaction mixture was centrifuged to remove the cells, and 170 mg of sodium borohydride was gradually added to the resulting solution (supernatant) to carry out a reduction reaction. As a result, 1250 mg of scyllo-inositol was present in the reaction solution, and 1600 mg of myo-inositol was contained as a by-product.
[0071]
  Scyllo-inositol was isolated in the same manner as in Example 3 (3) to obtain 800 mg of scyllo-inositol white crystals. The overall recovery from myo-inositol was 20%.
[0072]
Example 7
  Implementation method ( C 4) of production example of scyllo-inositol by
(1) Generation of scyllo-inosose
  3 liters of liquid medium containing 16.0% myo-inositol and 16% yeast extract was adjusted to pH 5.0, and 100 ml each was dispensed into 500 ml baffled Erlenmeyer flasks and sterilized by autoclave. Each Erlenmeyer flask was inoculated with one platinum loop of a slant culture of Acetobacter sp. Strain AB10253 (FERM P-18868) and cultured with shaking at 27 ° C. for 4 days. The culture solution was centrifuged (8,000 rpm for 20 minutes) to remove the cells, and the supernatant was used as a culture supernatant solution (2900 ml). The cultured cells obtained by centrifugation were refrigerated at 4 ° C.
  This culture supernatant was analyzed in the same manner as in Example 1. As a result, it was found that 153 mg / ml (459 g, conversion rate 97%) of scyllo-inosose was produced in the culture supernatant. Myo-inositol was not detected in the culture solution at this time.
[0073]
(2) Reduction of culture supernatant
  To 2900 ml of the culture supernatant containing scyllo-inosose obtained in (1) above, 30.6 g of sodium borohydride was gradually added to carry out the reduction reaction. After completion of the reduction, the culture supernatant (reaction solution) was analyzed by high performance liquid chromatography described in Example 1. As a result, it was found that 177 g of scyllo-inositol was present in the reaction solution after the reduction reaction (culture supernatant), and 252 g of myo-inositol was contained as a by-product.
[0074]
(3) Isolation of scyllo-inositol crude crystals and generation of scyllo-inosose by cell reaction
  When the reaction solution obtained after the reduction reaction obtained in the preceding item (2) was left to stand overnight at room temperature, a white precipitate containing scyllo-inositol was formed. The solution was filtered and separated into a white solid and filtrate. 99 g of a white solid was obtained by dry weight. In order to react with the filtrate again, 228 g of myo-inositol was added and dissolved, and then the pH was adjusted to 5 with 5N HCl. The cultured cells separated and stored in (1) above were suspended in this, and about 100 ml was suspended into 500 ml baffled Erlenmeyer flasks.
[0075]
  In the cell reaction, pure oxygen gas was bubbled through the mixed solution in the Erlenmeyer flask and reacted at 27 ° C. for 20 hours with a rotary shaker. After completion of the reaction, the reaction solution was centrifuged (8,000 rpm for 20 minutes), and the supernatant was used as a cell reaction supernatant (3050 ml). The cultured cells obtained by centrifugation were refrigerated at 4 ° C.
[0076]
(4) Reduction of cell reaction supernatant
  A reduction reaction was carried out by gradually adding 31.1 g of sodium borohydride to 3050 ml of the culture supernatant containing scyllo-inosose obtained in (3) above. After completion of the reduction, the bacterial cell reaction supernatant (reduction reaction solution) was analyzed by high performance liquid chromatography described in Example 1. As a result, it was found that 258 g of scyllo-inositol was present in the reaction solution after the reduction reaction, and 256 g of myo-inositol was contained as a by-product.
[0077]
(5) Isolation of scyllo-inositol crude crystals and generation of scyllo-inosose by cell re-reaction
  When the reaction solution obtained after the reduction reaction obtained in (4) was allowed to stand overnight at room temperature, a white precipitate containing scyllo-inositol was formed. The solution was filtered and separated into a white solid and filtrate. A white solid was obtained in a dry weight of 199 g. In order to react again with the filtrate, 224 g of myo-inositol was added and dissolved, and then adjusted to pH 5.0 with 5N HCl. The cultured cells separated and stored in (3) above were suspended in this, and about 100 ml each was dispensed into 500 ml baffled Erlenmeyer flasks.
  In the cell reaction, pure oxygen gas was bubbled through the mixed solution in the Erlenmeyer flask and reacted at 27 ° C. for 20 hours with a rotary shaker. After completion of the reaction with the cells, the culture solution containing the generated scyllo-inosose is centrifuged (8,000 rpm for 20 minutes) to remove the cells, and the supernatant is the culture supernatant after the cells are reacted again ( 3170 m1). The cultured cells obtained by centrifugation were refrigerated at 4 ° C.
[0078]
(6) Reduction of culture supernatant after cell reaction
  After 31.1 g of sodium borohydride was gradually added to 3170 ml of the culture supernatant containing scyllo-inosose obtained in (5) above, the reduction reaction was carried out. After completion of the reduction, the reduction reaction solution obtained here was analyzed by high performance liquid chromatography shown in Example 1. As a result, it was found that 268 g of scyllo-inositol was present in the reduction reaction solution (culture supernatant), and 253 g of myo-inositol was contained as a by-product.
[0079]
(7) Isolation of scyllo-inositol crude crystals
  When the reduction reaction solution obtained in the previous item (6) was allowed to stand overnight at room temperature, a white precipitate containing scyllo-inositol was formed. The solution was filtered and separated into a white solid and filtrate. A white solid was obtained in a dry weight of 197 g. This white precipitate was combined with the white precipitate obtained in the preceding items (3) and (5) to obtain a total of 495 g (99 + 199 + 197) of a white precipitate containing scyllo-inositol. The amount of myo-inositol required for the reaction so far was 932 g (480 + 228 + 224).
[0080]
(8) Purification and isolation of scyllo-inositol
  487 g of the white precipitate obtained so far was dissolved in 25 L of hot water, cooled to room temperature, and strongly acidic cation exchange resin Duolite (registered trademark) C-20 (H⁺The sample was passed through a column (inner diameter: 5 cm, length: 40 cm) packed with 400 ml, and then washed with 400 ml of ion-exchanged water. The passing liquid and the washing liquid were used as a strongly basic anion exchange resin Duolite (registered trademark) A-113 (OH⁻The sample was passed through a column (inner diameter 5 cm, length 60 cm) packed with 800 ml, and then washed with 800 ml of ion-exchanged water.
[0081]
  The aqueous solution obtained by combining the passing solution and the water washing solution thus obtained contained scyllo-inositol and myo-inositol as a by-product, but contained almost no impurities other than these. When this aqueous solution was concentrated under reduced pressure, only scyllo-inositol with low water solubility was precipitated in the concentrate. It concentrated to 500 ml and the precipitated crystal | crystallization was acquired by filtration operation. When a part of the crystals (421 g) thus obtained was dissolved in water and analyzed by liquid chromatography and other analyzers according to the method described in Example 1, it was found that pure scyllo containing no myo-inositol. It was a crystal of inositol.
  The overall yield of scyllo-inositol from myo-inositol in the above series of operations was 45% (421/932 × 100).

Claims (10)

Inositol, bacterial der Rua Setobakuta sp AB10253 strain by the action of (deposited as accession number FERM P-18868), myo - - myo characterized thereby converted into inosose, scyllo - - inositol white inosose Production method.   The bacterium according to claim 1 is cultured in a liquid medium containing myo-inositol, and the bacterium is allowed to act on myo-inositol in a culture solution to convert myo-inositol into scyllo-inosose, 2. The method of claim 1, wherein scyllo-inosose is produced and accumulated in the culture and the scyllo-inosose is recovered from the culture.   The bacterium according to claim 1 is cultivated in a liquid medium containing myo-inositol, and the microbial cells obtained from the culture solution or a crushed product thereof is myo-inositol in an aqueous solution or buffer containing myo-inositol. The method of claim 1, wherein a scyllo-inosose is produced in the aqueous solution or buffer, and the scyllo-inosose produced is recovered. By causing myo-inositol to act on bacteria Acetobacter sp. AB10253 strain ( deposited as deposit number FERM P - 18868 ) and converting myo-inositol to scyllo-inosose, Without isolating scyllo-inosose produced from the reaction solution, a reducing agent is added to the reaction solution containing scyllo-inosose to act to produce scyllo-inositol and myo-inositol from scyllo-inosose. A method for producing scyllo-inositol, which is characterized by the above. A scyllo-inosose is reduced by the action of a reducing agent during the process of claim 4 to produce scyllo-inositol and myo-inositol, and the reaction solution containing scyllo-inositol and myo-inositol is again added to the reaction solution. By using Acetobacter sp. AB10253 strain (Accession No. FERM P - 18868 ) , the myo-inositol produced at the same time as the scyllo-inositol was not affected without affecting the scyllo-inositol present in the reaction solution. -Converting to inosose, and then adding a reducing agent to the resulting reaction solution to regenerate scyllo-inositol and myo-inositol from scyllo-inosose, thereby increasing the content of scyllo-inositol in the reaction solution The method according to claim 4. White during the process of claim 5 - inositol, Acetobacter sp. AB10253 strain (accession number FERM P - - 18868) myo generating upon reduction inosose again white - several times the step of converting into inosose 6. The concentration of scyllo-inositol in the reaction solution is increased stepwise by repeatedly performing, and then adding a reducing agent to the resulting reaction solution to generate scyllo-inositol from scyllo-inosose. The method described in 1. The Acetobacter sp. Strain AB10253 (Accession No. FERM P - 18868 ) according to claim 1 is cultured in a liquid medium containing myo-inositol, and the bacterium is allowed to act on myo-inositol in the culture solution to obtain myo-inositol. The reaction containing scyllo-inosose, without generating and accumulating scyllo-inosose in the culture medium by converting inositol to scyllo-inosose and isolating scyllo-inosose from the resulting reaction liquid Next, a reducing agent is added directly to the solution to cause the reducing agent to act on scyllo-inosose to produce scyllo-inositol and myo-inositol, and scyllo-inositol is recovered from the resulting reaction solution. Item 5. The method according to Item 4. During method according to claim 7, scyllo - act with a reducing agent from inosose white - - the reaction solution was generated inositol, again, Acetobacter sp. AB10253 strain (18868 accession number FERM P -) inositol and myo The myo-inositol produced in the reaction solution is converted into scyllo-inosose by culturing in repeated batches, and the reducing agent is directly added to this reaction solution to act on the scyllo-inosose. The method according to claim 7, wherein the content of scyllo-inositol in the reaction solution is increased by generating scyllo-inositol and myo-inositol to recover scyllo-inositol from the reaction solution thus obtained. . The Acetobacter sp. Strain AB10253 (Accession No. FERM P - 18868 ) according to claim 1 is cultured in a liquid medium containing myo-inositol, and the cells obtained from the culture or crushed material thereof are Without reacting with myo-inositol in an aqueous solution or buffer containing inositol to produce scyllo-inosose in the aqueous solution or buffer, without isolating scyllo-inosose produced from the resulting reaction solution The reducing agent is directly added to the reaction solution containing scyllo-inosose, and the reducing agent is allowed to act on scyllo-inosose to produce scyllo-inositol and myo-inositol, and scyllo-inositol is recovered. The method according to claim 4.   Acetobacter sp. AB10253 strain, which has the property of selectively converting myo-inositol into scyllo-inosose and was deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center under the accession number FERM P-18868.