JP3532956B2 - 無定形単球形態のインスリン誘導体 - Google Patents
無定形単球形態のインスリン誘導体Info
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- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
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Description
【０００１】インスリンは５１個のアミノ酸残基で構成
されたポリペプチドである。いわゆるＡ(acidic（酸
性)）鎖は２１個のアミノ酸残基より成り、Ｂ(basic
（塩基性))鎖は３０個のアミノ酸残基より成る。天然分
子ではそれら２本の鎖が２個のシスチン橋によって連結
されている。Ａ鎖では６および１１位システィン残基の
間に更なるジスルフィド橋が存在する。D. A. Scott（B
iochem. J., (1934), 28, 1592）の研究以来、インスリ
ン類の結晶化方法が知られている。通常の結晶化用緩衝
液にＺｎ2+イオンを加えるとpH５.４のその等電点で菱
面体結晶型を優先的に形成するインスリンが得られる。
ユニットセルは２個のＺｎ2+イオンを錯化するヘキサマ
ーインスリンを含有する。
されたポリペプチドである。いわゆるＡ(acidic（酸
性)）鎖は２１個のアミノ酸残基より成り、Ｂ(basic
（塩基性))鎖は３０個のアミノ酸残基より成る。天然分
子ではそれら２本の鎖が２個のシスチン橋によって連結
されている。Ａ鎖では６および１１位システィン残基の
間に更なるジスルフィド橋が存在する。D. A. Scott（B
iochem. J., (1934), 28, 1592）の研究以来、インスリ
ン類の結晶化方法が知られている。通常の結晶化用緩衝
液にＺｎ2+イオンを加えるとpH５.４のその等電点で菱
面体結晶型を優先的に形成するインスリンが得られる。
ユニットセルは２個のＺｎ2+イオンを錯化するヘキサマ
ーインスリンを含有する。
【０００２】人間、豚または牛から単離されたインスリ
ンは製造規模で容易に結晶化可能であるが、一部のイン
スリン誘導体例えばジ−Ａｒｇ−（Ｂ３１−３２）−ヒ
トインスリンはフェノールの存在下でのみ結晶化でき
る。インスリン誘導体の生産および精製の際に、薬学的
組成物の調製が悪影響を受けないように精製物質をフェ
ノールを添加せずに単離することがしばしば必要であ
る。製造目的には、等電点沈殿の後遠心分離および凍結
乾燥を行うのがこのインスリン誘導体に適している。こ
れによって綿毛様のインスリン凍結乾燥物が得られるが
これは取り扱いにくく、またすべての凍結乾燥タンパク
質と同様、その吸湿性挙動のために用量設定が難しい。
本発明の目的は、結晶化しにくいインスリン誘導体を固
体として分離できる方法を開発することであった。
ンは製造規模で容易に結晶化可能であるが、一部のイン
スリン誘導体例えばジ−Ａｒｇ−（Ｂ３１−３２）−ヒ
トインスリンはフェノールの存在下でのみ結晶化でき
る。インスリン誘導体の生産および精製の際に、薬学的
組成物の調製が悪影響を受けないように精製物質をフェ
ノールを添加せずに単離することがしばしば必要であ
る。製造目的には、等電点沈殿の後遠心分離および凍結
乾燥を行うのがこのインスリン誘導体に適している。こ
れによって綿毛様のインスリン凍結乾燥物が得られるが
これは取り扱いにくく、またすべての凍結乾燥タンパク
質と同様、その吸湿性挙動のために用量設定が難しい。
本発明の目的は、結晶化しにくいインスリン誘導体を固
体として分離できる方法を開発することであった。
【０００３】本発明は、
Ａ） インスリン誘導体を、水に対するｎ−プロパノー
ル含量が１５％以上でありそしてpHが４.５〜６.５であ
るｎ−プロパノール／緩衝液混合物に溶解させ、そして Ｂ） 得られた溶液を水に対するｎ−プロパノール含量
が１５％以下となるように水で希釈して、デバイ−シェ
ラー（Debye-Scherrer）Ｘ線分析により示されるような
無定形単球（monospheric）形態のインスリン誘導体を
その溶液から沈殿させる ことより成る、インスリン誘導体を溶液から単離するこ
とを可能にする方法が今般見出された。
ル含量が１５％以上でありそしてpHが４.５〜６.５であ
るｎ−プロパノール／緩衝液混合物に溶解させ、そして Ｂ） 得られた溶液を水に対するｎ−プロパノール含量
が１５％以下となるように水で希釈して、デバイ−シェ
ラー（Debye-Scherrer）Ｘ線分析により示されるような
無定形単球（monospheric）形態のインスリン誘導体を
その溶液から沈殿させる ことより成る、インスリン誘導体を溶液から単離するこ
とを可能にする方法が今般見出された。
【０００４】驚くべきことに、このようにして生産され
たインスリン誘導体は約５μｍの平均直径を有する無定
形単球形態を呈する。このようにして生産されたこれら
のインスリン誘導体は濾過または遠心分離により懸濁液
から単離することができ、乾燥状態で安定しており、ま
た適宜の組成の安定懸濁液として用いることもできる。
たインスリン誘導体は約５μｍの平均直径を有する無定
形単球形態を呈する。このようにして生産されたこれら
のインスリン誘導体は濾過または遠心分離により懸濁液
から単離することができ、乾燥状態で安定しており、ま
た適宜の組成の安定懸濁液として用いることもできる。
【０００５】更に、本発明は、
Ａ） インスリン誘導体を、水に対するｎ−プロパノー
ル含量が１５％以上でありそしてpHが４.５〜６.５であ
るｎ−プロパノール／緩衝液混合物に溶解させ、そして Ｂ） 得られた溶液を水に対するｎ−プロパノール含量
が１５％以下となるように水で希釈して、デバイ−シェ
ラーＸ線分析により示されるような無定形単球形態のイ
ンスリン誘導体をその溶液から沈殿させる 際に得られる無定形単球形態のインスリン誘導体に関す
る。
ル含量が１５％以上でありそしてpHが４.５〜６.５であ
るｎ−プロパノール／緩衝液混合物に溶解させ、そして Ｂ） 得られた溶液を水に対するｎ−プロパノール含量
が１５％以下となるように水で希釈して、デバイ−シェ
ラーＸ線分析により示されるような無定形単球形態のイ
ンスリン誘導体をその溶液から沈殿させる 際に得られる無定形単球形態のインスリン誘導体に関す
る。
【０００６】好ましいインスリン誘導体は、式Ｉ
【化２】
（式中、Ｘは遺伝コード化可能なアミノ酸残基であり、
ｎは１〜１０の整数であり、Ｙは遺伝コード化可能なア
ミノ酸残基であり、Ｒ1はフェニルアラニン残基または
水素原子であり、Ｒ2は遺伝コード化可能なアミノ酸残
基であり、また残基Ａ２〜Ａ２０はヒトインスリン、動
物インスリンまたはインスリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸
配列に相当し、そして残基Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインスリ
ン、動物インスリンまたはインスリン誘導体のＢ鎖のア
ミノ酸配列に相当する）で示される。
ｎは１〜１０の整数であり、Ｙは遺伝コード化可能なア
ミノ酸残基であり、Ｒ1はフェニルアラニン残基または
水素原子であり、Ｒ2は遺伝コード化可能なアミノ酸残
基であり、また残基Ａ２〜Ａ２０はヒトインスリン、動
物インスリンまたはインスリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸
配列に相当し、そして残基Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインスリ
ン、動物インスリンまたはインスリン誘導体のＢ鎖のア
ミノ酸配列に相当する）で示される。
【０００７】好ましいインスリン誘導体は、式Ｉ（式
中、ＸはＡｒｇまたはＬｙｓアミノ酸残基であり、ｎは
１または２の整数であり、ＹはＡｌａ、ＴｈｒまたはＳ
ｅｒアミノ酸残基であり、Ｒ1はＰｈｅアミノ酸残基で
あり、Ｒ2はＡｓｎ、ＳｅｒまたはＧｌｙアミノ酸残基
であり、また残基Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２９はヒ
トインスリンのＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当す
る）で示される。
中、ＸはＡｒｇまたはＬｙｓアミノ酸残基であり、ｎは
１または２の整数であり、ＹはＡｌａ、ＴｈｒまたはＳ
ｅｒアミノ酸残基であり、Ｒ1はＰｈｅアミノ酸残基で
あり、Ｒ2はＡｓｎ、ＳｅｒまたはＧｌｙアミノ酸残基
であり、また残基Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２９はヒ
トインスリンのＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当す
る）で示される。
【０００８】特に好ましいインスリン誘導体は式Ｉ（式
中、ＸはＡｒｇまたはＬｙｓアミノ酸残基であり、ｎは
１または２の整数であり、ＹはＴｈｒアミノ酸残基であ
り、Ｒ1はＰｈｅアミノ酸残基であり、Ｒ2はＡｓｎまた
はＧｌｙアミノ酸残基であり、また残基Ａ２〜Ａ２０お
よびＢ２〜Ｂ２９はヒトインスリンのＡおよびＢ鎖のア
ミノ酸配列に対応する）で示される。ペプチドおよびタ
ンパク質のアミノ酸配列はアミノ酸鎖のＮ−末端を出発
点としてナンバリングされる。式Ｉの括弧内に記入して
あるもの、例えばＡ６、Ａ２０、Ｂ１、Ｂ７、Ｂ１９ま
たはＢ３０はインスリンのＡまたはＢ鎖におけるアミノ
酸残基の位置に相当する。
中、ＸはＡｒｇまたはＬｙｓアミノ酸残基であり、ｎは
１または２の整数であり、ＹはＴｈｒアミノ酸残基であ
り、Ｒ1はＰｈｅアミノ酸残基であり、Ｒ2はＡｓｎまた
はＧｌｙアミノ酸残基であり、また残基Ａ２〜Ａ２０お
よびＢ２〜Ｂ２９はヒトインスリンのＡおよびＢ鎖のア
ミノ酸配列に対応する）で示される。ペプチドおよびタ
ンパク質のアミノ酸配列はアミノ酸鎖のＮ−末端を出発
点としてナンバリングされる。式Ｉの括弧内に記入して
あるもの、例えばＡ６、Ａ２０、Ｂ１、Ｂ７、Ｂ１９ま
たはＢ３０はインスリンのＡまたはＢ鎖におけるアミノ
酸残基の位置に相当する。
【０００９】「遺伝コード化可能なアミノ酸残基」とい
う用語は、アミノ酸残基Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈ
ｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌ
ｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉ
ｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏおよびセレノシス
ティンを表わす。動物インスリンの「残基Ａ２〜Ａ２
０」および「残基Ｂ２〜Ｂ２９」という用語は例えば
牛、豚、鶏由来インスリンのアミノ酸残基を意味する。
インスリン誘導体の残基Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２
９という用語はアミノ酸を他の遺伝コード化可能なアミ
ノ酸と交換することにより形成されるヒトインスリンの
相当するアミノ酸配列を表わす。
う用語は、アミノ酸残基Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈ
ｒ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌ
ｕ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉ
ｓ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏおよびセレノシス
ティンを表わす。動物インスリンの「残基Ａ２〜Ａ２
０」および「残基Ｂ２〜Ｂ２９」という用語は例えば
牛、豚、鶏由来インスリンのアミノ酸残基を意味する。
インスリン誘導体の残基Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２
９という用語はアミノ酸を他の遺伝コード化可能なアミ
ノ酸と交換することにより形成されるヒトインスリンの
相当するアミノ酸配列を表わす。
【００１０】ヒトインスリンのＡ鎖は次の配列（配列番
号１）を有する：Gly, Ile, Val, Glu, Gln, Cys, Cys,
Thr, Ser, Ile, Cys, Ser, Leu, Tyr,Gln, Leu, Glu,
Asn, Tyr, Cys, Asn
号１）を有する：Gly, Ile, Val, Glu, Gln, Cys, Cys,
Thr, Ser, Ile, Cys, Ser, Leu, Tyr,Gln, Leu, Glu,
Asn, Tyr, Cys, Asn
【００１１】ヒトインスリンのＢ鎖は次の配列（配列番
号２）を有する：Phe, Val, Asn, Gln, His, Leu, Cys,
Gly, Ser, His, Leu, Val, Glu, Ala,Leu, Tyr, Leu,
Val, Cys, Gly, Glu, Arg, Gly, Phe, Phe, Tyr, Thr,
Pro,Lys,Thr
号２）を有する：Phe, Val, Asn, Gln, His, Leu, Cys,
Gly, Ser, His, Leu, Val, Glu, Ala,Leu, Tyr, Leu,
Val, Cys, Gly, Glu, Arg, Gly, Phe, Phe, Tyr, Thr,
Pro,Lys,Thr
【００１２】式Ｉで示されるインスリン誘導体は多数の
遺伝子工学構築物を用いて微生物において形成すること
ができる（ＥＰ ０ ４８９ ７８０、ＥＰ ０ ３４７ ７
８１、ＥＰ ０ ３６８ １８７、ＥＰ ０ ４５３ ９６
９）。遺伝子工学構築物は、発酵中に微生物例えば大腸
菌（Escherichia coli)または放線菌(Streptomyces)中
で発現される。形成されたタンパク質は微生物内に蓄積
する（ＥＰ ０ ４８９７８０）かまたは発酵溶液中に分
泌される。式Ｉで示されるインスリン誘導体は予め精製
した形で、例えば、沈殿後、またはクロマトグラフィー
精製後に、本発明方法に用いることができる。
遺伝子工学構築物を用いて微生物において形成すること
ができる（ＥＰ ０ ４８９ ７８０、ＥＰ ０ ３４７ ７
８１、ＥＰ ０ ３６８ １８７、ＥＰ ０ ４５３ ９６
９）。遺伝子工学構築物は、発酵中に微生物例えば大腸
菌（Escherichia coli)または放線菌(Streptomyces)中
で発現される。形成されたタンパク質は微生物内に蓄積
する（ＥＰ ０ ４８９７８０）かまたは発酵溶液中に分
泌される。式Ｉで示されるインスリン誘導体は予め精製
した形で、例えば、沈殿後、またはクロマトグラフィー
精製後に、本発明方法に用いることができる。
【００１３】工程Ａ）の手順は次のとおりである：イン
スリン誘導体を１％の濃度となるようにｎ−プロパノー
ル／緩衝液混合物に溶解する。水に対するｎ−プロパノ
ール含量は１５％以上、好ましくは２５〜７０％、特に
４０〜６０％である。ｎ−プロパノール／緩衝液混合物
のpHはその緩衝液によって一定に保たれる。適当な緩衝
物質は例えばグリシン／酢酸／硫酸アンモニウム緩衝液
である。しかしながら、インスリン誘導体の精製のため
のクロマトグラフィー法の場合に必要となるように、他
の物質、例えばグリシン、グルタミンまたはベタインな
どが緩衝液中に存在しいていてもよい。緩衝成分の濃度
は広い範囲にわたって変えてもよいが、０.０１〜０.５
Ｍの濃度が好ましい。更に、Ｚｎ2+イオンを所望により
存在させてもよい。０.１〜１.０％ＺｎＣｌ 2、好まし
くは０.３〜０.５％ＺｎＣｌ2を添加してもよい。
スリン誘導体を１％の濃度となるようにｎ−プロパノー
ル／緩衝液混合物に溶解する。水に対するｎ−プロパノ
ール含量は１５％以上、好ましくは２５〜７０％、特に
４０〜６０％である。ｎ−プロパノール／緩衝液混合物
のpHはその緩衝液によって一定に保たれる。適当な緩衝
物質は例えばグリシン／酢酸／硫酸アンモニウム緩衝液
である。しかしながら、インスリン誘導体の精製のため
のクロマトグラフィー法の場合に必要となるように、他
の物質、例えばグリシン、グルタミンまたはベタインな
どが緩衝液中に存在しいていてもよい。緩衝成分の濃度
は広い範囲にわたって変えてもよいが、０.０１〜０.５
Ｍの濃度が好ましい。更に、Ｚｎ2+イオンを所望により
存在させてもよい。０.１〜１.０％ＺｎＣｌ 2、好まし
くは０.３〜０.５％ＺｎＣｌ2を添加してもよい。
【００１４】工程Ｂ）に対しては、Ａ）で得られた溶液
を水または緩衝液で希釈する。ｎ−プロパノール含量は
希釈後１５％以下、好ましくは５〜１２％とすべきであ
る。その希釈溶液を室温で１〜５時間、好ましくは２〜
３時間、徐々に撹拌すると無定形単球形態のインスリン
誘導体が溶液から沈殿する。その懸濁液は以後４℃で１
２〜１６時間保存することができる。この間に単球形態
のインスリン誘導体が沈降する。その澄明上清にインス
リン誘導体が存在しないことをチェックした後、上清を
傾瀉し、次いで濃縮懸濁液を遠心分離し、その沈殿を少
量の水で洗浄し、そして真空中、０℃で乾燥または凍結
乾燥する。
を水または緩衝液で希釈する。ｎ−プロパノール含量は
希釈後１５％以下、好ましくは５〜１２％とすべきであ
る。その希釈溶液を室温で１〜５時間、好ましくは２〜
３時間、徐々に撹拌すると無定形単球形態のインスリン
誘導体が溶液から沈殿する。その懸濁液は以後４℃で１
２〜１６時間保存することができる。この間に単球形態
のインスリン誘導体が沈降する。その澄明上清にインス
リン誘導体が存在しないことをチェックした後、上清を
傾瀉し、次いで濃縮懸濁液を遠心分離し、その沈殿を少
量の水で洗浄し、そして真空中、０℃で乾燥または凍結
乾燥する。
【００１５】インスリン誘導体のｎ−プロパノール含有
緩衝液溶液は得られた固体生成物をいずれかの方法によ
り前記緩衝液に０.５〜１.７％、好ましくは１％の濃度
となるように溶解することによって調製される。インス
リン誘導体の単離およびクロマトグラフィー精製に好ま
しいのはプロパノールを含有する適切な緩衝液の使用で
ある。何故ならば、これによって本発明による形態のイ
ンスリン誘導体を直ちに沈殿させることができるからで
ある。本発明によるインスリン誘導体およびこれらのイ
ンスリン誘導体を含有する相当する薬学的調製物は真性
糖尿病の治療に適している。以下の実施例において、本
発明方法を詳述する。％は特に断らない限り重量に基づ
く。
緩衝液溶液は得られた固体生成物をいずれかの方法によ
り前記緩衝液に０.５〜１.７％、好ましくは１％の濃度
となるように溶解することによって調製される。インス
リン誘導体の単離およびクロマトグラフィー精製に好ま
しいのはプロパノールを含有する適切な緩衝液の使用で
ある。何故ならば、これによって本発明による形態のイ
ンスリン誘導体を直ちに沈殿させることができるからで
ある。本発明によるインスリン誘導体およびこれらのイ
ンスリン誘導体を含有する相当する薬学的調製物は真性
糖尿病の治療に適している。以下の実施例において、本
発明方法を詳述する。％は特に断らない限り重量に基づ
く。
【００１６】実施例１
無定形単球状Ｇｌｙ−Ａ２１−ジ−Ａｒｇ−（Ｂ３１−
３２）−ヒトインスリンの調製 下記のアミノ酸配列を有するインスリン誘導体１を遺伝
子的に改変された大腸菌細胞の発酵により生産する（Ｅ
Ｐ ０ ３６８ １８７）： インスリン１（配列番号３）： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
３２）−ヒトインスリンの調製 下記のアミノ酸配列を有するインスリン誘導体１を遺伝
子的に改変された大腸菌細胞の発酵により生産する（Ｅ
Ｐ ０ ３６８ １８７）： インスリン１（配列番号３）： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Gly
【００１７】インスリン１は式Ｉ（式中、ＸはＡｒｇ−
Ａｒｇであり、ｎは数値２であり、ＹはＴｈｒ（Ｂ３
０）であり、Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、Ｒ2はＧｌｙ
（Ａ２１）であり、またＡ２〜Ａ２０はヒトインスリン
のＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であ
り、そしてＢ２〜Ｂ２９はヒトインスリンのＢ鎖のアミ
ノ酸配列（アミノ酸残基２〜３９）である）に相当す
る。
Ａｒｇであり、ｎは数値２であり、ＹはＴｈｒ（Ｂ３
０）であり、Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、Ｒ2はＧｌｙ
（Ａ２１）であり、またＡ２〜Ａ２０はヒトインスリン
のＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であ
り、そしてＢ２〜Ｂ２９はヒトインスリンのＢ鎖のアミ
ノ酸配列（アミノ酸残基２〜３９）である）に相当す
る。
【００１８】５０ｇの未精製インスリン１を０.１Ｍグ
リシン、０.０５Ｍ（ＮＨ4)2ＳＯ4、０.０２５Ｍ酢酸お
よび５０％ｎ−プロパノールの溶液（pH５.５）３.３リ
ットルに溶解し、そして３.３リットルの緩衝液Ａ（水
中、０.２Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシン、０.
０２５Ｍ酢酸、５％ｎ−プロパノール、pH５.５）で希
釈する。得られる混合物をプロパノール含量が１０％以
下となるように希釈しそして溶液全容量に対し０.４％
ＺｎＣｌ2を添加する。その溶液のpHをチェックしそし
て必要に応じ数滴の１Ｎ ＮａＯＨでpH５.５に調整す
る。その溶液を室温で徐々に撹拌すると、所望の形態の
生成物が得られる。沈殿を完了させるためにその溶液を
冷室温で一夜保存する。生成物の沈降後、澄明上清を傾
瀉除去する。沈降物を遠心分離する。このようにして得
られた湿った単球状Ｇｌｙ−Ａ２１−ジ−Ａｒｇ−（Ｂ
３１−３２）−ヒトインスリンを水洗して付着緩衝液を
除去した後０℃で減圧下に乾燥する。収率：３６ｇ。
リシン、０.０５Ｍ（ＮＨ4)2ＳＯ4、０.０２５Ｍ酢酸お
よび５０％ｎ−プロパノールの溶液（pH５.５）３.３リ
ットルに溶解し、そして３.３リットルの緩衝液Ａ（水
中、０.２Ｍ硫酸アンモニウム、０.１Ｍグリシン、０.
０２５Ｍ酢酸、５％ｎ−プロパノール、pH５.５）で希
釈する。得られる混合物をプロパノール含量が１０％以
下となるように希釈しそして溶液全容量に対し０.４％
ＺｎＣｌ2を添加する。その溶液のpHをチェックしそし
て必要に応じ数滴の１Ｎ ＮａＯＨでpH５.５に調整す
る。その溶液を室温で徐々に撹拌すると、所望の形態の
生成物が得られる。沈殿を完了させるためにその溶液を
冷室温で一夜保存する。生成物の沈降後、澄明上清を傾
瀉除去する。沈降物を遠心分離する。このようにして得
られた湿った単球状Ｇｌｙ−Ａ２１−ジ−Ａｒｇ−（Ｂ
３１−３２）−ヒトインスリンを水洗して付着緩衝液を
除去した後０℃で減圧下に乾燥する。収率：３６ｇ。
【００１９】実施例２
単球状ジ−Ａｒｇ−（Ｂ３１−３２）−ヒトインスリン
の調製 下記のアミノ酸配列を有するインスリン誘導体２を実施
例１と同じ方法で、遺伝子的に改変された大腸菌細胞の
発酵により生産する。 インスリン２（配列番号４）： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
の調製 下記のアミノ酸配列を有するインスリン誘導体２を実施
例１と同じ方法で、遺伝子的に改変された大腸菌細胞の
発酵により生産する。 インスリン２（配列番号４）： Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
【００２０】インスリン２は式Ｉ（式中、ＸはＡｒｇ−
Ａｒｇであり、ｎは数値２であり、ＹはＴｈｒ（Ｂ３
０）であり、Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、Ｒ2はＡｓｎ
（Ａ２１）であり、またＡ２〜Ａ２０はヒトインスリン
のＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり
そしてＢ２〜Ｂ２９はヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸
配列（アミノ酸残基２〜２９）である）に相当する。
Ａｒｇであり、ｎは数値２であり、ＹはＴｈｒ（Ｂ３
０）であり、Ｒ1はＰｈｅ（Ｂ１）であり、Ｒ2はＡｓｎ
（Ａ２１）であり、またＡ２〜Ａ２０はヒトインスリン
のＡ鎖のアミノ酸配列（アミノ酸残基２〜２０）であり
そしてＢ２〜Ｂ２９はヒトインスリンのＢ鎖のアミノ酸
配列（アミノ酸残基２〜２９）である）に相当する。
【００２１】１ｇのジ−Ａｒｇ−（Ｂ３１−３２）−ヒ
トインスリンを１００mlの緩衝液Ｂに溶解しそしてその
溶液を濾過により滅菌する。濾液を１００mlの滅菌緩衝
液Ａおよび３５０mlの滅菌水で希釈し、そしてパドルス
ターラーを用いて室温で３時間撹拌する。沈降を完了さ
せるために、その懸濁液を４℃で１４時間保存する。こ
のようにして得られた単球状インスリン誘導体を遠心分
離により除去しそして沈殿を洗浄して付着緩衝液を除去
しそして凍結乾燥する。収量：０.８７ｇ
トインスリンを１００mlの緩衝液Ｂに溶解しそしてその
溶液を濾過により滅菌する。濾液を１００mlの滅菌緩衝
液Ａおよび３５０mlの滅菌水で希釈し、そしてパドルス
ターラーを用いて室温で３時間撹拌する。沈降を完了さ
せるために、その懸濁液を４℃で１４時間保存する。こ
のようにして得られた単球状インスリン誘導体を遠心分
離により除去しそして沈殿を洗浄して付着緩衝液を除去
しそして凍結乾燥する。収量：０.８７ｇ
【００２２】緩衝液Ａ：０.２Ｍ(ＮＨ4)2ＳＯ4／０.１
Ｍグリシン／０.０２５Ｍ酢酸（５％水性ｎ−プロパノ
ール中）／pH５.５ 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ(ＮＨ4)2ＳＯ4／０.１Ｍグリシン
／０.０２５Ｍ酢酸（５０％水性ｎ−プロパノール中）
／pH５.５
Ｍグリシン／０.０２５Ｍ酢酸（５％水性ｎ−プロパノ
ール中）／pH５.５ 緩衝液Ｂ：０.０５Ｍ(ＮＨ4)2ＳＯ4／０.１Ｍグリシン
／０.０２５Ｍ酢酸（５０％水性ｎ−プロパノール中）
／pH５.５
【００２３】実施例３
Ｇｌｙ−Ａ２１−ジ−Ａｒｇ−(Ｂ３１−３２)−ヒトイ
ンスリン調製物の生産滅菌条件下に生産された１４.８m
gのＧｌｙ−Ａ２１−ジ−Ａｒｇ−(Ｂ３１−３２)−ヒ
トインスリン（単球状、実施例１に相当）を滅菌条件下
に、インスリン調製物用プラセボ緩衝液１０ml（pH７）
に懸濁する。安定性をチェックするために、その懸濁液
を振盪機上１００Hz、４℃で１週間振盪した。球状形態
の顕微鏡検査は全く変化を示さなかった。遠心分離後の
澄明上清のクロマトグラフィー検査は溶液中のインスリ
ンが１％以下であることを示した。
ンスリン調製物の生産滅菌条件下に生産された１４.８m
gのＧｌｙ−Ａ２１−ジ−Ａｒｇ−(Ｂ３１−３２)−ヒ
トインスリン（単球状、実施例１に相当）を滅菌条件下
に、インスリン調製物用プラセボ緩衝液１０ml（pH７）
に懸濁する。安定性をチェックするために、その懸濁液
を振盪機上１００Hz、４℃で１週間振盪した。球状形態
の顕微鏡検査は全く変化を示さなかった。遠心分離後の
澄明上清のクロマトグラフィー検査は溶液中のインスリ
ンが１％以下であることを示した。
【００２４】前記インスリン誘導体の血糖低下作用を試
験するために、一部の調製物をまずpH４.５に酸性化す
ることにより澄明溶液に変えた。犬に静脈内投与（０.
２IU／kg）すると等モル用量のヒトインスリンのそれと
同等の血糖低下を示した。懸濁液を皮下投与すると最初
はほんのわずかではあるが、しかし長期持続性の血糖低
下を示し、これは反復注射後は基礎プロフィールを示し
た。
験するために、一部の調製物をまずpH４.５に酸性化す
ることにより澄明溶液に変えた。犬に静脈内投与（０.
２IU／kg）すると等モル用量のヒトインスリンのそれと
同等の血糖低下を示した。懸濁液を皮下投与すると最初
はほんのわずかではあるが、しかし長期持続性の血糖低
下を示し、これは反復注射後は基礎プロフィールを示し
た。
【００２５】
配列番号：１
配列の長さ：２１個のアミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：大腸菌
配列の特徴：
名称／キー：タンパク質
存在位置：１..２１
配列
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu
Asn Tyr Cys Asn
【００２６】配列番号：２
配列の長さ：３０個のアミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：大腸菌
配列の特徴：
名称／キー：タンパク質
存在位置：１..３０
配列
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu
Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
【００２７】配列番号：３
配列の長さ：５３個のアミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：大腸菌
配列の特徴：
名称／キー：タンパク質
存在位置：１..５３
配列
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu
Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr
Cys Gly
【００２８】配列番号：４
配列の長さ：５３個のアミノ酸
配列の型：アミノ酸
トポロジー：直線状
配列の種類：タンパク質
起源
生物名：大腸菌
配列の特徴：
名称／キー：タンパク質
存在位置：１..５３
配列
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu
Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg Gly Ile
Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr
Cys Asn
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 ペーター・ダイル
ドイツ連邦共和国デー−65931フランク
フルト．クロースターホーフシユトラー
セ49
(72)発明者 カール・ガイゼン
ドイツ連邦共和国デー−60318フランク
フルト．ヤーンシユトラーセ43
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07K 14/62 - 14/65
A61K 38/28
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】 Ａ) 下記の式(Ｉ)で示されるインスリン
誘導体を、水に対するｎ−プロパノール含量が１５％以
上でありそしてpHが４.５〜６.５であるｎ−プロパノー
ル／緩衝液混合物に溶解させ、そして Ｂ) 得られた溶液を水に対するｎ−プロパノール含量が
１５％以下となるように水で希釈して、デバイ−シェラ
ーＸ線分析により示されるような無定形単球形態のイン
スリン誘導体をその溶液から沈殿させる際に得られる、
無定形単球形態のインスリン誘導体。 【化１】 上記式中、 Ｘは遺伝コード化可能なアミノ酸残基であり、 ｎは１〜１０の整数であり、 Ｙは遺伝コード化可能なアミノ酸残基であり、 Ｒ1はフェニルアラニン残基または水素原子であり、 Ｒ2は遺伝コード化可能なアミノ酸残基であり、また残
基Ａ２〜Ａ２０のヒトインスリン、動物インスリンまた
はインスリン誘導体のＡ鎖のアミノ酸配列に相当し、そ
して残基Ｂ２〜Ｂ２９はヒトインスリン、動物インスリ
ンまたはインスリン誘導体のＢ鎖のアミノ酸配列に相当
する。 - 【請求項２】 式Ｉ （式中、 ＸはＡｒｇまたはＬｙｓアミノ酸残基であり、 ｎは１または２の整数であり、 ＹはＡｌａ、ＴｈｒまたはＳｅｒアミノ酸残基であり、 Ｒ1はＰｈｅアミノ酸残基であり、 Ｒ2はＡｓｎ、ＳｅｒまたはＧｌｙアミノ酸残基であ
り、また残基Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２９はヒトイ
ンスリンのＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に相当する）で
示されるインスリン誘導体が用いられる請求項１記載の
無定形単球形態のインスリン誘導体。 - 【請求項３】 式Ｉ （式中、 ＸはＡｒｇまたはＬｙｓアミノ酸残基であり、 ｎは１または２の整数であり、 ＹはＴｈｒアミノ酸残基であり、 Ｒ1はＰｈｅアミノ酸残基であり、 Ｒ2はＡｓｎまたはＧｌｙアミノ酸残基であり、また残
基Ａ２〜Ａ２０およびＢ２〜Ｂ２９はヒトインスリンの
ＡおよびＢ鎖のアミノ酸配列に対応する）で示されるイ
ンスリン誘導体が用いられる請求項１記載の無定形単球
形態のインスリン誘導体。 - 【請求項４】 Ａ） インスリン誘導体を、水に対する
ｎ−プロパノール含量が１５％以上でありそしてpHが
４.５〜６.５であるｎ−プロパノール／緩衝液混合物に
溶解し、そして Ｂ） 得られた溶液を水に対するｎ−プロパノール含量
が１５％以下となるように水で希釈して、デバイ−シェ
ラーＸ線分析により示されるような無定形単球形態のイ
ンスリン誘導体をその溶液から沈殿させる、ことより成
る、請求項１〜３のいずれかに記載の無定形単球形態の
インスリン誘導体の製造方法。 - 【請求項５】 希釈後のプロパノール濃度が５〜１２％
である請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 グリシン、硫酸アンモニウムおよび酢酸
を含有する緩衝液が用いられる請求項４記載の方法。 - 【請求項７】 請求項１〜３のいずれかに記載の無定形
単球形態のインスリン誘導体および生理学的に許容され
るビヒクルを含有する、真性糖尿病治療のための薬学的
組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4313702 | 1993-04-27 | ||
| DE4313702:4 | 1993-04-27 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06321990A JPH06321990A (ja) | 1994-11-22 |
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Family
ID=6486458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP08811194A Expired - Lifetime JP3532956B2 (ja) | 1993-04-27 | 1994-04-26 | 無定形単球形態のインスリン誘導体 |
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| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5466666A (ja) |
| EP (1) | EP0622376B1 (ja) |
| JP (1) | JP3532956B2 (ja) |
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| DE (1) | DE59409816D1 (ja) |
| DK (1) | DK0622376T3 (ja) |
| ES (1) | ES2161726T3 (ja) |
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| AU2004234345A1 (en) * | 2003-04-29 | 2004-11-11 | Eli Lilly And Company | Insulin analogs having protracted time action |
| RU2495131C2 (ru) * | 2008-02-19 | 2013-10-10 | Байокон Лимитид | Способ получения рекомбинантного инсулина гларгина |
| PL239062B1 (pl) * | 2016-01-22 | 2021-11-02 | Inst Biotechnologii I Antybiotykow | Sposób wytwarzania insuliny i jej pochodnych |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3333640A1 (de) * | 1983-09-17 | 1985-04-25 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von insulin-derivaten, deren b-kette c-terminal verlaengert ist, neue basisch modifizierte insulin-derivate diese enthaltende mittel und ihre verwendung |
| DE4012818A1 (de) * | 1990-04-21 | 1991-10-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
| ATE101620T1 (de) * | 1988-06-23 | 1994-03-15 | Hoechst Ag | Mini-proinsulin, seine herstellung und verwendung. |
| DE3837825A1 (de) * | 1988-11-08 | 1990-05-10 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| GR1005153B (el) * | 1989-08-29 | 2006-03-13 | The General Hospital Corporation | Πρωτεινες συντηξεως, παρασκευη τους και χρηση τους. |
-
1994
- 1994-04-21 DE DE59409816T patent/DE59409816D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-21 ES ES94106196T patent/ES2161726T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-21 DK DK94106196T patent/DK0622376T3/da active
- 1994-04-21 AT AT94106196T patent/ATE203998T1/de active
- 1994-04-21 EP EP94106196A patent/EP0622376B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-25 US US08/233,617 patent/US5466666A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-26 JP JP08811194A patent/JP3532956B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-10-09 GR GR20010401702T patent/GR3036840T3/el unknown
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| EP0622376B1 (de) | 2001-08-08 |
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| DE59409816D1 (de) | 2001-09-13 |
| ES2161726T3 (es) | 2001-12-16 |
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