JP3504658B2 - 新規生体高分子の製造方法 - Google Patents
新規生体高分子の製造方法Info
- Publication number
- JP3504658B2 JP3504658B2 JP50798892A JP50798892A JP3504658B2 JP 3504658 B2 JP3504658 B2 JP 3504658B2 JP 50798892 A JP50798892 A JP 50798892A JP 50798892 A JP50798892 A JP 50798892A JP 3504658 B2 JP3504658 B2 JP 3504658B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- selection
- cycle
- mixture
- mutagenesis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 title claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 44
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims abstract description 29
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims abstract description 29
- 238000009826 distribution Methods 0.000 claims abstract description 26
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 26
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 14
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 10
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims abstract description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 11
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000002729 polyribosome Anatomy 0.000 claims description 4
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 claims description 2
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 claims description 2
- 239000002213 purine nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 239000002719 pyrimidine nucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 description 10
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 8
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 206010069754 Acquired gene mutation Diseases 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 2
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000037439 somatic mutation Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 230000001427 coherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000010429 evolutionary process Effects 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000008080 stochastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1058—Directional evolution of libraries, e.g. evolution of libraries is achieved by mutagenesis and screening or selection of mixed population of organisms
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1079—Screening libraries by altering the phenotype or phenotypic trait of the host
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Ecology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明の目的は、ポリメラーゼを用いる、改良した特
性を有する新規生体高分子の製造方法を提供することに
ある。
性を有する新規生体高分子の製造方法を提供することに
ある。
ペプチド、DNA及びRNA等の生体高分子は、常にポリメ
ラーゼを用いて合成される。従来は、全種類の生物学的
リソースを広範にスクリーニングし、改良した機能を有
する新規生体高分子を得て、最終的に優れた又は更に優
れた機能を有するものを選択して、望ましい生体高分子
の製造を目的としてそれらを大量複製してきた。
ラーゼを用いて合成される。従来は、全種類の生物学的
リソースを広範にスクリーニングし、改良した機能を有
する新規生体高分子を得て、最終的に優れた又は更に優
れた機能を有するものを選択して、望ましい生体高分子
の製造を目的としてそれらを大量複製してきた。
結局のところ、全ての生物学的又は微生物学的培養の
古典的方法は、この原則に基づいている。
古典的方法は、この原則に基づいている。
遺伝子組換え技術と、組換え体微生物及び細胞培養に
よる生体高分子製造により、既に著しい進歩が成されて
きた。しかし、相当な努力とエネルギーを費やしたにも
関わらず、生体高分子又はそれをコードする核酸配列の
一部又は複数部を特異的又は非特異的に変更する試み
は、各々僅かな場合に成功したのみである。L.Coldは、
SELEXと呼ばれる方法を用いて、配列の小部分内に位置
する１又は２の等価な点変異によるRNA分子の最適化に
ついて記述している。しかし、自然界ではしばしば、配
列の更に離れた部分、又は更に長い結合（coherent）部
分が、特異的最適化の対象となりうることが観察され
る。この一例として、体細胞突然変異と称される機構に
よる抗体の最適化がある。体細胞突然変異は、機構的に
は完全には解明されていないが、抗体の選択性を著しく
高め、それによって、組換えによる変異型発生能力を越
えた、コードされた抗体の遺伝的能力を拡大することを
示す。
よる生体高分子製造により、既に著しい進歩が成されて
きた。しかし、相当な努力とエネルギーを費やしたにも
関わらず、生体高分子又はそれをコードする核酸配列の
一部又は複数部を特異的又は非特異的に変更する試み
は、各々僅かな場合に成功したのみである。L.Coldは、
SELEXと呼ばれる方法を用いて、配列の小部分内に位置
する１又は２の等価な点変異によるRNA分子の最適化に
ついて記述している。しかし、自然界ではしばしば、配
列の更に離れた部分、又は更に長い結合（coherent）部
分が、特異的最適化の対象となりうることが観察され
る。この一例として、体細胞突然変異と称される機構に
よる抗体の最適化がある。体細胞突然変異は、機構的に
は完全には解明されていないが、抗体の選択性を著しく
高め、それによって、組換えによる変異型発生能力を越
えた、コードされた抗体の遺伝的能力を拡大することを
示す。
生物薬剤の最適化は、製薬工業の目標の頂点である。
言及する価値のあるものとして、酵素活性、受容体の特
性、リガンド相互作用、抗生物質又は抗ウイルス特性、
接種の効能等の最適化がある。技術的には、天然に存在
する構造物又はその化学修飾物に関するスクリーニング
方法、又はコンピュータ・モデリングによる目標指向性
（goal−oriented）デザイン、あるいは遺伝子組換え工
学の手法等の多くの可能性が現在追求されている。
言及する価値のあるものとして、酵素活性、受容体の特
性、リガンド相互作用、抗生物質又は抗ウイルス特性、
接種の効能等の最適化がある。技術的には、天然に存在
する構造物又はその化学修飾物に関するスクリーニング
方法、又はコンピュータ・モデリングによる目標指向性
（goal−oriented）デザイン、あるいは遺伝子組換え工
学の手法等の多くの可能性が現在追求されている。
自然界から、自然最適化法の結果、即ち進化の結果を
見出すことができる。その機構を理解することは、多く
の有名な科学者及び哲学者の目標であった。以下に、ダ
ーウィン（Darwin）（“The origin of Species"、G.G.
Simpson,Collier McMillan、London 1962）、モノー（M
onod）（“Zufall und Notwendigkeit"、J.Monod,Pipe
r、Ｍnchen、1971）、及びアイゲン（Eigen）（M.Eig
en、J.McCaskill ＆ P.Schuster、1987、1988、J.Phys.
Chem.）の考えを、数行で簡単に解析することを試み
る。ダーウィンは種の研究において、進化は突然変異と
自然淘汰の相互作用に基づくという結論に達した。モノ
ーはこの考察を分子遺伝学の新概念に組み入れ、既存の
野性型の遺伝情報に関するランダム突然変異の重要性
と、突然変異体がより良い適応機能を発現する場合に続
いて起こる選択の必然性について議論した。
見出すことができる。その機構を理解することは、多く
の有名な科学者及び哲学者の目標であった。以下に、ダ
ーウィン（Darwin）（“The origin of Species"、G.G.
Simpson,Collier McMillan、London 1962）、モノー（M
onod）（“Zufall und Notwendigkeit"、J.Monod,Pipe
r、Ｍnchen、1971）、及びアイゲン（Eigen）（M.Eig
en、J.McCaskill ＆ P.Schuster、1987、1988、J.Phys.
Chem.）の考えを、数行で簡単に解析することを試み
る。ダーウィンは種の研究において、進化は突然変異と
自然淘汰の相互作用に基づくという結論に達した。モノ
ーはこの考察を分子遺伝学の新概念に組み入れ、既存の
野性型の遺伝情報に関するランダム突然変異の重要性
と、突然変異体がより良い適応機能を発現する場合に続
いて起こる選択の必然性について議論した。
アイゲンは単純な考察の結論として、進化における最
適化の自然過程は野性型の突然変異誘発では説明できな
いことを示すことができた。換言すれば、自然発達する
野性型突然変異体の盲検試験（試行錯誤）は、天文学的
に多数の他の可能性があるという見地から、決して有効
な進化には至らないであろうということである。いかな
る生命の原始的形態の発生にとっても、桁違いな程、経
過した40億年という期間はあまりに短く、可能な事柄は
少なすぎる。進化過程を理解する突破口は、準種（quas
i−species）、配列空間（sequence space）、値の景色
（value landscape）、ハイパーサイクル（hypercycl
e）、画分化（compartimentation）等の新規概念の導入
だけでなく、遺伝学実験の正確な解釈により見出され
る。
適化の自然過程は野性型の突然変異誘発では説明できな
いことを示すことができた。換言すれば、自然発達する
野性型突然変異体の盲検試験（試行錯誤）は、天文学的
に多数の他の可能性があるという見地から、決して有効
な進化には至らないであろうということである。いかな
る生命の原始的形態の発生にとっても、桁違いな程、経
過した40億年という期間はあまりに短く、可能な事柄は
少なすぎる。進化過程を理解する突破口は、準種（quas
i−species）、配列空間（sequence space）、値の景色
（value landscape）、ハイパーサイクル（hypercycl
e）、画分化（compartimentation）等の新規概念の導入
だけでなく、遺伝学実験の正確な解釈により見出され
る。
それらの用語のうちいくつかは、経済的に使用可能な
合成の方策に翻訳するために不可欠なものであるので、
本発明にはそれらの説明が必要とされる。
合成の方策に翻訳するために不可欠なものであるので、
本発明にはそれらの説明が必要とされる。
「準種」は古い「野性型」の定義の新しい解釈を指
す。再複製により次々と発生するゲノムの集合全体は、
理想的な「野性型」配列の集団などではない。それはむ
しろ野性型を取り囲む突然変異体の分布である。選択の
対象は、特定の「野性型」配列というよりもむしろ、ま
さにこの分布である。該分布そのものは、何よりもま
ず、再複製に含まれる酵素（ポリメラーゼ）によるコピ
ーエラーの結果である。最も頻繁に出現する平均配列の
みが、以前に仮定されていた「野性型」として認識され
る一方で、大多数の他の全ての配列は、程度の違いはあ
るが、以前に定義されていた野性型からの著しい偏差を
示す。特定の配列の頻度と、それと近い関係にある配列
の頻度は、それらの生物学的値の尺度である。該分布が
いわゆる値の景色を決定する。進化に関する利点は明白
である。即ち、そのように構築された生物学的システム
は、要求の変化した側面と非常にすばやく反応する。変
異型は、最初は数の上では十分には出現しないかもしれ
ないが、必ず存在し、野性型とはかなり大幅に異なる
が、新しい値の仮想の最大には比較的近い。この事実か
ら、進化は内部誘導機構を与えられ、従って相当な時間
を得ることができる。この正の効果に対して、複製の間
に発生するエラーの頻度が非常に高いことによる情報喪
失の危険もある。アイゲンは、自然のシステムが許容し
うるエラーの最大値よりも僅かに低い複製をすることを
示した。変化に対する適応の柔軟性は最大であるのに反
して、遺伝情報の不可逆的消失は回避される。該準種
は、より良い適応分布が出現しない限り安定であり続け
る。この値の景色の新しい解釈の更なる結論は次の通り
である。即ち、突然変異誘発の盲検「試行錯誤」過程は
不要である。必要なのはむしろ適合値の景色の「山の
背」に沿って目標を目指して移動する、進化に関する適
応性である。
す。再複製により次々と発生するゲノムの集合全体は、
理想的な「野性型」配列の集団などではない。それはむ
しろ野性型を取り囲む突然変異体の分布である。選択の
対象は、特定の「野性型」配列というよりもむしろ、ま
さにこの分布である。該分布そのものは、何よりもま
ず、再複製に含まれる酵素（ポリメラーゼ）によるコピ
ーエラーの結果である。最も頻繁に出現する平均配列の
みが、以前に仮定されていた「野性型」として認識され
る一方で、大多数の他の全ての配列は、程度の違いはあ
るが、以前に定義されていた野性型からの著しい偏差を
示す。特定の配列の頻度と、それと近い関係にある配列
の頻度は、それらの生物学的値の尺度である。該分布が
いわゆる値の景色を決定する。進化に関する利点は明白
である。即ち、そのように構築された生物学的システム
は、要求の変化した側面と非常にすばやく反応する。変
異型は、最初は数の上では十分には出現しないかもしれ
ないが、必ず存在し、野性型とはかなり大幅に異なる
が、新しい値の仮想の最大には比較的近い。この事実か
ら、進化は内部誘導機構を与えられ、従って相当な時間
を得ることができる。この正の効果に対して、複製の間
に発生するエラーの頻度が非常に高いことによる情報喪
失の危険もある。アイゲンは、自然のシステムが許容し
うるエラーの最大値よりも僅かに低い複製をすることを
示した。変化に対する適応の柔軟性は最大であるのに反
して、遺伝情報の不可逆的消失は回避される。該準種
は、より良い適応分布が出現しない限り安定であり続け
る。この値の景色の新しい解釈の更なる結論は次の通り
である。即ち、突然変異誘発の盲検「試行錯誤」過程は
不要である。必要なのはむしろ適合値の景色の「山の
背」に沿って目標を目指して移動する、進化に関する適
応性である。
本発明により技術的尺度に翻訳すべきその他の用語は
ハイパーサイクルと画分化なので、それらの意味につい
て簡単に説明しなければならない。ハイパーサイクルと
は、複製しうる情報のキャリヤと、それらキャリヤによ
りコードされた複製触媒酵素（replication−catalysin
g enzyme）の間のサイクリック相互作用である。小胞又
は細胞構造への画分化は、独立な進化が可能となるはず
のハイパーサイクルと、統計的かつ規則的に結果が出る
ことを避ける（これは、変異型がコード配列に直接かつ
特異的にフィードバックするのを回避する）変異型とを
扱う。
ハイパーサイクルと画分化なので、それらの意味につい
て簡単に説明しなければならない。ハイパーサイクルと
は、複製しうる情報のキャリヤと、それらキャリヤによ
りコードされた複製触媒酵素（replication−catalysin
g enzyme）の間のサイクリック相互作用である。小胞又
は細胞構造への画分化は、独立な進化が可能となるはず
のハイパーサイクルと、統計的かつ規則的に結果が出る
ことを避ける（これは、変異型がコード配列に直接かつ
特異的にフィードバックするのを回避する）変異型とを
扱う。
本発明は、上記の洞察を利用して、ポリメラーゼを用
いて、体系的に改良した特性を有する新規な生体高分子
の製造方法を開発することにある。このことを、比較さ
れるべき一連の対応する調製において、以下の段階の少
なくとも１サイクルを行うことで解決する。
いて、体系的に改良した特性を有する新規な生体高分子
の製造方法を開発することにある。このことを、比較さ
れるべき一連の対応する調製において、以下の段階の少
なくとも１サイクルを行うことで解決する。
（１）準種の突然変異体分布中の、核酸配列又は同様の
核酸配列の混合物を、エラー閾値の領域内で、限定され
た突然変異誘発に付する段階、 （２）それらの混合物を、同時条件の下で及び／又は連
続して、複製する段階、 （３）生成した核酸混合物を、画分化により分離する段
階、及び （４）特定の核酸配列の特性を直接反映するか又は間接
的にその翻訳生成物を通して反映する選択システムによ
り選択する段階。
核酸配列の混合物を、エラー閾値の領域内で、限定され
た突然変異誘発に付する段階、 （２）それらの混合物を、同時条件の下で及び／又は連
続して、複製する段階、 （３）生成した核酸混合物を、画分化により分離する段
階、及び （４）特定の核酸配列の特性を直接反映するか又は間接
的にその翻訳生成物を通して反映する選択システムによ
り選択する段階。
最も単純な場合には、突然変異誘発は既に複製により
複製酵素／酵素システムのエラー閾値の領域内で起きて
いる。また、突然変異に好ましい反応条件及び反応パラ
メータから影響を受け、遺伝子の特定のセグメントが許
容しうるエラー閾値の領域に到達し、あるいはいくらか
越える場合もある。ここには、例えばプリン及び／又は
ピリミジンヌクレオチド塩基の所定の非平衡投与、及び
塩基類似体の添加が属する。更に、突然変異誘発物質、
及び／又は高エネルギー照射を適用してもよい。最後
に、温度、pH値、酸化還元ポテンシャル等の他の反応パ
ラメータを、突然変異に好ましいものとしてもよい。
複製酵素／酵素システムのエラー閾値の領域内で起きて
いる。また、突然変異に好ましい反応条件及び反応パラ
メータから影響を受け、遺伝子の特定のセグメントが許
容しうるエラー閾値の領域に到達し、あるいはいくらか
越える場合もある。ここには、例えばプリン及び／又は
ピリミジンヌクレオチド塩基の所定の非平衡投与、及び
塩基類似体の添加が属する。更に、突然変異誘発物質、
及び／又は高エネルギー照射を適用してもよい。最後
に、温度、pH値、酸化還元ポテンシャル等の他の反応パ
ラメータを、突然変異に好ましいものとしてもよい。
限定的突然変異誘発は、本発明が意味するところで
は、システムの完全な破壊に至らない突然変異誘発の一
種であると解釈されるべきである。更にそれは、核酸配
列の全ての部分を変更する効果を目的とするものではな
い。しかしこのことは、混合物の一部では、及び短期間
では、エラー閾値で設定した生物学的制限を越えること
ができないということを意味するものではない。生き残
り、最適化されうる突然変異体に加えて、最終的には生
き残れない欠損突然変異体が生成しうることも、完全に
受入れられるべきである。しかし、いずれの場合にも、
単一の突然変異体のみが生き残ることが目的ではなく、
生き残るのは一群の突然変異体でなければならない。更
に、突然変異誘発条件を、異なる核酸配列が様々な突然
変異誘発圧力にさらされるように選択又は計画してもよ
い。しかし、この場合にも、確実に一群の突然変異体が
生き残るようにしなければならない。
は、システムの完全な破壊に至らない突然変異誘発の一
種であると解釈されるべきである。更にそれは、核酸配
列の全ての部分を変更する効果を目的とするものではな
い。しかしこのことは、混合物の一部では、及び短期間
では、エラー閾値で設定した生物学的制限を越えること
ができないということを意味するものではない。生き残
り、最適化されうる突然変異体に加えて、最終的には生
き残れない欠損突然変異体が生成しうることも、完全に
受入れられるべきである。しかし、いずれの場合にも、
単一の突然変異体のみが生き残ることが目的ではなく、
生き残るのは一群の突然変異体でなければならない。更
に、突然変異誘発条件を、異なる核酸配列が様々な突然
変異誘発圧力にさらされるように選択又は計画してもよ
い。しかし、この場合にも、確実に一群の突然変異体が
生き残るようにしなければならない。
突然変異誘発を起こす方法として好ましいのは、エラ
ー閾値（調整）領域内で、複製の変数として用いる精度
を調整し、又は連続段階的に精度を変化させ、続いて更
に正確な 複製増幅を行い、核酸分布を、常にエラー閾値の領域内
で、値の景色を通じて所望の最適値の方向へ誘導するよ
うな方法である。
ー閾値（調整）領域内で、複製の変数として用いる精度
を調整し、又は連続段階的に精度を変化させ、続いて更
に正確な 複製増幅を行い、核酸分布を、常にエラー閾値の領域内
で、値の景色を通じて所望の最適値の方向へ誘導するよ
うな方法である。
本発明では、画分への分離は、一方では実質上全ての
新旧変異型が少なくとも一つの画分に出現し、他方では
該画分の内容物が表現型選択により分化するような影響
を受ける。そのような条件は、単純な前試験によるより
も場合毎に決定することが可能である。適当な画分とし
ては、例えばアイゲンにより複製装置で用いられた画分
がある。ドイツユーティリティモデル88 13 773.2 U1
（“Verschiebeeinheit"）、88 14 398.8 U1（“Gradie
ntenbrett"）、DE 40 22 792.8（“Folie"）、DE 40 22
793.6（“VerschweiBeinrichtung"）、DE 40 22 794.4
（“Form d.Folie"）、及びDE 40 29 004.2（“Schlitt
en"）を参照。
新旧変異型が少なくとも一つの画分に出現し、他方では
該画分の内容物が表現型選択により分化するような影響
を受ける。そのような条件は、単純な前試験によるより
も場合毎に決定することが可能である。適当な画分とし
ては、例えばアイゲンにより複製装置で用いられた画分
がある。ドイツユーティリティモデル88 13 773.2 U1
（“Verschiebeeinheit"）、88 14 398.8 U1（“Gradie
ntenbrett"）、DE 40 22 792.8（“Folie"）、DE 40 22
793.6（“VerschweiBeinrichtung"）、DE 40 22 794.4
（“Form d.Folie"）、及びDE 40 29 004.2（“Schlitt
en"）を参照。
該手法を実際に実施することに関しては、特定の表現
型選択された生体高分子群に属するそれらの核酸配列
を、同時に、又は後に単独で、又は混合物中で評価可能
であることが更に重要である。このことは、本発明で確
立した最適核酸配列の回収、及び後のサイクルでのそれ
らの選択的な使用のために必要である。
型選択された生体高分子群に属するそれらの核酸配列
を、同時に、又は後に単独で、又は混合物中で評価可能
であることが更に重要である。このことは、本発明で確
立した最適核酸配列の回収、及び後のサイクルでのそれ
らの選択的な使用のために必要である。
遺伝子工学の古典的方法とは対照的に、本発明では、
初期集団の正確の核酸配列も、最適集団の正確な核酸配
列も決定しない。かわりに、突然変異誘発及び選択によ
り選択された群の多様性の程度に基づいて、更なる進展
が有効となり、そのため進化における山の背を歩く（ri
dge walking）性質を利用することができ、全体の過程
が加速されかつ単純化される。
初期集団の正確の核酸配列も、最適集団の正確な核酸配
列も決定しない。かわりに、突然変異誘発及び選択によ
り選択された群の多様性の程度に基づいて、更なる進展
が有効となり、そのため進化における山の背を歩く（ri
dge walking）性質を利用することができ、全体の過程
が加速されかつ単純化される。
核酸混合物からの選択は、遺伝子型と表現型が直接連
結した生成物上で行うことが好ましい。例としては、直
接連結した翻訳生成物とコードRNAとを含むポリソーム
がある。
結した生成物上で行うことが好ましい。例としては、直
接連結した翻訳生成物とコードRNAとを含むポリソーム
がある。
そのようなポリソーム群は通常、抗体、金属キレート
等の特定の受容体に対する結合特性等を用いて、その生
物学的意義等に従って選択される。関係する核酸配列
は、これらのポリソームと依然結合する。従って、それ
を後に非常に簡単な方法で分類してもよい。もちろん、
他の通常の選択方法も同様に採用することができる。例
えば、大きな突然変異体スペクトルのこのようなスクリ
ーニングを、アイゲンの装置で行うこともできる。109
個の変異型の初期スペクトルからの単一クローンの選択
は、この装置では４サイクル以内で可能である。この選
択が精度よくかつ効率的に行われる数値範囲を、階層的
平行過程と選択の結合、及び突然変異体の大きな選択ス
ペクトルのスクリーニングの各数値例を記載した、添付
した図１に示す。蛍光検出を用いた方法が、検出方法と
して特にふさわしいことが見出された。
等の特定の受容体に対する結合特性等を用いて、その生
物学的意義等に従って選択される。関係する核酸配列
は、これらのポリソームと依然結合する。従って、それ
を後に非常に簡単な方法で分類してもよい。もちろん、
他の通常の選択方法も同様に採用することができる。例
えば、大きな突然変異体スペクトルのこのようなスクリ
ーニングを、アイゲンの装置で行うこともできる。109
個の変異型の初期スペクトルからの単一クローンの選択
は、この装置では４サイクル以内で可能である。この選
択が精度よくかつ効率的に行われる数値範囲を、階層的
平行過程と選択の結合、及び突然変異体の大きな選択ス
ペクトルのスクリーニングの各数値例を記載した、添付
した図１に示す。蛍光検出を用いた方法が、検出方法と
して特にふさわしいことが見出された。
突然変異体分布が関連特性を示す場合、階層的平行過
程により、突然変異体の大きなスペクトルのスクリーニ
ングが可能となる。109個の変異型の多重度の例では、
４回の選択サイクルの終了時には既に純粋培養の段階に
到達している。
程により、突然変異体の大きなスペクトルのスクリーニ
ングが可能となる。109個の変異型の多重度の例では、
４回の選択サイクルの終了時には既に純粋培養の段階に
到達している。
統計的可能性が高いことによるいかなる変異型の喪失
も回避するために、増幅の後に多くの突然変異体を次の
サイクルに移し、各選択変異型を約10回出現させる。
も回避するために、増幅の後に多くの突然変異体を次の
サイクルに移し、各選択変異型を約10回出現させる。
の数値に関しては、推計学的効果が作用し始めるため、
変異型の喪失が容易に起こるようになる。逆に、各変異
型について平均100個のコピーが出現すると、選択効果
を阻害し、又は変異型の数を削減することになる。
変異型の喪失が容易に起こるようになる。逆に、各変異
型について平均100個のコピーが出現すると、選択効果
を阻害し、又は変異型の数を削減することになる。
本発明の方法を実施するため、次の要求を満たすよう
に条件を選ばなければならない。
に条件を選ばなければならない。
− 外部から制御可能な生物学的機能及び選択のモニタ
ーを伴う、サイクルで行われる反応連鎖。
ーを伴う、サイクルで行われる反応連鎖。
− 再現性のある多数試料の取扱い。
− 可能であれば、組換え生物の排除。
− 領域選択的突然変異誘発による、サイクリックで、
人工的に誘導した突然変異体スペクトルの拡張。
人工的に誘導した突然変異体スペクトルの拡張。
− 最適化過程のオンライン制御。
− 大きな準種集団の統計的分布の発生のポテンシャ
ル。
ル。
− 値の景色の山の背に沿った集団の最適化、
− 多数の試料調製の階層的平行プロセシング。
これにより、本発明の方法は、現在までに公知の方法
と明確に差別化される。十分適合された土台（substruc
tures）を、ランダム化された形で与えられた突然変異
体の集合から選択する考え方は、Rechenbergにより1973
年に既に提案されている（“Evolutionsstrategie"、Pr
oblemata frommannholzboog、Stuttgart−Bad Cannstad
t）。C.TuerkとL.GoldのScience 249:505−510（1990）
も、可能性のある突然変異体の数、即ち、変異しうる位
置の数が少なく、従って全ての可能性のある変異型が優
先的に一つの混合物中に出現する場合、この手法が成功
することを実験的に示している。しかし、このことは、
例えば1012分子の集合では、可能性のある各配列が平均
10分子で表される場合には、DNA/RNAレベル上の約18個
の位置を意味する。従ってこの方策では、非常に短い領
域のみの最適化が可能である。しかし本発明では、選択
の対象は配列の長い部分を最適化すべきタンパク質であ
り、よってそれらを突然変異体分布群のように表現しな
ければならない。「優先的」分布では、信じられない程
多数の分子を扱わなければならない。これは、様々な理
由、特に釣合いがとれない程支出が大きいことから、成
功しえない。また、全ての資材的、時間的許容範囲を越
えるものでもある。
と明確に差別化される。十分適合された土台（substruc
tures）を、ランダム化された形で与えられた突然変異
体の集合から選択する考え方は、Rechenbergにより1973
年に既に提案されている（“Evolutionsstrategie"、Pr
oblemata frommannholzboog、Stuttgart−Bad Cannstad
t）。C.TuerkとL.GoldのScience 249:505−510（1990）
も、可能性のある突然変異体の数、即ち、変異しうる位
置の数が少なく、従って全ての可能性のある変異型が優
先的に一つの混合物中に出現する場合、この手法が成功
することを実験的に示している。しかし、このことは、
例えば1012分子の集合では、可能性のある各配列が平均
10分子で表される場合には、DNA/RNAレベル上の約18個
の位置を意味する。従ってこの方策では、非常に短い領
域のみの最適化が可能である。しかし本発明では、選択
の対象は配列の長い部分を最適化すべきタンパク質であ
り、よってそれらを突然変異体分布群のように表現しな
ければならない。「優先的」分布では、信じられない程
多数の分子を扱わなければならない。これは、様々な理
由、特に釣合いがとれない程支出が大きいことから、成
功しえない。また、全ての資材的、時間的許容範囲を越
えるものでもある。
また、いわゆる「連続翻訳」手法は、少なくとも現在
まで出版されている文献に記載されているように、特定
の突然変異体の選択及び評価の段階で単一コピーにまで
希釈することが必須条件であるような形では、実際的で
はない。技術的には、これらの手法では十分な数の突然
変異体を試験し、評価することができない。しかし本発
明では、比較的よく適応する突然変異体は、均一配列ス
ペクトルにも特定の野性型配列にも対応しないという自
然法則を利用した。自然はむしろ突然変異体分布及び準
種の重み付けに作用する。今までのところ、この法則
は、目標指示性開発及び選択値決定には用いられていな
い。同様の理由から、大きなハミング距離（Humming−d
istance）を有する突然変異体を含む、準種を取り囲む
値の景色には注意が払われなかった。しかし、本発明が
提案することは、最も頻繁に占有される配列及び即時環
境から更に長距離にある突然変異体の集団そのものの占
有の増加を利用することである。この目的のため、準種
分布による値の景色の占有を広げ、即ち「溶解」する。
「溶解」とは、複製エラーの許容限界の限定的な計画的
踏み越えを意味する。エラーの許容限界（即ち、非「ワ
トソン−クリック対」の取り込み割合）は、配列の長
さ、及び準種分布の選択値、即ち値のプロフィールの垂
直方向の分布により決定される。生体中では一般に低い
取り込み違いの割合が、ポリメラーゼでは高いので、本
発明では突然変異誘発圧力を人工的に増加しなければな
らなかった。
まで出版されている文献に記載されているように、特定
の突然変異体の選択及び評価の段階で単一コピーにまで
希釈することが必須条件であるような形では、実際的で
はない。技術的には、これらの手法では十分な数の突然
変異体を試験し、評価することができない。しかし本発
明では、比較的よく適応する突然変異体は、均一配列ス
ペクトルにも特定の野性型配列にも対応しないという自
然法則を利用した。自然はむしろ突然変異体分布及び準
種の重み付けに作用する。今までのところ、この法則
は、目標指示性開発及び選択値決定には用いられていな
い。同様の理由から、大きなハミング距離（Humming−d
istance）を有する突然変異体を含む、準種を取り囲む
値の景色には注意が払われなかった。しかし、本発明が
提案することは、最も頻繁に占有される配列及び即時環
境から更に長距離にある突然変異体の集団そのものの占
有の増加を利用することである。この目的のため、準種
分布による値の景色の占有を広げ、即ち「溶解」する。
「溶解」とは、複製エラーの許容限界の限定的な計画的
踏み越えを意味する。エラーの許容限界（即ち、非「ワ
トソン−クリック対」の取り込み割合）は、配列の長
さ、及び準種分布の選択値、即ち値のプロフィールの垂
直方向の分布により決定される。生体中では一般に低い
取り込み違いの割合が、ポリメラーゼでは高いので、本
発明では突然変異誘発圧力を人工的に増加しなければな
らなかった。
次に、選択システムの厳格性（stringency）を、選ん
だ突然変異誘発圧力に調整しなければならない。厳格性
は、占有プロフィールが値の景色に従うことができる程
度に十分に大きくなければならず、またSELEX手法での
ランダム等価分布とは対照的に、永久に保持されるもの
である。従って、突然変異体が大きな相対的ハミング距
離を有することにより、選択を生き残ることが可能とな
るように、条件を選ばなければならない。
だ突然変異誘発圧力に調整しなければならない。厳格性
は、占有プロフィールが値の景色に従うことができる程
度に十分に大きくなければならず、またSELEX手法での
ランダム等価分布とは対照的に、永久に保持されるもの
である。従って、突然変異体が大きな相対的ハミング距
離を有することにより、選択を生き残ることが可能とな
るように、条件を選ばなければならない。
本発明に記載の準種の概念は、いわゆる中性突然変異
体による占有密度も考慮に入れている。最も厳格な意味
において中性であるのは、周囲を等価な突然変異体で囲
まれている突然変異体のみであり、それらが全て一緒に
値の景色中の平坦部に存在することを意味する。しか
し、これは近似としてのみ真である。特定の配列の値
は、その値と、複製と弱い突然変異誘発によりこの突然
変異体のまさにその配列が発生する近接変異型の占有か
ら、共同決定される。従って本発明では、値の景色の十
分な占有密度を維持するように、突然変異誘発と増幅の
条件を選ばなければならない。従って本発明は、大きな
ハミング距離を有する変異型の創作に至る突然変異誘発
段階と、遠隔の変異型の近接部の、比較的小さなハミン
グ距離を占有するために必要な複製段階を分化してい
る。この原則を、準種分布の溶解に関する突然変異誘発
及び増幅の方策を図示した。添付図２に示した。
体による占有密度も考慮に入れている。最も厳格な意味
において中性であるのは、周囲を等価な突然変異体で囲
まれている突然変異体のみであり、それらが全て一緒に
値の景色中の平坦部に存在することを意味する。しか
し、これは近似としてのみ真である。特定の配列の値
は、その値と、複製と弱い突然変異誘発によりこの突然
変異体のまさにその配列が発生する近接変異型の占有か
ら、共同決定される。従って本発明では、値の景色の十
分な占有密度を維持するように、突然変異誘発と増幅の
条件を選ばなければならない。従って本発明は、大きな
ハミング距離を有する変異型の創作に至る突然変異誘発
段階と、遠隔の変異型の近接部の、比較的小さなハミン
グ距離を占有するために必要な複製段階を分化してい
る。この原則を、準種分布の溶解に関する突然変異誘発
及び増幅の方策を図示した。添付図２に示した。
この概要図には、先行する選択と分布の段階を乗り越
えた後の突然変異体分布からの配列の運命が記載されて
いる。突然変異誘発段階において、この配列は「突然変
異誘発パルス」中で溶解するが、これは、含有ポリメラ
ーゼの自然な取り込み違いの割合から得られる場合と比
較して、突然変異体はその初期から、より高い平均ハミ
ング距離を有するように創作されているということを意
味する。機能的選択の達成を可能にするため、本発明で
は突然変異誘発段階に続いて増幅段階がある。実験で
は、ここでの突然変異誘発圧力を、突然変異誘発段階よ
りも遙かに低く、極端な場合には、用いたポリメラーゼ
の自然な取り込み違いの割合に対応するように選んだ。
結果として、低いハミング距離を有する突然変異体のス
ペクトルは、大きく発散した変異型の各平均配列を取り
囲むように出現する。
えた後の突然変異体分布からの配列の運命が記載されて
いる。突然変異誘発段階において、この配列は「突然変
異誘発パルス」中で溶解するが、これは、含有ポリメラ
ーゼの自然な取り込み違いの割合から得られる場合と比
較して、突然変異体はその初期から、より高い平均ハミ
ング距離を有するように創作されているということを意
味する。機能的選択の達成を可能にするため、本発明で
は突然変異誘発段階に続いて増幅段階がある。実験で
は、ここでの突然変異誘発圧力を、突然変異誘発段階よ
りも遙かに低く、極端な場合には、用いたポリメラーゼ
の自然な取り込み違いの割合に対応するように選んだ。
結果として、低いハミング距離を有する突然変異体のス
ペクトルは、大きく発散した変異型の各平均配列を取り
囲むように出現する。
記載した実行過程に有用な方法は、サイクル又は交互
サイクルとして操作可能であって、かつ試料の大きな集
合のプロセシングが可能な、自動遺伝子増幅手法であ
る。この目的のため、非常に大きな準種分布の翻訳と選
択を可能にする、PCR可能システム、及び／又は、連続
翻訳システムが開発された。通常よりも遙かに大きい試
料の集合を取り扱うことができることと、適した選択シ
ステムによりそれらを評価することができることは、本
発明を現実に実際的な技術に移行するための必須条件で
ある。特定の条件の下で、他の増幅手段（例えばJ.Comp
tonの、Nature 350:1991−92（1991））を増幅と突然変
異誘発の段階に適用することも可能である。
サイクルとして操作可能であって、かつ試料の大きな集
合のプロセシングが可能な、自動遺伝子増幅手法であ
る。この目的のため、非常に大きな準種分布の翻訳と選
択を可能にする、PCR可能システム、及び／又は、連続
翻訳システムが開発された。通常よりも遙かに大きい試
料の集合を取り扱うことができることと、適した選択シ
ステムによりそれらを評価することができることは、本
発明を現実に実際的な技術に移行するための必須条件で
ある。特定の条件の下で、他の増幅手段（例えばJ.Comp
tonの、Nature 350:1991−92（1991））を増幅と突然変
異誘発の段階に適用することも可能である。
遺伝子増幅に関して説明されているフィルム技術を用
いて、103〜106の調製試料を平行して評価することがで
きる。このことは、結局１反応サイクル当たり1013〜10
16個の突然変異体の分析と選択ができることを意味す
る。
いて、103〜106の調製試料を平行して評価することがで
きる。このことは、結局１反応サイクル当たり1013〜10
16個の突然変異体の分析と選択ができることを意味す
る。
本発明では、選択圧力と突然変異誘発圧力の相互作用
により、一方でのもはや数値的には管理不可能な占有の
可能性の連続への情報の内容の溶解と、他方でのシステ
ムの凍結の間の平衡を保つこととしている。この相互作
用は、望ましい最適状態への準種の最適浮動を可能とす
るように、微調整されている。自然界で用いられている
方法を解析して、価値のある数値、即ち実験パラメータ
の選択に関する強度次数の指示を得ることはできるが、
本発明では、相互作用は、各要求のプロフィールと特定
の相互関係を有し、最適化プロフィールの方法に沿って
変化することすらあることから、各場合について微調整
をしなければならないとした。換言すれば、両パラメー
タを何度も調整しなければならない。それらは、常に広
がっている値の景色の構造、即ち峡谷、又は山の背の幅
及び山の頂上を反映している。例えば、最適化過程の後
段で突然変異誘発圧力が高すぎることにより、情報が不
可逆的に溶解喪失する危険性を制御するように、あるパ
ラメータの軽微な偏差は、続いて起こる第二のパラメー
タの調整により制御される。これは実際的には、突然変
異誘発圧力があまりに低く選ばれた場合には、選択圧力
が上昇し、突然変異誘発圧力があまりに高く選ばれた場
合には、選択圧力が下降することを意味する。
により、一方でのもはや数値的には管理不可能な占有の
可能性の連続への情報の内容の溶解と、他方でのシステ
ムの凍結の間の平衡を保つこととしている。この相互作
用は、望ましい最適状態への準種の最適浮動を可能とす
るように、微調整されている。自然界で用いられている
方法を解析して、価値のある数値、即ち実験パラメータ
の選択に関する強度次数の指示を得ることはできるが、
本発明では、相互作用は、各要求のプロフィールと特定
の相互関係を有し、最適化プロフィールの方法に沿って
変化することすらあることから、各場合について微調整
をしなければならないとした。換言すれば、両パラメー
タを何度も調整しなければならない。それらは、常に広
がっている値の景色の構造、即ち峡谷、又は山の背の幅
及び山の頂上を反映している。例えば、最適化過程の後
段で突然変異誘発圧力が高すぎることにより、情報が不
可逆的に溶解喪失する危険性を制御するように、あるパ
ラメータの軽微な偏差は、続いて起こる第二のパラメー
タの調整により制御される。これは実際的には、突然変
異誘発圧力があまりに低く選ばれた場合には、選択圧力
が上昇し、突然変異誘発圧力があまりに高く選ばれた場
合には、選択圧力が下降することを意味する。
記載したパラメータの調整に関して重要な意味のある
点は、準種分布の制御された選択を可能にする選択手段
の選び方である。これらのパラメータは集団の値の正確
な測定を可能とするはずのものであり、即ちそれらは望
ましい最適状態と密接な相互関係にあるべきである。そ
れらのS/N比は、自動多重チャンネルシステムでの平行
プロセシングにおいて明確な決定をするのに十分な高さ
でなければならない。蛍光測定法はこの目的に最適であ
る。
点は、準種分布の制御された選択を可能にする選択手段
の選び方である。これらのパラメータは集団の値の正確
な測定を可能とするはずのものであり、即ちそれらは望
ましい最適状態と密接な相互関係にあるべきである。そ
れらのS/N比は、自動多重チャンネルシステムでの平行
プロセシングにおいて明確な決定をするのに十分な高さ
でなければならない。蛍光測定法はこの目的に最適であ
る。
目的とする最適状態に直接関係しない選択圧力を除外
することが好ましい。従って、複製速度を基準から除外
すべきである場合、増幅酵素及びプライマーが豊富に提
供されなければならない。試験管内で行うタンパク質生
合成では、希コドンの使用によって起こる特定の効果を
除外すべきであろう。
することが好ましい。従って、複製速度を基準から除外
すべきである場合、増幅酵素及びプライマーが豊富に提
供されなければならない。試験管内で行うタンパク質生
合成では、希コドンの使用によって起こる特定の効果を
除外すべきであろう。
本発明では、サイクルは少なくとも一回、好ましくは
数回行われる。図３に典型的なサイクリック生成物最適
化を示した。該最適化は、例えばａ）からｋ）までの段
階からなる。ここで、最適化されるRNAによって運ばれ
る情報は、レプリカーゼ、又はPCR反応、又は均一RNA/D
NA複製過程により複製され、突然変異誘発される。この
過程では、対応するタンパク質生成物への翻訳に関し
て、例えばプライマー又は結合手段により合成的に挿入
されるプロモーター配列を、突然変異段階にさらすこと
を避けるように導入する。遺伝子型と表現型の結合につ
いては、結合特性を特異的抽出と組み合わせ、与えられ
たサイクルの選択段階の効率を上げてもよい。本発明の
必要十分条件は、突然変異体分布の階層的平行プロセシ
ングに関する画分化の方策である。
数回行われる。図３に典型的なサイクリック生成物最適
化を示した。該最適化は、例えばａ）からｋ）までの段
階からなる。ここで、最適化されるRNAによって運ばれ
る情報は、レプリカーゼ、又はPCR反応、又は均一RNA/D
NA複製過程により複製され、突然変異誘発される。この
過程では、対応するタンパク質生成物への翻訳に関し
て、例えばプライマー又は結合手段により合成的に挿入
されるプロモーター配列を、突然変異段階にさらすこと
を避けるように導入する。遺伝子型と表現型の結合につ
いては、結合特性を特異的抽出と組み合わせ、与えられ
たサイクルの選択段階の効率を上げてもよい。本発明の
必要十分条件は、突然変異体分布の階層的平行プロセシ
ングに関する画分化の方策である。
図４に、選択後の典型的な階層的平行プロセシングを
示す。該図は、サイクリック反応連鎖のセクションを示
し、本発明での階層的平行プロセシングと、それが突然
変異、増幅、及び選択の段階とどのように関係するかを
説明するものである。示した数は本発明の対象となる過
程に対応する。それにもかかわらず、それらは現実とは
著しく異なる。強度の次数におけるそれらの範囲を、各
場合において、最適化された変異型が統計的に正の選択
をされ、又は各々以下に記載した次のサイクルに到達す
る高い可能性を有するように、選ばなければならない。
示す。該図は、サイクリック反応連鎖のセクションを示
し、本発明での階層的平行プロセシングと、それが突然
変異、増幅、及び選択の段階とどのように関係するかを
説明するものである。示した数は本発明の対象となる過
程に対応する。それにもかかわらず、それらは現実とは
著しく異なる。強度の次数におけるそれらの範囲を、各
場合において、最適化された変異型が統計的に正の選択
をされ、又は各々以下に記載した次のサイクルに到達す
る高い可能性を有するように、選ばなければならない。
− 選択段階において、最適化された変異型を、粗悪な
変異型のバックグラウンドノイズと区別して認識しう
る。
変異型のバックグラウンドノイズと区別して認識しう
る。
− 増幅のレベルが、選択パラメータの測定のための信
号を十分に高くするものである。
号を十分に高くするものである。
− 各サイクル毎に、できるだけ多くの変異型をスクリ
ーニングすることができる。
ーニングすることができる。
約1,000の変異型を含む、サイクルｏからの選択され
た変異型分布からのアリコート（mo）を、特定の数（例
えば1,000）の反応画分（rc）に、各rcが約10の変異型
を含むことで各変異型を合計で約10回出現させるような
方法で、（再）分布させる。従って、変異型を喪失する
可能性は統計的に小さい。最初のサイクルからの再分布
（11,21,...1,0001）を平行して突然変異誘発にかけ、
それにより各rc当たり約103の変異型が創作されるよう
にする。次にそれらを、突然変異誘発後の103の異なる
変異型からなる、各rc当たり約1010の配列を生成する方
法で増幅する。
た変異型分布からのアリコート（mo）を、特定の数（例
えば1,000）の反応画分（rc）に、各rcが約10の変異型
を含むことで各変異型を合計で約10回出現させるような
方法で、（再）分布させる。従って、変異型を喪失する
可能性は統計的に小さい。最初のサイクルからの再分布
（11,21,...1,0001）を平行して突然変異誘発にかけ、
それにより各rc当たり約103の変異型が創作されるよう
にする。次にそれらを、突然変異誘発後の103の異なる
変異型からなる、各rc当たり約1010の配列を生成する方
法で増幅する。
本発明では、選択段階において反応調製物n1を、n1の
評価ではなく、n1から誘導された増幅突然変異体スペク
トルn1'の評価により、次のサイクルのために選択す
る。各rc当たり約103の変異型の例については、再び平
均として各n1'からの単一の変異型がサイクル２で10回
出現するように、アリコートが次のサイクルの1,000のr
cに分布すること（12,22,...1,0002）で十分である。提
案した数に基づいて、各サイクル当たり105の変異型を
スクリーニングすることができるはずである。更に多く
のrcを用いるか、又は更に鋭敏であるか、更に厳格性の
高い選択手段を適用するか、あるいは、結合の最適化に
よる選択過程等において、可能であれば抽出等により、
所望の欠損突然変異体をn1'から分離することが可能で
あれば、この数字を著しく増加することができる。
評価ではなく、n1から誘導された増幅突然変異体スペク
トルn1'の評価により、次のサイクルのために選択す
る。各rc当たり約103の変異型の例については、再び平
均として各n1'からの単一の変異型がサイクル２で10回
出現するように、アリコートが次のサイクルの1,000のr
cに分布すること（12,22,...1,0002）で十分である。提
案した数に基づいて、各サイクル当たり105の変異型を
スクリーニングすることができるはずである。更に多く
のrcを用いるか、又は更に鋭敏であるか、更に厳格性の
高い選択手段を適用するか、あるいは、結合の最適化に
よる選択過程等において、可能であれば抽出等により、
所望の欠損突然変異体をn1'から分離することが可能で
あれば、この数字を著しく増加することができる。
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ，1990年 ８月，249,
505−510
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，1988年，85，5913−5917
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/00 - 15/90
C12Q 1/68
Claims (10)
- 【請求項１】ポリメラーゼを用いる、改良した特性を有
する新規な生体高分子の製造方法であって、以下の段
階： （１）核酸配列又は準種の突然変異体分布を有する同様
の核酸配列の混合物を、遺伝子セグメントについてのエ
ラー閾値の領域内で、限定された突然変異誘発に付する
段階、 （２）それらの混合物を、同時に及び／又は連続して複
製する段階、及び （３）生成した核酸混合物を、分離により画分化する段
階 の少なくとも１サイクルを、比較されるべき一連の平行
調製において行い、ここで段階（１）〜段階（３）を１
サイクルに少なくとも１回行い、次いで核酸配列そのも
のの所定の特性、又は間接的にその翻訳生成物による所
定の特性を反映する選択システムにより選択することを
特徴とする、前記方法。 - 【請求項２】請求項１に記載の方法で、プリン及び／又
はピリミジンヌクレオチド塩基又は塩基類似体の所定の
非平衡投与、又は突然変異誘発性物質、及び／又は高エ
ネルギー照射、又は突然変異に好ましいその他の反応パ
ラメータにより、前記限定された突然変異誘発を発生さ
せることを特徴とする方法。 - 【請求項３】請求項１又は２に記載の方法において、変
数として用いる複製の信頼度を調整し、又は遺伝子セグ
メントについてのエラー閾値（調整）領域付近において
連続段階で信頼度を勾配的に変化させ、次いでさらに信
頼度の高い 複製増幅をすることにより、核酸分布を、エラー閾値の
領域内で、値の景色により所望の最適値の方向へ誘導す
ることを特徴とする方法。 - 【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載の方法にお
いて、核酸配列の異なるセグメントを、異なる突然変異
誘発圧力に暴露することを特徴とする方法。 - 【請求項５】請求項１〜４のいずれかに記載の方法にお
いて、実質上全ての新旧変異型が少なくとも一つの画分
に出現し、一方、該画分の内容物が表現型選択により分
化するように、前記画分への分離を行うことを特徴とす
る方法。 - 【請求項６】請求項５に記載の方法において、前記表現
型選択された生体高分子群に属する核酸配列を、同時に
又は後に、単独で又は混合物中で分類可能であることを
特徴とする方法。 - 【請求項７】請求項１〜６のいずれかに記載の方法にお
いて、遺伝子型と表現型とが直接結合した生成物を用い
て、核酸混合物を選択することを特徴とする方法。 - 【請求項８】請求項７に記載の方法において、翻訳生成
物とコードRNAとの両方を結合した形で含むポリソーム
上で、前記選択を行うことを特徴とする方法。 - 【請求項９】請求項１〜８のいずれかに記載の方法にお
いて、選択と突然変異とに関する条件の厳格性の変化に
より、前記選択をサイクル毎に制御することを特徴とす
る方法。 - 【請求項１０】請求項１〜９のいずれかに記載の方法に
おいて、多数の平行調製を行い、かつ評価することを特
徴とする方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4112440A DE4112440C1 (ja) | 1991-04-16 | 1991-04-16 | |
| DE4112440.5 | 1991-04-16 | ||
| PCT/EP1992/000840 WO1992018645A1 (de) | 1991-04-16 | 1992-04-14 | Verfahren zur herstellung von neuen biopolymeren |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06506355A JPH06506355A (ja) | 1994-07-21 |
| JP3504658B2 true JP3504658B2 (ja) | 2004-03-08 |
Family
ID=6429722
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50798892A Expired - Lifetime JP3504658B2 (ja) | 1991-04-16 | 1992-04-14 | 新規生体高分子の製造方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0583265B1 (ja) |
| JP (1) | JP3504658B2 (ja) |
| AT (1) | ATE171479T1 (ja) |
| DE (2) | DE4112440C1 (ja) |
| WO (1) | WO1992018645A1 (ja) |
Families Citing this family (82)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5849545A (en) * | 1992-05-11 | 1998-12-15 | Evotec Biosystems Gmbh | Substrate material for simultaneously binding genotypic and phenotypic substances |
| DE4237381C1 (de) * | 1992-11-05 | 1994-04-28 | Diagen Inst Molekularbio | Trägermaterial zur simultanen Bindung genotypischer und phänotypischer Substanzen |
| DE4343591A1 (de) * | 1993-12-21 | 1995-06-22 | Evotec Biosystems Gmbh | Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes |
| US6335160B1 (en) | 1995-02-17 | 2002-01-01 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for polypeptide engineering |
| US6117679A (en) | 1994-02-17 | 2000-09-12 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
| US6165793A (en) * | 1996-03-25 | 2000-12-26 | Maxygen, Inc. | Methods for generating polynucleotides having desired characteristics by iterative selection and recombination |
| US5605793A (en) | 1994-02-17 | 1997-02-25 | Affymax Technologies N.V. | Methods for in vitro recombination |
| US5837458A (en) | 1994-02-17 | 1998-11-17 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
| US6309883B1 (en) | 1994-02-17 | 2001-10-30 | Maxygen, Inc. | Methods and compositions for cellular and metabolic engineering |
| WO1996017056A1 (en) * | 1994-12-02 | 1996-06-06 | Institut Pasteur | Hypermutagenesis |
| EP0714980A1 (en) * | 1994-12-02 | 1996-06-05 | Institut Pasteur | Hypermutagenesis |
| US6936289B2 (en) | 1995-06-07 | 2005-08-30 | Danisco A/S | Method of improving the properties of a flour dough, a flour dough improving composition and improved food products |
| JPH1066577A (ja) * | 1996-08-07 | 1998-03-10 | Novo Nordisk As | 核酸プールおよびその製造方法 |
| US8207093B2 (en) | 1997-01-21 | 2012-06-26 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using RNA-protein fusions |
| WO1998031700A1 (en) | 1997-01-21 | 1998-07-23 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using rna-protein fusions |
| US6261804B1 (en) | 1997-01-21 | 2001-07-17 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using RNA-protein fusions |
| US6153410A (en) * | 1997-03-25 | 2000-11-28 | California Institute Of Technology | Recombination of polynucleotide sequences using random or defined primers |
| AU754377B2 (en) * | 1997-09-03 | 2002-11-14 | Merck Patent Gesellschaft Mit Beschrankter Haftung | Methods for protein screening |
| US6927025B1 (en) | 1997-09-03 | 2005-08-09 | Biovation Limited | Methods for protein screening |
| EP1003853B1 (en) * | 1997-09-03 | 2005-11-30 | Biovation Limited | Methods for protein screening |
| KR20010052894A (ko) | 1998-06-17 | 2001-06-25 | 맥시겐, 인크. | 목적하는 특성을 보유한 폴리뉴클레오티드를 생성하는 방법 |
| US6846655B1 (en) | 1998-06-29 | 2005-01-25 | Phylos, Inc. | Methods for generating highly diverse libraries |
| ES2188190T5 (es) | 1998-07-21 | 2007-11-16 | Danisco A/S | Producto alimentario. |
| AU757955B2 (en) | 1998-08-17 | 2003-03-13 | Bristol-Myers Squibb Company | Identification of compound-protein interactions using libraries of protein-nucleic acid fusion molecules |
| DE19953854C2 (de) | 1999-11-09 | 2002-01-17 | Max Planck Gesellschaft | Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren mit veränderten Eigenschaften |
| US7022479B2 (en) | 2000-01-24 | 2006-04-04 | Compound Therapeutics, Inc. | Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis |
| JP2003520050A (ja) | 2000-01-24 | 2003-07-02 | フィロス インク． | タンパク質分析のための高感度多重化診断アッセイ法 |
| US6958213B2 (en) | 2000-12-12 | 2005-10-25 | Alligator Bioscience Ab | Method for in vitro molecular evolution of protein function |
| US20020086292A1 (en) | 2000-12-22 | 2002-07-04 | Shigeaki Harayama | Synthesis of hybrid polynucleotide molecules using single-stranded polynucleotide molecules |
| AU2002314712C1 (en) | 2001-02-02 | 2008-10-02 | Novici Biotech Llc | A method of increasing complementarity in a heteroduplex polynucleotide |
| US7582423B2 (en) | 2001-02-02 | 2009-09-01 | Novici Biotech Llc | Population of polynucleotide sequence variants |
| US7838219B2 (en) | 2001-02-02 | 2010-11-23 | Novici Biotech Llc | Method of increasing complementarity in a heteroduplex |
| MXPA03010511A (es) | 2001-05-18 | 2004-03-02 | Danisco | Metodo para preparar una masa con una enzima. |
| EP1840211A1 (en) | 2001-10-31 | 2007-10-03 | Danisco A/S | Pyranosone dehydratase from phanerochaete chrysosporium |
| US7078211B2 (en) | 2002-02-01 | 2006-07-18 | Large Scale Biology Corporation | Nucleic acid molecules encoding endonucleases and methods of use thereof |
| CN1668274B (zh) * | 2002-07-17 | 2010-06-16 | 荷兰联合利华有限公司 | 包含支链醇的羧烷基化物和/或其烷氧基化物的皮肤护理美容组合物 |
| US20050196766A1 (en) | 2003-12-24 | 2005-09-08 | Soe Jorn B. | Proteins |
| BR122016015076B1 (pt) | 2003-01-17 | 2017-05-16 | Dupont Nutrition Biosci Aps | método de produção de um éster de carboidrato e uso de uma enzima lipídio aciltransferase para produzir um éster de carboidrato |
| MXPA05007653A (es) | 2003-01-17 | 2005-09-30 | Danisco | Metodo. |
| US7955814B2 (en) | 2003-01-17 | 2011-06-07 | Danisco A/S | Method |
| US7335504B2 (en) | 2003-06-18 | 2008-02-26 | Direvo Biotechnology Ag | Engineered enzymes and uses thereof |
| GB0716126D0 (en) | 2007-08-17 | 2007-09-26 | Danisco | Process |
| EP2119771B1 (en) | 2003-12-24 | 2018-08-22 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Proteins |
| US7718408B2 (en) | 2003-12-24 | 2010-05-18 | Danisco A/S | Method |
| GB0405637D0 (en) | 2004-03-12 | 2004-04-21 | Danisco | Protein |
| PL1791933T3 (pl) | 2004-07-16 | 2011-12-30 | Dupont Nutrition Biosci Aps | Sposób enzymatycznego odgumowania oleju |
| GB0421598D0 (en) | 2004-09-29 | 2004-10-27 | Cambridge Advanced Tech | Modification of plant development and morphology |
| GB0422052D0 (en) | 2004-10-04 | 2004-11-03 | Dansico As | Enzymes |
| GB0423139D0 (en) | 2004-10-18 | 2004-11-17 | Danisco | Enzymes |
| CN101611141B (zh) | 2006-12-14 | 2014-05-07 | 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 | R-hnl随机变体及其用于制备光学纯的空间位阻氰醇的用途 |
| MX2009008021A (es) | 2007-01-25 | 2009-08-07 | Danisco | Produccion de una aciltransferasa de lipido de celulas de bacillus licheniformis transformadas. |
| US20080220498A1 (en) | 2007-03-06 | 2008-09-11 | Cervin Marguerite A | Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties |
| US8143046B2 (en) | 2007-02-07 | 2012-03-27 | Danisco Us Inc., Genencor Division | Variant Buttiauxella sp. phytases having altered properties |
| WO2008150376A1 (en) | 2007-05-21 | 2008-12-11 | Danisco Us, Inc., Genencor Division | Use of an aspartic protease (nsp24) signal sequence for heterologous protein expression |
| DK3118309T3 (da) | 2008-04-18 | 2020-12-14 | Danisco Us Inc | Buttiauxella sp. phytasevarianter |
| WO2009133464A2 (en) | 2008-04-30 | 2009-11-05 | Danisco A/S | Oxidation process |
| GB0908770D0 (en) | 2009-04-24 | 2009-07-01 | Danisco | Method |
| CA2761767A1 (en) | 2009-05-19 | 2010-11-25 | Danisco A/S | Use of amylase and lipolytic enzyme in bread |
| AR077042A1 (es) | 2009-06-12 | 2011-07-27 | Danisco | Metodo para tratar una composicion que contiene pirofiofitina |
| GB0920089D0 (en) | 2009-11-17 | 2009-12-30 | Danisco | Method |
| BR112012017292B1 (pt) | 2010-01-13 | 2021-05-18 | Basf Se | variante de mananase, molécula de ácido nucleico, método para a preparação da mananase modificada, composição e uso da mananase modificada |
| US20130059036A1 (en) | 2010-03-12 | 2013-03-07 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Process |
| WO2011114251A1 (en) | 2010-03-18 | 2011-09-22 | Danisco A/S | Foodstuff |
| CA2798152A1 (en) | 2010-06-17 | 2011-12-22 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Process |
| GB201011513D0 (en) | 2010-07-08 | 2010-08-25 | Danisco | Method |
| WO2012114232A1 (en) | 2011-02-23 | 2012-08-30 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Process |
| DK2678438T3 (en) | 2011-02-23 | 2017-10-02 | Dupont Nutrition Biosci Aps | ENZYME TREATMENT OF CHLOROPHYL IN PLANT OILS |
| AR085253A1 (es) | 2011-02-23 | 2013-09-18 | Danisco | Metodo para producir una clorofilasa |
| EP2694537A1 (en) | 2011-04-08 | 2014-02-12 | Danisco US Inc. | Compositions |
| EP2691530B1 (en) | 2011-06-10 | 2018-03-07 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| WO2013104659A2 (en) | 2012-01-13 | 2013-07-18 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Process |
| WO2013104660A1 (en) | 2012-01-13 | 2013-07-18 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Process for treating a plant oil comprising hydrolysing chlorophyll or a chlorophyll derivative and involving partial caustic neutralisation |
| WO2013160372A1 (en) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Process for treating plant oil involving addition of serial doses of chlorophyll or chlorophyll derivative degrading enzyme |
| WO2013160374A1 (en) | 2012-04-27 | 2013-10-31 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Process for refining crude plant oil involving enzymatic hydrolysis and gum recycling |
| US10226744B2 (en) | 2012-10-19 | 2019-03-12 | Danisco Us Inc | Stabilization of biomimetic membranes |
| US9982229B2 (en) | 2013-12-19 | 2018-05-29 | Danisco Us Inc. | Use of hydrophobins to increase gas transfer in aerobic fermentation processes |
| EP3126509A1 (en) | 2014-04-01 | 2017-02-08 | DuPont Nutrition Biosciences ApS | Method for increasing crude palm oil yields |
| WO2016062855A1 (en) | 2014-10-24 | 2016-04-28 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Proline tolerant tripeptidyl peptidases and uses thereof |
| CN107075534A (zh) | 2014-10-24 | 2017-08-18 | 丹尼斯科美国公司 | 使用三肽基肽酶制备醇的方法 |
| WO2016210395A1 (en) | 2015-06-26 | 2016-12-29 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Aminopeptidases for protein hydrlyzates |
| BR112018015589A2 (pt) | 2016-02-25 | 2019-10-01 | Dupont Nutrition Biosci Aps | método para produzir hidrolisado de proteína que emprega uma tripeptidil peptidase de aspergillus fumigatus |
| DE102023001827A1 (de) | 2023-04-19 | 2024-10-24 | Horst Wochnowski | Verfahren und dazugehörige Vorrichtung zum Züchten von in Gewässern Mikroplastik zersetzenden und abbauenden Mikroorganismenstämme durch einen künstlich herbeigeführten und beschleunigten Evolutions- und Selektionsprozess |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0285123A3 (en) * | 1987-04-03 | 1989-02-01 | Stabra AG | A method for complete mutagenesis of nucleic acids |
| WO1991005058A1 (en) * | 1989-10-05 | 1991-04-18 | Glenn Kawasaki | Cell-free synthesis and isolation of novel genes and polypeptides |
| AU8498091A (en) * | 1990-08-02 | 1992-03-02 | Regents Of The University Of Colorado, The | Systematic polypeptide evolution by reverse translation |
-
1991
- 1991-04-16 DE DE4112440A patent/DE4112440C1/de not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-04-14 JP JP50798892A patent/JP3504658B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-14 EP EP92908537A patent/EP0583265B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-14 DE DE59209506T patent/DE59209506D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-04-14 AT AT92908537T patent/ATE171479T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-04-14 WO PCT/EP1992/000840 patent/WO1992018645A1/de active IP Right Grant
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８年，８５，５９１３−５９１７ |
| Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０年 ８月，２４９，５０５−５１０ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE4112440C1 (ja) | 1992-10-22 |
| DE59209506D1 (de) | 1998-10-29 |
| ATE171479T1 (de) | 1998-10-15 |
| WO1992018645A1 (de) | 1992-10-29 |
| JPH06506355A (ja) | 1994-07-21 |
| EP0583265B1 (de) | 1998-09-23 |
| EP0583265A1 (de) | 1994-02-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3504658B2 (ja) | 新規生体高分子の製造方法 | |
| US5795747A (en) | Process for manufacturing new biopolymers | |
| Tsimring | Noise in biology | |
| JP2021010384A (ja) | Ｈｔｐゲノム操作プラットフォームによる微生物株の改良 | |
| Chen et al. | Single‐cell sequencing methodologies: from transcriptome to multi‐dimensional measurement | |
| AU2775402A (en) | Nucleic acid ligands to complex targets | |
| US7435542B2 (en) | Exhaustive selection of RNA aptamers against complex targets | |
| CA2278585A1 (en) | A method for in vitro molecular evolution of protein function | |
| CN106701995B (zh) | 通过单细胞转录组测序进行细胞质量控制的方法 | |
| Schulman et al. | Recent excitement in understanding transfer RNA identity | |
| WO2003010311A2 (en) | Process for preparing variant polynucleotides | |
| WO2004101788A3 (en) | Small interfering rna libraries and methods of synthesis and use | |
| EP3998338B1 (en) | Method for amplifying nucleic acid using solid-phase carrier | |
| TAKITA et al. | Applications of the long and accurate polymerase chain reaction method in yeast molecular biology: direct sequencing of the amplified DNA and its introduction into yeast | |
| JP2011517957A (ja) | ４段階連続的ｐｃｒ、４段階ブロックｐｃｒ、または遺伝子合成方法を用いた菌株特異的バーコードを含む遺伝子標的化ヘテロ接合分裂酵母菌株の製造方法 | |
| Cleary | Uncovering cell type‐specific complexities of gene expression and RNA metabolism by TU‐tagging and EC‐tagging | |
| WO2023154533A3 (en) | Combinatorial dna assembly for multispecific antibodies | |
| GB2617285A (en) | Multiparametric discovery and optimization platform | |
| AU1477299A (en) | Selective technique for rapid identification of proteins and genes and uses thereof | |
| CN114875118A (zh) | 确定细胞谱系的方法、试剂盒和装置 | |
| CN111411108A (zh) | 月季童期类型snp分子标记及其应用 | |
| CN113195716A (zh) | 核酸文库、肽文库及它们的用途 | |
| Chaparro-Riggers et al. | Revealing biases inherent in recombination protocols | |
| CN117051130B (zh) | 一种与卵形鲳鲹鱼抗无乳链球菌性状关联的snp分子标记及其应用 | |
| Schmidlin et al. | Distinguishing mutants that resist drugs via different mechanisms by examining fitness tradeoffs |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20031211 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071219 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081219 Year of fee payment: 5 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081219 Year of fee payment: 5 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081219 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091219 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101219 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101219 Year of fee payment: 7 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313111 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101219 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111219 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121219 Year of fee payment: 9 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121219 Year of fee payment: 9 |