JP3491695B2 - Method for producing N-acylneuraminic acid aldolase - Google Patents
Method for producing N-acylneuraminic acid aldolaseInfo
- Publication number
- JP3491695B2 JP3491695B2 JP25690393A JP25690393A JP3491695B2 JP 3491695 B2 JP3491695 B2 JP 3491695B2 JP 25690393 A JP25690393 A JP 25690393A JP 25690393 A JP25690393 A JP 25690393A JP 3491695 B2 JP3491695 B2 JP 3491695B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nal
- serratia
- dna
- leu
- producing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【0001】[0001]
【産業上の利用分野】本発明はN−アシルノイラミン酸
アルドラーゼ(以下、NALと略称する)産生遺伝情報
を担うDNAを組込んだベクターを導入したエシェリヒ
ア(Escherichia) 属以外のグラム陰性菌に属する微生物
および該微生物を用いた新規なNALの製造法に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a microorganism belonging to a Gram-negative bacterium other than the genus Escherichia, into which a vector incorporating a DNA carrying genetic information for producing N-acylneuraminic acid aldolase (hereinafter abbreviated as NAL) has been introduced. And a novel method for producing NAL using the microorganism.
【0002】[0002]
【従来の技術】N−アシルノイラミン酸アルドラーゼ
(NAL)は、国際生化学連合酵素委員会の酵素番号E.
C.4.1.3.3.に分類され、系統名ではN−アシルノイラミ
ン酸:ピルビン酸リアーゼと呼称される酵素である。こ
の酵素はシアル酸(N−アシルノイラミン酸)をN−ア
シルマンノサミンとピルビン酸に分解する酵素であり、
腫瘍の診断のためのシアル酸含量変化測定に用いられる
酵素である。またこの酵素は動物組織およびガス壊疽菌
(Clostridium perfringens) 、コレラ菌(Vibrochlolera
e)、大腸菌(Escherichia coli)等の微生物に存在するこ
とが知られている。さらに微生物においては培地中にN
−アシルノイラミン酸を存在させるとその生産能が飛躍
的に上昇することが報告されている(特公昭56-54153号
公報)が、このN−アシルノイラミン酸は非常に高価な
ものであり、工業的な規模で用いることは困難であっ
た。そこで近年、遺伝子組換え技術を応用し、NAL遺
伝情報を担うDNAを組込んだベクターを導入したエシ
ェリヒア属細菌を培養することにより、高価なN−アシ
ルノイラミン酸を培地に添加することなく、NALが生
産できることが知られている(特開昭 61-1384号公報、
特開昭61-81786号公報、特開昭62-277号公報など)。し
かしながらこれら公知の方法では、NALを工業的に製
造するにはその生産性が充分ではなかった。更にエシェ
リヒア属細菌由来のNAL遺伝情報を担うDNAを組み
込んだベクターを導入したエシェリヒア属細菌を培養す
るため、元来エシェリヒア属細菌が生産しているカタラ
ーゼやATPaseなどの酵素の除去に関しては、基本
的に遺伝子組換え技術を応用していない野生株からのN
ALの精製と同じく、多大な労力が必要であった。2. Description of the Related Art N-acylneuraminic acid aldolase (NAL) is an enzyme number E.
It is an enzyme that is classified as C.4.1.3.3. And is called N-acylneuraminic acid: pyruvate lyase in the systematic name. This enzyme is an enzyme that decomposes sialic acid (N-acylneuraminic acid) into N-acylmannosamine and pyruvate,
It is an enzyme used for measuring changes in sialic acid content for tumor diagnosis. This enzyme is also used in animal tissues and gas gangrene
(Clostridium perfringens), Vibrio cholerae
It is known to exist in microorganisms such as e) and Escherichia coli. Furthermore, in the case of microorganisms, N
-It has been reported that the presence of acylneuraminic acid dramatically increases its productivity (Japanese Patent Publication No. 56-54153), but this N-acylneuraminic acid is very expensive and is industrially used. It was difficult to use on a scale. Therefore, in recent years, by applying gene recombination technology and culturing Escherichia bacteria into which a vector incorporating a DNA carrying NAL genetic information has been introduced, NAL can be obtained without adding expensive N-acylneuraminic acid to the medium. It is known that it can be produced (JP-A-61-1384,
JP-A-61-81786, JP-A-62-277, etc.). However, with these known methods, the productivity was not sufficient for industrially producing NAL. Furthermore, in order to culture Escherichia bacteria into which a vector incorporating a DNA carrying NAL genetic information derived from Escherichia bacteria has been introduced, it is basically necessary to remove enzymes such as catalase and ATPase originally produced by Escherichia bacteria. N from a wild strain that does not apply the gene recombination technology to
As with the purification of AL, much labor was required.
【0003】[0003]
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、より
簡便な手法で、NALを使用する時、問題となる上記酵
素が混在することなく、純粋な形で安価にNALを大量
供給しうる手段を提供することにある。The object of the present invention is to provide a large amount of NAL in a pure form at a low cost in a simpler method without using the above-mentioned enzyme which is a problem when NAL is used. To provide the means.
【0004】[0004]
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記目的を
達成するため、NAL遺伝情報を担うDNAを種々のベ
クターに組込み、この組換えプラスミドを用いて各種グ
ラム陰性菌に属する微生物を形質転換した。その結果、
ある種の形質転換体が、誘導物質の添加なしに著量のN
ALを生産することを見いだした。更に本発明者らは、
NAL生産宿主としてエシェリヒア属細菌より低温で生
育するグラム陰性菌に属する微生物を用いた場合、NA
Lの精製において加温処理のみで宿主微生物由来のタン
パク質がほとんど除去できることを見い出し、より簡便
な手法でNALの精製を可能にした。[Means for Solving the Problems] In order to achieve the above-mentioned object, the present inventors have incorporated DNA carrying NAL genetic information into various vectors and used this recombinant plasmid to transform microorganisms belonging to various Gram-negative bacteria. Converted. as a result,
Some transformants showed significant N 2 addition without inducer.
I have found that it produces AL. Furthermore, the present inventors
When a microorganism belonging to a Gram-negative bacterium that grows at a lower temperature than an Escherichia bacterium is used as a NAL production host, NA
In the purification of L, it was found that most of the proteins derived from the host microorganism can be removed only by heating treatment, and it was possible to purify NAL by a simpler method.
【0005】すなわち本発明はエシェリヒア属細菌由来
のN−アシルノイラミン酸アルドラーゼ産生遺伝情報を
担うDNAをベクターに組込んだ組換えプラスミドを導
入したエシェリヒア属細菌以外のグラム陰性菌に属する
微生物である。That is, the present invention is a microorganism belonging to a Gram-negative bacterium other than Escherichia bacteria into which a recombinant plasmid in which a DNA carrying the genetic information for producing N-acylneuraminic acid aldolase derived from Escherichia bacteria is incorporated is introduced.
【0006】また本発明はエシェリヒア属細菌由来のN
−アシルノイラミン酸アルドラーゼ産生遺伝情報を担う
DNAをベクターに組込んだプラスミドを導入したエシ
ェリヒア属以外のグラム陰性菌に属する微生物を培地中
に培養し、培養物中にN−アシルノイラミン酸アルドラ
ーゼを産生せしめ、該培養物からN−アシルノイラミン
酸アルドラーゼを採取することを特徴とするN−アシル
ノイラミン酸アルドラーゼの製造法である。The present invention also relates to N derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia.
-Acyl neuraminate aldolase producing microorganisms belonging to Gram-negative bacteria other than Escherichia genus introduced with a plasmid incorporating DNA carrying genetic information into a vector are cultured in a medium to produce N-acyl neuraminate aldolase in the culture, A method for producing N-acylneuraminic acid aldolase, which comprises collecting N-acylneuraminic acid aldolase from the culture.
【0007】本発明におけるNALの遺伝情報を担うD
NAは、エシェリヒア属細菌由来のDNAであれば良
く、ゲノムDNAから調製してもよく、また合成するこ
ともできる。上記DNA配列としては例えば、Agri.Bio
l.Chem.,50(8),2155〜2158,1986 に記載された塩基配列
(配列表・配列番号1)を有するDNAを挙げることが
できる。なお、本発明におけるDNAは遺伝子組換え技
術により、基本となるDNAの特定部位に該DNAがコ
ードするNALの基本的な特性を変化させることなく、
或いはその特性を改善するように人為的に変異、例えば
置換、削除、挿入など起こさせたものも含むものであ
る。D that carries the genetic information of NAL in the present invention
NA may be DNA derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia, may be prepared from genomic DNA, or may be synthesized. Examples of the above DNA sequence include Agri.Bio.
DNA having the nucleotide sequence (Sequence ID No. 1) described in I. Chem., 50 (8), 2155 to 2158, 1986 can be mentioned. It should be noted that the DNA of the present invention can be produced by gene recombination technology without changing the basic characteristics of NAL encoded by the DNA at a specific site of the basic DNA.
Alternatively, it also includes those artificially mutated so as to improve its characteristics, for example, those caused by substitution, deletion, insertion and the like.
【0008】また本発明におけるベクターとしては、宿
主微生物で自律的に増殖しうるものであれば良く、遺伝
子組換え用として構築されたものが適している。例え
ば、pBR322, pUC19, Bluescript, pKT230, pTS1137など
が使用できる。pTS1137 は広域宿主ベクターR1b679A よ
り、INOUYEらの方法(J.Bacteriol.,166(3),739〜745(9
86) により構築することができる。図3にR1b679A から
pTS1137 への構築を示す。これらベクターに先に述べた
NALの遺伝情報を担うDNAを組込み、組換えプラス
ミドを作成することができる。組換えプラスミドとして
は、pNAL11、pNAL51、pNAL71などが
挙げられる。The vector in the present invention may be any vector as long as it can grow autonomously in a host microorganism, and a vector constructed for gene recombination is suitable. For example, pBR322, pUC19, Bluescript, pKT230, pTS1137, etc. can be used. pTS1137 was derived from the broad host vector R1b679A by the method of INOUYE et al. (J. Bacteriol., 166 (3), 739-745 (9
86). From R1b679A in Figure 3
The construction to pTS1137 is shown. A recombinant plasmid can be prepared by incorporating the above-mentioned DNA carrying the genetic information of NAL into these vectors. Examples of the recombinant plasmid include pNAL11, pNAL51, pNAL71 and the like.
【0009】宿主微生物としては、エシェリヒア属細菌
以外のグラム陰性菌に属する微生物であり、組換えプラ
スミドが安定、且つ自律的に増殖可能で、且つ外来性D
NAの形質が発現できるものであれば良く、例えばシュ
ードモナス(Pseudomonas)属、セラチア(Serratia)属に
属する微生物が挙げられる。さらに好ましくはエシェリ
ヒア属細菌より低温で生育するグラム陰性菌に属する微
生物、例えばシュードモナス・プチダ(Pseudomonas put
ida)、セラチア・リクイファシエンス(Serratia liquef
aciens) 、セラチア・プリムチカ(Serratia plymuthic
a) などが挙げられる。[0009] The host microorganism is a microorganism belonging to Gram-negative bacteria other than Escherichia bacteria, the recombinant plasmid is stable and can autonomously grow, and the foreign D
Any microorganism can be used as long as it can express the trait of NA, and examples thereof include microorganisms belonging to the genus Pseudomonas and the genus Serratia. More preferably, microorganisms belonging to Gram-negative bacteria that grow at a lower temperature than Escherichia bacteria, for example, Pseudomonas putida
ida), Serratia liquef
aciens), Serratia plymuthic
a) and so on.
【0010】宿主微生物に組換えプラスミドを導入する
方法としては、コンピテントセル法、プロトプラスト
法、エレクトロポレーション法などいずれの手法を用い
ても良い。このようにして得られた形質転換体である微
生物は、栄養培地で培養されることにより、多量のNA
Lを安定して生産する。宿主微生物への目的組換えプラ
スミド導入の有無についての選択は、目的とするDNA
を保持するベクターの薬剤耐性マーカーとNALとを同
時に発現し得る微生物を検索すれば良く、例えば薬剤耐
性マーカーに基づく選択培地で生育し、且つNALを生
成する微生物を選択すれば良い。As a method for introducing the recombinant plasmid into the host microorganism, any method such as the competent cell method, the protoplast method, and the electroporation method may be used. The thus obtained transformant microorganism is cultured in a nutrient medium to produce a large amount of NA.
Stable production of L. Whether or not the target recombinant plasmid is introduced into the host microorganism is selected by selecting the target DNA.
Microorganisms capable of simultaneously expressing the drug resistance marker and NAL of the vector holding the vector may be searched. For example, a microorganism that grows in a selective medium based on the drug resistance marker and produces NAL may be selected.
【0011】形質転換体である宿主微生物の培養は宿主
の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良
く、通常多くの場合は液体培養で行なうが、工業的には
通気撹拌培養を行なうのが有利である。培地の栄養源と
しては微生物の培養に通常用いられるものが広く使用さ
れ得る。炭素源としては資化可能な炭素化合物であれば
良く、例えばグルコ−ス、シュクロース、ラクトース、
マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン酸などが使
用される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれ
ば良く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼ
イン加水分解物、大豆粕アルカリ抽出物などが使用され
る。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウ
ム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの
塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応
じて使用される。Cultivation of a host microorganism which is a transformant may be carried out by selecting the culture conditions in consideration of the nutritional physiological properties of the host. Usually, in most cases, liquid culture is carried out, but industrially, aeration and agitation culture is carried out. It is advantageous to do so. As the nutrient source of the medium, those usually used for culturing microorganisms can be widely used. The carbon source may be any assimilable carbon compound, for example, glucose, sucrose, lactose,
Maltose, fructose, molasses, pyruvic acid, etc. are used. Any available nitrogen compound may be used as the nitrogen source, and for example, peptone, meat extract, yeast extract, casein hydrolyzate, soybean meal alkali extract, etc. are used. In addition, salts such as phosphates, carbonates, sulfates, magnesium, calcium, potassium, iron, manganese and zinc, specific amino acids, specific vitamins and the like are used as necessary.
【0012】培養温度は菌が発育し、NALを生産する
範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア属細菌より低温
で生育する宿主微生物、例えばシュードモナス・プチ
ダ、セラチア・リクイファシエンス、セラチア・プリム
チカなどを用いる場合は、好ましくは20〜30℃程度であ
る。培養時間は条件によって多少異なるが、NALが最
高収量に達する時期を見計らって適当時期に培養を終了
すれば良く、通常は12〜72時間程度ある。培地pHは菌が
発育し、NALを生産する範囲で適宜変更し得るが、特
に好ましくはpH6.0 〜8.0 程度である。The culturing temperature can be appropriately changed within the range in which the bacterium grows and produces NAL, but host microorganisms that grow at a lower temperature than Escherichia bacteria, such as Pseudomonas putida, Serratia liquifaciens, Serratia primuchica, etc. When using, it is preferably about 20 to 30 ° C. Although the culturing time varies slightly depending on the conditions, it is sufficient to finish the culturing at an appropriate time in consideration of the time when the maximum yield of NAL is reached, and it is usually about 12 to 72 hours. The pH of the medium can be appropriately changed within the range in which the bacteria grow and produce NAL, but it is particularly preferably about pH 6.0 to 8.0.
【0013】培養物中のNALを生産する菌体を含む培
養液をそのまま採取し利用することもできるが、一般に
は常法に従ってNALが培養液中に存在する場合は濾
過、遠心分離などにより、NAL含有溶液と微生物菌体
とを分離した後に利用される。NALが菌体内に存在す
る場合には、得られた培養物を濾過または遠心分離など
の手段により菌体を採取し、次いでこの菌体を機会的方
法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必
要に応じてEDTA等のキレート剤及びまたは界面活性剤を
添加してNALを可溶化し、水溶液として分離採取す
る。[0013] A culture solution containing NAL-producing cells in the culture can be directly collected and used. However, in general, when NAL is present in the culture solution, it may be filtered, centrifuged, or the like. It is used after separating the NAL-containing solution and the microbial cells. When NAL is present in the microbial cells, the obtained culture is harvested by means such as filtration or centrifugation, and then the microbial cells are destroyed by an opportunistic method or an enzymatic method such as lysozyme, If necessary, a chelating agent such as EDTA and / or a surfactant is added to solubilize NAL, and the NAL is separated and collected as an aqueous solution.
【0014】このようにして得られたNAL含有溶液を
例えば減圧濃縮、膜濃縮、更に硫酸アンモニウム、硫酸
ナトリウムなどの塩析処理、或は親水性有機溶媒、例え
ばメタノール、エタノール、アセトンなどによる分別沈
澱法により沈澱せしめれば良い。また加温処理や等電点
処理も有効な精製手段である。特にエシェリヒア属より
低温で生育するグラム陰性菌に属する微生物、例えばシ
ュードモナス・プチダ、セラチア・リクイファシエン
ス、セラチア・プロムチカなどを宿主微生物に用いた場
合は加温処理により、ほとんどの宿主微生物由来のタン
パク質が除去可能である。The NAL-containing solution thus obtained is concentrated under reduced pressure, membrane concentrated, salted out with ammonium sulfate, sodium sulfate or the like, or fractionated by a hydrophilic organic solvent such as methanol, ethanol or acetone. It should be made to precipitate by. Further, heating treatment and isoelectric point treatment are also effective refining means. In particular, when microorganisms belonging to Gram-negative bacteria that grow at a lower temperature than Escherichia, such as Pseudomonas putida, Serratia liquifaciens, Serratia promtica, etc. are used as host microorganisms, most of the host microorganism-derived substances are heated. The protein can be removed.
【0015】更に吸着剤、或はゲル濾過剤などによるゲ
ル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマト
グラフィー、アフィニテークロマトグラフィーにより、
精製されたNALを得ることが出来る。Further, by gel filtration using an adsorbent or a gel filtration agent, adsorption chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography,
A purified NAL can be obtained.
【0016】[0016]
【実施例】以下、本発明を実施例により具体的に説明す
る。実施例中、NALの活性測定は以下のように行なっ
た。すなわち、 50mM リン酸緩衝液(pH7.5) 、 20mM N
−アセチルノイラミン酸、0.2mM NADH、 10U/ml ラ
クテートデヒドロゲナーゼ中、酵素を37℃で反応させ、
酵素反応により生成するピルビン酸にラクテートデヒド
ロゲナーゼを作用させて、340nm におけるNADHの減
少量を記録した。その初期直線部分より△OD/minを計算
し、これよりNAL活性を計算した。NAL1 単位は、
この条件下で1 分間当り、1 μmol のNADHを酸化す
る酵素量とした。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples. In the examples, NAL activity was measured as follows. That is, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), 20 mM N
Reacting the enzyme at 37 ° C. in acetylneuraminic acid, 0.2 mM NADH, 10 U / ml lactate dehydrogenase,
Lactate dehydrogenase was allowed to act on pyruvate generated by the enzymatic reaction, and the amount of decrease in NADH at 340 nm was recorded. ΔOD / min was calculated from the initial linear portion, and NAL activity was calculated from this. NAL1 unit is
The amount of enzyme that oxidizes 1 μmol of NADH per minute under these conditions was defined as the amount of enzyme.
【0017】実施例 1 シュードモナス属細菌での
NALの生産
(1) 組換えプラスミドの調製
Agric. Biol. Chem., 50(8), 2155 〜2158 (1986) の記
載に従い、エシェリヒア・コリーJE1011より染色体DN
Aを抽出し、NAL遺伝子を分離した。即ちエシェリヒ
ア・コリーJE1011(FERM P-13898)をLB培地(1%ポリペ
プトン、0.5%酵母エキス、1%塩化ナトリウム、pH7.4) 1
00mlに接種し、37℃で 8時間振盪培養して培養液を得
た。この培養液を12,000rpm 、10分間遠心分離して湿菌
体約 1g を得た後、該菌体からRecombinant DNA Techni
ques (Rodriguez R.L. et al., Addison-Wesley Publin
shing Company, 1983)記載の方法により染色体DNAを
約1.5mg 調製した。次にこの染色体DNA10μg を制限
酵素、HindIII (東洋紡製)と EcoRI (東洋紡製) それぞ
れ50単位で37℃、16時間反応させて切断した。切断後、
アガロース電気泳動により分子量分画し、DNA精製キ
ット、GENCLEANII(フナコシ製) によりアガロースゲル
から約1.3kb 付近のDNA断片を精製した。一方ベクタ
ーとして用いるブルースクリプトBluescript KS (Stara
tagene製)0.5μgを制限酵素Hind IIIとEcoRI10ユニッ
トで37℃、1時間反応させ、完全に切断した後、T4-DNA
リガーゼ(東洋紡製)1ユニットで16℃、12時間反応さ
せ、上記アガロースゲルから精製した1.3Kb 付近のHind
III−EcoRI断片と連結した。Example 1 Production of NAL in Pseudomonas Bacteria (1) Preparation of Recombinant Plasmid Chromosomes from Escherichia coli JE1011 as described in Agric. Biol. Chem., 50 (8), 2155-2158 (1986). DN
A was extracted and the NAL gene was isolated. That is, Escherichia coli JE1011 (FERM P-13898) was added to LB medium (1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1% sodium chloride, pH 7.4) 1
00 ml was inoculated and cultured at 37 ° C. for 8 hours with shaking to obtain a culture solution. This culture solution was centrifuged at 12,000 rpm for 10 minutes to obtain about 1 g of wet cells, and then the recombinant cells were recombined from the cells.
ques (Rodriguez RL et al., Addison-Wesley Publin
About 1.5 mg of chromosomal DNA was prepared by the method described in shing Company, 1983). Next, 10 μg of this chromosomal DNA was cleaved by reacting 50 units of each of restriction enzymes HindIII (manufactured by Toyobo) and EcoRI (manufactured by Toyobo) at 37 ° C. for 16 hours. After cutting
The molecular weight was fractionated by agarose electrophoresis, and a DNA fragment of about 1.3 kb was purified from an agarose gel using a DNA purification kit, GENCLEAN II (Funakoshi). On the other hand, Bluescript KS (Stara
0.5 μg (made by tagene) was reacted with restriction enzyme Hind III and EcoRI10 unit at 37 ° C for 1 hour and completely cleaved, and then T4-DNA
Hind around 1.3 Kb purified from the above agarose gel by reacting with 1 unit of ligase (Toyobo) at 16 ℃ for 12 hours.
Ligated with the III-EcoRI fragment.
【0018】連結したDNAはエシェリヒア・コリー(E
scherichia coli)HB101のコンピテントセルを用い
て形質転換した。得られたコロニーはアンピシリン50μ
g/mlを含むLB寒天培地で選択し、アンピシリン耐性を
示し、NAL活性が発現しているコロニーを得た。この
保有するプラスミドには1.3kb の挿入DNA断片が存在
しており、このプラスミドをpNAL11とした。図1
にpNAL11の構築について記載した。The ligated DNA is Escherichia coli (E
Transformation was performed using competent cells of scherichia coli) HB101. The obtained colony is ampicillin 50μ
Selection was performed on an LB agar medium containing g / ml to obtain a colony showing ampicillin resistance and expressing NAL activity. A 1.3 kb inserted DNA fragment was present in this plasmid, and this plasmid was designated as pNAL11. Figure 1
Described the construction of pNAL11.
【0019】次いでpNAL11 0.5μgを制限酵素 H
inc II(東洋紡製)とSmaI(東洋紡製)10ユニットと3
7℃で1時間反応させ、完全に切断した後、T4−DN
Aリガーゼ1ユニットで16℃、12時間反応させ、切断さ
れたDNAを連結し、1.3kbの挿入DNAが逆方向に挿
入されたpNAL11Rを得た。Next, 0.5 μg of pNAL11 was added to the restriction enzyme H
inc II (Toyobo) and SmaI (Toyobo) 10 units and 3
After reacting at 7 ° C for 1 hour and completely cleaving, T4-DN
The reaction was carried out with 1 unit of A ligase at 16 ° C. for 12 hours, and the cut DNAs were ligated to obtain pNAL11R in which the 1.3 kb insert DNA was inserted in the reverse direction.
【0020】次にpNAL11R 0.5μg を制限酵素 B
amH I(東洋紡製)とXho I(東洋紡製)10ユニットと
37℃で1時間反応させ完全に切断した後、同様にしてBa
mHIとXho Iで切断したpTS1137(構築図を図3
に示す。J. Bacteriol., 166(3), 739〜745 (1986)参
照)0.5 μg にT4−DNAリガーゼ1ユニットと12時
間反応させ、DNAを連結した。連結したDNAは、エ
シェリヒア・コリーHB101のコンピテントセルを用
いて形質転換した。得られたコロニーはストレプトマイ
シン 50 μg/mlを含むLB寒天培地で選択し、ストレプ
トマイシン耐性を示し、NAL活性が発現しているコロ
ニーを得た。この保有するプラスミドには1.3kbの挿入
DNA断片が存在しており、このプラスミドをpNAL
51とした。図2にpNAL51の構築について記載し
た。Next, 0.5 μg of pNAL11R was added to the restriction enzyme B.
amHI (Toyobo) and Xho I (Toyobo) 10 units
After reacting at 37 ℃ for 1 hour and completely cutting,
pTS1137 cleaved with mHI and Xho I
Shown in. J. Bacteriol., 166 (3), 739-745 (1986)) 0.5 μg was reacted with 1 unit of T4-DNA ligase for 12 hours to ligate DNA. The ligated DNA was transformed with Escherichia coli HB101 competent cells. The obtained colonies were selected on LB agar medium containing 50 μg / ml of streptomycin to obtain streptomycin-resistant colonies expressing NAL activity. A 1.3 kb inserted DNA fragment was present in this plasmid, and this plasmid was designated as pNAL.
It was set to 51. The construction of pNAL51 is described in FIG.
【0021】(2) pNAL51のシュードモナス・プチ
ダへの導入
宿主微生物にシュードモナス・プチダmt−2(ATCC330
15) を用い、ジーン・パルサー(BIO-RAD製) を用い、エ
レクトロポレーション法によりpNAL51を導入し
た。エレクトロポレーションの条件はジーン・パルサー
の使用マニュアルのシュードモナス・プチダの条件に従
った。形質転換体はストレプトマイシン 200μg/mlを含
むLB寒天培地で選択し、ストレプトマイシン耐性を示
し、NAL活性が発現している形質転換体を得た。この
形質転換体、シュードモナス・プチダ(pNAL51)は組換え
プラスミドpNAL51を保持していた。(2) Introduction of pNAL51 into Pseudomonas putida As a host microorganism, Pseudomonas putida mt-2 (ATCC330
15) was used to introduce pNAL51 by electroporation using Gene Pulser (manufactured by BIO-RAD). The conditions for electroporation were according to the conditions of Pseudomonas putida in the Gene Pulsar User Manual. Transformants were selected on LB agar medium containing 200 μg / ml of streptomycin to obtain streptomycin-resistant transformants expressing NAL activity. This transformant, Pseudomonas putida (pNAL51), retained the recombinant plasmid pNAL51.
【0022】(3) 形質転換体によるNALの生産
500ml 容坂口フラスコに50mlのLB培地を分注し、 121
℃、15分間オートクレーブ滅菌を行ない、放冷後、 200
μg/mlになるようにストレプトマイシンを添加した培地
に上記形質転換体、シュードモナス・プチダ(pNAL51)を
接種し、30℃で18時間振騰培養した。培養後、超音波処
理により細胞を破砕し、培地1ml当りのNAL活性を測
定した。なお、対照実験として、pNAL51を保持し
ないシュードモナス・プチダ及びエシェリヒア・コリー
HB101(pNAL51)を同様に培養し、NAL活性を測定
した。得られた結果を表1に示す。(3) Production of NAL by transformant 50 ml of LB medium was dispensed into a 500 ml Sakaguchi flask, and 121
After autoclave sterilization for 15 minutes at ℃, let it cool, then 200
The above transformant, Pseudomonas putida (pNAL51), was inoculated into a medium containing streptomycin at a concentration of μg / ml and shake-cultured at 30 ° C. for 18 hours. After culturing, the cells were disrupted by ultrasonic treatment, and the NAL activity per 1 ml of the medium was measured. As a control experiment, Pseudomonas putida and Escherichia coli HB101 (pNAL51) that do not retain pNAL51 were similarly cultured and the NAL activity was measured. The results obtained are shown in Table 1.
【0023】[0023]
【表1】 [Table 1]
【0024】表1より明らかなように、本発明の形質転
換体、シュードモナス・プチダ(pNAL51)は宿主としてエ
シェリヒア属細菌を用いるよりも約3倍のNAL生産性
を示した。As is clear from Table 1, the transformant of the present invention, Pseudomonas putida (pNAL51), exhibited NAL productivity about 3 times higher than that using Escherichia bacteria as a host.
【0025】実施例2 セラチア属細菌によるNALの
生産
(1) 組換えプラスミドの調製
実施例1で調製したpNAL11を用いた。
(2) 組換えプラスミドpNAL11のセラチア属細菌へ
の導入
宿主微生物として、セラチア・リクィファシエンス IFO
12979及びセラチア・プリムチカJCM 1244を用い、実施
例1と同様にしてエレクトロポレーション法により組換
えプラスミドpNAL11を導入した。エレクトロポレ
ーションの条件はシュードモナス・プチダの条件と同様
にして行った。形質転換体はアンピシリン100 μg/mlを
含むLB寒天培地で選択し、アンピシリン耐性を示し、
NAL活性が発現している形質転換体を得た。これらの
形質転換体、セラチア・リクイファシエンス(pNAL11)お
よびセラチア・プリムチカ(pNAL11)は組換えプラスミド
pNAL11を保持していた。Example 2 Production of NAL by Serratia bacterium (1) Preparation of recombinant plasmid pNAL11 prepared in Example 1 was used. (2) Introduction of recombinant plasmid pNAL11 into Serratia spp. Bacteria As host microorganism, Serratia liquifaciens IFO
The recombinant plasmid pNAL11 was introduced by electroporation in the same manner as in Example 1 using 12979 and Serratia primica JCM 1244. The conditions for electroporation were the same as those for Pseudomonas putida. The transformants were selected on LB agar medium containing 100 μg / ml of ampicillin and showed resistance to ampicillin.
A transformant expressing NAL activity was obtained. These transformants, Serratia liquifaciens (pNAL11) and Serratia primtika (pNAL11), retained the recombinant plasmid pNAL11.
【0026】(3) 形質転換体によるNALの生産
500ml 容坂口フラスコに 100mlのLB培地を分注し、12
1 ℃、15分間オートクレーブ滅菌を行ない、放冷後、10
0 μg/mlになるようにアンピシリンを添加した培地にそ
れぞれ上記形質転換体、セラチア・リクイファシエンス
(pNAL11)、セラチア・プリムチカ(pNAL11)を接種し、30
℃で24時間振騰培養した。培養後、超音波破砕により、
細胞を破砕し、培地1ml 当りのNAL活性を測定した。
なお、対照実験として、pNAL11を保持しないセラ
チア・リクイファシエンス、セラチア・プリムチカ及び
エシェリヒア・コリーHB101(pNAL11)を同様に培養
し、NAL活性を測定した。得られた結果を表2に示
す。(3) Production of NAL by transformant 100 ml of LB medium was dispensed into a 500 ml Sakaguchi flask, and 12
Perform autoclave sterilization at 1 ° C for 15 minutes, allow to cool, then
The above transformants and Serratia liquifaciens were added to a medium containing ampicillin at 0 μg / ml.
(pNAL11), Serratia primica (pNAL11) inoculated, 30
The cells were shake-cultured at 24 ° C for 24 hours. After culturing, by ultrasonic disruption,
The cells were disrupted and the NAL activity per 1 ml of medium was measured.
As a control experiment, NAL activity was measured by similarly culturing Serratia liquifaciens, Serratia primtika and Escherichia coli HB101 (pNAL11) which did not retain pNAL11. The obtained results are shown in Table 2.
【0027】[0027]
【表2】 [Table 2]
【0028】表2より明らかなように、本発明の形質転
換体、セラチア・リクイファシエンス(pNAL11)は宿主と
してエシェリヒア属細菌を用いるよりも約 7.5倍、セラ
チア・プリムチカ(pNAL11)は約3.2 倍ものNAL生産性
を示した。As is clear from Table 2, the transformant of the present invention, Serratia liquifaciens (pNAL11), is about 7.5 times as high as that using Escherichia bacteria as a host, and Serratia primtica (pNAL11) is about 3.2 times. It showed twice as much NAL productivity.
【0029】実施例3 セラチア属細菌によるNALの
製造
(1) 組換えプラスミドの調製
実施例1で調製したpNAL11、1μgを制限酵素、
HindIIIとScaI (東洋紡製) それぞれ10単位で37℃、1
時間反応させ、完全に切断した後、アガロースゲル電気
泳動により分子量分画し、DNA精製キット、GENECLEA
NIIによりアガロースゲルから約1.1kb のHindIII-ScaI
断片を精製した。一方、Bluescript KS0.5 μg を制限
酵素、HindIIIとSmaIそれぞれ10単位で完全に切断した
後、T4-DNAリガーゼ 1単位で16℃、12時間反応させ、上
記アガラロースゲルから精製した 1.1KbのHindIII-ScaI
断片と連結した。連結したDNAはエシェリヒア・コ
リーHB101のコンピテントセルを用いて形質転換し
た。得られたコロニーはアンピシリン50μg/mlを含むLB
寒天培地で選択し、アンピシリン耐性を示し、NAL活
性が発現しているコロニーを得た。この保有するプラス
ミドには1.1kb の挿入断片DNAが存在しており、この
プラスミドをpNAL71とした。図4にpNAL71
の構築について記載した。Example 3 Production of NAL by Serratia bacterium (1) Preparation of recombinant plasmid pNAL11 prepared in Example 1 (1 μg) was treated with a restriction enzyme,
HindIII and ScaI (Toyobo) 10 units each at 37 ℃, 1
After reacting for a period of time and completely cleaving, molecular weight fractionation was performed by agarose gel electrophoresis, DNA purification kit, GENECLEA
About 1.1 kb of HindIII-ScaI from N-II agarose gel
The fragment was purified. On the other hand, 0.5 μg of Bluescript KS was completely cleaved with 10 units each of HindIII and SmaI restriction enzymes, and then reacted with 1 unit of T4-DNA ligase at 16 ° C for 12 hours. -ScaI
Ligated with the fragment. The ligated DNA was transformed with Escherichia coli HB101 competent cells. The resulting colonies were LB containing 50 μg / ml ampicillin.
By selecting on an agar medium, a colony showing ampicillin resistance and expressing NAL activity was obtained. A 1.1 kb insert fragment DNA was present in this plasmid, and this plasmid was designated as pNAL71. Figure 4 shows pNAL71
Described the construction of.
【0030】(2) 組換えプラスミドpNAL71のセラ
チア属細菌への導入
宿主微生物として、セラチア・リクィファシエンス IFO
12979及びセラチア・プリムチカJCM 1244を用い、実施
例1と同様にしてエレクトロポレーション法により組換
えプラスミドpNAL71を導入した。エレクトロポレ
ーションの条件はシュードモナス・プチダの条件と同様
にして行った。形質転換体はアンピシリン100 μg/mlを
含むLB寒天培地で選択し、アンピシリン耐性を示し、
NAL活性が発現している形質転換体を得た。これらの
形質転換体、セラチア・リクイファシエンス(pNAL71)お
よびセラチア・プリムチカ(pNAL71)は組換えプラスミド
pNAL11を保持していた。(2) Introduction of recombinant plasmid pNAL71 into Serratia bacteria As a host microorganism, Serratia liquefiaciens IFO
Using 12979 and Serratia primica JCM 1244, the recombinant plasmid pNAL71 was introduced by the electroporation method as in Example 1. The conditions for electroporation were the same as those for Pseudomonas putida. The transformants were selected on LB agar medium containing 100 μg / ml of ampicillin and showed resistance to ampicillin.
A transformant expressing NAL activity was obtained. These transformants, Serratia liquifaciens (pNAL71) and Serratia primtika (pNAL71), retained the recombinant plasmid pNAL11.
【0031】(3) 形質転換体によるNALの生産
500ml 容坂口フラスコに 100mlのLB培地を分注し、12
1 ℃、15分間オートクレーブ滅菌を行ない、放冷後、10
0 μg/mlになるようにアンピシリンを添加した培地にそ
れぞれ上記形質転換体、セラチア・リクイファシエンス
(pNAL71)、セラチア・プリムチカ(pNAL71)を接種し、30
℃で24時間振騰培養した。培養後、超音波破砕により、
細胞を破砕し、培地1ml 当りのNAL活性を測定した。
なお、対照実験として、pNAL71を保持しないセラ
チア・リクイファシエンス、セラチア・プリムチカ及び
エシェリヒア・コリーHB101(pNAL71)を同様に培養
し、NAL活性を測定した。得られた結果を表3に示
す。(3) Production of NAL by transformant 100 ml of LB medium was dispensed into a 500 ml Sakaguchi flask, and 12
Perform autoclave sterilization at 1 ° C for 15 minutes, allow to cool, then
The above transformants and Serratia liquifaciens were added to a medium containing ampicillin at 0 μg / ml.
(pNAL71), Serratia primica (pNAL71) inoculated, 30
The cells were shake-cultured at 24 ° C for 24 hours. After culturing, by ultrasonic disruption,
The cells were disrupted and the NAL activity per 1 ml of medium was measured.
As a control experiment, NAL activity was measured by similarly culturing Serratia liquifaciens, Serratia primtika and Escherichia coli HB101 (pNAL71) that did not retain pNAL71. The results obtained are shown in Table 3.
【0032】[0032]
【表3】 [Table 3]
【0033】表3より明らかなように、本発明の形質転
換体、セラチア・リクイファシエンス(pNAL71)は宿主と
してエシェリヒア属細菌を用いるよりも約 7.8倍、セラ
チア・プリムチカ(pNAL71)は約3.3 倍ものNAL生産性
を示した。As is clear from Table 3, the transformant of the present invention, Serratia liquifaciens (pNAL71), is about 7.8 times higher than that using Escherichia bacterium as a host, and Serratia primtika (pNAL71) is about 3.3 times. It showed twice as much NAL productivity.
【0034】実施例4 セラチア属細菌によるNALの
製造
前記LB培地61を101 ジャーファメンターに分注し、12
1 ℃、15分間オートクレーブを行い、放冷後、別途無菌
濾過した100mg/mlアンピシリン(ナカライテクス製)を
6ml 添加した。この培地に上記と同一組成の培地で予め
30℃で24時間振盪培養したセラチア・リケファシエンス
(pNAL71)の培養液60mlを接種し、30℃で24時間通気攪拌
培養した。培養終了後のNAL活性は5.8U/ml であっ
た。Example 4 Production of NAL by Serratia spp. LB medium 61 was dispensed into 101 jar-famentor,
Autoclave for 15 minutes at 1 ° C, let stand to cool, and then use 100 mg / ml ampicillin (manufactured by Nacalai Tex) separately sterile filtered.
6 ml was added. Add the same composition as above to this medium beforehand.
Serratia liquefaciens cultured at 30 ℃ for 24 hours with shaking
60 ml of the culture solution of (pNAL71) was inoculated, and the culture was carried out at 30 ° C. for 24 hours with aeration and stirring. The NAL activity after the culture was 5.8 U / ml.
【0035】培養液6lを遠心分離にて集菌し、50mMリ
ン酸緩衝液(pH7.5)200mlに懸濁し、常法により、ダイノ
ミル破砕機で破砕した後、15,000rpm で20分間遠心分離
してNAL粗酵素液を得た。このようにして得た粗酵素
液にプロタミンを用いて除核酸処理を施した後、硫酸ア
ンモニウムを用いた塩析分画を行なった。塩析沈澱物を
50mlの50mMリン酸緩衝液(pH7.5) に溶解し、55℃、16時
間加温処理を行なった。加温処理液をセファデックス G
-25 で脱塩した後、DEAEセファロースCL-6B クロマ
トギラフィーに供してNAL活性画分を得た。6 l of the culture broth was collected by centrifugation, suspended in 200 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), crushed with a Dynomill crusher by a conventional method, and then centrifuged at 15,000 rpm for 20 minutes. A NAL crude enzyme solution was obtained. The crude enzyme solution thus obtained was subjected to nucleic acid removal treatment with protamine and then subjected to salting out fractionation with ammonium sulfate. Salting out the precipitate
It was dissolved in 50 ml of 50 mM phosphate buffer (pH 7.5) and heated at 55 ° C for 16 hours. Sephadex G for heating solution
After desalting with -25, the product was subjected to DEAE Sepharose CL-6B chromatography and a NAL active fraction was obtained.
【0036】DEAEセファロース・クロマトグラフィ
ー後のNAL画分はSDS-PAGE電気泳動で単一バンドを示
し、その比活性は 58.4U/mg であった。また活性収率は
55.8% であった。以上の精製のまとめを表4に示す。The NAL fraction after DEAE Sepharose chromatography showed a single band on SDS-PAGE electrophoresis and its specific activity was 58.4 U / mg. The activity yield is
It was 55.8%. Table 4 shows a summary of the above purification.
【0037】[0037]
【表4】 [Table 4]
【0038】比較例1
比較のために、エシェリヒア・コリーHB101(pNAL7
1)を用い、実施例4と同様のスケールで同様の精製を行
なった。その結果を表5に示す。Comparative Example 1 For comparison, Escherichia coli HB101 (pNAL7
Using 1), the same purification was carried out on the same scale as in Example 4. The results are shown in Table 5.
【0039】[0039]
【表5】 [Table 5]
【0040】表4と表5から明らかなように、本発明で
は同じ培養スケールでも、約9倍のNALがより簡便
に、より高純度で得られるようになった。As is clear from Tables 4 and 5, according to the present invention, even with the same culture scale, about 9-fold NAL can be obtained more easily and with higher purity.
【0041】[0041]
【発明の効果】本発明ではエシェリヒア属以外のグラム
陰性菌に属する微生物、シュードモナス属細菌またはセ
ラチア属細菌を宿主として用いることにより、多量のN
ALを生産させることが可能になった。更にエシェリヒ
ア属細菌よりも低温で生育するグラム陰性菌に属する微
生物を宿主として用い、NALを生産することにより、
簡便に、かつ高純度でNALを製造することが可能とな
った。INDUSTRIAL APPLICABILITY In the present invention, a large amount of N can be obtained by using a microorganism belonging to Gram-negative bacteria other than Escherichia, Pseudomonas bacteria or Serratia bacteria as a host.
It has become possible to produce AL. Furthermore, by using as a host a microorganism belonging to Gram-negative bacteria that grows at a lower temperature than the Escherichia bacterium, by producing NAL,
It has become possible to produce NAL easily and with high purity.
【0042】[0042]
配列番号:1 配列の長さ:1243 配列の型:核酸(DNA) 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:genomic DNA 起源 生物名:エシェリヒア・コリー(Eschrichia coli) 株名:JE1011 配列 AAGCTTTCTG TATGGGGTGT TGCTTAATTG ATCTGGTATA ACAGGTATAA AGGTATATCG 60 TTTATCAGAC AAGCATCACT TCAGAGGTAT TT ATG GCA ACG AAT TTA CGT GGC 113 Met Ala Thr Asn Leu Arg Gly 1 5 GTA ATG GCT GCA CTC CTG ACT CCT TTT GAC CAA CAA CAA GCA CTG GAT 161 Val Met Ala Ala Leu Leu Thr Pro Phe Asp Gln Gln Gln Ala Leu Asp 10 15 20 AAA GCG AGT CTG CGT CGC CTG GTT CAG TTC AAT ATT CAG CAG GGC ATC 209 Lys Ala Ser Leu Arg Arg Leu Val Gln Phe Asn Ile Gln Gln Gly Ile 25 30 35 GAC GGT TTA TAC GTG GGT GGT TCG ACC GGC GAG GCC TTT GTA CAA AGC 257 Asp Gly Leu Tyr Val Gly Gly Ser Thr Gly Glu Ala Phe Val Gln Ser 40 45 50 55 CTT TCC GAG CGT GAA CAG GTA CTG GAA ATC GTC GCC GAA GAG GCG AAA 305 Leu Ser Glu Arg Glu Gln Val Leu Glu Ile Val Ala Glu Glu Ala Lys 60 65 70 GGT AAG ATT AAA CTC ATC GCC CAC GTC GGT TGC GTC AGC ACC GCC GAA 353 Gly Lys Ile Lys Leu Ile Ala His Val Gly Cys Val Ser Thr Ala Glu 75 80 85 AGC CAA CAA CTT GCG GCA TCG GCT AAA CGT TAT GGC TTC GAT GCC GTC 401 Ser Gln Gln Leu Ala Ala Ser Ala Lys Arg Tyr Gly Phe Asp Ala Val 90 95 100 TCC GCC GTC ACG CCG TTC TAC TAT CCT TTC AGC TTT GAA GAA CAC TGC 449 Ser Ala Val Thr Pro Phe Tyr Tyr Pro Phe Ser Phe Glu Glu His Cys 105 110 115 GAT CAC TAT CGG GCA ATT ATT GAT TCG GCG GAT GGT TTG CCG ATG GTG 497 Asp His Tyr Arg Ala Ile Ile Asp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Met Val 120 125 130 135 GTG TAC AAC ATT CCA GCC CTG AGT GGG GTA AAA CTG ACC CTG GAT CAG 545 Val Tyr Asn Ile Pro Ala Leu Ser Gly Val Lys Leu Thr Leu Asp Gln 140 145 150 ATC AAC ACA CTT GTT ACA TTG CCT GGC GTA GGT GCG CTG AAA CAG ACC 593 Ile Asn Thr Leu Val Thr Leu Pro Gly Val Gly Ala Leu Lys Gln Thr 155 160 165 TCT GGC GAT CTC TAT CAG ATG GAG CAG ATC CGT CGT GAA CAT CCT GAT 641 Ser Gly Asp Leu Tyr Gln Met Glu Gln Ile Arg Arg Glu His Pro Asp 170 175 180 CTT GTG CTC TAT AAC GGT TAC GAC GAA ATC TTC GCC TCT GGT CTG CTG 689 Leu Val Leu Tyr Asn Gly Tyr Asp Glu Ile Phe Ala Ser Gly Leu Leu 185 190 195 GCG GGC GCT GAT GGT GGT ATC GGC AGT ACC TAC AAC ATC ATG GGC TGG 737 Ala Gly Ala Asp Gly Gly Ile Gly Ser Thr Tyr Asn Ile Met Gly Trp 200 205 210 215 CGC TAT CAG GGG ATC GTT AAG GCG CTG AAA GAA GGC GAT ATC CAG ACC 785 Arg Tyr Gln Gly Ile Val Lys Ala Leu Lys Glu Gly Asp Ile Gln Thr 220 225 230 GCG CAG AAA CTG CAA ACT GAA TGC AAT AAA GTC ATT GAT TTA CTG ATC 833 Ala Gln Lys Leu Gln Thr Glu Cys Asn Lys Val Ile Asp Leu Leu Ile 235 240 245 AAA ACG GGC GTA TTC CGC GGC CTG AAA ACT GTC CTC CAT TAT ATG GAT 881 Lys Thr Gly Val Phe Arg Gly Leu Lys Thr Val Leu His Tyr Met Asp 250 255 260 GTC GTT TCT GTG CCG CTG TGC CGC AAA CCG TTT GGA CCG GTA GAT GAA 929 Val Val Ser Val Pro Leu Cys Arg Lys Pro Phe Gly Pro Val Asp Glu 265 270 275 AAA TAT CTG CCA GAA CTG AAG GCG CTG GCC CAG CAG TTG ATG CAA GAG 977 Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Lys Ala Leu Ala Gln Gln Leu Met Gln Glu 280 285 290 295 CGC GGG TGAGTTGTTT CCCCTCGCTC GCCCCTACCG GTGAGGGGAA ATAAACGCAT 1033 Arg Gly 297 CTGTACCCTA CAATTTTCAT ACCAAAGCGT GTGGGCATCG CCCACCGCGG GAGACTCACA 1093 ATGAGTACTA CAACCCAGAA TATCCCGTGG TATCGCCATC TCAACCGTGC ACAATGGCGC 1153 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 1243 Sequence type: nucleic acid (DNA) Number of chains: double-stranded Topology: linear Sequence type: genomic DNA origin Organism name: Escherichia coli Share name: JE1011 Array AAGCTTTCTG TATGGGGTGT TGCTTAATTG ATCTGGTATA ACAGGTATAA AGGTATATCG 60 TTTATCAGAC AAGCATCACT TCAGAGGTAT TT ATG GCA ACG AAT TTA CGT GGC 113 Met Ala Thr Asn Leu Arg Gly 1 5 GTA ATG GCT GCA CTC CTG ACT CCT TTT GAC CAA CAA CAA GCA CTG GAT 161 Val Met Ala Ala Leu Leu Thr Pro Phe Asp Gln Gln Gln Ala Leu Asp 10 15 20 AAA GCG AGT CTG CGT CGC CTG GTT CAG TTC AAT ATT CAG CAG GGC ATC 209 Lys Ala Ser Leu Arg Arg Leu Val Gln Phe Asn Ile Gln Gln Gly Ile 25 30 35 GAC GGT TTA TAC GTG GGT GGT TCG ACC GGC GAG GCC TTT GTA CAA AGC 257 Asp Gly Leu Tyr Val Gly Gly Ser Thr Gly Glu Ala Phe Val Gln Ser 40 45 50 55 CTT TCC GAG CGT GAA CAG GTA CTG GAA ATC GTC GCC GAA GAG GCG AAA 305 Leu Ser Glu Arg Glu Gln Val Leu Glu Ile Val Ala Glu Glu Ala Lys 60 65 70 GGT AAG ATT AAA CTC ATC GCC CAC GTC GGT TGC GTC AGC ACC GCC GAA 353 Gly Lys Ile Lys Leu Ile Ala His Val Gly Cys Val Ser Thr Ala Glu 75 80 85 AGC CAA CAA CTT GCG GCA TCG GCT AAA CGT TAT GGC TTC GAT GCC GTC 401 Ser Gln Gln Leu Ala Ala Ser Ala Lys Arg Tyr Gly Phe Asp Ala Val 90 95 100 TCC GCC GTC ACG CCG TTC TAC TAT CCT TTC AGC TTT GAA GAA CAC TGC 449 Ser Ala Val Thr Pro Phe Tyr Tyr Pro Phe Ser Phe Glu Glu His Cys 105 110 115 GAT CAC TAT CGG GCA ATT ATT GAT TCG GCG GAT GGT TTG CCG ATG GTG 497 Asp His Tyr Arg Ala Ile Ile Asp Ser Ala Asp Gly Leu Pro Met Val 120 125 130 135 GTG TAC AAC ATT CCA GCC CTG AGT GGG GTA AAA CTG ACC CTG GAT CAG 545 Val Tyr Asn Ile Pro Ala Leu Ser Gly Val Lys Leu Thr Leu Asp Gln 140 145 150 ATC AAC ACA CTT GTT ACA TTG CCT GGC GTA GGT GCG CTG AAA CAG ACC 593 Ile Asn Thr Leu Val Thr Leu Pro Gly Val Gly Ala Leu Lys Gln Thr 155 160 165 TCT GGC GAT CTC TAT CAG ATG GAG CAG ATC CGT CGT GAA CAT CCT GAT 641 Ser Gly Asp Leu Tyr Gln Met Glu Gln Ile Arg Arg Glu His Pro Asp 170 175 180 CTT GTG CTC TAT AAC GGT TAC GAC GAA ATC TTC GCC TCT GGT CTG CTG 689 Leu Val Leu Tyr Asn Gly Tyr Asp Glu Ile Phe Ala Ser Gly Leu Leu 185 190 195 GCG GGC GCT GAT GGT GGT ATC GGC AGT ACC TAC AAC ATC ATG GGC TGG 737 Ala Gly Ala Asp Gly Gly Ile Gly Ser Thr Tyr Asn Ile Met Gly Trp 200 205 210 215 CGC TAT CAG GGG ATC GTT AAG GCG CTG AAA GAA GGC GAT ATC CAG ACC 785 Arg Tyr Gln Gly Ile Val Lys Ala Leu Lys Glu Gly Asp Ile Gln Thr 220 225 230 GCG CAG AAA CTG CAA ACT GAA TGC AAT AAA GTC ATT GAT TTA CTG ATC 833 Ala Gln Lys Leu Gln Thr Glu Cys Asn Lys Val Ile Asp Leu Leu Ile 235 240 245 AAA ACG GGC GTA TTC CGC GGC CTG AAA ACT GTC CTC CAT TAT ATG GAT 881 Lys Thr Gly Val Phe Arg Gly Leu Lys Thr Val Leu His Tyr Met Asp 250 255 260 GTC GTT TCT GTG CCG CTG TGC CGC AAA CCG TTT GGA CCG GTA GAT GAA 929 Val Val Ser Val Pro Leu Cys Arg Lys Pro Phe Gly Pro Val Asp Glu 265 270 275 AAA TAT CTG CCA GAA CTG AAG GCG CTG GCC CAG CAG TTG ATG CAA GAG 977 Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Lys Ala Leu Ala Gln Gln Leu Met Gln Glu 280 285 290 295 CGC GGG TGAGTTGTTT CCCCTCGCTC GCCCCTACCG GTGAGGGGAA ATAAACGCAT 1033 Arg Gly 297 CTGTACCCTA CAATTTTCAT ACCAAAGCGT GTGGGCATCG CCCACCGCGG GAGACTCACA 1093 ATGAGTACTA CAACCCAGAA TATCCCGTGG TATCGCCATC TCAACCGTGC ACAATGGCGC 1153
【図1】 プラスミドpNAL11の構築図を示す。FIG. 1 shows a construction diagram of plasmid pNAL11.
【図2】 プラスミドpNAL51の構築図を示す。FIG. 2 shows a construction diagram of plasmid pNAL51.
【図3】 プラスミドpTS1137の構築図を示す。FIG. 3 shows a construction diagram of plasmid pTS1137.
【図4】 プラスミドpNAL71の構築図を示す。 >FIG. 4 shows a construction diagram of plasmid pNAL71. >
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI (C12N 1/21 C12N 15/00 ZNAA C12R 1:425) (C12N 9/88 C12R 1:38) (C12N 9/88 C12R 1:425) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:19) (56)参考文献 Nuleic Acids Rese arch ,1985, Vol.13, N o.24, p.8843−8852 Agric.Biol.Chem., 1986, Vol.50, No.8, p p.2155−2158 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12N 15/09 - 15/90 C12N 1/21 C12N 9/88 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI (C12N 1/21 C12N 15/00 ZNAA C12R 1: 425) (C12N 9/88 C12R 1:38) (C12N 9/88 C12R 1 : 425) (C12N 15/09 ZNA C12R 1:19) (56) Reference Nulic Acids Research arch, 1985, Vol. 13, No. 24, p. 8843-8852 Agric. Biol. Chem. , 1986, Vol. 50, No. 8, pp. 2155-2158 (58) Fields investigated (Int.Cl. 7 , DB name) C12N 15/09-15/90 C12N 1/21 C12N 9/88
Claims (2)
ラミン酸アルドラーゼ産生遺伝情報を担うDNAをベク
ターに組込んだ組換えプラスミドを導入したシュードモ
ナス属細菌またはセラチア属細菌に属する微生物。1. A Shudomo introduced a recombinant plasmid incorporating the DNA of the vector carrying the N- acyl neuraminic acid aldolase-producing genetic information derived from bacteria belonging to the genus Escherichia
A microorganism belonging to the genus Solanum or the bacterium Serratia .
ラミン酸アルドラーゼ産生遺伝情報を担うDNAをベク
ターに組込んだ組換えプラスミドを導入したシュードモ
ナス属細菌またはセラチア属細菌に属する微生物を培地
中で培養し、培養物中にN−アシルノイラミン酸アルド
ラーゼを産生せしめ、該培養物からN−アシルノイラミ
ン酸アルドラーゼを採取することを特徴とするN−アシ
ルノイラミン酸アルドラーゼの製造法。2. A Pseudomona in which a recombinant plasmid in which a DNA carrying genetic information for producing N-acylneuraminic acid aldolase derived from a bacterium belonging to the genus Escherichia is incorporated is introduced.
A microorganism belonging to the genus Solanum or a bacterium of the genus Serratia is cultured in a medium to produce N-acylneuraminic acid aldolase in the culture, and N-acylneuraminic acid aldolase is collected from the culture. Method for producing acid aldolase.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25690393A JP3491695B2 (en) | 1993-10-14 | 1993-10-14 | Method for producing N-acylneuraminic acid aldolase |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP25690393A JP3491695B2 (en) | 1993-10-14 | 1993-10-14 | Method for producing N-acylneuraminic acid aldolase |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH07107968A JPH07107968A (en) | 1995-04-25 |
JP3491695B2 true JP3491695B2 (en) | 2004-01-26 |
Family
ID=17298996
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP25690393A Expired - Fee Related JP3491695B2 (en) | 1993-10-14 | 1993-10-14 | Method for producing N-acylneuraminic acid aldolase |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3491695B2 (en) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN111386345B (en) | 2018-10-30 | 2023-05-16 | 绿色地球研究所株式会社 | Process for producing 1,3-propanediol |
-
1993
- 1993-10-14 JP JP25690393A patent/JP3491695B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Agric.Biol.Chem.,1986, Vol.50, No.8, pp.2155−2158 |
Nuleic Acids Research ,1985, Vol.13, No.24, p.8843−8852 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH07107968A (en) | 1995-04-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3491695B2 (en) | Method for producing N-acylneuraminic acid aldolase | |
JPH062061B2 (en) | Process for producing N-acetylneuraminic acid lyase | |
US6943004B1 (en) | Transformed microorganism and process for producing D-aminoacylase | |
US6340579B1 (en) | Gene encoding an alpha-hydroxy-gamma-carboxymuconic acid-epsilon-semialdehyde dehydrogenase | |
JPH06303981A (en) | Dna having genetic information on protein having formaldehyde dehydrogenase activity and production of formaldehyde dehydrogenase | |
JP2850033B2 (en) | Novel L-lactate dehydrogenase and gene encoding the same | |
JP3132618B2 (en) | Stabilized modified protein | |
US20030186412A1 (en) | Novel carbonyl reductase, gene thereof and method of using the same | |
JPH10248574A (en) | New lactic acid-oxidizing enzyme | |
JPS5959189A (en) | Novel alkali protease | |
JP3508871B2 (en) | DNA having genetic information of protein having creatinine deiminase activity and method for producing creatinine deiminase | |
JP2706223B2 (en) | Use of DNA having genetic information of pyruvate oxidase | |
US5993807A (en) | Truncated aspartase enzyme derivatives and uses thereof | |
JP4485734B2 (en) | 5-substituted hydantoin racemase, DNA encoding the same, recombinant DNA, transformed cell, and method for producing optically active amino acid | |
JP4561021B2 (en) | 5-substituted hydantoin racemase, DNA encoding the same, recombinant DNA, transformed cell, and method for producing optically active amino acid | |
JP3173619B2 (en) | Method for producing pyroglutamyl aminopeptidase | |
JP3358686B2 (en) | Gene encoding novel glutamate dehydrogenase and method for producing glutamate dehydrogenase using the gene | |
JPH0698003B2 (en) | DNA fragment having β-tyrosinase activity and transformed prokaryotic cell | |
JP2923654B2 (en) | DTA gene and its use | |
JP2788070B2 (en) | 2-haloacid dehalogenase producing gene | |
JPH08238087A (en) | Sarcosine oxidase and its production | |
JP4161232B2 (en) | Novel protein having sarcosine oxidase activity and method for producing the same | |
JP2000245471A (en) | Formate dehydrogenase gene, recombinant vector containing the same, transformant containing the recombinant vector and production of formate dehydrogenase using the transformant | |
JP3003785B2 (en) | DNA having genetic information of isocitrate dehydrogenase and use thereof | |
JP3202986B2 (en) | Method for producing cholesterol oxidase |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071114 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081114 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081114 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091114 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091114 Year of fee payment: 6 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101114 Year of fee payment: 7 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111114 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111114 Year of fee payment: 8 |
|
FPAY | Renewal fee payment (prs date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121114 Year of fee payment: 9 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |