JP4561021B2 - 5-substituted hydantoin racemase, DNA encoding the same, recombinant DNA, transformed cell, and method for producing optically active amino acid - Google Patents

Description

【０００５】
５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造するためには、上記▲１▼ヒダントイナーゼおよび▲２▼Ｎ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼのうち、少なくとも一方に光学選択性の酵素を用いればよく、従来から微生物酵素系を用いた方法および微生物酵素系と化学反応系とを組み合わせた方法が知られている。この５置換ヒダントイン化合物から、光学活性アミノ酸を製造する方法は、医薬品、化学工業品、食品添加物等の製造に重要である。
【０００６】
微生物酵素系あるいは微生物酵素系と化学反応系との組み合わせにより、ＤＬ−５置換ヒダントイン化合物の全量を光学選択的に加水分解させ、光学活性アミノ酸に変換するには、基質とならないエナンチオマーを効率的にラセミ化し、基質となるエナンチオマーに変化させる必要がある。ところが、微生物酵素系の作用する中性条件下では、基質とならない光学活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化速度がきわめて遅く、ラセミ化が律速となって効率的に光学活性アミノ酸に変換することができないといった問題があった。
【０００７】
そこで、中性条件下での光学活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を目的として、ＨＲａｓｅの検索がなされ、アースロバクター（Arthrobacter）属細菌由来（特開昭６２−１２２５９１号公報、Ann.N.Y.Acad.Sci ６７２巻４７８ページ、特開平６−３４３４６２号公報）、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌由来(特開平４−２７１７８４号公報、J.Bacteriol.１７４巻、７９８９ページ、１９９２年)が報告されている。従来報告されている細菌由来のＨＲａｓｅの至適反応温度は、アースロバクター エスピー（Arthrobacter sp.）ＤＳＭ−３７４７株由来のものが３７℃（Ann.N.Y.Acad.Sci ６７２巻 ４７８ページ）、同じくアースロバクター エスピー（Arthrobacter sp.）ＤＫ２００株由来のものが１０℃〜５０℃（特開昭６２−１２２５９１号公報）、またシュードモナスエスピー(Pseudomonas sp.)ＮＳ６７１由来のものが４５℃である。
【０００８】
一般的に、酵素反応における作用至適温度が高いほど、酵素の産業的な利用価値が高くなる。すなわち反応温度を高くすることができれば、より反応速度を速くすることが可能となる結果、目的とする反応が効率的に進むようになるのはもちろんのこと、反応中、反応液の微生物汚染のリスクが軽減されることから、品質保持を含めた工程管理が容易になる利点がある。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
上述したように、工業的応用の観点から、反応の至適温度が高いＨＲａｓｅは有用である。しかしながら、今まで報告されているＨＲａｓｅの作用至適温度の上限は５０℃であり、ラセミ化反応を効率的に進行させるため、また反応液の微生物汚染のリスクを軽減するため、さらに作用至適温度の高いＨＲａｓｅが求められている。
【００１０】
従って、本発明の目的は、従来になく反応の至適温度が高い新規ＨＲａｓｅを単離し、当該酵素を用いた光学活性アミノ酸の製造方法を提供することにある。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
上記問題に鑑み鋭意研究の結果、本発明者らは、マイクロバクテリウム属細菌に目的とする反応の至適温度が高い新規ＨＲａｓｅが存在することを見出し、本発明を完成するに至った。
【００１２】
即ち、本発明は、以下のとおりである。
【００１３】
（請求項１） ５置換ヒダントインのラセミ化反応を触媒する５置換ヒダントインラセマーゼにおいて、作用至適ｐＨがｐＨ７〜９の範囲内にあり、作用至適温度が５０〜６０℃の範囲内にあることを特徴とする５置換ヒダントインラセマーゼ。
【００１４】
（請求項２） 下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質。
（a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
（b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００１５】
（請求項３） マイクロバクテリウム属細菌を培養して得た菌体を破砕または溶菌後、精製処理を行うことにより取得されるマイクロバクテリウム属細菌由来の５置換ヒダントインラセマーゼ画分。
【００１６】
（請求項４） 請求項１または２に記載の５置換ヒダントインラセマーゼまたは請求項３に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ画分を、光学活性５置換ヒダントイン化合物に作用させることを特徴とする光学活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化方法。
【００１７】
（請求項５） 請求項１または２に記載の５置換ヒダントインラセマーゼまたは請求項３に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ画分、および、５置換ヒダントインを光学選択的に加水分解する酵素または当該酵素含有物を、５置換ヒダントインに作用させることを特徴とするＮ−カルバミルアミノ酸の製造方法。
【００１８】
（請求項６） 請求項１または２に記載の５置換ヒダントインラセマーゼまたは請求項３に記載の５置換ヒダントインラセマーゼ画分、５置換ヒダントインを加水分解する酵素または当該酵素含有物、および、Ｎ−カルバミルアミノ酸を光学選択的に加水分解する酵素または当該酵素含有物を、５置換ヒダントインに作用させることを特徴とする光学活性アミノ酸の製造方法。
【００１９】
（請求項７） 請求項１に記載の５置換ヒダントインラセマーゼをコードするＤＮＡ。
【００２０】
（請求項８） 下記(a)または(b)の塩基配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（a）配列表配列番号１に記載の塩基配列
（b）配列表配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列
【００２１】
（請求項９） 下記(c)または(d)のアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（c）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
（d）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【００２２】
（請求項１０） 請求項７〜９のいずれかに記載のＤＮＡとベクターＤＮＡとが接続されて得られる組み換えＤＮＡ。
【００２３】
（請求項１１） 前記ベクターＤＮＡは、ｐＵＣ系プラスミド、ｐＢＲ３２２系プラスミドまたはその誘導体に由来することを特徴とする請求項１０に記載の組み換えＤＮＡ。
【００２４】
（請求項１２） 請求項１０または１１に記載の組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞。
【００２５】
（請求項１３） 前記細胞は、エシェリヒア コリに由来することを特徴とする請求項１２に記載の細胞。
【００２６】
（請求項１４） 請求項１２または１３に記載の細胞を培地中で培養し、培地中および／または細胞中に５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を蓄積させることを特徴とする５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質の製造方法。
【００２７】
【発明の実施の形態】
以下、本発明について、
[I] ＨＲａｓｅ
[II] ＨＲａｓｅを用いた光学活性アミノ酸の製造方法
の順に添付の図面を参照して詳細に説明する。
【００２８】
[I] ＨＲａｓｅ
フラボバクテリウム属細菌に、ＤＬ−５−インドリルメチルヒダントインを光学選択的に加水分解し、対応するＬ−トリプトファンを生成する菌株が報告されている。このＬ−トリプトファンを生成する菌株であるフラボバクテリウム エスピー.（Flavobacterium sp.）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）を用い、ＤＬ−５−インドリルメチルヒダントインを基質としＬ−トリプトファン生成反応を行なわせた場合、Ｌ−トリプトファンの生成モル収率は８０％以上に達する（Agric.Biol.Chem.５１巻 ３６３ページ、１９８７年）。
【００２９】
光学活性インドリルメチルヒダントインは、酵素反応が行われるような中性条件下では、自発的ラセミ化がほとんど起こらないことから、本発明者らは、当該菌株に新規ＨＲａｓｅが存在すると考えた。この考えに基づき、本発明者らは、新規ＨＲａｓｅの存在を明らかにすべく、当該菌株の培養菌体からＨＲａｓｅを精製単離するとともに、この酵素が目的とする反応の至適温度が高い新規ＨＲａｓｅであることを見いだした。
【００３０】
なお、フラボバクテリウム エスピー.（Flavobacterium sp.）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）は、当初フラボバクテリウム エスピー.（Flavobacterium sp.）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）として１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託されたが、再同定の結果オーレオバクテリウム リクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens ）に分類されることが判明した。現在では、種名変更により、オーレオバクテリウム リクエファシエンス（Aureobacterium liquefaciens ）はマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）に分類され、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（国内寄託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３、国際寄託番号ＦＥＲＭ−ＢＰ７６４３）として独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている。
【００３１】
マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）について、細菌の分類学書であるバージェーズ マニュアル オブ デターミネイティブ バクテリオロジー 第１巻（第９版 1994年、ウイリアム アンド ウイルキンス社出版）に照らしあわせて生理性状試験を実施した試験結果を表１に示す。
【００３２】
【表１】

【００３３】
また、本発明者らは、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２由来のＨＲａｓｅを精製し、ＨＲａｓｅのアミノ酸配列を決定した。さらに、ＨＲａｓｅのアミノ酸配列から演繹した３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成し、これをプローブとして利用しマイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長を、マイクロバクテリウム属細菌染色体遺伝子ライブラリーから単離することに成功した。
【００３４】
さらに、本発明者らは、マイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅ遺伝子の単離の際、同時に得られたＨＲａｓｅ遺伝子下流の塩基配列がヒダントイナーゼ（以下ＨＨａｓｅ）遺伝子の一部であると予想し、該ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、プローブとして利用することにより、当該菌株の遺伝子ライブラリーからＨＨａｓｅ遺伝子の全長の単離・取得に成功した。同様に、ＨＨａｓｅ遺伝子の単離の際、ＨＨａｓｅ遺伝子下流の塩基配列がＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ（以下ＣＨａｓｅ）遺伝子の一部であると予想し、該ＤＮＡ断片をＰＣＲ法により増幅し、プローブとして利用することにより、ＣＨａｓｅ遺伝子の全長の単離・取得に成功した。
【００３５】
すなわち、図１に示すように、本発明のＨＲａｓｅは、ＨＨａｓｅ遺伝子およびＣＨａｓｅ遺伝子とともにオペロンを形成していると考えられる。図１中、▲１▼はＥｃｏＲ Ｉ／ＰｓｔＩ断片であり、▲２▼はＫｐｎ Ｉ／Ｓａｃ Ｉ断片であり、▲３▼はＢｇｌ ＩＩ断片である。
【００３６】
なお、添付した本発明の配列表において、上記方法によって特定された本発明のＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを配列番号１に示し、ＨＨａｓｅをコードするＤＮＡを配列番号３に示し、ＣＨａｓｅをコードするＤＮＡを配列番号５に示す。また、ＨＲａｓｅ遺伝子、ＨＨａｓｅ遺伝子およびＣＨａｓｅ遺伝子を含む構造遺伝子群をコードするＤＮＡを配列番号７に示す。配列番号７に記載の塩基配列のうち、塩基番号１〜７０８が本発明のＨＲａｓｅをコードし、塩基番号７２９〜２１０５がＨＨａｓｅをコードし、塩基番号２１０５〜３３４０がＣＨａｓｅをコードしている。
【００３７】
これらのＤＮＡは、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡから単離されたものであり、いずれもＬ−アミノ酸の製造に係わるタンパク質をコードするものである。
【００３８】
また、配列表の配列番号２に、配列表の配列番号１の塩基配列がコードするＨＲａｓｅのアミノ酸配列を示し、配列表の配列番号４に、配列表の配列番号３の塩基配列がコードするＨＨａｓｅのアミノ酸配列を示し、配列表の配列番号６に、配列表の配列番号５の塩基配列がコードするＣＨａｓｅのアミノ酸配列を示す。
【００３９】
配列表の配列番号２に記載のＨＲａｓｅ、配列表の配列番号４に記載のＨＨａｓｅおよび配列表の配列番号６に記載のＣＨａｓｅは、下記反応式（II）に示すように、５−（４−ヒドロキシベンジル）ヒダントインに代表される５置換ヒダントインから、Ｌ−チロシンに代表される光学活性アミノ酸を生成する反応を触媒する。
【００４０】
【化２】

【００４１】
次に、本発明の新規ＨＲａｓｅについて、（1）ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ、（2）ＨＲａｓｅの性質、（3）ＨＲａｓｅの製造方法の順に詳細に説明する。
【００４２】
（1）ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ
配列表の配列番号１の塩基配列を有する本発明のＨＲａｓｅ遺伝子は、前述したようにマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株の染色体ＤＮＡから単離されたものである。配列表の配列番号１の塩基配列は、既知のシュードモナス属細菌由来のＨＲａｓｅ（J.Bacteriol.１７４巻、９６２ページ、１９９２年）とアミノ酸配列において４８％の相同性を示し、塩基配列において４９％の相同性を示す。
【００４３】
マイクロバクテリウム属細菌からＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを取得する方法について説明する。
【００４４】
はじめに、精製されたＨＲａｓｅのアミノ酸配列を決定する。エドマン法（Edman,P., Acta Chem. Scand. 4, 227 (1950)）を用いてアミノ酸配列を決定することができる。またApplied Biosystems社製のシークエンサーを用いてアミノ酸配列を決定することができる。本発明のマイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅについて、Ｎ末端から３０残基のアミノ酸配列を決定したところ、配列表配列番号８に示される配列が明らかとなった。
【００４５】
明らかとなったアミノ酸配列に基づいて、これをコードするＤＮＡの塩基配列を演繹できる。ＤＮＡの塩基配列を演繹するには、ユニバーサルコドンを採用する。
【００４６】
演繹された塩基配列に基づいて、３０塩基対程度のＤＮＡ分子を合成する。該ＤＮＡ分子を合成する方法はTetrahedron Letters, 22, 1859 (1981)に開示されている。また、Applied Biosystems社製のシンセサイザーを用いて該ＤＮＡ分子を合成できる。該ＤＮＡ分子は、マイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長を、マイクロバクテリウム属細菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する際に、プローブとして利用できる。あるいは、マイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡをＰＣＲ法で増幅する際に、プライマーとして利用できる。ただし、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡはマイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長を含んでいないので、ＰＣＲ法を用いて増幅されるＤＮＡをプローブとして用いて、マイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡ全長をマイクロバクテリウム属細菌染色体遺伝子ライブラリーから単離する。
【００４７】
ＰＣＲ法の操作については、White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)等に記載されている。染色体ＤＮＡを調製する方法、さらにＤＮＡ分子をプローブとして用いて、遺伝子ライブラリーから目的とするＤＮＡ分子を単離する方法については、Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)等に記載されている。
【００４８】
単離されたマイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡの塩基配列を決定する方法は、A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Inc. (1985)に記載されている。また、Applied Biosystems社製のＤＮＡシークエンサーを用いて、塩基配列を決定することができる。マイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを配列表配列番号１に示す。
【００４９】
なお、マイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡは、配列表配列番号１に示されるＤＮＡだけではない。すなわち、マイクロバクテリウム属に属する細菌の種および株ごとに、塩基配列の違いが観察されるはずだからである。
【００５０】
また、本発明のＤＮＡは単離されたＨＲａｓｅをコードするＤＮＡのみではなく、当然ながら、マイクロバクテリウム属細菌の染色体ＤＮＡから単離されたＨＲａｓｅをコードするＤＮＡに人工的に変異を加えたＤＮＡであっても、ＨＲａｓｅをコードする場合には、本発明のＤＮＡである。人工的に変異を加える方法として頻繁に用いられるものとして、Method. in Enzymol.,154 (1987)に記載されている部位特異的変異導入法がある。
【００５１】
また、配列表配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。ここで「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば５０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、このましくは、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、さらに好ましくは６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件があげられる。また、「５置換ヒダントインラセマーゼ活性」とは、５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する活性であればよい。ただし、配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００５２】
さらに、配列表の配列番号１に記載のＤＮＡがコードするＨＲａｓｅと実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡも本発明のＤＮＡである。すなわち、
（a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列、
（b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ
も本発明のＤＮＡである。ここで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造や、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を大きく損なわない範囲のものであり、具体的には、２〜５０個、好ましくは２〜３０個、さらに好ましくは２〜１０個である。また、「５置換ヒダントインラセマーゼ活性」とは、前述のとおり、５置換ヒダントイン化合物をラセミ化する活性を意味する。ただし、（b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列の場合には、５０℃、ｐＨ８の条件下で配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質の半分程度以上の酵素活性を保持していることが望ましい。
【００５３】
（2）ＨＲａｓｅの性質
つぎに、精製されたマイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅの性質について説明する。
【００５４】
本発明のＨＲａｓｅは前述した遺伝子の単離と解析より明らかにされるように、配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する。しかし、本発明は、配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質をも含むものである。
【００５５】
すなわち、本発明のＨＲａｓｅは、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質である。
（a）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列
（b）配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
ここで、「数個」および「５置換ヒダントインラセマーゼ活性」の定義は（1）ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡの項の説明と同義である。
【００５６】
本発明のＨＲａｓｅは、５置換ヒダントイン化合物のラセミ化反応を触媒する。
【００５７】
本発明のＨＲａｓｅのＨＲａｓｅ活性の測定は、光学活性なＤ−、またはＬ−５置換ヒダントイン化合物を基質とし、ラセミ化度をこれらの旋光度の変化を測定する、または、光学分割カラムを用いた高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により測定することにより行うことが可能である。
【００５８】
具体的には、１２０ ｍｇ／ｄｌ Ｌ−またはＤ−ベンジルヒダントイン（ＢＨ）、５０ mM リン酸−カリウム緩衝液（ＫＰＢ） (ｐＨ ８．０)、５ mM ジチオスレイトール（ＤＴＴ）およびＨＲａｓｅ酵素溶液を含む反応液を３７℃で３０分間インキュベートした後、９倍容の１．１ mM ＣｕＳＯ₄、１１．１ mM Ｈ₃ＰＯ₄溶液を添加することにより反応を停止させた。２０，０００ｇ×１０分の遠心により沈澱を取り除いた後、ＨＰＬＣにてラセミ化したＢＨ量を定量し、ラセミ化活性を見積もった。なお、酵素活性の単位として、この条件にて１分に１μｍｏｌのＢＨをラセミ化する酵素活性をもって１Ｕと定義した。
【００５９】
ＨＰＬＣを用いた分析光学活性ＢＨの定量分析はダイセル化学ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＷＨ ０．４６ｃｍφ×２５ｃｍを用いて行った。分析条件は以下の通り。
移動相：５％ (ｖ／ｖ) methanol, １ mM ＣｕＳＯ₄
カラム温度：５０℃
流速：１．５ ml/分
検出：ＵＶ₂₁₀
この条件において、Ｄ−ＢＨ (リテンションタイム４．２分)、Ｌ−ＢＨ （同５．３ 分）に溶出した。
【００６０】
次に、本発明のＨＲａｓｅについて、上記分析方法にて測定した酵素化学的性質を以下に述べる。
【００６１】
本発明のＨＲａｓｅは、今まで報告されているＨＲａｓｅと比較して作用至適温度が高温領域にあるため、ラセミ化反応を効率的に触媒できることを特徴とする。すなわち、上記（a）または（b）のアミノ酸配列を有する本発明のＨＲａｓｅは、そのアミノ酸配列の違いにより、多少の差はあるものの、作用至適温度が５０℃超であることを特徴とする。より好ましい作用至適温度は５２℃以上であり、より好ましくは５５℃超である。作用至適温度の上限は特にないが、ＨＲａｓｅの温度安定性を考慮すると６０℃以下であることが好ましい。なお、本願明細書における「作用至適温度」とは、ｐＨ８の条件下において、最大活性を示す温度を意味する。
【００６２】
至適ｐＨ：約７〜約９付近にある。
作用至適ｐＨの範囲を求めるために、４０℃の条件下で３０分間反応を行った。
【００６３】
ｐＨ安定性：約６〜約９付近にある。
０℃の条件下で、３０分間各ｐＨ処理した場合のｐＨ安定性を調べた。
【００６４】
温度安定性：約４０℃以下で安定である。
ｐＨ８．０の条件下で３０分間加温処理した場合の温度安定性を調べた。
【００６５】
阻害剤の影響：ＮＥＭ（Ｎ−エチルマレイミド）、銅イオン、ＩＡＡ（モノヨード酢酸）によって強く阻害される。ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）ではほとんど阻害されない。なお、本発明のＨＲａｓｅはＤＴＴ（ジチオトレイトール）を添加することにより活性化される。
【００６６】
分子量：ａ）約１０７，０００（ゲル濾過法）、ｂ）約２７，０００(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法)
本発明のＨＲａｓｅは、分子量は２７，０００のサブユニット４量体構造をとると想定される。
【００６７】
（3）ＨＲａｓｅおよび５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質の製造方法
次に本発明のＨＲａｓｅおよび５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質の製造方法について説明する。本発明のＨＲａｓｅおよび５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質の製造方法としては、(i) 微生物培養によりＨＲａｓｅを生成蓄積させる方法と、(ii)組み換えＤＮＡ技術によりＨＲａｓｅまたは５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質を生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養することにより当該タンパク質を生成蓄積させる方法の２つがある。
【００６８】
(i) 微生物培養により生成蓄積する方法
微生物培養により生成蓄積する方法において、ＨＲａｓｅの取得源となる微生物としてはマイクロバクテリウム（Microbacterium）属に属する微生物があげられる。好適なものとしては、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）があげられる。
【００６９】
マイクロバクテリウム属に属する微生物の培養形態は液体培養、固体培養いずれも可能であるが、工業的に有利な方法は、深部通気撹拌培養法である。栄養培地の栄養源としては、微生物培養に通常用いられる炭素源、窒素源、無機塩およびその他の微量栄養源を使用できる。使用菌株が利用できる栄養源であればすべてを使用できる。
【００７０】
通気条件としては、好気条件を採用する。培養温度としては、菌が発育し、ＨＲａｓｅが生産される範囲であれば良い。従って、厳密な条件は無いが、通常１０〜５０℃、好ましくは３０〜４０℃である。培養時間は、その他の培養条件に応じて変化する。例えば、ＨＲａｓｅが最も生産される時間まで培養すれば良く、通常５時間〜７日間、好ましくは１０時間〜３日間程度である。
【００７１】
培養後菌体を遠心分離（たとえば、１０，０００ｘｇ、１０分）により集菌する。当該酵素は菌体中に存在するので、この菌体を破砕、または溶菌させることにより、酵素の可溶化を行う。菌体破砕には、超音波破砕、フレンチプレス破砕、ガラスビーズ破砕等の方法を用いることができ、また溶菌させる場合には、卵白リゾチームや、ペプチダーゼ処理またはこれらを適宜組み合わせた方法が用いられる。
【００７２】
マイクロバクテリウム属細菌由来ＨＲａｓｅを精製する場合、酵素可溶化液を出発材料として精製することになるが、未破砕あるいは未溶菌残査が存在するようであれば、可溶化液を再度遠心分離操作に供し、沈殿する残査を除いた方が、精製に有利である。
【００７３】
酵素の精製には、通常酵素の精製を行うために用いられる全ての常法、例えば硫安塩析法、ゲル濾過法、イオン交換クロマトグラフィー法、疎水クロマトグラフィー法等を採用することができる。その結果、より比活性が高いＨＲａｓｅ含有画分を得ることができる。
【００７４】
(ii)組み換えＤＮＡ技術による製法
次に、組み換えＤＮＡ技術によってＨＲａｓｅまたは５置換ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質（以下、(ii)組み換えＤＮＡ技術による製法において、ＨＲａｓｅと省略する。）を製造する方法について説明する。組み換えＤＮＡ技術を利用して酵素、生理活性物質等の有用タンパク質を製造する例は数多く知られており、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、天然に微量に存在する有用タンパク質を大量生産できる。
【００７５】
図２は、本発明のＨＲａｓｅの製造工程のフローチャートである。
先ず、本発明のＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを調製する(ステップＳ１)。
次に、調製したＤＮＡをベクターＤＮＡと接続して組み換えＤＮＡを作製し(ステップＳ２)、該組み換えＤＮＡによって細胞を形質転換して形質転換体を作製する(ステップＳ３)。続いて、該形質転換体を培地中で培養し、培地中および／または細胞中にＨＲａｓｅを生成蓄積させる(ステップＳ４)。
その後、ステップＳ５に進み、該酵素を回収・精製することによって精製ＨＲａｓｅを製造する。
また、ステップＳ５で生産した精製ＨＲａｓｅまたはステップＳ４のＨＲａｓｅが蓄積された培地をアミノ酸を合成に用いることで、目的とする光学活性アミノ酸を大量に製造することができる(ステップＳ６)。
【００７６】
なお、ベクターＤＮＡと接続されるＤＮＡは、本発明のＨＲａｓｅが発現可能であればよい。
【００７７】
ここで、ベクターＤＮＡに接続されるＨＲａｓｅゼ遺伝子としては、上述の
(a)配列表の配列番号１に記載の塩基配列を有するＤＮＡ、
(b)配列表の配列番号１に記載の塩基配列とストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列を有するＤＮＡ、
(c)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、
(d)配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
などを使用できる。
【００７８】
タンパクを組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、該タンパクを生産する形質転換体内で該タンパクが会合し、タンパクの封入体（inclusion body）を形成させることが好ましい。この発現生産方法の利点は、目的のタンパク質を菌体内に存在するプロテアーゼによる消化から保護する点および目的のタンパク質を菌体破砕に続く遠心分離操作によって簡単に精製できる点等である。
【００７９】
このようにして得られるタンパク封入体は、タンパク変性剤により可溶化され、主にその変性剤を除去することによる活性再生操作を経た後、正しく折り畳まれた生理的に活性なタンパクに変換される。例えば、ヒトインターロイキン−２の活性再生（特開昭６１−２５７９３１号公報）等多くの例がある。
【００８０】
タンパク封入体から活性型タンパクを得るためには、可溶化・活性再生等の一連の操作が必要であり、直接活性型タンパクを生産する場合よりも操作が複雑になる。しかし、菌体の生育に影響を及ぼすようなタンパクを菌体内で大量に生産させる場合は、不活性なタンパク封入体として菌体内に蓄積させることにより、その影響を抑えることができる。
【００８１】
目的タンパクを封入体として大量生産させる方法として、強力なプロモータの制御下、目的のタンパクを単独で発現させる方法の他、大量発現することが知られているタンパクとの融合タンパクとして発現させる方法がある。
【００８２】
さらに、融合タンパクとして発現させた後に、目的のタンパクを切り出すため、制限プロテアーゼの認識配列を適当な位置に配しておくことも有効である。
【００８３】
タンパクを組み換えＤＮＡ技術を用いて大量生産する場合、形質転換される宿主細胞としては、細菌細胞、放線菌細胞、酵母細胞、カビ細胞、植物細胞、動物細胞等を用いることができるが、一般に大腸菌、好ましくはエシェリヒア コリが用いられる。大腸菌を用いてタンパクを大量生産する技術について数多くの知見があるためである。以下、形質転換された大腸菌を用いてＨＲａｓｅを製造する方法を説明する。
【００８４】
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡを発現させるプロモータとしては、通常大腸菌における異種タンパク生産に用いられるプロモータを使用することができ、例えば、Ｔ７プロモータ、ｔｒｐプロモータ、ｌａｃプロモータ、ｔａｃプロモータ、ＰＬプロモータ等の強力なプロモータが挙げられる。
【００８５】
ＨＲａｓｅを融合タンパク封入体として生産させるためには、ＨＲａｓｅ遺伝子の上流あるいは下流に、他のタンパク、好ましくは親水性であるペプチドをコードする遺伝子を連結して、融合タンパク遺伝子とする。このような他のタンパクをコードする遺伝子としては、融合タンパクの蓄積量を増加させ、変性・再生工程後に融合タンパクの溶解性を高めるものであればよく、例えば、Ｔ７ｇｅｎｅ １０、β−ガラクトシダーゼ遺伝子、デヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、インターフェロンγ遺伝子、インターロイキン−２遺伝子、プロキモシン遺伝子等が候補として挙げられる。
【００８６】
これらの遺伝子とＨＲａｓｅをコードする遺伝子とを連結する際には、コドンの読み取りフレームが一致するようにする。適当な制限酵素部位で連結するか、あるいは適当な配列の合成ＤＮＡを利用すればよい。
【００８７】
また、生産量を増大させるためには、融合タンパク遺伝子の下流に転写終結配列であるターミネーターを連結することが好ましい。このターミネータとしては、Ｔ７ターミネータ、ｆｄファージターミネータ、Ｔ４ターミネータ、テトラサイクリン耐性遺伝子のターミネータ、大腸菌ｔｒｐＡ遺伝子のターミネータ等が挙げられる。
【００８８】
ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝子を大腸菌に導入するためのベクターとしては、いわゆるマルチコピー型のものが好ましく、ＣｏｌＥ１由来の複製開始点を有するプラスミド、例えばｐＵＣ系のプラスミドやｐＢＲ３２２系のプラスミドあるいはその誘導体が挙げられる。ここで、「誘導体」とは、塩基の置換、欠失、挿入、付加または逆位などによってプラスミドに改変を施したものを意味する。なお、ここでいう改変とは、変異剤やＵＶ照射などによる変異処理、あるいは自然変異などによる改変をも含む。
【００８９】
また、形質転換体を選別するために、該ベクターがアンピシリン耐性遺伝子等のマーカーを有することが好ましい。このようなプラスミドとして、強力なプロモーターを持つ発現ベクターが市販されている（ｐＵＣ系（宝酒造（株）製）、ｐＰＲＯＫ系（クローンテック製）、ｐＫＫ２３３−２（クローンテック製）ほか）。
【００９０】
プロモータ、ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパクとの融合タンパクをコードする遺伝子、ターミネータの順に連結したＤＮＡ断片と、ベクターＤＮＡとを連結して組み換えＤＮＡを得る。
【００９１】
該組み換えＤＮＡを用いて大腸菌を形質転換し、この大腸菌を培養すると、ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパクとの融合タンパクが発現生産される。
形質転換される宿主は、異種遺伝子の発現に通常用いられる株を使用することができるが、エシェリヒア コリ ＪＭ１０９株，特にＪＭ１０９（ＤＥ３）株が好ましい。形質転換を行う方法、および形質転換体を選別する方法はMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)等に記載されている。
【００９２】
融合タンパクとして発現させた場合、血液凝固因子Ｘａ、カリクレインなどの、ＨＲａｓｅ内に存在しない配列を認識配列とする制限プロテアーゼを用いてＨＲａｓｅを切り出せるようにしてもよい。
【００９３】
生産培地としては、Ｍ９−カザミノ酸培地、ＬＢ培地など、大腸菌を培養するために通常用いる培地を用いてもよい。また、培養条件、生産誘導条件は、用いたベクターのマーカー、プロモータ、宿主菌等の種類に応じて適宜選択する。
【００９４】
ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅと他のタンパクとの融合タンパクを回収するには、以下の方法などがある。ＨＲａｓｅあるいはその融合タンパク質が菌体内に可溶化されていれば、菌体を回収した後、菌体を破砕あるいは溶菌させ、粗酵素液として使用できる。さらに、必要に応じて、通常の沈澱、濾過、カラムクロマトグラフィー等の手法によりＨＲａｓｅあるいはその融合タンパク質を精製して用いることも可能である。この場合、ＨＲａｓｅあるいは融合タンパク質の抗体を利用した精製法も利用できる。
【００９５】
タンパク封入体が形成される場合には、変性剤でこれを可溶化する。菌体タンパクとともに可溶化してもよいが、以降の精製操作を考慮すると、封入体を取り出して、これを可溶化するのが好ましい。封入体を菌体から回収するには、従来公知の方法で行えばよい。例えば、菌体を破壊し、遠心分離操作等によって封入体を回収する。タンパク封入体を可溶化させる変性剤としては、グアニジン塩酸（例えば、６Ｍ、ｐＨ５〜８）や尿素（例えば８Ｍ）などが挙げられる。
【００９６】
これらの変性剤を透析等により除くと、活性を有するタンパクとして再生される。透析に用いる透析溶液としては、トリス塩酸緩衝液やリン酸緩衝液などを用いればよく、濃度としては２０ｍＭ〜０．５Ｍ、ｐＨとしては５〜８が挙げられる。
【００９７】
再生工程時のタンパク濃度は、５００μｇ／ｍｌ程度以下に抑えるのが好ましい。再生したＨＲａｓｅが自己架橋を行うのを抑えるために、透析温度は５℃以下であることが好ましい。また、変性剤除去の方法として、この透析法のほか、希釈法、限外濾過法などがあり、いずれを用いても活性の再生が期待できる。
【００９８】
ＨＲａｓｅをコードするＤＮＡとして、配列表配列番号１に示されるＤＮＡを用いた場合には配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅが生産される。
【００９９】
[II] ＨＲａｓｅを用いた光学活性アミノ酸の製法
次に、本発明のＨＲａｓｅを用いて、５置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造する方法について述べる。
【０１００】
光学活性アミノ酸製造反応に用いる本発明のＨＲａｓｅとしては、下記(a)または(b)のアミノ酸配列を有し、ヒダントインラセマーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
（a）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列
（b）配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列において1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、付加または逆位を含むアミノ酸配列
【０１０１】
上記ＨＲａｓｅとしては、（１）マイクロバクテリウム属細菌を培養して得たＨＲａｓｅを用いても良いし、（２）組み換えＤＮＡ技術によりマイクロバクテリウム属細菌由来のＨＲａｓｅを生成する形質転換体を作成し、当該形質転換体を培養して得たＨＲａｓｅを用いても良い。
【０１０２】
マイクロバクテリウム属細菌または組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を用いて、ＨＲａｓｅを製造する場合、培養しながら、培養液中に直接基質を添加してもよいし、培養液より分離された菌体、洗浄菌体などいずれも使用可能である。また、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物をそのまま用いてもよいし、当該菌体処理物からＨＲａｓｅを回収し、粗酵素液として使用してもよいし、さらに、酵素を精製して用いてもよい。すなわち、ＨＲａｓｅ活性を有する画分であれば、酵素と当該酵素含有物全てを使用することが可能である。ここで「酵素含有物」とは、当該酵素を含むものであればよく、具体的には培養物、培養菌体、洗浄菌体、菌体を破砕あるいは溶菌させた菌体処理物、粗酵素液、精製酵素などを含む。
【０１０３】
本発明の光学活性アミノ酸の製造方法においては、本発明のＨＲａｓｅの他、▲１▼５置換ヒダントイン化合物に作用し、当該物質を加水分解することによりＮ−カルバミルアミノ酸を生成する反応を触媒するヒダントイナーゼ（ＨＨａｓｅ）、
▲２▼生成したＮ−カルバミルアミノ酸に作用し、当該物質を加水分解することにより光学活性アミノ酸を生成する反応を触媒するＮ−カルバミルアミノ酸ハイドロラーゼ（ＣＨａｓｅ）
の２つの酵素が必要である。
【０１０４】
ここで、５置換ヒダントイン化合物を加水分解するＨＨａｓｅの光学選択性が高い場合には、光学選択性の高いＨＨａｓｅと本発明のＨＲａｓｅとを５置換ヒダントイン化合物に作用させることにより、高収率（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）で光学活性のＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸またはＮ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸の一方のみを生成させることができる。この場合は、引き続きＣＨａｓｅまたは当該酵素含有物を用いて光学活性アミノ酸を製造しても良いし、亜硝酸による化学的な加水分解処理を施すことにより、光学活性を維持したまま、高収率で光学活性アミノ酸を製造できる（微生物酵素系と化学反応系との組み合わせによる方法）。
【０１０５】
５置換ヒダントイン化合物を光学選択的に加水分解するＨＨａｓｅは次のようにして入手できる。たとえば、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸を生成するＤ−ＨＨａｓｅを有する菌としては、バチルス属細菌に耐熱性の酵素の存在が知られており、例としてバチルス ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)ＡＴＣＣ３１１９５等からＨＨａｓｅまたは、ＨＨａｓｅ含有画分を調製すれば良い(Appl.Microbiol. Biotechnol.４３巻 ２７０ページ、１９９５年)。
ＡＴＣＣ３１１９５株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（American Type Culture Collection、住所12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America）から入手することができる。また、Ｌ体ヒダントイン化合物に特異的に作用するＬ−ＨＨａｓｅは、例えばバチルスエスピー（Bacillus sp.）ＡＪ１２２９９株にその存在が知られている（特開昭６３−２４８９４号公報）。バチルス エスピー ＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-７６４６が付与された微生物である。
【０１０６】
ＨＨａｓｅに光学選択的加水分解活性がなくとも、ＣＨａｓｅに光学選択性があれば、生成アミノ酸はＤ−もしくはＬ−の光学活性体となる。この場合、反応液中には未反応のエナンチオマーであるＮ−カルバミルアミノ酸、すなわちＣＨａｓｅがＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸を選択的に分解し、Ｌ−アミノ酸を生成させる場合には、Ｎ−カルバミル−Ｄ−アミノ酸が、また逆にＤ−アミノ酸を生成させる場合には、Ｎ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸が残存することが想定される。しかしながら、このような場合においてＨＨａｓｅは、残存することになる未反応エナンチオマーのＮ−カルバミルアミノ酸を脱水縮合させ、再度５置換ヒダントイン化合物を生成させる逆反応をもわずかながら触媒するので、ＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅ、光学選択性の高いＣＨａｓｅの３種の酵素、もしくは３種の酵素含有物により、高収率（ＨＲａｓｅの作用によりモル収率５０％以上）で光学活性アミノ酸を製造することが可能となる。
【０１０７】
光学選択性のないＨＨａｓｅは、本発明に示したマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株のほか、例えばアースロバクター オーレセンス（Arthrobacter aurescens）にその存在が知られている（J.Biotechnol.６１巻、１ページ、１９９８年）。
【０１０８】
Ｎ−カルバミルアミノ酸をＤ体選択的に加水分解するＣＨａｓｅは、たとえばシュードモナス（Pseudomonas sp. ）ＡＪ １１２２０株にその存在が知られている(特公昭５６−００３０３４号公報)。再同定の結果、シュードモナス（Pseudomonas sp. ）ＡＪ １１２２０株は、アグロバクテリウム エスピー（Agrobacterium sp. ）に属することが判明している。アグロバクテリウム エスピー ＡＪ １１２２０株は１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-７６４５が付与された微生物である。またＮ−カルバミルアミノ酸をＬ体選択的に加水分解するＣＨａｓｅは、たとえばフラボバクテリウム エスピー.（Flavobacterium sp.）ＡＪ３９１２ (特公昭５６−００８７４９号公報)、バチルス エスピー.(Bacillus sp.)ＡＪ１２２９９にその存在が知られている。フラボバクテリウム エスピー. ＡＪ３９１２株は、上述の通り現在ではマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）に分類されているが、１９７５年６月２７日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-７６４３が付与された微生物である。またバチルス エスピーＡＪ１２２９９株は、１９８６年７月５日に、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ８８３７が付与され、２００１年６月２７日に独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにブタペスト条約に基づき移管され、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ-７６４６が付与された微生物である。
【０１０９】
ＨＲａｓｅまたはＨＲａｓｅ含有画分の基質としては、当該酵素の基質特異性においてラセミ化できる５置換ヒダントイン化合物であれば、いかなるものも使用できる。５置換ヒダントイン化合物の例としては、５−インドリルメチルヒダントイン、５−（ｐ−ハイドロキシベンジル）ヒダントイン、５−イソブチルヒダントイン、５−（３’−ピリジル）−メチルヒダントイン等が挙げられる。
【０１１０】
なお、好ましいＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅの組み合わせとして、
配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅ、
配列表配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＨＨａｓｅ、
配列表配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＨａｓｅ
の組み合わせが挙げられる。これらの酵素いずれも、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens）ＡＪ３９１２株由来の酵素である。
【０１１１】
配列表配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＨＲａｓｅ、配列表配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するＨＨａｓｅおよび配列表配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するＣＨａｓｅを組み合わせて用いる場合、これらのＬ−アミノ酸の製造に係わるタンパク質のすべてをコードする配列表の配列番号７に記載の構造遺伝子群とベクターとが接続されて得られる組み換えＤＮＡを用いて形質転換された細胞を培養することによって得られたＨＲａｓｅ、ＨＨａｓｅおよびＣＨａｓｅからなる混成タンパク質を用いることもできる。当該混成タンパク質を用いた場合、下記反応式（II）に示すように、混成タンパク質に含まれるヒダントンラセマーゼが５置換ヒダントイン化合物のラセミ化を触媒するので、ＤＬ体の５置換ヒダントイン化合物から理論的にはモル収率１００％でＬ−アミノ酸を製造することが可能となる。
【０１１２】
【化３】

【０１１３】
なお、上記混成タンパク質を用いてＮ−カルバミルアミノ酸を製造することも可能である。例えば、上記混成タンパク質にＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼの阻害剤等を添加して加水分解反応をＮ−カルバミルアミノ酸で止めることにより、Ｎ−カルバミルアミノ酸を製造できる。
【０１１４】
マイクロバクテリウム属細菌または組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞の培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、当該菌体処理物から得られる粗酵素液または精製酵素を用いてアミノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物と培養液、分離菌体、洗浄菌体、菌体処理物、粗酵素液、または精製酵素を含む反応液を２５〜４０℃の適当な温度に調整し、ｐＨ５〜９に保ちつつ、８時間〜５日静置または攪拌すればよい。
【０１１５】
また、マイクロバクテリウム属細菌または組み換えＤＮＡによって形質転換された細胞を水溶性媒体中で培養しながら、アミノ酸生成反応を進行させる場合には、５置換ヒダントイン化合物を含み、かつ形質転換された細胞の生育に必要な炭素源、窒素源、無機イオンなどの栄養素を含む水溶性媒体が用いられる。さらにビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素を添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。５置換ヒダントイン化合物は分割添加してもよい。好気的条件下でｐＨ５〜９、温度２５〜４０℃の適当な範囲に制御しつつ、８時間〜５日培養することが好ましい。
【０１１６】
生成したアミノ酸は、公知の手法により分離精製することができる。例えば、イオン交換樹脂に接触させて塩基性アミノ酸を吸着させ、これを溶離後晶析する方法または溶離後、活性炭等による脱色濾過し晶析する方法等が挙げられる。
【０１１７】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに説明する。尚、本発明は実施例の記載に限定されない。
【０１１８】
（実施例１）ＨＲａｓｅの生産および精製
マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）を培養し、充分にＨＲａｓｅ活性を有する菌体を得た。
まずＣＭ２Ｇ寒天培地（０．５ｇ／ｄｌ Ｄ−glucose, １ｇ／ｄｌ yeast extract, １ｇ／ｄｌ peptone, ０．５ｇ／ｄｌ ＮａＣｌ, ２ｇ／ｄｌ agar, ｐＨ７．０）にて、３０℃、２４時間リフレッシュ後、ＣＭ２Ｇ液体培地で３０℃、２４時間シード培養を行った。
【０１１９】
その後、１ｍｌのシード培養液をメイン培養培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ容の坂口フラスコに接種後、３０℃、１８時間振盪培養した。メイン培養の培地は０．５ｇ／ｄｌＤ−glucose, ０．５ｇ／ｄｌ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄, １ｇ／ｄｌ yeast extract, １ｇ／ｄｌ peptone, ０．１ｇ／ｄｌ ＫＨ₂ＰＯ₄, ０．３ｇ／ｄｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄, ０．０１ｇ／ｄｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ, ０．３５ｇ／ｄｌ ＤＬ−５−インドリルメチルヒダントイン（ＩＭＨ）, ｐＨ７．０を１２０℃、２０分オートクレーブ後、各１ｍｇ／ｄｌのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ＭｎＳＯ₄・４〜５Ｈ₂Ｏ、ＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏを添加し、更に４℃で静置することによりＩＭＨを十分に析出させた後に使用した。
培養終了後は、遠心分離により集菌し、０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ７．０)で洗浄し、洗浄菌体を得た。
こうして得られた菌体をＨＲａｓｅを精製するための材料として用いた。
【０１２０】
１．菌体破砕
洗浄菌体６６ｇ（培養液３．７Ｌ相当）を出発原料とし、この菌体を１３０ｍｌの０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ７．０)に懸濁後、０．１ｍｍφ glass beadsとともに３分（３０秒×６回、９０秒インターバル）ビーズビーターにて破砕した。溶液を回収し、終濃度５μg/ｍｌのＤＮａｓｅＩによって室温で２０分間処理した。その後、１３，０００ｇ×１０分の遠心分離操作により未破砕細胞を除去し、更に１００，０００ｇ×６０分の超遠心分離操作によって膜画分を取り除き、上清を無細胞抽出液とした。
【０１２１】
２．硫安分画
上記無細胞抽出液１２５ｍｌに終濃度７０％飽和となるよう、５９ｇの硫安を添加し、ＫＯＨでｐＨを７．０に調整した後、５℃で６０分攪拌した。１３，０００ｇ×１５分の遠心分離操作により沈澱を回収し、少量の２０ｍＭＫＰＢ (ｐＨ ７．０)で溶解した後、１．２Ｍ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄, ２０ｍＭ ＫＰＢ, ０．５ｍＭＣｏＣｌ₂, ｐＨ ７．０（; Buffer A）に対して透析した。透析後、１３，０００ g×３０ 分の遠心分離操作を行い、得られた上清４０ mlを以下の精製に用いた。
【０１２２】
３．疎水性クロマトグラフィー
得られた酵素溶液を、予めBuffer Aで平衡化した疎水性クロマトグラフィーカラムPhenyl Sepharose HP 26/10 (Pharmacia)に供した。Buffer Aで非吸着タンパク質を溶出した後、１．２〜０Ｍの直線的硫安濃度勾配（−１．２Ｍ ／１２ＣＶ）により吸着タンパク質を溶出した。溶出フラクションのＨＲａｓｅ活性を測定したところ、硫安濃度がおよそ５００ｍＭから１００ｍＭの溶出位置に活性が認められた。ＨＲａｓｅ活性を含むフラクションを回収、膜濃縮後、２０ｍＭＫＰＢ (ｐＨ７．０)に対して透析した。
【０１２３】
４．陰イオン交換クロマトグラフィー
得られた酵素溶液を、予め２０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ７．０)で平衡化した陰イオン交換クロマトグラフィーカラムQ-Sepharose HP 16/10 (Pharmacia)に供した。
２０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ７．０)で非吸着タンパク質を溶出した後、０〜０．５Ｍの直線的ＮａＣｌ濃度勾配（０．５Ｍ /１２ＣＶ）により吸着タンパク質を溶出した。溶出フラクションのＨＲａｓｅ活性を測定しところ、ＮａＣｌ濃度がおよそ３００ｍＭから４００ｍＭの溶出位置に活性が認められた。ＨＲａｓｅ活性を含むフラクションを回収、膜濃縮した。
【０１２４】
５．ゲル濾過
得られた酵素溶液を、予め２０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ７．０)で平衡化したSuperdex 200 pg 16/60 (Pharmacia)に供し、同bufferにて展開した。溶出フラクションのＨＲａｓｅ活性を測定したところ、分子量が約１０７，００００程度と見積もられる位置に活性が認められた。ＨＲａｓｅ活性を含むフラクションを回収、膜濃縮後、１．０Ｍ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄, ２０ ｍＭ ＫＰＢ, １ｍＭ Ｌ−ベンジルヒダントイン（ＢＨ）, ｐＨ７．０ (; Buffer B)に対して透析した。
【０１２５】
６．疎水性クロマトグラフィー
得られた酵素溶液を、Buffer Bで平衡化したPhenyl Superose 5/5 (Pharmacia)に供した。非吸着タンパク質をBuffer Bで溶出した後、１．２〜０Ｍの直線的硫安濃度勾配（−１．２Ｍ／１７ＣＶ）により吸着タンパク質を溶出した。溶出フラクションのＨＲａｓｅ活性を測定し、ＨＲａｓｅ活性を含むフラクションを回収、膜濃縮した。
この後、このPhenyl Superoseによる精製行程を、Ｌ−ＢＨを含まないbuffer系で一度行った後、Ｌ−ＢＨを加えたbuffer系で更にもう一度行った。
以上の操作で得られた酵素溶液を、精製ＨＲａｓｅ溶液として使用した。
【０１２６】
上記精製を行った結果の比活性の上昇を測定した。前出の菌体破砕後の無細胞抽出液、および精製により得られた活性画分のＨＲａｓｅ活性を測定した結果、この一連の精製操作により、単位タンパク質重量あたりの比活性は６５８倍に上昇したことがわかった。なお、後述する活性測定法においては、精製したＨＲａｓｅの比活性は、７９Ｕ／ｍｇと見積もられた。
【０１２７】
得られた活性画分を定法に従い、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、クマジーブリリアントブルー染色したところ、ＨＲａｓｅは、１本のバンドになるまでに精製されていることが確認され、その分子量は２７，０００と見積もられた。ゲル濾過の結果とあわせ、本ＨＲａｓｅは、分子量は２７，０００のサブユニット４量体構造をとることが想定された。
【０１２８】
７．Ｎ末端付近のアミノ酸配列の決定
上記のように精製されたＨＲａｓｅのＮ末端付近の配列を以下のようにして決定した。
即ち、精製されたＨＲａｓｅ画分のうち、タンパク質量約１０μｇ分をＳＤＳ存在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ミリポア社ミリブロットを用い、セミドライ方式（タンパク質構造解析、平野久著、東京化学同人）によって電気泳動後のゲルからポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ（Bio-Rad、Trans-Blot））膜に目的酵素を転写した。続いて、ＰＶＤＦ膜上の目的酵素をプロテインシーケンサー（ABI社製、モデル476A）に供し、Ｎ末端アミノ酸配列解析を行った。
【０１２９】
Ｎ末端から３０残基のアミノ酸配列を決定した。決定されたＨＲａｓｅのＮ末端付近のアミノ酸配列を配列表の配列番号８に示した。
【０１３０】
（実施例２）：ｐＨのＨＲａｓｅへの効果
反応ｐＨによる酵素活性の変化（至適ｐＨ）を以下の方法で測定した。
０．３μｇ／ｍｌの精製ＨＲａｓｅを用い、０．１Ｍのsodium acetate buffer (ｐＨ ３．１， ３．９， ４．９， ６．１)、ＫＰＢ (ｐＨ６．４， ７．２， ８．０)、あるいはsodium carbonate buffer (ｐＨ ８．２， ９．１， １０．２， １０．９)の存在下で３７℃、３０分間反応を行い、ＨＲａｓｅの反応至適ｐＨを測定した。
【０１３１】
測定結果は、それぞれの反応溶液の実測のｐＨに対する酵素活性の相対値の形で示した。便宜上、最も高い活性を１００とした。測定結果は図３に示した。
【０１３２】
本発明のＨＲａｓｅの至適ｐＨは約７〜約９、厳密には約ｐＨ８．０〜９．０の範囲であることが分かった（図３参照）。
【０１３３】
（実施例３）：ＨＲａｓｅのｐＨ安定性
３．０μｇ／ｍｌの精製ＨＲａｓｅを上述の０．１ Ｍの各ｐＨ Buffer存在下で０℃、３０分静置した後、ｐＨを８．０に調整し、ｐＨ８．０、３７℃で３０分反応を行い、残存する活性を測定することによりＨＲａｓｅのｐＨ安定性を測定した。
【０１３４】
測定結果は、各ｐＨでの前処理に対する酵素活性の相対値の形で示した。便宜上、最も高い活性を１００とした。測定結果を図４に示した。
【０１３５】
本発明のＨＲａｓｅは、約ｐＨ６〜９の範囲において安定であることがわかった（図４参照）。
【０１３６】
（実施例４）：温度のＨＲａｓｅへの効果
０．３μｇ／ｍｌの精製ＨＲａｓｅを用い、０，２１，３０，４０，５０，６０，７０および８０℃においてｐＨ８．０で３０分間反応を行い、ＨＲａｓｅの作用至適温度を測定した。
【０１３７】
測定結果は、それぞれの反応溶液の実測の温度に対する酵素活性の相対値の形で示した。便宜上、最も高い活性を１００とした。測定結果は図５に示した。
【０１３８】
本発明のＨＲａｓｅの至適温度は、５０〜６０℃の範囲内であることが分かった（図５参照）。この反応の至適温度は、従来知られているＨＲａｓｅの中で、最も高いものである。
【０１３９】
（実施例５）：ＨＲａｓｅの温度安定性
３．０μg/mlの精製ＨＲａｓｅをｐＨ８．０で０， ２１， ３０， ４０， ５０， ６０， ７０および８０℃において３０分静置した後、ｐＨ８．０、３７℃で３０分間反応を行い、残存する活性を測定することによりＨＲａｓｅの温度安定性を測定した。
【０１４０】
測定結果は、各温度での前処理に対する酵素活性の相対値の形で示した。便宜上、最も高い活性を１００とした。測定結果を図６に示した。
【０１４１】
本発明のＨＲａｓｅは、４０℃以下の範囲において安定であることがわかった（図６参照）。
【０１４２】
（実施例６）：ＨＲａｓｅ活性に対する酵素阻害剤等各種試薬の効果
１．５μｇ／ｍｌの精製ＨＲａｓｅを、２５ｍＭ ＤＴＴ、２５ｍＭ Ｎ−ethylmaleimide (ＮＥＭ)、１２．５ｍＭ ＣｕＳＯ₄、５０ｍＭモノヨード酢酸(ＩＡＡ)、５０ｍＭ ＥＤＴＡ、あるいは５０％ (v/v) methanolと共にｐＨ８．０、０℃で３０分間プレインキュベートした。これらを酵素源としてｐＨ８．０、３０℃で３０分間反応を行って残存活性を測定し、ＨＲａｓｅの各阻害剤に対する感受性を測定した。なお、反応時の酵素濃度および阻害剤濃度は、プレインキュベート時のそれぞれ５分の１となる。
【０１４３】
残存活性を、試薬無添加時の活性を１００％とした場合の相対活性で示した（表２参照）。本発明のＨＲａｓｅはＤＴＴの添加により活性化され（結果未表示）、また、ＮＥＭ、ヨード酢酸、あるいはＣｕ²⁺といったシステイン残基修飾試薬によって著しく阻害され、活性発現に対するシステイン残基の寄与が考えられた。ＥＤＴＡの添加によっては有意な阻害効果は見られなかったため、ＨＲａｓｅの活性発現に２価イオンは必要でないと考えられた。また、５０％ (v/v)のメタノールのプレインキュベートもＨＲａｓｅ活性には影響を与えなかった（表２）。
【０１４４】
【表２】

【０１４５】
（実施例７）：精製ＨＲａｓｅによるＢＨのラセミ化
０．３ｍｇ／ｍｌ 精製ＨＲａｓｅ、 ０．１２ｇ／ｄｌ Ｄ− or Ｌ−ＢＨ、５０ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ８．０)、 ５ｍＭ ＤＴＴを含む反応液を３７℃でインキュベートし、経時的にサンプリングを行いＢＨ量をＨＰＬＣにて定量した。対照として、酵素を含まない実験区でも同様の実験を行い、ＢＨの自発的ラセミ化を定量した。その結果を図７に示した。
【０１４６】
本発明のＨＲａｓｅはＤ−ＢＨ、Ｌ−ＢＨのいずれをも基質認識し、どちらからスタートした場合でも、Ｄ、Ｌ体比１：１になるまで反応が進行した。しかしラセミ化反応の反応初速度はＬ−ＢＨをスタート基質とした場合の方が早く、反応初速度から計算される精製ＨＲａｓｅの比活性は、Ｌ−ＢＨからＤ−ＢＨを生成する場合で１００Ｕ／ｍｇ、Ｄ−ＢＨからＬ−ＢＨを生成する場合で７９Ｕ／ｍｇとそれぞれ見積もられた（図７参照）。
【０１４７】
一方、ＨＲａｓｅを添加しない対照区でも自発的なＢＨのラセミ化が観察されたが、ＨＲａｓｅによって触媒されるラセミ化に比べ、著しく遅いものであった（図７参照）。
【０１４８】
（実施例８）：アグロバクテリウム エスピー（Agrobacterim sp. ）ＡＪ１１２２０株とＨＲａｓｅの組合わせによるＤＬ−ＢＨ、またはＬ−ＢＨからのＤ−Ｐｈｅ生産
アグロバクテリウム エスピーＡＪ１１２２０株は１９７７年１２月２０日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託され、受託番号ＦＥＲＭ−Ｐ４３４７が付与された微生物である。当該株は、Ｄ体の５置換ヒダントイン化合物を加水分解し、対応するＤ−アミノ酸を生成することが知られている（Agric.Biol.Chem.５１巻、７２１ページ、１９８７年）。ところがＡＪ１１２２０株は、ヒダントインラセマーゼを有しないことから、ヒダントイン化合物が自発的にラセミ化しない場合、Ｌ体の５置換ヒダントイン化合物からはＤ体アミノ酸は生成しないことから、化学合成により安価に調製できるＤＬ−５置換ヒダントイン化合物からの対応するＤ−アミノ酸の生成モル収率は最大でも５０％となる。
そこで、自発的にラセミ化しにくいＢＨを基質に、ＡＪ１１２２０菌体と精製ＨＲａｓｅの組合わせによるＤ−Ｐｈｅ生産の検討を行った。
【０１４９】
１．ＡＪ １１２２０株の培養
ＣＭ２Ｇ寒天培地（０．５ｇ／ｄｌ Ｄ−glucose, １ｇ／ｄｌ yeast extract,
１ｇ／ｄｌ peptone, ０．５ｇ／ｄｌ ＮａＣｌ, ２ｇ／ｄｌ agar, ｐＨ７．０）にて、３０℃、２４時間リフレッシュ後、ＣＭ２Ｇ液体培地で３０℃、２４時間シード培養を行った。
メイン培養の培地は０．５ｇ／ｄｌ Ｄ−glucose， ０．５ｇ／ｄｌ (ＮＨ₄)₂ＳＯ₄, １ｇ／ｄｌ yeast extract, ０．１ｇ／ｄｌ ＫＨ₂ＰＯ₄, ０．３ｇ／ｄｌ Ｋ₂ＨＰＯ₄, ０．０１ｇ／ｄｌ ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ, ｐＨ７．０を１２０℃、２０ 分オートクレーブ後、各１ｍｇ／ｄｌのＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ、ＭｎＳＯ₄・４〜５Ｈ₂Ｏおよび２ｇ／ｄｌのＣａＣＯ₃を添加し使用した。このメイン培養培地５０ｍｌを５００ｍｌ容の坂口フラスコに張り込み、１ｍｌのシード培養液を接種後、３０℃、２２時間振盪培養した。酵素の誘導のため、メイン培養開始後１４時間後に終濃度２ｇ／ｄｌＤ−glucose, ０．２ｇ／ｄｌ ＤＬ−ＢＨを、同１６、１８ 時間後に終濃度０．２ｇ／ｄｌ ＤＬ−ＢＨを添加した。
培養終了後は、遠心分離操作（１０，０００×ｇ、４℃、１０分間）により集菌し、０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ７．０)で洗浄し、洗浄菌体を得た。
【０１５０】
２．ＡＪ １１２２０株とＨＲａｓｅの組合わせによるＤＬ−ＢＨまたはＬ−ＢＨからのＤ−Ｐｈｅ生産
０．５ｇ／ｄｌ (２６ｍＭ) ＤＬ−ＢＨまたはＬ−ＢＨを、０．８４μｇ／ｍｌ精製ＨＲａｓｅ、０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ８．０)、０．５ｍＭ ＣｏＣｌ₂および２ｇ／ｄｌのＡＪ１１２２０株湿菌体とともに３０℃で静置反応させた。反応液は、窒素置換により反応液中の酸素をあらかじめ除去した。反応液を経時的にサンプリングし、ＨＰＬＣで解析することにより生成Ｄ−Ｐｈｅを定量した。
【０１５１】
Ｄ−Ｐｈｅ生成のタイムコースを図８に示した。ＨＲａｓｅを添加しない場合、対照となるＤ−ＢＨを同様に基質とした場合、３０時間反応で、ほぼ基質のすべてがＤ−Ｐｈｅに変換された（生成量２５．４ｍＭ、モル収率９８％、図８の□）。ところがＤＬ−ＢＨからのＤ−Ｐｈｅの生成量は、最大で１２．９ｍＭ（反応２２時間、モル収率４９％、図８の○）となり、Ｌ−ＢＨからでは１．５ｍＭの生成に留まった（反応３０時間、モル収率６％、図８の△）。ＤＬ−ＢＨを基質とした場合のＤ−Ｐｈｅ生成量がＤ−ＢＨを基質とした場合のおよそ半分であること、Ｌ−ＢＨを基質とした場合にはほとんどＤ−Ｐｈｅが生成しなかったことから、本反応系ではＢＨからのＤ−Ｐｈｅ生成の律速反応は、Ｌ−ＢＨからＤ−ＢＨへのラセミ化反応であると考えられた。
【０１５２】
一方、ＨＲａｓｅを添加した場合には、反応３０時間後に、ＤＬ−ＢＨからは２４．６ｍＭ（モル収率９４％）のＤ−Ｐｈｅ（図８の黒□）が、またＬ−ＢＨからでも同様に２４．６ｍＭ（モル収率９４％）のＤ−Ｐｈｅ（図８の黒△）が生成することが観察された。これらの値はＤ−ＢＨを基質とした場合とほぼ同量であり、ＨＲａｓｅの添加によりＬ−ＢＨからＤ−ＢＨへのラセミ化反応の律速がほぼ完全に解除されていると考えられた。
【０１５３】
上述のことから、ＤＬ−またはＬ−５置換ヒダントイン化合物をＤ体選択的加水分解反応系に作用させ、対応するＤ−アミノ酸を生成させる際、基質として用いる５置換ヒダントイン化合物に自発的ラセミ化能がない、もしくは弱い場合には、Ｌ−５置換ヒダントイン化合物は、加水分解を受けないことから未反応のまま反応液に残存することになるが、これにＨＲａｓｅを組み合わせるにより、基質全量が効率的に加水分解され高収率でＤ−アミノ酸を生成させることができる。
【０１５４】
当然のことながら、同様に５置換ヒダントイン化合物をＬ体選択的加水分解反応系に作用させ、対応するＬ−アミノ酸を生成させる際にも、ＨＲａｓｅを組み合わせることにより、基質全量が効率的に加水分解され高収率でＬ−アミノ酸を生成させることができる。
【０１５５】
（実施例９）：ＢＨ以外の各種光学活性５置換ヒダントイン化合物のラセミ化
本ＨＲａｓｅのＢＨ以外の光学活性５置換ヒダントイン化合物に対するラセミ化触媒能を検討した。実施例８と同様にアグロバクテリウム エスピーＡＪ １１２２０株とＨＲａｓｅの組合わせによるＬ−５置換ヒダントインからのＤ−アミノ酸の生成を確認する方法によった。
【０１５６】
１ｇ／ｄｌの各種５置換ヒダントインを１．３μｇ／ｍｌ 精製ＨＲａｓｅ、０．１Ｍ ＫＰＢ (ｐＨ ８．０)、０．５ｍＭ ＣｏＣｌ₂および２ｇ／ｄｌのＡＪ１１２２０株湿菌体とともに３７℃で２２時間静置反応させた。基質はＤ体、Ｌ体でそれぞれ反応を行い、ＨＲａｓｅ非存在下でＤ体基質から対応するＤ−アミノ酸が生成すること、Ｌ体基質からは対応するＤ−アミノ酸が生成しないことを確認した上で、ＨＲａｓｅ存在下でＬ体基質からＤ−アミノ酸の生成が見られた場合に基質認識されたと判断した。Ｄ−アミノ酸の生成は、光学分割ＴＬＣ（MERCK、HPTLC CHIR）をメタノール：Ｈ₂Ｏ：アセトニトリル＝１：１：４で展開することにより、定性的に見積もった。
【０１５７】
その結果、ＨＲａｓｅがＬ−５−インドリルメチルヒダントイン、Ｌ−５−(ｐ−ハイドロキシベンジル)ヒダントイン、Ｌ−５−イソブチルヒダントインをラセミ化し、各々対応するＤ−トリプトファン、Ｄ−チロシン、Ｄ−ロイシンの生成を認めた。
【０１５８】
（実施例１０）：ＨＲａｓｅ遺伝子の単離
以下、ＨＲａｓｅ遺伝子の単離とＥ．ＣｏｌｉでのＨＲａｓｅの発現について述べるが、使用菌株は、マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）株を用いた。遺伝子の単離、ＨＲａｓｅの発現とも、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＪＭ１０９を宿主に用い、ベクターはｐＵＣ１８を用いた。
【０１５９】
１．決定アミノ酸配列に基づいたＰＣＲ プライマーの作成
前述のマイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）株由来のＨＲａｓｅのＮ末端アミノ酸配列（配列表配列番号８）をもとに、配列表配列番号９、１０にそれぞれ示すミックスプライマーを作成した。
【０１６０】
２．菌体の取得
マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）株をＣＭ２Ｇ寒天培地（０．５ｇ／ｄｌ グルコース、 １．０ｇ／ｄｌ yeast extract、１．０ｇ／ｄｌ Peptone、０．５ｇ／ｄｌ ＮａＣｌ、２ｇ／ｄｌ 寒天、ｐＨ７．０）上で３０℃、２４ 時間培養し菌をリフレッシュした。これを５０ｍｌのＣＭ２Ｇ液体培地を張り込んだ５００ｍｌの坂口フラスコに１白金耳植菌し、３０℃、１６時間好気的に振とう培養した。
【０１６１】
３．菌体からの染色体ＤＮＡの取得
培養液５０ｍｌを遠心分離操作（１２，０００ｘｇ、４℃、１５分間）に供し、集菌した。この菌体を１０ｍｌの５０:２０ＴＥ（５０ｍＭ Tris-HCl，ｐＨ ８．０，２０ｍＭＥＤＴＡ）に懸濁し、洗浄し、遠心分離操作により、菌体を回収した。再び、この菌体を１０ｍｌ ５０:２０ ＴＥに懸濁した。さらに、この懸濁液に、０．５ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液、１ｍｌの１０％ＳＤＳ溶液を加えた後、５５℃で２０分間インキュベートした。インキュベート後、１倍容の１０:１ＴＥ飽和のフェノールを加えて除タンパクを行った。分離した水層に対して、１倍容の２−プロパノールを加えて、ＤＮＡを沈澱させ、回収した。沈澱したＤＮＡを０．５ｍｌ５０:２０ ＴＥに溶解した後、５μｌの１０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ、５μlの１０ｍｇ／ｍｌ ProteinaseＫを加えて、５５℃で２時間反応させた。反応後、１倍容の１０:１ＴＥ飽和のフェノールで除タンパクを行った。さらに、分離した水層に対して、１倍容の２４:１ クロロホルム／イソアミルアルコールを加えて攪拌し、水層を回収した。この操作をさらに２回行った後に得られた水層に、終濃度０．４Ｍとなるように3M酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を加え、さらに２倍容のエタノールを加えた。沈澱となって生じたＤＮＡを回収し、７０％エタノールで洗浄した後、乾燥させ、１ｍｌの１０:１ ＴＥに溶解させた。
【０１６２】
４．カセットＰＣＲ法によるＨＲａｓｅ遺伝子の一部を含むＤＮＡ断片の取得
カセットＰＣＲ法によるＨＲａｓｅをコードする遺伝子（ｆｈｒ）を含むＤＮＡ分子の単離・増幅には、TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit（宝酒造社製）を用いた。以下断わりの無い限り、説明書の方法に基づき実験を行った。カセットＰＣＲ法において、プライマー 1 (１ｓｔ ＰＣＲ)とプライマー２(２ｎｄＰＣＲ)をプライマーとした場合に、Ｈｉｎｄ ＩＩＩカセットとの間で約０．４ｋｂのバンド（フラグメント １）が増幅した。この断片の塩基配列を決定することにより、フラグメント １がｆｈｒの一部分であることを確認した。
【０１６３】
５．遺伝子ライブラリーからのＨＲａｓｅ遺伝子のクローニング
次ぎに、ｆｈｒの全長取得のために、フラグメント１をプローブとしてまず、サザンハイブリダイゼーションを行った。
【０１６４】
プローブとなるＤＮＡ断片を約５０ｎｇ／μｌに調整し、このＤＮＡ溶液１６μｌをDIG High Prime（Boehringer Mannheim）を使用して、プロトコールに準じて３７℃で２４時間インキュベートしてプローブの標識を行った。
染色体ＤＮＡ １μｇを各種制限酵素の組合わせで完全消化し、０．８％アガロースゲルで電気泳動した後に、ナイロンメンブレン（Boehringer Mannheim, Nylone membranes positively charged）にブロッティングした。以下定法に従ってサザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションはDIG EasyHyb（Boehringer Mannheim）を用いて行い、５０℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った後にプローブを添加して、５０℃、１８時間ハイブリダイゼーションさせた。検出はDIG Nucleotide Detection Kit（Boehringer Mannheim）を用いて行った。
【０１６５】
その結果、ＥｃｏＲＩ／ＰｓｔＩの切断物においては、約２．９ｋｂの位置にバンドが検出された。
この２．９ｋｂ領域の断片を回収してｐＵＣ１８に連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９にてライブラリー（１２０株）を作製した。以下定法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行った。コロニーをナイロンメンブレンフィルター（Boehringer Mannheim、Nylon membranes for colony and plaque hybridization）に転写し、アルカリ変性、中和、固定化の処理を行った。ハイブリダイゼーションはDIG Easy Hybを用いて行った。フィルターをbuffer中に浸し、４２℃、３０分間プレハイブリダイゼーションを行った。その後、上述の標識プローブを添加し、４２℃、１８時間ハイブリダイゼーションを行った。SSC bufferでの洗浄後、DIG Nucleotide Detection Kitを用いてポジティブクローン１株を選抜した。
【０１６６】
６．マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）由来ＨＲａｓｅ遺伝子の塩基配列
選抜した形質転換体が保有するプラスミドをMolecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989)に記載される方法に従って調製し、プローブとハイブリダイズした近傍の塩基配列を決定した。ＨＲａｓｅの３０残基のＮ末端アミノ酸配列を含むタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在し、ＨＲａｓｅをコードする遺伝子ｆｈｒであることを確認した。ＨＲａｓｅ遺伝子全長の塩基配列を配列表配列番号１に示した。得られたＯＲＦは既知のシュードモナス属細菌由来のＨＲａｓｅ（J.Bacteriol.１７４巻、９６２ページ、１９９２年）と４８％の相同性を示した。
【０１６７】
７．ＨＲａｓｅ遺伝子のＥ．Ｃｏｌｉでの発現
ｆｈｒをＥ．Ｃｏｌｉで発現させるために、ｐＵＣ１８のｌａｃプロモーターの下流にｆｈｒを連結したプラスミドｐＵＣＦＨＲを構築した。マイクロバクテリウム リクエファシエンス（Microbacterium liquefaciens ）ＡＪ３９１２（ＦＥＲＭ−Ｐ３１３３）株染色体ＤＮＡを鋳型とし、表２に示すオリゴヌクレオチドをプライマーとしてＰＣＲにより増幅した断片をＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨ Ｉで処理し、ｐＵＣ１８のＥｃｏＲ Ｉ、ＢａｍＨ Ｉ切断物とライゲーションした後、Ｅ．Ｃｏｌｉ ＪＭ１０９ に形質転換した。アンピシリン耐性株の中から、目的のプラスミドを持った株を選択し、構築した発現プラスミドｐＵＣＦＨＲと命名した。
【０１６８】
【表３】

【０１６９】
ｐＵＣＦＨＲを持つＨＲａｓｅのＥ． Ｃｏｌｉ での発現形質転換体を０．１ｍｇ／ｍｌ アンピシリンを含むＬＢ培地で、３７℃、１６時間、シード培養した。ＬＢ培地５０ｍｌを張り込んだ５００ｍｌ坂口フラスコに、この前培養液を１ｍｌシードし、３７℃にて本培養を行った。培養開始２．５時間後に、終濃度１ｍＭとなるようにイソプロピル１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに４時間培養を行った。
培養終了後、集菌、洗浄を行い、５ ｍｌの５０ ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ８．０)に懸濁し、０．１ mmφ glass beadsとともに３分間（３０ 秒×６ 回、９０秒のインターバル）ビーズビーターにて破砕した。溶液を回収し、２０，０００ g×１０ 分の遠心分離操作を行い、その上清を無細胞抽出液とした。
【０１７０】
８．ＨＲａｓｅ活性測定
培養終了後、無細胞抽出液を調製し、これを酵素源としてＨＲａｓｅ活性の測定を行った。
ＨＲａｓｅ活性の測定は、１２０ ｍｇ／ｄｌ Ｌ−ＢＨ、５０ ｍＭ ＫＰＢ (ｐＨ ８．０)、５ ｍＭ ＤＴＴ、５ ｍＭ ＥＤＴＡ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌおよび酵素溶液を含む反応液を３７℃で３０分インキュベートした後、９倍容の1.1ｍＭ ＣｕＳＯ₄、１１．１ ｍＭ Ｈ₃ＰＯ₄を添加することにより反応を停止させた。２０，０００ g×１０ 分の遠心により沈澱を取り除いた後、ＨＰＬＣにてラセミ化したＢＨ量を定量することによった。酵素活性の単位として、この条件にて１分に１μｍｏｌのＢＨをラセミ化する酵素活性をもって１Ｕと定義した。
【０１７１】
分析に用いたＨＰＬＣの条件は以下の通り。
カラム：ダイセル化学CHIRALPAK WH ０．４６ｃｍφ×２５ｃｍ
移動相：５％ (v/v) methanol, １ｍＭ ＣｕＳＯ₄
カラム温度：５０℃
流速：１．５ ｍｌ/分
検出：ＵＶ₂₁₀
【０１７２】
その結果、ｐＵＣ１８ＦＨＲを導入した場合のみＨＲａｓｅ活性が検出され、クローニングしたｆｈｒ遺伝子がＥ. ｃｏｌｉで発現したことを確認した（表４）。
【０１７３】
【表４】

【０１７４】
【発明の効果】
本発明によれば、マイクロバクテリウム属細菌からこれまで知られていないＨＲａｓｅを得ることができる。このＨＲａｓｅは従来知られているＨＲａｓｅに比較して、反応の至適温度が高いという特徴を有するので、反応温度を高くできる結果、より反応速度を速くすることが可能となり、目的とする反応を効率的に進めさせることができる。また反応中の反応液の微生物汚染のリスクが軽減されることから、品質保持を含めた工程管理が容易になる利点がある。さらに、本発明のヒダントインラセマーゼと、５置換ヒダントイン化合物を光学選択的に加水分解する系とを組み合わせて利用することにより、高収率にて医薬品、化学工業品、食品添加物等の製造に有用な光学活性アミノ酸を生成させることができる。
【０１７５】
【配列表】

【図面の簡単な説明】
【図１】ヒダントインラセマーゼ、ヒダントイナーゼおよびＮ−カルバミル−Ｌ−アミノ酸ハイドロラーゼをコードする構造遺伝子群の構造を示す図である。
【図２】本発明のヒダントインラセマーゼの製造工程を示すフローチャートである。
【図３】本発明のヒダントインラセマーゼの至適ｐＨ曲線を示す図である。
【図４】本発明のヒダントインラセマーゼのｐＨ安定曲線を示す図である。
【図５】本発明のヒダントインラセマーゼの至適温度曲線を示す図である。
【図６】本発明のヒダントインラセマーゼの温度安定曲線を示す図である。
【図７】本発明のヒダントインラセマーゼによるBHのラセミ化のタイムコースを示す図である。
○：基質D-BH（HRase添加）、 △：基質D-BH（HRase無添加）、
●：基質L-BH（HRase添加）、黒△：基質L-BH（HRase無添加）
【図８】 D-Phe生成のタイムコースを示す図である。
□：基質D-BH（HRase無添加）、 ○：基質DL-BH（HRase無添加）、
△：基質L-BH（HRase無添加）、黒□：基質DL-BH（HRase添加）、
黒△：基質L-BH（HRase添加）[0001]
BACKGROUND OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel 5-substituted hydantoin racemase, a DNA encoding the same, a recombinant DNA, a transformed cell, and a method for producing an optically active amino acid. The present invention relates to a novel 5-substituted hydantoin racemase that efficiently catalyzes, DNA encoding the same, recombinant DNA, transformed cells, and a method for producing optically active amino acids.
[0002]
[Prior art]
A 5-substituted hydantoin racemase (hereinafter abbreviated as HRase) is an enzyme that acts on an optically active 5-substituted hydantoin compound, that is, a D- or L-5-substituted hydantoin compound and catalyzes a racemization reaction of the substance.
[0003]
As shown in the following reaction formula (I), the 5-substituted hydantoin compound becomes an amino acid through a hydrolysis reaction by the enzymes (1) and (2).
(1) An enzyme (hydantoinase) that acts on a 5-substituted hydantoin compound and catalyzes a reaction for producing an N-carbamylamino acid by hydrolyzing the substance.
(2) An enzyme (N-carbamyl amino acid hydrolase) that acts on the produced N-carbamyl amino acid to catalyze a reaction for producing an optically active amino acid by hydrolyzing the substance.
[0004]
[Chemical 1]

[0005]
In order to produce an optically active amino acid from a 5-substituted hydantoin compound, an optically selective enzyme may be used for at least one of the above (1) hydantoinase and (2) N-carbamyl amino acid hydrolase. Methods using an enzyme system and methods combining a microbial enzyme system and a chemical reaction system are known. A method for producing an optically active amino acid from this 5-substituted hydantoin compound is important for producing pharmaceuticals, chemical industrial products, food additives and the like.
[0006]
In order to hydrolyze the entire amount of DL-5-substituted hydantoin compounds optically and convert them to optically active amino acids by combining a microbial enzyme system or a microbial enzyme system and a chemical reaction system, an enantiomer that is not a substrate is efficiently converted. It is necessary to racemize and change to the enantiomer that becomes the substrate. However, the racemization rate of the optically active 5-substituted hydantoin compound that does not serve as a substrate is very slow under neutral conditions where the microbial enzyme system acts. There was a problem.
[0007]
Therefore, HRase was searched for the purpose of racemization of optically active 5-substituted hydantoin compounds under neutral conditions, and was derived from bacteria belonging to the genus Arthrobacter (Japanese Patent Laid-Open No. 62-122591; Ann. NYAcad). Sci 672, 478, JP-A-6-343462), Pseudomonas genus bacteria (JP-A-4-271784, J. Bacteriol. 174, 7989, 1992) have been reported. . The optimal reaction temperature of HRase derived from bacteria reported in the past is 37 ° C (Ann.NYAcad.Sci 672, page 478) derived from Arthrobacter sp. DSM-3747. One derived from Lactobacillus sp. DK200 strain is 10 ° C. to 50 ° C. (Japanese Patent Laid-Open No. 62-122591), and one derived from Pseudomonas sp. NS671 is 45 ° C.
[0008]
Generally, the higher the optimum temperature for action in an enzyme reaction, the higher the industrial utility value of the enzyme. In other words, if the reaction temperature can be increased, the reaction rate can be further increased. As a result, the target reaction can proceed efficiently, and during the reaction, microbial contamination of the reaction solution can be prevented. Since the risk is reduced, there is an advantage that process management including quality maintenance becomes easy.
[0009]
[Problems to be solved by the invention]
As described above, HRase having a high optimum reaction temperature is useful from the viewpoint of industrial application. However, the upper limit of the optimum HRase temperature reported so far is 50 ° C., so that the racemization reaction can proceed efficiently and the risk of microbial contamination of the reaction solution is reduced. HRase with high temperature is required.
[0010]
Accordingly, an object of the present invention is to isolate a novel HRase that has an unprecedented high optimum reaction temperature and to provide a method for producing an optically active amino acid using the enzyme.
[0011]
[Means for Solving the Problems]
As a result of diligent research in view of the above problems, the present inventors have found that there is a novel HRase having a high optimum temperature for a target reaction in the genus Microbacterium, and have completed the present invention.
[0012]
That is, the present invention is as follows.
[0013]
(Claim 1) In a 5-substituted hydantoin racemase catalyzing a racemization reaction of a 5-substituted hydantoin, the optimum pH of action is in the range of pH 7-9, and the optimum temperature of action is in the range of 50-60 ° C. A 5-substituted hydantoin racemase characterized by
[0014]
(Claim 2) A protein having the following amino acid sequence (a) or (b) and having a 5-substituted hydantoin racemase activity.
(A) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
(B) Amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing
[0015]
(Claim 3) A 5-substituted hydantoin racemase fraction derived from microbacteria belonging to the genus Microbacteria, which is obtained by crushing or lysing cells obtained by culturing microbacteria spp.
[0016]
(Claim 4) The optically active 5-substituted hydantoin compound, wherein the 5-substituted hydantoin racemase according to claim 1 or 2 or the 5-substituted hydantoin racemase fraction according to claim 3 is allowed to act on an optically active 5-substituted hydantoin compound. Method for racemizing hydantoin compounds.
[0017]
(Claim 5) The 5-substituted hydantoin racemase according to claim 1 or 2, or the 5-substituted hydantoin racemase fraction according to claim 3, and an enzyme or an enzyme-containing enzyme that hydrolyzes the 5-substituted hydantoin optically selectively Is made to act on a 5-substituted hydantoin.
[0018]
(Claim 6) The 5-substituted hydantoin racemase according to claim 1 or 2, or the 5-substituted hydantoin racemase fraction according to claim 3, an enzyme hydrolyzing the 5-substituted hydantoin or an enzyme-containing substance thereof, and N-carba A method for producing an optically active amino acid, comprising causing an enzyme that optically hydrolyzes a mil amino acid or an enzyme-containing substance to act on a 5-substituted hydantoin.
[0019]
(Claim 7) A DNA encoding the 5-substituted hydantoin racemase according to claim 1.
[0020]
(Claim 8) A DNA encoding a protein having the following base sequence (a) or (b) and having a 5-substituted hydantoin racemase activity.
(A) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
(B) a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1
[0021]
(Claim 9) A DNA encoding a protein having the following amino acid sequence (c) or (d) and having a 5-substituted hydantoin racemase activity.
(C) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
(D) Amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing
[0022]
(Claim 10) A recombinant DNA obtained by connecting the DNA according to any one of claims 7 to 9 and a vector DNA.
[0023]
(Claim 11) The recombinant DNA according to claim 10, wherein the vector DNA is derived from a pUC plasmid, a pBR322 plasmid, or a derivative thereof.
[0024]
(Claim 12) A cell transformed with the recombinant DNA according to claim 10 or 11.
[0025]
(Claim 13) The cell according to claim 12, wherein the cell is derived from Escherichia coli.
[0026]
(Claim 14) A 5-substituted hydantoin racemase activity characterized by culturing the cell according to claim 12 or 13 in a medium and accumulating a protein having a 5-substituted hydantoin racemase activity in the medium and / or in the cell. A method for producing a protein having
[0027]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Hereinafter, regarding the present invention,
[I] HRase
[II] Method for producing optically active amino acid using HRase
A detailed description will be given with reference to the accompanying drawings in this order.
[0028]
[I] HRase
It has been reported that a bacterium belonging to the genus Flavobacterium produces a corresponding L-tryptophan by optically hydrolyzing DL-5-indolylmethylhydantoin. When L-tryptophan production reaction is carried out using Flavobacterium sp. AJ3912 (FERM-P3133), which is a strain producing L-tryptophan, using DL-5-indolylmethylhydantoin as a substrate The molar yield of L-tryptophan produced reaches 80% or more (Agric. Biol. Chem. 51, 363, 1987).
[0029]
Since the optically active indolylmethylhydantoin hardly undergoes spontaneous racemization under neutral conditions in which an enzymatic reaction is performed, the present inventors considered that a novel HRase exists in the strain. Based on this idea, the present inventors purify and isolate HRase from the cultured cells of the strain in order to clarify the existence of the novel HRase, and at the same time, this enzyme has a high optimum temperature for the intended reaction. I found out that it was HRase.
[0030]
In addition, Flavobacterium sp. (Flavobacterium sp.) AJ3912 (FERM-P3133) was originally Flavobacterium sp. (Flavobacterium sp.) AJ3912 (FERM-P3133) on June 27, 1975, industrial technology of the Ministry of International Trade and Industry. It was deposited with the Institute of Biotechnology, Institute of Biotechnology, but as a result of re-identification, it was found that it was classified as Aureobacterium liquefaciens. At present, by changing the species name, Aureobacterium liquefaciens is classified as Microbacterium liquefaciens, and Microbacterium liquefaciens AJ3912 (domestic deposit number FERM) -P3133, international deposit number FERM-BP7643), deposited with the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center.
[0031]
About Microbacterium liquefaciens AJ3912 (FERM-P3133), the Burger's Manual of Determinative Bacteriology Volume 1 (9th edition, 1994, published by William and Wilkins) Table 1 shows the results of a physiological property test conducted in comparison with each other.
[0032]
[Table 1]

[0033]
In addition, the present inventors purified HRase derived from Microbacterium liquefaciens AJ3912 and determined the amino acid sequence of HRase. Furthermore, a DNA molecule of about 30 base pairs deduced from the amino acid sequence of HRase was synthesized, and using this as a probe, the total length of DNA encoding HRase derived from microbacteria was obtained from a microbacterial bacterial chromosome gene library. Successfully isolated.
[0034]
Furthermore, the present inventors predicted that the base sequence downstream of the HRase gene obtained at the time of isolation of the HRase gene derived from the bacterium belonging to the genus Microbacterium is a part of the hydantoinase (hereinafter referred to as HHase) gene. By amplifying the fragment by PCR and using it as a probe, the full length of the HHase gene was successfully isolated and obtained from the gene library of the strain. Similarly, when isolating the HHase gene, the base sequence downstream of the HHase gene is expected to be part of the N-carbamyl amino acid hydrolase (hereinafter referred to as CHase) gene, and the DNA fragment is amplified by the PCR method. As a result, the full length of the CHase gene was successfully isolated and obtained.
[0035]
That is, as shown in FIG. 1, it is considered that the HRase of the present invention forms an operon together with the HHase gene and the CHase gene. In FIG. 1, (1) is an EcoR I / PstI fragment, (2) is a Kpn I / Sac I fragment, and (3) is a Bgl II fragment.
[0036]
In the attached sequence listing of the present invention, the DNA encoding the HRase of the present invention identified by the above method is shown in SEQ ID NO: 1, the DNA encoding HHase is shown in SEQ ID NO: 3, and the DNA encoding CHase is Shown in SEQ ID NO: 5. In addition, DNA encoding a structural gene group including the HRase gene, the HHase gene, and the CHase gene is shown in SEQ ID NO: 7. Of the base sequence described in SEQ ID NO: 7, base numbers 1 to 708 encode HRase of the present invention, base numbers 729 to 2105 encode HHase, and base numbers 2105 to 3340 encode CHase.
[0037]
These DNAs were isolated from the chromosomal DNA of Microbacterium liquefaciens strain AJ3912, and all encode proteins involved in the production of L-amino acids.
[0038]
In addition, SEQ ID NO: 2 in the sequence listing shows the amino acid sequence of HRase encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and SEQ ID NO: 4 in the sequence listing shows HHase encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 3 in the sequence listing. And the amino acid sequence of CHase encoded by the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5 in the sequence listing is shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
[0039]
As shown in the following reaction formula (II), HRase described in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing, HHase described in SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing, and CHase described in SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing are 5- (4- It catalyzes a reaction for producing an optically active amino acid represented by L-tyrosine from a 5-substituted hydantoin represented by (hydroxybenzyl) hydantoin.
[0040]
[Chemical 2]

[0041]
Next, the novel HRase of the present invention will be described in detail in the order of (1) DNA encoding HRase, (2) HRase properties, and (3) HRase production method.
[0042]
(1) DNA encoding HRase
The HRase gene of the present invention having the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is isolated from the chromosomal DNA of Microbacterium liquefaciens AJ3912 strain as described above. The nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing shows 48% homology in amino acid sequence with HRase derived from a known Pseudomonas genus bacterium (J. Bacteriol. 174, 962, 1992), and 49% in the nucleotide sequence. Shows homology.
[0043]
A method for obtaining DNA encoding HRase from Microbacterium will be described.
[0044]
First, the amino acid sequence of purified HRase is determined. The amino acid sequence can be determined using the Edman method (Edman, P., Acta Chem. Scand. 4, 227 (1950)). The amino acid sequence can be determined using a sequencer manufactured by Applied Biosystems. Regarding the HRase derived from the genus Microbacterium of the present invention, the amino acid sequence of 30 residues from the N-terminal was determined, and the sequence shown in SEQ ID NO: 8 was revealed.
[0045]
Based on the revealed amino acid sequence, the base sequence of the DNA encoding it can be deduced. To deduct the base sequence of DNA, a universal codon is employed.
[0046]
Based on the deduced base sequence, a DNA molecule of about 30 base pairs is synthesized. A method for synthesizing the DNA molecule is disclosed in Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981). Alternatively, the DNA molecule can be synthesized using a synthesizer manufactured by Applied Biosystems. The DNA molecule can be used as a probe when the full length DNA encoding HRase derived from Microbacterium is isolated from a Microbacterial chromosomal gene library. Alternatively, it can be used as a primer when a DNA encoding HRase derived from Microbacterium is amplified by PCR. However, since the DNA amplified using the PCR method does not include the entire DNA encoding HRase derived from the bacterium belonging to the genus Microbacterium, the DNA amplified using the PCR method is used as a probe, and the bacterium belonging to the genus Microbacterium is used. The full length DNA encoding the derived HRase is isolated from a microbacterial bacterial chromosomal gene library.
[0047]
The operation of the PCR method is described in White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989) and the like. A method for preparing chromosomal DNA and a method for isolating a target DNA molecule from a gene library using a DNA molecule as a probe are described in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989), etc. ing.
[0048]
A method for determining the base sequence of DNA encoding HRase derived from an isolated microbacterium is described in A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Inc. (1985). Further, the base sequence can be determined using a DNA sequencer manufactured by Applied Biosystems. DNA encoding HRase derived from Microbacterium is shown in SEQ ID NO: 1 in Sequence Listing.
[0049]
The DNA encoding HRase derived from the genus Microbacterium is not limited to the DNA shown in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing. That is, a difference in base sequence should be observed for each species and strain of bacteria belonging to the genus Microbacterium.
[0050]
Further, the DNA of the present invention is not limited to DNA encoding isolated HRase, but of course, DNA obtained by artificially mutating DNA encoding HRase isolated from chromosomal DNA of microbacteria Even so, when encoding HRase, it is the DNA of the present invention. A site-directed mutagenesis method described in Method. In Enzymol., 154 (1987) is frequently used as a method for artificially adding mutation.
[0051]
A DNA encoding a protein having a base sequence that hybridizes with the base sequence described in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and having a 5-substituted hydantoin racemase activity is also a DNA of the present invention. Here, “stringent conditions” refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to clearly quantify this condition, for example, DNAs having high homology, for example, 50% or more, more preferably 80% or more, and more preferably 90% or more have high homology. 60 ° C, 1 × SSC, 0.1% SDS, which is a condition in which DNAs hybridize and DNAs having lower homology do not hybridize, or washing conditions for normal Southern hybridization, , 60 ° C., 0.1 × SSC, 0.1% SDS, more preferably 65 ° C., 0.1 × SSC, hybridizing at a salt concentration corresponding to 0.1% SDS. The “5-substituted hydantoin racemase activity” may be any activity that racemizes a 5-substituted hydantoin compound. However, in the case of a base sequence that hybridizes under stringent conditions with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, it has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing at 50 ° C and pH 8 It is desirable to retain at least half of the enzyme activity of the protein.
[0052]
Furthermore, DNA encoding a protein substantially the same as HRase encoded by the DNA described in SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing is also the DNA of the present invention. That is,
(A) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing,
(B) has an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and has 5-substituted hydantoin racemase activity DNA encoding the protein
Is also the DNA of the present invention. Here, “several” is a range that does not significantly impair the three-dimensional structure of the protein of the amino acid residue and the 5-substituted hydantoin racemase activity, specifically 2 to 50, preferably 2 to 30. The number is more preferably 2 to 10. The “5-substituted hydantoin racemase activity” means an activity of racemizing a 5-substituted hydantoin compound as described above. However, (b) in the case of an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, 50 ° C., pH 8 It is desirable that the enzyme activity of about half or more of the protein having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is retained under the above conditions.
[0053]
(2) Properties of HRase
Next, the properties of the purified microbacterium-derived HRase will be described.
[0054]
The HRase of the present invention has the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing, as will be apparent from the above-described gene isolation and analysis. However, the present invention has an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and a 5-substituted hydantoin racemase. It also includes proteins having activity.
[0055]
That is, HRase of the present invention is a protein having the following amino acid sequence (a) or (b) and having 5-substituted hydantoin racemase activity.
(A) the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing
(B) Amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing
Here, the definitions of “several” and “5-substituted hydantoin racemase activity” are synonymous with the description in the section of (1) DNA encoding HRase.
[0056]
The HRase of the present invention catalyzes a racemization reaction of a 5-substituted hydantoin compound.
[0057]
The HRase activity of the HRase of the present invention was measured using an optically active D- or L-5 substituted hydantoin compound as a substrate, and the degree of racemization was measured by measuring the change in the optical rotation, or using an optical resolution column. It can be carried out by measuring by high performance liquid chromatography (HPLC).
[0058]
Specifically, 120 mg / dl L- or D-benzylhydantoin (BH), 50 mM phosphate-potassium buffer (KPB) (pH 8.0), 5 mM dithiothreitol (DTT) and HRase enzyme solution Was incubated for 30 minutes at 37 ° C., and then 9 volumes of 1.1 mM CuSO_Four11.1 mM H_ThreePO_FourThe reaction was stopped by adding the solution. After removing the precipitate by centrifugation at 20,000 g × 10 minutes, the amount of BH racemized by HPLC was quantified to estimate the racemization activity. As a unit of enzyme activity, 1 U was defined as an enzyme activity that racemizes 1 μmol of BH per minute under these conditions.
[0059]
Analytical optically active BH using HPLC was quantitatively analyzed using Daicel Chemical CHIRALPAK WH 0.46 cmφ × 25 cm. The analysis conditions are as follows.
Mobile phase: 5% (v / v) methanol, 1 mM CuSO_Four
Column temperature: 50 ° C
Flow rate: 1.5 ml / min
Detection: UV₂₁₀
Under these conditions, D-BH (retention time 4.2 minutes) and L-BH (5.3 minutes) were eluted.
[0060]
Next, the enzyme chemical properties of the HRase of the present invention measured by the above analysis method will be described below.
[0061]
The HRase of the present invention is characterized in that it can efficiently catalyze the racemization reaction because the optimum temperature of action is in the high temperature range as compared with HRases reported so far. That is, the HRase of the present invention having the amino acid sequence (a) or (b) is characterized in that the optimum temperature of action is more than 50 ° C. although there are some differences due to the difference in the amino acid sequences. . A more preferable optimum temperature of action is 52 ° C. or higher, and more preferably more than 55 ° C. Although there is no particular upper limit of the optimum temperature for action, it is preferably 60 ° C. or lower in consideration of the temperature stability of HRase. In the present specification, the “optimum temperature for action” means a temperature at which the maximum activity is exhibited under the condition of pH 8.
[0062]
Optimal pH: around 7 to about 9.
In order to determine the optimum pH range of action, the reaction was carried out at 40 ° C. for 30 minutes.
[0063]
pH stability: around 6 to about 9.
The pH stability when each pH was treated for 30 minutes under the condition of 0 ° C. was examined.
[0064]
Temperature stability: stable at about 40 ° C. or less.
The temperature stability when heated for 30 minutes under the condition of pH 8.0 was examined.
[0065]
Influence of inhibitor: It is strongly inhibited by NEM (N-ethylmaleimide), copper ion, IAA (monoiodoacetic acid). EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) hardly inhibits. The HRase of the present invention is activated by adding DTT (dithiothreitol).
[0066]
Molecular weight: a) about 107,000 (gel filtration method), b) about 27,000 (SDS-PAGE method)
The HRase of the present invention is assumed to have a subunit tetramer structure having a molecular weight of 27,000.
[0067]
(3) Method for producing a protein having HRase and 5-substituted hydantoin racemase activity
Next, a method for producing a protein having HRase and 5-substituted hydantoin racemase activity of the present invention will be described. The method for producing a protein having HRase and 5-substituted hydantoin racemase activity according to the present invention includes (i) a method for producing and accumulating HRase by microbial culture, and (ii) a protein having HRase or 5-substituted hydantoin racemase activity by recombinant DNA technology. There are two methods of producing and accumulating the protein by preparing a transformant that produces the protein and culturing the transformant.
[0068]
(i) Method of production and accumulation by microbial culture
In the method of producing and accumulating by microbial culture, microorganisms belonging to the genus Microbacterium are examples of microorganisms that can be used to acquire HRase. A preferable example is Microbacterium liquefaciens AJ3912 (FERM-P3133).
[0069]
The culture form of microorganisms belonging to the genus Microbacterium can be either liquid culture or solid culture, but an industrially advantageous method is the deep aeration stirring culture method. As a nutrient source of the nutrient medium, a carbon source, a nitrogen source, an inorganic salt, and other trace nutrient sources that are usually used for microbial culture can be used. Any nutrient source for which the strain used is available can be used.
[0070]
The aerobic condition is adopted as the aeration condition. The culture temperature may be within a range in which bacteria grow and HRase is produced. Therefore, although there is no strict condition, it is usually 10 to 50 ° C, preferably 30 to 40 ° C. The culture time varies depending on other culture conditions. For example, it may be cultured until the time when HRase is most produced, and is usually 5 hours to 7 days, preferably about 10 hours to 3 days.
[0071]
After culturing, the cells are collected by centrifugation (for example, 10,000 × g, 10 minutes). Since the enzyme exists in the microbial cell, the enzyme is solubilized by crushing or lysing the microbial cell. For crushing the cells, methods such as ultrasonic crushing, French press crushing, and glass bead crushing can be used. In the case of lysis, egg white lysozyme, peptidase treatment, or a combination of these methods is used.
[0072]
When purifying HRase derived from microbacteria, the enzyme lysate is purified as a starting material. If undisrupted or undissolved bacteria residue is present, the lysate is centrifuged again. It is advantageous for purification to remove the residue that is subjected to precipitation.
[0073]
For the purification of the enzyme, all conventional methods usually used for purifying the enzyme, such as ammonium sulfate salting-out method, gel filtration method, ion exchange chromatography method, hydrophobic chromatography method and the like can be employed. As a result, a HRase-containing fraction with higher specific activity can be obtained.
[0074]
(ii) Manufacturing method using recombinant DNA technology
Next, a method for producing a protein having HRase or 5-substituted hydantoin racemase activity by recombinant DNA technology (hereinafter, abbreviated as HRase in the production method using recombinant DNA technology) will be described. Many examples of producing useful proteins such as enzymes and physiologically active substances using recombinant DNA technology are known, and by using recombinant DNA technology, useful proteins existing in trace amounts can be produced in large quantities.
[0075]
FIG. 2 is a flowchart of the manufacturing process of the HRase of the present invention.
First, DNA encoding HRase of the present invention is prepared (step S1).
Next, the prepared DNA is connected to the vector DNA to produce a recombinant DNA (step S2), and cells are transformed with the recombinant DNA to produce a transformant (step S3). Subsequently, the transformant is cultured in a medium, and HRase is produced and accumulated in the medium and / or cells (step S4).
Then, it progresses to step S5 and refine | purified HRase is manufactured by collect | recovering and refine | purifying this enzyme.
Further, by using the purified HRase produced in step S5 or the medium in which the HRase of step S4 is accumulated for synthesis of amino acids, a large amount of the objective optically active amino acid can be produced (step S6).
[0076]
The DNA connected to the vector DNA only needs to express the HRase of the present invention.
[0077]
Here, as the HRase gene connected to the vector DNA, the above-mentioned
(a) DNA having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
(b) a DNA having a base sequence that hybridizes under stringent conditions with the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing;
(c) DNA encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing,
(d) DNA encoding an amino acid sequence containing substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing
Etc. can be used.
[0078]
When a protein is mass-produced using recombinant DNA technology, it is preferable that the protein associates in a transformant producing the protein to form an inclusion body of the protein. Advantages of this expression production method are that the target protein is protected from digestion by proteases present in the microbial cells, and that the target protein can be easily purified by centrifugation following cell disruption.
[0079]
The protein inclusion body obtained in this way is solubilized by a protein denaturing agent, and after being subjected to an activity regeneration operation mainly by removing the denaturing agent, it is converted into a correctly folded physiologically active protein. . For example, there are many examples such as activity regeneration of human interleukin-2 (Japanese Patent Laid-Open No. 61-257931).
[0080]
In order to obtain an active protein from a protein inclusion body, a series of operations such as solubilization and activity regeneration are required, and the operation becomes more complicated than when directly producing an active protein. However, when a large amount of a protein that affects the growth of the bacterial cell is produced in the bacterial cell, the effect can be suppressed by accumulating it in the bacterial cell as an inactive protein inclusion body.
[0081]
As a method for mass production of the target protein as inclusion bodies, in addition to a method of expressing the target protein alone under the control of a strong promoter, a method of expressing it as a fusion protein with a protein known to be expressed in large quantities is there.
[0082]
Furthermore, it is also effective to place a restriction protease recognition sequence at an appropriate position in order to cut out the target protein after expression as a fusion protein.
[0083]
When a protein is mass-produced using recombinant DNA technology, bacterial cells, actinomycetes cells, yeast cells, mold cells, plant cells, animal cells, etc. can be used as transformed host cells. Preferably, Escherichia coli is used. This is because there is a lot of knowledge about technology for mass production of proteins using E. coli. Hereinafter, a method for producing HRase using transformed E. coli will be described.
[0084]
As a promoter for expressing DNA encoding HRase, a promoter usually used for heterologous protein production in Escherichia coli can be used. For example, a strong promoter such as T7 promoter, trp promoter, lac promoter, tac promoter, PL promoter, etc. Is mentioned.
[0085]
In order to produce HRase as a fusion protein inclusion body, a gene encoding another protein, preferably a hydrophilic peptide, is linked upstream or downstream of the HRase gene to form a fusion protein gene. Such a gene encoding another protein may be any gene that increases the accumulation amount of the fusion protein and enhances the solubility of the fusion protein after the denaturation / regeneration process. For example, T7gene 10, β-galactosidase gene, Dehydrofolate reductase gene, interferon γ gene, interleukin-2 gene, prochymosin gene and the like are listed as candidates.
[0086]
When these genes and HRase-encoding genes are linked, the codon reading frames are made to match. Ligation may be performed at an appropriate restriction enzyme site, or synthetic DNA having an appropriate sequence may be used.
[0087]
In order to increase the production amount, it is preferable to link a terminator, which is a transcription termination sequence, downstream of the fusion protein gene. Examples of the terminator include T7 terminator, fd phage terminator, T4 terminator, tetracycline resistance gene terminator, E. coli trpA gene terminator, and the like.
[0088]
As a vector for introducing a gene encoding HRase or a gene encoding a fusion protein of HRase and other proteins into Escherichia coli, a so-called multi-copy type is preferable, and a plasmid having a replication origin derived from ColE1, such as a pUC-type plasmid. And pBR322 series plasmids or derivatives thereof. Here, the “derivative” means one obtained by modifying a plasmid by base substitution, deletion, insertion, addition or inversion. In addition, the modification here includes modification by mutation treatment with a mutation agent, UV irradiation, or natural mutation.
[0089]
In order to select transformants, the vector preferably has a marker such as an ampicillin resistance gene. As such a plasmid, expression vectors having a strong promoter are commercially available (pUC system (Takara Shuzo Co., Ltd.), pPROK system (Clontech), pKK233-2 (Clontech), etc.).
[0090]
A recombinant DNA is obtained by ligating a promoter, HRase, a gene encoding a fusion protein of HRase and other proteins, and a DNA fragment ligated in the order of terminator and vector DNA.
[0091]
When E. coli is transformed with the recombinant DNA and this E. coli is cultured, HRase or a fusion protein of HRase and another protein is expressed and produced.
As a host to be transformed, a strain usually used for expression of a heterologous gene can be used, but Escherichia coli JM109 strain, particularly JM109 (DE3) strain is preferred. Methods for performing transformation and methods for selecting transformants are described in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989) and the like.
[0092]
When expressed as a fusion protein, HRase may be excised using a restriction protease such as blood coagulation factor Xa, kallikrein, etc., which has a sequence not present in HRase as a recognition sequence.
[0093]
As the production medium, a medium usually used for culturing Escherichia coli such as M9-casamino acid medium and LB medium may be used. The culture conditions and production induction conditions are appropriately selected according to the type of the marker, promoter, host fungus and the like used.
[0094]
In order to recover HRase or a fusion protein of HRase and another protein, there are the following methods. If HRase or a fusion protein thereof is solubilized in the microbial cells, the microbial cells can be recovered and then disrupted or lysed to be used as a crude enzyme solution. Furthermore, if necessary, HRase or a fusion protein thereof can be purified and used by a conventional method such as precipitation, filtration, or column chromatography. In this case, a purification method using an antibody of HRase or fusion protein can also be used.
[0095]
When a protein inclusion body is formed, it is solubilized with a denaturing agent. Although it may be solubilized together with the bacterial protein, it is preferable to take out the inclusion body and solubilize it in consideration of the subsequent purification operation. In order to recover the inclusion body from the microbial cell, a conventionally known method may be used. For example, the microbial cells are destroyed, and the inclusion bodies are collected by centrifugation operation or the like. Examples of denaturing agents that solubilize protein inclusion bodies include guanidine hydrochloride (eg, 6M, pH 5-8), urea (eg, 8M), and the like.
[0096]
When these denaturing agents are removed by dialysis or the like, they are regenerated as active proteins. As a dialysis solution used for dialysis, a Tris-HCl buffer or a phosphate buffer may be used, and the concentration may be 20 mM to 0.5 M, and the pH may be 5 to 8.
[0097]
The protein concentration during the regeneration step is preferably suppressed to about 500 μg / ml or less. In order to suppress the regenerated HRase from self-crosslinking, the dialysis temperature is preferably 5 ° C. or lower. Further, as a method for removing the denaturant, there are a dialysis method, a dilution method, an ultrafiltration method, and the like, and the regeneration of activity can be expected by using any of them.
[0098]
When DNA shown in SEQ ID NO: 1 is used as DNA encoding HRase, HRase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is produced.
[0099]
[II] Preparation of optically active amino acids using HRase
Next, a method for producing an optically active amino acid from a 5-substituted hydantoin compound using the HRase of the present invention will be described.
[0100]
The HRase of the present invention used for the optically active amino acid production reaction includes a protein having the following amino acid sequence (a) or (b) and having hydantoin racemase activity.
(A) The amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
(B) Amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
[0101]
As the HRase, (1) HRase obtained by culturing a bacterium belonging to the genus Microbacterium may be used, or (2) a transformant that produces HRase derived from the bacterium belonging to the genus Microbacterium is prepared by a recombinant DNA technique. HRase obtained by culturing the transformant may also be used.
[0102]
When HRase is produced using cells transformed with microbacteria or recombinant DNA, a substrate may be added directly to the culture solution while culturing, or the cells isolated from the culture solution Any of the washed cells can be used. In addition, a cell-treated product obtained by crushing or lysing cells may be used as it is, or HRase may be recovered from the cell-treated product and used as a crude enzyme solution, or the enzyme may be purified. May be used. That is, as long as it is a fraction having HRase activity, it is possible to use the enzyme and all the enzyme-containing materials. Here, the “enzyme-containing substance” may be any substance that contains the enzyme. Specifically, the culture, cultured cells, washed cells, treated cells obtained by crushing or lysing the cells, or crude enzymes Liquid, purified enzyme, etc.
[0103]
In the method for producing an optically active amino acid according to the present invention, in addition to the HRase according to the present invention, (1) acts on a 5-substituted hydantoin compound to catalyze a reaction for producing an N-carbamylamino acid by hydrolyzing the substance. Hydantoinase (HHase),
(2) N-carbamyl amino acid hydrolase (CHase) which acts on the produced N-carbamyl amino acid and catalyzes a reaction to produce an optically active amino acid by hydrolyzing the substance.
These two enzymes are required.
[0104]
Here, when the optical selectivity of HHase that hydrolyzes a 5-substituted hydantoin compound is high, a high yield (HRase) can be obtained by allowing HHase having high optical selectivity and the HRase of the present invention to act on the 5-substituted hydantoin compound. Thus, only one of the optically active N-carbamyl-L-amino acid or N-carbamyl-D-amino acid can be produced in a molar yield of 50% or more. In this case, an optically active amino acid may be subsequently produced using CHase or the enzyme-containing material, or by performing a chemical hydrolysis treatment with nitrous acid, while maintaining the optical activity, with a high yield. An optically active amino acid can be produced (a method using a combination of a microbial enzyme system and a chemical reaction system).
[0105]
HHase that optically hydrolyzes 5-substituted hydantoin compounds can be obtained as follows. For example, the presence of a thermostable enzyme in bacteria belonging to the genus Bacillus is known as a bacterium having D-HHase that produces N-carbamyl-D-amino acid. For example, Bacillus stearothermophilus ATCC 31195 HHase or an HHase-containing fraction may be prepared from the above (Appl. Microbiol. Biotechnol. 43, 270, 1995).
The ATCC 31195 strain is available from the American Type Culture Collection (address 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, United States of America). The presence of L-HHase that specifically acts on L-form hydantoin compounds is known, for example, in the Bacillus sp. AJ12299 strain (Japanese Patent Laid-Open No. 63-24894). Bacillus SP AJ12299 was deposited with the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry on July 5, 1986, and was given the accession number FERM-P8837. Industrial technology was incorporated on June 27, 2001. It is a microorganism that has been transferred to the Research Institute Patent Biological Deposit Center under the Budapest Treaty and has been assigned the deposit number FERM BP-7646.
[0106]
Even if HHase has no optically selective hydrolysis activity, if CHase has optical selectivity, the resulting amino acid becomes a D- or L-optically active form. In this case, N-carbamylamino acid which is an unreacted enantiomer, that is, CHase, selectively decomposes N-carbamyl-L-amino acid to produce L-amino acid in the reaction solution. When -D-amino acid or conversely produces D-amino acid, it is assumed that N-carbamyl-L-amino acid remains. However, in such a case, HHase catalyzes the reverse reaction of dehydrating and condensing the N-carbamyl amino acid of the unreacted enantiomer that will remain to form a 5-substituted hydantoin compound again, so HRase, HHase In addition, it is possible to produce optically active amino acids in high yield (molar yield of 50% or more by the action of HRase) by using three kinds of enzymes of CHase with high optical selectivity or three kinds of enzyme-containing substances.
[0107]
In addition to Microbacterium liquefaciens AJ3912 strain shown in the present invention, HHase without optical selectivity is known to exist in, for example, Arthrobacter aurescens (J. Biotechnol). .61, 1 page, 1998).
[0108]
The presence of CHase that selectively hydrolyzes N-carbamylamino acid in D form is known, for example, in Pseudomonas sp. AJ 11220 (Japanese Patent Publication No. 56-003034). As a result of the re-identification, it has been found that Pseudomonas sp. AJ 11220 belongs to Agrobacterium sp. Agrobacterium SP AJ 11220 strain was deposited with the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry on December 20, 1977, and was given the accession number FERM-P4347. On June 27, 2001, an independent administrative agency. It is a microorganism that has been transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center under the Budapest Treaty and has been assigned the deposit number FERM BP-7645. Further, CHase that selectively hydrolyzes N-carbamylamino acid is exemplified by Flavobacterium sp. (Flavobacterium sp.) AJ3912 (Japanese Patent Publication No. 56-008749), Bacillus sp. (Bacillus sp.) AJ12299. Its existence is known. As described above, Flavobacterium sp. AJ3912 strain is currently classified as Microbacterium liquefaciens AJ3912 (FERM-P3133). On June 27, 1975, the Industrial Technology Institute of the Ministry of International Trade and Industry. Deposited at the Biotechnology Institute of Industrial Technology and given the accession number FERM-P3133, transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center on June 27, 2001, under the Budapest Treaty, and under the accession number FERM BP It is a microorganism to which -7643 is given. Bacillus SP AJ12299 was deposited with the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry on July 5, 1986, and was assigned a deposit number of FERM-P8837. On June 27, 2001, an independent administrative agency. It is a microorganism that has been transferred to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Organism Depositary under the Budapest Treaty and has been assigned the deposit number FERM BP-7646.
[0109]
As a substrate for HRase or a fraction containing HRase, any 5-substituted hydantoin compound that can be racemized in the substrate specificity of the enzyme can be used. Examples of 5-substituted hydantoin compounds include 5-indolylmethylhydantoin, 5- (p-hydroxybenzyl) hydantoin, 5-isobutylhydantoin, 5- (3'-pyridyl) -methylhydantoin, and the like.
[0110]
As a preferable combination of HRase, HHase and CHase,
HRase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 in Sequence Listing,
HHase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 in Sequence Listing,
CHase having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 in the Sequence Listing
The combination of is mentioned. All of these enzymes are enzymes derived from Microbacterium liquefaciens AJ3912 strain.
[0111]
When HRase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, HHase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing and CHase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 are used in combination, -Obtained by culturing transformed cells using recombinant DNA obtained by connecting a structural gene group described in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing encoding all proteins involved in amino acid production and a vector. A hybrid protein consisting of HRase, HHase and CHase can also be used. When the hybrid protein is used, the hydanton racemase contained in the hybrid protein catalyzes the racemization of the 5-substituted hydantoin compound as shown in the following reaction formula (II). Can produce L-amino acids in a molar yield of 100%.
[0112]
[Chemical Formula 3]

[0113]
It is also possible to produce N-carbamyl amino acids using the above hybrid protein. For example, an N-carbamyl amino acid can be produced by adding an inhibitor of N-carbamyl-L-amino acid hydrolase or the like to the hybrid protein and stopping the hydrolysis reaction with N-carbamyl amino acid.
[0114]
Amino acid production using culture solution, isolated cells, washed cells, treated cells, crude enzyme solution or purified enzyme obtained from treated cells of microbacteria or cells transformed with recombinant DNA When the reaction is allowed to proceed, the reaction solution containing the 5-substituted hydantoin compound and the culture solution, separated cells, washed cells, treated cells, crude enzyme solution, or purified enzyme is brought to an appropriate temperature of 25 to 40 ° C. It may be adjusted and kept at pH 5 to 9 or allowed to stand for 8 hours to 5 days or stirred.
[0115]
When the amino acid production reaction is allowed to proceed while culturing cells transformed with microbacteria or recombinant DNA in an aqueous medium, the transformed cells containing a 5-substituted hydantoin compound and An aqueous medium containing nutrients such as a carbon source, a nitrogen source, and inorganic ions necessary for growth is used. Furthermore, the addition of organic micronutrients such as vitamins and amino acids often yields desirable results. The 5-substituted hydantoin compound may be added in portions. It is preferable to culture for 8 hours to 5 days while controlling the pH within a suitable range of 5 to 9 and a temperature of 25 to 40 ° C. under aerobic conditions.
[0116]
The produced amino acid can be separated and purified by a known method. Examples thereof include a method in which a basic amino acid is adsorbed by contacting with an ion exchange resin, and this is crystallized after elution, or a method in which elution is followed by decolorization filtration using activated carbon or the like for crystallization.
[0117]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be further described by examples. In addition, this invention is not limited to description of an Example.
[0118]
(Example 1) Production and purification of HRase
Microbacterium liquefaciens AJ3912 (FERM-P3133) was cultured to obtain bacterial cells having sufficient HRase activity.
First, refresh for 24 hours at 30 ° C. on CM2G agar medium (0.5 g / dl D-glucose, 1 g / dl yeast extract, 1 g / dl peptone, 0.5 g / dl NaCl, 2 g / dl agar, pH 7.0) Thereafter, seed culture was performed in a CM2G liquid medium at 30 ° C. for 24 hours.
[0119]
Thereafter, 1 ml of the seed culture was inoculated into a 500 ml Sakaguchi flask in which 50 ml of the main culture medium was put, and then cultured at 30 ° C. for 18 hours with shaking. The main culture medium was 0.5 g / dl D-glucose, 0.5 g / dl (NH_Four)₂SO_Four, 1 g / dl yeast extract, 1 g / dl peptone, 0.1 g / dl KH₂PO_Four, 0.3g / dl K₂HPO_Four0.01 g / dl MgSO_Four・ 7H₂O, 0.35 g / dl DL-5-indolylmethylhydantoin (IMH), pH 7.0, after autoclaving at 120 ° C. for 20 minutes, 1 mg / dl FeSO each_Four・ 7H₂O, MnSO_Four・ 4-5H₂O, CaCl₂・ 2H₂O was added and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. to fully precipitate IMH, and then used.
After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation and washed with 0.1 M KPB (pH 7.0) to obtain washed cells.
The bacterial cells thus obtained were used as a material for purifying HRase.
[0120]
1. Cell disruption
Using 66 g of washed bacterial cells (equivalent to 3.7 L of culture solution) as a starting material, the bacterial cells were suspended in 130 ml of 0.1 M KPB (pH 7.0) and then mixed with 0.1 mmφ glass beads for 3 minutes (30 seconds × 6 Times, 90 seconds interval). The solution was collected and treated with DNase I at a final concentration of 5 μg / ml for 20 minutes at room temperature. Thereafter, unbroken cells were removed by centrifugation at 13,000 g × 10 minutes, and the membrane fraction was removed by ultracentrifugation at 100,000 g × 60 minutes, and the supernatant was used as a cell-free extract.
[0121]
2. Ammonium sulfate fraction
59 g of ammonium sulfate was added to 125 ml of the above cell-free extract so that the final concentration became 70% saturation, and the pH was adjusted to 7.0 with KOH, followed by stirring at 5 ° C. for 60 minutes. The precipitate was recovered by centrifugation at 13,000 g × 15 minutes, dissolved in a small amount of 20 mM KPB (pH 7.0), and then 1.2M (NH_Four)₂SO_Four, 20 mM KPB, 0.5 mM CoCl₂and dialyzed against pH 7.0 (; Buffer A). After dialysis, centrifugation was performed at 13,000 g × 30 minutes, and 40 ml of the resulting supernatant was used for the following purification.
[0122]
3. Hydrophobic chromatography
The obtained enzyme solution was applied to a hydrophobic chromatography column Phenyl Sepharose HP 26/10 (Pharmacia) previously equilibrated with Buffer A. After the non-adsorbed protein was eluted with Buffer A, the adsorbed protein was eluted with a linear ammonium sulfate concentration gradient (-1.2M / 12CV) of 1.2 to 0M. When the HRase activity of the elution fraction was measured, the activity was recognized at the elution position where the ammonium sulfate concentration was approximately 500 mM to 100 mM. Fractions containing HRase activity were collected, concentrated to a membrane, and dialyzed against 20 mM KPB (pH 7.0).
[0123]
4). Anion exchange chromatography
The obtained enzyme solution was applied to an anion exchange chromatography column Q-Sepharose HP 16/10 (Pharmacia) previously equilibrated with 20 mM KPB (pH 7.0).
After the non-adsorbed protein was eluted with 20 mM KPB (pH 7.0), the adsorbed protein was eluted with a linear NaCl concentration gradient (0.5 M / 12 CV) of 0 to 0.5 M. When the HRase activity of the elution fraction was measured, the activity was recognized at the elution position where the NaCl concentration was about 300 mM to 400 mM. Fractions containing HRase activity were collected and membrane concentrated.
[0124]
5. Gel filtration
The obtained enzyme solution was applied to Superdex 200 pg 16/60 (Pharmacia) previously equilibrated with 20 mM KPB (pH 7.0) and developed in the same buffer. When the HRase activity of the eluted fraction was measured, the activity was found at a position where the molecular weight was estimated to be about 107,0000. Fractions containing HRase activity were collected and concentrated in the membrane, then 1.0 M (NH_Four)₂SO_Four, 20 mM KPB, 1 mM L-benzylhydantoin (BH), pH 7.0 (; Buffer B).
[0125]
6). Hydrophobic chromatography
The obtained enzyme solution was subjected to Phenyl Superose 5/5 (Pharmacia) equilibrated with Buffer B. After the non-adsorbed protein was eluted with Buffer B, the adsorbed protein was eluted with a 1.2 to 0 M linear ammonium sulfate concentration gradient (-1.2 M / 17 CV). The HRase activity of the eluted fraction was measured, and the fraction containing the HRase activity was collected and concentrated in a membrane.
Thereafter, the purification process using Phenyl Superose was once performed in a buffer system not containing L-BH, and then further performed once again in a buffer system to which L-BH was added.
The enzyme solution obtained by the above operation was used as a purified HRase solution.
[0126]
The increase in specific activity as a result of the above purification was measured. As a result of measuring the HRase activity of the cell-free extract after disrupting the cells and the active fraction obtained by purification, the specific activity per unit protein weight increased 658 times by this series of purification operations. I understood it. In the activity measurement method described later, the specific activity of purified HRase was estimated to be 79 U / mg.
[0127]
The obtained active fraction was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis according to a standard method and stained with Coomassie brilliant blue. As a result, it was confirmed that HRase was purified to a single band. The molecular weight was estimated at 27,000. Together with the results of gel filtration, this HRase was assumed to have a subunit tetramer structure with a molecular weight of 27,000.
[0128]
7). Determination of amino acid sequence near the N-terminus
The sequence near the N-terminus of HRase purified as described above was determined as follows.
That is, about 10 μg of protein in the purified HRase fraction was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis in the presence of SDS, and then used in a semi-dry method (protein structure analysis, Hisashi Hirano, Tokyo Chemical Dojin) using Millipore Milli-Blot. The target enzyme was transferred from the gel after electrophoresis onto a polyvinylidene fluoride (PVDF (Bio-Rad, Trans-Blot)) membrane. Subsequently, the target enzyme on the PVDF membrane was subjected to a protein sequencer (ABI, model 476A), and N-terminal amino acid sequence analysis was performed.
[0129]
The amino acid sequence of 30 residues from the N-terminus was determined. The determined amino acid sequence near the N-terminus of HRase is shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
[0130]
(Example 2): Effect of pH on HRase
Changes in enzyme activity due to reaction pH (optimum pH) were measured by the following method.
Using 0.3 μg / ml purified HRase, 0.1 M sodium acetate buffer (pH 3.1, 3.9, 4.9, 6.1), KPB (pH 6.4, 7.2, 8.0) ), Or in the presence of sodium carbonate buffer (pH 8.2, 9.1, 10.2, 10.9), the reaction was carried out at 37 ° C. for 30 minutes, and the optimum pH of HRase was measured.
[0131]
The measurement result was shown in the form of the relative value of the enzyme activity with respect to the actually measured pH of each reaction solution. For convenience, the highest activity was taken as 100. The measurement results are shown in FIG.
[0132]
It was found that the optimum pH of the HRase of the present invention was in the range of about 7 to about 9, strictly about pH 8.0 to 9.0 (see FIG. 3).
[0133]
(Example 3): pH stability of HRase
After leaving 3.0 μg / ml of purified HRase in the presence of each of the above 0.1 M pH Buffers at 0 ° C. for 30 minutes, the pH was adjusted to 8.0, and then at pH 8.0 and 37 ° C. for 30 minutes. The pH stability of HRase was measured by conducting the reaction and measuring the remaining activity.
[0134]
The measurement results are shown in the form of relative values of enzyme activity with respect to pretreatment at each pH. For convenience, the highest activity was taken as 100. The measurement results are shown in FIG.
[0135]
The HRase of the present invention was found to be stable in the range of about pH 6-9 (see FIG. 4).
[0136]
(Example 4): Effect of temperature on HRase
Using 0.3 μg / ml purified HRase, the reaction was carried out at pH 8.0 at 0, 21, 30, 40, 50, 60, 70 and 80 ° C. for 30 minutes, and the optimum temperature of action of HRase was measured.
[0137]
The measurement result was shown in the form of the relative value of the enzyme activity with respect to the actually measured temperature of each reaction solution. For convenience, the highest activity was taken as 100. The measurement results are shown in FIG.
[0138]
The optimum temperature of the HRase of the present invention was found to be in the range of 50 to 60 ° C. (see FIG. 5). The optimum temperature for this reaction is the highest among the conventionally known HRases.
[0139]
(Example 5): Temperature stability of HRase
After leaving 3.0 μg / ml of purified HRase at pH 8.0 at 0, 21, 30, 40, 50, 60, 70 and 80 ° C. for 30 minutes, the reaction was performed at pH 8.0 and 37 ° C. for 30 minutes, The temperature stability of HRase was measured by measuring the remaining activity.
[0140]
The measurement results were shown in the form of relative values of enzyme activity with respect to pretreatment at each temperature. For convenience, the highest activity was taken as 100. The measurement results are shown in FIG.
[0141]
The HRase of the present invention was found to be stable in the range of 40 ° C. or lower (see FIG. 6).
[0142]
(Example 6): Effect of various reagents such as enzyme inhibitors on HRase activity
1.5 μg / ml of purified HRase was added to 25 mM DTT, 25 mM N-ethylmaleimide (NEM), 12.5 mM CuSO_Four, 50 mM monoiodoacetic acid (IAA), 50 mM EDTA, or 50% (v / v) methanol for 30 minutes at pH 8.0 and 0 ° C. Using these as enzyme sources, the reaction was carried out at pH 8.0 and 30 ° C. for 30 minutes to measure the residual activity, and the sensitivity to each inhibitor of HRase was measured. In addition, the enzyme concentration and inhibitor concentration at the time of reaction are each one fifth of that at the time of preincubation.
[0143]
The residual activity was shown as a relative activity when the activity when no reagent was added was taken as 100% (see Table 2). The HRase of the present invention is activated by the addition of DTT (results not shown), and NEM, iodoacetic acid, or Cu²⁺The cysteine residue-modifying reagent markedly inhibited the cysteine residue, and the contribution of the cysteine residue to the activity expression was considered. Since no significant inhibitory effect was observed by the addition of EDTA, it was considered that divalent ions were not necessary for the expression of HRase activity. In addition, preincubation of 50% (v / v) methanol did not affect HRase activity (Table 2).
[0144]
[Table 2]

[0145]
Example 7: Racemization of BH with purified HRase
0.3 mg / ml Purified HRase, 0.12 g / dl D- or L-BH, 50 mM KPB (pH 8.0), 5 mM DTT reaction solution is incubated at 37 ° C., sampled over time, and the amount of BH Was quantified by HPLC. As a control, a similar experiment was performed in an experimental group containing no enzyme to quantify spontaneous racemization of BH. The results are shown in FIG.
[0146]
The HRase of the present invention recognized both D-BH and L-BH as substrates, and the reaction proceeded until the ratio of D and L isomers was 1: 1, regardless of which was started. However, the initial reaction rate of the racemization reaction is faster when L-BH is used as the starting substrate, and the specific activity of purified HRase calculated from the initial reaction rate is 100 U when D-BH is produced from L-BH. In the case of producing L-BH from / mg, D-BH, it was estimated to be 79 U / mg, respectively (see FIG. 7).
[0147]
On the other hand, spontaneous BH racemization was observed even in the control group to which HRase was not added, but it was significantly slower than racemization catalyzed by HRase (see FIG. 7).
[0148]
Example 8: Production of D-Phe from DL-BH or L-BH by a combination of Agrobacterim sp. AJ11220 and HRase
The Agrobacterium sp. AJ11220 strain is a microorganism that was deposited at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry on December 20, 1977, and was assigned a deposit number of FERM-P4347. This strain is known to hydrolyze D-form 5-substituted hydantoin compounds to produce the corresponding D-amino acids (Agric. Biol. Chem. 51, 721, 1987). However, since the AJ11220 strain does not have a hydantoin racemase, if the hydantoin compound does not spontaneously racemize, the L-form 5-substituted hydantoin compound does not produce a D-form amino acid. The molar yield of formation of the corresponding D-amino acid from the -5-substituted hydantoin compound is at most 50%.
Thus, D-Phe production was examined by combining AJ11220 cells and purified HRase using BH that is difficult to racemize spontaneously as a substrate.
[0149]
1. Culture of AJ 11220 strain
CM2G agar medium (0.5 g / dl D-glucose, 1 g / dl yeast extract,
1 g / dl peptone, 0.5 g / dl NaCl, 2 g / dl agar, pH 7.0), refreshed at 30 ° C. for 24 hours, and then seeded in CM2G liquid medium at 30 ° C. for 24 hours.
The main culture medium is 0.5 g / dl D-glucose, 0.5 g / dl (NH_Four)₂SO_Four, 1g / dl yeast extract, 0.1g / dl KH₂PO_Four, 0.3g / dl K₂HPO_Four0.01 g / dl MgSO_Four・ 7H₂After autoclaving O, pH 7.0 at 120 ° C. for 20 minutes, 1 mg / dl each of FeSO_Four・ 7H₂O, MnSO_Four・ 4-5H₂O and 2 g / dl CaCO_ThreeWas added and used. 50 ml of this main culture medium was put into a 500 ml Sakaguchi flask, inoculated with 1 ml of the seed culture solution, and then cultured with shaking at 30 ° C. for 22 hours. In order to induce the enzyme, final concentrations of 2 g / dlD-glucose and 0.2 g / dl DL-BH were added 14 hours after the start of the main culture, and final concentrations of 0.2 g / dl DL-BH were added after 16 and 18 hours. .
After completion of the culture, the cells were collected by centrifugation (10,000 × g, 4 ° C., 10 minutes) and washed with 0.1 M KPB (pH 7.0) to obtain washed cells.
[0150]
2. Production of D-Phe from DL-BH or L-BH by combination of AJ 11220 and HRase
0.5 g / dl (26 mM) DL-BH or L-BH, 0.84 μg / ml purified HRase, 0.1 M KPB (pH 8.0), 0.5 mM CoCl₂And 2 g / dl of AJ11220 strain wet cells were allowed to stand at 30 ° C. In the reaction solution, oxygen in the reaction solution was previously removed by nitrogen replacement. The reaction mixture was sampled over time and analyzed by HPLC to quantify the produced D-Phe.
[0151]
The time course of D-Phe generation is shown in FIG. When HRase was not added, when D-BH as a control was also used as a substrate, almost all of the substrate was converted to D-Phe after 30 hours of reaction (production amount 25.4 mM, molar yield 98%, □ in FIG. However, the maximum amount of D-Phe produced from DL-BH was 12.9 mM (reaction 22 hours, molar yield 49%, ○ in FIG. 8), and only 1.5 mM was produced from L-BH. (Reaction 30 hours, molar yield 6%, Δ in FIG. 8). The amount of D-Phe produced when DL-BH was used as a substrate was approximately half that when D-BH was used as a substrate, and almost no D-Phe was produced when L-BH was used as a substrate. Thus, in this reaction system, it was considered that the rate-limiting reaction for producing D-Phe from BH was a racemization reaction from L-BH to D-BH.
[0152]
On the other hand, when HRase was added, 24.6 mM (molar yield 94%) of D-Phe (black □ in FIG. 8) was obtained from DL-BH after 30 hours of reaction, and the same was observed from L-BH. It was observed that 24.6 mM (94% molar yield) of D-Phe (black triangle in FIG. 8) was formed. These values were almost the same as when D-BH was used as a substrate, and it was considered that the rate-limiting of the racemization reaction from L-BH to D-BH was almost completely canceled by the addition of HRase.
[0153]
From the above, when a DL- or L-5-substituted hydantoin compound is allowed to act on a D-form selective hydrolysis reaction system to produce the corresponding D-amino acid, the 5-substituted hydantoin compound used as a substrate has a spontaneous racemization ability. When there is no or weak, the L-5 substituted hydantoin compound remains unreacted in the reaction solution because it is not hydrolyzed. By combining this with HRase, the total amount of the substrate is efficient. To yield D-amino acids in high yield.
[0154]
As a matter of course, when the 5-substituted hydantoin compound is similarly allowed to act on the L-form selective hydrolysis reaction system to produce the corresponding L-amino acid, the total amount of the substrate can be efficiently hydrolyzed by combining HRase. L-amino acids can be produced with high yield.
[0155]
(Example 9): Racemization of various optically active 5-substituted hydantoin compounds other than BH
The racemization catalytic ability of this HRase for optically active 5-substituted hydantoin compounds other than BH was examined. In the same manner as in Example 8, the production of D-amino acid from L-5 substituted hydantoin by the combination of Agrobacterium sp. AJ 11220 and HRase was confirmed.
[0156]
1 g / dl of various 5-substituted hydantoins at 1.3 μg / ml purified HRase, 0.1 M KPB (pH 8.0), 0.5 mM CoCl₂And 2 g / dl of AJ11220 strain wet cells were allowed to stand at 37 ° C. for 22 hours. After confirming that the corresponding D-amino acid is produced from the D-form substrate in the absence of HRase, the corresponding D-amino acid is not produced from the L-form substrate. Thus, it was judged that the substrate was recognized when the production of D-amino acid was observed from the L-form substrate in the presence of HRase. For the production of D-amino acids, optical resolution TLC (MERCK, HPTLC CHIR) is converted to methanol: H.₂Qualitatively estimated by developing with O: acetonitrile = 1: 1: 4.
[0157]
As a result, HRase racemizes L-5-indolylmethylhydantoin, L-5- (p-hydroxybenzyl) hydantoin, and L-5-isobutylhydantoin, and each corresponding D-tryptophan, D-tyrosine, D-leucine The production of
[0158]
(Example 10): Isolation of HRase gene
Hereinafter, isolation of the HRase gene and E. coli. Although the expression of HRase in Coli is described, the strain used was Microbacterium liquefaciens AJ3912 (FERM-P3133). Both E. gene isolation and HRase expression Coli JM109 was used as a host, and pUC18 was used as a vector.
[0159]
1. Creation of PCR primers based on the determined amino acid sequence
Based on the aforementioned N-terminal amino acid sequence of HRase derived from Microbacterium liquefaciens AJ3912 (FERM-P3133) strain (SEQ ID NO: 8), the mixes shown in SEQ ID NOs: 9 and 10, respectively. Primers were created.
[0160]
2. Acquisition of bacterial cells
Microbacterium liquefaciens AJ3912 (FERM-P3133) strain was added to CM2G agar medium (0.5 g / dl glucose, 1.0 g / dl yeast extract, 1.0 g / dl Peptone, 0.5 g / dl NaCl). 2 g / dl agar, pH 7.0) and cultured at 30 ° C. for 24 hours to refresh the bacteria. One platinum loop inoculum was inoculated into a 500 ml Sakaguchi flask in which 50 ml of CM2G liquid medium was put, and cultured with shaking at 30 ° C. for 16 hours.
[0161]
3. Obtaining chromosomal DNA from bacterial cells
50 ml of the culture solution was subjected to centrifugation (12,000 × g, 4 ° C., 15 minutes) and collected. The cells were suspended in 10 ml of 50: 20TE (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 mM EDTA), washed, and collected by centrifugation. Again, the cells were suspended in 10 ml 50:20 TE. Further, 0.5 ml of a 20 mg / ml lysozyme solution and 1 ml of a 10% SDS solution were added to this suspension, followed by incubation at 55 ° C. for 20 minutes. After incubation, deproteinization was performed by adding 1 volume of 10: 1 TE saturated phenol. To the separated aqueous layer, 1 volume of 2-propanol was added to precipitate and collect DNA. After the precipitated DNA was dissolved in 0.5 ml 50:20 TE, 5 μl of 10 mg / ml RNase and 5 μl of 10 mg / ml Proteinase K were added and reacted at 55 ° C. for 2 hours. After the reaction, protein removal was performed with 1 volume of 10: 1 TE saturated phenol. Further, 1 volume of 24: 1 chloroform / isoamyl alcohol was added to the separated aqueous layer and stirred to recover the aqueous layer. A 3M sodium acetate solution (pH 5.2) was added to the aqueous layer obtained after this operation was further performed twice so that the final concentration was 0.4 M, and further 2 volumes of ethanol was added. The resulting DNA was collected, washed with 70% ethanol, dried and dissolved in 1 ml of 10: 1 TE.
[0162]
4). Acquisition of DNA fragment containing part of HRase gene by cassette PCR
TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was used for isolation and amplification of a DNA molecule containing a gene encoding HRase (fhr) by the cassette PCR method. Unless otherwise stated, experiments were conducted based on the instructions. In the cassette PCR method, when primer 1 (1st PCR) and primer 2 (2nd PCR) were used as primers, a band of about 0.4 kb (fragment 1) was amplified between the Hind III cassette. By determining the base sequence of this fragment, it was confirmed that fragment 1 was a part of fhr.
[0163]
5. Cloning of HRase gene from gene library
Next, in order to obtain the full length of fhr, Southern hybridization was first performed using fragment 1 as a probe.
[0164]
The DNA fragment used as a probe was adjusted to about 50 ng / μl, and 16 μl of this DNA solution was incubated at 37 ° C. for 24 hours according to the protocol using DIG High Prime (Boehringer Mannheim) to label the probe.
1 μg of chromosomal DNA was completely digested with a combination of various restriction enzymes, electrophoresed on a 0.8% agarose gel, and then blotted on a nylon membrane (Boehringer Mannheim, Nylone membranes positively charged). Southern hybridization was performed according to the following standard method. Hybridization was performed using DIG EasyHyb (Boehringer Mannheim). After prehybridization at 50 ° C. for 30 minutes, a probe was added and hybridization was performed at 50 ° C. for 18 hours. Detection was performed using DIG Nucleotide Detection Kit (Boehringer Mannheim).
[0165]
As a result, a band was detected at a position of about 2.9 kb in the EcoRI / PstI cleavage product.
This 2.9 kb region fragment was recovered and ligated to pUC18. A library (120 strains) was prepared using E. coli JM109. Colony hybridization was performed according to a conventional method. The colony was transferred to a nylon membrane filter (Boehringer Mannheim, Nylon membranes for colony and plaque hybridization) and subjected to alkali denaturation, neutralization, and immobilization. Hybridization was performed using DIG Easy Hyb. The filter was immersed in buffer, and prehybridization was performed at 42 ° C. for 30 minutes. Thereafter, the above labeled probe was added, and hybridization was performed at 42 ° C. for 18 hours. After washing with SSC buffer, one positive clone was selected using DIG Nucleotide Detection Kit.
[0166]
6). Nucleotide sequence of HRase gene derived from Microbacterium liquefaciens AJ3912 (FERM-P3133)
A plasmid possessed by the selected transformant was prepared according to the method described in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989), and the base sequence in the vicinity of the hybridized probe was determined. An open reading frame (ORF) encoding a protein containing the 30-residue N-terminal amino acid sequence of HRase is present and confirmed to be a gene fhr encoding HRase. The full length base sequence of the HRase gene is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. The obtained ORF showed 48% homology with a known HRase derived from the genus Pseudomonas (J. Bacteriol. 174, 962, 1992).
[0167]
7). E. of the HRase gene. Expression in Coli
fhr to E.I. A plasmid pUCFHR in which fhr was ligated downstream of the lac promoter of pUC18 was constructed for expression in Coli. A fragment amplified by PCR using the chromosomal DNA of Microbacterium liquefaciens AJ3912 (FERM-P3133) as a template and the oligonucleotides shown in Table 2 as primers, was treated with EcoRI and BamHI, and EcoR I of pUC18 After ligation with BamHI cuts, E. coli. Coli JM109 was transformed. A strain having the target plasmid was selected from the ampicillin resistant strains and named the constructed expression plasmid pUCFHR.
[0168]
[Table 3]

[0169]
HRase E. p. with pUCFHR. The transformant expressed in Coli was seed-cultured in LB medium containing 0.1 mg / ml ampicillin at 37 ° C. for 16 hours. 1 ml of this preculture was seeded in a 500 ml Sakaguchi flask in which 50 ml of LB medium was put, and main culture was performed at 37 ° C. 2.5 hours after the start of the culture, isopropyl 1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) was added to a final concentration of 1 mM, and further cultured for 4 hours.
After completion of the culture, the cells are collected, washed, suspended in 5 ml of 50 mM KPB (pH 8.0), and bead beater with 0.1 mmφ glass beads for 3 minutes (30 seconds × 6 times, 90 seconds interval). It was crushed with. The solution was collected, centrifuged at 20,000 g × 10 minutes, and the supernatant was used as a cell-free extract.
[0170]
8). HRase activity measurement
After completion of the culture, a cell-free extract was prepared, and HRase activity was measured using this as an enzyme source.
HRase activity was measured by incubating a reaction solution containing 120 mg / dl L-BH, 50 mM KPB (pH 8.0), 5 mM DTT, 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, and an enzyme solution at 37 ° C. for 30 minutes. Later, 9 volumes of 1.1 mM CuSO_Four11.1 mM H_ThreePO_FourThe reaction was stopped by adding. After removing the precipitate by centrifugation at 20,000 g × 10 minutes, the amount of BH racemized by HPLC was determined. As a unit of enzyme activity, 1 U was defined as an enzyme activity that racemizes 1 μmol of BH per minute under these conditions.
[0171]
The HPLC conditions used for the analysis are as follows.
Column: Daicel Chemical CHIRALPAK WH 0.46cmφ × 25cm
Mobile phase: 5% (v / v) methanol, 1 mM CuSO_Four
Column temperature: 50 ° C
Flow rate: 1.5 ml / min
Detection: UV₂₁₀
[0172]
As a result, HRase activity was detected only when pUC18FHR was introduced, and it was confirmed that the cloned fhr gene was expressed in E. coli (Table 4).
[0173]
[Table 4]

[0174]
【The invention's effect】
According to the present invention, HRase that has not been known so far can be obtained from Microbacterium bacteria. Since this HRase has a feature that the optimum temperature for the reaction is higher than that of the conventionally known HRase, the reaction temperature can be increased. As a result, the reaction rate can be further increased, and the intended reaction can be performed. It can be made to proceed efficiently. In addition, since the risk of microbial contamination of the reaction solution during the reaction is reduced, there is an advantage that process management including quality maintenance becomes easy. Furthermore, by using the hydantoin racemase of the present invention in combination with a system that optically hydrolyzes a 5-substituted hydantoin compound, it is useful for producing pharmaceuticals, chemical industrial products, food additives, etc. in high yield. Optically active amino acids can be produced.
[0175]
[Sequence Listing]

[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the structure of a structural gene group encoding hydantoin racemase, hydantoinase and N-carbamyl-L-amino acid hydrolase.
FIG. 2 is a flowchart showing a production process of the hydantoin racemase of the present invention.
FIG. 3 is a diagram showing an optimum pH curve of the hydantoin racemase of the present invention.
FIG. 4 is a diagram showing a pH stability curve of the hydantoin racemase of the present invention.
FIG. 5 is a graph showing an optimum temperature curve of the hydantoin racemase of the present invention.
FIG. 6 is a graph showing a temperature stability curve of the hydantoin racemase of the present invention.
FIG. 7 is a diagram showing a time course of BH racemization by the hydantoin racemase of the present invention.
○: Substrate D-BH (HRase added), △: Substrate D-BH (no HRase added),
●: Substrate L-BH (HRase added), Black △: Substrate L-BH (no HRase added)
FIG. 8 is a diagram showing a time course of D-Phe generation.
□: Substrate D-BH (no HRase added), ○: Substrate DL-BH (no HRase added),
△: Substrate L-BH (no HRase added), Black □: Substrate DL-BH (HRase added),
Black △: Substrate L-BH (HRase added)

Claims (14)

A protein having the following amino acid sequence (a) or (b) and having a 5-substituted hydantoin racemase activity.
(A) Amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (b) Substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing Contains amino acid sequence The protein according to claim 1, wherein the optimal temperature of action is in the range of 50 to 60 ° C. in a 5-substituted hydantoin racemase that catalyzes a racemization reaction of a 5-substituted hydantoin. The protein according to claim 1 or 2, wherein an optimum pH of action is in the range of pH 7 to 9 in a 5-substituted hydantoin racemase catalyzing a racemization reaction of a 5-substituted hydantoin. A method for racemizing an optically active 5-substituted hydantoin compound, comprising causing the protein according to any one of claims 1 to 3 to act on an optically active 5-substituted hydantoin compound. An N-carba, wherein the protein according to any one of claims 1 to 3 , and an enzyme that optically hydrolyzes a 5-substituted hydantoin or an enzyme-containing product thereof is allowed to act on a 5-substituted hydantoin. A method for producing mil amino acids. The protein according to any one of claims 1 to 3, an enzyme that hydrolyzes a 5-substituted hydantoin or an enzyme-containing product thereof, and an enzyme or an enzyme-containing product that optically hydrolyzes an N-carbamylamino acid. Is made to act on a 5-substituted hydantoin. DNA encoding the protein according to any one of claims 1 to 3 . A DNA encoding a protein having the following base sequence (a) or (b) and having 5-substituted hydantoin racemase activity:
(A) Base sequence described in SEQ ID NO: 1 (b) Base sequence that hybridizes with the base sequence described in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions A DNA encoding a protein having the following amino acid sequence (c) or (d) and having a 5-substituted hydantoin racemase activity.
(C) amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (d) substitution, deletion, insertion, addition or inversion of one or several amino acid residues in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing Contains amino acid sequence   Recombinant DNA obtained by connecting the DNA according to any one of claims 7 to 9 and vector DNA.   The recombinant DNA according to claim 10, wherein the vector DNA is derived from a pUC plasmid, a pBR322 plasmid or a derivative thereof.   A cell transformed with the recombinant DNA according to claim 10 or 11.   The cell according to claim 12, wherein the cell is derived from Escherichia coli.   14. Production of a protein having a 5-substituted hydantoin racemase activity, wherein the cell according to claim 12 or 13 is cultured in a medium, and a protein having a 5-substituted hydantoin racemase activity is accumulated in the medium and / or in the cells. Method.

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