JP3453604B2 - 新規なバイオチップ及びその作製方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生体材料を固定化
した微小担体と疎水性固定部を備えたパターン化基板
を、無作為液中自己組織化法を用いて疎水性相互作用に
より固定化することを特徴とする、新規なバイオチップ
の作製方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＤＮＡチップやプロテインチップを作製
する方法として、幾つかの技術が現在用いられている。
フォトリソグラフィを利用した固相合成法は、幾何級数
的種類の生体高分子オリゴマーの全種類を高密度に合
成、配列できる技術である。しかし、固相合成方法であ
るため長い鎖長のポリマーを得ることができず、蛋白質
のような高次構造を有する材料の固定化方法には適用で
きない。また、多種類のフォトマスクを利用する工程数
の多い方法であるため、低コスト化には向いていない。
また、スタンプ法は、あらかじめ用意した多種類の材料
をチップ上に並べていく技術である。任意の材料に適用
できるが、個々の材料の固定は、物理・化学吸着か、簡
単な条件で反応が進行する固定化法に限定される。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】そこで、上記の従来の
バイオチップの作製方法の欠点を補うことが可能であ
り、量産にも適した、新規のバイオチップの作製方法を
開発することが、本発明の課題である。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、高集積型
バイオチップの開発にあたり、生体材料の新しい固定化
方法を提案した。即ち、生体材料を基板上に直接固定化
するのではなく、微小担体に固定化した後、担体をパタ
ーン化した基板上に固定化する２段階の固定化方法を採
用した。第二段階目の基板上への固定化方法として、微
小化した担体群を、無作為液中自己組織化法により、疎
水性相互作用を介して微小担体を基板に固定化した。無
作為液中自己組織化法については下記に詳しく述べる
が、この方法によると固定化材料の種類の増加や固定化
領域の微小化に際してもその工程が複雑にならず、生体
材料の活性を損なうことなく固定化できると期待され
る。また本方法を用いることにより、多くの分析を同時
に行えると共に、微小化により試薬や試料の消費量の抑
制や複合的情報の取得が期待されている。本発明の方法
は、このための微小担体の作製の方法、および配置の親
和力として薄板のダイシングにより得た微小担体とパタ
ーン化疎水性膜を有する基板との疎水性相互作用を用い
た方法に関するものである。

【０００５】

【発明の実施の形態】本発明のバイオチップの作製方法
は、生体材料を微小担体に対して固定化する過程と、そ
の担体を配置する過程より成る。微小担体に対する固定
化では個別に各種の生体材料をカバーガラスに固定化し
た後、ダイシングマシーンで１００〜４００μｍ角に切
った担体に固定化する。これを適当な量ずつ配合し、担
体として性質が等しく化学・生化学的に性質が異なる微
小担体の懸濁液を得る。後者の配置工程では無作為液中
自己組織化法により、担体の疎水性相互作用を用いて基
板と結合させる。基板上の形状や材料を制御することに
よっても、配置用サイトを格子上に並べておくことがで
きる。

【０００６】無作為液中自己組織化法とは、スピンコー
ター上に設置した液体中でこのサイト付近に先の担体懸
濁液を滴下し、そのスピンコーターを回すことで重力、
遠心力、疎水性相互作用また種々の親和力によって１つ
のサイトに一つだけの担体を配置させる方法である。た
とえば重力や疎水性相互作用によって、サイトの中に、
ほぼそのサイトと同じ大きさの担体を落とし込むと、２
つ目以降は入ることができない。基板上に多くのサイト
を用意して十分な数の担体を滴下すると、一度に数多く
のサイトに担体を配置させることが可能であり、この様
な方法を自己組織化法という。懸濁液に化学的、生化学
的に性質が異なる生体材料を固定化した担体の混合物を
用いれば、最終的に多種類の生体材料を密に固定化した
基板を得ることができる。このとき特定の生体材料を固
定化した担体が基板上のどこに配置されるかは制御され
ていないので、本発明の方法においては無作為に組織化
される。本発明の方法において、センサー応答のキャリ
ブレーション等によって、最終的な位置を知ることが可
能となる。この様に、生物材料を固定化した微小担体と
基板とを結合させるにあたり、無作為液中自己組織化法
によって疎水性相互作用を利用して結合させた事が、本
発明の最も大きな特徴である。

【０００７】本発明は、パターン化基板及び生体材料固
定化担体を備えたバイオチップである。ここで、疎水性
固定部と生体材料固定化担体は、疎水性相互作用により
結合している。尚、パターン化基板は基板とその基板の
片面に配列した複数の疎水性固定部とを備えており、そ
の基板の疎水性固定部の間は親水性である。また、生体
材料固定化担体は微小担体、その微小担体の片面の表層
に形成した疎水性コーティング、更にその微小担体の他
方の片面に固定化した生体成分又は生体成分類似物質を
備えている。ここで固定化する生体成分又は生体成分類
似物質として、核酸、蛋白質、脂質、生体模倣有機分
子、細胞及びこれらの複合体が挙げられる。ここでいう
生体模倣分子は、生体機能材料が持つ特異的認識能や、
信号変換機能などに相当する機能を発現するか、もしく
は安定化や信号伝達のように他の機能を支援する分子を
指す。認識能については、精密合成による認識分子やモ
レキュラーインプリンティング法によって得られた分子
認識ポリマー、分子認識能を目的として得られるコンビ
ナトリアル化学の産物などがある。信号変換機能につい
ては、触媒能を有する分子、光学特性が変化する分子、
酸化または還元されうる分子、重量変化を起こす分子な
どがある。支援機能には疎水場、または親水場などによ
り他の生体材料を安定化させる分子のほか、固定化を仲
介する分子、電子伝達する導電性分子などがある。ま
た、上記の構造より成るパターン化基板及び生体材料固
定化担体もまた、本発明の範囲内である。

【０００８】本発明のバイオチップアレイの構造を、図
１に示す。パターン化基板は、スライドガラス等の基板
（１）上に、疎水性固定部（２）が複数存在していると
いう構造をしている。パターン化基板は、親水性部分
（８）の間に疎水性部分（９）が格子状に配列されてい
る、という構造となっている。一方、生体材料固定化担
体は、疎水性コーティング（３）、カバーガラス等の微
小担体（４）、クロムコーティング（５）、金コーティ
ング（６）及び生体材料（７）の順番に層を形成してい
る。ここで、微小担体（４）の大きさは約１０〜５００
μｍで、厚さは１〜１２０μｍであることが望ましい。
また、疎水性コーティング（３）の厚さは１分子層〜約
１．０μｍ、クロムコーティング（５）の厚さは約２０
０オングストローム、金コーティング（６）の厚さは約
２０００オングストロームであることが望ましい。更
に、基板（１）の厚さは約０．５〜５ｍｍ、疎水性固定
部（２）の厚さは１分子層〜約２．０μｍであることが
望ましい。疎水性固定部（２）と疎水性コーティング
（３）は、疎水性相互作用により結合しており、上述し
た無作為液中自己組織化法によって、パターン化基板に
生体材料固定化担体が結合したバイオチップを作製する
ことができる。無作為液中自己組織化法の原理より、微
小担体（４）の大きさと疎水性固定部（２）の大きさは
ほぼ等しくなるように作製する必要がある。

【０００９】上記の生体材料固定化担体は、以下の様な
過程で作製することができる。 （１）親水性のカバーガラスの片面の表層を、疎水性コ
ーティングした後に焼成を行う。 （２）前記カバーガラスの疎水性コーティングを行わな
かった面にクロムを蒸着してクロム蒸着層を形成する。 （３）前記クロム蒸着層の上に金を蒸着して金蒸着層を
形成する。 （４）前記金蒸着層をジチオジプロピオン酸で処理し、
更にエチル−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドで
処理を行った後にアビジンを作用させることにより、ア
ビジンで修飾した金の層を形成する。 （５）前記アビジンで修飾した金の層にビオチン化した
生体成分を結合させる。 （６）カッターで切断する。

【００１０】ここで、疎水性相互作用を与えることがで
きる限り、疎水性コーティングを行う目的で種々の材料
を使用する事が出来る。その際に、環状パーフルオロポ
リマーを用いることが好ましく、ＣＹＴＯＰを用いるこ
とが特に好ましい。ＣＹＴＯＰの化学構造式を化１に、
物理的特性を表１に、それぞれ示す。ＣＹＴＯＰにより
疎水性コーティングを行った後に、コーティングを行わ
なかった面にクロムと金で蒸着を行う（図２）。クロム
で蒸着を行うのは、金はガラスに対する付着性が良くな
いために、金の前にクロムの蒸着層を作製する必要があ
るからである。

【００１１】

【化１】

【００１２】

【表１】

【００１３】金をジチオジプロピオン酸で処理を行うこ
とにより、チオール基を介してジチオジプロピオン酸は
金と結合する。その後、ジチオジプロピオン酸とエチル
−ジメチルアミノプロピルカルボジイミドを反応させる
ことにより、イミドを結合させる。更にアビジンと反応
させるとイミドが遊離して、ペプチド結合を介してアビ
ジンが金蒸着層の上に結合する。このような反応を用い
て固定化したアビジンにビオチン化ＤＮＡを作用させる
と、ビオチン−アビジン親和性相互作用により、微小担
体上にＤＮＡが固定化される（図３）。この様にして固
定化したＤＮＡにＦＩＴＣでラベル化したＤＮＡが結合
すると、ＦＩＴＣの蛍光により検出することが可能であ
る。また、同様の反応を用いて、ＤＮＡのみならず、ポ
リペプチドを固定化することも可能である。

【００１４】また、上記のパターン化基板は、以下の様
な過程で作製することができる。 （１）親水性のスライドガラスの片面の表層を、疎水性
コーティングした後に焼成を行う。 （２）前記カバーガラスの疎水性コーティングを行った
面にクロムを蒸着してクロム蒸着層を形成する。 （３）前記クロム蒸着層の上に金を蒸着して金蒸着層を
形成する。 （４）前記金蒸着層にフォトレジストを作用させ、露光
した後に現像を行う。 （５）前記金蒸着層のエッチングを行った後に、フォト
レジストを除去する。 （６）前記クロム蒸着層のエッチングを行った後に、前
記疎水性コーティングのエッチングを行う。 （７）フォトレジストを除去して、残っている金及びク
ロムを再びエッチングして除去する。

【００１５】ここで、疎水性相互作用を与えることがで
きる限り、疎水性コーティングを行う目的で種々の材料
を使用する事が出来る。その際に、環状パーフルオロポ
リマーを用いることが好ましく、商品名ＣＹＴＯＰを用
いることが特に好ましい。その様にして疎水性コーティ
ングを行った面に、クロムと金で蒸着を行う。この金蒸
着層にフォトレジストを作用させ、露光した後に現像を
行うことにより、パターン化基板の形状をプリントした
フォトレジスト層を作製する。そのために、金蒸着層の
エッチングを行った際に、感光していない部分のみが除
去され、パターン化基板の形状のプリントの通りに溝が
形成される。フォトレジストを除去した後に、クロム蒸
着層及び疎水性コーティングのエッチングを行って、疎
水性コーティングを有さない部分をパターン化基板の溝
の形状に作製する。それから、残った金蒸着層とクロム
蒸着層を除去すると、疎水性コーティングされたサイト
と疎水性コーティングされていない溝だけが残り、バタ
ーン化基板が作製される（図４）。

【００１６】更に本発明は、上記の方法により作製した
生体材料固定化担体とパターン化基板とを、無作為液中
自己組織化法を用いて、疎水性相互作用によって固定化
することにより、バイオチップを作製する方法である。
ここで、無作為液中自己組織化法とは、上述したよう
に、回転しているスピンコーター中において、液体に懸
濁させた生体材料固定化担体を、パターン化基板上に結
合させる方法である（図１）。パターン化基板上に作製
した疎水性被覆のパターンの大きさは、生体材料固定化
担体とほぼ同一であるので、１つの基板パターンには１
つの微小担体しか結合しない、という特質を有する。本
方法において、あるパターンにどの様な微小担体が結合
するかは制御されず、無作為である。

【００１７】更に本発明において、生体材料固定化担体
に何らかの識別子を持たせることもまた可能である。こ
こで「識別子」とは、前記担体を区別することを可能と
するために前記担体上に記載された指標を、包括的に意
味するものである。本発明において採用している無作為
液中自己組織化法においては、生体材料を固定化した担
体が基板上のどこに配置されるかを制御することはでき
ない。そのために、生体材料を固定化した担体に識別子
を付与して、各々の生体材料固定化担体が配置された位
置を識別することを可能することにより、本発明の有用
性は更に高くなる。よって本発明者らは、何らかの識別
子を生体材料固定化担体に付与することにより、その識
別子を指標として配置操作後に何がどこに配置されたか
を確認するための手段もまた開発した。

【００１８】下記の実施例においては、フォトリソグラ
フィーの手法によって生体材料固定化担体が有している
金薄膜を部分的に取り除くことにより、識別子を構成す
るタグの種々のパターンを書き分けて、そのパターンの
配列の組み合わせを読み取ることにより各担体の識別を
行っている。即ち、金蒸着をしたカバーガラス基板上に
フォトリソググラフィーによりタグを書き込んだ後に、
エッチングにより金薄膜を除去し、タグを構成している
パターンの種々の組み合わせを作製することにより、そ
のパターンを識別子として機能させた。より具体的に
は、２ｘ５の格子状の微小タイルから成るタグを用い
て、１つの微小タイルを１ビットとしてタイルの有無の
パターンを二進法の数字に変換することにより、識別の
ための数字を書き込んだ。

【００１９】本発明の識別子は、その他の様々な構成を
とることが可能である。実施例においては格子状の微小
タイルのパターンの配列を識別子として採用したが、例
えばバーコードの様に並列に配置している複数の線の組
み合わせを用いて、それらの線の太さにより識別させる
こともまた可能であると思われる。生体材料固定化担体
上に記載することが可能であって、個々の担体を識別す
る機能することを可能とする「識別子」としての機能を
有する限り、どの様な手段によりパターンを書き分ける
方法を用いても、本発明の範囲内であると解されるべき
である。

【００２０】リソグラフィー等の手段により記載される
２次元的形状の特徴により識別する手段は、全て本発明
の範囲内であると理解されるべきである。即ち本発明の
識別子は、太さ、長さ、大きさの違う図形、またはその
組み合わせ、文字、文字に類する形状等により記載され
ることが可能である。更に２次元的形状のみならず、エ
ッチング深さの様な３次元的形状の他、担体上への堆積
や固定化あるいは担体の表面改善によって得られる薄膜
の形状、厚み、材質、およびそれらの組み合わせに伴う
特徴によって識別する「識別子」によっても本発明の目
的を達することが可能であり、本発明の範囲内であると
解されるべきである。

【００２１】また、識別子としての機能を有するパター
ンを生体材料固定化担体に記載する手段は、実施例にお
いて述べているフォトリソグラフィーによるエッチッン
グに限定されるものではない。パターンを記載する手段
のその他の例として、紫外線リソグラフィー、Ｘ線リソ
グラフィー、電子ビームリソグラフィー、レーザーパタ
ーニング、集束イオンビームパターニング、スクリーン
印刷、スタンプなどの手段考えられる。しかしそれらに
限定されるものではなく、担体に識別子を記載すること
ができる限り、どの様な手段を用いても本発明の範囲内
であると解されるべきである。

【００２２】

【実施例】（実施例１） （試薬）ＣＹＴＯＰ（ｃｙｃｌｉｚｅｄ ｐｅｒｆｌｕ
ｏｒｏ ｐｏｌｙｍｅｒ（ＣＰＦＰ）の商品名、型番：
ＣＴＬ−８０９Ｍ）またＣＹＴＯＰ溶液剤の（Ｃ₄
Ｆ₉）Ｎ（型番：ＣＴ−Ｓｏｌｖ１８０）は旭化成のも
のを用いた。３，３’−ジチオジプロピオン酸は、ＰＦ
ＡＬＴＺ＆ＢＡＵＥＲ社のものを用いた。基板超音波洗
浄用のアセトン、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミ
ド）、アビジン（分子量６７０００、卵白由来）、トリ
ス、塩化ナトリウム、エタノール、ヨウ化カリウム、水
酸化ナトリウム、フェリシアン化カリウムは和光純薬工
業のものを用いた。ＥＤＣ（塩酸１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）は東京化
成工業のものを用いた。

【００２３】生体材料としては、５’末端に各々ビオチ
ン及びＦＩＴＣを修飾した０．２μＭスケールの二重螺
旋ＤＮＡをニッシンボーに委託合成した。塩基配列は各
々、５’−ＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧＡＣＧＴＣＡＴＣＣ
Ｇ−３’（ＣＲＥ（２１ｂｐ））、５’−ＡＧＧＡＡＴ
ＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＧＣＡ−３’（ｒａｎｄｏｍ
（２０ｂｐ））、そして５’−ＧＡＡＡＡＡＡＡＡＴＧ
ＡＣＧＴＣＡＴＣＣＧ−ＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＡＧＣ
ＴＴＧＧＣＡ−３’（ＣＲＥ−ｒａｎｄｏｍ（４１ｂ
ｐ））である。ポジ型レジストのＯＦＰＲ−８００とそ
の専用現像液のＮＭＤ−３；２．３８（産業用）は東京
応化工業のものを用いた。ヨウ素は岸田化学のものを用
いた。基板洗浄用溶媒には、電子工業用（関東化学）ア
セトンを、その他の試薬には化学・生化学用特級または
その相当品を用いた。水はクリーンルームプロセスでは
超純水（１８．０ＭΩ・ｃｍ）を、その他の場合は蒸留
水（４９．５×１０^-6Ｓｃｍ，ｐＨ４．８６）を用い
た。

【００２４】（カバーガラスの微小加工およびパターン
化した基板の作製）カバーガラスの微小加工の微細加工
についての模式図を、図２に示した。まず、カバーガラ
ス基板（０．１０〜０．１２ｍｍ、１８ｍｍ×１８ｍ
ｍ、西ドイツ）の表面は超音波洗浄器（Ｗ−２２２、Ｈ
ｏｎｄａ）を用いて純水、アセトン、純水の順にそれぞ
れ３０分間洗浄した。そして、カバーガラスの片面はス
ピンコーター（１Ｈ−Ｄ３、ＭＩＫＡＳＡ）により５０
０ｒｐｍで１０秒、１０００〜４０００ｒｐｍで２０秒
にして、（Ｃ₄ Ｆ₉ ）Ｎの溶剤液で０．４５〜９重量％
の濃度に希釈させたＣＹＴＯＰをピペットで１００μＬ
滴下させることによって０．５〜２．０μｍの厚さでコ
ーティングして疎水性にした。

【００２５】次に、１１５℃の恒温オーブン（ＤＳ６
４、ヤマト科学）の中に入れて４時間ハードベーキング
した。そして、その反対面上にタングステンボートを用
いる抵抗加熱型の小型真空蒸着装置（ＳＶＣ−７００Ｔ
ＵＲＢＯ−ＴＭ、サンユウ）を用いてクロムを厚さ約２
００オングストローム蒸着し、その後真空を破ることな
く続けて金（純度９９．９９％、フルヤ金属）を厚さ約
２０００オングストローム蒸着した。膜厚は水晶振動子
（６ＭＨｚ ＰＫＧ１０、ＬＥＹＢＯＬＤ ＩＮＦＩＣ
ＯＮ）を用いる膜厚モニター（ＴＭ−２００Ｒ、Ｍａｘ
ｔｅｋ）で測定し、蒸着速度をクロムの場合は０．５〜
１．０オングストローム／ｓで、金の場合は５．０〜１
０．０オングストローム／ｓの範囲になる様に調節し
た。真空度はイオン真空ゲージ（ＵＬＶＡＣ ＧＩ−Ｔ
Ｌ３）で測り、１０^-6ｔｏｒｒから開始した。蒸着後、
アニーリング等の処理は施さなかった。

【００２６】金蒸着のカバーガラス基板上に、図３のよ
うな過程でチオール誘導体およびアビジンを介して５’
末端にビオチン修飾したＤＮＡを固定した。まず、１ｍ
Ｍ濃度の３、３’−ジチオジプロピオン酸水溶液３ｍＬ
の中に金蒸着のカバーガラスを室温で２０分間浸した。
水溶液に１００ｍｇ／ｍＬの濃度にしたＮＨＳとＥＤＣ
を混合液としてカルボキシル酸と３０分反応させた後乾
燥させた。アビジンを緩衝液（ｐＨ７．９、１０ｍＭト
リス−塩酸、０．２Ｍ塩化ナトリウム）で０．２ｍｇ／
ｍＬとなるように調製した１ｍＬの溶液に１時間浸して
置いた。１Ｍ濃度のエタノールアミン水溶液１ｍＬにカ
バーガラスを３０分間浸して未反応のカルボキシル基を
不活性化した。アビジン修飾した金を緩衝液（ｐＨ７．
９、１０ｍＭトリス−塩酸、０．２Ｍ塩化ナトリウム）
にビオチン化ＤＮＡを１μＭになるようにした１ｍＬの
溶液に２５℃で３０分間浸して置いた。ここで、ビオチ
ン化ＤＮＡ鎖はアビジン分子の４つの結合サイトの１つ
と結合する。ビオチン化ＤＮＡの固定量はＤＮＡ溶液に
浸す時間により制御できた。

【００２７】そして、図２の４番目に示すようにビオチ
ン化ＤＮＡ修飾したカバーガラスを粘着性のダイシング
テープ（Ａｄｗｉｌｌ Ｄ−２１０、ＬＩＮＴＥＣ）に
付けた後ダイシングンマシン（Ａ−ＷＤ−１０Ａ、東京
精密）を用いてダイヤモンドカッタ（５２Ｄ−０．１Ｔ
−４０Ｈ、アサヒダイヤモンド）で０．５ｍｍ／ｓの速
度で純水を注ぎかけながら１００〜４００μｍ角の大き
さに切り分けて数多くのビオチン化ＤＮＡを修飾した微
小担体が作製できた。その後、５分間ダイシングテープ
にＵＶ照射して粘着性をＵＶ照射前１９６００ｍＮ／２
５ｍｍ（カタログ値）からＵＶ照射後２５０ｍＮ／２５
ｍｍに落として担体が取れ易くした。この工程によりチ
オール誘導体およびアビジンを介して５’末端にビオチ
ン修飾したＤＮＡを固定した１０００〜８０００個位の
微小担体を作製することができた。

【００２８】パターン化した基板の作製についての模式
図を図４に示した。まず、マイクロスライドガラス基板
（１．２〜１．５ｍｍ、７６ｍｍ×２６ｍｍ、Ｓ−１２
２５、マツナミガラス）をダイヤモンドカッターで３等
分した後その表面は超音波洗浄器を用いて純水、アセト
ン、純水の順にそれぞれ３０分間洗浄した。そして、ス
ライドガラスの片面にスピンコーターにより５００ｒｐ
ｍで１０秒、１０００〜４０００ｒｐｍで２０秒間、
（Ｃ₄ Ｆ₉ ）Ｎの溶剤液で９重量％の濃度に希釈させた
ＣＹＴＯＰをピペットで１００μＬ滴下することによっ
て、０．５〜２．０μｍの厚さで疎水性にコーティング
した。次に１１５℃の恒温オーブン中に入れて４時間ハ
ードベーキングした。この上にクロムと金を各々約２０
０オングストロームと２０００オングストロームに蒸着
した。

【００２９】金を蒸着したスライドガラス基板に対し、
クラス１０のクリーンルームでポジ型のフォトレジスト
のＯＦＰＲ−８００を７〜８滴落としてスピンコート
（１Ｈ−ＤＸＩＩ、ミカサ）し、（１回目：５００ｒｐ
ｍ／１０秒、スロープ：１０秒、２回目：４０００ｒｐ
ｍ／２０秒、スロープ：５秒）、プリベーク（８０℃、
３０分）（ＤＫ３００、ヤマトサイエンティフィック）
の後、マスクアライナー（ＭＪＢ３ ＵＶ４００、Ｋａ
ｒｌ Ｓｕｓｓ）を用いて８秒間露光し、現像液のＮＭ
Ｄ−３に３０秒間浸して現像した後、超純水で２度洗い
流した後窒素ガスを吹かして乾燥させた。

【００３０】ポストベーク（８０℃、３０分）の後、金
のエッチング液（ヨウ化カリウム４０ｇ、ヨウ素１０
ｇ、水４００ｍＬ）で金のエッチングを行い、超純水で
２度洗い流した後窒素ガスを吹かして乾燥させた。つい
で、アセトン洗浄でフォトレジストを除去した後２度洗
い流した後窒素ガスを吹かして乾燥させた。続けて、ク
ロムのエッチング液（水酸化ナトリウム４０ｇ、フェリ
シアン化カリウム１００ｇ、水４００ｍＬ）でクロムの
エッチングを行い、超純水で２度洗い流した後窒素ガス
を吹かして乾燥させた。また、２×１０^-5Ｔｏｒｒ以下
で酸素プラズマ（ＩＳＣＣＭ、５００Ｖ、イオン化密度
１．０ｍＡ／ｃｍ² 以下、ＲＦ ｐｏｗｅｒ １００
Ｗ）（ＥＩＳ−２００ＥＲ、ＥＬＩＯＮＩＸ）を２分間
照射することによりＣＹＴＯＰをエッチングさせた。再
び、残っているクロムと金を全部エッチングさせた。こ
の工程によりスライドガラスの片面に親水性および疎水
性部分に分けて数多くのサイトを作製することができ
た。

【００３１】（パターン化した基板上への担体の固定）
パターン化した基板上に微小加工した担体を疎水性相互
作用による無作為液中自己組織化法で付けるためスピン
コーターの回転部に図１の様にシャーレを載せ、その中
央部にパターン化した基板を固定してから純水を貯め
た。ここに１５０−４００個の担体を入れると水上に浮
くので３００ｒｐｍで６分間回転させると担体が重力、
遠心力および疎水性相互作用による担体群の無作為液中
自己組織化によりパターン化した基板に付いた。

【００３２】図１は、無作為液中自己組織化法を用いた
疎水性相互作用によるパターン化した基板への担体の固
定化により作製した、ＤＮＡチップアレイの模式図を現
わす。パターン化した基板の疎水性部分にビオチン化Ｄ
ＮＡ修飾した担体の疎水性部分が疎水性相互作用により
数多くの所で付いてＤＮＡチップアレイになる。

【００３３】一方、懸濁液に化学、生化学的に性質が異
なる生体材料を固定化した担体の混合物を用いれば、最
終的に他種類の生体材料を密に固定化したＤＮＡチップ
アレイを得ることができる。作製したＤＮＡチップアレ
イに図３の最後の部分のようにビオチン化ＤＮＡ修飾し
た担体に緩衝液（ｐＨ７．９、１０ｍＭトリス−塩酸、
０．２Ｍ塩化ナトリウム）にＦＩＴＣ修飾したＤＮＡを
適当な濃度にして１ｍＬの溶液に６０℃で３０分間浸し
て置いて二重螺旋を結合させた。二重螺旋ＤＮＡが結合
したかは暗室でＦＩＴＣ用蛍光フィルター付きの蛍光顕
微鏡（励起光４５０〜４９０ｎｍ、吸収光５１５〜５６
５ｎｍ、分光５１０ｎｍ）（ＬＥＩＣＡＭＺ ＦＬＩＩ
Ｉ、Ｌｅｉｃａ）で励起させると蛍光が確認でき、その
明るさによっても濃度がわかる。

【００３４】（疎水性相互作用力の測定）パターン化し
た基板のＣＹＴＯＰ面上に微細加工した担体が疎水性相
互作用により、どの位の力で固定化されているかを調べ
るため図５のようにスピンコーターの回転部にシャーレ
を載せ、その中央部にパターン化した基板を動かないよ
うに固定化してから純水を貯めた。ここにＣＹＴＯＰの
溶剤液の（Ｃ₄ Ｆ₉ ）Ｎに０．４５〜９．０重量％の濃
度に希釈したＣＹＴＯＰを１０００〜４０００ｒｐｍの
速度で０．５〜２．０μｍの厚さにスピンコーティング
した１５０〜４００個の担体を入れて３００ｒｐｍで６
分間回転させると担体が重力、遠心力および疎水性相互
作用による担体群の無作為液中自己組織化によりパター
ン化した基板のＣＹＴＯＰ面に付いた。そして、図１の
ＤＮＡチップアレイの拡大図の様に、担体の金の面では
なくＣＹＴＯＰ面がパターン化した基板のＣＹＴＯＰ面
に接する担体数をカウンターで数えて疎水性相互作用力
が測られた。ついで、１００〜９００ｒｐｍの間で６分
間スピンコーターを回転させて遠心力および疎水性相互
作用力によりパターン化した基板上の担体がどれ程付い
ているか、図１の上記の拡大図のようにパターン化した
基板のＣＹＴＯＰ面から剥離した担体の数を数えて測っ
た。疎水性相互作用の結合力の測定を示した図を、図５
に示す。

【００３５】（接触角の測定）動的接触角（ＤＣＡ、ｄ
ｙｎａｍｉｃ ｃｏｎｔａｃｔ ａｎｇｌｅ）の測定に
より高分子固体が空気中から水中へあるいは水中から空
気中へ移行する時の表面における分子鎖と分子鎖の凝集
状態の再編成挙動が評価される。そこで、ここでは「動
的Ｗｉｌｈｅｌｍｙ平板法」の原理によりＣＹＴＯＰ基
板の疎水性程度を測るため動的接触角（ＤＣＡ−１０
０、オリエンテック）を測定した。まず、カバーガラス
基板の両面上に０．４５〜９．０重量％濃度のＣＹＴＯ
Ｐを１０００〜４０００ｒｐｍの濃度で０．５〜２．０
μｍの厚さにスピンコーティングさせた。次に１１５℃
の恒温オーブンの中に入れて４時間ハードベーキングし
た。そして、ＣＹＴＯＰの動的接触角を測定した。動的
接触角の測定は２５℃で純水の液体中にカバーガラスを
２０．０ｍｍ／分の速度に保ちながら浸潰−引き上げを
３回行ってその平均値を取った。この時の浸潰−引き上
げに要する力を高感度荷重検出器を用いて動的接触角を
測定した。

【００３６】（疎水性相互作用による担体の固定）無作
為液中自己組織化法を用いて疎水性相互作用によりパタ
ーン化した基板上に微小加工した担体を付けるためにス
ピンコーター装置を使い、その回転部にシャーレを載
せ、その中央部にパターン化した基板を固定してから純
水を貯めた。ここに１５０〜４００個の担体を入れると
水面に担体が群れになって集まって浮くので、３００ｒ
ｐｍで６分間回転させると重心、遠心力および疎水性相
互作用により担体群パターン化した基板上部分に付い
た。図６に、パターン化基板上に担体が結合している写
真を示す。図６において疎水性相互作用により、基板の
疎水性パターンの部分に、単体が固定されていることが
見られる。また、図６の（ａ）に担体を正面から見た写
真を、（ｂ）に担体を側面から見た写真を、（ｃ）に担
体を斜めから見た写真を、それぞれ示す。

【００３７】また、懸濁液に化学、生化学的に性質が異
なる生体材料を固定化した担体の混合物を用いれば、多
種類の生体材料を密に固定化した多項目測定及び高集積
アレイ型ＤＮＡチップアレイを得ることができる。ま
ず、異なる生体材料を基板に固定させた後、担体を作製
する。ついで、担体の混合物を用いて無作為液中自己組
織化法を用いた疎水性相互作用によりパターン化した基
板上に固定して、最終的に新しい多項目測定及び高集積
ＤＮＡ化チップアレイを作製することができる。

【００３８】図７に、ビオチン化したＣＲＥ、Ｒａｎｄ
ｏｍ、ＣＲＥ−Ｒａｎｄｏｍをそれそれ固定化した担体
上に、それらと相補的なＦＩＴＣ修飾したＤＮＡを結合
させた時の蛍光を検出した結果を示す。上段はＣＲＥを
固定化した担体に、３種類のＦＩＴＣ修飾したＤＮＡを
添加した結果であり、ＣＲＥに相補的なＤＮＡを結合さ
せた左側の写真のみに蛍光が検出された。中段はＲａｎ
ｄｏｍを固定化した担体に、３種類のＦＩＴＣ修飾した
ＤＮＡを添加した結果であり、Ｒａｎｄｏｍに相補的な
ＤＮＡを結合させた、真ん中の写真のみに蛍光が検出さ
れた。下段はＣＲＥ−Ｒａｎｄｏｍを固定化した担体
に、３種類のＦＩＴＣ修飾したＤＮＡを添加した結果で
あり、ＣＲＥ−Ｒａｎｄｏｍに相補的なＤＮＡを結合さ
せた右側の写真のみに蛍光が検出された。これにより、
本発明の方法により作製されたＤＮＡが固定化された担
体において、固定化されたＤＮＡに特異的な相補的ＤＮ
Ａが結合することが示された。

【００３９】（疎水性相互作用力の測定）無作為液中自
己組織化を用いた疎水性相互作用により図１のようにパ
ターン化した基板に担体の金の面ではなくＣＹＴＯＰ面
が接する確率とパターン化した基板に担体がどれ程の力
で固定されているか図５のようなスピンコーター装置を
用いて遠心力と流速によりパターン化した基板から担体
が剥離する割合を調べた。結果を図８に示す。まず、
９．０重量％濃度でＣＹＴＯＰをコーティングしたパタ
ーン化した基板と担体に対してパターン化した基板に担
体の金の面ではなくＣＹＴＯＰ面が接する確率は８０％
位であったが、カバーガラスにＣＹＴＯＰをコーティン
グしないと４０％位まで下がり、パターン化した基板と
担体共に疎水性に処理するより接する確率はずっと劣
る。また、パターン化した基板と担体共に親水性に処理
すると担体の親水性部分が接する確率は７０％位で、疎
水性に処理した基板より劣った。

【００４０】次に、疎水性相互作用によりパターン化し
た基板に担体がどれ程の力で固定化されているかを、Ｃ
ＹＴＯＰの濃度を０．４５〜９．０重量％に変えてコー
ティングしたパターン化した基板と１５０〜４００個の
担体に対して調べて、その結果を図９に示した。９．０
重量％濃度のＣＹＴＯＰをコーティングしたパターン化
した基板と担体に対しては１００〜９００ｒｐｍの間で
スピンコーターの遠心力と流速によってもパターン化し
た基板上に担体が９５％以上まで付いていることが判
る。また、パターン化した基板と担体にＣＹＴＯＰの濃
度を薄めるか違うように（各々０．４５と９．0 重量
％）してコーティングすると担体のパターン化した基板
への固定力が８０〜９０％位まで低くなったが、同じ濃
度と厚さによっては結合力の差はほぼなかった。一方、
ＣＹＴＯＰをコーティングしなかったカバーガラス（親
水性）に対しては疎水性相互結合力は３０％以下まで下
がってしまい、疎水性相互作用力が劣ることが判る。そ
して、パターン化した基板と担体共に親水性に処理する
と親水性相互作用力は５０％位まで下がってしまい、疎
水性相互作用力より劣ることが判った。以上の結果によ
り本研究ではパターン化した基板と担体に９．０重量％
濃度のＣＹＴＯＰを４０００ｒｐｍでコーティングに利
用した。

【００４１】（接触角の測定）ＣＹＴＯＰのコーティン
グ濃度により担体とパターン化した基板の疎水性相互作
用力が違うので、カバーガラス両面にＣＹＴＯＰをコー
ティングしてＣＹＴＯＰの動的接触角を測ってその結果
を図１０に示した。カバーガラスのみの動的接触角は７
４．２°であった。また、０．４５〜９．０重量％のＣ
ＹＴＯＰの濃度別の動的接触角は８４．３〜８８．７°
で、濃度が高まると強くなった。一方、図１０から判る
ように９．０重量％濃度のＣＹＴＯＰを１０００〜４０
００ｒｐｍの速度でスピンコーティングすると動的接触
角は８８．３〜８８．９°で、その差はあまりなかっ
た。

【００４２】この結果は担体とパターン化した基板が疎
水性相互作用により固定されており、またＣＹＴＯＰの
濃度が高まると図１０のようにパターン化した基板と担
体の疎水性相互作用が強くなることを示唆する。また、
ＣＹＴＯＰの濃度が低くなると付く力が弱まることが判
る。

【００４３】本発明により、厚膜用ＣＹＴＯＰを用いて
作製したパターン化疎水性膜を有する基板に、ＤＮＡを
固定化してダイシングにより得た微小担体を液中で無作
為液中自己組織化法を用いた疎水性相互作用により、任
意の位置に配置することができた。このＤＮＡ反応を蛍
光によって確認することができた。また、液中でのパタ
ーン化疎水性膜と担体との疎水性相互作用力は他の作用
力より優れていて、多項目測定用の高集積型ＤＮＡチッ
プアレイとして応用可能な技術であることが示された。

【００４４】実施例１においては、新しい生体材料固定
化方法は配置直後にどの材料がどこに配置されたかの情
報が失われている。生体材料そのものの応答を用いてキ
ャリブレーション等により最終的な位置が確認できるほ
か、微小担体に対する配置前に別のマーキング操作を施
しておくか色々の形を取っておけば、最終的な位置を知
ることが可能となる。一方、より多くの担体を配置、固
定化するために安定なパターン化疎水性膜の形状を作製
していく必要がある。そこで、下記の実施例２におい
て、個々の微小担体の識別を可能とするタグを付与した
バイオチップの作製を試みた。更に、実施例２において
は微小担体との壁を基板上に作製し、配置時の安定性の
向上をはかった。

【００４５】（実施例２） （微小担体の作製）微小担体を作製するカバーガラス
（０．０４〜０．０６ｍｍ，３０ｍｍｘ３０ｍｍ）を、
超音波洗浄器を用いて純水、アセトン、純水の順にそれ
ぞれ３０分間洗浄した。カバーガラスの一方をＣＹＴＯ
Ｐ（９．０重量％、０．５μｍ）でスピンコートした。
カバーガラスを１１５℃で４時間ベーキングした。クロ
ム層（０．５〜１．０オングストローム／ｓ，２００オ
ングストローム）と金層（５．０〜１０．０オングスト
ローム／ｓ，２０００オングストローム）を、もう一方
の面に蒸着した。フォトリソグラフィーを用いてネガ型
のフォトレジスト（ＯＭＲ８３）を作用させて微粒子に
タグを与え、ホットプレート上で１００℃で１分間ベー
キングした。フォトマスクを通じて、ＵＶ光（ＭＪＢ３
ＵＶ４００、カールザーツ）をレジスト膜に４秒間照
射した。ＯＭＲ現像液で現像し、洗浄して窒素ガスで乾
燥させた。１００℃で１分間ベーキングした後、金のエ
ッチング液（ＫＩ：Ｉ₂ ：Ｈ₂ Ｏ＝４：１：４０）とク
ロムのエッチング液（ＮａＯＨ：Ｋ ₃ ［Ｆｅ（ＣＮ）
₆ ］：Ｈ₂ Ｏ＝２：５：２０）の中で３０秒間エッチン
グを行った。剥離したＯＭＲ層のエッチングを行い、金
表面を酸素プラズマ（６７Ｐａ，１００ＳＣＣＭ，２０
０Ｗ）に５分間暴露して親水性とした。切断するため
に、カバーガラスを粘着テープに固定した。ダイシング
マシーンを用いて、カバーガラスを１００〜４００μｍ
の微小担体に切断した。ＵＶ光を粘着テープに５分間照
射して、微粒子を剥離した。この過程によりタグを付し
た微小担体が得られた。

【００４６】図１１（ａ）は、タグにおける各ビットの
数字であり、リソグラフィーにより微小担体にそのタグ
を書き込んだ。１つの微小タイルが１ビットを意味する
とした場合には、この８ビットにより０〜２５５を表す
ことが可能である。ＳＰとＥＰはビットの出発点と終末
点を表し、微小担体に常に書かれている。図１１（ｂ）
は図１１（ａ）に基づいたタグであり、２進法の０１０
１１０００１（１０進法の数字でいうと８８）を示して
いる。また、図１１（ｃ）は微小担体のＳＥＭ写真であ
り、図１１（ｂ）の”０１０１１０００１”という数字
がリソグラフィーによって微小担体上に書かれており、
ダイシングマシーンにより分割した。微小担体の大きさ
は３００ｘ３００μｍ² である。ダイシングマシーンに
より種々の大きさの微小担体が得られた。図１１（ｃ）
において、１０ｘ１０μｍ² ／ビットであるタグを明確
にみることができた。この過程により、微小担体上に他
のタグを書くこともできる。

【００４７】（ＤＮＡの固定化）実施例１と同様の方法
で、金蒸着を行ったカバーガラス基板上にビオチン修飾
したＤＮＡを固定した。１ｍＭ濃度の３、３’−ジチオ
ジプロピオン酸水溶液３ｍＬの中に、金蒸着したカバー
ガラスを室温で２０分間浸した。金の上のカルボキシル
酸をＥＤＣの存在下でＮＨＳと反応させた後に乾燥し
た。活性化したカルボキシル基を有する金を、１ｍＬの
アビジン（１００μｇ／ｍＬ）の緩衝液（ｐＨ７．９、
１０ｍＭトリス−塩酸、０．２Ｍ塩化ナトリウム）中に
１時間浸した。何回か水溶液で洗浄しても、金からアビ
ジンは除去されなかった。アビジンが結合した金を、エ
タノールアミン（１Ｍ）の水溶液（１ｍＬ）に３０分間
浸して、カルボキシル基を不活化してβ−ヒドロキシエ
チルアミドにした。コントロール実験として、アビジン
の緩衝液（１ｍＬ中１０μｇ）の中にそのままの金を浸
したところ、アビジンの吸着はほとんど観察されなかっ
た。アビジンの濃度を１ｍＬ中において３０〜２００μ
ｇまで増加したところ、非特異的な吸着が観察された。
アビジンが結合した金を、ビオチン化したＤＮＡの緩衝
溶液（２０〜２１ｂｐ、１μＭ）１ｍＬ中に２５℃で３
０分間浸した。固定化量をコントロールするために金を
取り出した。アビジン分子の４つの結合サイトの１つと
結合するとして、ビオチン化したＤＮＡ鎖を計算した。
ビオチン化ＤＮＡの固定量はＤＮＡ溶液に浸す時間によ
り制御できた。

【００４８】（パターン化した基板の作製）スライドガ
ラスを、超音波洗浄器を用いて純水、アセトン、純水の
順にそれぞれ３０分間洗浄した。そして、スライドガラ
スの片面をＣＹＴＯＰによりスピンコートして、１１５
℃で４時間ベーキングした。クロム／金層をＣＹＴＯＰ
上に蒸着し、ホットプレート上で２００℃で１５分間ベ
ーキングしてこの表面を乾燥させた。ネガ型フォトレジ
スト（ＸＰ ＳＵ−８ ５０）を、スピンコーターによ
りスライドガラス上に滴下し、ホットプレート上で１０
０℃で３０分間ベーキングした。フォトマスクを通じて
スライドガラスをＵＶ光に２０秒間暴露した。ホットプ
レート上において１００℃で３０分間ベーキングし、自
然に冷却した。ＳＵ−８現像液中で３０分間現像し、現
像液で洗浄し、窒素ガスで乾燥した。ＳＵ−８ ５０の
表面を酸素プラズマに５分間暴露し、親水性とした。金
とクロムの層を３０秒間エッチングし、洗浄して窒素ガ
スで乾燥した。パターン化した基板は、２５〜３０μｍ
の厚さの壁を有する格子縞模様であった。大きさは、全
ての側において１００ｘ１００〜５００ｘ５００μｍ²
である。パターン化した基板はそれぞれ、親水性と疎水
性の部位に分けられた。１０³ 〜１０⁴ ／ｃｍ² の親水
性及び疎水性部位が得られた。

【００４９】図１２は、リソグラフィーと酸素プラズマ
プロセッシングにより作製された、パターン化基板を示
す。星印で示した範囲は親水性の部分を、残りは疎水性
の部分を示す。このパターン化基板は１００ｘ１００μ
ｍ² （１００００サイト／ｃｍ² ）であった。高さが２
５〜３０μｍの壁を全ての側面に規則的に作製したため
に、配列した後の微小担体の安定性は高いであろうと予
測される。また、５００ｘ５００μｍ² のパターン化基
板を作製することも可能であった。図１２（ａ）は作製
された壁の拡大図であり、親水性部分と壁との間のエッ
チングが巧みであることが示されている。壁を明確に見
ることができ、またフォトリソグラフィーを用いて、種
々の大きさの疎水性部位を得ることができる。

【００５０】（担体のパターン化した基板上への配置）
種々の固定化ＤＮＡとタグの両方を有する約５０００個
の担体を含む懸濁液（エタノール９０％＋蒸留水１０
％）の中に、パターン化した基板を入れた。重力と疎水
性相互作用により、無作為液中自己組織化を用いて微小
担体を基盤に付着させ、パターン化基板の疎水性部位の
各々に無作為に配列した。この過程により、集約型のＤ
ＮＡチップマイクロアレイを組み立てることができた。

【００５１】図１３は、無作為液中自己組織化を用い
て、疎水性相互作用によりタグを有する担体をパターン
化基板上に配列させた、集積型ＤＮＡチップマイクロア
レイのＳＥＭ写真を示す。星型と四角型の各部位はそれ
ぞれ、親水性と疎水性の部位を示す。微小担体がパター
ン化基板上の疎水性部位に配列する確立は約７５〜８５
％であった。図１３において担体の厚さは約５０μｍで
あり、周囲に壁（２５〜３０μｍ）があるために、担体
は強固に三次元的に配列することができる。各担体をタ
グによって区別することができるために、多くの種類の
ＤＮＡが担体に固定化されたときに各ＤＮＡを区別する
ことが可能となる。タグの例として、２進法の”０１０
１１０００”というタグや”０１１０００１１”という
タグが挙げられ、これらは１０進法の８８という数字と
９９という数字を、それぞれ示している。

【００５２】（ハイブリダイゼーション）固定化したＤ
ＮＡプローブ（ビオチン化したＤＮＡ）が結合した金
を、ハイブリダイゼーション緩衝液に入れて、次いでＦ
ＩＴＣ修飾した標的ｃＤＮＡ（０．１ｐＭ〜１μＭ，５
μＬ）と反応させることによりハイブリダイゼーション
の実験を行った。ハイブリダイゼーションは蛍光強度の
変化により確認した。非相補的なＤＮＡ結合（１μＭ，
５μＬ）もまた評価した。蛍光顕微鏡（励起光４５０〜
４９０ｎｍ、吸収光５１５〜５６５ｎｍ）（ＬＥＩＣＡ
ＭＺ ＦＬＩＩＩ、Ｌｅｉｃａ）により暗室で蛍光を
確認し、光度によりＤＮＡハイブリダイゼーションの検
討を行った。

【００５３】図１４は、ＤＮＡチップマイクロアレイに
おける、ＦＩＴＣ修飾された標的ｃＤＮＡの濃度（０．
１ｐＭから１μＭ）に依存した蛍光強度の変化を示す。
図１４（ａ）において、１０^-13 Ｍから１０^-6Ｍの範囲
内の濃度でＡとＢのプライマリーＤＮＡがそれらのｃＤ
ＮＡとハイブリダイズした時、濃度増加により蛍光強度
がほとんど直線的に増加するという関係が観察された。
蛍光強度はｃＤＮＡの濃度に依存していた。しかし図１
４（ｂ）は、プライマリーＤＮＡのｃＤＮＡではないサ
ンプルと反応させた結果である。ＦＩＴＣ標識された標
的ｃＤＮＡがプライマリーＤＮＡとハイブリダイズしな
かったために、この場合には蛍光は見られなかった。こ
れらの結果は、このＤＮＡチップアレイを用いてＤＮＡ
を認識することが可能であることを意味している。

【００５４】図１５は、ＤＮＡチップマイクロアレイに
おける、種々の標的ｃＤＮＡがハイブリダイズした後の
蛍光変化を示す。各プライマリーＤＮＡを担体に固定化
した後に各担体を懸濁液中で混合してチップパターン上
に配列させた。図１５（ａ）はＤＮＡチップマイクロア
レイを示しており、プライマリーＤＮＡは標的ｃＤＮＡ
とハイブリダイズしていないために蛍光は検出されな
い。ＦＩＴＣ標識された標的ｃＤＮＡを順次投入した。
図１５（ｂ）はＡ’のｃＤＮＡを投入したときの結果で
あり、Ａ’のｃＤＮＡとハイブリダイズした時だけに丸
型の点線内に蛍光が見られた。その上に図１５（ｃ）に
おいてＢ’のｃＤＮＡを、更に図１５（ｄ）において
Ａ’＋Ｂ’のｃＤＮＡを投入した時に、ハイブリダイズ
することによって丸型の点線内に蛍光が見られた。これ
らの結果は、この方法がＤＮＡチップマイクロアレイに
適用できることを示している。

【００５５】

【発明の効果】本発明により、生体材料を固定化した微
小担体と担体を固定化したパターン化基板を、無作為液
中自己組織化法を用いて疎水性相互作用により固定化す
ることを特徴とする、新規なバイオチップの作製方法が
与えられた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、本発明のバイオチップアレイの構造
を示した図である。

【図２】 図２は、微小担体の作製方法の概要を示す図
である。

【図３】 図３は、微小担体にＤＮＡを結合させる過程
を示す図である。

【図４】 図４は、パターン化基板の作製工程の概要を
示す図である。

【図５】 図５は、スピンコーターの遠心力を用いて、
担体群の疎水性相互作用を測定する装置を示す図であ
る。

【図６】 図６は、疎水性相互作用により、基板の疎水
性パターンの部分に固定された担体を示す写真である。

【図７】 図７は、ビオチン化ＤＮＡを固定化した担体
に対する、相補的なＦＩＴＣ化ＤＮＡの結合を示した写
真である。

【図８】 図８は、パターン化基板に対して担体のＣＹ
ＴＯＰ面が接する確率を示す図である。

【図９】 図９は、種々の濃度のＣＹＴＯＰ処理におけ
る、パターン化基板に残った担体の割合を示すグラフで
ある。

【図１０】 図１０は、種々の濃度のＣＹＴＯＰ処理に
おける、動的接触角を示すグラフである。

【図１１】 図１１は、本発明において使用したタグの
構成を示す模式図（ａ，ｂ）及びタグを付した微小担体
の写真（ｃ）である。

【図１２】 図１２は、親水性部位と疎水性部位を有す
るパターン化基板の写真である。

【図１３】 図１３は、無作為液中自己組織化を用いて
タグを有する担体をパターン化基板上に配列させたＤＮ
Ａチップマイクロアレイの写真である。

【図１４】 図１４は、標的ｃＤＮＡの濃度に依存した
蛍光強度の変化を示す図である。

【図１５】 図１５は、種々の標的ｃＤＮＡがハイブリ
ダイズした後の蛍光変化を示す図である。

【符号の説明】

１ 基板、２ 固定部、３ 疎水性コーティング、４
微小担体、５ クロムコーティング、６ 金コーティン
グ、７ 生体材料、８ 親水性部分、９ 疎水性部分

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ // Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｍ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｆ (56)参考文献 特開 平10−185923（ＪＰ，Ａ) 特開2002−98697（ＪＰ，Ａ) 特開2000−249706（ＪＰ，Ａ) 特表2001−501967（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 37/00 102 C12M 1/00 C12N 15/09 G01N 33/566 G01N 33/53

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 バイオチップであり、当該バイオチップ
   はパターン化基板及び生体材料固定化担体とを備え、当
   該パターン化基板は基板と当該基板の片面に配列した複
   数の疎水性固定部とを備え、当該基板の疎水性固定部の
   間は親水性であり、当該生体材料固定化担体は微小担
   体、当該微小担体の片面の表層に形成した疎水性コーテ
   ィング及び当該微小担体の他方の片面に固定化した生体
   成分又は生体成分類似物質を備え、当該疎水性固定部と
   当該生体材料固定化担体は疎水性相互作用により結合し
   ていることを特徴とする、バイオチップ。
2. 【請求項２】 前記生体成分又は生体成分類似物質が核
   酸、蛋白質、脂質、生体模倣有機分子、細胞及びこれら
   の複合体よりなる群より選択された、請求項１記載のバ
   イオチップ。
3. 【請求項３】 個々の前記生体材料固定化担体を識別た
   めの識別子を、前記生体材料固定化担体上に有している
   ことを特徴とする、請求項１又は請求項２記載のバイオ
   チップ。
4. 【請求項４】 前記識別子が、前記生体材料固定化担体
   上に記載された格子状のタグのパターンにより構成され
   ていることを特徴とする、請求項３記載のバイオチッ
   プ。
5. 【請求項５】 微小担体、当該微小担体の片面の表層に
   形成した微小担体疎水性コーティング及び当該微小担体
   の他方の片面に固定化した生体成分又は生体成分類似物
   質を備える、バイオチップ用の生体材料固定化担体。
6. 【請求項６】 前記生体成分又は生体成分類似物質が核
   酸又は蛋白質、脂質、生体模倣有機分子、細胞及びこれ
   らの複合体よりなる群より選択された、請求項５記載の
   生体材料固定化担体。
7. 【請求項７】 識別ための識別子を更に有していること
   を特徴とする、請求項５又は請求項６記載の生体材料固
   定化担体。
8. 【請求項８】 請求項５ないし請求項７記載のいずれか
   １項記載の生体材料固定化担体と、基板及び当該基板の
   片面に格子状に配列した固定部とを備えるパターン化基
   板とを、無作為液中自己組織化法を用いて、疎水性相互
   作用により固定化することにより、バイオチップを作製
   する方法。
9. 【請求項９】 前記無作為液中自己組織化法が、前記生
   体材料固定化担体の懸濁液を液体中に滴下して当該液体
   を回転させることにより、前記パターン化基板の前記疎
   水性固定部に前記生体材料固定化担体を配置することよ
   り成る、請求項８記載の方法。